1. No category

Nukleinsyrer – basal innføring
(+
Noen sentrale teknikker
og analysemetoder)
Geir Slupphaug,
Institutt for kreftforskning og
molekylærmedisin
Litt historikk
• DNA ble først isolert av Johannes F. Miescher ca
1870, som fant en svak syre kalt «nuklein» i kjerner
fra hvite blodceller.
• Kjemisk analyse av nukleinet viste at det inneholdt betydelige
mengder fosfor, og derfor ikke passet inn i noen av de hittil
kjente stoffgruppene
• Noen år greide Meischer å skille nuklein i en protein- og en
nukleinsyredel
Litt historikk
• I 1866 postulerte Ernst Haeckel postulert at
cellekjernen inneholdt arvematerialet. Meischer
foreslo at nukleinsyrene kunne være involvert i arv.
Han gikk senere bort fra denne teorien
• I 1879 observerte Walther Fleming filamenter i
cellekjerner som lot seg farge med basofile farger.
Han kalte disse strukturene kromatin, senere kjent
som kromosomer
• Rundt 1900 var det kjent at DNA inneholdt sukker,
fosfat og fire heterosykliske baser (A,T,C og G).
Phoebus Levene viste ca 1910 at disse komponentene
var ordnet som rekker av nukleotider. Han oppdaget
også ribose og deoksyribose
• Han trodde imidlertid at maksimal lengde av et DNAmolekyl var 4 nukleotider, og postulerte derfor at
DNA ikke kunne være bærer av genetisk informasjon
Litt historikk
• I 1928 publiserte Frederick Griffith sitt eksperiment
som viste at bakterier (Streptococcus pneumoniae) kunne
transformeres
• Griffith konkluderte at et «transforming principle» fra de drepte
bakteriene transformerte nonvirulente bakterene.
Litt historikk
• I 1944 klarte Oswald Avery, Colin
MacLeod og Maclyn McCarty å
renfremstille DNA fra virulent S.
pneumoliae, og viste at dette kunne
transformere nonvirulente bakterier
• I 1950 viste Edwin Chargaff at mengden adenin i DNA tilsvarte
mengden tymin. Det samme gjaldt guanin og cytosin (Chargaff’s
lov). Dette fikk stor betydning for løsningen av DNAets struktur
• 1950-53: Rosalind Franklin greide å
oppta røntgenkrystallografiske data
av rent DNA og kalkulerte at fosfat
måtte ligge på utsiden av molekylet,
samt fant mengden vann i strukturen
-begge deler vital informasjon for
bygging av en DNA-modell.
Litt historikk
• I april 1953 publiserte Watson Crick sin DNA-modell i Nature
Litt historikk
• 1975: Frederick sanger publiserer sin metode
for sekvensering av DNA
• 1975: Forskere ved Genentech lager
genmodifiserte mikroorganismer for
produksjon av humant somatostatin, insulin og
veksthormon
• 1985: Kary Mullis publiserer første paper som
beskriver polymerase-kjedereaksjon, PCR, for
amplifisering av DNA, og patenterte metoden
• Men – prinsippene for PCR hadde blitt
beskrevet av Kjell Kleppe og Har Gobind
Khorana allerede i 1971
Litt historikk
• 1990: NIH utfører første godkjente genterapieksperiment på en
4-årig jente med SCID
• 1993: Calgene produserer den første
rekombinante matvare, tomat (Flavr Savr),
godkjent av FDA
• 1996: Sauen Dolly klonet fra somatiske celler fusjonert
med ubefruktet egg
• 2003: Human Genome Project publiserer den
humane genomsekvensen til en nøyaktighet
på 99.99%
Prokaryote vs eukaryote genom
• Prokaryote celler:
• Eukaryote celler:
•
•
DNAet er organisert som kromatin i
cellekjernen, i en komplisert og tett
pakket struktur som består av blant
annet basiske histonproteiner.
