1. No category

(12) Oversettelse av
(11) NO/EP 2190296 B1
europeisk patentskrift
(19)
NORGE
NO
(51) Int Cl.
A23C 19/032 (2006.01)
A21D 8/04 (2006.01)
C07K 14/195 (2006.01)
C12N 9/10 (2006.01)
C12P 7/64 (2006.01)
C12Q 1/48 (2006.01)
Patentstyret
(21)
Oversettelse publisert
2015.01.12
(80)
Dato for Den Europeiske
Patentmyndighets
publisering av det meddelte
patentet
2014.09.24
(86)
Europeisk søknadsnr
08827725.6
(86)
Europeisk innleveringsdag
2008.08.14
(87)
Den europeiske søknadens
Publiseringsdato
2010.06.02
(30)
Prioritet
2007.08.17, GB, 0716126
(84)
Utpekte stater
AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR
HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT
RO SE SI SK TR
Utpekte samarbeidende
stater
AL BA MK RS
(73)
Innehaver
DuPont Nutrition Biosciences ApS, Langebrogade 1 Postboks 17, 1001
Copenhagen K., DK-Danmark
(72)
Oppfinner
LARSEN, Niels Erik, Skæring Hedevej 166, DK-8250 Egå, DK-Danmark
SØE, Jørn Borch, Orøvænget 11, DK-8381 Tilst, DK-Danmark
(74)
Fullmektig
Curo AS, Industriveien 53, 7080 HEIMDAL, Norge
(54)
Benevnelse
(56)
Anførte
publikasjoner
Prosess
WO-A-2006/008508
US-A1- 2007 122 525
NERLAND A H: "THE NUCLEOTIDE SEQUENCE OF THE GENE ENCODING GCAT FROM
AEROMONAS SALMONICIDA SSP. SALMONICIDA" JOURNAL OF FISH DISEASES,
OXFORD, GB, vol. 19, no. 2, 1 January 1996 (1996-01-01), pages 145-150, XP008049669
ISSN: 0140-7775
NERLAND A H: "GLYCEROPHOSPHOLIPID-CHOLESTEROL ACYLTRANSFERASE
PRECURSOR" SWISSPROT,, 1 January 1900 (1900-01-01), XP002318368
NO/EP2190296
1
Beskrivelse
HENVISNING TIL RELATERTE SØKNADER
[0001] Det foretas referanse til de følgende relaterte søknadene: US 2002-0009518, US 20040091574, WO2004/064537, WO2004/064987,
5
WO2005/066347, WO2005/066351, WO2006/008508, WO 2008/090395 og US 2008063783.
OMRÅDET FOR DEN FORELIGGENDE OPPFINNELSEN
[0002] Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en prosess for fremstilling av UHT-melk, en
prosess for enzymatisk behandling av UHT-melk, en enzymatisk behandlet UHT-melk, og
anvendelser av et enzym for behandling av UHT-melk for å gi nye og uventede tekniske fordeler.
10
BAKGRUNN FOR DEN FORELIGGENDE OPPFINNELSEN
[0003] Lipidacyltransferaser
er
kjent
for
å
være
fordelaktige
i
matanvendelser.
Lipidacyltransferaser har blitt funnet å ha sterk acyltransferaseaktivitet i matvarer. Denne
aktiviteten har overraskende fordelaktige anvendelser i fremgangsmåter for fremstilling av
matvarer.
15
[0004] For eksempel offentliggjør WO 2004/064537 en fremgangsmåte for in situ-produksjonen av
en emulgator ved anvendelse av en lipidacyltransferase, og fordelene forbundet med dette. WO
2008/090395 beskriver uttrykkingen av lipidacyltransferaser i (heterolog) vertscelle.
[0005] Varmebehandling i produksjon av produkter med lang levetid kalles ofte "sterilisering".
Dette innebærer at produktet utsettes for en slik kraftig varmebehandling at alle relevante
20
mikroorganismer og flesteparten av de varmebestandige enzymene inaktiveres. Slike produkter
har utmerkede holdekvaliteter og kan oppbevares over lengre tid ved omgivelsestemperatur.
Mange meierier kan derfor distribuere disse produktene over lange avstander og dermed finne
nye markeder.
[0006] Vanligvis anvendes to fremgangsmåter for fremstilling av sterilisert (ellers kjent som melk
25
med lang levetid til oppbevaring ved omgivelsestemperatur), nemlig i-beholdersterilisering eller
UHT-behandling etterfulgt av aseptisk emballering i emballasje som beskytter produktet mot lys
og atmosfærisk oksygen. Den foreliggende oppfinnelsen er anvendbar for melk med lang levetid
fremstilt ved hvilken som helst fremgangsmåte, f.eks. UHT-melk.
[0007] Det er mange fordeler for produsent, forhandler og forbruker hvis produktet ikke krever
30
kjøling og kan oppbevares i lange perioder uten søl.
[0008] Disse produktene kalles ofte UHT-produkter, særlig UHT-melk eller UHT-smakssatt melk.
[0009] Melk som utsettes for UHT-behandling må være av meget god kvalitet. Det er spesielt
viktig at proteinene i råmelken ikke forårsaker termisk ustabilitet, noe som kan være tilfelle
dersom råmelken er av dårlig kvalitet. En melk er uegnet for UHT-behandling hvis den er sur, har
35
feil saltbalanse og/eller inneholder for mange serumproteiner, typisk for kolostrum.
NO/EP2190296
2
[0010] Når melken holdes ved en høy temperatur i lang tid dannes visse kjemiske
reaksjonsprodukter, noe som fører til misfarging (bruning). Den erverver også en kokesmak og
karamellisert smak, og det er av og til en stor del bunnfall. Disse manglene unngås i stor grad ved
varmebehandling ved høyere temperatur i en kort tid. Det er viktig at den optimale
5
tid/temperatur-kombinasjonen velges for å muliggjøre tilfredsstillende sporeødeleggelse, mens
man samtidig holder varmeskaden på melken til et minimum.
[0011] Det har blitt vist at når melken varmes opp (f.eks. pasteuriseres ved 70-80 °C i 5-20
sekunder), blir en effekt kjent som "fløtepluggfenomenet" tydelig. Varmebehandling av melk kan
være skadelig for stabiliteten av melken.
10
[0012] De viktigste ingrediensene av melk er vann, fett, proteiner, laktose (melkesukker) og
mineraler (salter). Melk inneholder også mindre mengder av andre stoffer, slik som pigmenter,
enzymer, vitaminer, fosfolipider (stoffer med fettlignende egenskaper), steroler og gasser.
[0013] De mange lipidene i melk, som sammen danner "melkefettet", har en meget komplisert
sammensetning og struktur, enda mer komplisert enn de fleste andre naturlig forekommende
15
fettene. Vanligvis består melkefett av triglyserider, di- og monoglyserider, fettsyrer, steroler,
karotenoider og vitaminer (A, D, E og K). Andre komponenter inkluderer fosfolipider, lipoproteiner,
glyserider, cerebrosider, proteiner, nukleinsyrer, enzymer, metaller og vann.
[0014] Fosfolipider er den mest overflateaktive klassen, ettersom de er amfipolare. Ettersom
molekylstørrelsen er relativt stor, er de knapt løselige, verken i vann eller i fett. De har en tendens
20
til å danne lamellære bilag i begge væskene. Fosfolipider i melk er generelt sett i nær forbindelse
med proteiner, spesielt når de plasseres i membranen(e) av melkefettdråpene. Hoveddelen av
fosfolipider i melk er lecitiner, som er overflateaktive ved moderat hydrofilitet. Dermed kan lecitin
sees som et suspenderende og dispergerende middel eller som en emulgator for O/W-emulsjoner
så vel som for W/O-emulsjoner.
25
[0015] Fosfolipider omfatter 0,8-1,0 % av det naturlige melkefettet. Hovedtypene av
fosfolipider/lecitin i melk er fosfatidylkolin og fosfatidyletanolamin.
[0016] Steroler er svært uløselige i vann og viser meget liten overflateaktivitet. De assosieres lett
med fosfolipider. Kolesterolet kan betraktes som en uønsket ingrediens i melk når man vurderer
den ernæringsmessige verdien av melk. Kolesterol omfatter 0,3-0,4 % av det naturlige melkefettet.
30
[0017] EP 1 532 863 viser anvendelsen av en fosfolipase for å behandle en ostemelk eller en
ostemelkfraksjon.
[0018] Tanji et al (Res. Bull. Obihiro Univ., 22 (2001): 89-94) viser anvendelsen av lipaser for å
forbedre smaken i smørolje ved 40 °C.
NO/EP2190296
3
[0019] JP 57-189637 og JP57-189638 viser behandlingen av melk for å fremstille gjærede eller
sure melkedrikker som anvender fosfolipaser - der den enzymatiske behandlingen gjøres ved 3045 °C.
OPPSUMMERTE ASPEKTER AV DEN FORELIGGENDE OPPFINNELSEN
5
[0020] Aspekter ifølge den foreliggende oppfinnelsen presenteres i kravene og i den følgende
kommentaren.
[0021] Det har overraskende blitt funnet at stabiliteten, særlig langtidsstabiliteten, av UHT-melk
kan forbedres vesentlig ved å utsette melk eller en del av denne under UHT-melkeproduksjonen
for en lipidacyltransferase som definert i dette dokumentet.
10
[0022] Enda mer overraskende har oppfinnerne ifølge den foreliggende oppfinnelsen funnet at
den enzymatiske behandlingen kan utføres uten et ekstra oppvarmingstrinn. Dermed kan de
negative effektene av å varme opp melken to ganger, dvs. én gang for enzymatisk behandling og
deretter igjen for UHT-behandlingen unngås. Dette har mange fordeler som beskrevet nedenfor.
DETALJERTE ASPEKTER IFØLGE DEN FORELIGGENDE OPPFINNELSEN
15
[0023] I henhold til et første aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det tilveiebrakt en
fremgangsmåte for fremstilling av UHT-melk, der fremgangsmåten omfatter blanding av en
lipidacyltransferase og melk eller en fraksjon av denne ved en temperatur og i en inkubasjonstid
som er effektiv for å sikre at det er minst 5 % transferaseaktivitet målt ved den molare mengden
av kolesterolesteren dannet av acyloverføring fra fosfolipider eller triacylglyserider i melk til
20
kolesterol, i forhold til mengden av kolesterol som opprinnelig er tilgjengelig, beregnet ved hjelp
av den følgende ligningen:
Transferaseaktivitet = (mol/l kolesterester(t) – mol/l kolesterolester(0))x100
mol/l kolesterol(0), der:
Kolesterolester (t) = mengden kolesterolester ved tidspunktet t
25
Kolesterolester (0) = mengden kolesterolester ved tidspunktet 0
Kolesterol (0) = mengden kolesterol i melk ved tidspunktet 0;
og behandling av den enzymbehandlede melken ved ultravarmebehandling for å fremstille UHTmelk.
[0024] "Ultravarmebehandling (UHT)" er en prosess der melken varmes opp til omtrent 130-150
30
°C og holdes der i noen få sekunder, slik som ett til tre sekunder, fortrinnsvis to sekunder.
Begrepene
"ultravarmebehandling"
og
"ultrahøy
temperaturbehandling"
og
"høytemperaturbehandling" anvendes synonymt i dette dokumentet.
[0025] I én utførelsesform er begrepet "ultravarmebehandling" som anvendt i dette dokumentet
ment å omfatte både sterilisering i beholder og/eller UHT-behandling etterfulgt av aseptisk
35
emballering i emballasje som beskytter produktet mot lys og atmosfærisk oksygen.
NO/EP2190296
4
[0026] Som en fagperson vil forstå vil UHT-varmebehandlingstiden og temperaturkombinasjonen
etableres basert på produktet som skal behandles, og kan variere i en viss grad.
[0027] Etter varmebehandling kan UHT-melken sendes til en steril tank for å gi en buffer før
fylling.
5
[0028] Fylling gjøres vanligvis i en steril atmosfære der UHT-emballeringsmaskinen spyler pakken
med nitrogen og også holder området innenfor fyllehodene oversvømmet med nitrogen for å
eliminere eventuell luftforurensning.
[0029] I henhold til et andre aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det tilveiebrakt en
anvendelse av en lipidacyltransferase ved fremstilling av UHT-melk for å forbedre stabiliteten,
10
spesielt langtidsstabiliteten, av UHT-melken.
[0030] Begrepet "forbedring av stabiliteten" som anvendt i dette dokumentet, betyr at det er en
reduksjon i mengden av skumming og/eller bunnsetting og/eller flokkulering og/eller
faseseparasjon etter oppbevaring (fortrinnsvis etter oppbevaring i minst 24 timer). Hensiktsmessig
kan oppbevaringen være ved en temperatur på mellom omtrent 5 °C og 35 °C.
15
[0031] I én utførelsesform betyr begrepet "forbedring av stabiliteten" som anvendt i dette
dokumentet, at det er en reduksjon i mengden av skumming uten dannelse av et bunnlag etter
oppbevaring (fortrinnsvis etter oppbevaring i minst 24 timer). Oppbevaringen kan hensiktsmessig
være ved en temperatur på mellom omtrent 5 °C og 35 °C.
[0032] Skumming kan måles objektivt av Turbiscan (som beskrevet i dette dokumentet i
20
eksempeldelen) og/eller subjektivt av belastningstesten (som lært i dette dokumentet i
eksempeldelen).
[0033] Flokkulering kan måles objektivt av Turbiscan (som beskrevet i dette dokumentet i
eksempeldelen) og/eller subjektivt av belastningstesten (som beskrevet i dette dokumentet i
eksempeldelen).
25
[0034] Bunnsetting kan måles av bunnsettingstesten (som beskrevet i dette dokumentet i
eksempeldelen).
[0035] Faseseparasjon kan måles visuelt eller av Turbiscan (som beskrevet i dette dokumentet i
eksempeldelen).
[0036] Begrepet "forbedring av langtidsstabiliteten" som anvendt i dette dokumentet, betyr at
30
det er en reduksjon i mengden av skumming (fortrinnsvis uten dannelse av et bunnsettingslag)
og/eller bunnsetting og/eller flokkulering og/eller faseseparasjon etter oppbevaring over en lengre
tidsperiode (fortrinnsvis etter oppbevaring i omtrent 1-12 måneder, mer foretrukket etter
oppbevaring i omtrent 3-12 måneder, fortrinnsvis etter oppbevaring i opptil omtrent 6 måneder,
fortrinnsvis etter oppbevaring i opptil omtrent 12 måneder, mer foretrukket etter oppbevaring i
NO/EP2190296
5
minst omtrent 6 måneder). Oppbevaringen kan hensiktsmessig være ved en temperatur på
mellom omtrent 5 °C og 35 °C.
[0037] I henhold til et tredje aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det tilveiebrakt en
anvendelse av en lipidacyltransferase ved fremstilling av UHT-melk for å forbedre den sensorisk
5
merkbare forskjellen av UHT-melken. Den sensorisk merkbare forskjellen av UHT-melken kan
hensiktsmessig måles ved hjelp av "trekanttesten" beskrevet nedenfor i dette dokumentet.
[0038] I ett aspekt inkluderer den "sensorisk merkbare forskjellen" forbedret lukt og/eller smak,
f.eks. en redusert kokt smak og/eller aroma og/eller en redusert illeluktende smak og/eller aroma.
[0039] I henhold til et fjerde aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det tilveiebrakt en
10
anvendelse av en lipidacyltransferase ved fremstilling av UHT-melk for å redusere
kolesterolinnholdet i UHT-melken.
[0040] En reduksjon i kolesterolet kan måles ved hjelp av tynnsjiktkromatografi (TLC) og/eller
gassvæskekromatografi (GLC).
[0041] I henhold til et femte aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det tilveiebrakt en
15
anvendelse av en lipidacyltransferase ved fremstilling av UHT-melk for å eliminere eller redusere
skumming (fortrinnsvis uten dannelse av et bunnlag) i UHT-melken.
[0042] Hensiktsmessig betyr forbedringen i stabiliteten, særlig langtidsstabiliteten, og/eller
forbedringen i den sensorisk merkbare forskjellen og/eller forbedringen i lukt og/eller smak
og/eller reduksjonen i kolesterolinnholdet, og/eller reduksjonen i skummingen (fortrinnsvis uten
20
dannelse av et sedimentlag) av UHT-melken en forbedring når den enzymatisk behandlede UHTmelken (behandlet med enzymer i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen) sammenlignes
med UHT-melken, som ikke har blitt enzymatisk behandlet og/eller sammenlignet med UHTmelken som har blitt behandlet med en fosfolipase (nærmere bestemt et fosfolipase-A1-enzym
klassifisert som E.C. 3.1.1.32- eller et fosfolipase-A2-enzym klassifisert som EC.3.1.1.4).
