20.05.2015
1
LEUKEMIER
Klassifisering
og
Diagnostisk immunfenotyping
2
Leukemi
• Klonal sykdom av hematologiske stamceller.
• Deling av den leukemiske stamcellen fører til
opphopning av umodne blodceller og
hemming av de friske stamcellene.
• Kan fører til benmargsvikt med bl.a:
lave trombocytter-blødning
lav Hb
Infeksjonstendens
• Generell sykdomsfølelse, fatigue
1
20.05.2015
Hvor begynner vi?
3
WHO- klassifikasjon
EiKKr
Kreftregisteret
4
Nye tilfeller
2007
515
2012
886
2013
997
2
20.05.2015
Klassifisering av leukemier
5
• FAB -
Fransk-Amerikansk-Britisk gruppe(1976) basert på
morforlogi og immunhistokjemi.
• EGIL
- European Group for Immunolgisk klassifisering av
leukemier, 1995?- basert på immunfenotype.
• WHO 2008 –
Stor internasjonal arbeidsgruppe. Basert på
morfologi, cytogenetikk, molekylærgenetikk og flowcytometri.
(REAL -klassifisering av lymfoid neoplasi 2004)
Leukemi inndeling
6
• Akutte leukemier
-AML Akutt Myelogen Leukemi (barn og voksne)
-ALL Akutt Lymfoblastisk Leukemi (barn og voksne)
Lymfoblastlymfom (voksne)
• Kroniske Leukemier
-MNP Myeloproliferative Neoplasier
KML Kronisk Myelogen Leukemi (voksne)
-Lymfoproliferative sykdommer
KLL Kronisk Lymfatisk Leukemi (eldre voksne)
•
MDS Myelodysplastisk syndrom
3
20.05.2015
FAB-klassifisering
AML
•
•
•
•
Mo- udifferensiert
M1- uten modningstegn
M2- med modningstegn
M3- hypergranulær
promyelocytt
•
•
•
•
M4- myelomonocytt
M5- monoblast
M6- erytroleukemi
M7- megakaryoblast
•
Andre sjeldne (eosinofili, NKcelle)
7
ALL
• L1- cytoplasmafattige, små blaster
• L2- mer heterogent med henblikk på
cytoplasmarikdom og størrelse
• L3- blaster med basofilt
vakuolisert cytoplasma
EGIL/FAB klassifikasjon av AML
8
Best Practive & Research
Clin Haemat, 2003, 561
4
20.05.2015
EGIL-klassifikasjon av B-ALL
9
Best Practive & Research
Clin Haemat, 2003, 561
EGIL-klassifikasjon av T-ALL
10
Best Practive & Research
Clin Haemat, 2003, 561
5
20.05.2015
WHO klassifisering av AML
11
• AML
med genetiske abnormaliteter
9 undergrupper
• AML med myelodysplasi relasjon
• AML behandlingsrelatert
• AML NOS (not otherwise specified)
11 undergrupper
• Myeloid sarcoma
• Myeloid proliferasjon relatert til Downs syndrom
2 undergrupper
WHO klassifisering av ALL
12
Precursor lymfoid neoplasi
• B lymfoblastisk leukemi/lymfom NOS
• B lymfoblastisk leukemi/lymfom med
genetiske abnormaliteter.
7 undergrupper
• T lymfoblastisk leukemi/lymfom
6
20.05.2015
13
Acute leukemias of ambiguous lineage
• AUL,
akutt udifferensiert leukemi
• MPAL,
Mixed Phenotype Akutt leukemi (bifenotypisk)
5 undergrupper
Morfologi
MGG
Myeloperoxidase
14
Auerstaver
Monocytt
- esterase
7
20.05.2015
Eksempel på ulike teknikker
15
A: MGG farging B/M utstryk
B: Flowcytometri
C: Cytokjemi
D: Cytogenetikk
E: Molekylærgenetikk: FISH
Blood, 2008 111;3941-3967
Hva er flowcytometri?
16
• Måling av celler i væskestrøm
Cellestørrelse
Celleform
Kompleksitet
Fluorescens
Karakterisere proteiner som er uttrykt på overflaten,
i cytoplasma eller i kjernen på celler.
8
20.05.2015
17
Hva kan måles med flowcyometri?
18
Beinmarg
Perifert blod
ALL
9
20.05.2015
19
Hvordan
• Antistoff / antigenbinding
• Lysspredning
• Fluorescens
20
Antistoff / antigenbinding
Cellulære antigen
Membran receptor
Nucleære antigen
Cytoplasmatiske antigen
Antistoffer
Monoklonale antistoff konjugert med
fluorokrom (f.eks FITC, PE osv.)
CD-markører
10
20.05.2015
Lysspredning
21
FCS/SSC
Malign populasjon?
Fluorescens
Hvert fluorokrom har sitt spesifikke exitasjon- og emmisjonsspekter
22
11
20.05.2015
Fluorescens intensitet
Fluorokromer
23
24
Flere lasere: Opplysning om inntil 10 parametere på hver
celle
Laser
BD Horizon™ V450 (Em-Max 448 nm)
Pacific Blue™ (Em-Max 452 nm)
AmCyan (Em-Max 491 nm)
BD Horizon™ V500 (Em-Max 500 nm)
Alexa Fluor® 488 (Em-Max 519 nm).
FITC (Em-Max 520 nm)
R-PE (Em-Max 578 nm),.
