MOLEKYLÆR EPIDEMIOLOGI Mikrobiologiske metoder for undersøkelse av utbrudd av infeksjonssykdommer Kåre Bergh Avdeling for mikrobiologi, St.Olavs Hospital Institutt for laboratoriemedisin, barne- og kvinnesykdommer, NTNU Mars 2015 EVALUERING AV TYPING SYSTEMER Hovedpunkter: • TYPBARHET: UTVETYDIG POSITIVT RESULTAT • REPRODUSERBARHET: - “PERFORMANCE” AV TESTEN - STABILITET I MIKROORGANISMEN • DISKRIMINATORISK STYRKE: EVNEN TIL Å DISKRIMINERE MELLOM IKKE-RELATERTE ISOLATER INGEN METODE VIL OPPFYLLE ETHVERT BEHOV! PGA: HOVEDGRUNNER (OFTE I KOMBINASJON): • INADEKVAT DISKRIMINERING • TILGJENGELIGHET AV REAGENSER • INTRA- AND INTERLABORATORIE REPRODUSERBARHET • HVORDAN KVANTITERE DE(N) GENETISKE RELASJONER MELLOM ISOLATENE? TO HOVEDSPØRSMÅL: 1. KORT-TIDS- / LOKAL EPIDEMIOLOGI fokus: variasjoner som opptrer raskt/hyppig 2. LANG-TIDS- / GLOBAL EPIDEMIOLOGI variasjoner som akkumuleres langsomt (fortrinnsvis nøytrale mht seleksjonspresset) mer diskriminatorisk ved å kombinere ulike loci To hovedkategorier av metoder: 1) Fenotypiske metoder 2) Genotypiske metoder Fenotypiske metoder VANLIG BRUKTE FENOTYPISKE METODER: • BIOTYPING • ANTIBIOGRAM • SEROTYPING • FAG TYPING • IMMUNOBLOTTING • MULTILOKUS ENZYM ELEKTROFORESE • MALDI-TOF: IKKE DEFINERT ENDELIGE POTENSIAL Karakterisering av fenotypiske metodser (noe subjektivt) FENOTYPISK METODE REPRODUSERBARHET DISKRIMINATORISK STYRKE BIOTYPING ANTIBIOGRAM BRA BRA DÅRLIG DÅRLIG SEROTYPING PHAGE TYPING IMMUNO BLOTTING MULTILOCUS ENZYME ELEKTROPHORESIS GOD BRA UTMERKET UTMERKET BRA DÅRLIG GOD GOD GENOTYPISKE METODER * PLASMID PROFILANALYSE * RESTRIKSJONS ENDONUKLEASE ANALYSE (FINGERPRINTING) * RIBOTYPING * PCR & RESTRIKSJONSFRAGMENT ANALYSE * “RANDOMLY AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA” (RAPD) * “AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM” (AFLP) * PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) * VARIABLE NUMBER OF TANDEM REPEATS (VNTR) - inkl Multilocus variable number …= MLVA * SEKVENSERINGS BASERTE ANALYSER - MULTILOCUS SEQUENCE TYPING (MLST) - SINGLE LOCUS SEQUENCE TYPING (e.g.spa-TYPING) - WHOLE GENOME SEQUENCING (WGS) PLASMIDPROFIL ANALYSE • ISOLERING AV PLASMID  ELFO +/- RESTRIKSJONSFRAGMENT ANALYSE • PREMISS: PLASMID +, HELST > 2 PROBLEM: TAPES ELLER ERVERVES OVER TID • BEST ANVENDBARHET VED UTBRUDD BEGRENSET OVER TID OG OMRÅDE • BRA DISKRIMINATORISK STYRKE FINGERPRINTING RESTRIKSJONS ENDONUKLEASE ANALYSE RESTRIKSJONSENZYMER SOM KUTTER HYPPIG  HUNDREVIS AV FRAGMENTER KOMPLEKSE PROFILER (RESOLUSJON /OVERLAPPING) PLASMID(ER) VIL INFLUERE DNA FINGERPRINTING SOUTHERN BLOT ANALYSIS (KROMOSOMALT DNA) • RESTRIKSJONSFRAGMENT  EL.FO  BLOTTE TIL MEMBRAN • MERKET DNA FRAGMENT SOM PROBE  HYBRIDISERER TIL HOMOLOGE SEKVENSER I MATERIALET • VARIASJON I ANTALL OG STØRRELSE: RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORFISM (RFLP) MYE brukt moderne variant: RIBOTYPING: * POLYMORFISME ASSOSIERT MED RIBOSOMALE OPERONER PROBE: FRA