•
I tillegg inneholder cellene DNA i
mitokondriene (og i planter,
kloroplastene).
Genomet (DNAet) er lite,
sirkulært og ligger åpent
organisert i form av et nukleoid.
Det inneholder 1000-4000
gener. I tillegg finnes ofte
plasmider med noen få gener
Eschericia
coli
Celler har ulik genomstørrelse
• Prokaryoter og enkle eukaryoter har ofte et lite DNA-innhold (små
genom), mens høyere eukaryoter har genom som kan være flere
tusen ganger større
• Det er likevel ikke en direkte sammenheng mellom genomstørrelse
og hvor «avansert» organismen er
• Høyere vertebrater har en mer avansert regulering av sitt genom
Prok.
Euk.
Kromatin
• Størrelsen på eukaryote genom krever at de er tettere «pakket»
for å få plass inne i en cellekjerne
• Eukaryote kromatin er et nettverk av DNA og protein som er
pakket sammen i lange fibre. Med TEM kan en se tett pakkede
områder (heterokromatin) og løst pakkede områder (eukromatin)
TEM-bilde av cellekjerne
EM-forstørrelse av kromatinfragment
viser at det har en ”perler på en snor” struktur
• ”Perler-på en snor”-utseendet
skyldes at DNAet ligger krøllet
rundt store proteinkompleks som
kalles histoner. Under celledeling
(mitose) blir denne pakkingen så tett
at kromosomene blir synlige i
mikroskopet.
• Dette gjør også at en kopi av hvert
kromosompar lett kan trekkes ut til
hver av dattercellene i forbindelse
med celledelingen
• Eubacteria har ikke histoner, mens
Archaebacteria har en enklere form
for histoner enn eukaryoter
Genorganisering
• Mens eukaryote gener ligger spredt i store områder ikkekodende DNA, er prokaryote gener ofte mye tettere pakket
(«gene clustering»)
• Ofte ligger gener som koder for proteiner involvert i en og
samme reaksjonsvei, ordnet «på rekke», og er styrt av én felles
promoter. Slike rekker av funksjonelt relaterte gener kalles
operons
Strukturen av standard B-DNA
Andre DNAstrukturer
• A-DNA er sannsynligvis ikke viktig in vivo
for dsDNA, men dannes in vitro ved høye
saltkonsentrasjoner eller i nærvær av
etanol. A-formen er vanlig i RNA og i
RNA-DNA-duplexer. Den er bredere og
mer sammentrykt enn B-formen.
• Z-DNA ble første gang beskrevet i 1979.
Denne er en venstredreid helix, med
sikksakk-form. Denne konformasjonen
danner spesifikke bindingsregioner for
flere proteiner, blant annet et RNAediteringsenzym, ADAR1. Enkelte virale
protein (ex. poxvirus E3L) binder også til
Z-DNA, og øker ekspresjon av antiapoptotiske proteiner
H-DNA
• H-DNA er trippel-helix strukturer som
kan dannes ved inverterte
homopurin/homopyrimidinrepeats. Det er
nylig vist at slike sekvender er ”hotspots”
for mutasjoner
DNA hybridisering
• De to komplementære DNAtrådene holdes sammen av
hydrogenbindinger
• Disse kan brytes ved
oppvarming, og DNAet
denaturerer.
• Ved avkjøling vil det to trådene
renaturere
• Trådene kan også anneale til
andre komplementære DNAfragment, eller til RNA. dette
kalles hybridisering
• DNA/DNA- og RNA/DNA
hybridisering danner grunnlaget
for en rekke sentrale teknikker
innen molekylærbiologien
G:G sterkere enn A:T (A:U)
DNA-syntese
• Meselsohn og Stahl viste i
1958 at DNA replikeres
semikonservativt
• De to trådene i DNA-heliksen går i motsatt
retning av hverandre (de er antiparallelle). Den
enden av DNA-tråden som mangler en nukleotid
i 5’-pososjon på sukkerringen, kalles 5’-enden,
og tilsvarende kalles den enden som mangler en
nukleotide i 3’-posisjon, 3’-enden.