25
[0043] Hensiktsmessig kan forbedringen i stabiliteten, særlig langtidsstabiliteten, og/eller
forbedringen i den sensorisk merkbare forskjellen og/eller forbedringen i lukt og/eller smak
og/eller reduksjonen i kolesterolinnholdet, og/eller reduksjonen i skummingen (fortrinnsvis uten
dannelse av et sedimentlag) av UHT-melken bety en forbedring når den enzymatisk behandlede
UHT-melken (behandlet med enzymer i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen)
30
sammenlignes med UHT-melken som har blitt behandlet med én eller flere av de følgende
fosfolipasene: Fosfolipase A1 fra Fusarium oxysporum (Lipopan F™) og/eller en fosfolipase
fra Fusarium heterosporum og/eller en fosfolipase A1 fra Fusarium venenatum (YieldMax™)
og/eller en fosfolipase fra Aspergillus niger og/eller en fosfolipase A2 fra Streptomyces
violaceoruber og/eller en fosfolipase A2 fra bukspyttkjertelen til gris og/eller en fosfolipase A2
35
fra Tuber borchii.
NO/EP2190296
6
[0044] Hensiktsmessig kan forbedringen i stabiliteten, særlig langtidsstabiliteten, og/eller
forbedringen i den sensorisk merkbare forskjellen og/eller forbedringen i lukt og/eller smak
og/eller reduksjonen i kolesterolinnholdet, og/eller reduksjonen i skummingen (fortrinnsvis uten
dannelse av et sedimentlag) av UHT-melken bety en forbedring når den enzymatisk behandlede
5
UHT-melken sammenlignes med UHT-melken som har blitt behandlet med én fosfolipase A1 fra
Fusarium oxysporum (Lipopan F™).
[0045] Det er fortrinnsvis fordelaktig å blande lipidacyltransferasen med melken eller en del av
denne før den gjennomgår behandling med høy temperatur. Med andre ord kan
lipidacyltransferasen tilsettes til råmelk eller en del av denne, og den enzymbehandlede råmelken
10
eller en del av denne gjennomgår deretter ultravarmebehandling (som gir UHT-melk eller en del av
denne).
[0046] I én utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan den foreliggende
oppfinnelsen tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av UHT-melk, der fremgangsmåten
omfatter blanding av en lipidacyltransferase og melk eller en fraksjon av denne ved en temperatur
15
og i en inkubasjonstid som er effektiv for å sikre at det er minst 5 % transferaseaktivitet målt ved
den molare mengden av kolesterolesteren dannet ved acyloverføring fra fosfolipider eller
triacylglyserider i melk til kolesterol, i forhold til mengden av kolesterol som opprinnelig er
tilgjengelig, beregnet ved hjelp av den følgende ligningen:
Transferaseaktivitet = (mol/l kolesterolester(t) – mol/l kolesterolester(0))x100
20
mol/l kolesterol(0)der:
Kolesterolester (t) = mengden kolesterolester ved tidspunktet t
Kolesterolester (0) = mengden kolesterolester ved tidspunktet 0
Kolesterol (0) = mengden kolesterol ved tidspunktet 0.
[0047] Dessuten beskrives det i dette dokumentet at en lipidacyltransferase kan tilsettes til
25
melken eller en del av denne etter ultra-varmebehandlingen av melken.
[0048] Lipidacyltransferasen tilsettes fortrinnsvis til melken og inkuberes med denne ved en
temperatur på mindre enn omtrent 20 °C, fortrinnsvis mindre enn omtrent 10 °C.
[0049] Lipidacyltransferasen tilsettes fortrinnsvis til melken og inkuberes med denne ved en
temperatur på mindre enn omtrent 1 °C og omtrent 10 °C, fortrinnsvis mellom mindre enn
30
omtrent 3 °C og omtrent 7 °C, mer foretrukket omtrent 5 °C.
[0050] Inkubasjonstiden er fortrinnsvis effektiv til å sikre at det er minst 5 % transferaseaktivitet,
fortrinnsvis minst 10 % transferaseaktivitet, fortrinnsvis minst 15 %, 20 %, 25 % 26 %, 28 %, 30 %,
40 % 50 %, 60 % eller 75 % transferaseaktivitet.
NO/EP2190296
7
[0051] Transferaseaktiviteten måles ved den molare mengden av kolesterolesteren dannet ved
acyloverføring fra fosfolipider eller triacylglyserider i melk til kolesterol i forhold til mengden av
kolesterol som opprinnelig er tilgjengelig
Transferaseaktivitet = (mol/l kolesterolester(t) – mol(l) kolesterolester(0))x100
5
mol/l kolesterol (0)
[0052] der:
Kolesterolester(t) = mengden kolesterolester ved tidspunktet t
Kolesterolester(0) = mengden kolesterolester ved tidspunktet 0
Kolesterol (0) = mengden kolesterol i melk ved tidspunktet 0
10
Kolesterol og kolesterolester bestemmes ved GLC
Gasskromatografi:
[0053] Gasskromatografi anvendes til å måle innholdet av kolesterol og kolesterolester i
melkeprøvene.
[0054] Følgende CG-oppsett anvendes: Perkin Elmer Autosystem 9000 kapillær gasskromatograf
15
utstyrt med WCOT-sammensmeltet silikakolonne 12,5 m x 0,25 mm ID x 0,1 µ filmtykkelse 5 %
fenyl-metylsilikon (CP Sil 8 CB fra Chrompack).Bærergass: Helium.Injektor. PSSI kald splittinjeksjon
(innledende temp. 50 °C oppvarmet til 385 °C), volum 1,0 µl Detektor FID: 395 °C
Ovnsprogram (anvendt siden 30.10.2003):
1
2
3
Ovnstemperatur, °C.
90
280
350
Isotermal, tid, min.
1
0
10
Temperaturhastighet, °C/min.
15
4
Fremstilling av melkeprøver for GC-analyse:
20
[0055] Melkelipidene ble ekstrahert i henhold til Mojonnier AOAC 989.05 ved anvendelse av
etanol, NH3, MTBE (metyl-tert-butyleter) og p-eter. Lipidfraksjonen ble løst opp på nytt i
heptan/pyridin (2:1) inneholdende heptadekan som indre standard og kolesterol ble målt ved GC.
[0056] Fremstilling av prøver for kolesterol-estermålinger av Squalane tilsettes som en ekstra
indre standard. Lipidfraksjonen løses opp på nytt i heksan og kolesterolestere konsentreres ved
25
hjelp av en NH2-bindingselueringskolonne og heksaneluering. Prøvene ble løst på nytt i
heptan/pyridin (2:1) og kolesterol-estere ble målt ved CG.
NO/EP2190296
8
[0057] I fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen er kombinasjonen av temperatur
og inkubasjonstid effektiv til å sikre at det er minst 5 % transferaseaktivitet, fortrinnsvis minst 10 %
transferaseaktivitet, fortrinnsvis minst 15 %, 20 %, 25 %, 26 %, 28 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % eller
75 % transferaseaktivitet.
5
[0058] Inkubasjonstiden kan hensiktsmessig være fra 5 minutter opptil 30 timer, inkubasjonstiden
kan hensiktsmessig være fra 45 minutter opptil 30 timer.
[0059] I én utførelsesform kan inkubasjonstiden være fra rundt 10 timer til rundt 30 timer,
fortrinnsvis fra rundt 15 til 25 timer, mer foretrukket rundt 20 timer.
[0060] I én foretrukket utførelsesform finner den enzymatiske behandlingen sted ved rundt 3 til
10
rundt 10 °C (fortrinnsvis rundt 5 °C) i minst 10 timer, fortrinnsvis mellom rundt 10 og 25 timer,
fortrinnsvis rundt 20 timer.
[0061] Anvendelsen av lavere temperaturer i kombinasjon med effektive inkubasjonstider fører til
betydelige fordeler i den foreliggende oppfinnelsen.
[0062] I fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen varmes
15
fortrinnsvis ikke melken (UHT-melken) opp under enzymatisk behandling.
[0063] I fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen varmes
melken fortrinnsvis opp bare én gang (når den ultra-varmebehandles for å tilveiebringe en UHTmelk). Derfor gjennomgår melken (f.eks. UHT-melk) i den foreliggende oppfinnelsen fortrinnsvis
ikke mer enn ett oppvarmingstrinn under produksjonen sin.
20
[0064] I noen aspekter kan lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av
fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatte et GDSxmotiv og/eller et GANDY-motiv.
[0065] Fortrinnsvis karakteriseres lipidacyltransferaseenzymet som et enzym som besitter
acyltransferaseaktivitet og som omfatter aminosyresekvensmotivet GDSX, der X er én eller flere av
25
de følgende aminosyrerestene L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M eller S.
[0066] Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase eller lipidacyltransferase for
anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende
oppfinnelsen kan hensiktsmessig være oppnåelige, fortrinnsvis oppnådd, fra en organisme fra én
eller flere av de følgende slektene: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus,
30
Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter,
Vibrionaceae,
Xylella,
Sulfolobus,
Aspergillus,
Schizosaccharomyces,
Listeria,
Neisseria,
Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas og Candida. Lipidacyltransferasen er fortrinnsvis
oppnåelig, fortrinnsvis oppnådd, fra en organisme fra Aeromonas-slekten.
[0067] I noen aspekter ifølge den foreliggende oppfinnelsen koder nukleotidsekvensen som koder
35
for en lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller
NO/EP2190296
9
anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen for en lipidacyltransferase som omfatter en
asparaginsyrerest i en posisjon som tilsvarer N-80 i aminosyresekvensen til Aeromonas hydrophilalipidacyltransferasen vist som SEQ ID No. 35.
[0068] I noen aspekter ifølge den foreliggende oppfinnelsen er lipidacyltransferasen for
5
anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende
oppfinnelsen en lipidacyltransferase som omfatter en asparaginsyrerest i en posisjon som tilsvarer
N-80 i aminosyresekvensen til Aeromonas hydrophila-lipidacyltransferasen vist som SEQ ID No. 35.
[0069] I tillegg eller som et alternativ koder nukleotidsekvensen som koder for en
lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene
10
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
for
en
lipidacyltransferase
som
kan
omfatte
aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 16, eller en aminosyresekvens som har 75 % eller mer
homologi med denne. Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase koder
hensiktsmessig for en lipidacyltransferase som kan omfatte aminosyresekvensen vist som SEQ ID
No. 16.
15
[0070] I tillegg eller som et alternativ koder nukleotidsekvensen som koder for en
lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
for
en
lipidacyltransferase
som
kan
omfatte
aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 68, eller en aminosyresekvens som har 75 % eller mer
homologi med denne. Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase, koder
20
hensiktsmessig for en lipidacyltransferase som kan omfatte aminosyresekvensen vist som SEQ ID
No. 68.
[0071] I én utførelsesform har lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av
fremgangsmåtene
og/eller
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
en
aminosyresekvens vist i SEQ ID No. 16 eller SEQ ID No. 68, eller har en aminosyresekvens som har
25
minst 75 % identitet med denne, fortrinnsvis minst 80 %, fortrinnsvis minst 85 %, fortrinnsvis minst
95 %, fortrinnsvis minst 98 % identitet med denne.
[0072] I dette dokumentet betyr begrepet "UHT-melk" enhver melk med lang levetid utformet for
omgivelsesoppbevaring. Nærmere bestemt betyr "UHT-melk" enhver melk som har blitt
varmebehandlet for å gi melk med lang levetid, dette inkluderer smaksatte og ikke-smaksatte
30
produkter.
[0073] Fremgangsmåten kan hensiktsmessig omfatte et trinn med å fjerne enzymet og/eller
denaturere enzymet.
[0074] Enzymet for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen kan hensiktsmessig være et
immobilisert enzym.
NO/EP2190296
10
[0075] Melkeproduktet i den foreliggende offentliggjøringen er en UHT-melk eller en UHTsmakssatt melk.
[0076] Det er ikke ment å dekke ostemelk i dette dokumentet (dvs. en melk som ikke er en UHTmelk, og som anvendes i den etterfølgende fremstillingen av ost) og/eller ost eller osteprodukter
5
som produseres fra en melk som ikke er UHT-melk.
FORDELER
[0077] En fordel med den foreliggende oppfinnelsen er at stabiliteten, særlig langtidsstabiliteten,
av UHT-melk kan forbedres betydelig.
[0078] En ytterligere fordel er at den uønskede fysiske effekten av "skumming" av UHT-melk
10
forhindres og/eller reduseres sammenlignet med UHT-melk, som ikke er enzymatisk behandlet
og/eller sammenlignet med UHT-melk, som under fremstillingen er blitt behandlet med en
fosfolipase (nærmere bestemt et fosfolipase-A1-enzym klassifisert som E.C. 3.1.1.32- eller et
fosfolipase-A2-enzym klassifisert som EC.3.1.1.4) (i stedet for lipidacyltransferansen som beskrevet
i dette dokumentet).
15
[0079] Begrepet "skumming" som anvendt i dette dokumentet betyr den uønskede
gravitasjonsøkningen av fettdråper til toppen av melken (f.eks. i en beholder) over tid.
[0080] En ytterligere fordel ved den foreliggende oppfinnelsen kan være reduksjonen av
overflatespenningen i UHT-melk behandlet i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen
sammenlignet med UHT-melk som ikke er enzymatisk behandlet og/eller sammenlignet med UHT-
20
melk, som under fremstillingen er blitt behandlet med en fosfolipase (nærmere bestemt enten et
fosfolipase-A1-enzym klassifisert som E.C. 3.1.1.32- eller et fosfolipase-A2-enzym klassifisert som
EC.3.1.1.4) (i stedet for lipidacyltransferansen som beskrevet i dette dokumentet).
[0081] En ytterligere fordel med den foreliggende oppfinnelsen kan være reduksjonen av
forurensing av UHT-anlegget (f.eks. av anleggsrørene og/eller ståloverflatene) ved anvendelse av
25
UHT-melken behandlet i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen sammenlignet med UHTmelk, som ikke har blitt enzymatisk behandlet og/eller sammenlignet med UHT-melk, som under
fremstillingen er blitt behandlet med en fosfolipase (nærmere bestemt enten et fosfolipase-A1enzym klassifisert som E.C. 3.1.1.32- eller et fosfolipase-A2-enzym klassifisert som EC.3.1.1.4) (i
stedet for lipidacyltransferansen som beskrevet i dette dokumentet).
30
[0082] En ytterligere fordel med den foreliggende oppfinnelsen kan være en reduksjon i frie
fettsyrer i UHT-melk behandlet i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen sammenlignet med
UHT-melk, som under fremstillingen er blitt behandlet med en fosfolipase (nærmere bestemt
enten et fosfolipase-A1-enzym klassifisert som E.C. 3.1.1.32- eller et fosfolipase-A2-enzym
klassifisert som EC.3.1.1.4) (i stedet for lipidacyltransferansen som beskrevet i dette dokumentet).
NO/EP2190296
11
[0083] Enda mer overraskende har oppfinnerne av den foreliggende oppfinnelsen funnet at den
enzymatiske behandlingen kan utføres uten et ekstra oppvarmingstrinn. Nærmere bestemt kan
den enzymatiske behandlingen ved hjelp av lipidacyltransferasen i samsvar med den foreliggende
oppfinnelsen utføres ved temperaturer så lave som rundt 1-25 °C, fortrinnsvis så lave som rundt 15
10 °C, fortrinnsvis mellom rundt 3 og rundt 7 °C, mer foretrukket rundt 5 °C. Dermed kan man
unngå de negative effektene av å varme opp melken to ganger, dvs. én gang for UHT-behandlingen
og deretter igjen for den enzymatiske behandlingen. Dette har mange fordeler, inkludert (at):
a) prosessen er mer økonomisk og derfor er fordelaktig for produsenter av UHT-melken;
b) oppvarming av melken kan føre til uønskede effekter, slik som et sammenbrudd i
10
stabiliteten av ingrediensene av melken, den foreliggende oppfinnelsen reduserer denne
ufordelaktige egenskapen i stor grad; og/eller
c) færre endringer i organoleptiske egenskaper.
[0084] En ytterligere fordel med den foreliggende oppfinnelsen er et redusert kolesterolinnhold i
UHT-melken, som kan ha store helsefordeler.
15
[0085] Forbedringen i hvilken som helst av egenskapene beskrevet i dette dokumentet (for
eksempel skumming) kan hensiktsmessig sammenlignes med UHT-melk som har blitt behandlet
med én eller flere av de følgende fosfolipasene: Fosfolipase A1 fra Fusarium oxysporum (Lipopan
F™) og/eller en fosfolipase A1 fra Fusarium venenatum (YieldMax™) og/eller en fosfolipase
fra Fusarium heterosporum og/eller en fosfolipase fra Aspergillus niger og/eller en fosfolipase A2
20
fra Streptomyces violaceoruber og/eller en fosfolipase A2 fra bukspyttkjertelen til gris og/eller en
fosfolipase A2 fra Tuber borchii; fortrinnsvis fosfolipase A1 fra Fusarium oxysporum (Lipopan F™).
VERTSCELLE
[0086] Vertsorganismen kan være en prokaryot eller en eukaryot organisme.
[0087] I en utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelsen uttrykkes lipidacyltransferasen i
25
henhold til den foreliggende oppfinnelsen i en vertscelle, f.eks. bakterieceller, som f.eks. en
Bacillus spp-, f.eks. en Bacillus licheniformis-vertscelle.
[0088] Alternative vertsceller kan være f.eks. sopp, gjær eller planter.
[0089] Det har blitt funnet at anvendelsen av en Bacillus licheniformis-vertscelle fører til økt
uttrykking av en lipidacyltransferase når den sammenlignes med andre organismer, slik som
30
Bacillus subtilis.
