20.05.2015 1 LEUKEMIER Klassifisering og Diagnostisk immunfenotyping 2 Leukemi • Klonal sykdom av hematologiske stamceller. • Deling av den leukemiske stamcellen fører til opphopning av umodne blodceller og hemming av de friske stamcellene. • Kan fører til benmargsvikt med bl.a: lave trombocytter-blødning lav Hb Infeksjonstendens • Generell sykdomsfølelse, fatigue 1 20.05.2015 Hvor begynner vi? 3 WHO- klassifikasjon EiKKr Kreftregisteret 4 Nye tilfeller 2007 515 2012 886 2013 997 2 20.05.2015 Klassifisering av leukemier 5 • FAB - Fransk-Amerikansk-Britisk gruppe(1976) basert på morforlogi og immunhistokjemi. • EGIL - European Group for Immunolgisk klassifisering av leukemier, 1995?- basert på immunfenotype. • WHO 2008 – Stor internasjonal arbeidsgruppe. Basert på morfologi, cytogenetikk, molekylærgenetikk og flowcytometri. (REAL -klassifisering av lymfoid neoplasi 2004) Leukemi inndeling 6 • Akutte leukemier -AML Akutt Myelogen Leukemi (barn og voksne) -ALL Akutt Lymfoblastisk Leukemi (barn og voksne) Lymfoblastlymfom (voksne) • Kroniske Leukemier -MNP Myeloproliferative Neoplasier KML Kronisk Myelogen Leukemi (voksne) -Lymfoproliferative sykdommer KLL Kronisk Lymfatisk Leukemi (eldre voksne) • MDS Myelodysplastisk syndrom 3 20.05.2015 FAB-klassifisering AML • • • • Mo- udifferensiert M1- uten modningstegn M2- med modningstegn M3- hypergranulær promyelocytt • • • • M4- myelomonocytt M5- monoblast M6- erytroleukemi M7- megakaryoblast • Andre sjeldne (eosinofili, NKcelle) 7 ALL • L1- cytoplasmafattige, små blaster • L2- mer heterogent med henblikk på cytoplasmarikdom og størrelse • L3- blaster med basofilt vakuolisert cytoplasma EGIL/FAB klassifikasjon av AML 8 Best Practive & Research Clin Haemat, 2003, 561 4 20.05.2015 EGIL-klassifikasjon av B-ALL 9 Best Practive & Research Clin Haemat, 2003, 561 EGIL-klassifikasjon av T-ALL 10 Best Practive & Research Clin Haemat, 2003, 561 5 20.05.2015 WHO klassifisering av AML 11 • AML med genetiske abnormaliteter 9 undergrupper • AML med myelodysplasi relasjon • AML behandlingsrelatert • AML NOS (not otherwise specified) 11 undergrupper • Myeloid sarcoma • Myeloid proliferasjon relatert til Downs syndrom 2 undergrupper WHO klassifisering av ALL 12 Precursor lymfoid neoplasi • B lymfoblastisk leukemi/lymfom NOS • B lymfoblastisk leukemi/lymfom med genetiske abnormaliteter. 7 undergrupper • T lymfoblastisk leukemi/lymfom 6 20.05.2015 13 Acute leukemias of ambiguous lineage • AUL, akutt udifferensiert leukemi • MPAL, Mixed Phenotype Akutt leukemi (bifenotypisk) 5 undergrupper Morfologi MGG Myeloperoxidase 14 Auerstaver Monocytt - esterase 7 20.05.2015 Eksempel på ulike teknikker 15 A: MGG farging B/M utstryk B: Flowcytometri C: Cytokjemi D: Cytogenetikk E: Molekylærgenetikk: FISH Blood, 2008 111;3941-3967 Hva er flowcytometri? 16 • Måling av celler i væskestrøm Cellestørrelse Celleform Kompleksitet Fluorescens Karakterisere proteiner som er uttrykt på overflaten, i cytoplasma eller i kjernen på celler. 8 20.05.2015 17 Hva kan måles med flowcyometri? 18 Beinmarg Perifert blod ALL 9 20.05.2015 19 Hvordan • Antistoff / antigenbinding • Lysspredning • Fluorescens 20 Antistoff / antigenbinding Cellulære antigen Membran receptor Nucleære antigen Cytoplasmatiske antigen Antistoffer Monoklonale antistoff konjugert med fluorokrom (f.eks FITC, PE osv.) CD-markører 10 20.05.2015 Lysspredning 21 FCS/SSC Malign populasjon? Fluorescens Hvert fluorokrom har sitt spesifikke exitasjon- og emmisjonsspekter 22 11 20.05.2015 Fluorescens intensitet Fluorokromer 23 24 Flere lasere: Opplysning om inntil 10 parametere på hver celle Laser BD Horizon™ V450 (Em-Max 448 nm) Pacific Blue™ (Em-Max 452 nm) AmCyan (Em-Max 491 nm) BD