• Den DNA-tråden som tjener som templat, leses
alltid i 3’-5’-retning, og dattertråden
syntetiseres i 5’-3’-retning
5’
3’
Nytt DNA dannes av DNA polymeraser
• På 1950-tallet begynte en å lete
etter enzymer som kunne
syntetisere DNA. Det første av
disse ble renset fra E. coli, og
ble kalt DNA polymerase I.
• Dette er fremdeles den best
karakteriserte DNA
polymerasen, og det har vist seg
at virknings-mekanismen til
dette enzymet har mange
likhetstrekk med alle kjente
DNA polymeraser.
• Enzymet katalyserer et
nukleofilt angrep av oksygen på
3’-OH enden av en voksende
DNA tråd mot 5’-P i en
innkommende nukleotid
OH 3’
5’ P
A
T
P
P
T
A
P
P
G
C
3’ HO
O O O
O P O P O PO
O O O
P
G
C
HO
P
A
P
C
DNA polymerase I
P
G
P
Replikasjonsmaskineriet er komplisert
«Unormale» baser i DNA
• I tillegg til A, T, C og G, vil både prokaryot og eukaryot DNA
inneholde varierende mengder av «unormale» baser. Mange av disse
basene kan oppstå som følge av genotoksiske agens, men mange kan
også dannes spontant, eller inkorporeres under DNA replikasjon.
• Enkelte baseendringer kan også induseres enzymatisk i cellene. De to
viktigste av disse er metylering og deaminering
DNA metylering.
• I 1898 oppdaget man en ny nukleotide i DNA i tuberkelbakterien,
og kalte denne tuberkulin.
• Dette viste seg senere (1925) å
være 5-metylcytosin (5-meC). I
1948 ble 5-meC også påvist i
DNA hos pattedyr.
C
5-meC
Metyltransferaser
DNA metylering i bakterier
• C og A i bakterie-DNA kan
metyleres av metyltransferaser
• 5-meC, 4meC, 6-meA: Fungerer bla som forsvarssystem, da
bakteriene motvirker virusangrep ved å «kutte» viralt DNA med
enzymer kalt restriksjonsendonukleaser. Mange av disse er
metyleringssensitive, og vil derfor ikke angripe bakterienes eget
DNA.
• Metylering kan også
modulere virulens, DNAreplikasjon, DNAreparasjon og
genekspresjon.
DNA metylering hos pattedyr
• 60-90% av alle CpG-sekvenser hos
pattedyr er metylert, og dette utgjør er
en viktig del av den epigenetiske
reguleringen av genuttrykket
• Det epigenetiske metyleringsmønsteret er delvis arvelig, men også
dynamisk, da det bla. reprogrammeres etter fertilisering. Kjente
metyltransferaser metylerer C, men det har inntil nylig vært et
mysterium hvordan 5-meC kan demetyleres.
• I 2009 ble enzymatisk
dannelse av 5hydroksymetylcytosin (5hmC) oppdaget i humant
DNA, og at denne basen
også har en viktig
regulatorisk rolle (>600
artikler publ siden 2009)
DNA deaminering
• A, C og G har aminogrupper som kan tapes spontant, og derved
endre basenes baseparingsegenskaper. Den vanligste av disse er når
cytosin deaminerer og danner uracil (102-103/celle/døgn). Uracil vil
basepare mot adenin i stedet for guanin, og er derfor mutagen.
• 5-meC deaminerer også lett, og fører også til CT mutasjoner
mC
T
• Dette har gjennom evolusjonen ført til tap av CpG sekvenser fra
vertebrate genom.