[0090] En lipidacyltransferase fra Aeromonas salmonicida er blitt innført i en rekke konvensjonelle
uttrykkingsvektorer, som er utformet for å være optimale for uttrykking i henholdsvis Bacillus
subtilis, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe og Aspergillus tubigensis. Imidlertid
ble kun svært lave nivåer detektert i Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces
35
pombe og Aspergillus tubigensis. Uttrykkingsnivåene var under 1 µg/ml, og det var ikke mulig å
NO/EP2190296
12
velge celler som ga nok protein til å initiere en kommersiell produksjon (resultater ikke vist). I
motsetning til dette var Bacillus licheniformis i stand til å produsere proteinnivåer, som er
attraktive for en økonomisk gjennomførbar produksjon.
[0091] Det har nærmere bestemt blitt funnet at uttrykking i B. licheniformis er rundt 100 ganger
5
større enn uttrykking i B. subtilis under kontroll av apE-promoteren, eller er omtrent 100 ganger
større enn uttrykking i S. lividans under kontroll av en A4-promoter og sammensmeltet til cellulose
(resultater ikke vist i dette dokumentet).
[0092] Vertscellen kan være hvilken som helst Bacillus-celle forskjellig fra B.subtilis. Fortrinnsvis er
vertscellen Bacillus fra én av de følgende artene: Bacillus licheniformis; B. alkalophilus; B.
10
amyloliquefaciens; B. circulans; B. clausii; B. coagulans; B. firmus; B. lautus; B. lentus; B.
megaterium; B. pumilus eller B. stearothermophilus.
[0093] Begrepet "vertscelle" - i forhold til den foreliggende oppfinnelsen inkluderer hvilken som
helst celle som omfatter enten en nukleotidsekvens som koder for en lipidacyltransferase som
definert i dette dokumentet eller en uttrykkingsvektor som definert i dette dokumentet og som
15
anvendes i den rekombinante produksjonen av en lipidacyltransferase som har de spesifikke
egenskapene som er definert i dette dokumentet.
[0094] Vertscellen kan hensiktsmessig være en proteasefattig eller protease-minus-stamme
og/eller en α-amylasefattig eller α-amylase-minus-stamme.
[0095] Begrepet "heterolog" som anvendt i dette dokumentet betyr en sekvens avledet fra en
20
separat genetisk kilde eller arter. En heterolog sekvens er en ikke-vertssekvens, en modifisert
sekvens, en sekvens fra en annen vertscellestamme, eller en homolog sekvens fra en annen
kromosomal plassering av vertscellen.
[0096] En "homolog"-sekvens er en sekvens som finnes i den samme genetiske kilden eller artene,
dvs. at den er naturlig forekommende i de aktuelle artene av vertscellen.
25
[0097] Begrepet "rekombinant lipidacyltransferase" som anvendt i dette dokumentet betyr at
lipidacyltransferasen er blitt fremstilt ved hjelp av genetisk rekombinasjon. For eksempel har
nukleotidsekvensen som koder for lipidacyltansferasen blitt satt inn i en kloningsvektor, som gir en
B. licheniformis-celle karakterisert ved nærværet av den heterologe lipidacyltransferasen.
REGULATORISKE SEKVENSER
30
[0098] I noen anvendelser kan en lipid-acyltransferasesekvens for anvendelse i fremgangsmåtene
og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen oppnås ved operativt å forbinde en
nukleotidsekvens som koder for samme til en regulatorisk sekvens som er i stand til å sørge for
uttrykkingen av nukleotidsekvensen, f.eks. av den valgte vertscellen (som f.eks. en B. licheniformis
-celle).
NO/EP2190296
13
[0099] Som et eksempel kan det anvendes en vektor omfattende nukleotidsekvensen operativt
bundet til en slik regulatorisk sekvens, dvs. at vektoren er en uttrykkingsvektor.
[0100] Begrepet "operativt bundet" betyr en sidestilling der de beskrevne komponentene er i et
forhold som tillater dem å fungere på deres tiltenkte måte. En regulatorisk sekvens "operativt
5
bundet" til en kodingssekvens ligeres på en slik måte at uttrykkingen av kodingssekvensen oppnås
under forhold som er kompatible med kontrollsekvensene.
[0101] Begrepet "regulatoriske sekvenser" inkluderer promotere og forsterkere og andre
uttrykkingsregulerende signaler.
[0102] Begrepet "promoter" anvendes i normal forstand av teknikken, f.eks. et RNA-
10
polymerasebindingssete.
[0103] Forsterket uttrykking av nukleotidsekvensen som koder for enzymet som har de spesifikke
egenskapene som definert i dette dokumentet, kan også oppnås ved valget av regulerende
regioner, f.eks. promoter, utskillelsesleder og termineringsregioner som ikke er regulatoriske
regioner for nukleotidsekvensen som koder for enzymet i naturen.
15
[0104] Nukleotidsekvensen kan hensiktsmessig bindes operativt til minst én promoter.
[0105] Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltranferase kan hensiktsmessig bindes
operativt til en nukleotidsekvens som koder for en terminatorsekvens. Eksempler på egnede
terminatorsekvenser for anvendelse i hvilken som helst av vektorene, vertscellene,
fremgangsmåtene og/eller anvendelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer: en α-
20
amylaseterminatorsekvens
(f.eks.
CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTTGTTCATAAA - SEQ ID No. 64), en alkalisk
proteaseterminatorsekvens
(f.eks.
CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTTTGCAATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAA ATA - SEQ ID No. 65),
en
25
glutaminsyre-spesifikk
terminatorsekvens
(f.eks.
ACGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTAT TATTGT - SEQ ID No.
66),
en
levanaseterminatorsekvens
(f.eks.
TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT - SEQ ID No. 67), en
subtilisin-E-terminatorsekvens
(f.eks.
GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAGGAACCTGCTTCTTTTTACTATTATTG - SEQ ID No. 119).
30
Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltranferase kan hensiktsmessig bindes operativt til
en α-amylaseterminator, slik som en B. licheniformis α-amylaseterminator.
PROMOTER
[0106] Promotersekvensen som skal anvendes i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen kan
være heterolog eller homolog med sekvensen som koder for en lipidacyltransferase.
NO/EP2190296
14
[0107] Promotersekvensen kan være hvilken som helst promotersekvens i stand til å dirigere
uttrykking av en lipidacyltransferase i den valgte vertscellen.
[0108] Promotersekvensen kan hensiktsmessig være homolog med en Bacillus-art, f.eks. B.
licheniformis. Promotersekvensen er fortrinnsvis homolog med den valgte vertscellen.
5
[0109] Promotersekvensen kan hensiktsmessig være homolog med vertscellen. "Homolog med
vertscellen" betyr opprinnelse innenfor vertsorganismen; dvs. en promotersekvens som er funnet
naturlig i vertsorganismen.
[0110] Promotersekvensen kan hensiktsmessig velges fra gruppen bestående
nukleotidsekvens
10
som
koder
for:
en
α-amylasepromoter,
en
av en
proteasepromoter,
en
subtilisinpromoter, en glutaminsyrespesifikk proteasepromoter og en levansukrasepromoter.
[0111] Promotersekvensen kan hensiktsmessig være en nukleotidsekvens som koder for: LAT
(f.eks. alfa-amylasepromoteren fra B. licheniformis, også kjent som AmyL), AprL (f.eks. subtilisinCarlsberg-promoter),
licheniformis),
15
EndoGluC
AmyQ
(f.eks.
(f.eks.
den
glutaminsyrespesifikke
alfaamylasepromoteren
fra
promoteren
fra
B.
B.amyloliquefaciens-alfa-
amylasepromoteren) og SacB (f.eks. B. subtilislevansukrasepromoteren).
[0112] Andre eksempler på promoterer som er egnet til å dirigere transkripsjonen av en
nukleinsyresekvens i fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer:
promoteren til det alkaliske Bacillus lentus-proteasegenet (aprH); promoteren til Bacillus subtilisalfa-amylasegenet (amyE); promoteren til Bacillus stearothermophilus-maltogeneseamylasegenet
20
(amyM); promoteren til Bacillus licheniformis-penicillinasegenet (penP); promoterene til Bacillus
subtilis xylA- og xylB-genene; og/eller promoteren til Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionisCryIIIA-genet.
[0113] I en foretrukket utførelsesform er promotersekvensen en α-amylasepromoter (slik som
en Bacillus licheniformis α-amylasepromoter). Promotersekvensen omfatter fortrinnsvis -35- til -
25
10-sekvensen av B. licheniformis α-amylasepromoteren - se figurene 53 og 55.
[0114] "-35- til -10-sekvensen" beskriver posisjonen i forhold til transkripsjonsstartsetet. Både "35" og "-10" er bokser, dvs. en rekke av nukleotider, hver omfattende 6 nukleotider, og disse
boksene er adskilt med 17 nukleotider. Disse 17 nukleotidene refereres ofte til som et
"avstandsstykke". Dette er illustrert i figur 55, der -35- og -10-boksene er understreket. For å
30
unngå tvil, der "-35- til -10 -sekvensen" anvendes i dette dokumentet, refererer den til en sekvens
fra begynnelsen av -35-boksen til slutten av -10-boksen, dvs. inkludert både -35-boksen, det 17nukleotid lange avstandsstykket og -10-boksen.
SIGNALPEPTID
NO/EP2190296
15
[0115] Lipidacyltransferasen fremstilt av en vertscelle ved uttrykking av nukleotidsekvensen som
koder for lipidacyltransferasen, kan skilles ut eller kan inneholdes intracellulært avhengig av
sekvensen og/eller vektoren som anvendes.
[0116] En
5
signalsekvens
kan
anvendes
til
å
dirigere
utskillelse
av
de
kodende
sekvensene/kodingssekvensene gjennom en bestemt cellemembran. Signalsekvensene kan være
naturlige eller fremmede for den lipidacyltransferasekodende sekvensen. F.eks. kan den
signalpeptidkodende sekvensen oppnås fra et amylase- eller proteasegen fra en Bacillus-art,
fortrinnsvis fra Bacillus licheniformis.
[0117] Egnede signalpeptidkodende sekvenser kan oppnås fra ett eller flere av de følgende
10
genene: maltogenese-α-amylasegenet, subtilisingenet, beta-laktamasegenet, det nøytrale
proteasegenet, prsA-genet og/eller acyltransferasegenet.
[0118] Fortrinnsvis er signalpeptidet et signalpeptid av B.licheniformis-α-amylase, Aeromonas
acyltransferase (f.eks. mkkwfvcllglialtvqa - SEQ ID No. 21), B. subtilis-subtilisin (f.eks.
mrskklwisllfaltliftmafsnmsaqa - SEQ ID No. 22) eller
15
B. licheniformis-subtilisin (f.eks.
mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa - SEQ ID No. 23). Signalpeptidet kan hensiktsmessig være
signalpeptidet til B. licheniformis-α-amylase.
[0119] Hvilken som helst signalpeptidkodende sekvens i stand til å dirigere den uttrykte
lipidacyltransferasen inn i den utskillende reaksjonsveien til en valgt Bacillus-vertscelle
(fortrinnsvis en B. licheniformis-vertscelle) kan anvendes.
20
[0120] I noen utførelsesformer ifølge den foreliggende beskrivelsen kan en nukleotidsekvens som
koder for et signalpeptid bindes operativt med en nukleotidsekvens som koder for en valgt
lipidacyltransferase.
[0121] Den valgte lipidacyltransferasen kan uttrykkes i en vertscelle som definert i dette
dokumentet som et fusjonsprotein.
25
UTTRYKKINGSVEKTOR
[0122] Begrepet "uttrykkingsvektor" betyr et konstrukt i stand til in vivo- eller in vitro-uttrykking.
[0123] Fortrinnsvis innføres uttrykkingsvektoren i genomet til organismen, som f.eks. en B.
licheniformis-vert. Begrepet "innført" dekker fortrinnsvis stabil innføring i genomet.
[0124] Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase som definert i dette
30
dokumentet, kan være til stede i en vektor, der nukleotidsekvensen bindes operativt til
regulatoriske sekvenser, slik at de regulatoriske sekvensene er i stand til å gi uttrykkingen av
nukleotidsekvensen av en egnet vertsorganisme (slik som B.licheniformis), dvs. at vektoren er en
uttrykkingsvektor.
[0125] Vektorene kan omdannes til en egnet vertscelle som beskrevet ovenfor for å tilveiebringe
35
uttrykking av et polypeptid som har lipidacyltransferaseaktivitet som definert i dette dokumentet.
NO/EP2190296
16
[0126] Ved valget av vektor, f.eks. plasmid, kosmid, virus eller fagvektor, vil genomisk innsetting
ofte avhenge av vertscellen som den skal innføres i. Den foreliggende offentliggjøringen kan dekke
andre former for uttrykkingsvektorer som tjener ekvivalente funksjoner og som er, eller blir, kjent i
teknikken.
5
[0127] Når vektoren er transformert inn i den valgte vertscellen, kan vektoren replikere og
fungere uavhengig av vertscellens genom, eller kan integrere i genomet i seg selv.
[0128] Vektorene kan inneholde ett eller flere valgbare markørgener - slik som et gen som gir
antibiotikaresistens, f.eks. ampicillin-, kanamycin-, kloramfenikol- eller tetrasyklinresistens. Valget
kan
10
alternativt
utføres
ved
ko-transformasjon
(som
beskrevet
i
WO91/17243).
[0129] Vektorene kan anvendes in vitro, f.eks. for produksjon av RNA eller anvendes til å
transfektere eller transformere en vertscelle.
[0130] Vektoren kan videre omfatte en nukleotidsekvens som gjør det mulig for vektoren å
replikere i den aktuelle vertscellen. Eksempler på slike sekvenser er replikeringsopprinnelsene til
plasmidene pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 og pIJ702.
15
LIPIDACYLTRANSFERASE
[0131] Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som
helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan kode
for
en
naturlig
lipidacyltransferase
eller
en
variantlipidacyltransferase.
[0132] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller
20
anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være en naturlig lipidacyltransferase eller
en variantlipidacyltransferase.
[0133] F.eks. kan nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase for anvendelse i den
foreliggende
oppfinnelsen
kan
være
en
som
WO2004/064537, WO2004/064987, WO2005/066347
25
beskrevet
i
ellerWO2006/008508.
[0134] Begrepet "lipidacyltransferase" som anvendt i dette dokumentet betyr fortrinnsvis et
enzym som har acyltransferaseaktivitet (generelt klassifisert som E.C. 2.3.1.x, f.eks. 2.3.1.43), idet
enzymet er i stand til å overføre en acylgruppe fra et lipid til ett eller flere akseptorsubstrater, slik
som ett eller flere av de følgende: et sterol; en stanol; et karbohydrat; et protein; en
proteindelenhet; en sukkeralkohol, slik som askorbinsyre og/eller glyserol - fortrinnsvis glyserol
30
og/eller en sterol, slik som kolesterol.
[0135] Fortrinnsvis
fremgangsmåtene
er
lipidacyltransferasen
og/eller
anvendelsene
for
ifølge
anvendelse
den
i
hvilken
foreliggende
som
helst
av
oppfinnelsen
en
lipidacyltransferase som er i stand til å overføre en acylgruppe fra et fosfolipid (som definert i
dette dokumentet) til en sukkeralkohol, slik som askorbinsyre og/eller glyserol og/eller en sterol,
35
fortrinnsvis
glyserol eller en sterol, mest foretrukket
en sterol (f.eks. kolesterol).
NO/EP2190296
17
[0136] For noen aspekter kan "acylakseptoren" være hvilken som helst forbindelse omfattende en
hydroksygruppe (-OH), slik som f.eks. flerverdige alkoholer, inkludert glyserol; steroler; stanoler;
karbohydrater; hydroksysyrer, inkludert fruktsyre, sitronsyre, vinsyre, melkesyre og askorbinsyre;
proteiner eller en underenhet av denne, slik som aminosyrer, proteinhydrolysater og peptider
5
(delvis hydrolysert protein), f.eks.; og blandinger og derivater av denne. "Acylakseptoren" ifølge
den foreliggende oppfinnelsen er fortrinnsvis ikke vann. "Acylakseptoren" ifølge den foreliggende
oppfinnelsen er fortrinnsvis en sukkeralkohol, slik som et polyol, mest foretrukket glyserol. For
formålet med denne oppfinnelsen anses askorbinsyre også som
en sukkeralkohol.
[0137] Acylakseptoren er fortrinnsvis ikke et monoglyserid.
10
[0138] Acylakseptoren er fortrinnsvis ikke et diglyserid.
[0139] I ett aspekt er lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av
fremgangsmåtene
og/eller
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
en
lipidacyltransferase som kan, i tillegg til å være i stand til å overføre en acylgruppe fra en lipid til
glyserol, i tillegg være i stand til å overføre acylgruppen fra et lipid til ett eller flere av følgende: et
15
karbohydrat, et protein, en proteinunderenhet, sterol og/eller en stanol, den er fortrinnsvis i stand
til å overføre til både en sukkeralkohol, slik som askorbinsyre og/eller glyserol, mest foretrukket en
sterol slik som kolesterol, og/eller plantesteroler/stanoler.
