1. No category

(12) Oversettelse av
europeisk patentskrift
NORGE
(19)
(11) NO/EP 2328875 B1
NO
(51) Int Cl.
C07D 235/18 (2006.01)
A61K 31/454 (2006.01)
A61P 17/18 (2006.01)
C07D 207/444 (2006.01)
C07D 263/56 (2006.01)
C07D 403/02 (2006.01)
C07D 403/04 (2006.01)
C07D 403/12 (2006.01)
C07D 403/14 (2006.01)
Patentstyret
(21)
Oversettelse publisert
2015.03.23
(80)
Dato for Den Europeiske
Patentmyndighets
publisering av det meddelte
patentet
2014.10.15
(86)
Europeisk søknadsnr
09798808.3
(86)
Europeisk innleveringsdag
2009.07.17
(87)
Den europeiske søknadens
Publiseringsdato
2011.06.08
(30)
Prioritet
2008.07.17, US, 81585 P 2009.03.09, US, 158569 P 2009.05.15, US, 178570 P
(84)
Utpekte stater
AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR
HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL
PT RO SE SI SK SM TR
(73)
Innehaver
University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education, 200
Gardner Steel Conference Center Thackeray & O'Hara Streets,
Pittsburgh, PA 15260, USA
(72)
Oppfinner
WIPF, Peter, 135 Techview Terrace, Pittsburgh, Pennsylvania 15213, USA
FRANTZ, Marie, Celine, 4609 Bayard Street Apt 771, Pittsburgh, Pennsylvania
15213, USA
(74)
Fullmektig
Tandbergs Patentkontor AS, Postboks 1570 Vika, 0118 OSLO, Norge
(54)
Benevnelse
SPESIFIKKE NITROKSIDAGENTER
(56)
Anførte
publikasjoner
JIANG JIANFEI ET AL: "Structural requirements for optimized delivery, inhibition of oxidative stress, and
antiapoptotic activity of targeted nitroxides", JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL
THERAPEUTICS, AMERICAN SOCIETY FOR PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS,
US, vol. 320, no. 3, 1 March 2007 (2007-03-01) , pages 1050-1060, XP009095061, ISSN: 0022-3565, DOI:
10.1124/JPET.106.114769CARLOS A MACIAS ET AL: "Treatment With a Novel Hemigramicidin-TEMPO
Conjugate Prolongs Survival in a Rat Model of Lethal Hemorrhagic Shock", ANNALS OF SURGERY, J.B.
LIPPINCOTT COMPANY, PHILADELPHIA, US, vol. 245, no. 2, 1 February 2007 (2007-02-01), pages 305314, XP008144683, ISSN: 0003-4932, DOI: 10.1097/01.SLA.0000236626.57752.8E
MACIAS, CARLOS A. ET AL.: 'Treatment With a Novel Hemigramicidin-TEMPO Conjug ate Prolongs
Survival in a Rat Model of Lethal Hemorrhagic Shock' ANNALS OF SURGERY vol. 245, no. ISS.2, February
2007, pages 305 - 314, XP008144683 FINKA, MITCHELL P. ET AL.: 'HemigramicidinTEMPO conjugates:
Novel mitochondr ia-targeted anti-oxidants' BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY vol. 74, no. ISS.6, 15
September 2007, pages 801 - 809, XP022192420 US-A1- 2007 161 544 US-A1- 2007 161 573
PETER WIPF ET AL: "Convergent Approach to ( E )-Alkene and Cyclopropane Peptide Isosteres",
ORGANIC LETTERS, vol. 7, no. 1, 1 January 2005 (2005-01-01) , pages 103-106, XP55018692, ISSN:
1523-7060, DOI: 10.1021/ol0477529 PETER WIPF ET AL: "Mitochondrial Targeting of Selective Electron
Scavengers: Synthesis and Biological Analysis of Hemigramicidin-TEMPO Conjugates", JOURNAL OF THE
AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 127, no. 36, 1 September 2005 (2005-09-01), pages 12460-12461,
XP55018693, ISSN: 0002-7863, DOI: 10.1021/ja053679l
2
Beskrivelse
[0001] I dette dokumentet beskrives hittil ukjente blandinger og sammensetninger av
en substans som består av en nitroksidgruppe-inneholdende last (eller en "nitroksid5
inneholdende gruppe") og en mitokondrier-spesifiserende gruppe (eller "spesifikk
gruppe"). Den spesifiserende gruppen er ment å ha, uten noen intensjon om å være
bundet, evnen til å selektivt levere sammensetningen til mitokondrier, ved å levere
antioksidanten og den frie-radikal-fjernende aktiviteten til nitroksidgruppen til celler,
inkludert, men ikke begrenset, til en berikelse i mitokondrier. Disse sammensetningene
10
er generelt nyttige for sin anti-oksidant og sin evne til å fjerne frie-radikaler, og mer
spesifikt, for eksempel og uten begrensning, for deres radiobeskyttende evner og
forebygging samt demping av degenerative sykdommer.
[0002] Oksideringsstress i celler manifesterer seg vanligvis ved å generere reaktive
15
oksygenarter ("ROS") og reaktive nitrogenarter ("RNS"). Spesifikt genererer den
cellulære respirasjonsbanen ROS og RNS innen cellens mitokondrielle membran, se
Kelso et al., Selective Targeting of a Redox-active Ubiquinone to Mitochondria within
Cells: Antioxidant and Antiapoptotic Properties, J Biol Chem. 276:4588 (2001).
Reaktive oksygenarter inkluderer frie radikaler, reaktive anioner som inneholder
20
oksygenatomer og molekyler som inneholder oksygenatomer som enten kan produsere
frie radikaler eller som aktiveres kjemisk av dem. Spesifikke eksempler inkluderer
superoksidanion, hydroksylradikal og hydroperoksider. I mange sykdomstilstander er
den normale responsen på ROS- og RNS-generering svekket.
25
[0003] Naturlig forekommende enzymer, som f.eks. superoksid-dismutase ("SOD") og
katalase, redder ROS- og RNS-radikaler slik at normal metabolsk aktivitet kan skje.
Betydelige avvik fra cellehomeostase, som hemoragisk sjokk, fører til oksidativ
stresstilstand og forårsaker dermed "elektronlekkasje" fra den mitokondrielle
membranen. Denne "elektronlekkasjen" produserer en overflødig mengde ROS som
30
cellenes naturlige oksidanter ikke kan kompensere for. Spesifikt kan ikke SOD
tilrettelegge for den overflødige produksjonen av ROS tilknyttet hemoragisk sjokk som
til slutt fører til tidlig mitokondriell dysfunksjon og celledød via apoptose, se Kentner
3
et al., Early Antioxidant Therapy with TEMPOL during Hemorrhagic Shock Increases
Survival in Rats, J Trauma Inj Infect Crit Care., 968 (2002).
[0004] Kardiolipin ("CL") er en anionisk fosfolipid som finnes eksklusivt i den indre
5
mitokondrielle membranen til eukaryotiske celler, se Iverson, S. L. and S. Orrenius,
The cardiolipincytochrome c interaction and the mitochondria) regulation of apoptosis,
Arch Biochem. 423:37-46 (2003). Under normale forhold er det pro-apoptotiske
protein-cytokromet C forankret i den mitokondrielle indre membranen ved binding
med CL, se Tuominen, E. K. J., et al. Phospholipid cytochrome c interaction: evidence
10
for the extended lipid anchorage, J Biol Chem., 277:8822-8826 (2002). Acyl-delene av
CL er mottakelig for peroksidering fra reaktive oksygenarter. Når ROS er generert
innen mitokondrier i overflødige mengder, kan cytokrom C bundet til CL fungere som
en oksidase og fremkaller omfattende peroksidering av CL i den mitokondrielle
membranen, se Kagan, V. E. et al., Cytochrome c acts as a cardiolipin oxygenase
15
required, for release of proapoptotic, factors, Nat Chem Biol. 1:223-232 (2005), også
Kagan, V. E. et al., Oxidative lipidomics of apoptosis: redox catalytic interactions of
cytochrome c with cardiolipin and phosphatidylserine, Free Rad Biol Med. 37:19631985 (2005).
20
[0005] Peroksideringen av CL svekker bindingen mellom CL og cytokrom C, se
Shidoji, Y. et al., Loss of molecular interaction between cytochrome C and cardiolipin
due to lipid peroxidation, Biochem Biophys Res Comm. 264:343-347 (1999). Dette
fører til frigjøring av cytokrom C inn i det mitokondrielle intermembrane rommet, og
induserer celledød. Videre har peroksideringen av CL den effekten at den åpner den
25
mitokondrielle permeabilitetens overgangspore ("MPTP"), se Dolder, M. et al.,
Mitochondria creatine kinase in contact sites: Interaction with porin and adenine
nucleotide translocase, role in permeability transition and sensitivity to oxidative
damage, Biol Sign Recept., 10:93-111 (2001), og Imai, H. et al., Protection from
inactivation of the adenine nucleotide translocator during hypoglycaemia-induced
30
apoptosis by mitochondria/ phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase,
Biochem J., 371:799-809 (2003). I tillegg sveller den mitokondrielle membranen opp
og frigjør cytokromet C i cytosolen. Overflødig cytokrom C i cytosol fører til cellulær
4
apoptose, se Iverson, S. L. et al. The cardiolipincytochrome c interaction and the
mitochondria regulation of apoptosis, Arch Biochem Biophys. 423:37-46 (2003).
[0006] Videre kan den mitokondrielle dysfunksjonen og celledøden til slutt føre til
5
multiorgansvikt på tross av gjenopplivingsforsøk eller ekstra oksygentilførsel, se
Cairns, C., Rude Unhinging of the Machinery of Life: Metabolic approaches to
hemorrhagic Shock, Curr Crit Care., 7:437 (2001). I tillegg er det et behov på feltet for
en antioksidant som fjerner ROS, og dermed reduserer det oksidative stresset.
Reduksjon av oksidativt stress forsinker, og til og med hindrer, fysiologiske tilstander
10
som ellers kan oppstå, som f.eks. surstoffmangel.
[0007] Det er også behov for å forbedre permeabiliteten til antioksidanters penetrering
av den cellulære membranen. En av begrensningene for SOD er at den ikke enkelt kan
penetrere cellemembranen. Men, nitroksidradikaler, som f.eks. TEMPO (2,2,6,615
tetrametylpiperidin-N-oksyl) og dens derivater, har vist seg å penetrere
cellemembranen bedre enn SOD. Videre hindrer nitroksidradikaler som, for eksempel
og uten begrensning, TEMPO dannelsen av ROS, spesielt superoksid, på grunn av
deres reduksjon av den mitokondrielle elektrontransportkjeden til hydroksylaminradikalfjernere, se Wipf, P. et al., Mitochondria targeting of selective electron
20
scavengers: synthesis and biological analysis of hemigramicidin-TEMPO conjugates, J
Am Chem Soc.127:12460-12461. På samme måte kan selektiv levering av TEMPOderivater kan føre til en terapeutisk fordelaktig reduksjon av ROS og kan forsinke eller
hindre celledød på grunn av reduksjon av oksidativt stress på cellen.
25
[0008] Selektiv levering kan oppnås ved bruk av en rekke forskjellige baner, f.eks. ved
at en biologisk eller kjemisk del som har en spesifikk målsekvens for penetrering av
cellemembranen, som til slutt tas opp av den mitokondrielle membranen. Selektiv
levering av en nitroksid SOD-mimikk til den mitokondrielle membranen har vist seg å
være vanskelig. På samme måte er det et behov på feltet for effektiv og selektiv
30
levering av antioksidanter som spesifikt retter seg mot mitokondrier og deres
membraner, samt det inter-membrane rommet, for å bidra til reduksjon av ROS- og
RNS-arter. Antioksidantene bidrar også til å hindre cellulær og mitokondriell
5
apoptotisk aktivitet som ofte skyldes økte ROS-arter, se Kelso et al., Selective
Targeting of a Redox-active Ubiquinone to Mitochondria within Cells: Antioxidant and
Antiapoptotic Properties, J Biol Chem., 276: 4588 (2001). Eksampler på mitokondrierspesifiserte antioksidanter er beskrevet i de amerikanske patentutgivelsesnr.
5
20070161573 og 20070161544.
[0009] Det gjenstår et svært reellt behov for en blanding og tilknyttede metoder for
levering av forskjellig typer innhold til mitokondrier. I én legemliggjøring beskrives en
blanding som består av membranaktive peptidylfragmenter som har en høy affinitet
10
med mitokondrier koblet til innhold. Innholdet kan velges fra en stor gruppe
kandidater. Det er et behov for blandinger og metoder for effektiv behandling av en
tilstand som forårsakes av overflødig mitokondrieproduksjon av ROS og RNS i den
mitokondrielle membranen. Det er også behov for blandinger som kan beskytte celler
og vev i dyr mot strålingsskade.
15
Strålingseksponering
[0010] De biologiske konsekvensene av eksponering for ioniserende stråling (IR)
inkluderer genomisk ustabilitet og celledød (Little JB, Nagasawa H, Pfenning T, et al.
20
Radiation-induced genomic instability: Delayed mutagenic and cytogenetic effects of
X rays and alpha particles. Radiat Res 1997;148:299-307). Det antas at radiolytisk
genererte radikaler er hovedårsaken til skade fra IR. Direkte radiolyse av vann og de
sekundære reaktive mellomproduktene med en kort levetid (10-10-10-6 sekunder)
demper de kjemiske reaksjonene som utløser skade på cellulære makromolekyler,
25
inkludert DNA og proteiner, samt fosfolipider i membraner (Mitchell JB, Russo A,
Kuppusamy P, et al. Radiation, radicals, and images. Ann N Y Acad Sci 2000;899:2843). DNA antas å være hovedmål for det radikale angrepet, som fører til enkle og doble
DNA-trådbrudd (Bryant PE. Enzymatic restriction of mammalian cell DNA: Evidence
for double-strand breaks as potentially lethal lesions. Int J Radiat Biol 1985;48:55-60).
30
For å opprettholde den genomiske integriteten, aktiveres flere baner for DNAreparasjon og cellesyklus-sjekkpunktkontoll aktiveres i respons til strålingsindusert
DNA-skade (Elledge SJ. Cell cycle checkpoints: Preventing an identity crisis. Science
6
1996;274:1664-1672). Svikt i disse reparasjons- og regulativsystemene fører til
gentoksisitet, ondartet transformasjon og celledød (Sachs RK, Chen AM, Brenner DJ.
Proksimitetseffekter i produksjonen av kromosomavvik ved ioniserende stråling. Int J
Radiat Biol 1997;71:1-19).
5
[0011] En av hovedmekanismene i IR-indusert celledød er apoptose, vanligst realisert
gjennom en mitokondrie-avhengig indre bane (Newton K, Strasser A. Ionizing
radiation and chemotherapeutic drugs induce apoptosis in lymphocytes in the absence
of Fas or FADD/MORT1 signaling. Implications for cancer therapy. J Exp Med
10
2000;191:195-200). Det siste inkluderer permeabilisering av mitokondrier etterfulgt av
frigjøringen av cytokrom (cyt) C og andre proapoptotiske faktorer (Smac/Diablo [andre
mitokondrie-avledet aktivator av caspase /direkte hemmer av apoptose-bindende
protein med lav pI], EndoG [endonuclease G], Omi/HtrA2 og AIF [apoptoseinduserende faktor]) inn i cytosolen, som hovedhendelsene i utførelsen av
15
dødsprogrammet. Den frigjorte cyt C tilrettelegger dannelsen av apoptomer ved å
samhandle med apoptotisk protease-aktiverende faktor 1 (Apaf-1) og rekrutterer og
aktiverer deretter procaspase-9 og utløser proteolytiske kaskaden som til slutt fører til
celle-nedbryting. Frigjøringen av proapoptotiske faktorer og caspase-aktivering
spesifiserer starten av ikke-reverserbare faser med apoptose. Derfor ble det lagt ned
20
betydelig innsats for å finne et legemiddel som hindrer disse hendelsene, spesielt for
den mitokondrielle skaden som representerer et viktig punkt der det ikke er noen vei
tilbake (Szewczyk A, Wojtczak L. Mitochondria as a pharmacological target.
Pharmacol Rev 2002;54:101-127). De eksakte mekanismene i cyt C-frigjøring fra
mitokondrier er imidlertid fortsatt ikke godt klarlagt. Det ble påstått at generering av
25
reaktive oksygenarter (ROS), sannsynligvis ved hjelp av avbrutt elektrontransport, har
en avgjørende rolle i å fremme cyt C-frigjøring fra mitokondrier (Kowaltowski AJ,
Castilho RF, Vercesi AE. Opening of the mitochondrial permeability transition pore by
uncoupling or inorganic phosphate in the presence of Ca2+ is dependent on
mitochondrial-generated reactive oxygen species. FEBS Lett 1996;378:150-152). Det
30
er verdt å merke seg at ROS kan indusere mitokondrimembran-permeabilisering både
in vito og in vivo, og den mitokondrielle membranens overgangspore har vist seg å
7
være redoks-sensitiv (Kroemer G, Reed JC. Mitochondrial control of cell death. Nat
Med 2000;6:513-519).
[0012] Omvendt, kan antioksidanter og reduktanter, overuttrykk av manganese5
superoksid-dismutase (MnSOD) (Wong GH, Elwell JH, Oberley LW, et al. Manganous
superoxide dismutase is essential for cellular resistance to cytotoxicity of tumor
necrosis factor. Cell 1989;58:923-931), og thioredoksin (Iwata S, Hori T, Sato N, et al.
Adult T cell leukemia (ATL)-derived factor/human thioredoxin prevents apoptosis of
lymphoid cells induced by L-cystine and glutathione depletion: Possible involvement
10
of thiol-mediated redox regulation in apoptosis caused by pro-oxidant state. J Immunol
1997;158:3108-3117) forsinke eller hindre apoptose. Tidligere studier viser at tidlig i
apoptose, ble en mitokondrie-spesifikk fosfolid-kardiolipin (CL) transportert fra den
indre til den ytre mitokondrielle membranen og aktiverte cyt C til en CL-spesifikk
peroksidase (Fernandez MG, Troiano L, Moretti L, et al. Early changes in
15
intramitochondrial cardiolipin distribution during apoptosis. Cell Growth Differ
2002;13:449-455 og Kagan VE, Tyurin VA, Jiang J, et al. Cytochrome c acts as a
cardiolipin oxygenase required for release of proapoptotic factors. Nat Chem Biol
2005;1:223-232). Den aktiverte cyt C katalyserte videre oksideringen av CL ved å
bruke mitokondrielt generert ROS (Kagan VE, Tyurin VA, Jiang J, et al. Cytochrome c
20
acts as a cardiolipin oxygenase required for release of proapoptotic factors. Nat Chem
Biol 2005;1:223-232). Viktigst, oksidert CL er et viktig bidrag til frigjøring av cyt C
fra mitokondrier (Kagan VE, Tyurin VA, Jiang J, et al. Cytochrome c acts as a
cardiolipin oxygenase required for release of proapoptotic factors. Nat Chem Biol
2005;1:223-232 og Petrosillo G, Casanova G, Matera M, et al. Interaksjon mellom
25
peroksidert kardiolipin med mitokondrielle membraner fra rottehjerte: Induksjon av
permeabilitetsovergang og cytokrom C-frigjøring FEBS Lett 2006;580:6311-6316),
som kan skyldes endringer i mikromiljøet for interaksjonen mellom denne fosforlipiden
og cyt C (Ott M, Robertson JD, Gogvadze V, et al. Cytokrom C-frigjøring fra
mitokondrier skjer via en totrinnsprosess. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:1259-
30
1263 og Garrido C, Galluzzi L, Brunet M, et al. Mekanismer ved cytokrom Cfrigjøring fra mitokondrier. Cell Death Differ 2006; 13:1423-1433) og/eller deltakelse
av oksidert CL i form av mitokondriell permeabilitetsovergangspore (MTP) i
8
koordinasjon med Bcl-2 familieproteiner (Bid, Bax/Bak), samt adeninnukleotidtranslokator (ANT) og spenningsavhengig anionkanal (VDAC) (Petrosillo G, Casanova
G, Matera M, et al. Interaksjon mellom peroksidert kardiolipin med mitokondrielle
membraner fra rottehjerte: Induksjon av permeabilitetsovergang og cytokrom C5
frigjøring FEBS Lett 2006;580:6311-6316 and Gonzalvez F, Gottlieb E. Cardiolipin:
Setting the beat of apoptosis. Apoptosis 2007;12:877-885). I tillegg til deres viktige
rolle i den apoptiske signaleringsbanen ble også ROS implisert i fortsettelsen av
tilskuereffekten (Narayanan PK, Goodwin EH, Lehnert BE. Alpha particles initiate
biological production of superoxide anions and hydrogen peroxide in human cells.
10
Cancer Res 1997;57:3963-3971 og Iyer R, Lehnert BE. Factors underlying the cell
growth-related bystander responses to alpha particles. Cancer Res 2000;60:1290-1298)
og genomisk ustabilitet etter strålingseksponering (Spitz DR, Azzam EI, Li JJ, et al.
Metabolic oxidation/reduction reactions and cellular responses to ionizing radiation: A
unifying concept in stress response biology. Cancer Metastasis Rev 2004;23:311-322;
15
Limoli CL, Giedzinski E, Morgan WF, et al. Persistent oxidative stress in
chromosomally unstable cells. Cancer Res 2003; 63:3107-3111; og Kim GJ,
Chandrasekaran K, Morgan WF. Mitochondrial dysfunction, persistently elevated
levels of reactive oxygen species and radiation-induced genomic instability: A review.
Mutagenesis 2006;21:361-367). Dermed kan eliminering av ROS, spesielt dets
20
viktigste kilde, mitokondriell ROS, ved antioksidanter, være en viktig mulighet for å
utvikle radiobeskyttere og radiodempere. Beskyttelse av okisdanter mot IR har blitt
studert i mer enn 50 år (Weiss JF, Landauer MR. Radioprotection by antioxidants. Ann
N Y Acad Sci 2000;899:44-60).
25
[0013] En av de største mekanismene for ioniserende strålingsindusert celledød er
apoptose, oftest realisert gjennom en mitokondrie-avhengig indre bane. Oksidering av
kardiolipin katalysert med cytokrom ("cyt c"), frigjøring av cytokrom C og andre proapoptotiske faktorer til cytosol og påfølgende caspase-aktivering er hovedhendelsene i
utførelsen av dødsprogrammet som utpeker igangsettingen av ikke-reversible faser av
30
apoptose.
[0014] I Belikova, NA, et al., (Cardiolipin-Specific Peroxidase Reactions of
9
Cytochrome C in Mitochondria During Irradiation-Induced Apoptosis, Int. J. Radiation
Oncology Biol. Phys., Vol. 69, No. 1, pp. 176-186, 2007), ble en liten forstyrrende
RNA (siRNA) tilnærming brukt til å skape HeLa-celler med redusert innhold av cyt C
(14 %, HeLa 1.2-celler). Celler ble behandlet med γ-stråling (i doser på 5-40 Gy).
5
Lipidoksidering ble karakterisert ved elektrospray ioniseringsmassespektrometrianalyse og fluorescense høyytelses-væske-kromatografi-basert Amplex
Red-analyse. Frigjøring av proapoptotisk faktor (cyt C, Smac/DIABLO) ble oppdaget
av vestlig blotting. Apoptose ble oppdaget ved caspase-3/7 aktivering og
fosfatidylserin-eksternalisering. De viste at stråling forårsaket selektiv akkumulering av
10
hydroperoksider i kardiolipin (CL), men ikke i andre fosfolipider. HeLa 1.2 celler
responderte ved en lavere strålingsindusert akkumulering av CL-oksideringsprodukter
enn foreldre-HeLa-celler. Proporsjonalt redusert frigjøring av en proapoptotisk faktor,
Smac/DIABLO, ble oppdaget i cyt C-mangelfulle celler etter stråling. Caspase-3/7aktivering og fosfatidylserin-eksternalisering var proporsjonal til cyt C-innholdet i
15
celler. De konkluderte med at cytokrom C er en viktig katalysator av CL-peroksidering,
som er viktig for gjennomføring av det apoptotiske programmet. Denne nye rollen til
cyt C i strålingsindusert apoptose er avgjørende for utviklingen av nye radiobeskyttere
og radiosensibilisatorer.
20
[0015] Betydelig innsats innen legemiddeloppdagelse har blitt rettet mot forebygging
av disse hendelsene, spesielt den mitokondrielle skaden som representerer et viktig
ikke-reverserbart punkt. Selv om man fortsatt ikke helt forstår de eksakte
mekanismene, mener man at generering av reaktive oksygenarter (ROS) og oksidering
av kardiolipin via peroksidasefunksjon av cytokrom C/cardiolipin-komplekser spiller
25
en viktig rolle i fremmingen av cytokrom C-frigjøring fra mitokondrier. ROS superokside radikaler som dismuterer til H2O2 - mater peroksidasesyklusen og
tilrettelegger akkumulering av oksidert kardiolipin. Dermed er eliminering av
intracellulær ROS, spesielt dets viktigste kilde, mitokondriell ROS, ved elektron og
radikal-fjernere, en lovende mulighet for å utvikle radiobeskyttere og radiodempere.
30
Betydelige mengder forskning har blitt utført på feltet for strålingsbeskyttelse for å
bruke antioksidanter mot ioniserende stråling (Weiss et al. Radioprotection by
Antioxidants. Ann N Y Acad Sci 2000;899:44-60).
10
[0016] En ny klasse med antioksidanter, stabile nitroksidradikaler, har blitt foreslått
som potente radiobeskyttere grunnet mangfoldigheten ved deres direkte radikalfjernende egenskaper, samt katalytiske enzymaktige mekanismer (Saito et al. Two
5
reaction sites of a spin label, TEMPOL with hydroxyl radical. J Pharm Sci
2003;92:275-280; Mitchell et al. Biologically active metal-independent superoxide
dismutase mimics. Biochemistry 1990;29:2802-2807). TEMPOL (4-hydroksy-2,2,6,6tetrametylpiperidin-N-oksyl) er en nitroksid, og det har blitt utført omfattende
forskning på dens egenskaper som radiobeskytter in vitro og in vivo (Mitchell et al.
10
Nitroxides as radiation protectors. Mil Med 2002;167:49-50; Hahn et al. In vivo
radioprotection and effects on blood pressure of the stable free radical nitroxides. Int J
Radiat Oncol Biol Phys 1998;42:839-842. Mitchell et al. Inhibition of oxygendependent radiation-induced damage by the nitroxide superoxide dismutase mimic,
tempol. Arch Biochem Biophys 1991;289:62-70; Hahn et al. Tempol, a stable free
15
radical, is a novel murine radiation protector. Cancer Res 1992;52:1750-1753). På
nåværende tidspunkt er TEMPOL i kliniske prøver som en topisk strålingsbeskytter for
å hindre hårtap i løpet av kreft-strålebehandling. Selv om dette ser lovende og relativt
effektivt ut, setter de nødvendige høye millimolarkonsentrasjoner av TEMPOL,
hovedsakelig på grunn av dens dårlige partisjonering inn i celler og mitokondrier, en
20
grense for bredere bruksområder (Gariboldi et al. Study of in vitro and in vivo effects
of the piperidine nitroxide Tempol--a potential new therapeutic agent for gliomas. Eur
J Cancer 2003;39:829-837). I tillegg har det blitt demonstrert at TEMPOL må være
tilstede i løpet av stråling for å bruke sin radiobeskyttende effekt (Mitchell et al.
Radiation, radicals, and images. Ann N Y Acad Sci 2000;899:28-43; Mitchell et al.
25
Inhibition of oxygen-dependent radiation-induced damage by the nitroxide superoxide
dismutase mimic, tempol. Arch Biochem Biophys 1991;289:62-70), Dette antyder at de
beskyttende mekanismene for TEMPOL er begrenset til dets interaksjon med kortlevde
radiolytiske mellomprodukter produsert av stråling.
30
[0017] Tilstrekkelige konsentrasjoner av antioksidanter på områdene for generering av
frie radikaler er avgjørende for optimerte beskyttelsesstrategier. En stor del av
forskningen har indikert at mitokondrier er både primærkilde og hovedmål for ROS
11
(Gjennomgått i Orrenius S. Reactive oxygen species in mitochondria-mediated cell
death. Drug Metab Rev 2007;39:443-455). Faktisk har mitokondrier lenge vært ansett
som et viktig mål for legemiddeloppdagelse (Szewczyk et al., Mitochondria as a
pharmacological target. 221 Pharmacol. Rev. 54:101- 127; 2002; Garber K. Targeting
5
mitochondria emerges as therapeutic strategy. J. Natl. Cancer Inst. 97:1800-1801;
2005).
[0018] Kjemibaserte tilnærminger til spesifisering av blandinger til mitokondrier
inkluderer bruk av proteiner og peptider, samt festing av nyttelast til lipofiliske
10
kationiske blandinger, trifenylfosfoniumfosfat, sulfonylurea, antrcycliner og andre
agenter med beviste eller hypotetiske affiniteter for mitokondrier (Murphy MP.
Targeting bioactive compounds to mitochondria. Trends Biotechnol. 15:326-330; 1997;
Dhanasekaran et al., Mitochondria superoxide dismutase mimetic inhibits
peroxideinduced oxidative damage and apoptosis: role of mitochondrial superoxide.
15
Free Radic. Biol. Med. 157 39:567-583; 2005; Hoye et al., Targeting Mitochondria.
Acc. Chem. Res. 41: 87-97 (2008). På tidspunktet da dette skrives har det imidlertid
ikke blitt presentert noe bevis for at GS-nitroksider
OPPSUMMERING
20
[0019] Det gjenstår et svært reellt behov for en blanding og tilknyttede metoder for
levering av forskjellig typer innhold til mitokondrier. Her beskrives blandinger som
består av en spesifiserende gruppe og et innhold som er en nitroksid-inneholdende
gruppe og blandinger som består av sammensetningene. Som illustrert i eksemplene
25
under, brukes blandingene og sammensetningene som beskrives heri i profylaksis og
behandling av eksponering for ioniserende stråling, i anti-aldringsbehandlinger og,
generelt, i behandling av tilstander som har fordeler av behandling med antioksidanter.
Eksempler på disse blandingene gis under og i kravene.
30
[0020] For eksempel kan den effektive mitokondrielle konsentrasjonen av
mitokondrier-spesifiserte konjugerte nitroksider (-N-O●, -N-OH or N=O inneholdende
blandinger og grupper) mot γ-stråling økes opp til 1,000 ganger (og deres nødvendige
12
vevskonsentrasjoner kan reduseres 1,000 ganger fra 10 mM til 10 µM) sammenlignet
med foreldre-ikke-konjugerte nitroksider. Økning i mitokondrier fra mirokondrierspesifiserte nitroksider har blitt vist ved EPR-spektroskopi, samt ved MS-analyse av
deres innhold i mitokondrier som hentes fra celler som er inkubert med mitokondrier5
spesifiserte nitroksider. Levering av mitokondrier-spesifiserte nitroksider avhenger
ikke av potensialet til den mitokondrielle membranen. Derfor kan mitokondrierspesifiserte nitroksider akkumuleres ikke bare i intakt, men ogsp i avenergisert eller
skadet mitokondrier med lavt membranpotensial. Videre leveres mitokondrierspesifiserte nitroksidkonjugater til mitokondrier uten å påvirke den mitokondrielle
10
membranens potensial. Dermed svekker de ikke den viktigste mitokondrielle
funksjonen, energiproduksjonen, i celler. I tillegg gir de konjugerte nitroksidene en ny
viktig funksjon, beskyttelse etter stråling,
[0021] Som med andre nitroksider, kan konjugerte mitokondrier-spesifiserte
15
nitroksider potensielt senke blodtrykket og sympatetisk aktivitet. Den dramatisk
reduserte dosen av mitokondrier-spesifiserte nitroksider (rundt 1000-ganger),
sammenlignet med ikke-konjugerte foreldre-nitroksider kan være betydelig for de som
induserer bivirkninger.
20
[0022] Innholdet i den aktuelle oppfinnelsen er en blanding som har en struktur
der X er en av
og
25
13
R1 er hydrogen, C1-C6 rett eller forgreinet-kjede alkyl eller en C1-C6 rett eller forgrenet
kjede-alkyl som videre består av en fenyl (C6H5) gruppe, som er uerstattet eller er
metyl-, hydroksyl- eller fluoro-erstattet; R2 er hydrogen, C1-C6 rett eller forgreinetkjede alkyl, R4 is hydrogen, C1-C6 rett eller forgreinet kjede-alkyl, eller en C1-C6 rett
5
eller forgreinet kjede-alkyl som videre består av en fenyl (C6H5) gruppe som er
uerstattet eller er metyl-, hydroksyl- eller fluoro-erstattet; R3 er -NH-R5, -O-R5 eller CH2-R5, aog R5 er en -N-O●, -N-OH ellerr N=O inneholdende gruppe; R er -C(O)-R6, C(O)O-R6, eller -P(O)-(R6)2, der R6 is C1-C6 rett eller forgreinet kjede-alkyl eller C1-C6
rett eller forgreinet kjede-alkyl som videre består av en eller flere fenyl (-C6H5) grupper
10
som er uavhengig erstattet, eller metyl-, etyl-, hydroksyl- eller fluoro-erstattet eller en
blanding har strukturen
der X er en av
15
og
og
R1 er hydrogen, C1-C6 rett eller forgreinet kjede-alkyl, R4 er hydrogen, C1-C6 rett eller
forgreinet kjede-alkyl, eller en C1-C6 rett eller forgreinet kjede-alkyl som videre består
20
av en fenyl (C6H5) gruppe som er uerstattet eller er metyl-, hydroksyl- eller fluoroerstattet; R3 is -NH-R5, -O-R5 eller -CH2-R5, og R5 er en -N-O●, -N-OH or N=O
inneholdende gruppe; og R er -C(O)-R6, -C(O)O-R6, eller -P(O)-(R6)2, der R6 is C1-C6
rett eller forgreinet kjede-alkyl eller C1-C6 rett eller forgreinet kjede-alkyl som videre
består av en eller flere fenyl (-C6H5) grupper som er uavhengig erstattet, eller metyl-,
25
etyl-, hydroksyl- eller fluoro-erstattet.
14
KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGER
[0023]
Figur 1 gir ubegrensede eksempler på visse nitroksider. logP-verdiene ble estimert ved
5
bruk av nettkalkulatoren for molekylære egenskaper og legemiddel-likhet på
Molinspirations-nettstedet (www.molinspiration.com/cgi-bin/properties). TIPNO =
tert-butyl isopropyl fenylnitroksid.
Figur 2 gir eksempler på strukturer av visse mitokondrier-spesifikke antioksidantblandinger som refereres til heri, og strukturen på TEMPOL.
10
Figur 3 avbilder et eksempel på en syntetisk bane for TEMPO-hemigramicidinkonjugater.
Figur 4 viser en EPR-basert analyse av integrering og reduksjon av nitroxid-gramicidin
S-peptidyl-TEMPO konjugater i MECer.
Figur 5 viser en fluorescein-isotiocyanat-dekstran (FD4) avlesning som reflekterer
15
effekten av Gramicidin-S TEMPO-konjugater på mellomtarm-slimhinnens
permeabilitet hos rotter etter alvorlig sjokk. Dataen uttrykkes som en prosentandel av
relativ til den som ble observert i samtidig analyserte kontrollsegmenter som ble lastet i
løpet av sjokket med normal saltløsning. Figur 5A viser en FD4-avlesning for
TEMPOLL som brukes som en "positiv kontroll" for tarmslimhinnebeskyttelse-
20
analysen. Figur 5B viser en FD4-avlesning for TEMPO-konjugat XJB-5-5208 som
reflekterer tarmslimhinnebeskyttelse. Figur 5C viser en FD4-avlesning for XJB-5-125
som har TEMPO-nyttelast, men som ikke gir beskyttelse mot tarmbarriere-dysfunksjon
fremkalt av hemorrage. Figur 5C viser en FD4-avlesning for XJB-5-127 som mangler
TEMPO-nyttelast, og som ikke gir beskyttelse mot tarmbarriere-dysfunksjon fremkalt
25
av hemorrage. Figur 5E viser en FD4-avlesning for TEMPO-konjugat XJB-5-131 som
reflekterer tarmslimhinnebeskyttelse. Figur 5F viser en FD4-avlesning for XJB-5-133
som mangler TEMPO-nyttelast selv om den har samme hemigramicidin-mitokondrierspesifiserte deler som den mest aktive blandingen XJB-5-131. Figur 5G viser en FD4avlesning for XJB-5-197 som har TEMPO-nyttelast, men som ikke gir beskyttelse mot
30
tarmbarriere-dysfunksjon fremkalt av hemorrhage. Figur 5H viser en FD4-avlesning
for XJB-5-194 som mangler TEMPO-nyttelast, og som ikke gir beskyttelse mot
tarmbarriere-dysfunksjon fremkalt av hemorrhage.