KONSERVERTE REGIONER (VANLIGST FRA E.COLI) Ribotyping Available also as an automated system for identification and investigation of relatedness PCR-baserte metoder PCR: * POS eller NEGATIV ved å benytte spesifikke primere * RESTRIKSJONSFRAGMENT ANALYSER AV PCR-PRODUKTET * PCR + REVERS HYBRIDISERING – (EX.: “SPOLIGOTYPING” - DIRECT REPEATS (DR) MED SPACER REVERS LINE BLOT Line-Probe Assays GenoType Mycobacterium INNO-LIPA 15 Padilla et al. JCM, 2004, 44: 3083.88 Molekylærepidemiologi – Genotypingsteknikker: M.tuberculosis SPOLIGOTYPING (Spacer oligonucleotide typing) • DR-locus: DR (36bp) separert med unike ikke-repetitive spacersekvenser (43) • PCR med (biotinylerte) primere i DR • (Revers) Hybridisering med oligonukleotider komplementære til (43) spacer CDC Tuberculosis Genotyping Laboratory Procedures PCR-baserte metoder PCR: * POS eller NEGATIV ved å benytte spesifikke primere * RESTRIKSJONSFRAGMENT ANALYSER AV PCR-PRODUKTET * PCR + REVERS HYBRIDISERING – (EX.: “SPOLIGOTYPING” - DIRECT REPEATS (DR) MED SPACER PROBE) * PCR MED REPETITIVE ELEMENTER SOM TARGET * RANDOMLY AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (ARBITRARILY PRIMED PCR ) - USPESIFIKK BINDING AV EN SINGEL PRIMER - VARIASJON I ANTALL OG STØRRELSE AV PCR PRODUKTER PCR-based methods rep-PCR PrimerE rettet mot ”interspersed repetitive DNA elements present at characteristic locations in prokaryotic genomes” REP sequence 35-40 bp ERIC sequences 124-127 bp 154 BOX elements Mer standardiserte primere vs RAPD primere (Kommersielt tilgjengelige kits fins med gode resultater for visse bakteriearter, ex DiversiLab System, men mindre bra for andre) Photo:Lene Granbo & Kari Berg PCR-baserte metoder RANDOMLY AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA: (SYN: RAPD) * USPESIFIKK BINDING AV SINGEL PRIMER * VARIASJON I ANTALL OG STØRRELSE AV PCR PRODUKTENE RANDOMLY AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA: (SYN: RAPD) RAPD in three Neisseria meningitidis isolates: Effect of various annealing temperature in PCR Reproducibility of RAPD in three Neisseria meningitidis isolates tested on three different days Photo: Hanne Amdahl PCR-based methods RAPD: (syn Arbitrarily primed PCR) • OFTE KATEGORISERT SOM GOD (MEN TVILSOM FRA VÅR ERFARING) • VARIABILITET STERKT INFLUERT AV DE EKSPERIMENTELLE BETINGELSER AFLP:Amplified Fragment Length Polymorphism AFLP:Amplified Fragment Length Polymorphism 1. DNA restriction 2. Ligation of adapters 3. Preselective PCR 4. Selective PCR 1. DNA restriction Purified genomic DNA is typically digested with one rare and one frequently cutting restriction enzyme. 