PE-Texas Red® (Em-Max 615 nm)
Texas Red® (Em-Max 620 nm)
APC (Em-Max 660 nm),
PE-Cy™5 (Em-Max 667 nm)
Alexa Fluor® 647 (Em-Max 668 nm).
PerCP (Em-Max 678 nm)
PerCP-Cy™5.5 (Em-Max 695 nm)
Alexa Fluor® 700 (Em-Max 723 nm).
APC-Cy™7 (Em-Max 785 nm)
APC-H7 (Em-Max 785 nm)
PE-Cy™7 (Em-Max 785 nm)
12
20.05.2015
25
Flowcytometrisk Immunfenotyping
Benmarg
SSC/CD45-gating
SSC/FSC-gating
Eosinofile
Granulocytter
Granulocytter
Monocytter
Monocytter
Lymfocytter
Erytroide forstadier
Erytroide
forstadier
Lymfocytter
”Blastregionen”
Liv T.N. Osnes
26
Normal benmarg vs AML vs ALL
Normal
AML
ALL
ALL
Grønn populasjon :Blaster
M H Fenstad
13
20.05.2015
27
Immunfenotype
• Avvik fra normalmønster
• Linjetilhørighet av patolologisk populasjon
Lymfoid –B eller T, Myeloid
• Akutt eller kronisk
Subklassifisering - betydning for behandling/prognose
• Markørkombinasjoner
viktig for oppfølging av MRD
28
Immunfenotyping av leukemi
• Konsensuspaneler
• NOPHO/NFCG (nordisk samarbeid)
• Felles 6-farge-panel for B-ALL og T-ALL til diagnostikk og MRD
deteksjon
• Fra 2008 har FCM-MRD-funn behandlingsmessig konsekvens
• EMN02 Myelomatose MRD European Myeloma Network
(2012)
• EuroFlow
Juni-09: Forslag til 8-farge-FCM-paneler for de aller fleste diagnoser
(www. EuroFlow.org)
14
20.05.2015
29
Panel for screening
8-farge Screening
Etikett:
Dato:
Materiale:
Prøve tatt:
Prøve analysert:
Sign lege(r):
kl:
kl:
x109/L
WBC:
x106/rør
WBC/analyserør:
Kommentar:
 Filene exportert til X:\
Sign bioing:
Antistoff kombinasjon
Ekstra Rør
FITC
µl
2,5
5
PE
µl
CD56 og
kappa
2,5
5
PerCPCY5.5
µl
PE-Cy7
1
CD8 og
Lambda
CD19 og
TCRgd
2
CD36
5
CD64
10
CD34
5
CD117
3
cy MPO
5
cy CD79a
5
CD34
5
CD19
µl
APC
2,5 CD3
5
CD33
2,5 CD7
µl
APC-H7
APCCy7
2,5 CD38
5
CD14
5
CD3
µl
P B / HRZ
V450
CD20 og
2,5 CD4
µl
HRZ
V500
µl
Antall
events
2,5 CD45
2,5 50000 (LST)
HLADR
2,5 CD45
2,5 50000( rør 2 AML
2,5 cy CD3
2,5 CD45
2,5 50000 (ALOT)
5
ALOT rør: Før merking må prøven lyseres vha Ammoniumklorid ( NH4Cl). Vask to ganger før vanlig prosedyre for intracellulær merking følges.
Benytt intracellulær metode til antistoffer med rød skrift
LST: Benytt 25 µl av mix, tilsett PerCP-Cy5:5, PE-Cy7 og APC-Cy7/H7 i tillegg
Tilhører EQS-prosedy re 8482 "Immunfenoty ping v ed flow cy tometri"
Immunologiske linjemarkører
30
• Acute leukemia orientation tube (ALOT) (EuroFlow)
ALL, AML, akutt udifferensiert leukemi
B-celler
CD19/CD79a
T-celler
CD7/CD3/cyCD3
Myeloide celler:
cyMPO/ (CD13/CD33)
Liv T.N. Osnes
15
20.05.2015
Mistanke om leukemi
31
Erasmus MC,
32
Litt til nå….!
16
20.05.2015
• Leukemi-assosiert fenotype (LAPs)
– Umodne celler
(eks CD34, CD117, TdT)
– Asynkron/abberant markør ekspresjon
(eks: dobbelpositive CD13-CD7, CD13-CD19)
– Antigen overekspresjon
– Fravær av linjespesifikke markører
(spes T-ALL CD7+/CD3-)
– Unormal lysspredning
(FSC/SSC)
33
Minimal residual disease
(MRD)
34
• Molekylært/cytogenetisk/immunfenotypisk
bevis for rest-sykdom
• Rest-sykdom kan ikke påvises ved vanlig
mikroskopering
(morfologisk remisjon:<5% leukemiceller)
• Flow cytometri
– Sensitivitet <0,01% (hvis nok celler)
– Abberant fenotype (viktig redskap i MRD oppfølging)
17
20.05.2015
Flowcytometrisk immunfenotyping
• Identifisering av
celletype
• Konklusjon
– B- vs T-celle, myeloid
– Moden vs umoden
– Myeloid vs lymfoid
forstadium
Normal?
+ leg
+arm
+ mouth
+ eyes
• Kvantitering
– Mengde/dominans av
maligne celler
FC Analysis: Abnormal!
The legs don’t go with
arms, eye or mouth
• Karakterisering
Decrease in eyes
– Abberante fenotyper
– Prognose
– Monitorering
35
36
18
20.05.2015
37
38
Takk for oppmerksomheten !
19