15
Figur 6 viser grafiske representasjoner av effekten av nitroksidkonjugater på ActDindusert apoptose. Figur 6A er en grafisk fremstilling av superoksidproduksjon basert
på gjennomsnittlig fluorescence-intensitet fra 10000 mellomtarmceller. Figur 6B er en
grafisk fremstilling av fosfatidylserin (PS) eksternalisering som indikert av
5
prosentandelen av anneksin V-positive celler. Figur 6C er en grafisk fremstilling av
caspase-3-aktivitet som indikert av mengden av dens spesifikke, tilstedeværende
substrat, Z-DVED-AMC, in nmol/mg protein. Figur 6D er en grafisk fremstilling av
DNA-fragmentering som indikert av propidiumiodid-fluorescence. Figur 6E er en
grafisk fremstilling av PS-eksternalisering ved forskjellige konsentrasjoner av
10
blandingen 5a (som vist i figur 3). Figur 6F er en grafisk fremstilling av adenosintrifosfat (ATP) nivåer i mitokondrier i nærvær eller fravær av 5a eller 2-deksyglykose.
Figur 7 illustrerer effektene av intraluminal XJB-5-131 på hemorrhage-fremkalt
peroksidering av fosfolipider i tarmslimhinnen. Figur 7A er en grafisk fremstilling av
peroksidering av fosfatidylkolin ("PC"). Figur 7B er en grafisk fremstilling av
15
peroksideringaktivitet når det gjelder fosfatidyletanolamin ("PE"). Figur 7C er en
grafisk fremstilling av peroksideringaktivitet når det gjelder fosfatidylserin ("PS").
Figur 7D er en grafisk fremstilling av peroksideringaktivitet når det gjelder kardiolipin
("CL").
Figur 8 er en grafisk fremstilling av caspase 3- og 7-aktivitet som illustrerer effektene
20
av intraluminal XJB-5-131.
Figur 9 er en grafisk fremstilling av permeabilitet fra XJB-5-131 når det gjelder Caco2BBe menneskelige enterocytt-aktige monolag underlagt oksidativt stress.
Permeabiliteten av monolagrene uttrykkes som en klaring (pL●h-l●cm2).
Figur 10A er en grafisk fremstilling av effektene av intravenøs behandling med XJB-5-
25
131 på MAP (gjennomsnittlig arterietrykk, mm Hg) av mengder underlagt
volumkontrollert hemorrhagisk sjokk. Figur 10B er en grafisk fremstilling av effektene
av intravenøs behandling med XJB-5-131 på overlevelsessannsynligheten for mengder
underlagt volumkontrollert hemorrhagisk sjokk.
Figur 11A er en skjematisk fremstilling av en synteseprotokoll for JP4-039. Figur 11B
30
gir en synteserute for en blanding av formel 4 under.
Figur 12 viser at nitroksidkonjugat XJB-5-125 integreres inn i celler og mitokondrier
mye mer effektivt enn deres ikke-konjugerte 4-amino-TEMPO i mus-embryoniske
16
foreldreceller. (A) viser deres cellulære og mitokondrielle integreringseffektiviteter i
mus-embryoniske celler, og (B) viser representativt EPR-spektrum for nitroksider som
er gjenopprettet fra mitokondrier.
Figur 13 viser at nitroksidkonjugat XJB-5-125 beskytter mus-embryoniske celler mot
5
gammatråling-indusert superoksid-generering og kardiolipin-peroksidering. (A)
Superoksidgenerering. Celler ble eksponert for 10 Gy γ-stråling. XJB-5-125 (20 µM)
ble tilsatt til celler enten 10 min før eller 1 time etter stråling og fjernet etter 5 timers
inkubasjon. Cellene ble inkubert med 5 µM DHE i 30 min på de indikerte
tidspunktene. Etidium-fluorescence ble analysert ved bruk av et FACScan-
10
flytcytometer som leveres med CellQuest-programvaren. Gjennomsnittlig
fluorescence-intensitet fra 10 000 celler ble oppnådd ved bruk av et 585-nm-båndpassfilter. (B) Kardiolipin-oksidering. Kardiolipin-hydroperoksider ble fastsatt ved bruk av
fluorescent HPLC-basert Amplex Red-analyse. Den presenterte dataen er
middelverdier ± S.E. (n=3). *p<0.01 vs ikke-bestrålte celler; *p<0.01(0.05) vs bestrålte
15
celler uten XJB-5-125 behandling under samme forhold. Innlegget er en typisk 2DHPTLC-profil av fosfolipider fra celler.
Figur 14 viser at nitroksidkonjugat XJB-5-125 beskytter celler mot gammastrålingsindusert apoptose. (A) XJB-5-125 blokkerer γ-stråling-indusert akkumulering av
cytokrom C i cytosolen av mus-embryoniske celler. (B) Densitometriforholdet av
20
cytolrom c/aktin. Semikvantifisering av bånd ble utført av densitomtri ved bruk av
Labworks Image Acquisition and Analysis Software (UVP, Upland, CA). Nivået av
cytokrom C-frigjøring ble uttrykt som gjennomsnittlig densitometriforhold av
cytokrom C over aktin. (C) Dose (5, 10 g 20 µM) avhengig radiobeskyttende effekt fra
XJB-5-125 (forbehandling) på γ-stråling (10 Gy) indusert fosfatidylserin (PS)
25
eksternalisering. Etter 48 timer etter strålingsinkuberinger, ble cellene høstet og farget
med anneksin-V-FITC og propodiumiodid (PI) før flyt-cytometri-analyse. (D) Tid (2,
3, 4, 5, og 6 h) avhengig radiobeskyttende effekt av XJB-5-125 (20 μM) ved γ-stråling
(10 Gy) indusert PS eksternalisering (48 h etter bestråling) i mus-embryoniske celler.
(E) Effekt av XJB-5-125 ved γ-stråling (10 Gy) indusert PS eksternalisering i
30
menneskelig bronkial epitelcellelinje BEAS-2B-celler. Cellene ble behandlet med 5125 (5 eller 10 µM) før (10-min) eller etter (1-h) stråling. Eksternalisering av PS ble
analysert 72 t etter strålingseksponering. Den presenterte dataen er middelverdier ±
17
S.E. (n=3). *(&)p<0.01(0.05) vs bestrålte celler uten 5-125 behandling, #p<0.05 vs
celler som er forhåndsbehandlet med 5-125.
Figur 15 viser effekten av nitroksidkonjugat XJB-5-125 på gamma-strålingsdoseoverlevelseskurvene for mus-embryoniske celler. Cellene ble forbehandlet (10 min)
5
eller etterbehandlet (1 time) med XJB-5-125 (20 µM), som ble fjernet etter en 4 timers
inkubasjonsperiode. Den overlevende fraksjonen ble kalkulert som platingseffektiviteten av prøvene relativ til den fra kontrollen. Dataen ble satt inn i en enkeltpunktmultimålmodell ved bruk av SigmaPlot 9.0 (Systat-programvare). Den presenterte
dataen er middelverdier ± S.E. (n=3).
10
Figur 16 illustrerer effekten av GS-konjugert nitroksid, XJB-5-125, på gammastrålingsdosens overlevelseskurver på 32D cl 3 mus-hematopoietiske celler. Cellene
inkubert i XJB-5-125 eller Tempol hadde en økt Do (1.138 eller 1.209 Gy,
henholdsvis) sammenlignet med 32D cl 3 celler (0.797 Gy). Cellene som ble inkubert i
XJB-5-125 hadde en økt skulder på overlevelseskurven med en n av 18.24
15
sammenlignet med 5.82 for celler inkubert i tempol.
Figurer 17A og 17B er grafer som viser GS-nitroksidblandingen JP4-039 øker
overlevelsen for mus eksponert for 9.75 Gy total kroppsstråling.
Figur 18 er en graf som viser GS-nitroksidblandingen JP4-039 øker overlevelsen for
mus eksponert for 9.5 Gy total kroppsstråling.
20
Figur 19 er en graf som viser at GS-nitrokisd JP4-039 er en effektiv hematopoietisk
celle-strålingsdemper når den leveres 24 timer etter stråling.
Figur 20 er en graf som viser at JP4-039 er en effektiv demper av strålingsskade på
KM101 menneskelig beinmarg-stromal-celler.
Figur 21A viser resultater med oppdagelse av menneskelig celler i NOD/SCID mus-
25
beinmarg høstet 27 dager etter navlestrengblod transplantert I.V, som viser flytcytometrisk analyse og identifisering av menneskelig CD45+ (lysegrå) hematopoietiske
celler i NOD/SCID-mus BM etter stråling, proksimal boring i skinnebeinet (se under),
og menneskelig navlestrengsblod-injeksjon.
Figur 21Ber en fotomikrograf av et tverrsnitt gjennom et skinnebeinsår 7 dager etter
30
den kirurgiske konstruksjonen med en drillbit av et unikortikal sår på 2-mm diameter i
det laterale aspektet i skinnebeinet 2-mm under den proksimale epifyseplaten.
18
Figur 22 et en skjematisk tabell over et Bronaugh-diffusjonssystem for å studere in
vitro-transdermal fluks.
Figur 23 er en graf som viser levering av XJB-5-125 inn i musehus etter 24 timer.
Figur 24 viser en typisk EPR-spektra av GS-nitroksider registrert fra forskjellige
5
fraksjoner innhentet etter filtrering gjennom musehuden. 1- donorvæske, 2mottakervæske etter 6 timer med løsning A-filtrering, 3- mottakervæske eter 6 timer
med løsning B-filtrering, 4-hud etter 24 timers eksponering for løsning A. EPR-spektra
av GS-nitroksidradikaler i medium, eller hudhomogenater ble registrert i 28,5% av
acetronitril med tillegging av 2 mM K3Fe(CN)6
10
Figur 25 er en graf som viser kumulativ transdermal absorbering av XJB-5-125
gjennom musehud etter 24 timer.
Figurer 26A og 26B gir strukturer for blandinger JED-E71-37 og JED-E71-58,
henholdsvis.
Figur 27 viser en behandlingsparadigme for studie for å bestemme virkningen av XJB-
15
5-131 på alderen ved begynnelsen av aldring i progeroid Ercc1-/Δ mus. XJB-5-131 var
2 mg/kg laget av en 10 µg/µL grunnstamme i DMSO blandet med 50 µL med solsikkefrøolje og injisert intraperitonealt. Kontrollmus fra samme kull Ercc1-/Δ ble behandlet
med et likt volum med kun solsikke-strøolje, i en dobbeltblind tvillingsstudie.
Figur 28 er en oppsummerinstabell som vises effektene av behandling med XJB-5-131
20
("XJB" i denne figuren), relativ til kontroll (solsikkefrøolje) på alderen ved start (i
uker) av forskjellige indisier på aldring i Ercc1-/Δ mus, ved bruk av protokoll i figur 27.
Varigheten av behandlingen av mus i denne figuren var tre ganger i uken, med oppstart
ved 5 ukers alder og utover i livsløpet deres. Celler uthevet i XJB-kolonnen indikerer
en betydelig forsinkelse i starten av den aldersrelaterte degenerative endringen u mus
25
behandlet med XJB-relativ til isogeniske kontroller kun behandlet med bindemiddel.
Figur 29 er et stolpediagram som viser glykosaminoglykan (en ekstracellulær
matrisprotein som er avgjørende skivevedlikehold og fleksibilitet) innhold i
intervertebrale skiver i Ercc1-/Δ mus enten behandlet med XJB-5-131 ("XJB" i denne
figuren) eller bindemiddel (solsikkefrøolje) i henhold til protokollen som vises i figur
30
27. Varigheten av behandlingen av mus i denne figuren var tre ganger i uken, med
oppstart ved 5 ukers alder og utover i livsløpet deres.
19
Figur 30 viser bilder som viser effektene av (foto)aldring i Ercc1-/Δ mus enten
behandlet med XJB-5-131 (80 µg emulgert i en topisk krem) eller kun krem, i henhold
til protokollen som vises i figur 27. Varigheten av behandlingen av mus i denne figuren
var daglig i fem dager etter UV-stråling.
5
Figurer 31A-B er grafer som viser vekter som en funksjon for alder av (A) hann og (B)
hunn Ercc1-/Δ mus som enten er behandlet med XJB-5-131 eller bindemiddel
(solsikkefrøolje) i henhold til protokollen som vises i figur 27. XJB-5-131 forårsaker
ikke vekttap slik som parentalblandingen TEMPO.
Figur 32 viser fotomikrografer av SA-β galaktosidase (en markør av cellulær
10
senescence) farging i mus-embryonisk fibroblast ("MEF") celler laget av Ercc1-/- mus,
der MEF-celler enten ble behandlet med XJB-5-131 ("XJB" i denne figuren; 500 nM
oppløst i media) eller media alene kontinuerlig i 48 timer før fiksering og farging av
celler.
Figur 33 viser fotomikrografer av yH2AX immunofarging (en markør av DNA-
15
dobbelttråd-brudd og cellulær senescence) i mus-embryonisk fibroblast ("MEF") celler
laget av Ercc1-/- mus, der MEF-celler enten ble behandlet med XJB-5-131 ("XJB" i
denne figuren; 500 nM oppløst i media) eller media alene kontinuerlig i 48 timer før
fiksering og farging av celler.
Figur 34 er en graf som viser apoptose mus-embryonisk fibroblast ("MEF") celler laget
20
av Ercc1-/- mus, der MEF-celler enten ble behandlet med XJB-5-131 ("XJB" i denne
figuren; 500 nM oppløst i media) eller media alene kontinuerlig i 48 timer før fiksering
og farging av celler.
Figur 35 viser fotomikrografer som viser effektene av forskjellige doser med JP4-039
ved spredning og vekst av mus-embryonisk fibroblast ("MEF") celler laget av Ercc1-/-
25
mus. JP4-039 er ikke giftig for celler ved konsentrasjoner så høye som 10 µM.
Figur 36 viser fotomikrografer som viser effektene av forskjellige doser med JP4-039
ved spredning og vekst av mus-embryonisk fibroblast ("MEF") celler laget av villtypemus. JP4-039 er ikke giftig for celler ved konsentrasjoner så høye som 10 µM.
Figur 37 viser fotomikrografer som viser nivåer av p16, en markør for ikke-reverserbar
30
cellulær senescence i mus-embryonisk fibroblast ("MEF") celler laget av Ercc1--Δ mus, der MEF-celler enten ble behandlet med JP4-039 ("0-39" i denne figuren; 10µM
oppløst i media) eller media alene i 48 timer før fiksering og farging av celler.
20
Figur 38 viser fotomikrografer som viser cellespredning av primær mus-embryonisk
fibroblast ("MEF") celler laget av Ercc1-/- mus og og dyrket under forhold med
oksidativt stress (20% oksygen), der MEF celler enten ble behandlet med JED-E71-37,
JED-E71-58 91 uM oppløst i media), eller kun media i en varighet på 48 timer før
5
fiksering og farging av cellene.
Figur 39 viser fotomikrografer som viser γH2AX immunofarging (en markør av DNA
dobbelttråd-brudd og cellulær senescence) av mus-embryonisk fibroblast ("MEF")
celler laget av Ercc1--Δ mus og og dyrket under forhold med oksidativt stress (20%
oksygen), der MEF-celler enten ble behandlet med JED-E71-58 (1 µM oppløst i
10
media), eller kun media i en varighet på 48 timer før fiksering og farging av cellene.
Figur 40 er en skjematisk fremstilling som viser alternative design for
nitroksidanaloger,
Figur 41 er en skjematisk visning av en synteseprotokoll for forskjellige alternative
design av nitroksidanaloger.
15
Figur 42 er en skjematisk visning av en synteseprotokoll for en alternative nitroksid-del
av 1,1,3,3-tetrametylisoindolin-2-yloksyl (TMIO).
Figur 43 er en skjematisk visning av en synteseprotokoll for en alternative nitroksid-del
av 1-metyl 2-azaadamantan N-oksyl (1-Me-AZADO).
20
DETALJERT BESKRIVELSE
[0024] Som brukt her referer uttrykket "emne" til medlemmer av dyreriket inkludert,
men ikke begrenset til, mennesker. Uttrykket "reaktive oksygenarter" ("ROS")
inkluderer, men er ikke begrenst til, superoksid anion, hydroksyl og hydroperokside
25
radikaler.
[0025] En antioksidantbladning er definert heri som en blanding som reduserer
hastigheten av oksidasjonen av andre blandinger eller hindrer en substans i å reagere
med oksygen eller oksygeninneholdende blandinger. En blanding kan fastslås å være
30
en antioksidantblanding ved å vurdere dens evne til å redusere molekylær oksidering
og/eller cellulære følgesykdommer fra oksidativt stress, for eksempel, og uten
begrensning, evnen til å redusere lipidperoksidering og/eller redusere oksidativ skade
21
på proteiner eller nukleinsyre. I en legemliggjøring har en antioksidant et nivå av
antioksidantaktivitet mellom 0.01 og 1000 ganger antiokdisantaktiviteten til
askorbinsyre i minst en analyse som måler antioksidantaktivitet.
5
[0026] Gitt heri er blandinger og sammensetninger som består av en spesifiseringsgruppe og et innhold, som f.eks. en nitroksid-inneholdende gruppe. Innholdet kan være
hvilken som helst sammensetning, som f.eks. amtioksidant, noe som er velkjent på de
medisinske og kjemiske feltene. Lasten kan bestå av en faktor som har en antikikrobiell
aktivitet. For eksempel kan spesifiserende grupper være krysskoblet til antibakterielle
10
enzymer, som f.eks. lysozym, eller antibiotika, som f.eks. penicillin. Andre metoder for
å feste de spesifiserende gruppene til et innhold er velkjente på feltet. I en
legemliggjøring er innholdet en antioksidant, som f.eks. en nitroksid-inneholdende
gruppe. I en annen legemliggjøring kan innholdet som transporteres av mitokondrierselektiv spesifiserende agenter inkludere en hemmer av NOS-aktivitet. Innholdet kan
15
ha en egenskap valgt fra gruppen som består av antioksidant, radiobeskyttende,
beskyttende, anti-apoptotisk, terapeutisk, forbedrende, NOS-antagonisk og
kombinasjoner av dette. I en annen legemliggjøring kan innholdet ha evnen til å hindre
nitrogensoksid-syntaseenzym-aktivitet. En rekke forskjellig innhold kan brukes i
sammensetningen som beskrives heri. Ikke-begrensende eksempler på innhold
20
inkluderer: 2-amino-6-metyl-thiazineubikinon-analog, en ubikinon-analogfragmentdel,
en ubikinon-analogfragmentdel som mangler en hydrofilisk hale, en superoksid
dismutase etterligning, en superoksid dismutase bioetterligning eller en salen-manganblanding.
25
[0027] Selv om genereringen av ROS i små mengder er et typisk biprodukt av den
cellulære respirasjonsbanen, visse tilstander, inkludert en sykdom eller annen
medisinsk tilstand, kan oppstå i pasienten når mengden ROS er overflødig til det
punktet der de naturlige enzym-mekanismer ikke kan fjerne mengden av ROS som
produseres. Derfor er sammensetninger, blandinger og metoder som fjerner reaktive
30
oksygenarter som er tilstede innen den mitokondrielle membranen av cellen nyttig og
beskrives heri. Disse sammensetningene, blandingene og metodene kan fjerne en
22
overflødig mengde ROS som blir produsert som naturlig forekommende enzymer SOD
og catalase, blant andre, ikke klarer å håndtere.
[0028] I en annen ikke-begrensende legemliggjøring har blandingen strukturen:
5
der X er en av
og
10
og
R1, og R4 er, uavhengig, hydrogen, C1-C6 rett eller forgreinet-kjede alkyl, som
alternativt inkluderer en fenyl (C6H5) gruppe, som alternativt er metyl-, hydroksyleller fluoro-erstattet, inkludert: metyl, etyl, propyl, 2-propyl, butyl, t-butyl, pentyl,
heksyl, benzyl, hydroksybenzyl (f.eks., 4-hydroksybenzyl), fenyl og hydroksyfenyl, R2
15
er hydrogen, C1-C6 rett eller forgreinet-kjede alkyl R3 er -NH-R5, -O-R5 eller -CH2-R5,
der R5 er en -N-O●, -N-OH or N=O inneholdende gruppe. I en legemliggjøring er R3
(1-Me-AZADO eller 1-metyl 2-azaadamantan N-oksyl). I en annen legemliggjøring er
R3
20
23
(TMIO; 1,1,3,3-tetrametylisoindolin-2-yloksyl).
R er -C(O)-R6, -C(O)O-R6, eller -P(O)-(R6)2, der R6 is C1-C6 rett eller fogreinet-kjede
alkyl som alternativt består av en eller flere fenyl (-C6H5) grupper og at alternativt er
metyl-, etyl-, hydroksyl- eller fluoro-erstattet, inkludert Ac (Acetyl, R =-C(O)-CH3),
5
Boc (R=-C(O)O-tert-butyl), Cbz (R=-C(O)O-benzyl (Bn)) grupper. R kan også være en
difenylfosfatgruppe som er,
R=
Ekskludert fra dette er enantiomeren XJB-5-208. I visse legemliggjøringer er R1 t-butyl
10
og R2 og R4 er H;
15
[0029] Som brukt heri, hvis ikke annet er indikert, for eksempel i en struktur, består
alle blandinger og/eller strukturer som er beskrevet heri alle mulige stereoisomere,
individuelt eller blandinger av disse.
[0030] Som indikert over er R5 en -N-O●, -N-OH eller -N=O inneholdende gruppe
20
(ikke -N-O●, -N-OH eller -N=O alene, men grupper som inneholder disse delene, som
f.eks. TEMPO, etc, som beskrevet heri). Som kjent for personer med normal kunnskap
på feltet, er nitroksid og nitroksid-avledninger, inkludert TEMPOL og tilknyttede
24
TEMPO-avledninger stabile radikaler som kan motstå biologiske miljøer. Derfor kan
tilstedeværelsen av 4-amino-TEMPO, TEMPOL eller an annen nitrokisd-"nyttelast"
innen mitokondrie-membranen fungerer som en effektiv og virkningsfull
elektronfjerner for ROS som blir produsert innen membranen. Ikke-begrensende
5
eksempler på dette inkluderer TEMPO (2,2,6,6-Tetrametyl-4-piperidin 1-oksyl) og
TEMPOL (4-Hydroksy-TEMPO), der, når de innlemmes i blandingen som beskrives
heri, for eksempel når R3 er -NH-R5, -O-R5:
10
[0031] Ekstra ikke begrensende eksempler på -N-O●, -N-OH eller N=O inneholdende
grupper beskrives i tabell 1 og i figur 1 /fra Jiang, J., et al. (Structural Requirements for
Optimized Delivery, Inhibition of Oxidative Stress, and Antiapoptotic Activity of
Targeted Nitroxides, J Pharmacol Exp Therap. 2007, 320(3):1050-60). En person med
normal kunnskap på feltet vil kunne konjugere (kovalent feste) hvilken som helst av
15
disse blandingene til resten av blandingen ved bruk av vanlige koblere og/eller
konjugasjonskjemier, som f.eks. kjemiene som beskrives heri. Tabell 1 beskriver et
ikke-begrensende utdrag fra en liste med over 300 identifiserte kommersielt
tilgjengelige -N-O●, -N-OH eller N=O inneholdende blandinger som kan være nyttige i
fremstillingen av blandingene eller sammensetningene som beskrives heri.
20
Tabell 1 - Kommersielt tilgjengelig -N-O●, -N-OH eller N=O inneholdende grupper.
Struktur
Navn
Trimetylamin N-Oksid
VAS
Nr.
118478-7
N,N-Dimetyldodekylamin N-
1643-
Oksid
20-5
25
Struktur
Navn
VAS
Nr.
7059280-2
N-Benzoyl-N-Fenylhydroksylamin
N,N-Dietylhydroksylamin
304-881
371084-7
1416527-6
N,N-Dibenzylhydroksylamin
621-078
Di-Tert-Butylnitroksid
240625-9
N,N-Dimetylhydroksylamin
16645-
Hydroklorid
06-0
Metobromuron
Benzyl-Di-Beta-Hydroksyetylamin-N-Okside
306089-7
26
Struktur
Navn
Bis(Trifluorometyl)Nitroksid
Trimetylamin N-Oksid
N-Metoksy-N-Metylkarbamat
N,N-Bis(2-kloro-6-Fluorobenzyl)N-[(([2,2-Dikloro-1-(1,4Thiazinan-4-yl+)etyliden]
amino)karbonyl)oksy]amin
VAS
Nr.
215471-4
268745-8
691962-6
27
Struktur
Navn
Tri-N-Oktylamin N-Oksid
VAS
Nr.
1310304-3
Dietyl (N-Metoksy-N-
124931-
Metylkarbamoylmetyl)Fosfonat
12-0
N-Metoksy-N-Metyl-2(Trifenylfosforanyliden
e)Acetamid
12998667-0
N-Metoksy-N-Metyl-N'-[5-Okso2-(Trifluorometyl)-5hkromeno[2,3-B]Pyridi+ N-3Yl]Urea
N-[(4-klorobenzyl)Oksy]-N-([5Okso-2-fenyl-1,3-Oksazol-4(5h)Yliden]Metyl+ )Acetamid
N-Metylfurohydroksamisk syre
N,N-Dimetylnonylamin N-Oksid
10953196-6
253613-2
28
Struktur
Navn
N-(Tert-Butoksykarbonyl)-L-
VAS
Nr.
87694-
Alanin N'-Metoksy-N'-Metylamid 49-3
1-(4-Bromofenyl)-3-(Metyl([3(Trifluorometyl)Benzoyl]
Oksy)Amino)-2-Prop+ En-1-One
2-([[(Anilinokarbonyl)Oksy](
Metyl)Amino]Metylene)-5-(4klorofenyl)-1,3+ Sykloheksanedion
N-Metoksy-N-Metyl-2(Trifluorometyl)-1,8-Nafthyridin3-karboksamid
N-Metoksy-N-Metyl-Indol-6karboksamid
29
Struktur
Navn
VAS
Nr.
Desferrioksamin
AKOS 91254
12740831-5
N-[(3s,4r)-6-Cyano-3,4-Dihydro3-Hydroksy-2,2-Dimetyl-2h-1-
127408-
Benzopyran-4-Y+ L]-N-
31-5
Hydroksyacetamid
N-Metoksy-N-Metyl-1,2-Dihydro4-Okso-Pyrrolo[3,2,1Ij]Quinoline-5-Carboxa+ Mide
Fr-900098
2,2'-(Hydroksyimino)Bis-Ethan-
133986-
svovelsyre Dinatrium Salt
51-3
30
Struktur
Navn
VAS
Nr.
Fmoc-N-Etyl-Hydroksylamin
Bis(N,NDimetylydroksamido)Hyd
roksooksovanadat
Pyraclostrobin
1-Boc-5-kloro-3-(Metoksy-Metylkarbamoyl)Indazol
N-Metoksy-N-Metyl-Thiazol-2karboksamid
17501318-0
31
Struktur
Navn
VAS
Nr.
4,4-Difluoro-N-Metyl-N-MetoksyL-Prolinamid Hcl
3-Fluoro-4(Metoksy(Metyl)karbamo
yl)fenylborsyre
1-Isopropyl-N-Metoksy-N-Metyl1h-Benzo[D][1,2,3]Triazole-6karboksamid
(Trans)-2-(4-klorofenyl)-NMetoksy-NMetylsyklopropanekarboksamid
Bicyclo[2.2.1]Heptan-2karboksylsyre MetoksyMetylAmid
Akos Bc-0582
91383559-3
46723506-9
32
Struktur
Navn
3-(N,ODimetylhydroksylaminocar
bonyl)fenylborsyre, Pinacol Ester
1-Triisopropylsilanyl-1hPyrrolo[2,3-B]Pyridin-5karboksylsyre Metoksy+ -MetylAmid
[0032] I henhold til en legemliggjøring har blandingen strukturen
5
eller strukturen
VAS
Nr.
33
der R er -NH-R1, -O- R1 or -CH2- R1, og R1 er en -N-O●, -N-OH eller N=O
inneholdende gruppe. I en legemliggjøring er R -NH-R1, og i en annen er R -NHTEMPO.
5
[0033] I en annen ikke-begrensende legemliggjøring har blandingen strukturen:
Der X er en av
10
og
og R1 R1 er hydrogen, C1-C6 rett eller forgreinet kjede-alkyl R er hydrogen C1-C6 rett
eller forgreinet kjede-alkyl, som valgfritt inkluderer en fenyl (C6H5) gruppe, som
alternativt er metyl-, hydroksyl- ellerr fluoro-erstattet, inkludert: metyl, etyl, propyl, 215
propyl, butyl, t-butyl, pentyl, heksyl, benzyl, hydroksybenzyl (f.eks., 4hydroksybenzyl), fenyl og hydroksyfenyl. R3 er -NH-R5, -O-R5 or -CH2-R5, der R5 er
en -N-O, -N-OH eller N=O inneholdende gruppe. I en legemliggjøring er R3
34
(1-Me-AZADO eller 1-metyl 2-azaadamantan N-oksyl). I en annen legemliggjøring er
R3
(TMIO; 1,1,3,3-tetrametylisoindolin-2-yloksyl).
5
R er -C(O)-R6, -C(O)O-R6, eller -P(O)-(R6)2, der R6 is C1-C6 rett eller forgreinet-kjede
alkyl som alternativt består av en eller flere fenyl (-C6H5) grupper og at alternativt er
metyl-, etyl-, hydroksyl- eller fluoro-erstattet, inkludert Ac (Acetyl, R =-C(O)-CH3),
Boc (R=-C(O)O-tert-butyl), Cbz (R=-C(O)O-benzyl (Bn)) grupper. R kan også være en
difenylfosfatgruppe, dvs.,
10
R=
[0034] I en ikke-begrensende legemliggjøring har blandingen en av strukturene
15
I en annen ikke-begrensende legemliggjøring, har blandingen strukturen
der R4 er hydrogen eller metyl.
[0035] Blandingene som beskrives over, som f.eks. blandingen av formel 1, kan
20
syntetiseres ved bruk av hvilken som helst nyttig metode. Blandingen JP4-039 ble
syntetisert ved bruk av metoden i eksempel 8. I en legemliggjøring beskrives en
35
metode for å lage en blanding av formel 1. Blandingene syntetiseres ved bruk av
følgende trinn:
A. reagere en aldehyd av struktur R1-C(O)-, der for eksempel og uten begrensning, R1
er C1-C6 rett eller forgreinet-kjede alkyl, som alternativt inneholder en fenyl (C6H5)
5
gruppe, som alternativt er metyl-, hydroksyl- eller fluoro-erstattet, inkludert: metyl,
etyl, propyl, 2-propyl, butyl, t-butyl, pentyl, heksyl, benzyl, hydroksybenzyl (e.g., 4hydroksybenzyl), fenyl og hydroksyfenyl, med (R)-2- metylpropan-2-sulfinamid for å
danne en imin, f.eks.
10
B. reagere en terminal-alkyn-1-ol (HCC-R2-CH2-OH), der for eksempel og uten
begrensning, R2 ikke er til stede eller er en forgreinet eller rettkjedet alkylen, inkludert
metyl, etyl, propyl, etc., med et tert-butyl difenylsilansalt for å produsere en alkyn, for
eksempel
15
C. reagere (ved hydrozirkonisering) alkynen med iminen i nærvær av en
organozirkonium-katalysator for å produsere en alken, for eksempel
D1. asylere alkenen til å produsere karbamat, for eksempel
20
der, for eksempel og uten begrensning, R3 er C1-C6 rett eller flergreinet-kjede alkyl,
36
som alternativt inkluderer en fenyl (C6H5) gruppe, som alternativt er: metyl, etyl,
propyl, 2-propyl, butyl, t-butyl, pentyl, heksyl, benzyl, hydroksybenzyl (e.g., 4hydroksybenzyl), fenyl og hydroksyfenyl;
D1. alternativt syklopropanere alkenen og deretter asylere alkenen til å produsere
5
karbamat, for eksempel
der, for eksempel og uten begrensning, R3 er C1-C6 rett eller flergreinet-kjede alkyl,
som alternativt inkluderer en fenyl (C6H5) gruppe, som alternativt er: metyl, hydroksyleller fluoro-erstattet, inkludert metyl, etyl, propyl, 2-propyl, butyl, t-butyl, pentyl,
10
heksyl, benzyl, hydroksybenzyl (e.g., 4-hydroksybenzyl), fenyl og hydroksyfenyl;
E. fjerne t-butyldifenylsilyl-gruppen fra karbamatet for å produsere en alkohol, for
eksempel
F. oksidere alkoholen for å produsere en karboksylsyre, for eksempel
15
og
37
G. reagere karboksylsyre med en nitroksid-inneholdende blanding som består av en
hydroksyl eller amin i kondensreaksjon for å produsere antiokisdantblandingen, for
eksempel
5
der R4 er -NH-R4 eller -O-R4, og R4 er en -N-O●, -N-OH eller N=O inneholdende
gruppe, som beskrevet over.
[0036] En blanding beskrives som har strukturen R1-R2-R3 der R1 og R3 er en gruppe
10
som har strukturen -R4-R5, der R4 er en mitokondrie-spesifiserende gruppe og R5 er NH-R6, -O-R6 eller -CH2-R6, der R6 er en -N-O●, -N-OH eller N=O inneholdende
gruppe som f.eks. TEMPO. R1 og R2 kan være samme eller forskjellige. På samme
måte kan R4 og R5 for både R1 og R3 være samme eller forskjellig. R2 er en kobler
som, i en ikke-begrensende legemliggjøring, er symmetrisk. Figur 26A og 26B avbilder
15
to eksempler på slike komponenter. I en legemliggjøring har R1 og R2 strukturen som
vises i formlene 1, 2 eller 3, over, med alle grupper som definert over, inkludert
strukturer A, A1, A2 A3, D, D1, D2 og D3, over, et eksempel som er blanding JEDE71-58, som vises i figur 26B. I en annen legemliggjøring er R1 og R2, uavhengig, en
gramicidinavledning, for eksempel, som i blandingen JED-E71-37, som vist i figur
20
26A. Eksempler på gramicidinderivater beskrives heri, som f.eks. XJB-5-131 og XJB5-125 (se figur 2), og er videre beskrevet både strukturelt og funksjonelt i de
amerikanske patentutgivelsesnr. 20070161573 og 20070161544 samt i Jiang, J, et al.
(Structural Requirements for Optimized Delivery, Inhibition of Oxidative Stress, and
Antiapoptotic Activity of Targeted Nitroxides, J Pharmacol Exp Therap. 2007,
25
320(3):1050-60, se også, Hoye, AT et al., Targeting Mitochondria, Acc Chem Res.
2008, 41(1):87-97, se også, Wipf, P, et al., Mitochondrial Targeting of Selective
38
Electron Scavengers: Synthesis and Biological Analysis of Hemigramicidin-TEMPO
Conjugates, (2005) J Am Chem Soc. 2005, 127:12460-12461). TXJB-blandingene kan
kobles til en dimer, for eksempel og uten begrensning, ved reaksjon med nitrogen i
BocHN-gruppene (f.eks. som i XJB-5-131), eller med en amin, hvis de er til stede, for
5
eksempel, hvis en eller flere amingrupper i blandingen ikke er asylert for å danne en
amid (som. f.eks. NHBoc eller NHCbx).