2. Ligating the adapters Complementary adaptors of known sequence are ligated to the restricted DNA ends. The ligated template DNA is now ready for PCR amplification 3. Preselective AFLP amplification PCR at high-stringent conditions To initially reduce the complexity of the adapted fragment population, PCR amplification is performed with primers complementary to the adaptor sequences, each with one selective nucleotide. Theoretically, assuming equal nucleotide frequencies, each additional base extending into the unknown region of DNA should reduce the number fragments generated by 4n where n = the number of additional bases. The population of preselective PCR-generated fragments consists primarily of those with the following sequence: 4. Selective PCR The preselective products are again amplified as before but one of the primers, with possibly multiple selective nucleotides, is now labeled with a fluorophore. Only fragments containing a priming site complementary to the fluorophore labeled primer will be visualized during dPAGE. The number of selective nucleotides required for optimum fragment distribution is highly dependent on the complexity of the target DNA which varies greatly among classes of organisms. AFLP Detection of fAFLP-products (capillary electrophoresis) Fordeler til AFLP: • Universell protokoll (DNA virus, G+/G- bakterier, intracellulære bakt, eukaryoter) • DNA sekvensen i målorganismen trenger ikke være kjent • Mange restriksjonsenzymer tilgjengelige • Antall og størrelse på fragmentene kan skreddersyes Forsiktighet som kreves ved AFLP: • Sterkt influert av DNA kontaminasjon • Ekstrem kontroll av stringensbetingelsene nødvendig for konstruksjon av databaser basert på AFLP båndmønster PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) • MAKRORESTRIKSJONS FRAGMENT ANALYSE SEPARERING AV STORE DNA FRAGMENTER (HELE BAKTERIEGENOMET) • RESTRIKSJONSENZYMER SOM KUTTER SJELDEN • SPESIELL ELECTROPHORESE TEKNIKK (for å gi 5-20 FRAGMENTS : ~ 10  800 kbp) •UTMERKET DISKRIMINATORISK STYRKE Electric current 18-20 hours electrodes buffer 14 C MRSA Ullevål 1993-97 BM Andersen et al, J Hosp Infection 1999, 41:123-32 SINGLE GENETIC EVENTS 600 400 250 150 100 50 GAIN OF RESTRICTION SITE SINGLE GENETIC EVENTS 600 500 400 250 150 100 50 LOSS OF RESTRICTION SITE SINGLE GENETIC EVENTS 600 400 200 100 50 INSERTION 100 kb SINGLE GENETIC EVENTS 600 400 100 70 50 DELETION 30 kb SINGLE GENETIC EVENTS 600 500 400 250 200 150 100 70 50 GAIN OF LOSS OF RESTRICTION SITE INSERTION 100 kb 2-3 BANDS DIFFERENCES DELETION 30 kb CATEGORY GENETIC DIFFERENCES BAND DIFFERENCES INTERPRETATION: PART OF OUTBREAK? IDENTICAL “indistinguishable” 0 0 YES CLOSELY RELATED 1 2-3 PROBABLY POSSIBLY RELATED 2 4-6 POSSIBLY DIFFERENT 7 NO 3 Tenover FC et al, J Clin Microbiol, 1995, 33:2233-9 MRSA Ullevål 1993-97 BM Andersen et al, J Hosp Infection 1999, 41:123-32 BAND-BASED SIMILARITY COEFFICIENTS SJ: a / a + b +c (Jaccard) SD: 2a / 2a + b +c (Dice) a= number of shared bands in strains 1& 2 b= number of unique bands in strain 1 c= number of unique bands in strain 2 SJ: 6 / 6 + 2 +1 = 6 / 9 = 0.67 No of bands: 8 No of shared bands : No of unique bands : 2 7 6 1 SD: 2 x 6 / 2 x 6 + 2 +1 = 12/15 =0.80 UWPGMA: Unweigthed pair group method with mathematical averages 1 vs 