[0140] Fortrinnsvis er lipidsubstratet som lipidacylet opptrer på ett eller flere av de følgende
lipidene: et fosfolipid, slik som et lecitin, f.eks. fosfatidylkolin og/eller fosfatidyletanolamin.
20
[0141] Dette lipidsubstratet kan refereres til i dette dokumentet som "lipidacyldonoren".
Begrepet lecitin som anvendt i dette dokumentet omfatter fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin,
fosfatidylinositol, fosfatidylserin og fosfatidylglyserol.
[0142] For noen aspekter er fortrinnsvis lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst
av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen en
25
lipidacyltransferase som er i stand til, eller i det vesentlige ikke i stand til, å virke på et triglyserid
og/eller et 1-monoglyserid og/eller 2-monoglyserid.
[0143] For noen aspekter er fortrinnsvis lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst
av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen en
lipidacyltransferase som ikke fremviser triacylglyserollipaseaktivitet (E.C. 3.1.1.3) eller ikke
30
fremviser betydelig triacylglyserollipaseaktivitet (E.C. 3.1.1.3).
[0144] Muligheten til å hydrolysere triglyerid (E.C. 3.1.1.3-aktivitet) som kan bestemmes av
lipaseaktivitet bestemmes i henhold til Food Chemical Codex (3. utg., 1981, s. 492-493) modifisert
til solsikkeolje og pH 5,5 i stedet for olivenolje og pH 6,5. Lipaseaktiviteten måles som LUS
(lipaseenheter solsikke) der 1 LUS er definert som mengden enzym som kan frigjøre 1 [mu]mol
NO/EP2190296
18
fettsyrer per minutt fra solsikkeolje i henhold til analyseforholdene ovenfor. Alternativt kan LUTanalysen som definert i WO9845453 anvendes.
[0145] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller
anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være en lipidacyltransferase som i det
5
vesentlige ikke er i stand til å virke på et triglyserid som kan ha en LUS/mg på mindre enn 1000,
f.eks. mindre enn 500, slik som mindre enn 300, fortrinnsvis mindre enn 200, mer foretrukket
mindre enn 100, mer foretrukket mindre enn 50, mer foretrukket mindre enn 20, mer foretrukket
mindre enn 10, slik som mindre enn 5, mindre enn 2, mer foretrukket mindre enn 1 LUS/mg.
Alternativt er LUT/mg-aktiviteten mindre enn 500, slik som mindre enn 300, fortrinnsvis mindre
10
enn 200, mer foretrukket mindre enn 100, mer foretrukket mindre enn 50, mer foretrukket
mindre enn 20, mer foretrukket mindre enn 10, slik som mindre enn 5, mindre enn 2, mer
foretrukket mindre enn 1 LUT/mg.
[0146] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller
anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være en lipidacyltransferase som i det
15
vesentlige ikke er i stand til å virke på et monoglyserid. Dette kan bestemmes ved anvendelse av
mono-oleat (M7765 1-oleoyl-rac-glyserol 99 %) i stedet for solsikkeoljen i LUS-analysen. 1 MGHU
er definert som mengden enzym som kan frigjøre 1 [mu]mol fettsyrer per minutt fra monoglyserid
under analyseforholdene.
[0147] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller
20
anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen er en lipidacyltransferase som fortrinnsvis i det
vesentlige ikke er i stand til å virke på et triglyserid som kan ha en MGHU/mg på mindre enn 5000,
f.eks. mindre enn 1000, f.eks. mindre enn 500, slik som mindre enn 300, fortrinnsvis mindre enn
200, mer foretrukket mindre enn 100, mer foretrukket mindre enn 50, mer foretrukket mindre
enn 20, mer foretrukket mindre enn 10, slik som mindre enn 5, mindre enn 2, mer foretrukket
25
mindre enn 1 MGHU/mg.
[0148] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller
anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen er hensiktsmessig en lipidacyltransferase som
kan fremvise én eller flere av de følgende fosfolipaseaktivitetene: fosfolipase-A2-aktivitet (E.C.
3.1.1.4) og/eller fosfolipase-A1-aktivitet (E.C. 3.1.1.32). Lipidacyltransferasen kan også ha
30
fosfolipase-B-aktivitet (EC 3.1.1.5).
[0149] For noen aspekter kan lipidacyltransferasen hensiktsmessig være i stand til å overføre en
acylgruppe fra et fosfolipid til en sukkeralkohol, fortrinnsvis glyserol og/eller askorbinsyre.
[0150] For noen aspekter kan lipidacyltransferasen hensiktsmessig være i stand til å overføre en
acylgruppe
35
fra
et
fosfolipid
til
en
stanol
og/eller
sterol,
fortrinnsvis
kolesterol.
[0151] For noen aspekter koder fortrinnsvis lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som
NO/EP2190296
19
helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen for en
lipidacyltransferase som er i stand til å overføre en acylgruppe fra et fosfolipid til en sterol og/eller
en
stanol
for
å
danne
minst
én
sterolester
og/eller
en
stanolester.
[0152] Lipidacyltransferasen kan være i stand til å overføre en acylgruppe fra et lipid til et polyol,
5
slik som glyserol og/eller et sterol, slik som kolesterol eller plantesterol/stanoler. I en
utførelsesform kan dermed "acylakseptoren" ifølge den foreliggende oppfinnelsen være glyserol
og/eller
kolesterol
eller
plantesterol/stanoler.
[0153] Lipidacyltransferaseenzymet kan fortrinnsvis karakteriseres ved anvendelse av de følgende
kriteriene:
10
enzymet
besitter
acyltransferaseaktivitet
som
kan
defineres
som
esteroverføringsaktivitet hvorved acyldelen til en original esterbinding til en lipidacyldonor
overføres til en acylakseptor, fortrinnsvis glyserol eller kolesterol, for å danne en ny ester; og
enzymet omfatter aminosyresekvensmotivet GDSX, der X er én eller flere av de følgende
aminosyrerestene
L,
A,
V,
I,
F,
Y,
H,
Q,
T,
N,
M
eller
S.
[0154] Fortrinnsvis er X i GDSX-motivet L eller Y. Mer foretrukket er X i GDSX-motivet L. Dermed
15
omfatter
fortrinnsvis
enzymet
i
henhold
til
den
foreliggende
oppfinnelsen
aminosyresekvensmotivet GDSL.
[0155] GDSX-motivet omfatter fire konserverte aminosyrer. Fortrinnsvis er serinet i motivet et
katalytisk serin av lipidacyltransferaseenzymet. Serinet i GDSX-motivet kan hensiktsmessig være i
en posisjon som tilsvarer Ser-16 i Aeromonas hydrophila-lipidacyltransferaseenzymet vist i Brumlik
20
&
Buckley
(Journal of Bacteriology
Apr.
1996,
bind
178,
Nr.
7,
s.
2060-2064).
[0156] For å avgjøre om et protein har GDSX-motivet ifølge den foreliggende oppfinnelsen
sammenlignes sekvensen fortrinnsvis med de skjulte markov-modellprofilene (HMM-profiler) av
pfam-databasen i samsvar med prosedyrene vist i WO2004/064537 ellerWO2004/064987.
[0157] Lipidacyltransferaseenzymet kan fortrinnsvis sammenstilles ved anvendelse av Pfam0065725
konsensussekvensen (for en fullstendig forklaring se WO2004/064537 eller WO2004/064987).
[0158] Fortrinnsvis indikerer en positiv match med den skjulte markov-modellprofilen (HMMprofil) av pfam00657-domenefamilien nærvær av GDSL- eller GDSX-domenet ifølge den
foreliggende oppfinnelsen.
[0159] Når lipidacyltransferasen for anvendelse i fremgangsmåtene eller anvendelsene ifølge
30
oppfinnelsen er sammenstilt med Pfam00657-konsensussekvensen, kan den ha minst én,
fortrinnsvis flere enn én, fortrinnsvis flere enn to, av de følgende, en GDSx-blokk, en GANDY-blokk,
en HPT-blokk. Hensiktsmessig kan lipidacyltransferasen ha en GDSx-blokk og en GANDY-blokk.
Enzymet kan alternativt ha en GDSx-blokk og en HPT-blokk. Enzymet omfatter fortrinnsvis minst
én
35
GDS-blokk.
Se
WO2004/064537 eller WO2004/064987 for
mer
informasjon.
[0160] Rester av GANDY-motivet velges fortrinnsvis fra GANDY, GGNDA, GGNDL, mest foretrukket
NO/EP2190296
20
GANDY.
[0161] Når enzymet for anvendelse i fremgangsmåtene eller anvendelsene ifølge oppfinnelsen er
sammenstilt med Pfam00657-konsensussekvensen, har det fortrinnsvis mer enn én, fortrinnsvis
mer enn to, fortrinnsvis mer enn tre, fortrinnsvis mer enn fire, fortrinnsvis mer enn fem,
5
fortrinnsvis mer enn seks, fortrinnsvis mer enn syv, fortrinnsvis mer enn åtte, fortrinnsvis mer enn
ni, fortrinnsvis mer enn ti, fortrinnsvis mer enn elleve, fortrinnsvis mer enn tolv, fortrinnsvis mer
enn tretten, fortrinnsvis mer enn fjorten av de følgende aminosyrerestene når det sammenlignes
med referanse-A.hydrophilia-polypeptidsekvensen, nemlig SEQ ID No. 1: 28hid, 29hid, 30hid, 31
hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132Hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His.
10
[0162] pfam00657-GDSX-domenet er en unik identifikator som skiller proteiner som har dette
domenet fra andre enzymer.
[0163] pfam00657-konsensussekvensen er presentert i figur 3 som SEQ ID No. 2. Dette avledes fra
identifikasjon av pfam-familien 00657, databaseversjon 6, som også kan refereres til som
pfam00657.6 i dette dokumentet.
15
[0164] Konsensussekvensen kan oppdateres ved hjelp av flere utgivelser av pfam-databasen (se
f.eks. WO2004/064537 ellerWO2004/064987).
[0165] I en utførelsesform er lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av
fremgangsmåtene
og/eller
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
en
lipidacyltransferase som kan karakteriseres ved anvendelse av de følgende kriteriene:
20
(i) enzymet har acyltransferaseaktivitet som kan defineres som esteroverføringsaktivitet
hvorved acyldelen til en original esterbinding til en lipidacyldonor overføres til en
acylakseptor, fortrinnsvis glyserol eller kolesterol, for å danne en ny ester; fortrinnsvis
henholdsvis monoglyserid eller kolesterolester;
(ii) enzymet omfatter aminosyresekvensmotivet GDSX, der X er én eller flere av de følgende
25
aminosyrerestene L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M eller S.;
(iii) enzymet omfatter His-309, eller omfatter en histidinrest i en posisjon som tilsvarer His-309
i Aeromonas hydrophila-lipidacyltransferaseenzymet vist i figurene 2 og 4 (SEQ ID No.
1 eller SEQ ID No. 3).
[0166] Aminosyreresten
30
til
GDSX-motivet
er
fortrinnsvis
L.
[0167] I SEQ ID No. 3 eller SEQ ID No. 1 danner de første 18 aminosyrerestene en signalsekvens.
His-309 av fullengdesekvensen, som er proteinet inkludert signalsekvensen, tilsvarer His-291 av
den
modne
delen
av
proteinet,
dvs.
sekvensen
uten
signalsekvensen.
[0168] I en utførelsesform er lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av
fremgangsmåtene
35
og/eller
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
en
lipidacyltransferase som omfatter den følgende katalytiske triaden: Ser-34, Asp-306, og His-309,
NO/EP2190296
21
eller omfatter henholdsvis en serinrest, en asparaginsyrerest og en histidinrest, i posisjoner som
tilsvarer Ser-34, Asp-306 og His-309 i Aeromonas hydrophila-lipidacyltransferaseenzymet vist i
figur 4 (SEQ ID No. 3) eller figur 2 (SEQ ID No. 1). Som angitt ovenfor, i sekvensen vist i SEQ ID No. 3
eller SEQ ID No. 1, danner de første 18 aminosyrerestene en signalsekvens. Ser-34, Asp-306, og
5
His-309 av fullengdesekvensen, dvs. proteinet inkludert signalsekvensen, motsvarer Ser-16, Asp288 og His-291 av den modne delen av proteinet, dvs. sekvensen uten signalsekvensen. I
pfam00657-konsensussekvensen, som gitt i figur 3 (SEQ ID No. 2), tilsvarer de aktive seterestene
Ser-7, Asp-345 og His-348.
[0169] I en utførelsesform er lipidacyltransferaseenzymet for anvendelse i hvilken som helst av
10
fremgangsmåtene
og/eller
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
en
lipidacyltransferase som kan karakteriseres ved anvendelse av de følgende kriteriene:
enzymet har acyltransferaseaktivitet som kan defineres som esteroverføringsaktivitet hvorved
acyldelen til en original esterbinding til en første lipidacyldonor overføres til en acylakseptor for å
danne en ny ester; og enzymet omfatter minst Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134, og His-309 eller
15
omfatter glycin-, asparaginsyre-, serin-, asparaginsyre- og histidinrester ved posisjoner som
tilsvarer henholdsvis Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-306 og His-309, i Aeromonas hydrophilalipidacyltransferaseenzymet
vist
i
SEQ
ID
No.
3
eller
SEQ
ID
No.
1.
[0170] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller
anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan hensiktsmessig kodes for av én av de
20
følgende nukleotidkriteriene:
(a) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 36 (se figur 29);
(b) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 38 (se figur 31);
(c) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 39 (se figur 32);
(d) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 42 (se figur 35);
25
(e) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 44 (se figur 37);
(f) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 46 (se figur 39);
(g) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 48 (se figur 41);
(h) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 49 (se figur 57);
(i) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 50 (se figur 58);
30
(j) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 51 (se figur 59);
(k) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 52 (se figur 60);
(l) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 53 (se figur 61);
(m) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 54 (se figur 62);
(n) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 55 (se figur 63);
35
(o) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 56 (se figur 64);
NO/EP2190296
22
(p) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 57 (se figur 65);
(q) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 58 (se figur 66);
(r) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 59 (se figur 67);
(s) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 60 (se figur 68);
5
(t) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 61 (se figur 69);
(u) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 62 (se figur 70);
(v) nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 63 (se figur 71);
(w) eller
en nukleotidsekvens som har 70 % eller mer, fortrinnsvis 75 % eller mer, identitet med hvilken som
10
helst av sekvensene vist som SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID
No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52,
SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 58, SEQ ID
No. 59, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 62 eller SEQ ID No. 63.
[0171] Nukleotidsekvensen kan hensiktsmessig ha 80 % eller mer, fortrinnsvis 85 % eller mer, mer
15
foretrukket 90 % eller mer, og enda mer foretrukket 95 % eller mer identitet med hvilken som
helst av sekvensene vist som SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID
No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52,
SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 58, SEQ ID
No. 59, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 62 eller SEQ ID No. 63.
20
[0172] I én utførelsesform er nukleotidsekvensen som koder for et lipidacyltransferaseenzym for
anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og anvendelsene i den foreliggende
oppfinnelsen en nukleotidsekvens som har 70 % eller mer, fortrinnsvis 75 % eller mer, identitet
med hvilken som helst av sekvensene vist som: SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ
ID No. 62 og SEQ ID No. 63. Nukleotidsekvensen kan hensiktsmessig ha 80 % eller mer, fortrinnsvis
25
85 % eller mer, mer foretrukket 90 % eller mer, og enda mer foretrukket 95 % eller mer identitet
med hvilken som helst av sekvensene vist som: SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ
ID No. 62 og SEQ ID No. 63.
[0173] I en utførelsesform er nukleotidsekvensen som koder for et lipidacyltransferaseenzym for
anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og anvendelsene ifølge den foreliggende
30
oppfinnelsen en nukleotidsekvens som har 70 % eller mer, 75 % eller mer, 80 % eller mer,
fortrinnsvis 85 % eller mer, mer foretrukket 90 % eller mer, og enda mer foretrukket 95 % eller
mer
identitet
med
sekvensen
vist
som
SEQ
ID
No.
49.
[0174] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller
anvendelsene
35
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
kan
hensiktsmessig
lipidacyltransferase som omfatter én eller flere av de følgende aminosyresekvensene:
være
en
NO/EP2190296
23
(i) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 3
(ii) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 4
(iii) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 5
(iv) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 6
5
(v) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 7
(vi) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 8
(vii) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 9
(viii) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 10
(ix) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 11
10
(x) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 12
(xi) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 13
(xii) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 14
(xiii) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 1
(xiv) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 15
15
(xv) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 16
(xvi) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 17
(xvii) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 18
(xviii) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 34
(xix) aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 35; eller
20
en aminosyresekvens som har 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % eller mer identitet med hvilken
som helst av sekvensene vist som SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID
No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ
ID No. 13, SEQ ID No. 14 eller SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID
No. 34 eller SEQ ID No. 35.