[0037] In Jiang, J, et al. (J Pharmacol Exp Therap. 2007, 320(3):1050-60), ved bruk av
en modell med ActD-indusert apoptose mus-embryoniske celler, undersøkte forfatterne
10
et bibliotek av nitroksider for å utforske strukturaktivitet-forholdene mellom deres
antioksidant/anti-apoptotiske egenskaper og tre-dimensjonale (3D)-struktur. Høy
hydrofobitet og effektiv mitokondrier-integrering ble ansett som nødvendig, men ikke
tilstrekkelig for høy antiapoptotisk/antioksidant-aktivitet av en nitroksidkonjugat. Ved
å designe konformasjonelt preorganiserte peptidylnitroksidkonjugater og karakterisere
15
deres 3D-struktur eksperimentelt (sirkulær dikroisme og NMR) og teoretisk
(molekylære dynamikker), fastslo de at nærværet av β-turn/β-sheet sekundær struktur
er avgjørende for den ønskede aktiviteten. Monte Carlo-simuleringer i modeller av den
lipide membranen bekreftet at konservering av D-Phe-Pro-reversrunden i hemi-GSanaloger sikrer den spesifikke plasseringen av nitroksid-delen ved den mitokondrielle
20
membranens grensesnitt og maksimerer deres beskyttende effekter. Denne kunnskapen
om strukturaktivitetens forhold med nitroksid-peptid og -peptid isostere-konjugater er
nyttig i utviklingen av nye mekanisme-basert terapeutisk effektive agenter, som de som
beskrives heri.
25
[0038] Målgruppe R4 kan være et membranaktiv peptidfragment som er avledet fra et
antibiotisk molekyl som fungerer ved å rettes mot den bakterielle celleveggen.
Eksempler på slike antibiotika inkluderer: bacitraciner, gramicidiner, valinomyciner,
enniatiner, alameticiner, beauvericin, serratomolid, sporesmolid, tyrocidiner,
polymyksiner, monamyciner og lissoklinum-peptider. Det membranaktive
30
peptidfragmentet som er avledet fra et antibiotikum kan inkludere den fullstendige
antibiotiske polypeptiden, eller deler av denne som har membran, og fortrinnsvis
mitokondrier-spesifiserende evner, som lett kan avgjøres, for eksempel, via cellulære
39
partisjoneringseksperimenter ved bruk av radiomerkede peptider. Eksempler på nyttig
gramicidin-avledede membranaktive peptidfragmenter er Leu-D-Phe-Pro-Val-Orn og
D-Phe-Pro-Val-Orn-Leu hemigramicidin-fragmenter. Ettersom gramicidin er syklisk,
forventes alle hemigramicidin 5-mer å være nyttig som membranaktivt peptidfragment,
5
inkludert Leu-D-Phe-Pro-Val-Orn, D-Phe-Pro-Val-Orn-Leu, Pro-Val-Orn-Leu-D-Phe,
Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro og Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val (fra Gramicidin S). Alle mindre
fragmenter med gramicidin, eller til og med større fragmenter som inneholder gjentatte
gramicidin-sekvenser (f.eks., Leu-D-Phe-Pro-Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val-Orn-LeuD-Phe-Pro) forventes å være nyttige for membranspesifisering, og kan lett testes for
10
slik aktivitet. I en legemliggjøring består den gramicidin S-avledede peptiden av et βpunkt, som virker å overføre en høy affinitet for mitokondrier til peptiden.
DAvledninger av gramicidin, eller andre antibiotiske fragmenter, inkluderer isosterer
(molekyler eller ioner med samme antall atomer og samme antall valenselektron - som
et resultat kan de vise lignende farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaper),
15
som f.eks. (E)-alkene isosterer (se, amerikanske patentutgivelsesnr. 20070161573 og
20070161544 for eksempler på syntese-metoder). Som med gramicidin, er strukturen
(aminosyresekvensen) til bacitraciner, andre gramicidiner, valinomyciner, enniatiner,
alameticiner, beauvericin, serratomolid, sporidesmolid, tyrocidiner, polymyksiner,
monamyciner og lissoclinum-peptider alle kjente, og fragmenter av disse kan lett
20
fremstilles og deres membranspesifiseringsevner kan lett bekreftes av en person med
normal kunnskap på feltet.
[0039] Alken-isostere som f.eks. (E)-alken-isostere av gramicidin S (f.eks.,
hemigramicidin) ble brukt som en del av målsekvensen. Se figur 3 for en syntetisk
25
bane for (E)-alken-isostere og referansenummer 2 for den korresponderende kjemiske
strukturen. Først, hydrozirkonering av alkyn (Figur 3, blanding 1) med Cp2ZrHCl er
etterfulgt av transmetalasjon til Me2Zn og tilføring av N-Boc-isovaleraldimin. Den
resulterende blandingen (ikke vist) ble deretter opparbeidet ved bruk av en løsning med
tetrabutylammoniumfluorid ("TBAF") og dietyl-eter med 74% resultat. Den
30
resulterende blandingen ble deretter behandlet med eddiksyreanhydrid, triethylamin
(TEA) og 4-N,N1-(dimetylamino) pyridin ("DMAP") for å gi en blanding av
diastereomeriske allyliske amider med en 94 % resultat som ble separert via
40
kromotografi. Til slutt ble produktet opparbeidet med K2CO3 i metanol for å gi (E)alken, fremstilt som blanding 2. (E)-alken, fremstilt som blanding 2 i figur 3, ble
deretter oksidert i en multi-trinnsprosess for å gi blanding 3 (figur 3) - et eksempel på
(E)-alken-isostere.
5
[0040] Blanding 3 i figur 3 ble deretter konjugert med peptid H-Pro-Val-Orn (Cbz)OMe ved bruk av 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl karbodiimide hydroklorid) (EDC)
som en koblingsagent. Peptiden er et eksempel på en egnet målsekvens som har
affinitet for mitokondrien i en celle. Det resulterende produktet vises som blanding 4a i
10
figur 3. Forsåping av blanding 4a etterfulgt av kobling med 4-amino-TEMPO (4-AT)
ga den resulterende konjugaten vist som blanding 5a i figur 3, der Leu-DPhepeptidbåndet har blitt skiftet ut med en (E)-alken.
[0041] I en alternativ legemliggjøring ble konjugater 5b i figur 3 fremstilt ved
15
forsåping og kobling av peptid 4b (Boc-Leu-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe) med 4AT. På samme måte ble konjugat 5c i figur 3 fremstilt via kobling av (E)-alken-isostere
som indikert som blanding 3 i figur 3 med 4-AT. Disse peptidene og peptidanalogene
er ytterligere eksempler på egnede målsekvenser som har en affinitet til en celles
mitokondiria.
20
[0042] I en annen legemliggjøring kan peptid-isostere brukes som konjugat. Blant
egnede peptid-isostere er trisubstituert (E)-alkenpeptid-isostere og syklopropanpeptidisostere, samt alle imin-tilsettingsprodukter av hydro- eller karbometalaterte interne og
terminale alkyner for syntese av d-i og trisubstituert (E)-alken og syklopropanpeptid25
isosterer. See Wipf et al. Imine additions of internal alkynes for the synthesis of
trisubstituted (E)-alkene and cyclopropane isosteres, Adv Synth Catal. 2005, 347:16051613. Disse peptid-etterligningene har vist seg å fungere som β-punkt-fremmere. Se
Wipf et al. Convergent Approach to (E)-Alkene and Cyclopropane Peptide Isosteres,
Org Lett. 2005, 7(1):103-106.
30
[0043] Kobleren, R2, kan være hvilken som helst nyttig kobler, valgt for dens aktive
grupper, f.eks. karboksyl, alkoksyl, amino, sulfhydryl, amid, etc. Vanligvis, bortsett fra
41
de aktive gruppene, er gjenværende ikke-reaktive (som f.eks. mettet alkyl eller fenyl),
og forstyrrer ikke, sterisk eller ved noen annen fysisk eller kjemisk egenskap, som
f.eks. polaritet eller hydrofobitet/hydrofilitet, i en negativ (tap av funksjon) kapasitet
med aktiviteten til den generelle blandingen. I en legemliggjøring, bortsett fra de aktive
5
gruppene, består kobleren av en lineær eller forgreinet mettet C4-C20 alkyl. I en
legemliggjøring har kobleren R2 strukturen
Der n er 4-18, inkludert alle heltall mellom disse, i en legemliggjøring, 8-12 og i en
annen legemliggjøring, 10.
10
[0044] En person som er faglært innen organisk syntese kan syntetisere disse
blandingene ved å krysskoble grupper R1 og R3 ved bruk av hvilken som helst av de
tilgjengelige kjemiene. I en legemliggjøring er R1 og R3 to R2 ved en amidkobling
(peptidbånd) dannet av dehydreringssyntese (kondensering) av terminale
15
karboksylgrupper på kobleren og en amin på R1 og R3 (eller motsatt). I en
legemliggjøring er R1 og R3 identiske eller forskjellige og velges fra gruppen som
består av: XJB-5-131, XJB-5-125, XJB-7-75, XJB-2-70, XJB-2-300, XJB-5-208, XJB5-197, XJB-5-194, .JP4-039 og JP4- 049, vedlagt på måten som vises i figurer 26A og
26B.
20
[0045] I en terapeutisk legemliggjøring gis en metode for fjerning av frie-radikaler i et
emne (f.eks. en pasient med behov forbehandling med en frie radikaler-skyller), som
består av å administrere til emnet en liten mengde av en eller flere blandinger som er
beskrevet heri og som har en frie radikaler-fjernende gruppe, som f.eks. en nitroksid25
inneholdende gruppe som er effektiv for å fjerne frie radikaler. Som beskrevet over kan
en rekke sykdommer, tilstander eller skader forbedres eller på annen måte behandles
eller hindres ved administrasjon av frie radikaler-fjernende blandinger, som f.eks. de
som er beskrevet heri.
42
[0046] I alle tilfeller, som brukt heri, administreres alle agenter som brukes for
hindring, demping eller behandling i emne med skader forårsaket av
strålingseksponering i en mengde som er effektiv for å forebygge, dempe eller
5
behandle slik skade, nemlig i en mengde og dosestyring som er effektiv for å hindre
skade eller redusere varigheten og/eller alvorlighetsgraden av skaden som skyldes
strålingseksponering. I tillegg til den ikke-begrensende legemliggjøringen, spenner en
effektiv dose fra 0.1 eller 1 mg/kg til 100mg/kg, inkludert hvilken som helst økning
eller område mellom dette, inkludert 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25
10
mg/kg, 50mg/kg og 75 mg/kg. For hver blanding som er beskrevet heri, forventes
imidlertid en effektiv dose eller doseområdet å variere fra andre blandinger som er
beskrevet heri av en rekke årsaker, inkludert molekylærvekten til blandingen,
biotilgjengeligheter, spesifikk aktivitet, etc. For eksempel, og uten begrensning, der
XJB-5-131 er antioksidanten, kan dosen være mellom rundt 0.1 og 20 mg/kg, eller
15
mellom rundt 0.3 og 10 mg/kg, eller mellom rundt 2 og 8 mg/kg, eller rundt 2 mg/kg
og der enten JP4-039, JED-E71-37 eller JED-E71-58 er antioksidanten, kan dosen være
mellom rundt 0.01 og 50 mg/kg, eller mellom rundt 0.1 og 20 mg/kg, eller mellom
rundt 0.3 og 10 mg/kg, eller mellom rundt 2 og 8 mg/kg eller rundt 2 mg/kg. Det
terapeutiske vinduet mellom den minimalt effektive dosen og maksimum tolerabel dose
20
i et emne kan avgjøres empirisk ved av en person som er faglært på feltet, der
endepunktene blir bestemt av in vitro- og in vivo-analyser, som de som ble beskrevet
heri og/eller er akseptable på de farmasøytiske og medisinske feltene for å oppnå slik
informasjon angående radiobeskyttende agenter. Forskjellige konsentrasjoner av
agentene er beskrevet heri forventes å oppnå lignende resultater, med det administrerte
25
legemiddelet, for eksempel og uten begrensning, før en forventet strålingsdose, som
f.eks. før strålingsbehandling eller diagnostisk eksponering for ioniserende stråling, i
løpet av eksponering for stråling, eller eksponering i hvilken som helst dosestyring.
Disse blandingene kan administreres kontinuerlig, som f.eks. intravenøst, en eller flere
ganger daglig, en gang hver andre, tredje, fjerde, femte eller flere dager, ukentlig,
30
månedlig, etc., inkludert inkrementer mellom disse. En person med normal kunnskap
på fe farmasøytiske og medisinske feltene vil forstå at det vil være et enkelt designvalg
43
og optimalisering å identifisere en egnet dosestyring for hindring, demping eller
behandling av skade på grunn av strålingseksponering.
[0047] Blandingene som beskrives heri er også nyttige for å forebygge, dempe (gjøre
5
mindre alvorlig) og/eller behandle skade forårsaket av strålingseksponering. Med
stråling, i konstekst av denne presentasjonen, menes typer stråling som fører til
generering av frie radikaler, f.eks. reaktive oksygenarter (ROS), som beskrevet heri. De
frie radikalene produseres, for eksempel og uten begrensning, ved direkte
strålingshandling, som en fysiologisk respons til strålingen og/eller som en konsekvens
10
av skade/ulykke forårsaket av stråling. I en legemliggjøing er strålingen ioniserende
stråling. Ioniserende stråling består av høyenergiske partikler eller bølger som kan
avkoble (ionisere) minst ett elektron fra et atom eller molekyl. Eksempler på
ioniserende stråling er energiske betapartikler, nøytroner og alfapartikler. Lysbølgenes
(fotoner) evne til å ionisere et atom eller molekyler varierer på tvers av det
15
elektromagnetisk spektere. Røntgen eller gammastråler kan ionisere nesten alle
molekyler eller atomer, fjernt ultrafiolett lys kan ionisere mange atomer og molekyler,
nært ultrafiolett og synlig lys er ioniserende for svært få molekyler. Mikrobølger og
radiobølger anses vanligvis for å være ikke-ioniserende stråling, selv om skade
forårsaket av f.eks. mikrobølger, kan føre til produksjon av frie radikaler som en del av
20
skade og/eller fysiologisk respons til skaden.
[0048] Blandingene administreres vanligvis i mengde- og dosestyring for å forebygge,
dempe eller behandle strålingseffektene som et emne har fått på grunn av
strålingseksponering. Blandingene kan administreres på en måte som er effektiv å
25
behandle, dempe eller forebygge skade forårsaket av stråling. Eksempler på
leveringsruter inkluderer, uten begrensning: topisk, for eksempel, epikutan, inhalering,
enema , okular, otisk og intranasal levering, enteral, for eksempel, oralt, via gastrisk
mateslange og rektalt, og parenteralt, som f.eks. intravenøs, intraarteriell, intrmuskulær,
intrakardiell, subkutant, intraossøs, intradermal, intratekal, intraperitoneal, transdermal,
30
iontophoretisk, transmukosal, epidural og intravitreal, med oral, intravenøs,
intramuskulær og transdermale tilnærminger er foretrukne i mange tilfeller.
44
[0049] Blandingene kan være sammensatt eller på annen måte produsert i en egnet
sammensetning for bruk, som en farmasøytisk doseingsform eller legemiddelprodukt
der blandingen er en aktiv agent. Blandinger kan består av en farmasøytisk akseptabelt
5
bærestoff, eller bindemiddel. Et bindemiddel er en inaktiv substans som brukes som
bæremiddel for de aktive ingrediensene i et legemiddel. Selv om de er "inaktive" kan
bæremidler tilrettelegge og hjelpe med å øke leveringen eller biotilgjengeligheten til en
aktiv ingrediens i et legemiddelprodukt. Ikke-begrensende eksempler på nyttige
bæremidler inkluderer: anti-klebemidler, bindere, reologimodifikatorer, belegg,
10
disintegranter, emulgatorer, oljer, buffere, salter, syrer, baser, fyllere, tynningsmiddel,
løsemidler, smaktilsetninger, fargetilsetninger, glidemidler, smøremidler,
konserveringsmidler, antioksidanter, sorbenter, vitaminer, søtningsstoffer, etc., som er
tilgjengelige i feltet for farmasøytisk kjemi/blandinger.
15
[0050] Nyttige doseringsformer inkluderer; intravenøse, intramuskulære eller
intraperitoneale løsninger, orale tabletter eller væsker, topiske salver eller kremer og
transdermale enheter (f.eks. lapper). I en legemliggjøring er blandingen er steril løsning
som består av den aktive ingrediensen (legemiddel eller blanding), og et løsemiddel,
som f.eks. vann, saltløsning, laktatisert Ringers løsning eller fosfat-bufret saltløsning
20
(PBS). Ekstra bæremidler, som f.eks. polyetylenglykol, emulgatorer, salter og buffere
kan være inkludert i løsningen.
[0051] Doseringsformen er en transdermal enhet, eller "lapp". Den generelle strukturen
på en transdermal lapp er godt kjent på det farmasøytiske feltet. En typisk lapp
25
inkluderer, uten begrensning, et leveringsreservoar for innhold og levering av et
legemiddelprodukt til et emne, en okklusiv bakdel som reservoaret er festet til på en
proksimal side (mot det tenkte emnets hud) på baksiden og som går videre utover,
vanligvis omgir den reservoaret, og et klebemiddel på den proksimale siden av
baksiden, som omgir reservoaret, vanligvis fullstendig, for å feste lappen til en pasients
30
hud. Reservoaret består vanligvis av en matrise dannet på en ikke-vevd (f.eks. et
gasbind) eller en hydrogel, som f.eks. polyvinylpyrrolidon (PVP) eller polyvinylacetat
(PVA), som er velkjente. Reservoaret består vanligvis av den aktive ingrediensen som
45
absorberes inn i eller adsorberes på reservoarmatrisen, og
hudgjennomtrengingsforsterkere. Valget av gjennomtrengingsforsterkere avhenger
vanligvis av empiriske studier. Som vist i eksempel 12 under, inkluderer visse
formuleringer som kan være nyttige som gjennomtrengingsforsterkere uten
5
begrensning: DMSO; 95% Propylenglykol + 5% linolsyre og 50% EtOH +40% HSO +
5% Propylenglykol + 5% Brij30.
[0052] Eksempler 1-7 er utdrag fra amerikansk patentsøknad nr. 11/565,779, og er
resitert heri for å gi ikke-begrensende illustrasjoner av nyttige syntetiske metoder og
10
effekter av visse mitokondri-spesifiserende frie radikaler-fjernende blandinger som
bruker gramicidin S-avledet mitokondrier-spesifiserende grupper.
Eksempel 1
15
[0053] Materialer. Alle kjemikaler var fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO) hvis ikke
annet er nevnt. Heparin, ketamin HC1 og natriumpentobarbital var fra Abbott
Laboratories (North Chicago, IL). Dulbecco's modifisert Eagle medium ("DMEM") var
fra BioWhittaker (Walkersville, MD). Fetal bovine serum (FBS; <0.05 endotoksin
enheter/ml) var fra Hyclone (Logan, UT). Pyrogen-fri steril normal saltløsning var fra
20
Baxter (Deerfield, IL).
[0054] Generelt. Alle fuktsensitive reaksjoner ble utført ved bruk av sprøyte-septum
cap-teknikker under en N2-atmosfære og all glassvare ble tørket i en ovn ved 150 °C i
2 t før bruk. Reaksjoner som ble utført ved -78 °C brukte et CO2-acetonbad.
25
Tetrahydrofuran (THF) ble destillert over natrium/benzofenonketyl; CH2Cl2 (DCM),
toluen og Et3N ble destillert fra CaH2. Me2Zn ble kjøpt fra Aldrich Company.
[0055] Reaksjoner ble overvåket via tynnlagskromatografi ("TLC") analyse (EM
Science forhåndsbelagt silikagele 60 F254 plater, 250 µm lagtykkelse) og visualisering
30
ble oppnådd med et 254 nm UV-lys og ved farging med en Vaughn's reagens (4.8 g
(NH4)6Mo7O24·4H2O, 0.2 g Ce(SO4)2·4H2O i 10 mL kons. H2SO4 og 90 mL H2O).
Lynkromatografi på SiO2 ble brukt til å rense de rå reaksjonsblandingene.
46
[0056] Smeltepunktene ble fastslått ved bruk av en Laboratory Devices Mel-Temp II.
Infrarød spektra ble fastslått på et Nicolet Avatar 360 FT-IR spektrometer.
Massespektra ble oppnådd på et Waters Autospec dobbeltfokuserende
5
massespektometer ("EI") eller et Waters Q-Tof massespektrometer ("ESI"). LC-MS
data ble oppnådd på et Agilent 1100-instrument, ved bruk av en Waters Xterra MS CH
3.5 µm RP-kolonne (4.6 x 100 mm).
[0057] Syntese, eksempel I. Fremstilt som en fargeløs olje (Figur 3, blanding 1) i
10
henhold til literaturprosedyren, se Edmonds, M. K. et al. Design and Synthesis of a
Conformationally Restricted Trans Peptide Isostere Based on the Bioactive
Conformations of Saquinavir and Nelfinavir, J Org Chem. 66:3747 (2001); see also
Wipf, P. et al., Org Lett. 7:103 (2005); see also Xiao, J. et al., Electrostatic versus
Steric Effects in Peptidomimicry: Synthesis and Secondary Structure Analysis of
15
Gramicidin S Analogues with (E)-Alkene Peptide Isosteres, J Am Chem Soc. 127:5742
(2005).
[0058] En løsning på 2.20 g (5.52 mmol) av blanding 1 (Figur 3) i 20.0 mL med tørr
CH2Cl2 ble behandlet ved romtemperatur med 1.85 g (7.17 mmol) av Cp2ZrHCl.
20
Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 5 min, CH2Cl2 ble fjernet in vacuo
og 20.0 mL toluen ble tilsatt. Den resulterende løsningen ble avkjølt til -78 °C og
behandlet over en periode på 30 min med 2.76 mL (5.52 mmol) med Me2Zn (2.0 M
løsninger i toluen). Løsningen ble rørt ved -78°C i 30 min, varmet til 0°C i en periode
på 5 min og behandlet i én del med 2.05 g (11.1 mmol) med N-Boc-isovaleraldimin, se
25
Edmonds, M. K. et al. J Org Chem. 66:3747 (2001); se også Wipf, P. et al., J Org Lett.
7:103 (2005); se også Xiao et al., J Am Chem Soc. 127:5742 (2005).
[0059] Den resulterende blandingen ble rørt 0°C i 2 t, avkjølt med mettet NH4Cl,
uttynnet med EtOAc, filtrert gjennom en tynn pute med kelitt og ekstrahert med
30
EtOAc. Det organiske laget ble tørket (MgSO4), konsentrert in vacuo, og renset med
kromotografi på SiO2 (20:1, heksan/EtOAc) for å gi 3.13 g (97%) som en fargeløs
oljete 1:1 blanding av diastereomere.
47
[0060] En løsning med 4.19 g (7.15 mmol) av produkt i 100 mL av tørr tetrahydrofuran
("THF") ble behandlet ved 0°C med 9.30 mL (9.30 mmol) tetrabutylammoniumfluorid
(TBAF, 1.0 M løsning i THF). Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 20 t,
5
uttynnet med EtOAc, og vasket med saltløsning. Det organiske laget ble tørket
(MgSO4), konsentrert in vacuo, og renset med kromotografi på SiO2 (4:1,
heksan/EtOAc) for å gi 1,89 g (76%) som en lys gulaktig, skummende 1:1 blanding av
diastereomere.
10
[0061] En løsning med 1.86 g (5.23 mmol) av produktet i 40.0 mL av tørr CH2Cl2 ble
behandlet ved 0°C med 1.46 mL (10.5 mmol) av trietylamin ("TEA"), 2.02 mL (21.4
mmol) av Ac2O, og 63.9 mg (0.523 mmol) of 4-N,N1-(dimetylamino) pyridin
("DMAP"). Reaksjonsblandingen ble rørt ved 0°C i 15 min, i romtemperatur i 3 t og
uttynnet med EtOAc, og vasket med saltløsning. Det organiske laget ble tørket
15
(MgSO4), konsentrert in vacuo, og renset med kromatografi på SiO2 (20:1,
heksan/Et2O) for å gi 1.97 g (94%) med eddiksyre (2S)-benzyl-(5R)-tertbutoksykarbonylamino-7-metyloct-(3E)-enyl ester (807 mg, 38.7%), eddiksyre (2S)benzyl-(5S)-tert-butoksykarbonylamino-7-metyloct-(3E)-enyl ester (826 mg, 39.6%),
og en blanding av de tildligere nevnte artene (337 mg, 16.2%).
20
[0062] En løsning på 350 mg (0.899 mmol) med eddiksyre (2S)-benzyl-(5S)-tertbutoksykarbonylamino-7-metyloct-(3E)-enyl ester i 8.00 mL med MeOH ble behandlet
ved 0°C med 62.0 mg (0.449 mmol) av K2CO3. Reaksjonsblandingen ble rørt ved 0°C i
1 t, i romtemperatur i ekstra 4 t og uttynnet med EtOAc, og vasket med H2O. Det
25
organiske laget ble tørket (MgSO4), konsentrert in vacuo, og renset med kromotografi
på SiO2 (4:1, heksan/EtOAc) for å gi 312 mg (kvant) som blanding 2 (figur 2) som en
fargeløs olje.
[0063] En løsning på 23.0 mg (66.2 µmol) av blanding 2 (Figur 3) i 2.00 mL med tørr
30
CH2Cl2 ble behandlet ved 0°C med 42.1 mg (99.3 µmol) av Dess-Martin Periodinane.
Reaksjonsblandingen ble rørt ved 0°C i 1 t og ved romtemperatur i 4 timer ekstra,
avkjølt med mettet Na2S2O3 i et mettet NaHCO3 løsning, rørt i 30 min ved
48
romtemperatur og ekstrahert med CH2Cl2. Det organiske laget ble tørket (Na2SO4),
konsentrert in vacuo for å gi et fargeløst skum og deretter oppløses i 3.00 mL med
THF, og behandlet ved 0°C med 300 µL (600 µmol) med 2-metyl-2-buten (2.0 M
løsning THF) etterfulgt av en annen løsning med 18.0 mg (199 µmol) med NaClO2 og
5
18.2 mg (132 µmol) av NaH2PO4•H2O i 3.00 mL med H2O. Reaksjonsblandingen ble
rørt ved 0°C i 1 t, i romtemperatur i ekstra 3 t og ekstrahert med EtOAc, og vasket med
H2O. De kombinerte organiske lagene ble tørket (Na2SO4), og konsentrert in vacou for
å gi blanding 3 (figur 3) som er rå fargeløst skum som ble brukt i neste trinn uten
videre rensing.
10
[0064] En løsning med råoljeblanding 3 (Figure 3) (66.2 µmol) i 3.00 mL med CHCl3
ble behandlet ved 0°C med 10.7 mg (79.2 µmol) med 1-hydroksybenzotrizol ("HOBt")
og 14.0 mg (73.0 µmol) med 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) karbodimidhydroklorid
("EDC"), etterfulgt av en løsning på 62.9 mg (132 µmol) med H-Pro-Val-Orn(Cbz)15
OMc, se Edmonds, M. K. et al. J Org Chem. 66:3747 (2001); se også Wipf, P. et al., J
Org Lett. 7:103 (2005); se også Xiao, J. et al., J Am Chem Soc. 127:5742 (2005), i
1.00 mL av CHCl3 and 0.8 mg (6.6 µmol) av DMAP. Reaksjonsblandingen ble rørt ved
romtemperatur i 2 d, uttynnet med CHCl3, og vasket med H2O. Det organiske laget ble
tørket (Na2SO4), konsentrert in vacuo, og renset med kromotografi på SiO2 (2:1,
20
heksaner/EtOAc til 20:1, CHCl3/MeOH) for å gi 51,3 mg (94%) av blanding 2 (figur 3)
som et fargeløst skum.
En løsning på 53.7 mg (65.5 µmol) av blanding 4a (figur 3) i 2.00 mL av MeOH ble
behandlet ved 0°C med 655 µL (655 µmol) av 1 N NaOH. Reaksjonsblandingen ble
25
rørt ved romtemperatur i 86 t og behandlet med 655 µL (655 µmol) av 1 N HCl.
TLøsningen ble ekstrahert med CHCl3 og det organiske laget ble tørket (Na2SO4) og
konsentrert in vacuo for å gi den rå syren som en fargeløs form. Denne syren ble
oppløst i 5,00 mL med CHCl3 og behandlet ved romtemperatur med 10.6 mg (78.4
µmol) of HOBt, 15.1 mg (78.8 µmol) av EDC, 20.2 mg (118 µmol) av 4-amino-
30
TEMPO og 8.0 mg (65.5 µmol) av DMAP. Reaksjonsblandingen ble rørt ved
romtemperatur i 36 t, uttynnet med CHCl3, og vasket med H2O. Det organiske laget ble
tørket (Na2SO4), konsentrert in vacuo, og renset med kromotografi på SiO2 (1:1,
49
heksan/EtOAc til 20:1, CHCl3/MeOH) for å gi 62.0 mg (99%) av blanding 5a (figur 3)
som et fargeløst fast stoff. Følgende karakterisering ble oppnådd: LC-MS (Rt 8.81 min,
lineær gradient 70% to 95% CH3CN (H2O) i 10 min, 0.4 mL/min; m/z = 959.5 [M+H]+,
981.5 [M+Na]+) og HRMS (ESI) m/z kalkulert for C53H80N7O9Na (M+Na) 981.5915,
5
funnet 981.5956.
[0066] En løsning på 60.0 mg (71.7 µmol) av blanding 4b (Figur 3), se Tamaki, M. et
al. I. Bull Chem Soc Jpn., 66:3113 (1993), i 2.15 mL av MeOH ble behandlet ved
romtemperatur med 717 tL (717 µmol) av 1 N NaOH. Reaksjonsblandingen ble rørt
10
ved romtemperatur i 5 t og behandlet ved 0°C med 717 µL (717 µmol) av 1 N HCl.
Løsningen ble ekstrahert med CHCl3 og det organiske laget ble tørket (Na2SO4) og
konsentrert in vacuo for å gi råsyren som et fargeløst skum. Denne syren ble oppløst i
6.04 mL med CHCl3 og behandlet ved romtemperatur med 11.6 mg (85.8 µmol) med
HOBt, 16.5 mg (85.1 µmol) av EDC, 18.5 mg (108 µmol) av 4-amino-TEMPO og 8.8
15
mg (72.0 µmol) med DMAP. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 20 t,
uttynnet med CHCl3, og vasket med H2O. Det organiske laget ble tørket (Na2SO4),
konsentrert in vacuo, og renset med kromotografi på SiO2 (fra 2:1, heksan/EtOAc til
20:1, CHCl3/MeOH) for å gi 62.6 mg (99%) av blanding 5b (figur 3) som et gulaktig
fast stoff. Følgende karakterisering ble oppnådd: LC-MS (Rt 7.02 min, lineær gradient
20
70% til 95% CH3CN (H2O) i 10 min, 0.4 mL/min; m/z = 976.5 [M+H]', 998.4
[M+Na]+) og HRMS (ESI) m/z kalkulert for C52H79N8O10Na (M+Na) 998.5817, funnet
998.5774.
[0067] En løsnings av råblanding 3 (Figur 3) (40.3 µmol) i 3.00 mL of CH2Cl2 ble
25
behandlet ved 0°C med 10.4 mg (60.7 µmol) av 4-amino-TEMPO, 7.7 mg (40.2 µmol)
av EDC og 5.4 mg (44.2 µmol) av DMAP. Reaksjonsblandingen ble rørt ved
romtemperatur i 20 t, uttynnet med CHCl3, og vasket med H2O. Det organiske laget ble
tørket (Na2SO4), konsentrert in vacuo, og renset med kromotografi på SiO2 (fra 4:1 til
1:1 heksan/EtOAc) for å gi 18.8 mg (91%) av blanding 5c (figur 3) som et gulaktig
30
fast stoff. Følgende karakterisering ble oppnådd: LC-MS (Rt 7.01 min, lineær gradient
70% til 95% CH3CN (H2O) i 10 min, 0.4 mL/min; m/z = 537.3 [M+Na]+) og HRMS
(ESI) in/z kalkulert for C30H48N3O4Na (M+Na) 537.3543, funnet 537.3509.
50
[0068] Bestemmelse av intracellulære superoksidradikaler Oksidasjonsavhengig
fluorogenisk farge, dihydroetidium ("DHE", molekylære prober) ble brukt for å
evaluere intracellulær produksjon av superokside radikaler. DHE er celle-permeabel og
oksideres, i nærvær av superoksid, til fluorescerende etidium som innskytes til DNA.
5
Fluorescence av etidium ble målt ved bruk av FACscan (Becton-Dickinson,
Rutherford, NJ) flyr-cytometer, utstyrt med en 488-nm argon ion-laser og levert med
Cell Quest-programvare. Gjennomsnittlig fluorescence-intensitet fra 10 000 celler ble
oppnådd ved bruk av et 585-nm-båndpass-filter. (FL-2-kanal).
10
[0069] Bestemmelse av intracellulære ATP-nivåer Cellene ble inkuberte med 10 µm av
blanding 5a (figur 3) for indikerte tidsperioder (2, 4, 6, 12 og 14 t). På slutten av
inkuberingen ble celler oppsamlet og innholdet i intracellulær ATP ble bestemt ved
bruk av bioluminescent somatisk celle-analysesett (Sigma, St. Louis, MA). Som en
positiv kontroll, ble celler inkubert med 2 mM med 2-deksy-glukose, en glukoseanalog
15
som kompetitivt hemmer cellulært opptak og bruk av glukose i12 og 14 t.
[0070] Celler. Caco-2BBe menneskelig enterocytt-aktige celler ble hentet fra American
Type Culture Collection (Manassas, VA). Celler ble rutinemessig opprettholdt ved 37
°C inn under en fuktighetstilført atmosfære som inneholder 8% CO2 i luft.
20
Dyrkingsmediet var DMEM supplert med 10% FBS, ikke-essensielt aminosyresupplement (Sigma-Aldrich catalogue #M7145), natrium pyruvate (2 mM),
streptomycin (0.1 mg/ml), penicillin G (100 U/ml) og menneskelig transferrin (0.01
mg/ml). Dyrkningsmediet ble skiftet 3 ganger i uken.
25
[0071] Kirurgiske prosedyrer for å oppnå vaskulær tilgang. Alle studieprotokoller som
bruker rotter fulgte retningslinjene for bruk av forsøksdyr fra US National Institutes of
Health og var godkjente av Institutional Animal Care and Use Committee ved
University of Pittsburgh.
30
[0072] Hann-spesifikke patogenfrie Sprague Dawley-rotter (Charles River
Laboratories, Wilmington, MA), som veier 150-250 g, ble oppbevart i et
temperaturkontrollert miljø med en 12-t lys/mørk syklus. Rottene hadde fri tilgang til
51
mat og vann. For eksperimenter ble rottene bedøvd med intramuskulær ketamin HCl
(30 mg/kg) og intraperitoneal natriumpentobarbital (35 mg/kg). Dyrene var i liggende
stilling i løpet av eksperimenter. Lidokain (0.5 ml av 0.5% løsning) ble injisert
subkutant for å gi lokalbedøvelse på kirurgiske kuttsteder. For å sikre luftveien, ble en
5
trakeotomi utført og polyetylenslange (PE 240; Becton Dickinson, Sparks, MD) ble
ført ned i luftrøret. Dyrene kunne puste spontant.
[0073] Den høyre femurarterien ble kanylert med polyetylenslange (PE 10). Dette
kateteret ble festet til en trykktransduser som muliggjorde umiddelbar måling av det
10
gjennomsnittlige arterietrykket (MAP) i løpet av eksperimentet. For eksperimenter som
bruke trykk-kontroller hemorrhagisk sjokk (HS)-modellen, ble høyre halspulsåret
eksponert, ombundet distalt og kanylert med polyetylenrør (PE 10) for å kunne trekke
blod. For eksperimenter som bruker volumkontrollert hemorragisk sjokk (HS)-modell,
ble halsårens kateter brukt for å infusere gjenopplivningsløsningen og den høyre
15
femorale åren, som ble kanylert med et silikonkateter Chronic-Cath, Norfolk Medical,
Skokie, IL), brukt for å trekke blod.
[0074] Alle dyr ble instrumentert innen 30 min. Heparin (500 U/kg) ble administrert
umiddelbart etter instrumentering via den femorale blodåren. Dyr ble plassert i et
20
varmeteppe for å opprettholde kroppstemperaturen på 37°C. Plasseringen av de
forskjellige enhetene som tidligere ble nevnt, ble kontrollert postmortem.
