1. No category

Lipasbaserade in vitro frisättningstester
för farmaceutiska lipidformuleringar
Av: Leonard Saffer – Institutionen för livsmedelsteknik – Lunds Universitet – Juni 2015
Behovet av avancerade läkemedelsformuleringar
När man tar en medicin är det viktigt att man tar rätt dos. Tar man för liten dos uteblir den önskade
terapeutiska effekten och tar man för stor dos kan bieffekterna bli allvarliga. Skillnaden mellan
terapeutisk och giftig dos kallas terapeutiskt fönster. Om det terapeutiska fönstret är snävt kan man
behöva ta små doser ofta för att en säker och effektiv koncentration av läkemedlet i kroppen under
hela behandlingen. Det skulle kunna innebära att en patient måste ta flera tabletter under dagen och
under natten. Att missa en dos skulle kunna vara allvarligt.[1]
En lösning på detta problem kallas kontrollerad frisättning.
Det finns sådana läkemedel som varar i ett par timmar, andra
kan vara i flera år. På Camurus AB i Lund utvecklas flera
läkemedel med avancerade lipidformuleringar för
kontrollerad frisättning. Dessa kommer användas vid
behandlingar av opiatberoende, akromegali, prostatakancer,
neuroendokrina tumörer, smärta med mera. [2][3][4][5][6]
Några av dessa läkemedel formuleras med deras FluidCrystal® Figur 1. Här visas FluidCrystal®
Injection depot teknologi, se Figur 1. En verksam Injection depots funktionalitet
läkemedelssubstans löses upp i en speciell lipidblanding av 1. Subkutan injektion av
fosfolipider och diacylglyceroler, m.m. Sedan injiceras lipidformuleringen.
formuleringen subkutant (i underhuden). När formuleringen 2. Flytande kristaller bildas då vatten
kommer i kontakt med vatten som finns i kroppen bildar tas upp ifrån omgivningen (W).
lipideerna omedelbart så kallade flytande kristaller. 3. Långsam frisättning av läkemedel
Lipidformuleringen fortsätter ta upp små mängder vatten och (D), biodegradering av depån.[7]
bilda flytande kristaller till dess att hela formuleringen blivit en
gel-matris av flytande kristaller. De flytande kristallerna kommer omsluta och låsa in läkemedlet.
Därefter frisätts läkemedlet långsamt från depån och tas upp i kroppen samtidigt som depån bryts ner
av kroppen.[7]
I vissa formuleringar är det nästan helt och hållet biologiska interaktioner, eller biodegradering, som
styr hur snabbt läkemedlet frisätts från depån och tas upp av kroppen. En bidragande faktor tros vara
de fettnedbrytande enzymer som finns överallt i kroppen. Genom att studera hur dessa lipaser
fungerar i flaskor på lab, in vitro, hoppas man kunna öka sin förståelse för vad som händer med depån
i kroppen, in vivo. Om dessa studier med lipaser visar sig vara bra in vitro modeller för vad som händer
in vivo kommer de kunna vara till hjälp under läkemedelsutvecklingen samt ifall ett läkemedel på
marknaden skulle behöva ändringar relaterade till sin kemi, tillverkning och kontroll.[8][9]
I denna studien bestod formuleringen huvudsakligen av en fosfolipid kallad fosfatidylkolin och en
diacylglycerol kallad glycerol dioleat. Tre lipaser användes i studien; två triacyl glycerol lipaser kallade
TLL och CALB, samt en fosfolipas kallad PLA1. TLL och CALB hydrolyserar (spjälkar/klyver/bryter ner)
glycerol dioleat så att två produkter, glycerol monooleat och en fri fettsyra bildas. De kan även
hydrolysera glycerol monooleat så att glycerol och ytterligare en fri fettsyra bildas. PLA1 hydrolyserar
fosfatidylkolin så att produkterna lysofosfatidylkolin och en fri fettsyra bildas.[10][11]
Istället för frisättningsförsök med riktiga läkemedel användes ett färgämne, Patent Blått V Natrium
salt. Detta för att det är lätt att studera och hantera och dessutom frisätts det väldigt långsamt från
depån, så att nästan all frisättning kan sägas bero på lipaserna. Den effekt som lipiderna har är att de
klyver en viss kemisk bindning i Vialer och 96 brunnsplattor användes istället för att testa i människor.
I denna artikel visas endast fotografier från vialförsöken men resultat från spektrofotometriska
mätningar från både vialförsöken och 96-brunn plattorna kommer att diskuteras.
Resultat
De tre testade Lipaserna påskyndade frisättningen av Patent Blått. Triacylglycerol lipaserna TLL & CALB
påskyndade inte på frisättningen lika mycket som PLA1.
0 timmar
4 timmar
Figur 2. Den första bilden visar hur vialer såg ut precis efter injektion av PLA1 i vialerana i mitten och
till höger. Bilden till höger visar hur flaskorna såg ut fyra timmar senare.