Horizon™ V500 (Em-Max 500 nm) Alexa Fluor® 488 (Em-Max 519 nm). FITC (Em-Max 520 nm) R-PE (Em-Max 578 nm),. PE-Texas Red® (Em-Max 615 nm) Texas Red® (Em-Max 620 nm) APC (Em-Max 660 nm), PE-Cy™5 (Em-Max 667 nm) Alexa Fluor® 647 (Em-Max 668 nm). PerCP (Em-Max 678 nm) PerCP-Cy™5.5 (Em-Max 695 nm) Alexa Fluor® 700 (Em-Max 723 nm). APC-Cy™7 (Em-Max 785 nm) APC-H7 (Em-Max 785 nm) PE-Cy™7 (Em-Max 785 nm) 12 20.05.2015 25 Flowcytometrisk Immunfenotyping Benmarg SSC/CD45-gating SSC/FSC-gating Eosinofile Granulocytter Granulocytter Monocytter Monocytter Lymfocytter Erytroide forstadier Erytroide forstadier Lymfocytter ”Blastregionen” Liv T.N. Osnes 26 Normal benmarg vs AML vs ALL Normal AML ALL ALL Grønn populasjon :Blaster M H Fenstad 13 20.05.2015 27 Immunfenotype • Avvik fra normalmønster • Linjetilhørighet av patolologisk populasjon Lymfoid –B eller T, Myeloid • Akutt eller kronisk Subklassifisering - betydning for behandling/prognose • Markørkombinasjoner viktig for oppfølging av MRD 28 Immunfenotyping av leukemi • Konsensuspaneler • NOPHO/NFCG (nordisk samarbeid) • Felles 6-farge-panel for B-ALL og T-ALL til diagnostikk og MRD deteksjon • Fra 2008 har FCM-MRD-funn behandlingsmessig konsekvens • EMN02 Myelomatose MRD European Myeloma Network (2012) • EuroFlow Juni-09: Forslag til 8-farge-FCM-paneler for de aller fleste diagnoser (www. EuroFlow.org) 14 20.05.2015 29 Panel for screening 8-farge Screening Etikett: Dato: Materiale: Prøve tatt: Prøve analysert: Sign lege(r): kl: kl: x109/L WBC: x106/rør WBC/analyserør: Kommentar: Filene exportert til X:\ Sign bioing: Antistoff kombinasjon Ekstra Rør FITC µl 2,5 5 PE µl CD56 og kappa 2,5 5 PerCPCY5.5 µl PE-Cy7 1 CD8 og Lambda CD19 og TCRgd 2 CD36 5 CD64 10 CD34 5 CD117 3 cy MPO 5 cy CD79a 5 CD34 5 CD19 µl APC 2,5 CD3 5 CD33 2,5 CD7 µl APC-H7 APCCy7 2,5 CD38 5 CD14 5 CD3 µl P B / HRZ V450 CD20 og 2,5 CD4 µl HRZ V500 µl Antall events 2,5 CD45 2,5 50000 (LST) HLADR 2,5 CD45 2,5 50000( rør 2 AML 2,5 cy CD3 2,5 CD45 2,5 50000 (ALOT) 5 ALOT rør: Før merking må prøven lyseres vha Ammoniumklorid ( NH4Cl). Vask to ganger før vanlig prosedyre for intracellulær merking følges. Benytt intracellulær metode til antistoffer med rød skrift LST: Benytt 25 µl av mix, tilsett PerCP-Cy5:5, PE-Cy7 og APC-Cy7/H7 i tillegg Tilhører EQS-prosedy re 8482 "Immunfenoty ping v ed flow cy tometri" Immunologiske linjemarkører 30 • Acute leukemia orientation tube (ALOT) (EuroFlow) ALL, AML, akutt udifferensiert leukemi B-celler CD19/CD79a T-celler CD7/CD3/cyCD3 Myeloide celler: cyMPO/ (CD13/CD33) Liv T.N. Osnes 15 20.05.2015 Mistanke om leukemi 31 Erasmus MC, 32 Litt til nå….! 16 20.05.2015 • Leukemi-assosiert fenotype (LAPs) – Umodne celler (eks CD34, CD117, TdT) – Asynkron/abberant markør ekspresjon (eks: dobbelpositive CD13-CD7, CD13-CD19) – Antigen overekspresjon – Fravær av linjespesifikke markører (spes T-ALL CD7+/CD3-) – Unormal lysspredning (FSC/SSC) 33 Minimal residual disease (MRD) 34 • Molekylært/cytogenetisk/immunfenotypisk bevis for rest-sykdom • Rest-sykdom kan ikke påvises ved vanlig mikroskopering (morfologisk remisjon:<5% leukemiceller) • Flow cytometri – Sensitivitet <0,01% (hvis nok celler) – Abberant fenotype (viktig redskap i MRD oppfølging) 17 20.05.2015 Flowcytometrisk immunfenotyping • Identifisering av celletype • Konklusjon – B- vs T-celle, myeloid – Moden vs umoden – Myeloid vs lymfoid forstadium Normal? + leg +arm + mouth + eyes • Kvantitering – Mengde/dominans av maligne celler FC Analysis: Abnormal! The legs don’t go with arms, eye or mouth • Karakterisering Decrease in eyes – Abberante fenotyper – Prognose – Monitorering 35 36 18 20.05.2015 37 38 Takk for oppmerksomheten ! 19
© Copyright 2024