[0075] Tarmslimhinne-permeabilitets-analyse Dyr fikk tilgang til vann, men ikke mat, i
24 timer før eksperimentet for å kunne redusere tarminnholdets volum. Rottene ble
25
instrumentert som beskrevet over. En midlinjelaparotomi ble utført og tynntarmen ble
eksteriorisert fra duodenojejunonale leddet til ileokoliske ventilen. Et lite innsnitt ble
gjort på det antimesenteriske aspektet i den proksimale tynntarmen og saltløsning (1,5
ml) ble injisert. Tarmen ble forbundet proksimalt og distalt til innsnittet med 4-0 silke
(Look, Reading, PA).
30
[0076] Tynntarmen ble komprimert forsiktig i aboral retning langs dens lengde for å
flytte tarminnhold til tykktarmen. Mellomtarmen ble partisjonert i seks tilstøtende
52
vanntette segmenter, som startet 5 cm fra den ileokoliske ventilen. Hvert segment var 3
cm langt og var bundet proksimalt og distalt ved å innsnevre periferiske 4-0
silkesuturer. Man passet nøye på slik at den vaskulære tilførselen til tarmen ikke ble
skadet, og hvert segment var godt perfusert.
5
[0077] To tilfeldig valgte segmenter i hver rotte ble injisert med 0,3 ml bindemiddel og
levert som "ingen behandling"-kontroller. For å kunne fylle segmentene ble et lite
innsnitt gjort og løsningen ble injisert ved bruk av et Teflon-kateter (Abbocath 16Ga,
Abbot Laboratories).
10
[0078] De gjenværende fire andre segmentene ble injisert med løsninger som inneholdt
enten 4-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylpiperidin-N-oksyl (TEMPOL) eller en av de
gramicidin S-baserte blandingene. Fire forskjellige endelige konsentrasjoner av
TEMPOL i normal saltoppløsning ble evaluert: 0.1, 1,5 g 20 mM. Hemigramicidin15
baserte blandinger ble oppløst i en blanding av dimetylsulfoksid (DMSO) og normal
saltoppløsning (1:99 v/v) og injisert i endelige konsentrasjoner på 0.1, 1, 10 eller 100
µM.
[0079] Etter at segmentene ble lastet med saltløsning eller testblandingene, ble tarmen
20
erstattet inne i den peritoneale kaviteten og det abdominale innsnittet ble lukket
midlertidig ved bruk av Backhaus-tang.
[0080] Etter en 5 min stabiliseringsperiode ble hemorrhagisk sjokk fremkalt ved å
trekke blod via halsårens kateter. MAP ble opprettholdt ved 30 ± 3 mm Hg i 2 timer.
25
Blodet ble reinfusert etter behov for å opprettholde MAP innen ønsket område.
[0081] Etter to timer med sjokk ble dyrene avlivet med en KCI-bolusinjeksjon i hjertet.
Mellomtarmen ble raskt skåret ut fra tykktarmsventilen til det mest proksimale
tarmsegmentet. Tuppene på hvert segment ble kassert. For å analysere caspaser 3 og 7
30
aktivitet og fosfolipid-peroksidering, ble slimhinneprøver tatt fra tarmsegmenter
umiddelbart etter hemorrhage og oppbevart ved -80 °C. For permeabilitetsmålinger ble
hvert segment konvertert til en vrengt tarmsekk, som tidligere beskrevet av
53
Wattanasirichaigoon et al., se Wattanasirichaigoon, S. et al., Effect of mesenteric
ischemia and reperfusion or hemorrhagic shock on intestinal mucosal permeability and
ATP content in rats, Shock. 12:127-133 (1999).
5
[0082] Kort sagt, i henhold til Wattanasirichaigoon-protokollen som referes til over,
ble sekkene klargjort i iskald modifisert Krebs-Henseleit-bikarbonatbuffer ("KHBB"),
pH 7.4. En ende av tarmsegmentet ble ombundet med en 4-0 silkesutur, segmentet ble
deretter vrengt på en tynn plaststang, Den resulterende tarmsekken ble montert på et
Teflon-kateter (Abbocath 16GA, Abbot Laboratories) tilkoblet en 3 ml plastsprøyte
10
som inneholdt 1,5 ml KHBB. Sekken ble suspendert i et beger som inneholder KHBB
pluss fluorescein-isothiocyanat-merket dekstran (gjennomsnittlig molekylmasse 4 kDa;
FD4; 0.1 mg/ml). Denne løsningen ble opprettholdt ved 37 °C, og oksygenert med
bobling med en gassblanding (O2 95%/CO2 5%). Etter 30 min ble væsken inne i
tarmsekken oppsamlet. Prøvene ble klarert ved sentrifugering ved 2000 g i 5 minutter.
15
[0083] Fluorescence av FD4 i løsningen inne i begeret og innen hver tarmsekk ble målt
ved bruk av fluorescence-spektrofotometer (LS-50, Perkin-Elmer, Palo Alto, CA) ved
en at en stimuleringsbølgelengde på 492 nm og en utslippsbølgelengde på 515 nm.
Slimhinnens permeabilitet ble uttrykt som en klaring normalisert av lengden på
20
tarmsekken med enheter på nL•min-1•cm2, som tidligere beskrevet, se Yang, R. et al.,
Ethyl pyruvate modulates inflammatory gene expression in mice subjected to
hemorrhagic shock, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 283:G212-G22 (2002).
[0084] Resultater for et spesifikt eksperimentelt forhold (f.eks. spesifikk testblansing
25
ved en enkelt konsentrasjon) ble uttrykt som en relativ endring i permeabiliteten
beregnet i henhold til denne ligningen: Relativ endring i permeabilitet (%) = (CHs Exp Cnormal) / CHs cont - Cnormal) x 100, der CHS exp er klaringen for FD4 målt for et
tarmsegment lastet med forsøksblandingen, Cnormal er klaringen av FD4 målt i 6
tarmsegmenter fra 3 normal dyr ikke underlagt hemorrhagisk sjokk, og CHs cont er ikke
30
den gjennomsnittlige klaringen for FD4 målt i 2 tarmsegmenter fylt med bindemiddel
fra samme dyr som ble bruk for å måle CHs exp.
54
[0085] Måling av permeabilitet av Caco-2 monolag. Caco-2BBe celler ble lagt på plate
med en tetthet på 5 x 104 celler/well på permeable filtre (0.4 µm porestørrelse) i 12well bikamerale kamre (Transwell, Costar, Corning, NY). Etter 21 til 24 dager, ble
5
paracellulær permeabilitet avgjort ved å måle den apikale-til-basolaterale klaringen av
FD4.
[0086] Kort sagt ble mediumet på den basolaterale siden skiftet ut med kontrollmedium
eller medium som inneholder menadion (50 µM endelig). Medium som inneholder
10
FD4 (25 mg/ml) ble påført til det apikale kammeret. I enkelte tilfeller ble en av
gramicidinblandingene, XJB-5-131, også lagt til den apikale siden ved endelige
konsentrasjoner på 0.1, 1, 10 eller 100 µM. Etter 6 timer med inkubasjon ble mediumet
aspirert fra begge kamre. Permeabiliten til monolagene ble uttrykt som en klaring
(pL•h-1•cm-2), se Han, X. et al., Proinflammatory cytokines cause NO dependent and
15
independent changes in expression and localization of tight junction proteins in
intestinal epithelial cells, Shock. 19:229-237 (2003).
[0087] Caspaser 3 og 7 aktivitetsanalyse. Kaspaser 3 og 7 aktivitet ble målt ved bruk
av et kommersielt tilgjengelig analysesett, Caspase GIoTM 3/7 analysesett (Promega,
20
Madison, WI). Kort sagt ble, 50 µl med rottetarmslimhinne-homogenat (20 mugger
protein) blandet med 50 µl med Caspase-GloTM-reagens og inkubert ved
romtemperatur i en time. På slutten av inkubasjonsperioden ble luminescencen av hver
prøve målt ved bruk av et plateavlesende chemiluminometer (ML1000, Dynatech
Laboratories, Horsham, PA). Aktiviteten til caspaser 3 og 7 ble uttrykt som
25
luminescence-intensitet (tilfeldige enheter per mg protein). Proteinkonsentrasjoner ble
bestemt ved bruk av BioRad-analyse (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA).
[0088] Analyse for peroksidering av fosfolipider. Tarmslimhinneprøver ble
homogenisert. Lipider ble ekstrahert fra homogenater ved bruk av Folch-prosedyren, se
30
M. Lees and G. H. Sloan-Stanley, A simple method for isolation and purification of
total lipids from animal tissue, J. BIOL. CHEM. 226:497- 509 (1957), og løst ved 2D
HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography) som tidligere beskrevet, se
55
Kagan, V. E. et al., A role for oxidative stress in apoptosis: Oxidation and
externalization of phosphatidylserine is required for macrophage clearance of cell
undergoing Fas-mediated apoptosis, J Immunol. 169:487-489 (2002). Flekker med
fosfolipider ble skrapet fra HPTLC-plater og fosfolipider ble ekstrahert fra silika. Lipid
5
fosfor ble bestemt av en mikrometode, se Bottcher, C. J. F. et al., A rapid and sensitive
sub-micro phosphorus determination, Anal Chim Acta. 24: 203-204 (1961).
[0089] Oksidiserte fosfolipider ble hydrolysert ved bruk av pankreatisk fosfolipase A2
(2U/µl) i 25 mM fosfatbuffer som fosfatbuffer inneholdende 1 mM CaCl2, 0.5 mM
10
EDTA og 0.5 mM natriumdodekylsulfat (SDS) (pH 8.0, ved romtemperatur i 30 min).
Fettsyrehyperoksider som ble dannet ble fastsatt av fluorecence HPLC av resorufin
støkiometrisk dannet i løpet av deres mikroperoksidase 11-katalisert reduksjon i
nærvær av Amplex Red (i 40 min ved 4°C) (8). Fluorescence HPLC (Eclipse XDBC18-kolonne, 5 µm, 150 x 4.6 mm, mobilfasen ble komponert av 25 mM
15
dinatriumfosfatbuffer (pH 7,0) / metanol (60:40 v/v); stimuleringsbølgelengde 560 nm,
utslippsbølgelengde 590 nm) ble utført på et Shimadzu LC-100AT HPLC-system
utstyrt med fluorescence-detektor (RF-10Axl) og auto-prøvetaker (SIL-10AD).
[0090] Overlevelse blant rotter eksponert for volumkontrollert hemorrhagisk sjokk.
20
Etter kirurgisk klargjøring og en 5-min stabiliseringsperiode for å innehente baselineavlesninger, ble rotter eksponert for hemorragisk sjokk. Blødningen ble utført i 2 faser.
[0091] Innledningsvis ble 21 ml/kg med blod ble trukket over 20 min. Umiddelbart
etter dette ble ytterligere over12.5 ml/kg blod trukket over 40 minutter. Dermed oppsto
25
hemorrhage over en total tidsperiode på 60 minutter og det totale blodtapet var 33.5
ml/kg eller ca. 55% av det totale blodvolumet. Rotter ble tilfeldig utpekt for å motta
XJB-5-131 (2 µmol/kg) eller dets bindemiddel, en 33:67 (v/v) blanding av DMSO og
normal saltløsning.. XJB-5-131-løsning eller bindemiddelet alene ble administrert som
en kontinuerlig infusjon i løpet av de siste 20 min av hemorrhage-periode. Det totale
30
volumet av den infuserte væsken 2.8 ml/kg og den ble administrert intravenøst ved
bruk av en sprøytepumpe (KD100, KD Scientific, New Hope, PA). Rotter ble observert
56
i 6 timer eller til de døde (definert ved pustestans i > min). På slutten av 6timersperioden ble dyr som fortsatt var i live avlivet med en overdose KCI.
[0092] Blodtrykk ble registrert kontinuerlig ved bruk av en kommersiell
5
belastningsmåler-transduser, forsterker og monitor (S90603a, SpaceLabs, Redmond,
WA). Blodprøver (0,5 ml) ble tatt fra halsblodåren ved starten av hemorrage (baseline),
på slutten av hemorrhage (sjokk) og på slutten av gjenopplivning ( gjenopplivning).
Hemoglobinkonsentrasjon [Hb], laktat- og glukosekonsentrasjon ble bestemt ved bruk
av autoanalysator (Model ABL 725, Radiometer Copenhagen, Westlake, OH).
10
[0093] Datapresentasjon og statistikk. Alle variabler er presentert som
gjennomsnittsverdier + standandarfeilen til gjennomsnittet (SEM). Statistisk viktighet
av differanser blant grupper ble bestemt ved bruk av ANOVA (analyse av varianse) og
LSD (minst viktige differanse)-tester, eller Kruskal-Wallis- og Mann-Whitney-tester,
15
alt etter hva som egner seg. Overlevelsesdata ble analysert ved bruk av loggrangeringstesten. Viktigheten ble klarlagt for p-verdier mindre enn 0,05.
Eksempel 2
20
[0094] Selektiv levering av TEMPO til mitokondrier kan føre til terapeutisk fordelaktig
reduksjon av ROS, derfor ble undersøkelse av bruken av konjugater av 4-aminoTEMPO ("4-AT") utforsket. For å selektivt spesifisere mitokondrier, vises en
spesifiseringssekvens som bruker den membranaktive antibiotikaen gramicidin S
("GS") samt korresponderende alkenisosterer, som vist i figurer 2 og 3. På samme
25
måte, hvis man bruker gramicidin S-peptidylfragmenter og alkenisosterer som "ankre",
kan TEMPO "nyttelasten" guides inn i mitokondrien.
[0095] Leu-DPhe-Pro-Val-Orn-fragment av hemigramicidin ble brukt som en
spesifiseringssekvens. Alken-isostere som f.eks. (E)-alken-isostere av gramicidin S
30
(f.eks., hemigramicidin) ble brukt som en del av spesifiseringssekvensen. Se figur 3 for
en syntetisk bane for (E)-alken-isostere og blanding 3 for den korresponderende
kjemiske strukturen. (E)-alken, som fremstilt i blanding 2 i figur 3, ble deretter oksidert
57
i en multi-trinnsprosess for å gi blandingen som fremstilt i blanding 3 - et eksempel på
(E)-alken-isosteren.
[0096] Blanding 3 i figur 3 ble deretter konjugert med tripeptid H-Pro-Val-Orn(Cbz)5
OMe ved bruk av 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimide hydroklorid) ("EDC")
som en koblingsagent. Tripeptiden er et eksempel på en egnet målsekvens som har
affinitet for mitokondrien i en celle. Det resulterende produktet vises som blanding 4a i
figur 3. Forsåping av blanding 4a etterfulgt av kobling med 4-amino-TEMPO ("4-AT")
ga den resulterende konjugaten vist som blanding 5a i figur 3, der Leu-DPhe-
10
peptidebåndet har blitt skiftet ut med en (E)-alken.
[0097] I en annen legemliggjøring konjugater 5b og 5c i figur 3 ved å koble peptid 4b
(Boc-Leu-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe) og (E)-alkene isostere som indikert som
blanding 3 i figur 3 til 4-AT. Peptiden er et annet eksempel på en egnet
15
spesifiseringssekvens som har affinitet for mitokondrien i en celle.
[0098] Elektronparamagnetisk resonans ("EPR") spektroskopi ble brukt for å overvåke
den cellulære leveringen av blandinger 5a og 5b vist i figur 3 i mus-embryoniske celler
("MEC").
20
[0099] Følgende forhold ble brukt i løpet av EPR-basert analyse av integreringen og
reduksjonen av nitroksid-gramicidin S-peptidyl-konjugater i MECer. MECer ved en
konsentrasjon på 10 millioner MEDer per mL ble inkubert med 10 µM av 4-AT og
blanding 5a, henholdsvis. Gjenvunnede nitroksidradikaler i hele celler, mitokondrier og
25
cytosolfraksjoner ble resuspendert i fosfatbuffer-saltløsning ("PBS") i nærvær og
fravær, henholdsvis 2 µM K3Fe(CN)6. Kort sagt viser 4A et representativt EPRspektrum av blanding 5a i forskjellige fraksjoner av MECer i nærvær av K3Fe(CN)6.
Videre viser figur 4B en vurdering av integrerte nitroksider.
30
[0100] Distinktive karakteristiske tripletsignaler fra nitroksidradikaler ble oppdaget i
MECer inkubert med10 µM av blanding 5a (Figur 3) samt i mitokondrier isolert fra
disse cellene. Den cytosoliske funksjonen fremkalte ikke EPR-signaler fra
58
nitroksidradikaler, lignende resultater ble observert med konjugat 5b (figur 3) (data
vises ikke).
[0101] Inkubering av MECer med blanding 5a (figur 3) førte til integrering og ett5
elektron-reduksjon av blanding 5a, sett ved en betydelig økning i størrelsen på EPRsignalets intensitet ved tilsetting av en ett-elektronsoksidant, ferrycyanid (figur 4B).
(Merk: EPR-resultater for inkubering av MECer med 5b vises ikke i figur 4, men, EPRresultater for 5b var like når de ble sammenlignet med 5a). I kontrast til 5a og 5b,
gjennomtrengte imidlertid ikke 4-amino-TEMPO (4-AT) cellene eller mitokondrier
10
effektivt, som vist ved fraværet av viktig amplitudendring i EPR-resulatene for 4-AT.
[0102] Evnen til 5a, 5b (Figur 3), og 4-AT til å hindre intracellulær superoksidgenerering ved flyt-cytometrisk overvåking av oksidering av dihydroetidium ("DHE")
til en fluorescent etidium ble testet. Evnen til 5a, 5b og 4-AT for å beskytte celler mot
15
apoptose trigget av actinomycin D ("ActD") ble også testet. MECs ble forhåndsbehandlet med 10 µM 4-AT, 5a eller 5b deretter inkubert med ActD ved en
konsentrasjon på 100 ng/mL. Det ble oppdaget at 5a og 5b fullstendig hindret nesten to
ganger så mye intracellulær superoksidgenerering i MECer (se figur 6A). 4-AT hadde
ingen effekt på superoksidproduksjonen i MECer.
20
[0103] Apoptotiske celle-responser ble dokumenter ved bruk av tre biomarkører: (1)
eksternalisering av fosfatidylserin ("PS") på celleoverflaten (via flyt-cytometri ved
bruk av et FITC-merket PS-bindende protein, anneksin V, se figurene 6B og 6E); (2)
aktivering av caspace-3 ved spalting av Z-DEVD-AMC-substrat (se figur 6C), og, (3)
25
DNA fragmentering ved flyt-cytometri av propidiium iodid farget DNA (see figur 6D).
[0104] Fosfatidylserin ("PS") er ensyreholdig fosfolipid som befinner seg kun på det
indre laget av plasmamembranen, eksponering av PS på celleoverflaten erkarakteristisk
for celle-apoptose. Eksternalisering av PS ble analysert via flyt-cytometri ved bruk av
30
anneksin-V-sett. Celler ble høstet ved trypsinisering på slutten av inkubasjonen, og
deretter farget med anneksin V-FITC og propidium-iodid ("PS"). Ti tusen
59
cellehendelser ble samlet på et FACScan-flyt-cytometer. Anneksin V-positive og PInegative celler ble ansett som apoptopiske.
[0105] Aktivering av caspase-3, en cystein-protease kun aktivert i utførelsesfasen av
5
apoptose, ble fastslått ved bruk av et EnzChek caspase-3-analysesett.
[0106] Videre aktiveres kalsium- og magnesium-avhengige nukleaser som nedbryter
DNA i løpet av apoptose. Disse DNA-fragmentene vaskes ut, farges med propidiumjod
og analyseres ved bruk av flyt-cytometri. En cellepopulasjon med redusert DNA10
innhold ble ansett som en fraksjon av apoptotiske celler.
[0107] Anti-apoptotiske effekter av blandinger 5a og 5b ble observert ved relativt lave
konsentrasjoner 10 µM. Blandinger 5a og 5b (figur 3) reduserte antall anneksin Vpositive celler som vist i figur 6B, hindret caspase-3-aktivering som vist i figur 6C, og
15
hindret DNA-fragmentering som vist i figur 6D. Ved konsentrasjoner over 10 µM, ble
både 5a og 5b enten mindre beskyttende eller viste cytotoksisitet (Figur 6E). I
motsetning ga ikke 4-AT noen beskyttelse.
[0108] I motsetning var blanding 5c, som ikke har en fullstendig spesifiseringsdel,
20
ineffektiv i å beskytte MECer mot ActD-indusert apoptose (Figurer 6B og 6C) ved lave
konsentrasjoner. På samme måte er den hemigramicidin-peptidyl-spesifiserende
sekvensen avgjørende for anti-apoptotisk aktivitet av nitroksidkonjugater som de som
inneholder TEMPO.
25
[0109] Til slutt kunne også reduksjonen av blandinger 5a og 5b forårsake hemming av
mitokondriell oksidativ fosforylering, slik at ATP-nivåer med MECer behandlet med
disse blandingene ble testet. Som kjent for personer med normal kunnskap på feltet,
fungerer ATP som hovedenergikilden i biologiske organismer, reduksjon av ATPnivåer ville svekke normal cellefunksjon betydelig. ATP-nivåer i MECer i nærvær eller
30
fravær av 5a eller 2-deoksyglukose ("2-DG") ble brukt som en positiv kontroll (se figur
6F). Ved konsentrasjoner der de anti-apoptotiske effektene var maksimale (‫׽‬10 µM,
figur 6E), forårsaket ikke nitroksidkonjugater betydelige endringer i det cellulære ATP-
60
nivået. Derfor migrerer syntetiske GS-peptidylkonjugater inn i celler og mitokondrier
der de reduserer uten at det påvirker mitokondriens evne til å produsere ATP.
Eksempel 3
5
[0110] I en in vivo-analyse ble mellomtarmen hos rotter delt inn i en serie av godt
vaskulerte komponenter på en lignende måte som pølseledd. Lumenet i hver
tarminndeling ble fylt med en 3µL alikvot med testløsning. To av mellomtarmens deler
ble fylt kun med bindemiddel (f.eks. en løsning som inneholder minst delvis TEMPO10
avledningen). Disse to komponentene fungerte som interne kontroller for individuelle
variasjoner i sjokkets alvorlighet eller slimhinnens respons til sjokk.
[0111] Når dette analysesystemet brukes, ble åtte blandinger evaluert som vist i figur 5:
TEMPOL (Figur 5A), en dipeptid TEMPO-analog (Figur 5B - XJB-5-208), 3
15
hemigramicidin-TEMPO-konjugater (Figurer 5C XJB-5-125, 5E XJB-5-131 og 5G
XJB-5-197), og 3 hemigramicidin-blandinger som ikke har TEMPO-deler (Figurer 5D
- XJB-5-127, 5F - XJB-5-133, og 5H - XJB-5-194).
[0112] Hemorrhagisk sjokk hos rotter fører til de merkede forstyrrelsene i
20
tarmslimhinnens barrierefunksjon - med andre ord, slimhinnens permeabilitet av
sjokkede tarmsegmenter var betydelig større enn permeabiliteten av segmenter fra
normale rotter (52.3 +0.5 versus 6.9 + 0.1 nL•min-1•cm-2, henholdvis; p < 0.01), se
Tuominen, E. K. J., Phospholipid cytochrome c interaction: evidence for the extended
lipid anchorage, J. BIOL. CHEM., 277:8822-8826 (2002), også Wipf, P. et al.,
25
Mitochondria targeting of selective electron scavengers: synthesis and biological
analysis of hemigramicidin-TEMPO conjugates, J. AM. CHEM. SOC. 127:1246012461. På samme måte ble mus eksponert for 2 timers sjokk (Mean Arterial Pressure
("MAP") = 30 f 3 mm Hg), tarmsegmentene ble høstet og slimhinnens permeabilitet for
flourescein isotiocyanat-dekstran ("FD4") ble målt ex vivo. Dataen i figur 5 uttrykkes
30
som en prosentandel av endringspermeabiliteten relativ til den som ble observert i
samtidig analyserte kontrollsegmenter som ble lastet i løpet av sjokket med normal
saltløsning.
61
[0113] På samme måte ble intraluminal TEMPOL brukt som en "positiv kontroll" for
tarmslimhinne-beskyttelses-analyse. TEMPOL-konsentrasjoner >1 mM i tarmlumenet
forbedret hemorrhagisk sjokk-indusert slimhinne-permeabilitet i mellomtarmen (figur
5
5A). To av TEMPO-konjugatene, nemlig XJB-5-208 (Figur 5B) og XJB-5-131 (Figur
5C), forbedret også hemorrhagisk sjokk-indusert hyperpermeabilieten i mellomtarmen.
Den laveste effektive konsentrasjonen av XJB-5-208 (Figur 5B) og XJB-5-131 (Figur
5E) var 1µM; f.eks., var begge disse blandingene ‫׽‬1000-ganger mer potente enn
TEMPOL. To andre blandinger som bar TEMPO nyttelasten, XJB-5-125 (Figur 5C)
10
and XJB-5-197 (Figur 5G) kunne ikke gi beskyttelse mot tarmbarrieredysfunksjon
indisert av hemorrhage. XJB-5-133 (Figur 5F) har samme (hemigramicidin-basert)
mitokondrielle spesifiseringsdel som XJB-5-131 (Figur 5E). men mengler TEMPOnyttelasten. Det er derfor verdt å merke seg at t XJB-5-133 (figur 5F) ikke ga
beskyttelse mot utviklingen av slimhinnepermeabiliteten i mellomtarmen.
15
[0114] Ineffektiv var også de to andre hemigramicidin-baserte blandingene som også
manglet TEMPO-nyttelasten XJB-5-127 (figur 5D) og XJB-5-194 (figur 5H). Av de
undersøkte blandingene viste XJB-5-131 (figur 5E) seg å være den mest effektive, og
reduserte hemorrhagisk sjokk-indusert slimhinne-hyperpermeabilitet til ca. 60 % av
20
kontrollverdien.
[0115] Basert på resultatene som reflekteres i figurer 5A-5H, er både TEMPOnyttelasten og det "forankrende" hemigramicidin-fragmentet nødvendige deler som
skal være tilstede for effektiv elektron-fjerningsaktivitet fra XJB-5-131-blandingen. På
25
samme måte ble det oppdaget at XJB-5-131 forbedrer peroksideringen av
mitokondrielle fosfolipider (f.eks. ROS-aktivitet) i tarmslimhinnen fra rotter som
utsettes for hemorrhagisk sjokk.
[0116] I de påfølgende seriene av in vivo-studier ble effekten av intraluminal XJB-530
131 på hemorrage-indusert peroksidering av fosfolipider i tarmslimhinnen undersøkt.
Isolerte segmenter av mellomtarmen hos rotter ble inndelt i serier med godt
vaskulariserte komponenter på samme måte som pølseledd, og lumenet i hver
62
komponent ble fylt med samme volum mrd testløsning som inneholdt enten
bindemiddel eller en 10 µM-løsning med XJB-5-131, som tidligere ble indikert til å
være den mest aktive av hemigramicidin-TEMPO-konjugatene. I en foretrukket
legemliggjøring, ble 0,3 mL av testløsningen fylt i lumenet på hver mellomtarm-del.
5
[0117] Etter to timer med HS, ble prøver av slimhinnen i mellomtarmen fra
tarmsekkene fylt med bindemiddelet og XJB-5-131 ble hentet og sammenlignet med
mellomtarmslimhinne fra normale MECer. Alle prøver ble analysert med caspase 3
eller caspase 7-aktivitet, samt peroksidering av fosfatidylkoline ("PC"),
10
fosfatidyletanolamin ("PE"), fosfatidylserin ("PS"), og kardiolipin ("CL"), oppsummert
i figur 7.
[0118] Som kan ses fra figurer 7A-7D, behandling med XJB-5-131 forbedret
hemorrhage-indusert peroksidering av CL betydlig, den eneste testede fosfolipiden som
15
finnes i mitokondrier. Behandling med XJB-5-131 hadde imidlertid kun en liten effekt
på PE-peroksidering av PC og PS. Basert på disse trendene er hemorrhagisk sjokk
assosiert med betydelig oksidativt stress, selv i fravær av gjenopplivning. Videre
fastslår denne dataen også at XJB-5-131 er en effektiv ROS-skyller, da den lokaliseres
hovedsakelig i mitokondrier og beskytter CL mot peroksidering.
20
[0119] Relativ til aktiviteten som ble målt i prøver fra normale dyr, var aktiviteten til
caspases 3 og 7 betydelig økt i bindemiddelbehandlede slimhinneprøver fra rotter utsatt
for hemorrhage (figur 8). Da mellomtarmsegmentene ble fylt med XJB-5-131-løsning i
stedet for dens bindemiddel, ble aktiviteten til caspase 3 og 7 imidlertid betydelig
25
redusert. På samme måte er hemoragisk sjokk assosiert med aktivering av proapoptotiske baner i tarmens slimhinneceller. Videre støtter dataen oppfatningen om at
denne prosessen betydelig forbedrer mitokondriell behandling med XJB-5-131.
Eksempel 4
30
[0120] I en annen serie med eksperimenter ble monolag av enterocytt-aktige celler,
Caco-2BBe, studert for fysiologiske og pathofysiologiske formål for å fastslå
63
tarmbarrierefunksjonen. På samme måte som med tidligere Eksempler når det gjelder
ROS-eksmperimentering, øker permeabiliteten til Caco-2BBe monolag når cellene
inkuberes med ROS-hydrogenperoksid, eller menadion (en redoks-syklisk kinin som
fremmer danningen av superoksidanion-radikaler), se Baker, R. D. et al., Polarized
5
Caco-2 cells, Effect of reactive oxygen metabolites on enterocyte barrier function,
DIGESTIVE DIS. VIT. 40:510-518 (1995), og Banan, A. et al., Activation of deltaisoform of protein kinase C is required for oxidant-induced disruption of both the
microtubule cytoskeleton and permeability barrier of intestinal epithelia, J.
PHARMACOL. EKSP. THER, 303:17-28 (2002).
10
[0121] På grunn av resultater når det gjelder XJB-5-131 og dens forbedring av
hemorage-indusert CL-peroksidering i slimhinneceller in vivo (se tidligere nevnte
Eksempler 1 og 2), ble en mulig behandling ved bruk av XJB-5-131 undersøkt for å
avgjøre om menadion-indusert epitel-hyperpermeabilitet kan forbedres in vitro. I
15
hendhold til tidligere in vivo-observasjoner ble, Caco-2BBe monolag inkubert i fravær
av og nærvær av menadion, henholdsvis. Etter 6 timer, forårsaket inkubering av Caco2BBe monolag med menadion en betydelig økning i den apikal-basolaterale klaringen av
FD4 (Figure9). Behandling med 10 µM XJB-5-131 ga betydelig beskyttelse mot
menadion-indusert hyperpermeabilitet.
20
Eksempel 5
[0122] Som reflektert av ovennevnte in vivo- og in vitro-studier, hadde XJB-5-131
betydelige fordelaktige virkninger på flere biokjemiske og fysiologiske avlesninger. På
25
samme måte ble systemisk administrasjon av XJB-5-131 undersøkt når det gjelder om
den ville forlenge overlevelsen hos pasienter utsatt for alvorlige perioder med
hemoragisk sjokk med massivt blodtap i fravær av standard gjenopplivning med blod
og krystallinløsning. På samme måte som i studiene over ble rotter brukt som
testpasienter.
30
[0123] Totalt seksten rotter ble testet i denne studien. Rotter ble behandlet med 2.8
ml/kg bindemiddel eller samme volum med XJB-5-131-løsning i løpet av de endelige
64
20 min av blødningsprotokollen. Den totale dosen med infusert XJB-5-131 var 2
µmol/kg. Etter alvorlig hemoragisk sjokk i samsvar med protokollen som beskrives
over for de tidligere studiene, overlevde tretten i minst 60 min og fikk full dose av
enten XJB-5-131-løsning eller bindemiddelet, en 33:67 (v/v) blanding av DMSO og
5
normal saltløsning. Som vist i tabell 2 var blodglukose-, laktat- og g\hemoglobinkonsentrasjonene like i begge gruppene ved baselinje og før og umiddelbart etter
behandling. Ingen av mellom-gruppe-differansene var statistisk markante.
Tabell 2
Slutt på første
Slutt på andre
hemorrhagefase
hemorraghefase
143 + 5
255 + 30
219 + 26
XJB-5-131
134 + 4
228 + 24
201 + 38
Bindemiddel
1,8 + 0,4 606 + 0,8
5,9 + 1,3
(mEq/L)
XJB-5-131
1,8 + 0,2 5,7 + 0,8
5,6 + 1,2
Blod Hb-
Bindemiddel
12,7 +
11,1 + 0,3
9,4 + 0,2
10,7 + 0,3
9,4 + 0,3
Parameter
Sammensetning Baselinje
Blodglukose-
Bindemiddel
(mg/dL)
Blodlaktat-
konsentrasjon
konsentrasjon
konsentrasjon
(g/ dL)
0,5
XJB-5-131
12,7 +
0,3
10
[0124] Kort tid etter at behandlingen ble starter, ble det gjennomsnittlige arterielt trykk
("MAP") økt litt i begge grupper (se Figur 10A). I begge grupper stupte det
gjennomsnittlige arterietrykket ("MAP") i løpet av den første fasen med hemorrhageprotokoll og forble nesten konstant på 40 mm Hg i løpet av starten på andre fase. Seks
15
av de sju dyrene i den bindemiddelbehandlede (kontroll) gruppen døde innen en time
før slutten av blødningsprotokollen og alle var døde etter125 minutter (figur 10B).
Rotter som ble behandlet med intravenøs XJB-5-131 overlevde betydelig lenger enn de
65
som ble behandlet med bindemiddel. Tre av de seks rottene overlevde lenger enn 3
timer etter fullføring av blødningsprotokollen, én rotte overlevde hele den sekstimers
etter-blødnings-observasjonsperioden (Figur 10B).
5
[0125] På samme måte indikerer analyse ab XJB-5-131-studier at eksponering av
pasienten for blandingen forlenger tidsperioden som pasienter kan overleve etter å ha
mistet store mengder blod på grunn av traumatiske skader eller katastrofer (f.eks. en
abdominal aortisk aneurisme som sprekker).
10
[0126] Ved å forlenge behandlingsvinduet før ugjenkallelig sjokk utvikles, kan kanskje
behandling i felten med XJB-5-131 "kjøpe" nok tid til å transportere mer alvorlig
skadde pasienter til steder der endelige helsetjenester, inkludert blødningskontroll og
gjenopplivning med blodprodukter og ikke -bloddannende væsker, kan gis. Resultatene
ved bruk av en gnagermodell for hemorraghisk sjokk åpner også opp muligheten for at
15
legemidler som XJB-5-131 kan være fordelaktig ved andre tilstander tilknyttet
betydelig vevshypoperfusjon, som f.eks, slag og myokardisk infarkt.
[0127] Resultatene som presenteres heri støtter den generelle oppfatningen om at
mitokondriell spesifisering av ROS-skyllere er en fornuftig terapeutisk strategi. Selv
20
om tidligere studier har vist at behandling med TEMPOL er fordelaktig i gnager-HSsituasjoner, var en relativt stordose av blandingen nødvendig (30 mg/kg bolus + 30
mg/kg per t). Behandling med en dose XJB-5-131 som var rundt 300 ganger mindre
(‫׽‬0.1 mg/kg) var klart fordelaktig. Denne større potensen til XJB-5-131 sammenlignet
med TEMPOL reflekterer antageligvis tendensen til XJB-5-131 til å lokalisere i
25
mitokondrielle membraner, en hovedlegemliggjøring av oppfinnelsen. Som indikert
over er to hemigramicidin-4-amino-TEMPO-konjugater konsentrert i mitokondrien av
kulturer med muse-embryoniske celler etter inkubering med løsninger av blandinger.
[0128] Videre forlenget bruken av XJB-5-131 betydelig overlevelsen for rotter som ble
30
utsatt for massivt blodtap, selv om dyrene ikke ble gjenopplivet med verken blod eller
andre ikke-bloddannende væsker og de forble grunnleggende hypotensive.