25
[0175] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
kan
hensiktsmessig
være
en
lipidacyltransferase som enten omfatter aminosyresekvensene vist som SEQ ID No. 3 eller som
SEQ ID No. 4 eller SEQ ID No. 1 eller SEQ ID No. 15 eller SEQ ID No. 16 eller SEQ ID No. 34 eller SEQ
ID No. 35 eller omfatter en aminosyresekvens som har 75 % eller mer, fortrinnsvis 80 % eller mer,
30
fortrinnsvis 85 % eller mer, fortrinnsvis 90 % eller mer, fortrinnsvis 95 % eller mer, identitet med
aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 3 eller aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 4 eller
aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 1 eller aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 15 eller
aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 16 eller aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 34 eller
aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 35.
NO/EP2190296
24
[0176] Lipidacyltransferaseenzymet for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene
og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan hensiktsmessig være en
lipidacyltransferase som omfatter en aminosyresekvens som har 80 % eller mer, fortrinnsvis 85 %
eller mer, mer foretrukket 90 % eller mer, og enda mer foretrukket 95 % eller mer identitet med
5
hvilken som helst av sekvensene vist som SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6,
SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No.
13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID
No. 34 eller SEQ ID No. 35.
[0177] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller
10
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
kan
hensiktsmessig
være
en
lipidacyltransferase som omfatter én eller flere av de følgende aminosyresekvensene:
(a) en aminosyresekvens vist som aminosyrerestene 1-100 ifølge SEQ ID No. 3 eller SEQ ID No. 1;
(b) en aminosyresekvens vist som aminosyrerestene 101-200 ifølge SEQ ID No. 3 eller SEQ ID No.
1;
15
(c) en aminosyresekvens vist som aminosyrerestene 201-300 ifølge SEQ ID No. 3 eller SEQ ID No. 1;
eller
(d) en aminosyresekvens som har 75 % eller mer, fortrinnsvis 85 % eller mer, mer foretrukket 90 %
eller mer, enda mer foretrukket 90 % eller mer identitet med hvilken som helst av
aminosyresekvensene
20
definert
i
(a)-(c)
ovenfor.
[0178] Lipidacyltransferasen for anvendelse i fremgangsmåtene og anvendelsene ifølge den
foreliggende oppfinnelsen kan hensiktsmessig omfatte én eller flere av de følgende
aminosyresekvensene:
(a) en aminosyresekvens vist som aminosyrerestene 28-39 ifølge SEQ ID No. 3 eller SEQ ID No. 1;
(b) en aminosyresekvens vist som aminosyrerestene 77-88 ifølge SEQ ID No. 3 eller SEQ ID No. 1;
25
(c) en aminosyresekvens vist som aminosyrerestene 126-136 ifølge SEQ ID No. 3 eller SEQ ID No. 1;
(d) en aminosyresekvens vist som aminosyrerestene 163-175 ifølge SEQ ID No. 3 eller SEQ ID No.
1;
(e) en aminosyresekvens vist som aminosyrerestene 304-311 ifølge SEQ ID No. 3 eller SEQ ID No. 1;
eller
30
(f) en aminosyresekvens som har 75 % eller mer, fortrinnsvis 85 % eller mer, mer foretrukket 90 %
eller mer, enda mer foretrukket 90 % eller mer identitet med hvilken som helst av
aminosyresekvensene definert i (a)-(e) ovenfor.
[0179] I ett aspekt er lipidacyltransferaseenzymet for anvendelse i hvilken som helst av
fremgangsmåtene
35
og/eller
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
en
lipidacyltransferase som kan være lipidacyltransferasen fra Candida parapsilosis som vist i EP 1 275
NO/EP2190296
25
711. Lipidacyltransferasen for anvendelse i fremgangsmåten og anvendelsene ifølge den
foreliggende oppfinnelsen kan dermed være en lipidacyltransferase omfattende hvilken som helst
av
aminosyresekvensene
vist
i
SEQ
ID
No.
17
eller
SEQ
ID
No.
18.
[0180] Det foretrekkes i høy grad at lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av
5
fremgangsmåtene og anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen en lipidacyltransferase
som kan være en lipidacyltransferase omfattende aminosyresekvensene vist som SEQ ID No. 16
eller en aminosyresekvens som har 75 % eller mer, fortrinnsvis 85 % eller mer, mer foretrukket 90
% eller mer, enda mer foretrukket 95 % eller mer, enda mer foretrukket 98 % eller mer, eller enda
mer foretrukket 99 % eller mer identitet med SEQ ID No. 16. Dette enzymet kan betraktes som en
10
variant av enzymet.
[0181] I ett aspekt er lipidacyltransferaseenzymet for anvendelse i hvilken som helst av
fremgangsmåtene
og/eller
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
en
lipidacyltransferase som kan være en lecitin:kolesterolacyltransferase (LCAT) eller variant av denne
(f.eks. en variant fremstilt ved molekylær utvikling).
15
[0182] Egnede LCAT-er er kjent i teknikken og kan oppnås fra én eller flere av de følgende
organismene, f.eks.: pattedyr, rotter, mus, kyllinger, Drosophila melanogaster, planter, inkludert
Arabidopsis
og
Oryza
sativa,
nematoder,
sopp
og
gjær.
[0183] I en utførelsesform er lipidacyltransferaseenzymet for anvendelse i hvilken som helst av
fremgangsmåtene
20
og/eller
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
en
lipidacyltransferase som kan være den oppnåelige lipidacyltransferasen, fortrinnsvis oppnådd, fra
E. coli-stammene TOP 10 som huser pPet12aAhydro og pPet12aASalmo, deponert av Danisco A/S i
Langebrogade 1, DK-1001 København K, Danmark under Budapest-konvensjonen om internasjonal
gjenkjennelse av deponeringen av mikroorganismer med henblikk på patentprosedyre ved
National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street,
25
Aberdeen Scotland, GB 22. desember 2003 i henhold til aksessnumrene, henholdsvis NCIMB 41204
og NCIMB 41205.
[0184] Et lipidacyltransferaseenzym for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene
og/eller
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
kan
være
en
fosfolipidglyserolacyltransferase. Fosfolipidglyserolacyltransferaser inkluderer de som er isolert fra
30
Aeromonas spp.,
fortrinnsvis Aeromonas
hydrophila eller A.salmonicida, mest
foretrukket
A. salmonicida eller varianter av disse.
[0185] Mest foretrukne lipidacyltransferaser for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen
kodes for av SEQ ID No. 1, 3, 4, 15, 16, 34 og 35. Det vil forstås av fagmannen at det er å foretrekke
at signalpeptidene av acyltransferasen er blitt spaltet under uttrykkingen av transferasen.
35
Signalpeptidet av SEQ ID No. 1, 3, 4, 15 og 16 er aminosyrene 1-18. Derfor er de mest foretrukne
NO/EP2190296
26
regionene aminosyrene 19-335 for SEQ ID No. 1 og SEQ ID No. 3 (A. hydrophilia) og aminosyrene
19-336 for SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 15 og SEQ ID No. 16. (A.salmonicida). Når de anvendes til å
bestemme homologien av identiteten av aminosyresekvensene er det foretrukket at
sammenstillingene
5
beskrevet
i
dette
dokumentet
anvender
den
modne
sekvensen.
[0186] I én utførelsesform omfatter lipidacyltransferasen for anvendelse i den foreliggende
oppfinnelsen (eller består av) henholdsvis aminosyresekvensen vist i SEQ ID No. 16, eller omfatter
(eller består av) en aminosyresekvens som har minst 70 %, minst 75 %, minst 85 %, minst 90 %,
minst
95
%,
minst
98
%
identitet
med
SEQ
ID
No.
16.
[0187] I én utførelsesform kodes hensiktsmessig lipidacyltransferasen for anvendelse i den
10
foreliggende oppfinnelsen for av en nukleotidsekvens omfatter (eller består av) en
nukleotidsekvens vist i SEQ ID No. 68 eller omfatter (eller består av) en nukleotidsekvens som har
minst 70 %, minst 75 %, minst 85 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 98 % identitet med SEQ ID No.
68.
[0188] Derfor er de mest foretrukne regionene for bestemmelse av homologi (identitet)
15
aminosyrene 19-335 i SEQ ID No. 1 og 3 (A. hydrophilia) og aminosyrene 19-336 ifølge SEQ ID No.
4, 15 og 16. (A. salmonicida). SEQ ID No. 34 og 35 er modne proteinsekvenser av en
lipidacyltransferase fra henholdsvis A. hydrophilia og A. salmonicida som valgfritt kan gjennomgå
ytterligere posttranslasjonell modifisering.
[0189] Et lipidacyltransferaseenzym for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og
20
anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være en lipidacyltransferase som også kan
isoleres fra Thermobifida, fortrinnsvis T. fusca, mest foretrukket den som kodes for av SEQ ID No.
28.
[0190] Egnede lipidacyltransferaser for anvendelse i henhold til den foreliggende oppfinnelsen
og/eller i fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte hvilken som helst av
25
de følgende aminosyresekvensene og/eller kodes for av de følgende nukleotidsekvensene:
a) en nukleinsyre som koder for et polypeptid som oppviser lipidacyltransferaseaktivitet og er
minst 70 % identisk (fortrinnsvis minst 80 %, mer foretrukket minst 90 % identisk) med
polypeptidsekvensen vist i SEQ ID No. 16 eller med polypeptidet vist i SEQ ID No. 68;
b) et (isolert) polypeptid omfattende (eller består av) en aminosyresekvens som vist i SEQ ID No.
30
16 eller SEQ ID No. 68 eller en aminosyresekvens som er minst 70 % identisk (fortrinnsvis minst 80
% identisk, mer foretrukket minst 90 % identisk) med SEQ ID No. 16 eller SEQ ID No. 68;
c) en nukleinsyre som koder for en lipidacyltransferase, der nukleinsyren omfatter (eller består av)
en nukleotidsekvens vist som SEQ ID No. 49 eller en nukleotidsekvens som er minst 70 % identisk
(fortrinnsvis minst 80 %, mer foretrukket minst 90 % identisk) med nukleotidsekvensen vist som
35
SEQ ID No. 49;
NO/EP2190296
27
d) en nukleinsyre som hybridiseres under middels eller høye stringensforhold til en
nukleinsyreprobe omfattende nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 49 og koder for et
polypeptid som oppviser lipidacyltransferaseaktivitet;
e) en nukleinsyre som er et fragment av nukleinsyresekvensene spesifisert i a), c) eller d); eller
5
f) et polypeptid som er et fragment av polypeptidet spesifisert i b).
[0191] Et lipidacyltransferaseenzym for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og
anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være en lipidacyltransferase som også kan
isoleres fra Streptomyces, fortrinnsvis S. avermitis, mest foretrukket den som kodes for av SEQ ID
No. 32. Andre mulige enzymer for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen fra Streptomyces
10
inkluderer de som kodes for av SEQ ID No. 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 31 og 33.
[0192] Et enzym for anvendelse i oppfinnelsen kan også isoleres fra Corynebacterium, fortrinnsvis
C.
efficiens,
mest
foretrukket
det
som
kodes
for
av
SEQ
ID
No.
29.
[0193] Lipidacyltransferaseenzymet for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene
og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan hensiktsmessig være en
15
lipidacyltransferase som omfatter hvilken som helst av aminosyresekvensene vist som SEQ ID No.
37, 38, 40, 41, 43, 45, eller 47 eller en aminosyresekvens som har minst 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90
%, 95 %, 96 %, 97 % eller 98 % identitet med disse, eller kan kodes for av hvilken som helst av
nukleotidsekvensene vist som SEQ ID No. 36, 39, 42, 44, 46 eller 48 eller en nukleotidsekvens som
har minst 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % eller 98 % identitet med denne.
20
[0194] I én utførelsesform velges nukleotidsekvensen som koder for et lipidacyltransferaseenzym
for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene i den foreliggende
oppfinnelsen fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyre omfattende en nukleotidsekvens vist i SEQ ID No. 36;
b) en nukleinsyre som knyttes til nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID No. ved degenereringen av den
25
genetiske koden; og
c) en nukleinsyre omfattende en nukleotidsekvens som har minst 70 % identitet med
nukleotidsekvensen vist i SEQ ID No. 36.
[0195] I en utførelsesform er lipidacyltransferaseenzymet for anvendelse i hvilken som helst av
fremgangsmåtene
30
og/eller
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
en
lipidacyltransferase som omfatter en aminosyresekvens som vist i SEQ ID No. 37, eller en
aminosyresekvens
som
har
60
%
identitet
med
denne.
[0196] I en ytterligere utførelsesform kan lipidacyltransferaseenzymet for anvendelse i hvilken
som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen være
en lipidacyltransferase omfattende hvilken som helst av aminosyresekvensene vist som SEQ ID No.
35
37, 38, 40, 41, 43, 45 eller 47 eller en aminosyresekvens som har minst 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90
NO/EP2190296
28
%, 95 %, 96 %, 97 % eller 98 % identitet med denne, eller kan kodes for av hvilken som helst av
nukleotidsekvensene vist som SEQ ID No. 39, 42, 44, 46 eller 48, eller en nukleotidsekvens som har
minst 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % eller 98 % identitet med denne.
[0197] I en ytterligere utførelsesform kan lipidacyltransferaseenzymet for anvendelse i hvilken
5
som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen være
en lipidacyltransferase omfattende hvilken som helst av aminosyresekvensene vist som SEQ ID No.
38, 40, 41, 45 eller 47, eller en aminosyresekvens som har minst 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95
%, 96 %, 97 % eller 98 % identitet med denne for anvendelsene beskrevet i dette dokumentet.
[0198] I en ytterligere utførelsesform kan lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst
10
av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen være en
lipidacyltransferase omfattende hvilken som helst av aminosyresekvensene vist som SEQ ID No.
38, 40 eller 47, eller en aminosyresekvens som har minst 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %,
97 % eller 98 % identitet med denne for anvendelsene beskrevet i dette dokumentet.
[0199] I en utførelsesform kan lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av
15
fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen mer foretrukket
være en lipidacyltransferase omfattende aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 47 eller en
aminosyresekvens som har minst 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % eller 98 %
identitet med denne.
[0200] I en annen utførelsesform kan lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av
20
fremgangsmåtene
og
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
være
en
lipidacyltransferase omfattende aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 43 eller 44, eller en
aminosyresekvens som har minst 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % eller 98 % identitet med
denne.
[0201] I en utførelsesform kan lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av
25
fremgangsmåtene
og
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
være
en
lipidacyltransferase omfattende aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 41 eller en
aminosyresekvens som har minst 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % eller 98 %
identitet med denne.
[0202] I én utførelsesform kan lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av
30
fremgangsmåtene og anvendelsene i den foreliggende oppfinnelsen kodes for av en nukleinsyre
valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyre omfattende en nukleotidsekvens vist i SEQ ID No. 36;
b) en nukleinsyre som er knyttet til nukleotidsekvensen til SEQ ID No. 36 ved degenereringen av
den genetiske koden; og
NO/EP2190296
29
c) en nukleinsyre omfattende en nukleotidsekvens som har minst 70 % identitet med
nukleotidsekvensen vist i SEQ ID No. 36.
[0203] I en utførelsesform kan lipidacyltransferasen ifølge den foreliggende oppfinnelsen være en
lipidacyltransferase oppnåelig, fortrinnsvis oppnådd, fraStreptomyces-stammene L130 eller L131
5
deponert av Danisco A/S i Langebrogade 1, DK-1001 København K, Danmark under Budapestkonvensjonen om internasjonal gjenkjennelse av deponeringen av mikroorganismer med henblikk
på patentprosedyre ved National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St.
Machar Street, Aberdeen Scotland, GB 25. juni 2004 i henhold til aksessnumrene, henholdsvis
NCIMB 41226 og NCIMB 41227.
10
[0204] Egnede nukleotidsekvenser som koder for en lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken
som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan
kode for et polynukleotid som koder for en lipidacyltransferase (SEQ ID No. 16); eller kan kode for
en
aminosyresekvens
av
en
lipidacyltransferase
(SEQ
ID
No.
16).
[0205] En egnet lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene
15
og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være en aminosyresekvens som
kan identifiseres ved sammenstilling til L131- (SEQ ID No. 37) sekvensen ved anvendelse av Align X,
den
Clustal
W-parvise
sammenstillingsalgoritmen
til
VectorNTI
ved
anvendelse
av
standardinnstillinger.
[0206] En sammenstilling av L131 og homologer fra S. avermitilis og T. fusca illustrerer
20
konserveringen av GDSx-motivet (GDSY i L131 og S. avermitilis og T. fusca), GANDY-boksen, som er
enten GGNDA eller GGNDL, og HPT-blokken (ansett å være det konserverte katalytiske histidinet).
Disse tre konserverte blokkene er uthevet i figur 42.
[0207] Når den er sammenstilt til enten pfam Pfam00657-konsensussekvensen (som beskrevet i
WO04/064987) og/eller i L131-sekvensen offentliggjort i dette dokumentet (SEQ ID No. 37), er det
25
mulig å identifisere tre konserverte regioner, GDSx-blokken, GANDY-blokken og HTP-blokken
(seWO04/064987 for mer informasjon).