DNA deaminering
• I 1999 ble enzymet Activation induced cytidine deaminase (AID)
oppdaget. En trodde først dette enzymet deaminerte C i RNA, men
det viste seg da at C i DNA er målet.
• AID uttrykkes i antigen-stimulerte B-celler, transporteres inn i
cellekjernen, og angriper målrettet immunglobulingenene ved å
deaminere C til U i Ig-genenes v- og s-regioner.
• Dette fører til mutasjoner og en kraftig økning i Ig-variabiliteten.
Pasienter med AID-mangel får derved defekt adaptivt
immunforsvar
• En har senere funnet at andre humane enzymer i samme familie
(APOBEC) kan deaminere C til U. Disse enzymene aktiveres ved
virusinfeksjon, og ser ut til å være en viktig del av det innate
immunforsvaret ved å initiere uracilering og degradering av viralt
DNA
• Ny forskning tyder imidlertid på at både AID og APOBEC-enzymer
kan foreta «untargeted» deaminering også i det humane genomet.
Hva er et gen?
• Genene er de fysiske og funksjonelle enhetene forbundet med
arv
• Gjennom det humane
genomprosjektet har en
funnet at mennesket
har ca 22 000 proteinkodende gener og at de
proteinkodende
sekvensene utgjør bare
ca 1-2% av genomet.
Proteinkodende gen
RNA
Protein
Hva med resten av DNAet?
• En kalte lenge DNAet mellom genene «junk DNA», og mente
dette hovedsakelig var evolusjonsmessig «skrap»
• I dag vet vi at store deler av dette DNAet uttrykker RNAmolekyler som aldri omsettes til protein, men som har flere
viktige regulatoriske funksjoner
• Nyere funn tyder faktisk på at RNA-molekyl kan være bærere
av arvelig informasjon også hos eukaryoter!
• En har f. eks funnet at Arabidopsisplanter (vårskrinneblom) kan «overkjøre»
bestemte gensekvenser arvet fra sine
foreldre, og revertere til sekvenser
funnet hos besteforeldregenerasjonen (i
ca 10% av avkommet)
• En tror dette har skjedd via gamle RNAfragment overført fra tidligere
generasjoner
Ulike typer RNA
• RNA (RiboNucleic Acid) har nesten samme grunnstruktur som
DNA, bortsett fra at sukkergruppen er ribose, i stedet for
deoksyribose – og at Tymin (T) er erstattet med Uracil (U).
• Selv om ikke RNA danner den klassiske dobbelhelixstrukturen,
kan basene danne basepar. Ulike RNA-molekyl kan derfor
opptre i svært komplekse strukturer.
• Hovedtyper RNA i cellen er:
– mRNA: Budbringer RNA
• (koder for proteiner)
– rRNA: Ribosomalt RNA
• (byggesteiner for ribosomer)
– tRNA: Transfer-RNA
• (”bærere” av aminosyrer)
– miRNA: mikro-RNA
• (viktig i genregulering)
– ncRNA: non-coding RNA
• (Funksjonelt viktig, diagnoseverktøy?)
RNA-molekyler kan danne
komplekse strukturer, som i
dette tRNA-molekylet
RNA-interferens og miRNA
• Nobelprisen i medisin i 2006 gikk til
Andrew Fire (Stanford) og Craig
Mellon (Univ. of Massachusetts) for
sin banebrytende oppdagelse av RNA
interferens.
• De fant i 1993 at korte, dobbelttrådete RNA molekyler sprøytet
inn i celler (kalte disse small inhibitory RNA, siRNA) kunne
redusere eller skru av uttrykket av gener.
• Senere er det funnet at tilsvarende RNA lages i cellene selv (kalles
micro RNA, miRNA). Hele 3% av våre gener koder for miRNA!
• Disse er viktige både for organismens utvikling, og de fysiologiske
funksjonene til både celler og vev.
Mekanisme
•
DROSHA kutter ved foten av dsRNA
hairpins laget i kjernen, og transporterer
disse til cytoplasma.