66
[0129] I lys av det ovennevnte, trenger syntetisk hemigramicidin peptidyl-TEMPOkonjugater gjennom cellemembranen og også den mitokondrielle membranen der de
fungerer som frie radikaler-fjernere for ROS, som f.eks., men ikke begrenset til,
superokside anion-radikaler. Konjugatene reduseres deretter innen mitokondrien ved
5
elektron-transport-proteiner som er involvert i den cellulære-respirasjonsbanen, og
kobler dermed de avkoblede ROS-artene. Disse konjugatene har også den fordelen at
de, som diskutert over, er anti-apoptoiske, spesielt når det gjelder blandinger som 5a og
5b.
10
[0130] Ved å effektivt redusere mengden ROS-arter, kan en pasientes tilstand,
inkludert sykdom eller annen medisinsk tilstand forbedres, og i enkelte tilfeller kan
overlevelsen forlenges, som beskrevet i eksempel Eksempel IV-studien. Eksempler på
slike tilstander, inkludert sykdommer og andre medisinske tilstander, inkludert (men er
ikke begrenset til) følgende medisinske tilstander som inkluderer sykdommerog
15
tilstander: myokardisk iskemi og reperfusjon (f.eks. etter angioplasti og stenting for
administrasjon av ustabil angina eller myokardisk infarkt), solid organ (lunge, lever,
nyre, bukspyttkjertel, tarm, hjerte) transplantasjon, hemorraghisk sjokk, septisk sjokk,
slag, vevskade på grunn av ioniseringsstråling, lungeskade, akutt respiratorisk distress
syndrom /ARDS), nekrotiserende pankreatitt og nekrotiserende enterokolitt.
20
Eksempel 6
[0131] I en videre legemliggjøring, i støtte av byttbarheten av innholdet i de
mitokondrier-spesifiserende gruppene, består en blanding for fjernende radikaler i en
25
mitokondriell membran av en radikal skyllende agent eller en NOS-hemmer og en
membranaktiv peptidylfragment som har en høy affinitet med den mitokondrielle
membranen. Det membranaktive peptidylfragmentet har fortrinnsvis en egenskap valgt
fra gruppen som består av antioksidant, radiobeskyttende, beskyttende, anti-apoptotisk,
terapeutisk, forbedrende, NOS-antagonisk og kombinasjoner av dette. I en relatert
30
legemliggjøring, når det gjelder blandinger med antibiotiske egenskaper, er det generelt
fordelaktig å bruke blandinger som har en handlingsmodus som inkluderer
bakterieveggmål.
67
[0132] I en annen legemliggjøring velges den membranaktive blandingen fotrinnsvis
fra gruppen som består av bacitraciner, gramicidiner, valinomyciner, enniatiner,
alameticiner, beauvericin, serratomolid, sporidesmolid, tyrocidiner, polymyksiner,
monamyciner og lissoclinumpeptider.
5
[0133] I en relatert legemliggjøring velges NOS-antagonisten fra gruppen som består
av XJB-5-234 (a), XJB-5-133 (b), XJB-5-241 (c), og XJB-5-127 (d), som består av
AMT NOS antagonist-innhold:
10
Eksempel 7
[0134] Følgende eksempler gir protokoller for ekstra innhold som kan brukes i
15
blandinger som er beskrevet her som fungerer som NOS-antagonister.
[0135] Blanding (1) er Boc-Leu-ψ[(E)-C(CH3)=CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-AMT
(XJB-5-241) og ble fremstilt i henhold til følgende proyokoll. En løsning på 11.0 mg
68
(13.2 µmol) med Boc-Leu-ψ[(E)-C(CH3)=CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe (2-48) i
400 µL av MeOH ble behandlet ved 0 °C with 132 µL (132 µmol) av 1 N NaOH.
Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 8 t og behandlet med 132 µL (132
µmol) av 1 N HCl. TLøsningen ble ekstrahert med CHCl3 og det organiske laget ble
5
tørket (Na2SO4) og konsentrert in vacuo for å gi den rå syren som en fargeløs form.
Denne syren ble oppløst i 2.00 mL av CHCl3 og behandlet ved romtemperatur med 2.1
mg (16 µmol) av HOBt, 3.0 mg (16 µmol) av EDC, 3.3 mg (20 µmol) av 2-amino-5,6dihydro-6-metyl-4H-1,3-thiazin • HCl og 3.5 mg (27 µmol) av DMAP. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 48 t, uttynnet med CHCl3, og vasket med H2O.
10
Det organiske laget ble tørket (Na2SO4), konsentrert in vacuo, og renset med
kromotomatografi på SiO2 (1:1, heksanes/EtOAc etterfulgt av 20 : 1, CHCl3/MeOH)
for å gi 11 mg (89%) of XJB-5-241 som et fargeløst pulver. Følgende karakterisering
ble oppnådd: LC-MS (Rt 8.37 min, lineær gradient 70% til 95% CH3CN (H2O) i 10
min, 0.4 mL/min; m/z = 932.4 [M+H]+, 954.3 [M+Na]+) og HRMS (ESI) m/z kalkulert
15
for C50H74N7O8S (M+H) 932.5320, funnet 932.5318.
[0136] Blanding (2) er Boc-Leu-ψ[(E)-CH=CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-AMT (XJB5-133) og ble fremstilt i henhold til følgende protokoll. En løsning på 20.0 mg (24.3
20
µmol) på 2-85 (XJB-5-194) i 800 µL av MeOH ble behandlet ved 0 °C med 243 µL
(243 µmol) av 1 N NaOH. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 86 t og
behandlet med 243 µL (243 µmol) av 1 N HCl. Løsningen ble ekstrahert med CHCl3
og det organiske laget ble tørket (Na2SO4) og konsentrert in vacuo for å gi den rå syren
som en fargeløs form. Denne syren ble oppløst i 1.00 mL av CHCl3 og behandlet ved
25
romtemperatur med 3.9 mg (29 µmol) of HOBt, 5.6 mg (29 µmol) av EDC, 6.1 mg (37
69
µmol) of 2-amino-5,6-dihydro-6-metyl-4H-1,3-thiazine • HCl og 7.4 mg (61 µmol) av
DMAP. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 20 t, uttynnet med CHCl3,
og vasket med H2O. Det organiske laget ble tørket (Na2SO4), konsentrert in vacuo, og
renset med kromotomatografi på SiO2 (1:1, heksaner/EtOAc etterfulgt av 20 : 1,
5
CHCl3/MeOH) og en ekstra kalrgjørende C18 reversfase HPLC-rensing ble utført: 80%
to 100% CH3CN (H2O) i 20 min, 5.0 mL/min) for å gi 12.9 mg (58%) of XJB-5-133
som et fargeløst pulver. Følgende karakterisering ble oppnådd: LC-MS (Rt 7.89 min,
lineær gradient 70% til 95% CH3CN (H2O) i 10 min, 0.4 mL/min; m/z = 918.3 [M+H]+,
940.3 [M+Na]+) og HRMS (ESI) m/z kalkulert for C49H72N7O8S (M+H) 918.5163,
10
funnet 918.5185.
[0137] Blanding (3) er Boc-Leu-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-AMT (XJB-5-127) og ble
fremstilt i henhold til følgende protokoll. En løsning på 24.0 mg (28.7 µmol) av Boc15
Leu-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe i 800 µL of MeOH ble behandlet ved 0 °C med 287
µL (287 µmol) av 1 N NaOH. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 5 t og
behandlet ved 0 °C med 287 µL (287 µmol) av 1 N HCl. Løsningen ble ekstrahert med
CHCl3 og det organiske laget ble tørket (Na2SO4) og konsentrert in vacuo for å gi
råsyren som et fargeløst skum. Denne syren ble oppløst i 2.00 mL av CHCl3 og
20
behandlet ved romtemperatur med 4.6 mg (34 µmol) of HOBt, 6.6 mg (34 µmol) of
EDC, 5.7 mg (34 µmol) of 2-amino-5,6-dihydro-6-methyl-4H-1,3-thiazine • HCl og
8.8 mg (72.0 µmol) of DMAP. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 24 t,
uttynnet med CHCl3, og vasket med H2O. Det organiske laget ble tørket (Na2SO4),
konsentrert in vacuo, og renset med kromotomatografi på SiO2 (2:1, hexanes/EtOAc
25
etterfulgt av 20 : 1, CHCl3/MeOH) for å gi 17,0 mg (63%) of XJB-5-127 som et
fargeløst pulver. Følgende karakterisering ble oppnådd: LC-MS (Rt 6.32 min, lineær
gradient 70% ti 95% CH3CN (H2O) i 10 min, 0.4 mL/min; m/z = 935.3 [M+H]+, 957.3
70
[M+Na]+) og HRMS (ESI) m/z kalkulert for C48H71N8O9S (M+H) 935.5065, funnet
935.5044.
5
[0138] Blanding (4) er Boc-Leu-ψ[(E)-CH=CH]-DPhe-AMT (XJB-5-234). En løsning
med Boc-Leu-ψ[(E)-CH=CH]-DPhe-OH (2-84) (30.5 µmol) in 2.00 mL av CH2Cl2 ble
behandlet ved 0 °C with 6.1 mg (37 µmol) of 2-amino-5,6-dihydro-6-metyl-4H-1,3thiazine • HCl, 7.0 mg (37 µmol) of EDC, 4.9 mg (37 µmol) of HOBt, og 9.3 mg (76
µmol) av DMAP. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtempertur over natten,
10
konsentrert i in vacuo og renset med kromotomatografi på SiO2 (2 : 1, CH2Cl2/EtOAc)
for å gi 9.1 mg (63%) av XJB-5-234 som et fargeløst skum. Følgende karakterisering
ble oppnådd: LC-MS (Rt 8.42 min, lineær gradient 70% til 95% CH3CN (H2O) i 10
min, 0.4 mL/min; m/z = 474.5 [M+H]+) og HRMS (ESI) m/z kalkulert for C26H40N3O3S
(M+H) 474.2790, funnet 474.2781.
15
[0139] Blanding (5) er Boc-Leu-ψ[(Z)-CF=CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-TEMPO
(XJB-7-53). En løsning på 3.4 mg (4.1 µmol) av Boc-Leu-ψ[(Z)-CF=CH]-DPhe-ProVal-Orn(Cbz)-OMe XJB-5-66) i 400 µL av MeOH ble behandlet ved 0 °C med 41 µL
20
(41 µmol) av 1 N NaOH. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 12 t og
behandlet med 41 µL (41 µmol) av 1 N HCl. TLøsningen ble ekstrahert med CHCl3 og
det organiske laget ble tørket (Na2SO4) og konsentrert in vacuo for å gi den rå syren
som en fargeløs form. Denne syren ble oppløst i 400 µL med CHCl3 og behandlet ved
romtemperatur med 0.7 mg (5 µmol) of HOBt, 0.9 mg (5 µmol) of EDC, 0.5 mg (4
25
µmol) of 4-amino-TEMPO og 1.1 mg (6 µmol) of DMAP. Reaksjonsblandingen ble
71
rørt ved romtemperatur i 12 t, uttynnet med CHCl3, og vasket med H2O. Det organiske
laget ble tørket (Na2SO4), konsentrert in vacuo, og renset med kromotomatografi på
SiO2 (1 : 1, heksaner/EtOAc etterfulgt av 20 : 1, CHCl3/MeOH) for å gi 3,6 mg (91%)
of XJB-7-53 som et fargeløst skum. Følgende karakterisering ble oppnådd: LC-MS (Rt
5
8.45 min, lineær gradient 70% to 95% CH3CN (H2O) i 10 min, 0.4 mL/min; m/z =
977.5 [M+H]+, 999.5 [M+Na]+) og HRMS (ESI) m/z kalkulert for C53H79FN7O9Na
(M+Na) 999.5821.
10
[0140] Blanding (6) er Boc-DPhe-ψ[(E)-C(CH3)=CH]-Ala-Val-Orn(Cbz)-Leu-AMT
(XJB-7-42) og ble fremstilt i henhold til følgende protokoll. En løsning på 4.5 mg (5.6
µmol) av Boc-DPhe-ψ[(E)-C(CH3)=CH]-Ala-Val-Orn(Cbz)-Leu-OMe (2-119) i 0.35
mL av MeOH ble behandlet ved 0 °C med 56 µL (56 µmol) av 1 N NaOH. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 12 t og behandlet med 56 µL (56 µmol) av 1 N
15
HCl. TLøsningen ble ekstrahert med CHCl3 og det organiske laget ble tørket (Na2SO4)
og konsentrert in vacuo for å gi den rå syren som en fargeløs form. Denne syren ble
oppløst i 0.80 mL av CHCl3 og behandlet ved romtemperatur med 0.9 mg (6.7 µmol)
av HOBt, 1.3 mg (6.7 µmol) av EDC, 1.4 mg (8.4 µmol) av 2-amino-5,6-dihydro-6metyl-4H-1,3-thiazine • HCl og 1.7 mg (14 µmol) og DMAP. Reaksjonsblandingen ble
20
rørt ved romtempertur i 36 t, konsentrert in vacuo og renset med kromotomatografi på
SiO2 (20 : 1, CHCl3/MeOH) for å gi 5.0 mg (99%) of XJB-7-42 som et fargeløst skum.
Følgende karakterisering ble oppnådd: LC-MS (Rt 6.61 min, lineær gradient 70% to
95% CH3CN (H2O) in 10 min, 0.4 mL/min; m/z = 907.3 [M+H]+, 929.4 [M+Na]+) og
HRMS (ESI) m/z kalkulert for C48H72N7O8S (M+H) 906.5163, funnet 906.5190.
25
72
[0141] Sammensetning (7) er Boc-DPhe-ψ[(E)-C(CH3)=CH]-Ala-Val-AMT (XJB-743). En løsning på 14.3 µmol av crude Boc-DPhe-ψ[(E)-C(CH3)=CH]-Ala-Val-OMe
(2-111) i 1.00 mL av CHCl3 ble behandlet ved romtemperatur med 2.3 mg (17 µmol)
av HOBt, 3.3 mg (17 µmol) av EDC, 3.6 mg (22 µmol) av 2-amino-5,6-dihydro-65
methyl-4H-1,3-thiazin • HCl og 4.4 mg (36 µmol) av DMAP. Reaksjonsblandingen ble
rørt ved romtempertur i 36 t, konsentrert in vacuo og renset med kromotomatografi på
SiO2 (20 : 1, CHCl3/MeOH) for å gi 7.5 mg (96%) of XJB-7-43 som et fargeløst skum.
Følgende karakterisering ble oppnådd: LC-MS (Rt 5.41 min, lineær gradient 70% to
95% CH3CN (H2O) i 10 min, 0.4 mL/min; m/z = 545.3 [M+H]+, 567.3 [M+Na]+) og
10
HRMS (ESI) m/z kalkulert for C29H44N4O4S (M+Na) 567.2981, funnet 567.2971.
[0142] Blant de foretrukne radikale fjerningsagentene er et materiale valgt fra gruppen
som består av ubikinon-analog, en ubikinon-analogfragmentdel, en ubikinonanalogfragmentdel sommangler en hydrofilisk hale, en superoksid dismutase
15
etterligning, en superoksid dismutase bioetterligning eller en salen-mangan-blanding.
[0143] Personer med normal kunnskap på feltet kjenner til at ioniserende stråling
aktiverer en mitokondriell nitrogenoksydsyntase ("mtNOS"), som fører til en hemming
av respirasjonskjeden, generering av overflødig superoksid-radikaler, peroksynitritt20
produksjon og nitrosative skade. Skaden fra ioniserende stråling menes å være lindret
[See Kanai, A.J. et al., Am J Physiol. 383: F1304-F1312 (2002); og Kanai, A.J. et al.,
Am J Physiol. 286: H13-H21 (2004)]. Sammensetningen av denne legemliggjøringen
er karakterisert ved hemming av mtNOS, og dermed motvirking av genereringen av
overflødig superoksidredikaler, peroksynitritt og nitrosativ skade.
25
[0144] Beskyttelse mot strålingsskade ved bruk av systemisk legemiddellevering kan
føre til uønskede bivirkninger. En tilnærming for å begrense eller hindre disse
bivirkningene er å rette legemiddellevering til mitokondrier ved bruk av en peptidbærestoff til mitokondrier ved bruk av en peptidbæremiddelstrategi.
30
[0145] I en legemliggjøring ble en potent NOS-hemmer, den ikke-arginine analogen av
2-amino-6-metyl-thiazine ("AMT"), valgt som innhold. Stråling av ureoitelium fører til
73
økt produksjon av superosid og nitriloksid ("NO"), museblærer instillert med AMT
eller 4-amino-TEMPO for å avgjøre om hemming av NO eller fjerning av frie radikaler
er mer radiobeskyttende.
5
[0146] En ukonjugert og en konjugert NOS-antagonist (AMT, 100 µM) og en
ukonjugert og konjugert nitroksidavledning (4-amino-TEMPO, 100 µM) inkubert i to
timer ved 37°C med 32D c13 hemopoietiske celler.
10
[0147] Etter inkubering ble cellene lysert og mitokondriene isolert for en massespektomianalyse der blandinger isolerte fra mitokondrier ble identifiserte som Na+
addukter. De resulterende spektra (ikke vist) viser at 4-amino-TEMPO kun
gjennomtrenger den mitokondrielle membranen med hjelp av den festede GS-avledede
målsekvensen. Videre spaktra (ikke vist) indikerer at ukonjugert AMT ikke kommer
15
inn i den mitokondrielle membranen i betydelige mengder. Dermed retter målpeptidene
vellykket en NOS-antagonist og en nitroksid til mitokondrier.
[0148] Videre fysiologiske studier ble utført for å avgjøre effektene av peptidspesifisert AMT og 4-amino-TEMPO på NO og peroksynitritt-produksjon i bestrålte
20
uroepitel-celler. Cellene ble dyrket i et 8-veggs skyvekammer i 3 dager og deretter ble
mikrosensormålinger tatt i 24 timer etter stråling.
[0149] I ubehandlede bestrålte celler og celler behandlet med ukonjugerte 4-aminoTEMPO (100 µM) eller ukonjugert AMT (10 µM), capsaicin fremkalt NO-produksjon
25
og første til danningen av en sammenlignbar mengde peroksynitritt. I celler som er
behandlet med høydose-konjugert 4-amin-TEMPO (100 µM), peroksynitrittproduksjonble redusert med ca. 4 ganger. I ikke-bestrålte celler eller celler behandlet
med konjugert AMT (10 µM), var NO-indusert peroksynitrittdanning nesten
74
fullstendig hindret. Dette antyder at peptid konjugerer par eller kovalent kobler med
membran-ugjennomtrengelig 4-amino-TEMPO eller AMT og tilrettelegger transport av
4-amin-TEMPO på tvers av den mitokondrielle membranen. Videre foreslår denne
dataen at peptidkonjugeringer ikke forstyrrer NOS hemmende aktivitet av AMT eller
5
den frie radikalfjernende aktiviteten til 4-amino-TEMPO og at AMT er en mer effektiv
radiobeskytter [Kanai, A.J. et al., Mitochondrial Targeting of Radioprotectants Using
Peptidyl Conjugates, ORGANIC AND BIOMOLECULAR CHEMISTRY (i trykk)].
[0150] Kvantitativ massespektrometristudier ble brukt for å sammenligne effektiviteten
10
til flere AMT-peptid-konjugater i å gjennomtrenge den mitokondrielle membranen,
spesifikt XJB-5-234, XJB-5-133, XJB-5-241 og XJB-5-127. fmole/10µM mitokondriproteiner gir en relativ kvantifisering av konjugatkonsentrasjon på målstedet. Tabell 3
indikerer at den mest virkningsfulle konjugaten var blanding XJB-5-241.
15
Tabell 3
Sammensetning
fmole/10 µM mitokondrielt protein
XJB-5-234
1,45
XJB-5-133
89,8
XJB-5-241
103,3
XJB-5-127
50,8
[0151] Den trisubstituerte (E)-alken-delen innlagt i XJB-5-241 har en sterkere
konformasjonseffekt enn den mindre biologisk aktive disubstituerte (E)-alken XJB-5133 eller GS peptidylfragmentet XJB-5-127, see Wipf, P. et al., Methyl- and
20
(Triluoromethyl)alkene Peptide Isosteres: Synthesis and Evaluation of Their Potential
as β-Turn Promoters and Peptide Mimetics J ORG. CHEM. 63:6088-6089 (1998); også
Wipf, P. et al., Imine Additions of Internal Alkynes for the Synthesis of Trisubstituted
(E)-Alkene and Cyclopropane Peptide Isosteres ADV. SYNTH. CAT. 347:1605-1613
(2005). Dataen indikerer at en definert sekundær struktur og en egnet konformasjons-
75
forhåndsorganisasjon er viktig for å oppnå mitokondriell gjennomtrengning av
blandinger som reduserer nitrosative og oksidative effekter.
[0152] Tilstedeværelsen av en ikke-hydrolyserbar alken-isoster fungerer i stedet for
5
labile peptidbindinger er betydelig i en forlenget handlingsmekanisme. Den relativt
stive (E)-alkenes (ψ[(E)-C(R)=CH]) representerer nyttig, konformasjonelt
forhåndsorganiserte strukturelle etterligninger og har blitt brukt som erstatninger av
hydrolytisk labile amidbindinger i en rekke enzymhemmere. Det primære målet med
denne strategien er den nøyaktige etterligningen av geometrien til peptidbindingen,
10
men, (E)-alkener modulerer også de fysiokjemiske egenskapene, oppløseligheten og
lipofilisiteten, antall hydrogendonorer og mottakere, etc, av foreldrestrukturene, og har
derfor generelt en annen metabolsk skjebne enn enkle peptider.
[0153] En målrettet leveringsstrategi brukt i denne oppfinnelsen er fordelaktig ettersom
15
enkelte neuronale NOS (nNOS) antagonister og de fleste antiokSIDanter, inkludert
nitroksidderivater, har dårlig cellegjennomtrenging og trenger terapeutisk effektive
konsentrasjoner som er større enn 100 µM hvis de ikke brukes med en konjugat.
[0154] Metoden som er tilknyttet denne legemliggjøringen av oppfinnelsen gir en
20
komposisjon til mitokondrier som består av å transport et ønsket innhold til nevnte
mitokondrier, som for eksempel kan være (a) en radikal-fjernende agent ved bruk av et
membranaktivt peptidylfragment som fortrinnsvis har et β-plass motiv som har en høy
affinitet for den mitokondrielle membranen eller (b) en nitrogenoksydsyntaseantagonist bundet til det membranaktive peptidylfragmentet.
25
Eksempel 8- Syntese av JP4-039 (se figur 11)
[0155] Syntese av JP4-039 ble oppnådd i henhold til følgende.
76
[0156] (R,E)-2-Metyl-N-(3-metylbutyliden)propan-2-sulfinamid (1) (Staas, D. D.;
Savage, K. L.; Homnick, C. F.; Tsou, N.; Ball, R. G. J. Org. Chem., 2002, 67, 8276) Til en løsning av isovaleraldehyd (3-Metylbutyraldehyd, 5.41 mL, 48.5 mmol) i
CH2Cl2 (250 mL) ble lagt til (R)-2- metylpropan-2-sulfinamide (5.00 g, 40.4 mmol),
5
MgSO4 (5.0 eq, 24.3 g, 202 mmol) og PPTS (10 mol%, 1.05 g, 4.04 mmol) og den
resulterende løsningen ble rørt ved RT (romtemperatur, ca 25°C) for 24 h. Reaksjonen
ble filtrert gjennom en pute med Celite® and rå-reststoffet ble renset ved kromatografi
på SiO2 (3:7, EtOAc:heksaner) for å gi 6.75 g (88%) som en fargeløs olje. 1H NMR δ
8.07 (t, 1 H, J = 5.2 Hz), 2.47-2.38 (m, 2 H), 2.18-1.90 (m, 1 H), 1.21 (s, 9 H), 1.00 (d,
10
6 H, J = 6.7 Hz). Som et alternativ gir filtrering gjennom en pute av SiO2 rå-imin som
fungerer like bra i påfølgende reaksjoner.
[0157] (But-3-ynyloxy)(tert-butyl)difenylsilan (2) (Nicolaou, K. C. et al.. J. Am.
15
Chem. Soc. 2006,128, 4460) - Til en løsning av 3-butyn-1-ol (5.00 g, 71.3 mmol) i
CH2Cl2 (400 mL) ble tilsatt imidazol (5.40 g, 78.5 mmol) og TBDPSCl ((tert-butyl)
difenylsilanklorid) (22.0 g, 78.5 mmol) og reaksjonen ble rørt ved RT i 22 t.
Reaksjoner ble filtrert gjennom en pute med SiO2, SiO2 ble vasket med CH2Cl2 og den
fargeløse løsningen er konsentrert til å gi 21.4 g (97%) rå-alkyn som ble utført uten
20
videre rensing.
[0158] (S,E)-8-(tert-Butyldifenylsilyloksy)-2-metyloct-5-en-4-aminhydroklorid (3) Til en løsning av (2) (15.9 g, 51.5 mmol) i CH2Cl2 (300 mL) ble tilsatt zirconocene25
hydrokloride (15.1 g, 58.4 mmol) i 3 deler og den resulterende løsninger ble rørt ved
RT i 10 min. Den resulterende gule løsningen ble avkjølt til 0 °C og Me3Al (2.0 M i
heksaner, 27.5 mL, 54.9 mmol) ble tilsatt og rørt i 5 minutter etterfulgt av tilsetting av
imin (1) (6.50 g, 34.3 mmol) i CH2Cl2 (50 mL) og den oransje løsningen ble rørt i
ekstra 4 t mens den ble varmet til rt. Reaksjonen ble avkjølt med MeOH, uttynnet med
77
H2O og CH2Cl2 og HCl (1 M) ble lagt til for å bryte opp emulsjonen (forlenget røring
med Rochelle-salt kan også brukes). Det organiske laget ble separert og det
vannholdige laget ble vasket med CH2Cl2 (2x). De organiske lagene ble kombinert,
vasket med saltløsning, tørket (MgSO4), filtrert gjennom en pute med Celite® og
5
konsentrert. Ettersom råoljen ble kontaminert med metallsalter, ble oljen oppløst i Et20
(diethyl ether, Et = etyl), og fikk sette seg i 2 t og deretter filtrert gjennom en pute av
Celite® og konsentrert. Analyse av råoljeresten ved 1H NMR viste kun 1 diastereomer
(> 95:5 dr).
10
[0159] Til råoljeresten i Et2O (800 mL) ble HCl tilsatt (4.0 M i dioksan, 17.2 mL, 68.7
mmol) og reaksjonen ble rørt i 30 minutter, og i løpet av denne tiden ble et hvitt
presipitat dannet. Det utskilte produktet ble filtrert, vasket med tørr Et2O, og tørket for
å oppnå 11.0 g (74% over 2 trinn) av (3) som en fargeløst fast stoff. mp 151-154°C;
[α]D -2.9 (c 1.0, CH2Cl2); 1H NMR δ 8.42 (bs, 3 H), 7.70-7.55 (m, 4 H), 7.48-7.30 (m,
15
6 H), 5.90 (dt, 1 H, J = 14.9, 7.5 Hz), 5.52 (dd, 1 H, J = 15.4, 8.4 Hz), 3.69 (appt, 3 H,
J = 6.5 Hz), 2.45-2.20 (m, 2 H), 1.80-1.50 (m, 3 H), 1.03 (s, 9 H), 0.95-0.84 (m, 6 H);
13
C NMR δ 135.5, 134.5, 133.7, 129.5, 127.6, 127.3, 63.0, 52.9, 42.1, 35.6, 26.7, 24.4,
22.9, 21.5, 19.1; EIMS m/z 395 ([M-HCl]+, 40), 338 (86), 198 (100); HRMS (EI) m/z
kalkulert for C25H37NOSi (M-HCl) 395.2644, funnet 395.2640.
20
[0160] (S,E)-tert-Butyl 8-(tert-butyldifenylsilyloksy)-2-metyloct-5-en-4-ylkarbamat
(4) - Til en løsning av (3) (10.5 g, 24.3 mmol) i CH2Cl2 (400 mL) ble tilsatt Et3N
(trietylamin) (3.0 eq, 10.3 mL, 72.9 mmol) og Boc2O (1.05 eq, 5.74 g, 25.5 mmol) og
25
den resulterende suspensjonen ble rørt ved RT i 14 t. Reaksjonen ble avkjølt med sat.
aq. NH4Cl, de organiske lagene ble separert, tørket (MgSO4), filttrert og konsentrert.
Råoljeresten ble videreført til neste trinn uten videre rensing.
78
[0161] (S,E)-tert-Butyl 8-hydrosky-2-metylokt-5-en-4-ylkarbamat (5) - Til en
løsning med rå (4) (12.0 g, 24.3 mmol) i THF (200 mL) ved 0°C ble TBAF tilsatt (1.0
M i THF, 1.25 eq, 30.4 mL, 30.4 mmol) og reaksjonen ble varmet til RT og rørt i 2 t.
Reaksjonen ble avkjølt med sat. aq. NH4Cl, det organiske laget ble separert, tørket
5
(MgSO4), filtrert og konsentrert. Rå-resten ble renset med kromatografi på SiO2 (3:7,
EtOAc:heksaner) for å gi 5.51 g (88%, 2 trinn) som en fargeløs olje. [α]D -12.7 (c 1.0,
CH2Cl2); 1H NMR δ 5.56 (dt, 1 H, J = 15.3, 6.9 Hz), 5.41 (dd, 1 H, J = 15.4, 6.4 Hz),
4.41 (bs, 1 H), 4.06 (bm, 1 H), 3.65 (appbq, 2 H, J = 5.7 Hz), 2.29 (q, 2 H, J = 6.3 Hz),
1.76 (bs, 1 H), 1.68 (m, 1 H), 1.44 (s, 9 H), 1.33 (m, 2 H), 0.92 (m, 6 H); 13C NMR δ
10
155.4, 134.3, 126.9, 79.2, 61.5, 50.9, 44.5, 35.6, 28.3, 24.6, 22.5; EIMS m/z 257 ([M]+,
10), 227 (55), 171 (65); HRMS (EI) m/z kalkulert for C14H27NO3 257.1991, funnet
257.1994.
15
[0162] (S,E)-5-(tert-Butoksykarbonylamino)-7-metylokt-3-enolsyre (6) - Til en
løsning på (5) (1.00 g, 3.89 mmol) i aceton (40 mL) ved 0°C ble en ferskt tilberedet
løsning med Jones Reagent tilsatt (2.5 M, 3.89 mL, 9.71 mmol) og reaksjonen ble rørt
ved 0°C i 1 t. Den mørke løsningen ble ekstrahert med Et2O (3 x 50 mL), de organiske
lagene ble vasket med vann (2 x 75 mL), saltløsning (1 x 50 mL), tørket (Na2SO4),
20
filtrert og konsentrert for å 990 mg (94% rå) av syre (6) som en gul olje som ble brukt
uten videre rensning.
[0163] TEMPO-4-yl-(S,E)-5-(tert-butoksykarbonylamino)-7-metyloct-3-enamid (7)
25
- Til en løsning på (6) (678 mg, 2.50 mmol, rå) in CH2Cl2 (35 mL) ved 0°C ble 4amino tempo tilsatt (1.5 eq, 662 mg, 3.75 mmol), EDCI (1.2 eq, 575 mg, 3.00 mmol),
DMAP (1.1 eq, 339 mg, 2.75 mmol) og HOBt-hydrat (1.1 eq, 377 mg, 2.75 mmol) og
79
den resulterende oransje løsningen ble rørt ved RT i 14 t. Reaksjonen ble tynnet ut med
CH2Cl2, vasket med sat. aq. NH4Cl og det organiske laget tørket (Na2SO4), filtrert og
konsentrert. Rå-resten ble renset med kromatografi på SiO2 (1:1 til 2:1,
EtOAc/heksaner) for å gi 857 mg (76%, 2 trinn) som en ferskenfarget fast stoff. 61°C
5
(mykningspunkt: 51°C); [α]D23 +35.6 (c 0.5, DCM); ESIMS m/z 365 (40), 391 (50),
447 ([M+Na]+, 100), 257 (20); HRMS (ESI) m/z kalkulert for C23H42N3O4Na 447.3073,
funnet 447.3109.
[0164] Blandingene vises for Blanding 4 over, kan syntetiseres som vist i figur 11B.
10
Kort forklart ble syntese utført på følgende måte: Til en løsning av blanding (1) i
CH2Cl2 ble zirconocenhydroklorid tilsatt, etterfulgt av tilsetting av Me2Zn, deretter en
løsning av N-difenylfosforyl-1-fenylmetanimin (Imin). Reaksjonsblandingen ble
refluksert, filtrert, vasket og tørket for å gi (2). Spalting av TBDPS-beskyttende gruppe
ble oppnådd ved å behandle (2) med TBAF, noe som førte til danning av (3).
15
Terminalalkoholen (3) ble dehydrert til alken (4), som ble videre behandlet med
ozonolyse for å gi ester (5). Lignende protokoller som er gitt for syntesen av JP4-039,
over, ble brukt for å asylere aminogruppen med den Boc-beskyttende gruppen og å
reagere terminal-karkoksylsyren med 4-amino-TEMPO for å gi (6).
20
Eksempel 9 - En mitokondri-rettet nitroksid/hemigramicidin S-konjugat
beskytter mus-embryoniske celler mot gammastråling (se, Jiang, J, et al., Int. J.
Radiation Oncology Biol. Fys., Vol. 70, Nr. 3, s. 816-825, 2008)
[0165] EPR-basert analyse for integrering og distribusjon av nitroksider. For å
25
sammenligne integreringens effektivitet, ble mus-embryoniske celler (1×107/mL)
inkubert med 10 µM nitroksider i 10 min. ESR-spektra med nitroksidradikaler i
inkubasjonsmediet, celle-suspensjonen eller den mitokondrielle suspensjonen ble
registrert etter bladning med acetonitril (1:1 v/v) etter 5-min inkubasjon med 2 mM
K3Fe(CN)6 ved bruk av JEOL-RE1X EPR spektrometer under følgende forhold: 3350
30
G senterfelt, 25 G skanningsområde 0.79 G feltmodulering, 20 mW mikrobølgeeffekt
0.1 s tidskonstant 4 min skannetid Integreringseffektiviteten ble kalkulert som (EinitialEmedium)/Einitial×100%. Mitokondrier ble isolert ved bruk av et mitokondri-isoleringssett
80
(Pierce, Rockford, IL) i henhold til produsentens instruksjon. Mengder av
nitroksidradikaler integrert inn i mitokondrier blenormalisert til innholdet av cytokrom
C oksidase underenhet IV.
5
[0166] Superoksidgenerering. Oksideringsavhengig fluorogenisk farge, DHE, ble
brukt for å evaluere intracellulær produksjon av superokside radikaler. DHE er cellepermeabel og oksideres, i nærvær av superoksid, til fluorescerende etidium som
innskytes til DNA. Kort forklart ble cellene behandlet med 5 µM DHE i 30 min ved
slutten på inkubasjonstiden. Celler ble deretter innsamlet ved trypsinisering og
10
resuspendert i PBS. Fluoresencen av etidium ble målt ved bruk av et FACSkan-flytcytometer (Becton-Dickinson, Rutherford, NJ) levert sammen med CellQuestprogramvaren. Gjennomsnittlig fluorescence-intensitet fra 10 000 celler ble oppnådd
ved bruk av et 585/42-båndpass-filter.
15
[0167] CL-oksidering. CL hydroperoksider ble avgjort ved fluorescence HPLC av
produkter dannet i MP-11-katalysert reaksjon med et fluorogenisk substrat, Amplex
Red. Oksiderte fosfolider ble hydrolysert ved pankreatisk fosfolipase A2 (2 U/ml) i en
25 mM fosfatbuffer som inneholder 1 mM CaCl2, 0.5 mM EDTA og 0.5 mM SDS (pH
8.0 ved RT i 30 min). Etter dette ble Amplex Red and MP-11 tilsatt og prøvene ble
20
inkubert i 40 minutter ved 4°C. Shimadzu LC-100AT vp HPLC-system utstyrt med
fluorescence-detektor (RF-10Axl, Ex/Em=560/590 nm) og auto-prøvetaker (SIL-10AD
vp) blebrukt for analyse av produkter separert av HPLC (Eclipse XDB-C18 kolonne, 5
µm, 150×4.6 mm). Den mobile fasen ble komponert av NaH2PO4 (25 mM, pH
7.0)/metanol (60:40 v/v).