Figur 2 ovan visar hur vialerna kan se ut direkt efter injektion av PLA1 och fyra timmar senare. Den
vänstra vialen innehåller inga lipaser. Vialen i mitten innehåller en liten volym PLA1 lösning och vialen
till höger innehåller tio gånger så mycket PLA1 lösning som den mittersta. I vialen till vänster har lite
färg släppts ut, långt ifrån lika mycket som flaskan i mitten och till höger. I den högra vialen kan man
till och med se hur depån börjar fragmenteras och frisättningen accelereras kraftigt. Notera att detta
är snabbare än det kommer gå till i kroppen och att det viktiga är de slutsatser man kan dra om vilken
effekt PLA1 har på lipidformuleringen.
3 dagar
3 dagar
Figur 3. Vänstra bilden en vial från frisättningsförsök utan lipas efter tre dagar. Bilden till höger visar
hur TLL ökar frisättningshastigheten av Patent Blått
Figur 3 visar att inte mycket mer Patent Blått är frisatt efter tre dagar än efter fyra timmar i frånvaro
av lipaser (jämför med figur 2). Proverna med relativt mycket TLL hade efter tre dagar ännu mindre
Patent Blått än proverna med lite PLA1 hade efter 4 timmar. CALB var ännu långsammare (finns inte
fotograferad här).
Frisättningsförsök med både TLL och PLA1 visade ingen ökning av frisättning jämnfört med prover som
enbart hade PLA1. Olika formuleringar testades och det visades att formuleringstyp spelade roll för
den lipasbaserade frisättningen av patentblått.
En viktig avgörande faktor för hur frisättningshastigheten från formuleringarna påverkas av de olika
lipaserna är mikrostrukturen av de olika flytande kristallerna. När lipaserna hydrolyserar de olika
lipiderna introduceras nya komponenter som kan förändra strukturen i de flytande kristallerna.
Arbetet i denna studien visar att lipaser kan spela en avgörande del i biodegraderingen av
lipidformuleringen in vitro. Framtida arbete får avgöra om lipaserna spelar en avgörande roll för
biodegraderingen in vivo. Om det är så kommer dessa tester kunna användas för att modelera in vivo
förloppet in vitro.
Slutsatser
De lipasbaserade in vitro frisättningstesterna visade att fosfolipasen PLA1 kraftigt ökade
frisättningshastigheten av färgämnet Patent Blått från en lipidformulering. Triacylglycerol lipaserna TLL
och CALB ökade frisättningshastigheten märkbart, men väldigt lite.
Att kombinera lipaserna PLA1 och TLL gav ingen additiv eller synergisk ökning av
frisättningshastigheten. Olika formuleringstyper påverkas olika av lipaserna.
Referenser
[1] Aulton M, Taylor K. Aulton's Pharmaceutics : The Design And Manufacture Of Medicines. Edinburgh ;
New York : Churchill Livingstone/Elsevier, 2013.
[2] Wilson C, Crowley P. Controlled Release In Oral Drug Delivery. Boston, MA : Springer US, 2011.
[3] Hoffman A. Review: The origins and evolution of “controlled” drug delivery systems. Journal Of
Controlled Release. January 1, 2008;132(Proceedings of the Tenth European Symposium on Controlled
Drug Delivery):153-163.
[4] Greene J, Riggs K. Why is there no generic insulin? Historical origins of a modern problem. New England
Journal Of Medicine [serial online]. March 19, 2015;372(12):1171-1175.
[5] Rowlands S, Searle S. Contraceptive implants: current perspectives. Open Access Journal Of
Contraception. September 2014;5:73-84.
[6] Camurus AB Technologies webpage, http://www.camurus.com/products/ Viewed at May 19 2015.
[7] C amurus AB Technologies webpage, http://www.camurus.com/technologies/ Viewed at May 19 2015.
[8] Tiberg, F.; Johnsson, M. Drug delivery applications of non-lamellar liquid crystalline phases and
nanoparticles. Journal of Drug Delivery Science and Technology, 2011, 21.1: 101-109.
[9] M. Mukherjee. Human digestive and metabolic lipases—a brief review. Journal of Molecular Catalysis
B: Enzymatic Volume 22, Issues 5–6, 11 July 2003, Pages 369–376.
[10] Casas-Godoy, L.; Duquesne, S.; Bordes, F.; Sandoval, G.; Mart, A. Lipases: An overview. Chapter 1 of
the book: Georgina Sandoval (ed.), Lipases and Phospholipases: Methods and Protocols. Humana Press
2012.
[11] Aloulou, A.; Ben Ali, Y.; Bezzine, S.; Gargouri, Y.; Gelb, M.H. Phospholipases: An overview. Chapter
4 of the book: Georgina Sandoval (ed.), Lipases and Phospholipases: Methods and Protocols. Humana
Press 2012.