2: 0.80 3 vs 4: 0.88 1 vs 3: 0.63 1 vs 4: 0.63 2 vs 3: 0.80 2 vs 4: 0.75 1 2 3 4 50 % SIMILARITY UWPGMA: Unweigthed pair group method with mathematical averages 60 70 80 90 100 1 vs 2: 0.80 3 vs 4: 0.88 1 vs 3: 0.63 1 vs 4: 0.63 2 vs 3: 0.80 2 vs 4: 0.75 1 2 3 4 Hovedproblem PFGE • Teknisk krevende • Arbeidsintensivt • Tidsforbruk • Kan mangle resolusjonsevne for å skille nesten like store bånd 5 % • Noe subjektivt i tolkning • Viktige momenter mht kvalitetskontroll, standardisering og data portabilitet VNTR Variable Number Tandem Repeats Repeat unit: 1 – 100 bp Head – tail configuration - satellite DNA : > 100 bp ( rare in prokaryotes) - minisatellites : 11 -100 bp - microsatelittes : 1 - 10 bp Repetition unit and number of copies define size VNTR Typing I monomorfe arter: (ex: B.anthracis, Y.pestis, F.tularensis, M.tuberculosis) - konserverte sekvenser av repetisjonsenheten - PCR basert deteksjon - kopitallet på hvert locus definerer allelet Ex: B.anthracis vrrA vrrB1 vrrB2 vrrC1 12 bp 9 bp 9 bp 36 bp 2-6 repeats 15-23 11-15 4-12 5 alleles 5 5 6 VNTR Typing In monomorfic species: (ex: B.anthracis, Y.pestis, F.tularensis, M.tuberculosi - conserved - PCR based detection - the copy number of each locus defines the allele I polymorfe species: - sekvens variasjon innen repetisjonsenheten - sekvensering vil kunne øke antall typer - innholdet i repetisjonsenheten definerer typen MLVA : Multiple Locus VNTR Analysis Sammenligning av amplifikasjonsproduktstørrelsen av hvert VNTR target • • • • repetisjonsenheten størrelse antall kopier på mange loci Premiss: Identifisering av species- og locispesifikke primere Resolution of 27 GBS strains of ST17 Lindstedt et al. Eurosurveillance 2013;18(4): 24 Jan 2013 NUKLEOTID SEKVENSERING SAMMENLIGNING AV DNA SEKVENS FRA SAMME LOCUS • MUTASJONER VIL INFLUERE • POTENTIAL TIL Å BLI FOR DETALJERT - DESIGN VIKTIG Å VURDERE • STORT POTENSIAL • BRUKT EN DEL FOR VISSE SPECIES SPECIES MULTI-LOCUS SEQUENCE TYPING MULTILOCUS SEQUENCE TYPING - MLST • SEQUENCING OF A NUMBER OF “HOUSE-KEEPING GENES” : arc aro glp gmk pta tpi yqi (Carbamate kinase) (Shikimate dehydrogenase) (Glycerol kinase) (Guanylate kinase) (Phosphate acetyltransferase) (Triosephosphate isomerase) (Acetyle coenzyme A acetyltransferase) (These 7 apply for S.aureus !) MULTILOCUS SEQUENCE TYPING - MLST • SEQUENCING SEVERAL “HOUSE-KEEPING GENES” (typically 7) • TYPICALLY 450-500 bp • ANY VARIATION IS ASSIGNED A NEW ALLELIC NUMBER • COMBINATION OF ALLELES DEFINES THE SEQUENCE TYPE • Ex: 17 ALLELES AT 6 LOCI  24 MILL. STs THEORETICALLY • UNAMBIGUOUS RESULT IN ANY LAB. • PORTABLE  DATA EXPORTED TO UNIVERSAL DATABASES TILGJENGELIGE MLST DATABASER (pr mars 2015) ( http://www.mlst.net/) B.burgdorferi B.cereus B.henselae B.pseudomallei C.albicans C.glabrata C.krusei C.trachomatis C.tropicalis C.jejuni C.neoformans var grubii E.coli E.faecium E.faecalis H.influenzae H.pylori Leptospira spp. M.catharrhalis N.meningitidis P.acnes