25
[0168] Fosfatidylserin (PS) eksternalisering. Eksternalisering av PS ble analysert via
flit-cytometri ved bruk av anneksin-V-sett. Kort sagt ble høstede celler farget med
anneksin-V-FITC og PI i 5 min i mrøke før flyt-cytometri-analysen. Ti tusen hendelser
ble samlet på et FACScan-flyt-cytometer (Becton-Dickinson) levert med CellQuest30
programvaren.
[0169] Gamma-strålingsdosens overlevelseskurver i mus-embryoniske celler. Celler
81
ble lagt på plater i 35 mm Petri-skåler med 2 ml kulturmedium med en tetthet mellom
100 og 1000 celler per skål. Cellene ble behandlet med GS-nitroksid (XJB-5-125)
enten før (10-min) eller etter (1-h) γ-stråling XJB-5-125 ble fjernet fra mediumet 4 t
etter stråling. Kolonier ble fikserte og farget med 0.25% krystallfiolett og 10% formalin
5
(35% v/v) i 80% metanol i 30 min etter en 9-dagers inkubasjonsperiode, og de med ≥50
celler ble regnet som overlevende. Den overlevende fraksjonen ble kalkulert som
platingseffektiviteten av prøvene relativ til den fra kontrollen.
[0170] Figur 12 viser at nitroksidkonjugat XJB-5-125 integreres inn i celler og
10
mitokondrier mye mer effektivt enn deres ikke-konjugerte 4-amino-TEMPO i
museembryoniske forldreceller. (A) viser deres cellulære og mitokondrielle
integreringseffektiviteter i mus-embryoniske celler, og (B) viser representativt EPRspektrum for nitroksider som er gjenopprettet fra mitokondrier.
15
[0171] Figur 13 viser at nitroksidkonjugat XJB-5-125 beskytter mus-embryoniske
celler mot gammatråling-indusert superoksid-generering og kardiolipin-peroksidering.
(A) Superoksidgenerering. Celler ble eksponert for 10 Gy γ-stråling. XJB-5-125 (20
µM) ble tilsatt til celler enten 10 min før eller 1 time etter stråling og fjernet etter 5
timers inkubasjon. Cellene ble inkubert med 5 µM DHE i 30 min på de indikerte
20
tidspunktene. Etidium-fluorescence ble analysert ved bruk av et FACScanflytcytometer som leveres med CellQuest-programvaren. Gjennomsnittlig
fluorescence-intensitet fra 10 000 celler ble oppnådd ved bruk av et 585-nm-båndpassfilter. (B) Kardiolipin-oksidering. Kardiolipin-hydroperoksider ble fastsatt ved bruk av
fluorescent HPLC-basert Amplex Red-analyse. Den presenterte dataen er
25
middelverdier ± S.E. (n=3). *p<0.01 vs ikke-bestrålte celler; *p<0.01(0.05) vs bestrålte
celler uten XJB-5-125 behandling under samme forhold. Innlegget er en typisk 2DHPTLC-profil av fosfolipider fra celler.
[0172] Figur 14 viser at nitroksidkonjugat XJB-5-125 beskytter celler mot
30
gammastrålingsindusert apoptose. (A) XJB-5-125 blokkerer γ-bestråling indisert
akkumulering av cytokrom C i cytosolen av mus-embryoniske celler. (B)
densitometriforholdet av cytolrom c/aktin. Semikvantisering av bånd ble utført av
82
densitomtri ved bruk av Labworks Image Acquisition and Analysis Software (UVP,
Upland, CA). Nivået av cytokrom c-frigjøring ble uttrykt som gjennomsnittlig
densitomtriforhold av cytokrom c over aktin. (C) Dose (5, 10 g 20 µM) avhengig
radiobeskyttende effekt fra XJB-5-125 (forbehandling) på γ-stråling (10 Gy) indusert
5
fosfatidylserin (PS) eksternalisering. Etter 48 timer etter strålingsinkuberinger, ble
cellene høstet og farget med anneksin-V-FITC og propodiumiodid (PI) før flytcytometri-analyse. (D) Tid (2, 3, 4, 5, og 6 h) avhengig radiobeskyttende effekt av
XJB-5-125 (20 μM) ved γ-stråling (10 Gy) indusert PS eksternalisering (48 h etter
bestråling) i mus-embryoniske celler. (E) Effekt av XJB-5-125 ved γ-stråling (10 Gy)
10
indusert PS eksternalisering i menneskelig bronkial epitelcellelinje BEAS-2B-celler.
Cellene ble behandlet med 5-125 (5 eller 10 µM) før (10-min) eller etter (1-h) stråling.
Eksternalisering av PS ble analysert 72 t etter strålingseksponering. Den presenterte
dataen er middelverdier ± S.E. (n=3). *(&)p<0.01(0.05) vs bestrålte celler uten 5-125
behandling, #p<0.05 vs celler som er forhåndsbehandlet med 5-125.
15
[0173] Figur 15 viser effekten av nitroksidkonjugat XJB-5-125 på gammastrålingsdose-overlevelseskurvene for mus-embryoniske celler. Cellene ble
forbehandlet (10 min) eller etterbehandlet (1 time) med XJB-5-125 (20 µM), som ble
fjernet etter en 4 timers inkubasjonsperiode. Den overlevende fraksjonen ble kalkulert
20
som platingseffektiviteten av prøvene relativ til den fra kontrollen. Dataen ble satt inn i
en enkelttreffs multimålsmodell ved bruk av SigmaPlot 9.0 (Systat-programvare). Den
presenterte dataen er middelverdier ± S.E. (n=3).
[0174] Figur 16 illustrerer effekten av GS-konjugert nitroksid, XJB-5-125, på
25
gammastrålingsdosens overlevelseskurver på 32D cl 3 muse-hematopoietiske celler.
Cellene inkubert i XJB-5-125 eller Tempol hadde en økt Do (1.138 eller 1.209 Gy,
henholdsvis) sammenlignet med 32D cl 3 celler (0.797 Gy). Cellene som ble inkubert i
XJB-5-125 hadde en økt skulder på overlevelseskurven med en n av 18.24
sammenlignet med 5.82 for celler inkubert i tempol.
30
Eksempel 10- Testing av de radiobeskyttende evnene til JP4-039
83
[0175] Figurer 17A og 17B er grafer som viser GS-nitroksidblandingen JP4-039 øker
overlevelsen for mus eksponert for 9.75 Gy total kroppsstråling. I figur 17A, fikk mus
intraperitoneal injeksjon på 10 mg per kilogram av hvert av kjemikaliene indikert i
figur 5, deretter, 24 timer senere mottak de 9.75 Gy total kroppsstråling i henhold til
5
publiserte metoder. Mus ble fulgt for overlevelse i henhold til IACUC-forskriftene. Det
var en betydelig økning i overlevelse hos mus som mottok JP4-039 sammenlignet med
bestrålte kontrollmus. (P = .0008). I figur 17B, mottok mus intraperitoneal injeksjon
med JP4-039 enten 10 minutter før (firekantede symboler) eller 4 timer etter
(trekantede symboler) stråling med 9.75 Gy.
10
[0176] Figurer 18 er en graf som viser GS-nitroksidblandingen JP4-039 øker
overlevelsen for mus eksponert for 9.5 Gy total kroppsstråling. Grupper på 15 mus fikk
intraperitoneal injeksjon med 10 mg. per kilogram av hver indikerte GSnitroksidblanding eller bæremiddel (Cremphora pluss alkohol ved 1 til 1 forhold, og
15
deretter uttynnet til til 10 i destillert vann). Mus fikk 10 mg per kilogram
intraperitoneal injeksjon 24 før total kroppsstråling. Kontrollmus mottok kun stråling.
Det var en statistisk betydelig økning i overlevelsen for mus som fikk GSnitroksidblandinger. (P = .0005)
20
[0177] Figur 19 er en graf som viser at GS-nitroksid JP4-039 er en effektiv
hematopoietisk celle-strålingsdemper når den leveres 24 timer etter stråling.
Strålingens overlevelseskurver ble utført på celler fra 32D cl 3 mus-hematopoietisk
progenitor-cellelinje, inkubert i 10 µM JP4-039 i 1 time før stråling, eller lagt på plate i
metylcellulose som inneholder 10 µM JP4-030 etter stråling. Celler ble bestrålt med fra
25
0 til 8 Gy, lagt på plate i 0.8% metylcellulose som inneholdt media, og inkubert i 7
dager ved 37°C. Kolonier med mer enn 50 celler ble telt og dataanalysert ved lineære
kvadratiske og enkelt-punkt, multimål-modeller. Celler inkubert i JP4-039 var mer
motstandsdyktige som vist ved en økt skulder på overlevelseskurven med en ñ på 5.25
± 0.84 hvis legemiddel ble tilsatt før stråling eller 4.55 ± 0.47 hvis legemiddel ble
30
tilsatt etter stråling sammenlignet med 1.29 + 0.13 for 32D cl 3 kun celler (p = 0.0109
eller 0.0022, henholdsvis).
84
[0178] Figur 20 er en graf som viser at JP4-039 er en effektiv demper av strålingsskade
på KM101 menneskelig beinmarg-stromal-celler. KM101-celler ble inkubert i kun
media eller i JP4-039 (10 µM) i en time før stråling eller 24 timer etter stråling. Cellene
ble bestrålt til doser som spenner fra 0 til 6 Gy og lagt på plater i 4 brønnplater. Sju
5
dager senere var cellene farget med gentian fiolett og kolonier på mer enn 50 celler ble
telt. Celler inkubert i JP4-039 enten før eller etter stråling var mer radioresistante som
vist av en økt skulder av n = 2.3 ± 0.2 or 2.2 ± 0.2, respektivt sammenlignet til n av 1.1
± 0.1 for KM101 celler (p = 0.0309 eller 0.0386, respektivt). Det var ingen betydelig
endring i Do for de forskjellige forholdene.
10
Eksempel 11 - NOD/SCID musemodell for å optimere JP4-039 for en klinisk
prøve
[0179] Vi har en betydelig preliminær data om bruk av NOD/SCID mus for å teste
15
effektene av JP4-039 på menneskelig beinmarg-stromal-celle og hematopoietiske
stamceller-gjenvinning fra total kroppsbestråling til doser som forårsaker det
hematopoietiske syndromet. Figur 21A viser resultater med oppdagelse av
menneskelig celler i NOD/SCID mus-beinmarg høstet 27 dager etter navlestrengblod
transplantert I.V, som viser flyt-cytometrisk analyse og identifisering av menneskelig
20
CD45+ (lysegrå) hematopoietiske celler i NOD/SCID-mus BM etter stråling,
proksimal boring i skinnebeinet (se under), og menneskelig navlestrengsblod-injeksjon.
[0180] Seks NOD/SCID mus ble bestrålt til 350cGy og injisert med 1x107 menneskelig
navlestrengblod (CB) mononukleære celler (MNC). Fem måneder etter at CB MNC-
25
cellene først ble injisert, ble det høyre benet til seks mus bestrålt til 10 Gy. 24 timer
etter stråling ble det boret hull i skinnebeinet. (Se figur 21B) drillbitstørrelsen 1 mm
diameter (Dremel Corp.). 24 timer etter beinboring ble 1x107 CB MNC injisert inn i 3
av 6 mus. Kontrollmus (3) mottok ingen CB. 27 dager etter at CB ble injisert, ble
beinene høstet for histokjemisk analyse og flyt-cytometrisk analyse for menneskelig
30
CD45+ celler (lysegrå) i BM ved bruk av en PE-konjugert anti-CD45 antistoff (BD
Biosciences). Analysen ble utført på et BD LSR II flytcytometer (BD Biosciences).
Menneskelige CD45+ celler ble detekterbare i alle musene (numre 1-3) som fikk
85
menneskelig CB MNC når de ble sammenlignet med kontrollmus (mus 4). Prosenten
av CD45+ celler spente fra .045-3.288 prosent i det ikke-forsterkede benet og fra .028.892 prosent i det høydose-bestrålte benet. Det var ingen forskjell mellom boostbestråling og ikke-boost-bestråling i disse musene. Selv om dataen antyder at det er en
5
trend (prosenten menneskelig DCD45+-celler var lavere enn delen med høydosebestråling), var det ingen statistisk viktig forskjell i den bestrålte kroppen uten
forsterkning sammenlignet med den 1000 cGy (p=0.25) bestrålte ,ed forsterkning. Dag
7 beinbilde vist i figur 21B.
10
[0181] Figur 21 er en fotomikrograf av et tverrsnitt gjennom et skinnebeinsår 7 dager
etter den kirurgiske konstruksjonen med en drillbit av et unikortikal sår på 2-mm
diameter i det laterale aspektet i skinnebeinet 2-mm under den proksimale
epifyseplaten. Robust trabekulært bein fyller den intramedullære kanalen, samt det
kortikale vinduet i denne mellomliggende fasen av spontan sårreparasjon. Dette
15
tidspunktet er optimalt for å bedømme hemming av beinmarg-stromalcelle-formidlet
osteogenese ved stråling og gjenoppretting av JP4-039, som foreslått i denne bruken.
Piler indikerer sårenes margin. (Toluidin blå farging, x 35)(58)
[0182] Eksempel 12 - Topisk og transdermal absorbering av GS-nitroksid. En
20
praktisk hudlapp planleges for levering v JP4-039 eller andre blandinger som beskrives
heri. Lappen kan administreres til en pasient før, under eller etter stråling, inkludert 24
t eller senere etter strålingseksponering av pasienten. I innledende studier ønsket vi å
karakterisere absorberingen/penetreringen av en topisk påført representant GSNitrokside XJB-5-125 i musehud. XJB-5-125 ble valgt som en potensiell topisk agent
25
basert på den evne til å hemme ROS-generering, hemme apoptose og undertrykke
oksidativ skade på de mitokondrielle lipidene. XJB-5-125 består av (Leu-D-Phe-ProVal-Orn) segmentet av XJB-5-125 og har vist seg å svekke ActD-indusert PSeksternalisering på en doseavhengig måte på 2.5-20µM. Den kan også hemme
frigjøringen av cytokrom c fra mitokondrier og undertrykke CL-peroksidering. De
30
fysiske egenskapene til et kjemikalie er avgjørende for dets evne til å penetrere inn i og
gjennom huden. To viktige faktorer er loggens oktanale/vann (Ko/w)
partisjonskoeffisient og molekylærvekten. For XJB-5-125, er loggens Ko/v = 4.5 og
86
molekylærvekten er 956. Lipofil-"regelen" er basert på behovet for en blanding for å
skille ut av den lipofile stratum corneum og inn i de mer hydrofiliske epidermis og
dermis. Loggen Ko/w and MW av XJB-5-125 er lik ketaconazol (logen Ko/w = 4.34,
MW = 532), klotrimazol (loggen k/ow = 6.27, MW = 902), og indometacin (loggen
5
Ko/w = 4.23, MW = 358) som antyder gjennomførbarhet av levering ved bruk av
formuleringer som er lik de som brukes for å effektivt levere disse agentene. På samme
måte som JP4-039, er XJB-5-125 en strålingsformidler i tillegg til en beskytter (se figur
15).
10
[0183] En liten bit hud (2cm2) ble plassert i et gjennomstrømmings-diffusjonscellesystem i Bronaugh-stil (PermeGear, Riegelsville, PA) (Figure 22). Det ble dermed lagt
mellom to biter med den inerte polymeren Kel-F og klemt igjen for å hindre lekkasje.
Den epidermale siden vender oppover og er eksponert for donorløsningen
(løsningen)og den dermale siden er i kontakt med mottaksvæsken. Det eksponerte
15
området er 0,79 cm2 (sirkulært kammer med 1 cm diameter). Huden danner en vanntett
forsegling i flyten gjennom kammeret slik at den mottatte væsken (PBS + 25% etanol)
på den dermale siden vil inneholde XJB-5-125 kun hvis den har penetrert gjennom
huden. Mottakskammeret ble gjennomstrømmet med denne bufferen som deretter føres
til en fraksjonsoppsamler via Teflon-rør. PBS ? 25 % etanol ble brukt fordi det er
20
effektivt for hydrofobiske blandinger og produserer bedre i vitrolin vivo-korrelasjoner
enn andre mottakerløsninger. Huden ble opprettholdt ved 32 °C ved å plassere
kammeret i en metallblokk som er oppvarmet via et sirkulerende vannbad. Huden ble
avbalansert i 60 minutter for introduksjon av testblandingen. Syttifem µL med XJB-5125 ble plassert på huden og fikk forbli der under hele eksperimentet. Strømmen ble
25
samlet opp i 24 timer. (Figurer 23-25).
[0184] For å evaluere XJB-5-125 penetrering i musehud, C57/BL6 ble mus barbert ved
bruk av klippemaskin for dyr (#40 blad), etterfulgt av en kort behandling med Nair
(hårfjernende) for å fjerne gjenværende hår. Huden ble vasket umiddelbart etter
30
hårfjerning for å hindre videre irritasjon. Huden fikk 24 timer til å komme seg før
studien. Dette reduserer interferens fra hår og gir små skrubbsår tid til å hele før de
dermale penetreringsstudiene.
87
[0185] Ved fullføring av studien ble huden fjernet fra diffusjonskammeret. Stratum
corneum, som vil inneholde hoveddelen av den topisk påførte mengden, men som ikke
er relevant sett fra en behandlingsstandpunkt, ble fjernet ved sekvensiell tapestripping
(15 ganger) ved bruk av Brookman Tape (3M, Minneapolis, MN). Den gjenværende
5
huden (levedyktig epidermis og dermis) og transdermal avløpsstrøm ble analysert for
XJB-5-125 via EST.
[0186] Musehud ble homogenisert i 400 µL 50 mM PBS pH 7.4. EPR-målinger ble
utført i gass-permeabelt teflon-rør (0.8 mm intern diameter, 0.013 mm tykkelse)
10
oppnådd med Alpha Wire Corp. (Elizabeth, NJ, USA) på et JEOL JES-RE1X
spektrometer ved 25°C. Teflonrøret (ca. 8 cm i lengde) var fylt med 70 µL prøve som
inneholdt 28.5% acetonitril og 2 mM K3Fe(CN)6, brettet sammen en gang og plassert i
et åpent EPR quartz-rør (indre diameter på 3.0 mm). (Figur 24)
15
[0187] EPR spektra ble registrert ved 334.7 mT, senterfelt, 20 mW, effekt; 0.079 mT,
feltmodulering, 5 mT, sveipebredde; 400 og 4000, mottakerforsterkning, 0.1 s,
tidsbegrensning. Spektra ble innsamlet ved bruk av EPRware-programvare (Scientific
Software Services, Bloomington, IL, USA).
20
[0188] Disse preliminære eksperimentene viser at XJB-5-125 kan penetrere intakt hud
tilstrekkelig. Videre kan den totale transdermale absorberingen etter 24 timer og nivået
av XJB-5-125 til stede i den levedyktige huden måles vellykket ved bruk av teknikkene
som er beskrevet heri. Effekten av formuleringen på topisk levering ble undersøkt ved
bruk av tre forskjellige donorløsninger (figur 25). Donor A = 1 mM XJB-5-125 i
25
DMSO, donor B = 1 mM XJB-5-125 i 95% Propylenglykol + 5% Linolsyre, og donor
C = 1 mM XJB-5-125 i 50% EtOH +40% HSO + 5% Propylenglyckol + 5% Brij30. En
total på 75nmole ble plassert oppå hver hudbit for å starte disse eksperimentene (75 ul
of 100 mM). Leveringen av XJB-5-125 inn i huden første til mellom 0.07% og 0.46%
gjenværende innen huden etter 24 timer. Den høyere leveringshastigheten er innen
30
området for andre topiske produkter.
[0189] Gitt observasjonen på at XJB-5-125 er aktiv i celler i konsentrasjonsområder fra
88
2.5-20µM og hvis man går ut i fra en vevstetthet på 1 g/cm3, indikerer en rekkefølge av
magnitydanalyse basert på disse datene at den topiske leveringen av XJB-5-125metoden for å forsterke systemiske blodnivåer for å beskytte beinmark er
gjennomførbart.
5
[0190] I tillegg impliserer det faktum at den totale hudabsorbasjonen generelt anses
som lineær tilknyttet donorkonsentrasjoen at topisk levering vil ble betydelig forsterket
ved å øke donorkonsentrasjonen. Disse preliminære studiene viser gjennomførbarhet på
XJB-5-125 levering til terapeutiske nivåer og indikerer at det mindre JP4-03910
molekylet, samt andre blandinger som er beskrevet heri, kan være nyttig som hudlappleveringsbar strålingsdemper av det hematopoietiske syndromet.
Eksempel 13 (foreslått)
15
[0191] Følgende kan brukes før å velge og optimere den beste GS-nitroksiden JP4-039
(Strålingsskade-dempingslegemiddel) som kan forsterke menneskelig beinmargstromalcelle og fersk menneskelig stromalcellelinje-podingseffektivitet inn i bestrålte
lemmer med NOD/SCID-mus. MnSOD-overuttrykkingsceller er en positiv kontroll.
1.
20
A. Eksperimenter med KM101-MnSOD/ds-red (kontroll KM101-ds-red)
klonale cellelinjer. Grupper med 12 NOD/SCID mus fikk 300 cGy total kroppsstråling
(lavdose-ben) og en 1000 cGy forsterkning i venstre bakben (høydose-ben), deretter,
24 timer senere, en intravenøs injeksjon med 1 x 105 eller 1 x 106 celler av hver
cellelinje (grupper 1 og 2). Gruppe 3 er mus som får MnSOD-PL intravenøst 24 timer
før stråling og deretter injeksjon av of KM101-MnSOD/ds-red. Gruppe 4 er MnSOD-
25
PL intravenøst 24 timer før stråling, deretter kontroll KM101/ds-red-celler. Dette
eksperimentet kan gjentas to ganger. Mus vil få beinmarg skylt fra baklemmene på dag
1, 3 , 7 og 14 eter celletransplantasjon, og skåring av prosenten av de totale cellene og
antall kolonidannende celler som er gjenopprettelige som er ds-red-positive og dermed
av menneskelig opprinnelse. Skåringen kan være ved ds-red-positivitet, og deretter ved
30
kolonidannelse in vitro ved stromalceller. Vi kan skåre totalen, deretter prosenten av
stromalceller av menneskelig opprinnelsen.
89
2.
B.eksperimenter som viser forbedring i menneskelig beinmark-stromal-
cellelinje KM101-poding ved mitokondrial-spesifisert strålingsbeskyttelse/demping
JP4-039 (GS-nitrokside) administrasjon. Dette eksperimentet kan utføres hovedsakelig
som beskrevet over (A), med alle grupper, men med en undergruppe som mottar JP45
039 (24 timer) etter stråling (samme dag som cellelinjene injiseres, eller en
undergruppe som får intraperitoneal JP4-039 (daglig eller ukentlig etter cellelinjetransplantasjon). Cellene kan eksplanteres fra de høydose- og de lavdose-bestråle
femurene på dag 7, 14, 21 og dyrket in vitro for menneskelig stromal-kolonidannende
progenitorceller (CFU-F). Prosenten og det totale antall menneskeceller som entrer de
10
høydose- og lavdose-bestrålte lemmene kan kvantifiseres via cellesortering for ds-red.
Hvert eksperiment kan fullføres to ganger.
3.
C. eksperimenter som i (A) over, men erstatting av fersk menneskelig beinmarg
Stro1 + stromalceller fra en 45 y.o. donor.
4.
15
D. Eksperimenter som i (B) over, erstatting av Stro1+ menneskelig beinmarg
stromal-celler.
[0192] Statistiske hensyn - I (A), foreslår vi å sammenligne ved 4 forskjellige
tidspunkter mellom 4 grupper der enten MnSOD eller ingen MnSOD, og enten 105
eller 106 KM101 celler injiseres, når det gjelder antall DsRed-KM101-celler. I (B)
20
foreslår vi å sammenligne ved 3 forskjellige tidspunkter mellom 10 grupper der
forskjellige doser og planer av den eksperimentelle blandingen vil bli brukt, når det
gjelder samme endepunkt som i (A). (C) og (D) er de samme som (A) og (B)
henholdsvis, bortsett fra at menneskelige stromalceller brukes i stedet for KM101celler. Alle sammenligningene i denne oppgaven utføres separat for høydose- og
25
lavdose-bestrålte ben. ANOVA etterfulgt av Tukeys test kan brukes for disse
analysene. Prøvestørrelse kan estimeres ved bruk av de to prøve t-testene for parvise
sammenligninger. På grunn av mangelen på preliminære data, er
prøvestørrelseestimeringen basert på den forventede differansen for å detektere
mellomgrupper når det gjelder det vanlige standard avviket σ. Seks mus per gruppe
30
kan ofres per tidspunkt. Med denne prøvestørrelsen vil det være 82 % effekt for å
detektere en differans på 1.8σ mellom grupper ved bruk av den tosidige toprøve-ttesten med signifikansnivå 0,05.
90
[0193] Som det sekundære endepunktet, kan også antall kolonidannende
enhetfibroblast (menneskelig) CFU-F også sammenlignes mellom grupper med samme
metode som det primære endepunktet.
5
[0194] Det forventes at MnSOD-overuttrykk i KM101-MnSOD/ds-red-celler vil føre
til en høyere podingseffektivitet inn i både de høydose- og lavdosebestrålte lemmene til
NOD/SCID-mus. Vi forventer at MnSOD-PL-behandling av det hematopoietiske
mikromiljøet før KM101 klonal linjecellelinje-infusjon vil enten videre forsterke
poding av både KM101-MnSOD/ds-red og KM101-ds-red cellelinjer. Vi forventer den
10
høyeste prosenten av podingseffektivitet vil bli detektert i musene som får MnSOD-PL
før stråling og injeksjon av KM101-MnSOD/ds-red-celler.
[0195] Vi forventer at JP4-039-administrasjon daglig etter celletransplantasjon vil
tilrettelegge forbedret stabilitet i podingen av alle stromalcellerlinjer ved å redusere
15
produksjonen av frie radikaler fra det bestrålte beinmarg-mikromiljøet.
[0196] En inaktiv kontrollblanding for JP4-039 kan brukes (JP4-039 fraværende
nitroksidaktiv del). Basert på resultatene av disse eksperimentene, kan det optimale
forholdet for beinmarg-stromalcelle-podingen avledes, og disse forholdene kan brukes i
20
eksperimentene som beskrives under.
Eksempel 14 (foreslått)
[0197] Valg og optimering av en GS-nitroksid JP4-039-behandling for å forsterke
25
menneskelig CD34+ navlestrengblod-multilinje-hematopoietisk stamcelle-progenitorcellepoding inn i bestråle lemmer på NOD/SCID-mus som har blitt klargjort med
poding av beinmarg-stromalceller.
1. Eksperimenter med TBI-behandlet C57BL/6J-mus og musbeinmargundersøkelse. (innledende systemtest)
30
2. Eksperimenter ved bruk av den optimale podingsprotokollen for
menneskelige KM101-celler i bestrålte NOD/SCID-mus (forventet å være de musene
som mottar MnSOD-PL før stråling, og som deretter injiseres med KM101-
91
MnSOD/ds-red, supplert med JP4-039 daglig). Mus kan deretter få intravenøs injeksjon
på 1 x 105 eller 1 x 106 CD34+ LIN- celler fra menneskelig navlestrengblodopprinnelse. Kontrollceller kan være CD34+ LIN+ (differensiert progenitor) celler
105 eller 106 per injeksjon. Grupper på 12 mus.
5
Disse eksperimentene kan utføres i to deler.
a. Injeksjon av navlestrengblodceller samtidig som KM101-MnSOD/ds-red
celler.
b. Injeksjon av navlestrengblod-celler på tidspunktet for optimal gjenvinning
av KM101-MnSOD/ds-red-celler fra eksmplantateksperimenter i eksempel 13. Dette
10
skal være på dag 7 eller 14 etter stromalcelle-injeksjon.
I disse eksperimentene kan mus følges og testes ved serietidspunkter ut til to måneder
etter navlestreng-stamcelle-transplantasjon. Prosenten av menneskelige perifere blodhematopoietiske celler kan skåres i ukentlige perifere blodprøver og antall celler som
15
danner CFU-GEMM-kolonier kan testes i eksplanterte bein fra ofrede mus.
På dager 7, 14, 21, 28 eller 60 etter navlestreng-blodtransplantasjon, kan mus i
undergrupper ofres, og alle celler som skylles fra høydose og lavdose bestrålte femurer,
og analyser utført for menneskelig multilinje hematopoiteiske progenitorer-CFUGEMM. Analyser kan utføres via to metoder:
20
a. Sortering av menneskelig CD34+ celler med monoklonale antistoffer som er
spesifikke for mennesker.
b. Kolonifannelse i menneskelig CFU-GEMM-dyrkningsmedium og deretter
sekundærskåring av menneskelige kolonier som undersettet av total mus- og
menneskekolonidannende celler oppdaget på dag 7 og dag 14 in vitro.
25
In vitro-eksperimenter kan utføres parallelt som følger:
KM101-MnSOD-PL platåfase-stromalceller kan stråles in vitro til 100, 200, 500, 1000
cGy, og deretter CD34+ LIN- menneskelig navlestrengblodceller samdyrkes med
stromalceller in vitro. Kontroller kan inkludere ubestrålt KM101-MnSOD/ds-red,
30
bestrålt KM101-ds-red celler, ubestrålt KM101-ds-red.
Vi kan skåre menneskelige kampesteinøyer (stamcellekolonier) på disse kulturene
92
ukentlig, plotte kumulative kampesteinøy-dannelse, kumulativ ikke-adherent
celleproduksjon med ukentlig cellehøsting og analyse av ukentlig cellehøsting for
CFU-GEMM-dannelse. Disse studiene kan utføres over to-tre uker. In vitro
samdyrkningsstudier kan kun delvis duplisere in vivo hematopoietiske mikromiljøer,
5
og dermed skal to uker være maksimum effektiv tid for deteksjon av om MnSOD-PLuttrykk i det tilsluttende KM101-laget vil øke mengden poding av navlestrengblodstamceller.
3. Eksperimenter med JP4-039-supplering av navlestrengblodtransplantasjonsprogrammet som i (1) over for å øke målsøking, stabil hvile og
10
repopulasjonskapasitet av menneskelig navlestrengblod-stamceller ved å fjerne ROSproduksjonen i de bestrålte beinmarg-stromalcellemiljøet.
Eksperimenter in vitro som supplerer i samdyrkningsmedia legemiddelet JP4-039
daglig. Eksperimentene med bestrålt KM101 subklonale linjer, samdyrket med
navlestrengblod-stamceller kan utføres med tilføring av JP4-039, eller en aktiv analog
15
JP4-039 daglig. Kontrolleksperimentene kan inkludere tilsetting av CD34+ LIN+
differensierte blodceller som forventes å produsere færre CFU-GEMM over tid.
Stromalcelledyrkninger kan bestråles, navlestrengblodceller kan legges til og
dyrkninger kan skåres som over.
Grupper på 12 mus kan motta den optimal protokollen for menneskelige CFU-GEMM-
20
cellepoding fra eksperimentet over, og deretter kan undergrupper behandles på
følgende måte.
a. JP4-039 to ganger i uken.
b. JP4-039 daglig.
c. Inaktiv JP4-039 analog daglig.
25
4. Eksperimenter som i (1) over erstatter ferske menneskelige Stro1+beinmargceller for
KM101-subklonale linjer.
5. Eksperimenter som i (2) over erstatter menneskelige Stro1+beinmargceller for
KM101-subklonale linjer.
30
[0198] Statistiske hensyn - I (1), kan vi sammenligne ved 5 forskjellige tidspunkter
mellom 7 grupper der vi bruker MnSOD-KM101 and/or 105/106 CD34+ celler når det
gjelder antall CD45+-celler. I (2) kan vi sammenligne ved 5 forskjellige tidpunkter
93
mellom 7 grupper som bruker KM101, CD34+ celler, KM101 pluss CD34+ celler,
eksperimentblandingen ved enkle eller doble administrasjoner, eller inaktiv analog av
eksmperimentbladningen ved enkle eller doble administrasjoner, når det gjelder samme
endepunkt som i (1). Oppgaver (3) og (4) er de samme som (A) og (B) i eksempel 13,
5
henholdsvis, bortsett fra at vi kan bruke menneskelig Stro1 + beinmargceller i stedet
for KM101-celler. Alle sammenligningene i denne oppgaven kan utføres separat for
høydose- og lavdose-bestrålte ben. ANOVA etterfulgt av Tukeys test kan brukes for
disse analysene. På samme måte som prøvestørrelsens hensyn i eksempel 13 vil vi
bruke 6 mus per gruppe ved hvert tidspunkt. Som det sekundære endepunktet, kan også
10
antall CFU-GEMM sammenlignes mellom grupper med samme metode som det
primære endepunktet.
[0199] Sannsynlige resultater - Basert på resultatene i eksempel 13, forventer vi at
navlestreng-stamceller og menneskelig beinmarg-stromalcelle-målsøking in vitro vil
15
bli optimert av MnSOD-PL-behandling av muse-mikromiljø før stromalcellertransplantasjon, og at MnSOD-PL-overuttrykking av KM101-celler vil vise videre
stabilitet i det bestrålte mikromiljøet. Vi forventer at JP4-039-behandling vil forsterke
hematopoetisk celleoverlevelse ytterligere og øke CFU-GEMM i antall.
20
Eksempel 15 (foreslått)
0200] Disse eksperimentene bruker osteogenese av menneskelige stromalceller som et
tiltak for effektiv formidling av beinmargsskade ved JP4-039. JP4-039 kan testes for
reparasjon av kunstig brudd i den proksimale tibiae i NOD/SCID mus ved
25
menneskelige stromalcelleavledede osteoblaster som produserer menneskelig kollagen
og som kan vise forsterket frakturheling ved antioksidant JP4-039-behandling.
A. Eksperimenter med mus innpodet med KM101-MnSOD/ds-rød
sammenlignet med KM101-celler. Mus kan ha hull boret i begge proksimale tibias som
beskrevet over, deretter stråling med 300 cGy total kroppsdose, 1000 cGy til ett
30
baklem, og deretter 24 timer senere, injeksjon med 1 x 105 beinmarg-stromaleceller i
hver linje. Mus kan følges i 21 dager og i serie i sju dager tidspunkter tibias eksplantert
og analysert for relativt innhold av menneskelig kollagen i helede bein.
94
B. JP4-039 ukentlige eller daglige supplerte injeksjoner i et gjentatt
eksperiment av eksperiment som er beskrevet i (A) (12 mus per gruppe).
C. Mus som mottar MnSOD-PL intravenøst 24 timer før bestråling (på dagen
for beinboringen), og deretter injeksjon av enten KM101-MnSOD/ds-rød eller KM1015
ds-rød.
D. Mus som mottar uregelmessig sekvens MnSOD-PL-injeksjon før
cellelinjeinjeksjon som beskrevet i (C) over.
E. Eksperimenter som i (A - D) erstatter fersk Stro+ stromalceller for KM101subkloner.
10
[0201] Statistiske hensyn - I (A), sammenligner vi, ved tre forskjellige tidspunktet, 17
grupper som bruker KM101-celler, MnSOD, eksperimentblandingen ved enkle eller
doble administrasjoner, uregelmessig MnSOD, eller en kombinasjon av noen av disse,
når det gjelder prosenten menneskelig kollagen. (B) er den samme som (A) bortsett fra
15
at menneskelig Stro + beinmargceller brukes i stedet for KM101-celler. Alle
sammenligningene i denne oppgaven kan utføres separat for høydose- og lavdosebestrålte ben. ANOVA etterfulgt av Tukeys test kan brukes for disse analysene. På
samme måte som prøvestørrelsens hensyn i eksempel 13 kan vi bruke 6 mus per gruppe
ved hvert tidspunkt.
20
[0202] Sannsynlige resultater - Vi forventer at KM101-MnSOD/ds-red vil vise
forbedret osteogenisk kapasitet in vivo. Vi forventer at MnSOD-PL-administrasjon til
mus 24 timer før bestråling videre vil forsterke målsøking og osteoblast-differensiering
av KM101-MnSOD/ds-red.