[0208] Når den er sammenstilt til enten pfam Pfam00657-konsensussekvensen (som beskrevet i
WO04/064987) og/eller L131-sekvensen offentliggjort i dette dokumentet (SEQ ID No. 37)
i) kan lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og
30
anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen være en lipidacyltransferase som har et GDSxmotiv, mer foretrukket et GDSx-motiv valgt fra GDSL- eller GDSY-motivet.og/eller
ii) kan lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og
anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen være en lipidacyltransferase som, har en
GANDY-blokk, mer foretrukket en GANDY-blokk omfattende amino-GGNDx, mer foretrukket
35
GGNDA eller GGNDL.og/eller
NO/EP2190296
30
iii) kan lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og
anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen være en lipidacyltransferase som fortrinnsvis
har en HTP-blokk,og fortrinnsvis
iv) kan lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og
5
anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen være en lipidacyltransferase som fortrinnsvis
har et GDSx- eller GDSY-motiv, og en GANDY-blokk omfattende amino-GGNDx, fortrinnsvis GGNDA
eller GGNDL, og en HTP-blokk (konservert histidin).
[0209] Uten ønske om å være bundet av teori, kan reaksjonen mellom lipidacyltransferasen og
lecitin naturlig til stede i UHT-melken anvendes til å endre overflateaktiviteten til de naturlige
10
komponentene av melken og/eller den kan anvendes til å redusere mengden av kolesterol i
melken.
[0210] Lipidacyltransferasen som anvendt i dette dokumentet kan refereres til som en
glyserofosfolipidkolesterolacyltransferase. Med andre ord har lipidacyltransferasen for anvendelse
i den foreliggende oppfinnelsen fortrinnsvis evnen til å "hydrolysere" fosfolipider og samtidig
15
forestre kolesterol med den frie fettsyren fra hydrolyseringen, dette er egentlig en
tranferasereaksjon
(dvs.
en
interforestrings-
og/eller
en
transforestringsreaksjon.)
[0211] Graden av "hydrolyse" kan beskrives som forholdet mellom fosfatidylkolin (PC) og/eller
fosfatidyletanolamin (PE) omdannet til henholdsvis lyso-PC eller lyso-PE. Ved den enzymatiske
hydrolyseringen av PC til lyso-PC, endres forholdet mellom den hydrofile delen av
20
fosfolipidmolekylet (polar hodegruppe) og den hydrofobe delen (fettsyrekjeder). Ved fjerning av
en fettsyre (mettede og/eller umettede fettsyrer) reduseres den hydrofobe delen, som dermed
gjør hele molekylet mer hydrofilt. Videre kan den steriske molekylkonformasjonen endres, noe
som kan påvirke fasestrukturene (f.eks. micelleringen) dannet av molekylene i dispersjon, samt
interaksjoner
25
med
andre
molekyler,
som
f.eks.
melkeproteiner.
[0212] Lyso-lecitinprodukter er kjent for å ha bedre emulgerende egenskaper. Med en høy grad
av interforestring og/eller transforestring er det mulig å oppnå mindre gjennomsnittlig størrelse på
oljedråpene i en sammenlignende emulgeringstest.
[0213] Ved å endre kolesterol til kolesterol-ester sammen med en endring av PC og PE til lyso-PC
og lyso-PE (som begge har overlegen overflateaktivitet sammenlignet med normal PC/PE) er det
30
mulig å fremstille UHT-melkeprodukter uten kolesterol og med forbedret emulsjonsstabilitet.
Dette er viktig i produksjonen av UHT-melk og særlig i produksjonen av smakstilsatt UHT-melk, der
én av de viktigste manglene knyttes til lav emulsjonsstabilitet og en høy grad av skumming.
NO/EP2190296
31
[0214] Anvendelsen av lipidacyltransferasen som definert i dette dokumentet fører til mindre
partikler i melken som er en fordel i UHT-melk, der skumming svært ofte anses som en defekt.
[0215] Funksjonen til lipidacyltransferase er at kolesterol og fosfolipider vil endres i kolesterol5
estere og lyso-fosfolipider, noe som gir to resulterende komponenter med overflateaktive
egenskaper i forhold til O/W-emulsjoner. Det har vist seg at lipidacyltransferaser bidrar til økt
stabilitet mot skumming samt et redusert kolesterolnivå i UHT-melken. Dermed vil
sluttproduktene inneholde ingen eller vesentlig redusert kolesterol og ha en forbedret
emulsjonsstabilitet.
10
[0216] Enzymet ifølge den foreliggende oppfinnelsen er fortrinnsvis ikke et fosfolipaseenzym, slik
som en fosfolipase A1 klassifisert som E.C. 3.1.1.32 eller en fosfolipase A2 klassifisert som E.C.
3.1.1.4.
Variantlipidacyltransferase
[0217] I
15
en
foretrukket
utførelsesform
kan
nukleotidsekvensen
som
koder
for
en
lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
kode
for
en
lipidacyltransferase
som
er
en
variantlipidacyltransferase.
[0218] Det kan anvendes varianter som har en økt aktivitet på fosfolipider, slik som økt
hydrolytisk aktivitet og/eller økt transferaseaktivitet, fortrinnsvis økt transferaseaktivitet på
NO/EP2190296
32
fosfolipider.
[0219] Fortrinnsvis
fremstilles
variantlipidacyltransferasen
av
én
eller
flere
aminosyremodifiseringer av lipidacyltransferasene som definert ovenfor i dette dokumentet.
[0220] Lipidacyltransferaseenzymet for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og
5
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
kan
hensiktsmessig
være
en
lipidacyltransferase som kan være en variantlipidacyltransferase, i så fall kan enzymet
karakteriseres ved at enzymet omfatter aminosyresekvensmotivet GDSX, der X er én eller flere av
de følgende aminosyrerestene L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M eller S, og der variantenzymet omfatter
én eller flere aminosyremodifiseringer sammenlignet med en modersekvens ved hvilken eller
10
hvilke som helst av aminosyrerestene definert i sett 2 eller sett 4 eller sett 6 eller sett 7 (som
definert WO2005/066347 og i det etterfølgende).
[0221] F.eks. kan variantlipidacyltransferasen karakteriseres ved at enzymet omfatter
aminosyresekvensmotivet GDSX, der X er ett eller flere av de følgende aminosyrerestene L, A, V, I,
F, Y, H, Q, T, N, M eller S, og der variantenzymet omfatter én eller flere aminosyremodifiseringer
15
sammenlignet med en modersekvens ved hvilken eller hvilke som helst av aminosyrerestene som
er beskrevet i sett 2 eller sett 4 eller sett 6 eller sett 7 (som definert i WO2005/066347 og i det
etterfølgende) identifisert av modersekvensen som sammenstilles strukturelt med den strukturelle
modellen til P10480 definert i dette dokumentet, som fortrinnsvis oppnås ved strukturell
sammenstilling av P10480-krystallstrukturkoordinater med 1IVN.PDB og/eller 1DEO.PDB som
20
definert i WO2005/066347 og i det etterfølgende.
[0222] I en ytterligere utførelsesform kan en lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som
helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen være en
variantlipidacyltransferase
som
kan
karakteriseres
ved
at
enzymet
omfatter
aminosyresekvensmotivet GDSX, der X er én eller flere av de følgende aminosyrerestene L, A, V, I,
25
F, Y, H, Q, T, N, M eller S, og der variantenzymet omfatter én eller flere aminosyremodifiseringer
sammenlignet med en modersekvens ved hvilken eller hvilke som helst av aminosyrerestene vist i
sett 2 identifisert når modersekvensen sammenstilles med pfamkonsensussekvensen (SEQ ID No. 2
-figur 3) og modifisert ifølge en strukturell modell av P10480 for å sikre best mulig
passformoverlapping
30
som
definert
i
WO2005/066347 og
i
det
etterfølgende.
[0223] En lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen
kan
hensiktsmessig
være
et
variantlipidacyltransferaseenzym som kan omfatte en aminosyresekvens, der aminosyresekvensen
er vist som SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7,
SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No.
35
14, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID
NO/EP2190296
33
No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33 eller SEQ ID No. 35 med unntak av én eller
flere aminosyremodifiseringer i hvilken eller hvilke som helst av aminosyrerestene som er definert
i sett 2 eller sett 4 eller sett 6 eller 7 sett (som definert iWO2005/066347og i det etterfølgende)
identifisert
5
ved
sekvenssammenstilling
med
SEQ
ID
No.
34.
[0224] Alternativt kan lipidacyltransferasen være et variantlipidacyltransferaseenzym omfattende
en aminosyresekvens, der aminosyresekvensen er vist som SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 3, SEQ ID No.
4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No.
11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID
No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33
10
eller SEQ ID No. 35 med unntak av én eller flere aminosyremodifiseringer i hvilken eller hvilke som
helst av aminosyrerestene som er definert i sett 2 eller sett 4 eller sett 6 eller sett 7 som definert i
WO2005/066347 og i det etterfølgende, identifisert ved modersekvensen som er strukturelt
sammenstilt med den strukturelle modellen til P10480 definert i dette dokumentet, som
fortrinnsvis oppnås ved strukturell sammenstilling av P10480-krystallstrukturkoordinater med
15
1IVN.PDB
og/eller
1DEO.PDB
som
vist
i WO2005/066347 og
i
det
etterfølgende.
[0225] Alternativt kan lipidacyltransferasen være et variantlipidacyltransferaseenzym omfattende
en aminosyresekvens, der aminosyresekvensen er vist som SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 3, SEQ ID No.
4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No.
11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID
20
No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33
eller SEQ ID No. 35 med unntak av én eller flere aminosyremodifiseringer i hvilken eller hvilke som
helst av aminosyrerestene vist i sett 2 identifisert når modersekvensen sammenstilles med
pfamkonsensussekvensen (SEQ ID No. 2) og modifisert ifølge en strukturell modell av P10480 for å
sikre best mulig passformoverlapping vist i WO2005/066347 og i det etterfølgende.
25
[0226] Fortrinnsvis er moderenzymet et enzym som omfatter, eller er homologt med,
aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 34 og/eller SEQ ID No. 15 og/eller SEQ ID No. 35.
[0227] Fortrinnsvis kan lipidacyltransferasen være et variantenzym som omfatter en
aminosyresekvens, der aminosyresekvensen er vist som SEQ ID No. 34 eller SEQ ID No. 35 med
unntak av én eller flere aminosyremodifiseringer i hvilken eller hvilke som helst av
30
aminosyrerestene som er definert i sett 2 eller sett 4 eller sett 6 eller 7 sett som definert i
WO2005/066347og i det etterfølgende.
DEFINISJON AV SETT
Aminosyresett
1:
[0228] Aminosyresett 1 (merk at disse er aminosyrer i 1IVN - figur 53 og figur 54) Gly8, Asp9,
35
Ser10, Leu11, Ser12, Tyr15, Gly44, Asp45, Thr46, Glu69, Leu70, Gly71, Gly72, Asn73, Asp74, Gly75,
NO/EP2190296
34
Leu76, Gln106, Ile107, Arg108, Leu109, Pro110, Tyr113, Phe121, Phe139, Phe140, Met141, Tyr145,
Met151, Asp154, His157, Gly155, Ile156, Pro158
[0229] De meget konserverte motivene, som f.eks. GDSx og katalytiske rester, ble valgt bort fra
sett 1 (rester understreket). For å unngå tvil, definerer sett 1 aminosyrerestene innenfor 10A av
5
det sentrale karbonatomet i et glyserol i det aktive setet til 1IVN-modellen.
Aminosyresett 2:
[0230] Aminosyresett 2 (merk at nummereringen av aminosyrene refererer til aminosyrene i den
modne P10480-sekvensen)Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88,
Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164,
10
Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Met209,
Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289 og Val290.
NO/EP2190296
35
Tabell av utvalgte rester i sett 1 sammenlignet med sett 2:
IVN-modell
IVN
P10480-modent sekvensresttall
A.hyd.-homolog
PFAM
Struktur
Gly8
Gly32
Asp9
Asp33
Ser10
Ser34
Leu11
Leu35
Leu17
Ser12
Ser36
Ser18
Lys22
Met23
Tyr15
Gly58
Gly40
Gly44
Asn98
Asn80
Asp45
Pro99
Pro81
Thr46
Lys100
Lys82
Asn87
Asn88
Glu69
Trp129
Trp111
Leu70
Val130
Val112
Gly71
Gly131
Gly72
Ala132
Ala114
NO/EP2190296
36
IVN-modell
IVN
P10480-modent sekvensresttall
A.hyd.-homolog
PFAM
Struktur
Asn73
Asn133
Asp74
Asp134
Gly75
Tyr135
Tyr117
Leu76
Leu136
Leu118
Gln106
Pro174
Pro156
Ile107
Gly177
Gly159
Arg108
Gln178
Gln160
Leu109
Asn179
Asn161
Pro110
180 til 190
Pro162
Tyr113
Ser163
Ala164
Arg165
Ser166
Gln167
Lys168
Val169
Val170
Glu171
NO/EP2190296
37
IVN-modell
IVN
P10480-modent sekvensresttall
A.hyd.-homolog
PFAM
Struktur
Ala172
Phe121
His198
Tyr197
Tyr179
His198
His180
Asn199
Asn181
Phe139
Met227
Met209
Phe140
Leu228
Leu210
Met141
Arg229
Arg211
Tyr145
Asn233
Asn215
Lys284
Met151
Met303
Met285
Asp154
Asp306
Gly155
Gln307
Gln289
Ile156
Val308
Val290
His157
His309
Pro158
Pro310
Aminosyresett-3:
[0231] Aminosyresett 3 er identisk med sett 2, men refererer til den kodende sekvensen
Aeromonas salmonicida (SEQ ID No. 4), dvs. at aminosyreresttallene er 18 høyere i sett 3 ettersom
5
dette gjenspeiler forskjellen mellom aminosyrenummereringen i det modne proteinet (SEQ ID No.
34)
sammenlignet
med
proteinet
inkludert
en
signalsekvens
(SEQ
ID
No.
3).
NO/EP2190296
38
[0232] De modne proteinene til Aeromonas salmonicida GDSX (SEQ ID No. 4 og Aeromonas
hydrophila GDSX (SEQ ID No. 34) avviker i fem aminosyrer. Disse er Thr3Ser, Gln182Lys, Glu309Ala,
Ser310Asn, og Gly318, der salmonicida-resten er oppført først og hydrophila-resten er oppført sist.
Hydrophila-proteinet er bare 317 aminosyrer langt og mangler en rest i posisjon 318. Aeromonas
5
salmonicida-GDSX
har
betydelig
høy
aktivitet
på
polare
lipider,
slik
som
andre
galaktolipidsubstrater enn Aeromonas hydrophila-proteinet. Setescanning ble utført på alle fem
aminosyrestillingene.
Aminosyresett 4:
[0233] Aminosyresett 4 er S3, Q182, E309, S310 og -318.
10
[0234] Aminosyresett 5:
[0235] F13S, D15N, S18G, S18V, Y30F, D116N, D116E, D157 N, Y226F, D228N Y230F.
Aminosyresett 6:
[0236] Aminosyresett 6 er Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn 87, Asn88,
Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164,
15
Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182,
Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318.
[0237] Nummereringen av aminosyrene i sett 6 refererer til aminosyrerestene i P10480 (SEQ ID
No.
3)
-
tilsvarende
aminosyrer
i
andre
sekvensryggrader
kan
bestemmes
ved
homologisammenstilling og/eller strukturell sammenstilling med P10480 og/eller 1IVN.
20
Aminosyresett
7:
[0238] Aminosyresett 7 er Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn 87, Asn88,
Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164,
Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182,
Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318, Y30X
25
(der X er valgt fra A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V eller W), Y226X (der X er valgt fra A, C,
D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V eller W), Y230X (der X er valgt fra A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N,
P, Q, R, S, T, V eller W), S18X (der X er valgt fra A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W eller Y),
D157X (der X er valgt fra A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W eller Y).
[0239] Nummereringen av aminosyrene i sett 7 refererer til aminosyrerestene i P10480 (SEQ ID
30
No.
3)
-
tilsvarende
aminosyrer
i
andre
sekvensryggrader
kan
bestemmes
ved
homologisammenstilling og/eller strukturell sammenstilling med P10480 og/eller 1IVN.
[0240] Variantenzymet
omfatter
hensiktsmessig
ett
aminosyremodifiseringene sammenlignet med moderenzymet:
S3E, A, G, K, M, Y, R, P, N, T eller G
35
E309Q, R eller A, fortrinnsvis Q eller R
eller
flere
av
de
følgende
NO/EP2190296
39
-318Y, H, S eller Y, fortrinnsvis Y.
[0241] X i GDSX-motivet er fortrinnsvis L. Dermed omfatter moderenzymet fortrinnsvis
aminosyremotivet
GDSL.
[0242] Den første moderlipidacyltransferasen kan hensiktsmessig omfatte hvilken som helst av de
5
følgende aminosyresekvensene: SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID
No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ
ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27,
SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33 eller SEQ ID No. 35.
[0243] Den andre relaterte lipidacyltransferasen kan hensiktsmessig omfatte hvilken som helst av
10
de følgende aminosyresekvensene: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID
No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ
ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27,
SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33 eller SEQ ID No. 35.