•
Her er proteinet DICER, som kutter dette
videre til korte siRNA/dsDNA fragment.
•
En del av DICER blir sittende på fragmentene, og
flere proteiner rekrutteres og danner et RISCkompleks, som fjerner den ene RNA-tråden
•
RISC-miRNA komplekset rekrutterer inn Argonautproteiner, og sammen vil komplekset gjenkjenne
komplementære mRNA, og kutte disse ved aktivering
av SLICER-aktiviteten i et av Argonaut-proteinene.
•
Det er beregnet at 10-30% av alle gener reguleres
ved miRNA-enten ved å regulere mengden mRNA,
eller ved å regulere translasjonen.
•
Det har også vist seg at serum/plasma inneholder
store mengder stabile miRNA, og at profilering av
disse kan være nyttige diagnoseverktøy, blant annet
for infeksjoner.
RISC
(
)
Isolering av DNA fra celler/vev
• Klassisk metode: Tidligere ble de fleste trinnene gjort manuelt, og
besto av mest mulig skånsomt å åpne cellene og løse DNAet.
Deretter ble det foretatt ulike trinn for å fjerne proteiner, RNA
og andre makromolekyler
• I dag utføres DNA-ekstraksjon med kits eller er robotisert. Disse
finnes i ulike varianter alt etter type startmateriale (bakterier,
gjær, planter, humane celler etc), mengde DNA som skal isoleres,
type DNA (kromosomalt, plasmid) og hvor høy grad av renhet som
trengs.
• I de fleste av disse kitene brukes ionebytterkromatografi – dvs.
en matrix som selektivt binder DNA, mens andre typer molekyler
vaskes ut.
• Måten DNAet er ekstrahert på kan ha stor betydning for hvordan
det skal analyseres i neste trinn. Endel vaske- og elueringsbuffere
som benyttes i ionebytter-basert DNA-isolering kan for eksempel
hemme enzymatiske reaksjoner.
• Eks: PCR av aktin-genet
fra humant placentalt
DNA,
• 50 ul reaksjon spiket
med ulike volum av
vaskeløsninger brukt i
forkjellige kit
• Ny ultra-rask DNAekstraksjon snart på
markedet (60 sek)?
Kontaminering i DNA isoleringskit
er også påvist
Isolering av RNA fra celler/vev
• De grunnleggende prinsippene er som for isolering av DNA. I tillegg må
en imidlertid ta hensyn til følgende:
– Hvilken type RNA skal isoleres? total-RNA, mRNA, miRNA etc.
– Hvor rent skal RNAet være? Fjerning av DNA nødvendig?
– Inneholder materialet mye RNAser? Hvor kritisk er det å inhibere
disse? For å unngå RNAser er det viktig at disse blir inhibert straks
cellene åpnes. Dette kan være vanskelig for celler som har en hard
cellevegg, f. eks gjær og gram-positive bakterier
• Anbefalte metoder
(Ambion)
Det fins flere måter å unngå nedbrytning av
RNA ved RNAser
• Prøven homogeniseres straks etter høsting i en buffer som
inneholder kaotrope forbindelser (f. eks. guanidin hydroklorid).