25
[0203] Preliminær data viser strålingens overlevelseskurver for beinmargstromalcellelinjer og forsterkning av overlevelse ved MnSOD-overuttrykking. Andre
preliminære data forventes å vise at hver Stro1+ celle transfektert med MnSOD-PL og
KM101-MnSOD/ds-red samt KM101-ds-red er fortsatt kapable til differensiering til
30
osteblaster in vitro (osteogenisk mediaeksperimenter pågår) og in vivo i NOD/SCIDmus med borede hull. Strålingens overlevelseskurver på KM101-MnSOD/ds-red og
KM101-ds-red behandlet med JP4-039, men ikke den inaktive analogen av JP4-039
95
vises over. Vi forventer disse forholdene: 1) MnSOD-PL-administrasjon til
mikromiljøet, 2) overuttrykk av MnSOD i beinmarg-stromale cellelinjer av
menneskelig opprinnelse, og 3) supplering av JP4-039 antioksidantbehandling vil føre
til maksimum osteogenisk differansiering av menneskelige kollagenproduserende
5
celler. Som videre kontroller for eksperimentet kan vi fastslå om hematopoietiske celler
av menneskelig opprinnelse er nødvendige for optimal funksjon av beinmargstromalceller. KM101-MnSOD/ds-red stromalcelle-podede NOD/SCID-mus kan
suppleres med injeksjon av menneskelig navlestrengblod CD34+ LIN-, eller CD34+
LIN+ celler administrert enten med stromalceller eller 24 timer senere, for å se om
10
disse cellene produserer optimal kolonidannelse. Andre kontroller kan kun være
CD34+ LIN-, CD34+ LIN+ hematopoietiske celler. Andre kontroller kan inkludere
STRO1+ stromalcelle-progenitorer fra navlestrengblod alene eller hele
navlestrengblod-kontroller.
15
[0204] Eksempel 16 For å bedømme effektiviteten til XJB-5-131 i hemmende
nedbryting og/eller aldringstegn, ble blandingen administrert, over en 18-21
ukersperiode, progeroid Erccr1-/Δ mus, ved en dose på 2 mg/kg i solsikkeoljebærer (for
å fremme oppløselighet) administrert intraperitonealt tre ganger i uken (figur 32).
Solsikkefrøolje ble administrert til to Erccr1-/Δ tvillingmus i henhold til samme plan
20
som en kontroll. De behandlede musene og kontrollmusene ble overvåket to ganger i
uken for vekt- og symptom/tegn-utvikling.
[0205] Figur 33 presenterer en oppsummeringstabell som viser resultatene av
behandlingen med XJB-5-131 ("XJB" i denne figuren), relativ til kontroll
25
(solsikkefrøolje) etterbehandling fra 5 ukers liv frem til døden. Tallene indikerer
gjennomsnittsalder ved oppstart av hvert aldersrelaterte symptom for mus behandlet
med XJB-5-131 eller kun bindemiddel (olje) (n=5 mus per gruppe). Celler som er
uthevet i gult indikerer symptomer som var betydelig forsinket av XJB-5-131. I tillegg
til forbedring i de fleste målte tegn, ble den generelle aldersskåren betydelig forbedret i
30
XJB-5-131-behandlet mus. Som notatet viser, ble alle tegnene på nevronedbryting,
inkludert dystoni, skjelving, ataksi, wasting og urininkontinens forsinket i behandlede
96
dyr, noe som ga sterke bevis på at XJB-5-131 beskytter nevroner mot degenerative
endringer forårsaket av oksidativt stress.
[0206] For å bedømme evnen til XJB-5-131 til å hindre nedbryting av mellomvirvler
5
(en indeks på degenerativ sykdom i ryggvirvelen), ble nivået av glykosaminoglykan i
virvlene i behandlede mus og kontrollmus målt, og resultatene vises i figur 34.
Mellomvirvlene hos behandlede mus inneholdt ca. 30 prosent mer glykosaminoglykan
relativ til kontrollmus, noe som indikerer hemming av virvelnedbryting.
10
[0207] Som et mål på effekten av XJB-5-131 på fotoaldring, Ercc1-/cond;K14-Cre mus,
som mangler ERCC1 kun i huden, ble barbert, behandlet med hårfjerningsmiddel og
deretter bestrålt med UV-B-lys for å fremkalle solbrenthet (500 J/m2, median
erytematisk dose). Deretter ble musene behandlet med XJB-5-131 (80 µg) emulgert i
en krem daglig i fem dager. Resultatene, som vises i figur 35, indikerer at huden til
15
behandlede mus virket mye glattere og sunnere i forhold til kontrollmus (mus
behandlet kun med krem).
[0208] På et makroskopisk nivå, virker administrasjon av XJB-5-131 å ha blitt bra
tolerert av dyrene, som indikert ved det faktum at de ikke gikk ned i vekt som et
20
resultat av behandlingen. Grafer som viser vekten over tid for behandlede, ubehandlede
og kontrolldyr vises i figur 36A-B. For å bedømme virkningen av XJB-5-131 på et
cellulært nivå, ble en rekke eksperimenter utført ved bruk av mus-embryoniske
fibroblaster ("MEF") celler høstet fra Erccr1-/- muse-embryoer. Som vist i figur 37, ble
slike MEF-dyrkninger fremstilt og dyrket under omgivende oksygenforhold (oksidativt
25
stress), og deretter enten ubehandlet (kun media) eller behandlet med en konsentrasjon
på 500 nM (i media) XJB-5-131, og deretter testet for SA-β galactosidase-farging (en
markør for cellulær senescence). Mengden farging ble merkbart mindre i behandlede
celler. I tillegg ble XJB-5-131-behandling funnet å redusere antall γH2AX foci i DNA
(en andre markør for cellulær senescence samt DNA dobbelttrådbrudd) (figur 38), selv
30
om det ikke reduserte mengden apoptose (figur 39).
Eksempel 17 - Beskyttende effekter av JP4-039
97
[0209] For å bedømme det terapeutiske potensialet til JP4-039, ble tester for sikkerhet
og beskyttende aktivitet utført. Figurer 35 og 36 viser testresultatene for å evaluere om
varierende konsentrasjoner av JP4-039 produserer giftige effekter etter 48 timer i
dyrkninger MEF-celler fremstilt av Ercc1-/- eller villtype-muse-embryoer, henholdsvis.
5
Selv under de høyeste konsentrasjonene som ble testet (10 µM), ble ingen tegn på
giftighet observert i noen av dyrkningssystemene og cellulær spredning forsterkes
relativ til ubehandlede kontrollceller (kun media).
[0210] For å teste den beskyttende aktiviteten til JP4-039, ble dyrkninger av primære
10
MEFer fremstilt fra Ercc1-/- museembryoer og dyrket under 20 % oksygen (omgivende
luft), som skaper oksidativt stress i disse cellene som er hypersensitive for reaktive
oksygenarter. Cellene ble deretter enten behandlet med en konsentrasjon på 1 uM XJB5-131, JP4-039, JED-E71-37 eller JED-E71-58, eller ble forble ubehandlet (media), og
deretter, etter 48 timer, ble nivået av p16, en markør for ikke-reverserbar cellulær
15
senescence, målt ved immunofluorescence-farging. Som sett i figur 37 var nivået av
p16 mye lavere i MEF-celler behandlet med JP4-039 relativ til dets nivå i ubehandlede
celler, mens XJB-5-131, JED-E71-37 og JED-E71-58 ble observert å være mindre
effektiv ved denne konsentrasjonen.
20
Eksempel 18 - beskyttende effekter av antioksidanter i cellekultur
[0211] For å evaluere de beskyttende aktiviteten til JED-E71-37 og JED-E71-58, ble
hovedsakelig MEF-celler klargjort fra Ercc1-/- mus og dyrket under forhold med
oksidativt stress (omgivende luft, 20 % oksygen). Cellene ble deretter enten ikke
25
behandlet eller behandlet med1 µM JED-E71-37 eller JED-E71-58 i en periode på 48
timer. Som man kan se i figur 38, forbedret begge blandingene cellespredning på tross
av det oksidative stresset.
[0212] Deretter ble evnene til disse to agentene, samt XJB-5-131 og JP4-039, begge
30
med konsetrasjoner på 1 µM, testet for sin evne til å hindre oksidasjonsindusert DNA
dobbeltrådbrudd i fremstilte cellekulturer og påført oksidativt stress, som i foregående
paragraf. Behandlede og ubehandlede celler ble etter 48 timers behandling,
98
immunofarget for γ-H2AX, en markør for DNA dobbelttrådbrudd samt cellulær
senescence. Resultatene for JED-E71-58 vises i figur 39, viser en distinkt reduksjon i
γ-H2AX. JP4-039 var også effektiv, men XJB-5-131 og JED-E71-37 ble observert å
være mindre effektiv ved denne konsentrasjonen.
5
Eksempel 19 - Alternative design av nitroksidanaloger
[0213] For å videre undersøke de strukturelle krav for aktivitet av GS-nitroksidblanding JP4-039, har vi designet flere nitroksidanaloger. Figur 40 er en skjematisk
10
fremstilling som viser alternative design for nitroksidanaloger. Designet kan innebære
en eller begge disse: modifisering av spesifiserende gruppe for å optimere de
legemiddelaktige egenskapene og/eller undersøkelse av alternativ nitroksidinneholdende grupper for å forbedre deres oksidanteffektivitet (for eksempel og uten
begrensning, se Reid, D.A. et al. The synthesis of water soluble isoindoline nitroxides
15
and a pronitroxide hydroxylamine hydrochloride UV-VIS probe for free radicals.
Chem Comm. 1998, 17:1907-8; Iwabuchi, Y.J., Exploration and Exploitation of
Synthetic Use of Oxoammonium Ions in Alcohol Oxidation. J. Synth. Org. Chem. Jpn.
2008, 66(11):1076-84). Modifisering av målgruppene kan inkludere erstatning av Boc
for alternative beskyttende grupper, som f.eks. Ac (-C(O)CH3), Cbz (-C(O)O-Bn, der
20
Bn er en benzylgruppe) dialkylfosfatet. Dialkylfosfater inkluderer -P(O)-Ph2, der Ph er
en fenylgruppe. Andre modifikasjoner inkluderer også isosterisk erstatning av
alkengruppen med målgruppen, som f.eks. med en syklopropangruppe. Nitroksidinneholdende grupper inkluderer TEMPO og TEMPOL, samt alternative nitroksiddeler, som f.eks. TMIO (1,1,3,3-tetrametylisoindolin-2-yloksyl) eller 1-Me-AZADO
25
(1-metyl 2-azaadamantan N-oksyl). Synteseprotokoller av disse alternative nitroksiddelene beskrives under.
[0214] Figur 41 viser en syntetisk protokoll som kan brukes for å produsere forskjellige
alternative design for nitroksidanaloger, inkludert JP4-039, blandinger i henhold til
30
Formel 3, og andre analoger. Den spesifikke syntesen for JP4-039 har blitt beskrevet i
eksempel 8. JP4-039 og dets analoger ble klargjort med en effektiv metode for den
asymmetriske syntesen av allyl-aminer, tidligere utviklet i vårt laboratorium (Wipf P.
99
& Pierce J.G. Hurtig syntese av α-C-Glykosid-analogen av immunostimulant
galaktosylceramid (KRN7000), Org. Lett. 2006, 8(15):3375-8). Et viktig trinn i figur
41 inkluderer bruk av zirkonium-metodologi for å produsere diastereomisk allyl-amin
(7). Denne metodologien inkluderer hydrozirkonering av alkyn (5) med Cp2ZrHCl,
5
transmetalasjon til Me3Al, og tilsetting til N-tBu-sulfinyl amin (3). Smith
syklopropanering av alken (8b) med Zn(CH2I)2 er et annet hovedtrinn i figur 41. I dette
siste trinnet skal stereokjemien rundt den sykliske propan-ringen fastslås etter
reaksjonen.
10
[0215] Syntese av blandinger (10a, JP4-039), (10b), (10c), (14a), og (14b) (viser i
figur 41) ble oppnådd i henhold til følgende.
(R,E)-2-Metyl-N-(3-metylbutyliden)propan-2-sulfinamid (3). Syntesen av
tittelblandingen har allerede blitt beskrevet i eksempel 8 (blanding 1).
(But-3-ynyloxy)(tert-butyl)difenylsilan (5). Syntesen av tittelblandingen har allerede
15
blitt beskrevet i eksempel 8 (blanding 2).
(S,E)-8-(tert-Butyldifenylsilyloksy)-2-metyloct-5-en-4-amin hydroklorid (7).
Syntesen av tittelblandingen har allerede blitt beskrevet i eksempel 8 (blanding 3).
(S,E)-tert-Butyl 8-(tert-butyldifenylsilyloksy)-2-metyloct-5-en-4-ylkarbamat (8a).
20
Syntesen av tittelblandingen har allerede blitt beskrevet i eksempel 8 (blanding 4).
[0216] (S,E)-Benzyl 8-(tert-butyldifenylsilyloksy)-2-metyloct-5-en-4-ylkarbamat
(8b). Til en blanding av amin 7 (1.50 g, 3.79 mmol) i tørr THF (15 mL) ble tilsatt Et3N
(1.65 mL, 11.75 mmol),og deretter en løsning med benzyl-kloroformat (CbzCl, 0.59
25
mL, 4.17 mmol) i tørr THF (4 mL) ved 0°C. Den resulterende hvite løsningen ble
varmet til rt og rørt i 5 t, og deretter tynnet ut med DCM og vann. Den vannholdige
fasen ble ekstrahert med DCM (2x) og kombinerte organiske lag ble vasket med 10 %
HC1 og sat. NaHCO3, tørket (MgSO4), filtrert og konsentrert in vacuo.
Lynkromatografi (SiO2, 8:2 heksaner/EtOAc) ga 1.45 g (72%) av tittelblandingen som
30
en gul olje. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.75-7.65 (m, 4 H), 7.50-7.28 (m, 11 H),
100
5.70-5.55 (m, 1 H), 5.40 (dd, 1H, J = 15.4, 6.2 Hz), 5.11 (s, 2 H), 4.58 (m, 1 H), 4.21
(m, 1 H), 3.71 (t, 2 H, J = 6.6 Hz), 2.30 (q, 2 H, J = 6.6 Hz), 1.67 (m, 1 H), 1.40-1.22
(m, 2 H), 1.07 (s, 9 H), 0.92 (m, 6 H); HRMS (ESI) m/z kalkulert for C33H43NO3SiNa
552.2910, funnet 552.2930.
5
(S,E)-N-(8-(tert-Butyldifenylsilyloksy)-2-metyloct-5-en-4-yl)-P,P-difenylfosfinamid (8c). Til en løsning av amin 7 (400 mg, 1.01 mmol) i tørr DCM (7 mL) ble tilsatt
Et3N (0.44 mL, 3.13 mmol),og deretter en løsning med difenylfosfinklorid (Ph2POCl,
0.22 mL, 1.11 mmol) i tørr DCM (3 mL) ved 0°C. Etter å ha blitt rørt ved 0°C i 15 min,
ble reaksjonsblandingen varmet opp til rt og røres i 4 timer, og ble deretter tynnet ut
10
med DCM og 10 % HC1. Den vannholdige fasen ble ekstrahert med DCM og
kombinerte organiske lag ble vasket med sat. NaHCO3, tørket (MgSO4), filtrert og
konsentrert in vacou for å gi 720 mg av den råe tittelblandingen som en blek gul stivnet
olje, som ble brukt for neste trinn uten videre rensing.
15
(S,E)-tert-Butyl 8-hydroksy-2-metyloct-5-en-4-ylkarbamat (9a). Syntesen av
tittelblandingen har allerede blitt beskrevet i eksempel 8 (blanding 5).
(S,E)-Benzyl 8-hydroksy-2-metyloct-5-en-4-ylkarbamat (9b). Til en løsning av
TBDPS-beskyttet alkohol 8b (584 mg, 1.10 mmol, rå) i tørr THF (9 mL) ved 0°C ble
TBAF (1.0M / THF, 1.38 mL, 1.38 mmol),tilsatt og reaksjonsblandingen ble varmet
20
opp til rt mens røring under argon i 3,5 t, og deretter avkjølt med sat. aq. NH4Cl og
uttynnet med EtOAc. Den vannholdige fasen ble separert og ekstrahert med EtOAc. De
kombinerte organiske lagene ble vasket med saltløsning, tørket (Na2SO4), filtrert og
konsentrert i vakou. Lynkromatografi (SiO2, 5:5 heksaner/EtOAc) ga 194 mg (60%, 2
trinn) av tittelblandingen som en fargeløs olje. [α]D23 -6.4 (c 1.0, DCM); 1H NMR (300
25
MHz, CDCl3) δ 7.20-7.40 (m, 5 H), 5.65-5.49 (m, 1 H), 5.44 (dd, 1 H, J = 15.3, 6.6
Hz), 5.09 (s, 2 H), 4.67 (bs, 1 H), 4.16 (m, 1 H), 3.63 (bs, 2 H), 2.28 (q, 2 H, J = 6.0
Hz), 1.82 (bs, 1 H), 1.65 (m, 1 H), 1.40-1.25 (m, 2 H), 0.80-1.00 (m, 6 H); HRMS
(ESI) m/z kalkulert for C17H25NO3Na 314.1732, funnet 314.1739.
(S,E)-N-(8-Hydroksy-2-metyloct-5-en-4-yl)-P,P-difenylfosfin- amid (9c). Til en
30
løsning av TBDPS-beskyttet alkohol 8c (700 mg, 1.10 mmol, rå) i tørr THF (8 mL)
101
ved 0°C ble TBAF (1.0M / THF, 1.23 mL, 1.23 mmol), tilsatt og reaksjonsblandingen
ble varmet opp til rt mens den ble rørt under argon. Ettersom fullføring ikke ble
oppnådd etter 4 t, ble 0.75 eq med TBAF (0.75 mL) tilsatt ved 0°C.
Reaksjonsblandingen ble videre rørt ved rt i 3 t, og deretter avkjølt med sat. aq. NH4Cl
5
og uttynnet med EtOAc. Den vannholdige fasen ble separert og ekstrahert med EtOAc.
De kombinerte organiske lagene ble vasket med saltløsning, tørket (Na2SO4), filtrert og
konsentrert i vakou. Lynkromotografi (SiO2, 95:5, EtOAc/MeOH) ga 272 mg (77%, 2
trinn) med tittelblandingen som et hvitt fast stoff. mp 124.0-124.2°C; [α]D23 -12.1 (c
1.0, DCM); 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.00-7.83 (m, 4 H), 7.58-7.35 (m, 6 H), 5.52
10
(dd, 1 H, J = 15.3, 9.0 Hz), 5.24 (m, 1 H), 4.58 (bs, 1 H), 3.78-3.47 (m, 3 H), 2.80
(appdd, 1 H, J = 9.2, 3.8 Hz), 2.16 (m, 2 H), 1.68 (bs, 1 H), 1.55-1.43 (m, 1 H), 1.431.31 (m, 1 H), 0.87 (dd, 6 H, J = 8.6, 6.4 Hz); HRMS (ESI) m/z kalkulert for
C21H28NO2PNa 380.1755, funnet 380.1725.
15
TEMPO-4-yl-(S,E)-5-(tert-butoksykarbonylamino)-7-metyloct-3-enamid (10a,
JP4-039). Syntesen av tittelblandingen har allerede blitt beskrevet i eksempel 8
(blanding 7).
TEMPO-4-yl-(S,E)-5-(benzyloxykarbonylamino)-7-metyloct-3-enamid (10b). Til
en løsning av alkoholen 9b (158 mg, 0.543 mmol) i aceton (5 mL) ved 0°C ble
20
langsomt tilsatt en ferskt fremstilt løsning av Jones-reagent (2.5M, 0.36 mL, 0.904
mmol). Den resulterende mørke løsningen ble rørt ved 0°C i 1 t, og deretter uttynnet
med Et2O og vann. Den vannholdige fasen ble separert og ekstrahert med Et2O (2x).
De kombinerte organiske lagene ble vasket med vann (2x) og saltoppløsning (1x),
tørket (Na2SO4), filtrert og konsentrert i vacou for å gi 166 mg (kvant.) av den rå
25
tittelblandingen som en lett gul olje, som ble brukt i neste trinn uten videre rensing.
Til en løsning av denne syren ble (160 mg, 0.524 mmol, rå) i tørr DCM (7 mL) ved
0°C tilsatt suksessivt til en løsning 4-amino-TEMPO (139 mg, 0.786 mmol) i tørr
DCM (0.5 mL), DMAP (71 mg, 0.576 mmol), HOBt·H2O (78 mg, 0.576 mmol) og
EDCI (123 mg, 0.629 mmol). Den resulterende gulaktige løsningen ble rørt ved rt
102
under argon i 15 t, og deretter vasket med sat. NH4Cl. Den vannholdige fasen ble
separert og ekstrahert en gang med DCM, og de kombinerte organiske lagene ble tørket
(Na2SO4), filtrert og konsentrert in vacou. Lynkromatografi (SiO2, 5:5 til 3:7,
heksaner/EtOAc) ga 171 mg (71%) av tittelblandingen som et ferskenfarget skum. mp
5
19260,5°C (mykningspunkt: 44°C); [α]D23 +26.5 (c 0.5, DCM); EIMS m/z 458 ([M]+,
37), 281 (19), 154 (28), 124 (47), 91 (100), 84 (41); HRMS (EI) m/z kalkulert for
C26H40N3O4 458.3019, funnet 458.3035.
TEMPO-4-yl-(S,E)-5-(difenylfosforylamino)-7-metyloct-3-enamid (10c). Til en
løsning av alkoholen 9b (166,5 mg, 0.466 mmol) i aceton (5 mL) ved 0°C ble langsomt
10
tilsatt en løsning av Jones-reagent (2.5M, 0.47 mL, 1,165 mmol). Den resulterende
mørke løsningen ble rørt ved 0°C i 2 t, og deretter uttynnet med Et2O og vann. Den
vannholdige fasen ble separert og ekstrahert med Et2O (2x). De kombinerte organiske
lagene ble vasket med vann (2x) og saltoppløsning (1x), tørket (Na2SO4), filtrert og
konsentrert i vacou for å gi 114 mg (66%) av den rå tittelblandingen som et hvitt skum,
15
som ble brukt i neste trinn uten videre rensing.
Til en løsning av denne syren ble (110 mg, 0.296 mmol, rå) i tørr DCM (3,5 mL) ved
0°C tilsatt suksessivt til en løsning 4-amino-TEMPO (78,4 mg, 0.444 mmol) i tørr
DCM (0.5 mL), DMAP (40,2 mg, 0.326 mmol), HOBt·H2O (44,0 mg, 0.326 mmol) og
EDCI (69,5 mg, 0.355 mmol). Den resulterende oransje løsningen ble rørt ved rt under
20
argon i 13 t, og deretter vasket med sat. NH4Cl. Den vannholdige fasen ble separert og
ekstrahert en gang med DCM, og de kombinerte organiske lagene ble tørket (Na2SO4),
filtrert og konsentrert in vacou. Lynkromotografi (SiO2, EtOAc til 97:3,
EtOAc/MeOH) ga 91.2 mg (59%) av tittelbladningen som en oransje olje som stivnet
svært langsomt ved høyt vakuum. mp 168.0-168.8°C (mykningspunkt: ‫׽‬75°C); [α]D23 -
25
14.1 (c 0.5, DCM); EIMS m/z 525 ([M+H]+, 10), 371 (27), 218 (28), 201 (74), 124
(100), 91 (35), 84 (26); HRMS (EI) m/z kalkulert for C30H43N3O3P 524.3042, funnet
524.3040.
Benzyl (1S)-1-(2-(2-(tert-butyldifenylsilyloksy)etyl)syklopropyl)-330
metylbutylkarbamat (11b). Til en løsning av ZnEt2 (110 mg, 0.844 mmol) i tørr
103
DCM (2 mL) ble lagt til DME (destillert, 0.088 mL, 844 mmol). Reaksjonsblandingen
ble rørt ved rt i 10 min under N2, deretter avkjølt til -20°C og CH2I2 (0.137 mL, 1.687
mmol) ble tilsatt dråpevis over 4 min. Etter å ha rørt i10 min, ble en løsning på alken
8b (149 mg, 0.281 mmol) i tørr DCM (1 mL) tilsatt dråpevis over 5 min.
5
Reaksjonsblandingen ble varmet opp til rt under røring. Etter 10 t ble reaksjonsblandingen avkjølt med sat. aq. NH4Cl og uttynnet med DCM og vann, den
vannholdige fasen ble separert og ekstrahert med EtOAc. De kombinerte organiske
lagene ble tørket (Na2SO4), filtrert og konsentrert i vakou. Lynkromatografi (SiO2, 9:1
heksaner/Et2O) ga 785 mg (68%) av tittelblandingen som en fargeløs olje. 1H NMR-
10
analyse vises kun diastereomer (> 95:5 dr). [α]D23 -26.8 (c 1.0, DCM); 1H NMR (300
MHz, CDCl3) δ 7.73-7.66 (m, 4 H), 7.48-7.28 (m, 11 H), 5.13-4.96 (m, 2 H), 4.62
(appbd, 1 H, J = 8.4 Hz), 3.72 (appbt, 2 H, J = 6.4 Hz), 3.21 (m, 1 H), 1.80-1.63 (m, 1
H), 1.60-1.25 (m, 4 H), 1.08 (s, 9 H), 0.92 (appd, 6 H, J = 6.3 Hz), 0.79 (m, 1 H), 0.51
(m, 1 H), 0.40 (m, 1 H), 0.30 (m, 1 H); HRMS (ESI) m/z kalkulert for C34H45NO3SiNa
15
566.3066, funnet 566.3103.
(1S)-1-(2-(2-(Tert-butyldifenylsilyloksy)etyl)syklopropyl)-3-metylbutan-1-amin
(12). En flaske som inneholder en løsning av den Cbz-beskyttede aminen 11b (460 mg,
0.846 mmol) i en 5:1 MeOH/EtOAc-blanding (12 mL) ble skylt og fylt 3 ganger med
argon, og deretter ble 10% Pd/C (50 mg) tilsatt. Flasken ble skylt og fylt 3 ganger med
20
H2, og den resulterende svarte løsningen ble rørt ved rt under H2 (1 atm). Ettersom
reaksjonen ikke ble ferdig etter 3 t, ble en ekstra mengde på 10 % Pd/C (30 mg) tilsatt
og røring under H2 ble fortsatt i 5 t. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert gjennom
en pute med kelitt, kelitten ble vasket med MeOH og AcOEt, og løsningen ble
konsentrert in vacou for å gi 317 mg (92%) av det rå tittelproduktet som en svakt gul
25
olje, som ble brukt i neste trinn uten videre rensing.
Benzyl (1S)-1-(2-(2-(tert-butyldifenylsilyloksy)etyl)syklopropyl)-3metylbutylkarbamat (11a). Til en løsning av aminen 12 (309 mg, 0.755 mmol) i tørr
DCM (12 mL) ble tilsatt Et3N (0.21 mL, 0.153 mmol) og deretter Boc2O (183 mg,
0.830 mmol) ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble rørt ved rt under N2 for 28 h.
30
Reaksjonen ble avkjølt med sat. aq. NH4Cl og den vannhldige fasen ble ekstrahert med
DCM. De kombinerte organiske lagene ble tørket (Na2SO4), filtrert og konsentrert i
vacou for å gi 471 mg av den rå tittelblandingen som en fargeløs olje, som ble brukt i
104
neste trinn uten videre rensing.
Tert-butyl (1S)-1-(2-(2-hydroksyetyl)syklopropyl)-3-metylbutylkarbamat (13a). Til
en løsning av den rå TBDPS-beskyttede alkoholen 11a (464 mg, 0.742 mmol) i tørr
5
THF (6 mL) ved 0°C ble TBAF (1.0M / THF, 0,93 mL, 0.927 mmol), og reaksjonsblandingen ble varmet opp til rt mens den ble rørt under N2. Ettersom TLC viste
ufullført reaksjon etter 5 t, 0.75 eq. ble TBAF (0.56 mL) tilsatt. Etter 9 t ble
reaksjonsblandingen avkjølt med sat. aq. NH4Cl og uttynnet med EtOAc. Den
vannholdige fasen ble separert og ekstrahert med EtOAc. De kombinerte organiske
10
lagene ble vasket med saltløsning, tørket (Na2SO4), filtrert og konsentrert i vakou.
Lynkromotografi (SiO2, 5:5, heksaner/EtOAc) ga 177 mg (88%) av tittelbladningen
som en fargeløs olje som stivnet ved høyt vakuum for å gi et hvitt pulver. mp 49.850.2°C; [α]D22 -30.8 (c 1.0, DCM); 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.50 (appbd, 1 H, J =
4.5 Hz), 3.66 (bs, 2 H), 2.94 (m, 1 H), 2.36 (bs, 1 H), 1.82 (bs, 1 H), 1.71 (m, 1 H),
15
1.45 (s, 9 H), 1.39 (t, 2 H, J = 7.2 Hz), 1.01 (bs, 2 H), 0.90 (dd, 6 H, J = 10.2, 6.6 Hz),
0.50 (m, 1 H), 0.43-0.27 (m, 2 H); HRMS (ESI) m/z kalkulert for C15H29NO3Na
294.2045, funnet 294.2064.
Benzyl (1S)-1-(2-(2-hydroksyetyl)syklopropyl)-3-metylbutylkarbamat (13b). Til en
løsning av TBDPS-beskyttet alkohol 11b (320 mg, 0.588 mmol) i tørr THF (5 mL) ved
20
0°C ble TBAF (1.0M / THF, 0,74 mL, 0,735 mmol), tilsatt og reaksjonsblandingen ble
varmet opp til rt mens røring under argon i 7 t, og deretter avkjølt med sat. aq. NH4Cl
og uttynnet med EtOAc. Den vannholdige fasen ble separert og ekstrahert med EtOAc.
TDe kombinerte organiske lagene ble vasket med saltløsning, tørket (Na2SO4), filtrert
og konsentrert i vakou. Lynkromatografi (SiO2, 5:5 heksaner/EtOAc) ga 166 mg (92%)
25
av tittelblandingen som en fargeløs olje. [α]D23 -21.6 (c 1.0, DCM); 1H NMR (300
MHz, CDCl3) δ 7.42-7.28 (m, 5 H), 5.10 (m, 2 H), 4.76 (appbd, 1 H, J = 5.7 Hz), 3.63
(bs, 2 H), 3.04 (m, 1 H), 2.12-1.98 (bs, 1 H), 1.83-1.62 (m, 2 H), 1.42 (t, 2 H, J = 7.0
Hz), 1.16-0.95 (m, 2 H), 0.90 (appt, 6 H, J = 7.0 Hz), 0.53 (sept, 1 H, J = 4.3 Hz), 0.42
(dt, 1 H, J = 8.4, 4.5 Hz), 0.34 (dt, 1 H, J = 8.4, 5.0 Hz); HRMS (ESI) m/z kalkulert for
30
C18H27NO3Na 328.1889, funnet328.1860.
105
TEMPO-4-yl-2-(2-((S)-1-(tert-butoksykarbonylamino)-3metylbutyl)cyclopropyl)acetamide (14a). Til en løsning av alkoholen 13a (130 mg,
0.477 mmol) i aceton (5 mL) ved 0°C ble langsomt tilsatt en løsning av Jones-reagent
5
(2.5M, 0.48 mL, 1.194 mmol). Den resulterende mørke løsningen ble rørt ved 0°C i 2 t,
og deretter uttynnet med Et1O og vann. Den vannholdige fasen ble separert og
ekstrahert med Et2O (2x). De kombinerte organiske lagene ble vasket med vann (2x) og
saltoppløsning (1x), tørket (Na2SO4), filtrert og konsentrert i vacou for å gi 133 mg
(97%) av den rå tittelblandingen som en fargeløs olje, som ble brukt i neste trinn uten
10
videre rensing.
Til en løsning av denne syren ble (127,6 mg, 0.447 mmol, rå) i tørr DCM (5,5 mL) ved
0°C tilsatt suksessivt til en løsning 4-amino-TEMPO (118,4 mg, 0.671 mmol) i tørr
DCM (0.5 mL), DMAP (60,7 mg, 0.492 mmol), HOBt·H2O (66.4 mg, 0.492 mmol) og
EDCI (105.0 mg, 0.536 mmol). Den resulterende oransje løsningen ble rørt ved rt
15
under argon i 15 t, og deretter vasket med sat. NH4Cl. Den vannholdige fasen ble
separert og ekstrahert en gang med DCM, og de kombinerte organiske lagene ble tørket
(Na2SO4), filtrert og konsentrert in vacou. Lynkromatografi (SiO2, 5:5 to 3:7,
heksanes/EtOAc) ga 150.0 mg (76%) av tittelblandingen som et ferskenfarget skum.
mp 139.5°C; [α]D23 -15.7 (c 0.5, DCM); EIMS m/z 438 ([M]+, 6), 252 (57), 140 (67),
20
124 (80), 91 (48), 84 (59), 57 (100); HRMS (EI) m/z kalkulert for C24H44N3O4
438.3332, funnet 438.3352.
TEMPO-4-yl-2-(2-((S)-1-(benzyloksykarbonylamino)-3metylbutyl)cyclopropyl)acetamid (14b). Til en løsning av alkoholen 13b (110,5 mg,
0.362 mmol) i aceton (5 mL) ved 0°C ble langsomt tilsatt en løsning av Jones-reagent
25
(2.5M, 0.36 mL, 0.904 mmol). Den resulterende mørke løsningen ble rørt ved 0°C i 2 t,
og deretter uttynnet med Et1O og vann. Den vannholdige fasen ble separert og
ekstrahert med Et2O (2x). De kombinerte organiske lagene ble vasket med vann (2x) og
saltoppløsning (1x), tørket (Na2SO4), filtrert og konsentrert i vacou for å gi 113,5 mg
(98%) av den rå tittelblandingen som en fargeløs olje, som ble brukt i neste trinn uten
106
videre rensing.
Til en løsning av denne syren (110 mg, 0.344 mmol, rå) i tørr DCM (4.5 mL) ved 0°C
ble tilsatt suksessivt til en løsning med 4-amino-TEMPO (91.2 mg, 0.517 mmol) i tørr
DCM (0.5 mL), DMAP (46.7 mg, 0.379 mmol), HOBt·H2O (51.2 mg, 0.379 mmol) og
5
EDCI (80.8 mg, 0.413 mmol). Den resulterende oransje løsningen ble rørt ved rt under
argon i 18 t, og deretter vasket med sat. NH4Cl. Den vannholdige fasen ble separert og
ekstrahert en gang med DCM, og de kombinerte organiske lagene ble tørket (Na2SO4),
filtrert og konsentrert in vacou. Lynkromatografi (SiO2, 4:6, hexanes/EtOAc) ga 123
mg (75%) av tittelblandingen som et ferskenfarget skum. mp 51.8°C (mykningspunkt:
10
44°C); [α]D23 -15.3 (c 0.5, DCM); EIMS m/z 472 ([M]+, 42), 415 (58), 322 (43), 168
(47), 140 (46), 124 (75), 91 (100), 84 (53); HRMS (EI) m/z kalkulert for C27H42N3O4
472.3175, funnet 472.3165.
Eksempel 20 - Syntese for alternative nitroksid-deler
15
[0217] Skjematiske fremstillinger vises for alternative nitroksid-deler, der figur 42
viser en synteseprotokoll for 5-amino-1,1,3,3-tetrametylisoindolin-2-yloksyl (5-aminoTMIO) og figure 43 viser en synteseprotokoll for 6-amino-1-metyl 2-azaadamantan Noksyl (6-amino-1-Me-AZADO).
20
[0218] Blandinger 5-amino-1,1,3,3-tetramethylisoindolin-2-yloxyl (5-amino-TMIO) og
(20) vises i figur 42 og ble fremstilt i henhold til følgende.
[0219] Syntese 5-amino-TMIO ble tidligere beskrevet av Reid, D.A. et al. (The
25
synthesis of water soluble isoindoline nitroxides and a pronitroxide hydroxylamine
hydrochloride UV-VIS probe for free radicals. Chem Comm. 1998, 17,1907-8) og
referanser oppgitt heri.