S.agalactiae S.aureus S.dysgalactiae S.enterica S.epidermidis S.pneumoniae S.pyogenes S.suis V.vulnificus MLST results usually presented as: • Dendrogram : Caution required in species with frequent recombinations • BURST (Based Upon Related Sequence Types) • Grouping of ST with > 6 (5?) identical alleles • Identification of ancestry - ”ancestor” eBURST Singel locus sekvens typing Ex: S.aureus VNTR typing; GAS emm typing Spa: 24 bp repetisjon i 3’-enden av Protein A -genet Coa: 81 bp repetisjon i 5’-enden av coagulase-genet Prinsippet ved spa-typing • Tandem repeats in 3´-end of spa gene – Variasjon i antall av repetisjoner – Variasjon i nukleotidsekvensen til de individuelle repetisjoner (21-30 nt) • Hver identifisert repetisjon gies en numerisk kode • Spa-type: utledes fra spesifikke antall og rekkefølgen av de funne repetisjoner Principle spa-typing OTHER METHODS • COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION - Several microarrays are available Immobilized Probes: pcr amplicons (>200bp) or oligonucleotides ( up to 70-mers) Target DNA : labelled and allowed to hybridize • OPTICAL MAPPING Principle: stretch of DNA on a microfluidic device  restriction endonuclease  fragments stained with intercalating fluorescent dye  length of fragments proportional to fluorescence intensity (may be coupled with Next Generation sequencing) • WHOLE GENOME SEQUENCING Large potential but several challenges exist GENOTYPISK METODE REPRODUSERBARHET PLASMID PROFIL FINGERPRINTING RIBOTYPING PCR -FINGERPRINTING ARBITR. PRIMED PCR PFGE AFLP VNTR NUCLEOTIDE SEQUENCE BRA GOD UTMERKET UTMERKET GOD (?) UTMERKET UTMERKET UTMERKET UTMERKET DISKRIMINERENDE STYRKE BRA BRA FAIR GOD GOD UTMERKET UTMERKET UTMERKET UTMERKET ”The clock speed” of the genetic variations observed is an important factor which has to be taken into account. Yet not completely resolved for every method applicable For S.aureus and VNTR vs other methods: PFGE > spa > coa > MLST (?) Local outbreaks / short term epidemiology Long term epidemiology / Global characterization Konklusjon: •Ingen metode idell for ethvert formål •Pros & contras må tas i betraktning Meget god, overordnet oversikt kan finnes i: Sabat et al, Eurosurveillance. Vol 18, Issue 4, 24 January 2013 MOLECULAR EPIDEMIOLOGY METHODS IN MICROBIOLOGY FOR : • INVESTIGATION OF OUTBREAK OF INFECTIOUS DISEASES • DELINEATION OF STRAIN IDENTITY 5 biopsier (No 1-5) og 1 skrap fra protesen (No 6) 1 2 4 5 3 6 Biopsi 3: 5 fenotypisk ulike KNS I II III IV V clindamycin R R R R R penicillin R R R R R oxacillin R S S S R erythromycin R R R R R cefotaxim R S S S R → PFGE: 1-2 bånd forskjeller - samme klon! Simpsons’s Diversity Indices Simpsons’s Index (D) measures the probability that two individuals randomly selected from a sample will belong to the same species D= ∑ n(n-1) _________ N(N-1) n=number of organisms of a particular sp N = total number of organisms of all spp Simpsons Index of Diversity: 1-D