Disse okkuperer hydrogenbindingene på proteiner og forårsaker
denaturering av RNAser
• Prøvene fryses og knuses i flytende nitrogen (prøvene må være
små nok til at de fryser umiddelbart)
• RNAse-frie buffere etc (f. eks ved
DEPC-behandling), utstyr
(RNAZap), -spesifikke RNAseinhibitorer (Placental RNAse
inhibitor RNAsin, SUPERase-IN ,
RNAse-Out, Ribolock etc)
•
Placental RNAse
inhibitor og SUPERase
RNAlater (Ambion)
• Lagringsløsning som muliggjør lagring av celler/vevsprøver ved 4oC
over lengre tid før selve RNA-ekstraksjonen starter
• I de fleste tilfeller kan det samme materialet også brukes f. eks
for immunohistokjemiske analyser
Enzymatisk behandling av DNA/RNA
• De aller fleste protokoller for analyse av rensede nukleinsyrer
omfatter enzymatisk behandling. Noen av de vanligste enzymene som
benyttes er:
– DNA restriksjonsendonukleaser
– DNA/RNA ligaser
– DNA-avhengige DNA polymeraser (også termostabile)
– Templat-uavhegige DNA polymeraser (terminal transferase)
– RNA-avhengige DNA polymeraser (revers transkriptase)
– Fosfataser og kinaser (CIP,SAP, T4 polynukleotid kinase etc)
– Eksonukleaser (S1, mung bean, DNAse I etc)
• I dag er det et stort kommersielt marked og en lang rekke
leverandører av disse enzymene, og gode protokoller, samt egnede
reaksjonsbuffere følger som regel med enzymene.
• Grunnleggende protokoller med rekasjonsmekanismer finnes også i f.
eks. Current Protocols in Molecular Biology (Wiley)
Sekvensering av DNA
• For å kunne gjøre funksjonelle studier av DNA, er det
nødvendig å kjenne DNA-sekvensen. Inntil for ca 10 år
siden vas Sanger-sekvensering dominerende.
• Enzymatisk sekvensering (Sanger 1977, 1980)
Manuell
– Rask, men sensitiv for ”vanskelige” DNA strukturer”. Benytter
DNA polymerase for å syntetisere DNA, og dideoxy-dNTP for
å stoppe forlengelsen. Bruk av alternative polymeraser har
gjort strukturproblematikken mindre viktig
– Metoden har blitt kraftig automatisert
Automatisert
Next generation sequencing
• Etter ferdigstillingen av det humane genom i år 2000 har nye
teknologier blitt utviklet som har revolusjonert effektiviteten i DNA
sekvensering
Next generation sequencing
• Noe som har redusert kostnadene kraftig
Next generation sequencing
• Det finnes nå en rekke teknologier på markedet, med ulike egenskaper,
leselengder, hurtighet og kostnader involvert
What’s next?
• Nanoteknologi kan gi det neste store spranget i sekvenseringshastighet.
Her har Oxford Nanopores utviklet nanopore-sekvensering.
• Hvis selskapet lykkes med kommersialiseringen av denne teknologien,
vil det teoretisk kunne øke dagens sekvenseringshastighet nærmest
ubegrenset
• I tillegg vil den ha teoretisk potensiale til å detektere ulike
basemodifikasjoner direkte
• Teknologien har også potensiale for å kunne sekvensere proteiner!
Sekvenserte genom
• Siden 1995 er ca 10 000 genom sekvensert
• De fleste av disse er fra prokaryoter, og svært mange er humane
patogener
• Mer informasjon om- og linker til sekvenserte genom kan finnes på
– http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome
• En rekke firma har spesialisert seg på å lage array for å detektere
ulike grupper av patogener
• Eks:
• Luminex: ulike virus i luftveiene
• Autogenomics: luftveisvirus, HPV,
mykobakterier etc
• Akonni, TessAree, Veredus:
Influensavirus
• De fleste av disse arrayene
inneholder opptil 100 prober, og er
altså ikke egnet for mer
dyptpløyende analyser
• Andre har utviklet array med mye høyere antall prober, som
ViroChip, GreeneChip og LLMDA (Lawrence Livermore Microbial
Detection Array)
Et omfattende metoderepertoar
Konklusjon?
Dypsekvensering ser ut til å vinne terreng over andre teknologier når
det gjelder mikrobiologisk identifikasjon og kvantitering
Men:
Den teknologiske utviklingen skjer så raskt at det er vanskelig å spå hva
som blir fremtidens dominerende metoder
Nyhetsoppdatering kan blant annet finnes her
http://rapidmicromethods.com/