2-Benzyl-1,1,3,3-tetrametylisoindolin (16). (Første trinn: Org. Synt. 1998, 9, 649;
30
second step: Griffiths, P. G. et al. Synthesis of the radical scavenger 1,1,3,3-
107
tetramethylisoindolin-2-yloxyl. Aust. J. Chem. 1983, 36, 397-401). En ovnstørket 250
mL flaske med tre flaskehalser og rund bunn ble skylt med nitrogen, og magnesium
(3.84 g, 156.5 mmol) ble introdusert, som ble dekket med tørr Et2O (9 mL). En løsning
med MeI (9.45 mL, 150.2 mmol) i tørr Et2O (80 mL) ble deretter tilsatt dråpevis via en
5
dråpetrakt mens den ble rørt i en periode på 50 min. Den resulterende reaksjonsblandingen ble deretter rørt i ytterligere 30 min, og deretter konsentrert ved lav
destillasjon av løsningen til den interne temperaturen nådde 80 °C. Resten fikk kjøle
seg ned til 60 °C, og en løsning med N-benzylftalimid (6.00 g, 25.04 mmol) i tørr
toluen (76 mL) ble tilsatt dråpevis via en dråpetrakt med røring i tilstrekkelig hastighet
10
for å vedlikehold denne temperaturen. Når tilsetningen var fullført, ble løsningen
destillert langsomt fra blandingen til temperaturen nådde 108-110°C. Reaksjonsblandingen ble refluksert ved 110 °C i 4 t, og deretter konsentrert på nytt ved videre
løsningsdestillasjon. Den ble deretter avkjølt og uttynnet med heksaner (ble lilla). Den
grøtete resultatet ble filtrert gjennom kelitt og vasket med heksaner. Det kombinerte
15
gule filtratet ble mørkelilla etter å ha støtt i luft over natten. Den ble deretter
konsentrert in vacou. Den resulterende lilla resten ble sendt gjennom en kort kolonne
av basisk alumina (grad I, 70-230 nett), elutert med heksaner (‫׽‬1 L), for å gi 2.585 g
(39%) av tittelblandingen som en fargeløs olje som stivnet for å gi et hvitt fast stoff.
mp 61.0-61.4°C. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.48 (appd, 2 H, J = 7.2 Hz), 7.34-7.19
20
(m, 5 H), 7.18-7.11 (m, 2 H), 4.00 (s, 2 H), 1.31 (s, 12 H); HRMS (EI) m/z kalkulert for
C19H23N 265.1830, funnet 265.1824.
1,1,3,3-Tetrametylisoindolin (17). (Griffiths, P. G. et al. Synthesis of the radical
scavenger 1,1,3,3-tetramethylisoindolin-2-yloxyl. Aust. J. Chem. 1983, 36, 397-401;
25
Chan, K. S. et al. Reaksjoner mellom nitroksider og metalloporfyrin-alkyder leder
betahydrogener: alifatisk karbon-karbon-båndaktivering av metallsentrerte radikaler. J.
Organomet. Chem. 2008, 693, 399-407). Den beskyttede benzyl-aminen 16 (1.864 g,
7.02 mmol) ble oppløst i AcOH (34 mL) i en Parr-flaske, og 10% Pd/C (169.5 mg) ble
tilsatt. (Reaksjonen ble delt i 3 serier). Flasken ble plassert i en høytrykksreaktor.
30
Reaktoren ble ladet med H2 og skylt i 5 sykluser og ble til slutt trykksatt med H2 ved 4
108
bar (60 psi). Etter å ha blitt rørt ved rt i 3 timer, ble reaksjonsblandingen filtrert
gjennom kelitt, og løsningen ble fjernet in vacou. Den resulterende resten ble oppløst i
vann (5 mL) og løsningen ble nøytralisert med 2.5N NaOH (pH 11.5), og ekstrahert
med Et2O (3 x 50 mL). De kombinerte organiske lagene ble tørket (Na2SO4), filtrert og
5
konsentrert in vacuo for å gi 1.165 g (95%) av den rå tittelblandingen som svakt gule
krystaller. mp 36.0-36.5°C. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.30-7.23 (m, 2 H), 7.187.11 (m, 2 H), 1.86 (bs, 1 H), 1.48 (s, 12 H).
1,1,3,3-Tetrametylisoindolin-2-yloksyl (18). (Griffiths, P. G. et al. Synthesis of the
10
radical scavenger 1,1,3,3-tetramethylisoindolin-2-yloxyl. Aust. J. Chem. 1983, 36, 397401; Chan, K. S. et al. Reaksjoner mellom nitroksider og metalloporfyrin-alkyder leder
betahydrogener: alifatisk karbon-karbon-båndaktivering av metallsentrerte radikaler. J.
Organomet. Chem. 2008, 693, 399-407). Til en løsning av amin 17 (1.46 g, 8.33 mmol)
i en 14:1 blanding av MeOH/MeCN (16.6 mL) ble tilsatt suksessivt NaHCO3 (560 mg,
15
6.67 mmol), Na2WO4·2H2O (83.3 mg, 0.25 mmol) og 30% aq. H2O2 (3.12 mL, 27.50
mmol). Den resulterende løsningen ble rørt ved rt. Etter 18 timer dannet en skarpt gul
løsning seg og 30 % aq. H2O2 (3.00 mL, 26.44 mmol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen
ble rørt i 2 dager, og uttynnet med vann og ekstrahert med heksaner (2x). De
kombinerte organiske lagene ble vasket med 1M H2SO4 og saltoppløsning (Na2SO4),
20
filtrert og konsentrert i vacou for å gi 1,55 g (98%) av den rå tittelblandingen som et
gult krystallinpulver, som ble brukt i neste trinn uten videre rensing. mp 122-125°C
(mykningspunkt: 108°C); HRMS (EI) m/z kalkulert for C12H17NO 191.1310, funnet
191.1306.
25
5-Nitro-1,1,3,3-tetrametylisoindolin-2-yloksyl (19). (Bolton, R. et al. An EPR and
NMR study of some tetramethylisoindolin-2-yloxyl free radicals. J. Chem. Soc. Perkin
Trans. 2, 1993, 2049-52). Kons. H2SO4 (13.5 mL) ble lagt til dråpevis til 18 (1.345 g,
7.07 mmol) avkjølt i isvannbad, og danner en mørk løsning som deretter ble varmet til
109
60°C i 15 min og deretter avkjølt til 0°C. Kons. HNO3 (0.90 mL, 19.09 mmol) ble lagt
til dråpevis. Når reaksjonen så ut til å være ferdig, ble den gul-oransje løsningen
oppvarmet ved 100 °C i 10 min, fargen endret seg da til rød-oransje. Etter avkjøling til
rt, ble reaksjonsblandingen nøytralisert med nøye tilsetting til isavkjølt 2.5N NaOH (30
5
mL). Denne vannholdige fasen ble ekstrahert med Et2O til den ble fargeløs og de
kombinerte organiske lagene ble tørket (Na2SO4), filtrert og konsentrert in vacou for å
gi 1.64 g (98%) av den rå tittelblandingen som et gul-oransje pulver, som ble brukt i
neste trinn uten videre rensing.
10
5-amino-1,1,3,3-tetrametylisoindolin-2-yloksyl (5-amino-TMIO). (Første trinn:
Reid, D.A. et al. The synthesis of water soluble isoindoline nitroxides and a
pronitroxide hydroxylamine hydrochloride UV-VIS probe for free radicals. Chem
Comm. 1998, 17,1907-8; Giroud, A. M. and Rassat, A. Nitroxydes LXXX: syntheses
de mono et biradicaux nitroxydes dérivés de l'isoindoline. Bull. Soc. Chim. Fr. 1979,
15
II, 48-55; andre trinn: Keana, J. F. W. and Lee, T. D. Versatile synthesis of doxyl spin
labels bypassing the usual ketone precursors. J. Am. Chem. Soc. 1975, 97, 1273-4). En
flaske som inneholder 19 (1.50 g, 6.38 mmol, rå) i MeOH (75 mL) ble skylt og fylt
med argon, deretter ble 10% Pd/C (150 mg) tilsatt. Flasken ble skylt og fylt 3 ganger
med H2, og den resulterende svarte løsningen ble rørt ved rt under H2 (1 atm) i 4 t.
20
Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert gjennom kelitt, kelitten ble vasket med
MeOH, og løsningen konsentrert i vakou for å gi 1.38 g av den rå tittelproduktetblandingen som et gult fast stoff, som ble brukt for neste trinn uten videre rensing. 1H
NMR (300 MHz, CD3OD) δ 6.89 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 6.25 (dd, 1 H, J = 8.1, 2.1 Hz),
6.54 (d, 1 H, J = 2.1 Hz), 3.35 (s, 2 H), 1.34 (appd, 12 H, J = 5.7 Hz).
25
Til en løsning med den rå hydroksylaminen ble (1.38 g, 6.38 mmol) i MeOH (75 mL)
tilsatt Cu(OAC)2.H2O (26 mg, 0.128 mmol). Reaksjonsblandingen ble rørt ved rt under
luft i 1,5 t, fargen endret seg da til mørk brun. Løsningen ble deretter fjernet in vacou,
restproduktet ble tatt opp i CHCl3 og en liten mengde MeOH for å løse opp den
uløselige materialet, og vasket med vann. Den vannholdige fasen ble ekstrahert to
30
ganger med CHCl3, og de kombinerte organiske lagrene ble vasket med saltoppløsning,
110
tørket (Na2SO4), filtrert og konsentrert in vacou. Lynkromatografi (SiO2, 6:4 til 5:5,
heksaner/EtOAc) ga 1.126 g (86%) av tittelblandingen som et gult pulver. mp 192194°C (mykningspunkt: 189°C); HRMS (EI) m/z kalkulert for C12H17N2O 205.1341,
funnet 205.1336.
5
TMIO-5-yl-(S,E)-5-(tert-butoksykarbonylamino)-7-metyloct-3-enamid (20). Til en
løsning av alkoholen 9a (187 mg, 0.728 mmol, fremstilt i henhold til tidligere
eksempler) i aceton (7 mL) ved 0°C ble langsomt tilsatt en løsning av Jones-reagent
(2.5M, 0.73 mL, 1.821 mmol). Den resulterende mørke løsningen ble rørt ved 0°C i 1 t,
10
og deretter uttynnet med Et2O og vann. Den vannholdige fasen ble separert og
ekstrahert med Et2O (2x). TDe kombinerte organiske lagene ble vasket med vann (2x)
og saltoppløsning (1x), tørket (Na2SO4), filtrert og konsentrert i vacou for å gi 190 mg
(96%) av den rå tittelblandingen som en lett gul olje, som ble brukt i neste trinn uten
videre rensing.
15
Til en løsning av denne syren (187,4 mg, 0.691 mmol, rå) i tørr DCM (8 mL) ved 0°C
ble tilsatt suksessivt til en løsning med 5-amino-TMIO (212.6 mg, 1.036 mmol),
DMAP (93.7 mg, 0.760 mmol), HOBt·H2O (102.6 mg, 0.760 mmol) og EDCI (162.1
mg, 0.829 mmol). Den resulterende gulaktige løsningen ble rørt ved rt under argon i 16
t, og deretter vasket med sat. NH4Cl. Den vannholdige fasen ble separert og ekstrahert
20
med en gang DCM og kombinerte organiske lag ble vasket to ganger med 1N HC1 og
en gang med sat. NaHCO3, tørket (Na2SO4), filtrert og konsentrert i vakuo.
Lynkromatografi (SiO2, 6:4 heksaner/EtOAc) ga 221.0 mg (70%) av tittelblandingen
som et svakt oransje skum. mp 78-79°C (mykningspunkt: 70°C); [α]D22 +72.2 (c 0.5,
DCM); ESIMS mlz 481 ([M+Na]+, 50), 939 ([2M+Na]+, 100).
25
[0220] Blandingen 6-amino-1-metyl 2-azaadamantan N-oksyl (6-amino-1-MeAZADO) og (30) vises i figur 43 og ble fremstilt i henhold til følgende.
111
2-Adamantanekarbonitril (tricyclo[3.3.1.13,7]decane-2-karbonitrile, 22).
(Oldenziel, O. H. et al. 2-Adamantanekarbonitril. Org. Synt. 1977, 57, 8; Rohde, J. J. et
al. Discovery and Metabolic Stabilization of Potent and Selective 2-Amino-N(adamant-2-yl) Acetamide 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 Inhibitors. J.
5
Med. Chem. 2007, 50, 149-64). A 3-5°C løsning av 2-adamantanon
(tricyclo[3.3.1.13,7]decan-2-en, 21) (21.0 g, 137 mmol), p-tolylsulfonylmetyl
isocyanid (TosMIC, 35.5 g, 178 mmol) og EtOH (14 mL, 233 mmol) i 1,2dimetoksyetan (DME, 470 mL) ble behandlet med delvis tilsetning av t-BuOK (39.2 g,
342 mmol) i fast form, og den interne temperaturen ble holdt under 10°C. Etter
10
tilsetningen ble den resulterende grøtete reaksjonsblandingen rørt ved rt i 30 minutter
og deretter ved 35-40°C i 30 min. Den heterogene reaksjonsblandingen ble filtrert og
det faste stoffet ble vasket med DME. Filtratet ble konsentrert in vacou, lastet til en
kort Al2O3-kolonne (aktivert, nøytral, Brockmann I, 150 filter, 7 cm tykk x 15 cm
høyt), og vasket av med en and 5:1 blanding av heksaner/DCM (‫׽‬1.5 L). Løsningen
15
ble konsentrert in vacou for å gi 19.0 g (86%) av tittelblandingen som et hvitt pulver.
1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.91 (s, 1 H), 2.23-2.08 (m, 4 H), 2.00-1.80 (m, 4 H),
1.80-1.66 (m, 6 H).
2-Adamantan karboksylsyre (23). (Rohde, J. J. et al. Discovery and Metabolic
20
Stabilization of Potent and Selective 2-Amino-N-(adamant-2-yl) Acetamide 11βHydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 Inhibitors. J. Med. Chem. 2007, 50, 149-64).
En blanding av nitrilen 22 (18.9 g, 117 mmol) i AcOH (56 mL) og 48% HBr (224 mL)
ble rørt ved 120°C over natten. Reaksjonsblandingen ble avkjølt ved 4°C, fikk stå i 4
timer og ble deretter filtrert. Det faste stoffet ble skylt med vann og tørket i vakuum
25
over silikagele over natten for å gi 20,6 g (98 %) av tittelblandingen som off-white
krystaller. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s, 1 H), 2.55-2.47 (m, 1 H), 2.20
(bs, 2 H), 1.87-1.64 (m, 10 H), 1.60-1.50 (m, 2 H).
112
5,7-Dibromo-2-adamantan karboksylsyre (24). (Adaptert fra Rohde, J. J. et al.
Discovery and Metabolic Stabilization of Potent and Selective 2-Amino-N-(adamant-2yl) Acetamide 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 Inhibitors. J. Med. Chem.
5
2007, 50, 149-64). En godt rørt 0°C-løsning med AlBr3 (18.9 g, 69.6 mmol), BBr3
(2.40 g, 9.49 mmol) og Br2 (40 mL) ble behandlet porsjonsvis med syren 23 (5.70 g,
31.6 mmol). Ved fullføring av tilsetningen ble reaksjonsblandingen rørt ved 70 °C i 48
timer, og deretter avkjølt i isbad, og tørket forsiktig med sat. natriumbisulfitt. Røringen
ble fortsatt ved rt over natten. Den resulterende lysebrune suspensjonen ble filtrert, det
10
faste stoffet ble skylt med vann og tørket over nattet under vakuum ved 60°C for å gi
10.95 g (kvant.) av rå-tittelblandingen som et beige pulver. 1H NMR (300 MHz,
DMSO-d6) δ 12.56 (bs, 0.3 H), 2.85 (appd, 2 H, J = 12.9 Hz), 2.75-2.55 (m, 2 H), 2.502.35 (m, 2 H), 2.35-2.10 (m, 7 H).
15
(5,7-Dibromo-adamantan-2-yl)-karbamidsyre tert-butyl ester (25). En suspensjon
av syren 24 (2.00 g, 5.92 mmol) i tørr toluen (30 mL) ble behandlet suksessivt med
Et3N (1.0 mL, 7.10 mmol) og difenylfosforyl-azid (DPPA, 1.6 mL, 7.10 mmol). Den
resulterende blandingen ble rørt ved 85°C i 15 t. til en separert flaske som inneholdt en
løsning med t-BuOK (1,35 g, 11.8 mmol) i tørr THF (80 mL) ved 0°C ble tilsatt til
20
isocyanat-løsningen dråpevis via en dråpetrakt. Den resulterende reaksjonsblandingen
ble varmet til rt i løpet av 30 min, og deretter ble den avkjølt med vann. THF ble fjernet
in vacou, og det resulterende materialet ble uttynnet med EtOAc. Det organiske laget
ble vasket med 1N HCl, sat. NaHCO3 og saltløsning, tørket (Na2SO4), filtrert og
konsentrert in vacuo. Lynkromatografi (SiO2, 95:5 to 8:2, hexanes/EtOAc) ga 1,20 g
25
(50%, 2 trinn) av tittelblandingen som et hvitt pulver. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ
4.68 (bs, 1 H), 3.76 (bs, 1 H), 2.87 (s, 2 H), 2.47-2.13 (m, 10 H), 1.46 (s, 9 H).
113
(7-Metylen-bicyclo[3.3.1]nonan-3-one-9-yl)-karbaminsyre tert-butyl ester (26).
(Første trinn: Rohde, J. J. et al. Discovery and Metabolic Stabilization of Potent and
Selective 2-Amino-N-(adamant-2-yl) Acetamide 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase
5
Type 1 Inhibitors. J. Med. Chem. 2007, 50, 149-64). En løsning på 25 (125 mg, 0.305
mmol) i dioksan (0.80 mL) ble behandlet med 2N NaOH (0.70 mL, 1.37 mmol) og
bestrålt under mikrobølger (µw, Biotage) i 15 min ved 180°C. Dioksan ble fjernet in
vacuo. Resten ble oppløst i DCM, vasket med vann, tørket (Na2SO4), filtrert og
konsentrert in vacou for å gi 82,5 mg av den rå 9-amino-7-metylen-
10
bicyclo[3.3.1]nonan-3-one som en gul olje, som ble brukt i neste trinn uten videre
rensing.
Til en løsning av denne rå aminen i tørr DCM (5 mL) ble tilsatt Et3N (0.13 mL, 0.913
mmol) og deretter Boc2O (73,8 mg, 0.335 mmol) ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble
rørt ved rt under N2 i14 t. Reaksjonen ble avkjølt med sat. aq. NH4Cl og den
15
vannholdige fasen ble ekstrahert med DCM. De kombinerte organiske lagene ble tørket
(Na2SO4), filtrert og konsentrert i vakou. Lynkromatografi (SiO2, 7:3 heksaner/EtOAc)
ga 48,0 mg (59%, 2 trinn) av tittelblandingen som hvitt pulver. 1H NMR (300 MHz,
CDCl3) δ 4.93 (bs, 0.25 H), 4.84 (s, 2 H), 4.81 (bs, 0.75 H), 4.12 (bs, 0.25 H), 3.91
(appbd, 0.75 H, J = 3.6 Hz), 2.64-2.37 (m, 6 H), 2.37-2.23 (m, 3.25 H), 2.17 (appbd,
20
0.75 H, J = 13.8 Hz), 1.48 and 1.46 (2 s, 9 H).
(7-Metylen-bicyclo[3.3.1]nonan-3-one-oksime-9-yl)-karbaminsyre tert-butyl ester
(27). Til en løsning av keton 26 (137 mg, 0.515 mmol) i tørr pyridin (1 mL) ble tilført
NH2OH·HCl (109 mg, 1.54 mmol). Reaksjonsblandingen ble rørt ved rt under argon i
25
23 t. Løsningen ble deretter fjernet in vacou, og resten ble uttynnet med EtOAc og
deretter ble vann tilsatt. Lagene ble separat og den vannholdige fasen ekstrahert med
EtOAc. De kombinerte lagene ble vasket med 5% aq. CuSO4 (3x), saltløsning (1x),
tørket (Na2SO4), filtrert og konsentrert in vacuo. Lynkromatografi (SiO2, 4:6
114
heksaner/EtOAc) ga 133 mg (92%) av tittelblandingen som en fargeløs masse. 1H
NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.02 (bs, 0.6 H), 4.90 (bs, 0.25 H), 4.80 (d, 1 H, J = 2.1
Hz), 4.76 (bs, 0.75 H), 4.69 (d, 1 H, J = 2.1 Hz), 3.87 (bs, 1 H), 3.26 (d, 0.25 H, J =
16.8 Hz), 3.11 (d, 0.75 H, J = 16.8 Hz), 2.55-2.48 (m, 4 H), 2.48-2.20 (m, 4 H), 2.16
5
(appd, 0.25 H, J = 17.1 Hz), 2.04 (dd, 0.75 H, J = 17.1, 5.4 Hz), 1.47 (s, 9 H).
(1-Iodometyl-2-azaadamantan-6-yl)-karbaminsyre tert-butyl ester (28). Til en
blanding av oksim 27 (130 mg, 0.464 mmol) og MoO3 (94 mg, 0.649 mmol) i tørr
MeOH (4.6 mL) ved 0°C under argon ble tilsatt NaBH4 (179 mg, 4.64 mmol)
10
porsjonsvis. Reaksjonsblandingen ble rørt ved 0°C, og 2 ekstra mengder NaBH4 (179
mg, 4.64 mmol) ble tilstt porsjonsvis etter 2.5 h og etter 5.5 t. Etter 7 t, ble den
mørkebrune reaksjonsblandingen avkjølt med aceton og deretter filtrert gjennom kelitt,
og kelitten ble skylt med aceton. Filtratet ble konsentrert in vacou. Den resulterende
resten ble tynnet ut med vann og ekstrahert to ganger med EtOAc. De kombinerte
15
organiske lagene ble vasket med saltløsning, tørket (K2CO3), filtrert og konsentrert i
vacou for å gi 136 mg av den rå aminen som en gul olje, som ble brukt i neste trinn
uten videre rensing.
Til en suspensjon med denne rå-aminen i tørr acetonitril (MeCN, 2.3 mL) ved 0°C
under argon ble tilsatt I2 (117 mg, 0.462 mmol). Reaksjonsblandingen ble rørt ved rt i 4
20
timer og deretter avkjølt med sat. NaHCO3 and sat. Na2S2O3. Den resulterende
blandingen ble ekstrahert to ganger med DCM/CHCl3, og det organiske lageret ble
tørket (K2CO3) filtrert og konsentrert in vacuo. Lynkromatografi (SiO2, 95:5 to 9:1,
DCM/MeOH) ga 76,5 mg (42%) av tittelblandingen som en brun olje. 1H NMR (300
MHz, CDCl3) δ 4.83 (bs, 1 H), 3.77 (bs, 1 H), 3.30 (bs, 1 H), 3.24 (apps, 2 H), 2.14
25
(appbs, 2 H), 1.94 (appbd, 2 H, J = 13.5 Hz), 1.75 (m, 6 H), 1.46 (s, 9 H).
(1-Metyl-2-azaadamantan-N-oksyl-6-yl)-karbaminsyre tert-butyl ester (29).
Deiodinering av amin 28 kan oppnås ved å behandle 28 med en reduserende agent, som
115
f.eks. LiAlH4 eller NaBH4, muligens i nærvær av en katalysator, som f.eks. InCl3, og i
en polar aprotisk løsning som f.eks. THF eller MeCN.
Oksidering av den resulterende aminen for å gi den korresponderende nitroksiden 29
kan oppnås ved å behandle den nevnte aminen med H2O2 i nærvær av en katalytisk
5
mengde Na2WO4·2H2O, i en løsningsblanding av MeOH og H2O.
6-Amino-1-metyl-2-azaadamantan-N-oksyl (6-amino-1-Me-AZADO). Spalting av
den Boc-beskyttende gruppen kan oppnås ved å behandle 29 med trifluoreddiksyre
(TFA) in DCM, for å gi en fri amin 6-amino-1-Me-AZADO.
10
(1-Me-AZADO-6-yl)-(S,E)-5-(tert-butoksykarbonylamino)-7-metyloct-3-enamid
(30). Jones oksidering av (S,E)-tert-butyl 8-hydroksy-2-metylokt-5-en-4-ylkarbamat
(9a) gir korresponderende syre som beskrevet over. Blanding (9a) fremstilles i henhold
til tidligere eksempler.
15
Amid-kobling av den nevnte syren med 6-amino-1-Me-AZADO oppnås etter
betingelsene som er beskrevet over, ved bruk av koblingsagentene EDCI, DMAP og
HOBt-hydrat i CH2Cl2 (DCM), for å gi blanding (30).
[0221] Selv om spesifikke legemliggjøringer av denne oppfinnelsen har blitt beskrevet
20
over for illustrasjonsformål, vil det være tydlig for faglærte på feltet at en rekke
variasjoner av detaljene i den nåværende oppfinnelsen kan gjøres uten å fravike fra
oppfinnelsen som den er definert i de vedlagte kravene.
25
116
Drawing
Fig. 1-1
Source
Target
G1, LogP=2.0
G1, LogP=2.0
TIPNO-1, LogP=3.9
TIPNO-1, LogP=3.9
Bis-TIPNO, LogP=7.3
Bis-TIPNO, LogP=7.3
Fig. 1-2
Source
Target
Nitronyl nitroxide, LogP=1.7
Nitronyl nitroksid, LogP=1.7
Doxyl radical, LogP=2.6
Doksyl radikal, LogP=2.6
3-carboxyl-PROXYL, LogP=1.4
3-karboksyl-PROKSYL, LogP=1.4
TEMPO choline, LogP=2.5
TEMPO kolin, LogP=2.5
3-Carbamoyl-PROXYL, LogP=0.9
3-Carbamoyl-PROXYL, LogP=0.9
4-Maleimido-TEMPO, LogP=2.9
4-Maleimido-TEMPO, LogP=2.9
4-(2-Bromoacetamido)-TEMPO,
4-(2-Bromoacetamido)-TEMPO,
LogP=1.9
LogP=1.9
5
Fig. 4
Source
Target
Nitroxides, pmol/mg protein
Nitroksides, pmol/mg protein
Cells
Celler
Mitochondria
Mitokondrier
Cytosol
Cytosol
4-AT
4-AT
Fig. 5
10
Source
Target
Relative change in permeability (%)
Relativ endring i permeabilitet (%)
Fig. 6
117
Source
Target
Annexin V-positive cell
Anneksin V-positiv celle
% of controls
% av kontroller
ActD
ActD
Caspase-3 activity
Caspase-3-aktivitet
AMC, nmol/mg protein
AMC, nmol/mg protein
Control
Kontroll
ActD
ActD
Superoxide production
Superoksid-produksjon
Meanfluorescence of ethidium, a.u
Middel-fluorescense av etidium, a.u
ATP, nmol/mg protein
ATP, nmol/mg protein
Time, h
Time, t
Cell counts
Celle-tellinger
Propidium iodide fluorescence
PRopidium-iodid-fluorescence
Annexin V-positiv cell
Anneksin V-positiv celle
% of controls
% av kontroller
Fig. 7A-D
Source
Target
PC-OOH (pmol/nmol PC)
PC-OOH (pmol/nmol PC)
PS-OOH (pmol/nmol PS)
PS-OOH (pmol/nmol PS)
PE-OOH (pmol/nmol PE)
PE-OOH (pmol/nmol PE)
CL-OOH (pmol/nmol CL)
CL-OOH (pmol/nmol CL)
Control
Kontroll
HS + vehicle
HS + bil
Fig. 8
Source
Target
Caspase 3/7 activity (AU/mg protein)
Caspase 3/7 aktivitet (AU/mg protein)
Con
Kon
HS
HS
118
+ vehicle
+ bil
Fig. 9
Source
Target
Clearance (pl. Min -1. cm2)
Klaring (pl. Min -1. cm2)
menadione
menadion
Fig. 10A
Source
Target
MAP
KART
Control
Kontroll
Time (min)
Tid (min)
Infusion
Infusjon
5
Fig. 10B
Source
Target
Survival probability
Overlevelsessannsynlighet
Time (minutes)
Tid (minutter)
control
kontroll
Fig. 11A
Source
Target
88% - can use crude
88% - kan bruke rå
97%, used crude
97 % brukt rå
74%, 2steps; >95:5 dr
74%, 2trinn; >95:5 dr
no chromatography
ingen kromotografi
88%, 2 steps
88 %, 2 trinn
2. 4-amino tempo
2. 4-amino tempo
EDCI, DMAP
EDCI, DMAP
HOBt
HOBt
8 steps, 42% overall yield
8 trinn, 42% generelt resultat
119
from commercial materials
fra kommersielle materialer
Fig. 12
Source
Target
Intergration effiency % of the total
Integreringseffektivitet % av den totale
Cell
Celle
Mitochondria
Mitokondrier
N.D.
N.D.
4-amino TEMPO
4-amino TEMPO
Fig. 13
Source
Target
CL hydroperoxides, pmol/nmol CL
CL-hydroperoksider, pmol/nmol CL
Time, h
Time, t
Origin
Opprinnelse
Ethidium fluorescence fold of control
Etidiumfluorescence fold av kontroll
Time, h
Time, t
IR
IR
5-125/pre-IR
5-125/pre-IR
Post-IR/5-125
Post-IR/5-125
PEG-SOD/pre-IR
PEG-SOD/pre-IR
5
Fig. 14
Source
Target
Control
Kontroll
Cytosol
Cytosol
IR
IR
Pre-
Pre-
Post-
Post-
Cyt c
Cyt c
Actin
Actin
120
Densitometry ratio, cyt c/actin
Densitometriforhold, cyt c/aktin
AnnexinV positiv cells, % of total
AnneksinV positive celler, % av total
No IR
Nr IR
Fig. 15
Source
Target
Surviving Fraction
Overlevende fraksjon
y-irradiation dose, Gy
y-strålingsdose, Gy
Fig. 16
Source
Target
Surviving Fraction
Overlevende fraksjon
Radiation Dose (Gy)
Strålingsdose (Gy)
Control
Kontroll
Tempol
Tempol
5
Fig. 18
Source
Target
Survival Fraction
Overlevelsesfraksjon
Days After 9.5 Gy
Dager etter 9,5 Gy
Fig. 19
10
Source
Target
JP4-039 Before
JP4-039 Før
JP4-039 After
JP4-039 Etter
Fig. 21A
Source
Target
Mouse
Mus
Control-no CB injection
Kontrollnr CB-injeksjon
Left leg
Venstre ben
121
Not boost irradiated
Ikke forsterkning ved stråling
Right leg
Høyre ben
Irradiated to added 1000 cGy
Bestrålt ved ekstra 1000 cGy
Fig. 22
Source
Target
Pump
Pumpe
Donor
Donor
Skin
Hud
Receiver
Mottaker
Fraction Collector
Fraksjonssamler
Fig. 23
Source
Target
GS-Nitrone pmol/mg protein
GS-nitron, pmol/mg protein
Accumulation of 1B-5-125 in mouse skin
Akkumulering av 1B-5-125 i musehus
after infiltration through skin
etter infiltrering gjennom huden
Askin
Ahud
Bskin
Bhud
Cskin
Chud
5
Fig. 25
Source
Target
Cumulative Absorption (pmole)
Kumulativ absorbering (pmol)
DMSO
DMSO
Emulsion
Emulgering
Time (hr)
Tid (time)
Fig. 27
Source
Target
Untreated
Ubehandlet
122
Symptomatic
Symptomatisk
XJB or sunflower seed oil
XJB eller solsikkefrøolje
i.p. administration 3x / week
i.p.-administrasjon 3x / uke
Age (weeks)
Alder (uke)
Fig. 28
Source
Target
XJB
XJB
Oil
Olje
Dystonia
Dystoni
Trembling
Skjelving
Kyphosis
Kyfose
Ataxia
Ataksi
Wasting
Wasting
Eyes
Øyne
Priapism
Priapisme
Decreased activity
Redusert aktivitet
Incontinence
Inkontinens
AGING SCORE
ALDERSSKÅR
(delay in onset of symtoms)
(forsinkelse i symptomstart)
Fig. 29
Source
Target
GAG/DNA
GAG/DNA
Series
Serie
5
Fig. 30
Source
Target
Vehicle
Bindemiddel
XJB-5-131
XJB-5-131
123
Fig. 31A+B
Source
Target
Weight (grams)
Vekt (gram)
XJB males
XJB hannkjønn
Untreated
Ubehandlet
XJB
XJB
Oil
Olje
Age (weeks)
Alder (uke)
XJB females
XJB hunnkjønn
Fig. 32
5
Source
Target
UNTREATED
UBEHANDLET
TREATED
BEHANDLET
SA-bGAL
SA-bGAL
DAPI
DAPI
MERGE
FUSJONERE
Fig. 34
Source
Target
Levels of Apoptosis using XJB treatment
Nivåer av apoptose ved bruk av XJBbehandling
% Grated Cells
% Raspede celler
Early Apoptosis
Tidlig apoptose
Late Apoptosis
Sen apoptose
Treated
Behandlet
Untreated
Ubehandlet
Fig. 40
Source
Target
Rplacement of Boc for alternative
Erstatning av Boc for alternative
124
protecting groups
beskyttende grupper
Isosteric replacement of alkene
Isosterisk erstatning av alken
Cyclopropane
Syklisk propan
Change TEMPO for alternative nitroxide
Endre TEMPO for alternative nitroksid-
moieties
deler
125
Krav
1. En blanding som har strukturen:
5
der X er en av
og
10
R1 er hydrogen, C1-C6 rett eller flergreinet-kjede alkyl, eller en C1-C6 rett eller
flergreinet-kjede alkylsom videre besto av en fenyl (C6H5)-gruppe som er uerstattet
eller er metyl-, hydroksyl- eller fluoro-erstattet; R2 er hydrogen, C1-C6 rett eller
flergreinet-kjede alkyl, R4 er hydrogen, C1-C6 rett eller flergreinet-kjede alkyl, eller en
C1-C6 rett eller flergreinet-kjede alkyl som videre består av en fenyl (C6H5) gruppe som
15
er uerstattet eller som er metyl-, hydroksyl- eller fluoro-erstattet; R3 er -NH-R5, -O-R5
eller -CH2-R5, og R5 er en -N-O•, -N-OH eller N=O inneholdende gruppe; R er -C(O)R6, -C(O)O-R6, eller -P(O)-(R6)2, der R6 er C1-C6 rett eller flergreinet-kjede alkyl eller
C1-C6 rett eller flergreinet-kjede alkylsom videre består av en eller flere fenyl (-C6H5)
grupper som er uavhengig erstattet, eller metyl-, etyl-, hydroksyl- eller fluoro-erstattet.
20
2. En blandingsom har strukturen
der X er en av
126
og
og
5
R1 er hydrogen, C1-C6 rett eller flergreinet-kjede alkyl, R4 er hydrogen, C1-C6 rett eller
flergreinet-kjede alkyl, eller en C1-C6 rett eller flergreinet-kjede alkyl som videre består
av en fenyl (C6H5) gruppe som er uerstattet eller er metyl-, hydroksyl- eller fluoroerstattet; R3 er -NH-R5, -O-R5 eller -CH2-R5, og R5 er en -N-O•, -N-OH eller N=O
inneholdende gruppe; og R er -C(O)-R6, -C(O)O-R6, eller -P(O)-(R6)2, der R6 is C1-C6
10
rett eller flergreinet-kjede alkyl eller C1-C6 rett eller flergreinet-kjede alkyl som videre
består av en eller flere fenyl (-C6H5) grupper som er uavhengig erstattet, eller metyl-,
etyl-, hydroksyl- eller fluoro-erstattet.
3. Blandingen av en av kravene 1-2, der R1, R2, R4 og R6 velges uavhengig fra
hydrogen, metyl, etyl, propyl, 2-propyl, butyl, t-butyl, pentyl og heksyl.
15
4. Blandingen i hvilket som helst av kravene 1-2, der når X is -CH=CR4-, R4 er
hydrogen, metyl eller etyl.
5. Blandingen i hvilket som helst av kravene 1-2, der R5 er 2,2,6,6-Tetrametyl-4piperidin 1-oksyl, 1-metyl 2-azaadamantan N-oksyl, eller 1,1,3,3-tetrametylisoindolin2-yloksyl.
20
6. Blandingen i krav 1, som har strukturen
127
7. Blandingen i krav 1, der X er
og R3 er -NH-R5.
8. Blandingen i krav 1, der X er
5
og R3 er -NH-R5.
9. Blandingen i krav 1, som har strukturen
10. Blandingen i krav 1, som har strukturen
10
128
5
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
5
143
5
144
145
146
147
5
148
5
10
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
5