[0244] Variantenzymet må omfatte minst én aminosyremodifisering sammenlignet med
15
moderenzymet. I noen utførelsesformer kan variantenzymet omfatte minst 2, fortrinnsvis minst 3,
fortrinnsvis minst 4, fortrinnsvis minst 5, fortrinnsvis minst 6, fortrinnsvis minst 7, fortrinnsvis
minst 8, fortrinnsvis minst 9, fortrinnsvis minst 10 aminosyremodifiseringer sammenlignet med
moderenzymet.
[0245] Når det refereres til spesifikke aminosyrerester i dette dokumentet er nummereringen den
20
som oppnås fra sammenstilling av variantsekvensen med referansesekvensen vist som SEQ ID No.
34 eller SEQ ID No. 35.
[0246] I ett aspekt omfatter variantenzymet fortrinnsvis én eller flere av de følgende
aminosyresubstitusjonene:
S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W eller Y; og/eller
25
L17A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
S18A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W eller Y; og/eller
K22A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
M23A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
Y30A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V eller W; og/eller
30
G40A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
N80A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
K82A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
35
N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
NO/EP2190296
40
W111A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
V112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W eller Y; og/eller
A114C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
Y117A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V eller W; og/eller
5
L118A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
P156A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
D157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
G159A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
Q160A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
10
N161A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
P162A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
S163A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W eller Y; og/eller
A164C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
R165A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W eller Y; og/eller
15
S166A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W eller Y; og/eller
Q167A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
K168A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
V169A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W eller Y; og/eller
V170A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W eller Y; og/eller
20
E171A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
A172C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V eller W; og/eller
H180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
N181A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
25
Q182A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W eller Y, fortrinnsvis K; og/eller
M209A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
L210 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
R211 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
N215 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
30
Y226A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V eller W; og/eller
Y230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V eller W; og/eller
K284A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
M285A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
35
V290A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W eller Y; og/eller
NO/EP2190296
41
E309A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; og/eller
S310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W eller Y.
[0247] I tillegg eller alternativt til dette kan det være én eller flere C-endeforlengelser.
Fortrinnsvis omfattes den ytterligere C-endeforlengelsen av én eller flere alifatiske aminosyrer,
5
fortrinnsvis en ikke-polar aminosyre, mer foretrukket av I, L, V eller G. Dermed tilveiebringer
foreliggende oppfinnelse videre et variantenzym omfattende én eller flere av de følgende Cendeforlengelsene: 318I, 318L, 318V, 318G.
[0248] Foretrukne variantenzymer kan ha en redusert hydrolytisk aktivitet mot et fosfolipid, slik
som fosfatidylkolin (PC), og kan også ha en økt transferaseaktivitet fra et fosfolipid.
10
[0249] Foretrukne variantenzymer kan ha en økt transferaseaktivitet fra et fosfolipid, slik som
fosfatidylkolin (PC), disse kan også ha en økt hydrolytisk aktivitet mot et fosfolipid.
[0250] Modifisering av én eller flere av de følgende restene kan gi et variantenzym som har en økt
absolutt transferaseaktivitet mot fosfolipid: S3, D157, S310, E309, Y179, N215, K22, Q289, M23,
H180, M209, L210, R211, P81, V112, N80, L82, N88; N87
15
[0251] Spesifikke foretrukne modifiseringer som kan gi et variantenzym som har en forbedret
transferaseaktivitet fra et fosfolipid kan velges fra én eller flere av de følgende:
S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W eller Y; fortrinnsvis N, E, K, R, A, P eller M, mest
foretrukket S3A
D157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis D157S, R, E, N, G, T, V, Q, K
20
eller C
S310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W eller Y; fortrinnsvis S310T -318 E
E309A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W eller Y; fortrinnsvis E309 R, E, L, R eller A
Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V eller W; fortrinnsvis Y179 D, T, E, R, N, V, K, Q
eller S, mer foretrukket E, R, N, V, K eller Q
25
N215A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis N215 S, L, R eller Y
K22A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis K22 E, R, C eller A
Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis Q289 R, E, G, P eller N
M23A, C, D, E, F, G, H, I, K, L N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis M23 K, Q, L, G, T eller S
H180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis H180 Q, R eller K
30
M209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis M209 Q, S, R, A, N, Y, E, V
eller L
L210A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis L210 R, A, V, S, T, I, W eller
M
R211A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis R211T
35
P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis P81G
NO/EP2190296
42
V112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W eller Y; fortrinnsvis V112C
N80A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis N80 R, G, N, D, P, T, E, V, A
eller G
L82A, C, D, E, F, G, H, I, M, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis L82N, S eller E
5
N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis N88C
N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W eller Y; fortrinnsvis N87M eller G
[0252] Foretrukket modifisering av én eller flere av de følgende restene gir et variantenzym som
har en økt absolutt transferaseaktivitet mot fosfolipid:
S3 N, R, A, G
10
M23 K, Q, L, G, T, S
H180 R
L82G
Y179 E, R, N, V, K eller Q
E309 R, S, L eller A
15
[0253] En foretrukket modifisering er N80D. Dette er særlig tilfellet ved anvendelse av
referansesekvensen SEQ ID No. 35 som ryggraden. Dermed kan referansesekvensen være SEQ ID
No. 16. Denne modifiseringen kan være i kombinasjon med én eller flere ytterligere
modifiseringer. I en foretrukket utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan
nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som helst av
20
fremgangsmåtene og anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen derfor kode for en
lipidacyltransferase som omfatter SEQ ID No. 35 eller en aminosyresekvens som har 75 % eller
mer, fortrinnsvis 85 % eller mer, mer foretrukket 90 % eller mer, enda mer foretrukket 95 % eller
mer, enda mer foretrukket 98 % eller mer, eller enda mer foretrukket 99 % eller mer identitet med
SEQ ID No. 35.
25
[0254] Som angitt ovenfor, når det refereres til spesifikke aminosyrerester i dette dokumentet er
nummereringen den som oppnås fra sammenstilling av variantsekvensen med referansesekvensen
vist som SEQ ID No. 34 eller SEQ ID No. 35.
[0255] Det foretrekkes i høy grad at nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase for
anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og anvendelsene ifølge den foreliggende
30
oppfinnelsen kan svært foretrukket kode for et lipid omfattende aminosyresekvensen vist som
SEQ ID No. 16 eller aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 68 eller en aminosyresekvens som
har 70 % eller mer, fortrinnsvis 75 % eller mer, fortrinnsvis 85 % eller mer, mer foretrukket90 %
eller mer, enda mer foretrukket 95 % eller mer, enda mer foretrukket 98 % eller mer, eller enda
mer foretrukket 99 % eller mer identitet med SEQ ID No. 16 eller SEQ ID No. 68. Dette enzymet
35
kunne betraktes som et variantenzym.
NO/EP2190296
43
[0256] For formålene ifølge den foreliggende oppfinnelsen er graden av identitet basert på
antallet sekvenselementer som er de samme. Graden av identitet i samsvar med foreliggende
oppfinnelse
for
aminosyresekvenser
kan
hensiktsmessig
bestemmes
ved
hjelp
av
datamaskinprogrammer kjent i teknikken, som f.eks. Vector NTI 10 (Invitrogen Corp.). For parvis
5
sammenstilling er scoren som anvendes fortrinnsvis BLOSUM62 med mellomromåpningsstraff på
10,0 og mellomromforlengelsesstraff på 0,1.
[0257] Graden av identitet med hensyn på en aminosyresekvens bestemmes hensiktsmessig over
minst 20 sammenhengende aminosyrer, fortrinnsvis over minst 30 sammenhengende aminosyrer,
fortrinnsvis over minst 40 sammenhengende aminosyrer, fortrinnsvis over minst 50
10
sammenhengende aminosyrer, fortrinnsvis over minst 60 sammenhengende aminosyrer.
[0258] Graden av identitet med hensyn på en aminosyresekvens kan hensiktsmessig bestemmes
over hele sekvensen.
[0259] Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase eller lipidacyltransferaseenzym
til anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen kan hensiktsmessig være oppnåelig, fortrinnsvis
15
oppnådd, fra organismer fra ett eller flere av de følgende slektene: Aeromonas, Streptomyces,
Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium,
Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces,
Listeria,
Neisseria,
Mesorhizobium,
Ralstonia,
Xanthomonas,
Candida,
Thermobifida og Corynebacterium.
20
[0260] Nukleotidsekvensen
som
koder
for
en
lipidacyltransferase
eller
lipidacyltransferaseenzymet til anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen kan hensiktsmessig
være oppnåelig, fortrinnsvis oppnådd, fra én eller flere av de følgende organismene: Aeromonas
hydrophila,
Aeromonas
Mycobacterium,
25
salmonicida,
Streptococcus
Streptomyces
pyogenes,
Lactococcus
coelicolor,
lactis,
Streptomyces
Streptococcus
rimosus,
pyogenes,
Streptococcus thermophilus, Streptomyces thermosacchari, Streptomyces avermitilis Lactobacillus
helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans, Bacillus sp, Campylobacter jejuni, Vibrionaceae,
Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus terreus,
Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis,
Mesorhizobium loti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis,
30
Candida
parapsilosis,
Thermobifida
fusca ogCorynebacterium
efficiens.
[0261] I ett aspekt er nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase for anvendelse i
hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene i den foreliggende oppfinnelsen
fortrinnsvis for et lipidacyltransferaseenzym ifølge den foreliggende oppfinnelsen oppnåelig,
fortrinnsvis oppnådd eller avledet, fra én eller flere av Aeromonas spp., Aeromonas
35
hydrophila eller Aeromonas salmonicida.
NO/EP2190296
44
[0262] I ett aspekt er fortrinnsvis lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av
fremgangsmåtene
og/eller
anvendelsene
i
den
foreliggende
oppfinnelsen
et
lipidacyltransferaseenzym oppnåelig, fortrinnsvis oppnådd eller avledet, fra én eller flere av
Aeromonas
5
spp.,
Aeromonas
hydrophila eller Aeromonas
salmonicida.
[0263] Enzymer som fungerer som lipidacyltransferaser i samsvar med den foreliggende
oppfinnelsen kan rutinemessig identifiseres ved hjelp av analysen som vist i det etterfølgende:
ANALYSE FOR TRANSFERASEAKTIVITET
[0264] Transferaseaktiviteten måles fortrinnsvis av den molare mengden av kolesterolesteren
dannet ved acyloverføring fra fosfolipider og/eller lipider i melk til kolesterol i forhold til mengden
10
av kolesterol som opprinnelig er tilgjengelig.
[0265] Melk inkuberes med enzym eller vann (som kontroll) i 30 minutter ved 40 ° C.
[0266] Melkelipider isoleres ved løsningsmiddelekstraksjon, og de isolerte lipidene analyseres ved
GLC.
[0267] Basert på GLC-analyse beregnes mengden av kolesterol (CHL), kolesterolester (CHLE) og
15
frie fettsyrer (FFA).
[0268] der:
CHLE(O) = mol/l kolesterolester-kontroll
20
CHLE(t) = mol/l kolesterolester-enzymbehandling
FFA(O) = mol/l frie fettsyrer-kontroll
FFA(t) = mol/l frie fettsyrer-enzymbehandling
[0269] GLC-analyse kan utføres som følger:
GLC-analyse
25
[0270] Perkin Elmer Autosystem 9000 kapillær gasskromatograf utstyrt med WCOTsammensmeltet silikakolonne 12,5 m x 0,25 mm ID x 0,1 µ filmtykkelse 5 % fenyl-metylsilikon (CP
Sil 8 CB fra Chrompack). Bærergass: Helium.Injektor. PSSl kald splittinjeksjon (starttemp. 50 °C
oppvarmet til 385 °C), volum
1,0 µl detektor FID: 395 °C
Ovnstemperatur:
1
2
3
Ovnstemperatur, °C.
90
280
350
NO/EP2190296
45
Ovnstemperatur:
Isotermal, tid, min.
Temperaturhastighet, °C/min.
1
1
2
0
10
15
4
3
Prøvefremstilling: 30 mg prøve ble løst opp i 9 ml heptan:pyridin, 2:1 inneholdende heptadekan av
indre standard, 0,5 mg/ml. 300 µl prøveløsning ble overført til et hetteglass, 300 µl MSTFA (Nmetyl-N-trimetylsilyl-trifluoraceamid) ble tilsatt og reagert i 20 minutter ved 60 °C.Beregning:
Responsfaktorer for mono-di-triglyserider og frie fettsyrer ble bestemt fra standard 2 (mono-di5
triglyserid), for kolesterol, kolesterylpalmitat og kolesterylstearat ble responsfaktorene bestemt
fra rent referansemateriale (vekt for rent materiale:
10
mg).
[0271] Ved hjelp av denne analysen er lipidacyltransferaser/lipidacyltransferase i samsvar med
den foreliggende oppfinnelsen de som har minst 5 % transferaseaktivitet, fortrinnsvis minst 10 %
10
transferaseaktivitet, fortrinnsvis minst 15 %, 20 %, 25 %, 26 %, 28 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % eller
75 % transferaseaktivitet.
[0272] Begrepene "transferase" og "lipidacyltransferase" kan være brukt om hverandre i dette
dokumentet.
[0273] Lipidacyltransferasen som definert i dette dokumentet katalyserer hensiktsmessig én eller
15
flere av de følgende reaksjonene: interforestring, transforestring, alkoholyse, hydrolyse.
[0274] Begrepet "interforestring" refererer til den enzymatisk katalyserte overføringen av
acylgrupper mellom en lipiddonor og lipidakseptor, der lipiddonoren ikke er en fri acylgruppe.
[0275] Begrepet "transforestring" som anvendt i dette dokumentet betyr den enzymatisk
katalyserte overføringen av en acylgruppe fra en lipiddonor (forskjellig fra en fri fettsyre) til en
20
acylakseptor (forskjellig fra vann).
[0276] Som anvendt i dette dokumentet refererer begrepet "alkoholyse" til den enzymatiske
spaltingen av en kovalent binding av et syrederivat ved omsetning med en alkohol ROH, slik at ett
av produktene kombineres med H-en av alkoholen og det andre produktet kombineres med ORgruppen til alkoholen.
25
[0277] Som anvendt i dette dokumentet refererer begrepet "alkohol" til en alkylforbindelse som
inneholder en hydroksylgruppe.
[0278] Som anvendt i dette dokumentet refererer begrepet "hydrolyse" til den enzymatisk
katalyserte overføringen av en acylgruppe fra et lipid til OH-gruppen av et vannmolekyl.
[0279] Begrepet "uten å øke eller uten i det vesentlige å øke de frie fettsyrene" som anvendt i
NO/EP2190296
46
dette dokumentet betyr fortrinnsvis at lipidacyltransferasen ifølge den foreliggende oppfinnelsen
har 100 % transferaseaktivitet (dvs. overfører 100 % av acylgruppene fra en acyldonor på
acylakseptoren, uten noen hydrolytisk aktivitet); imidlertid kan enzymet overføre mindre enn 100
% av acylgruppene som er til stede i lipidacyldonoren til acylakseptoren. I så fall utgjør fortrinnsvis
5
acyltransferaseaktiviteten minst 5 %, mer foretrukket minst 10 %, mer foretrukket minst 20 %, mer
foretrukket minst 30 %, mer foretrukket minst 40 %, mer foretrukket 50 %, mer foretrukket minst
60 %, mer foretrukket minst 70 %, mer foretrukket minst 80 %, mer foretrukket minst 90 % og mer
foretrukket minst 98% av den totale enzymaktiviteten. Prosent transferaseaktivitet (dvs.
transferaseaktiviteten som en prosentandel av den totale enzymatiske aktiviteten) kan bestemmes
10
ved å følge "analyse for transferaseaktivitet" gitt ovenfor.
[0280] I noen aspekter ifølge den foreliggende oppfinnelsen betyr begrepet "i det vesentlige uten
å øke frie fettsyrer" som anvendt i dette dokumentet at mengden av fri fettsyre i en spiselig olje
som ble behandlet med en lipidacyltransferase ifølge den foreliggende oppfinnelsen er mindre enn
mengden av fri fettsyre som produseres i den spiselige oljen når et annet enzym enn en
15
lipidacyltransferase ifølge den foreliggende oppfinnelsen hadde blitt anvendt, slik som f.eks.
sammenlignet med mengden av fri fettsyre som fremstilles når et konvensjonelt fosfolipaseenzym,
f.eks.
Lecitase
Ultra™
(Novozymes
A/S,
Danmark),
hadde
blitt
anvendt.
[0281] Begrepet "melk" som anvendt i dette dokumentet kan omfatte melk fra enten animalsk
eller vegetabilsk opprinnelse. Det er mulig å anvende melk fra animalske kilder, slik som bøffel,
20
(tradisjonell) ku, sau, geit osv. enten individuelt eller kombinert. Vegetabilsk melk, som f.eks.
soyamelk kan også anvendes, som regel i kombinasjon med animalsk melk, vanligvis ved en lav
prosentandel (av vegetabilsk melk) la oss si under 15 volum-%, eller under 20 volum-% eller under
25
volum-%.
Begrepet
melk
omfatter
fortrinnsvis
ikke
ost,
melk
og
fløte.
[0282] Begrepet "består i det vesentlige" som anvendt i dette dokumentet, når det refereres til et
25
produkt eller sammensetning, betyr fortrinnsvis at produktet eller sammensetningen, kan bestå av
andre produkter eller sammensetninger, men bare opp til en maksimal konsentrasjon på
fortrinnsvis 10 %, slik som 5 %, slik som 3 %, slik som 2 % eller 1 %, eller 0,5 % eller 0,1 %.
[0283] For enzymmodifiseringen av melk og/eller fløte kan det f.eks. være å foretrekke å anvende
en temperatur på mindre enn f.eks. omtrent 30 °C, hensiktsmessig mindre enn f.eks. 20 °C,
30
hensiktsmessig mindre enn f.eks. 10 °C. Det kan anvendes egnede temperaturer på mellom 1-30
°C,
slik
som
mellom
3-20
°C,
slik
som
mellom
1-10
°C.
[0284] Enzymet ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes med ett eller flere andre
egnede enzymer av næringsmiddelkvalitet. Innenfor omfanget til den foreliggende oppfinnelsen
tilsettes minst ett ytterligere enzym til matvaren, i tillegg til enzymet. Slike ytterligere enzymer
35
inkluderer stivelsesnedbrytende enzymer, slik som endo- eller eksoamylaser, pullulanaser,
NO/EP2190296
47
avforgreningsenzymer, hemicellulaser, inkludert xylanaser, cellulaser, oksidoreduktaser, f.eks.
peroksidaser, fenoloksidaser, glukoseoksidase, pyranoseoksidase, sulfhydryloksidase, eller en
karbohydratoksidase, slik som en som oksiderer maltose, f.eks. heksoseoksidase (HOX), lipaser,
fosfolipaser, glykolipaser, galaktolipaser og proteaser.
5
[0285] I en utførelsesform kan enzymet være Dairy HOX™, som virker som en oksygenfjerner for å
forlenge holdbarheten av ost og samtidig gi bruningskontroll i pizzaovner. I ett aspekt vedrører
derfor foreliggende offentliggjøring anvendelsen av et enzym som er i stand til å redusere
Maillard-reaksjonen i en matvare (se WO02/39828 innført i dette dokumentet ved referanse), slik
som et melkeprodukt, f.eks. ost, der enzymet fortrinnsvis er et maltoseoksiderende enzym, slik
10
som karbohydratoksidase, glukoseoksidase og/eller heksoseoksidase, i prosessen, eller
fremstillingen av et næringsmiddelmateriale og/eller matvare.
[0286] I en foretrukket utførelsesform anvendes lipidacyltransferasen i kombinasjon med en
lipase som har én eller flere av de følgende lipaseaktivitetene: glykolipaseaktivitet (E.C. 3.1.1.26,
triacylglyserollipaseativitet (E.C. 3.1.1.3), fosfolipase-A2-aktivitet (E.C. 3.1.1.4) eller fosfolipase-A1-
15
aktivitet (E.C. 3.1.1.32). Hensiktsmessig er lipolytiske enzymer godt kjent i teknikken og inkluderer
som eksempel de følgende lipolytiske enzymene: LIPOPAN® F og/eller LECITASE® ULTRA
(Novozymes A/S, Danmark), fosfolipase A2 (f.eks. fosfolipase A2 fra LIPOMOD™22L fra
Biocatalysts, LIPOMAX™ fra Genecor), LIPOLASE®(Novozymes A/S, Danmark), lipasene vist
i WO03/97835, EP 0 977 869 eller EP 1 193 314. Denne kombinasjonen av en lipidacyltransferase,
20
som definert i dette dokumentet og en lipase kan være særlig foretrukket i deigprodukter eller
bakte
produkter
eller
i
fine
matprodukter,
slik
som
kaker
og
konfekt.
[0287] I noen utførelsesformer kan det også være fordelaktig å kombinere anvendelsen av
lipidacyltransferase med lipolytiske enzymer, som løypepasta lagd av mager fra kalver, lam og
geitekje, eller Palatase A750L (Novo), Palatase M200L (Novo), Palatase M1000 (Novo) eller
25
Piccantase A (DSM), også Piccantase fra animalske kilder fra DSM (K, KL, L & C) eller Lipomod 187,
Lipomod 338 (Biocatalysts). Disse lipasene anvendes konvensjonelt i produksjonen av ost for å
fremstille ostesmaker. Disse lipasene kan også anvendes til å fremstille en enzymatisk modifisert
matvare, f.eks. et melkeprodukt (f.eks. ost), særlig der melkeproduktet består av, fremstilles fra
eller omfatter smørfett. En kombinasjon av lipidacyltransferasen med én eller flere av disse
30
lipasene kan ha en fordelaktig virkning på smaken i meieriproduktet (f.eks. ost for eksempel).
[0288] Anvendelsen av lipaser i kombinasjon med enzymet ifølge oppfinnelsen kan være spesielt
fordelaktig i tilfeller der noe opphopning av frie fettsyrer kanskje er ønskelig, f.eks. i ost, der de frie
fettsyrene kan gi en ønskelig smak, eller ved fremstilling av fine matvarer. Fagpersonen vil være i
stand til å kombinere andeler av lipolytiske enzymer, f.eks. LIPOPAN® F og/eller LECITASE® ULTRA
35
(Novozymes A/S, Danmark), fosfolipase A2 (f.eks. fosfolipase A2 fra LIPOMOD™ 22L fra
NO/EP2190296
48
Biocatalysts, LIPOMAX™ fra Genecor), LIPOLASE® (Novozymes A/S, Danmark), lipasene vist
i WO03/97835, EP 0 977 869 eller EP 1 193, 314 og lipidacyltransferasen for å gi det ønskede
forholdet mellom hydrolytisk og transferaseaktivitet som gir en foretrukket teknisk effekt eller
kombinasjon av tekniske effekter i matvaren (som f.eks. de som er oppført under 'Tekniske
5
effekter').
[0289] Det kan også være fordelaktig å kombinere anvendelsen av lipidacyltransferase med en
fosfolipase, slik som fosfolipase A1, fosfolipase A2, fosfolipase B, fosfolipase C og/eller fosfolipase
D.
[0290] Den kombinerte anvendelsen kan utføres sekvensielt eller samtidig, f.eks. kan
10
lipidacyltransferasebehandlingen forekomme før eller under den videre enzymbehandlingen.
Alternativt
kan
den
ytterligere
enzymbehandlingen
forekomme
før
eller
under
lipidacyltransferasebehandlingen.
[0291] I tilfellet med sekvensielle enzymbehandlinger, kan det i noen utførelsesformer være
fordelaktig å fjerne det første enzymet som anvendes, f.eks. ved varmedeaktivering, eller ved
15
anvendelse av et immobilisert enzym, før behandling med det andre (og/eller tredje osv.)
enzymet.
POSTTRANSKRIPSJONELLE OG POSTTRANSLASJONELLE MODIFISERINGER
[0292] Lipidacyltransferasen ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan hensiktsmessig kodes for av
hvilken
20
som
[0293] Avhengig
helst
av
av
nukleotidsekvensene
vertscellen
som
anvendes
lært
kan
i
dette
dokumentet.
posttranskripsjonelle
og/eller
posttranslasjonelle modifiseringer foretas. Det er tenkt at lipidacyltransferasen for anvendelse i de
foreliggende fremgangsmåtene og/eller anvendelsene omfatter lipide acyltransferaser som har
gjennomgått
posttranskripsjonell
og/eller
posttranslasjonell
modifisering.
[0294] Kun ved hjelp av eksempel gir uttrykkingen av nukleotidsekvensen vist i dette dokumentet
25
som SEQ ID No. 49 (se figur 57) i en vertscelle (slik som f.eks. Bacillus licheniformis)
posttranskripsjonelle og/eller posttranslasjonelle modifiseringer som fører til aminosyresekvensen
vist
i
dette
dokumentet
som
SEQ
ID
No.
68
(se
figur
73).
[0295] SEQ ID No. 68 er det samme som SEQ ID No. 16 (vist i figur 1 i dette dokumentet) bortsett
fra at SEQ ID No. 68 har gjennomgått en posttranslasjonell og/eller posttranskripsjonell
30
modifisering for å fjerne 38 aminosyrer.
ISOLERT
[0296] I ett aspekt er lipidacyltransferasen en gjenvunnet/isolert lipidacyltransferase. Dermed kan
den
produserte
lipidacyltransferasen
være
i
en
isolert
form.
[0297] I et annet aspekt kan nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase for
35
anvendelse
i
den
foreliggende
oppfinnelsen
være
i
en
isolert
form.
NO/EP2190296
49
[0298] Begrepet "isolert" betyr at sekvensen eller proteinet er i det minste i det vesentlige er fri
for minst én annen komponent som sekvensen eller proteinet er naturlig assosiert i naturen med,
og som finnes i naturen.
RENSET
5
[0299] I
ett
aspekt
kan
lipidacyltransferasen
være
i
en
renset
form.
[0300] I et annet aspekt kan nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase for
anvendelse
i
den
foreliggende
oppfinnelsen
være
i
en
renset
form.
[0301] Begrepet "renset" betyr at sekvensen er i en relativt ren tilstand - f.eks. minst omtrent 51
% ren, eller minst omtrent 75 %, eller minst omtrent 80 %, eller minst omtrent 90 % ren, eller
10
minst omtrent 95 % ren, eller minst omtrent 98 % ren.
KLONING AV EN NUKLEOTIDSEKVENS SOM KODER FOR ET POLYPEPTID IFØLGE DEN
FORELIGGENDE OPPFINNELSEN
[0302] En nukleotidsekvens som koder for enten et polypeptid som har de spesifikke
egenskapene som definert i dette dokumentet, eller et polypeptid som er egnet for modifisering,
15
kan isoleres fra enhver celle eller organisme som fremstiller polypeptidet. Forskjellige
fremgangsmåter
er
godt
kjente
i
teknikken
for
isolering
av
nukleotidsekvenser.
[0303] F.eks. kan et genomisk DNA- og/eller cDNA-bibliotek konstrueres ved hjelp av
kromosomalt DNA eller messenger-RNA fra organismen som fremstiller polypeptidet. Hvis
aminosyresekvensen til polypeptidet er kjent, kan de merkede oligonukleotidprobene syntetiseres
20
og anvendes til å identifisere polypeptidkodende kloner fra det genomiske biblioteket fremstilt fra
organismen. Alternativt kan en merket oligonukleotidprobe som inneholder sekvenser som er
homologe med et annet kjent polypeptidgen anvendes til å identifisere polypeptidkodende kloner.
I det sistnevnte tilfellet anvendes hybridiserings- og vaskebetingelser av lavere stringens.
[0304] Alternativt kan polypeptidkodende kloner identifiseres ved å sette inn fragmenter av
25
genomisk DNA inn i en uttrykkingsvektor, slik som et plasmid, og transformere enzym-negative
bakterier med det resulterende genomiske DNA-biblioteket, og deretter belegge de transformerte
bakteriene på agar inneholdende et enzym hemmet av polypeptidet, for derved å tillate kloner
som uttrykker polypeptidet som skal identifiseres.
[0305] I enda et ytterligere alternativ kan nukleotidsekvensen som koder for polypeptidet
30
fremstilles syntetisk ved etablerte standard fremgangsmåter, f.eks. fosforamidittfremgangsmåten
beskrevet av Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, s. 1859-1869, eller fremgangsmåten
beskrevet av Matthes et al (1984) EMBO J. 3, s. 801-805. I fosforamidittfremgangsmåten
syntetiseres oligonukleotidene, f.eks. i en automatisk DNA-syntetisator, renses, hybridiseres,
ligeres og klones i egnede vektorer.
NO/EP2190296
50
[0306] Nukleotidsekvensen kan være av blandet genomisk og syntetisk opprinnelse, blandet
syntetisk og cDNA-opprinnelse eller blandet genomisk og cDNA-opprinnelse, fremstilt ved å ligere
fragmenter av syntetisk, genomisk eller cDNA-opprinnelse (som hensiktsmessig) i samsvar med
standardteknikker. Hvert ligerte fragment tilsvarer forskjellige deler av hele nukleotidsekvensen.
5
DNA-sekvensen kan også fremstilles ved polymerasekjedereaksjon (PCR) under anvendelse av
spesifikke primere, f.eks. som beskrevet i US 4,683,202eller i Saiki R K et al (Science (1988) 239, s.
487-491).
NUKLEOTIDSEKVENSER
[0307] Den foreliggende oppfinnelsen omfatter også nukleotidsekvenser som koder for
10
polypeptider som har de spesifikke egenskapene som definert i dette dokumentet. Begrepet
"nukleotidsekvens" som anvendt i dette dokumentet refererer til en oligonukleotidsekvens eller
polynukleotidsekvens, og variant, homologer, fragmenter og derivater av disse (slik som deler av
disse). Nukleotidsekvensen kan være av genomisk eller syntetisk eller rekombinant opprinnelse,
som kan være dobbeltstrenget eller enkeltstrenget enten den representerer sense- eller
15
antisensestrengen.
[0308] Begrepet "nukleotidsekvens" i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen inkluderer
genomisk DNA, cDNA, syntetisk DNA og RNA. Det betyr fortrinnsvis DNA, mer foretrukket cDNA,
for den kodende sekvensen.
[0309] I en foretrukket utførelsesform dekker ikke nukleotidsekvensen i seg selv som koder for et
20
polypeptid som har de spesifikke egenskapene som definert i dette dokumentet, den naturlige
nukleotidsekvensen i sitt naturlige miljø når den bindes til sin(e) naturlig(e) tilhørende sekvens(er)
som er også er i dets/deres naturlige miljø. For letthets skyld skal vi kalle denne foretrukne
utførelsesformen den "ikke-naturlige nukleotidsekvensen". I dette henseendet betyr begrepet
"naturlig nukleotidsekvens" en hel nukleotidsekvens som er i sitt naturlige miljø og da den bindes
25
operativt til en hel promoter som den er naturlig forbundet med, er denne promoteren også i sitt
naturlige miljø. Dermed kan polypeptidet uttrykkes av en nukleotidsekvens i dens naturlige
organisme, men der nukleotidsekvensen ikke er under kontroll av promoteren som den er naturlig
forbundet med innenfor den organismen.
[0310] Fortrinnsvis er polypeptidet ikke et naturlig polypeptid. I dette henseendet betyr begrepet
30
"naturlig polypeptid" et helt polypeptid som er i sitt naturlige miljø og når det er blitt uttrykt av sin
naturlige nukleotidsekvens.
[0311] Vanligvis fremstilles nukleotidsekvensen, som koder for polypeptider som har de spesifikke
egenskapene som definert i dette dokumentet, ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker (dvs.
rekombinant DNA). I en alternativ utførelsesform kunne imidlertid nukleotidsekvensen
35
syntetiseres helt eller delvis, ved hjelp av kjemiske fremgangsmåter som er godt kjente i teknikken
NO/EP2190296
51
(se Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 og Horn T et al (1980) Nuc Acids Res
Symp Ser 225-232).
MOLEKYLÆR UTVIKLING
[0312] Når en enzymkodende nukleotidsekvens er blitt isolert, eller en antatt enzymkodende
5
nukleotidsekvens er blitt identifisert, kan det være ønskelig å modifisere den valgte
nukleotidsekvensen, det kan f.eks. være ønskelig å mutere sekvensen for å fremstille et enzym i
samsvar med den foreliggende oppfinnelsen.
[0313] Mutasjoner kan innføres ved hjelp av syntetiske oligonukleotider. Disse oligonukleotidene
inneholder
10
nukleotidsekvenser
som
flankerer
de
ønskede
mutasjonssetene.
[0314] En egnet fremgangsmåte er offentliggjort i Morinaga et al (Biotechnology (1984) 2, s. 646649). En annen fremgangsmåte for å innføre mutasjoner i enzymkodende nukleotidsekvenser er
beskrevet
i
Nelson
and
Long
(Analytical
Biochemistry
(1989),
180,
s.
147-151).
[0315] I stedet for seterettet mutagenese, slik som beskrevet ovenfor, kan man innføre
mutasjoner vilkårlig f.eks. ved hjelp av et kommersielt sett, slik som GeneMorph PCR15
mutagenesesettet fra Stratagene, eller det tilfeldige mutagenesesettet Diversity PCR fra
Clontech. EP 0 583 265 refererer til fremgangsmåter for å optimalisere PCR-basert mutagenese,
som også kan kombineres med anvendelsen av mutagene DNA-analoger som f.eks. de som er
beskrevet i EP 0 866 796. Feilutsatt PCR-teknologi er egnet til fremstilling av varianter av
lipidacyltransferaser med foretrukne karakteristikker. WO0206457 refererer til molekylær
20
utvikling av lipaser.
[0316] En tredje fremgangsmåte for å oppnå nye sekvenser er å fragmentere ikke-identiske
nukleotidsekvenser, enten ved hjelp av en rekke restriksjonsenzymer eller et enzym, slik som
Dnase I, og gjenoppbygging av fulle nukleotidsekvenser som koder for funksjonelle proteiner.
Alternativt kan man anvende én eller flere ikke-identiske nukleotidsekvenser og innføre
25
mutasjoner under gjenoppbyggingen av den fulle nukleotidsekvensen. DNA-omstokkings- og
familieomstokkingsteknologier er egnet til fremstilling av varianter av lipidacyltransferaser med
foretrukne karakteristikker. Egnede fremgangsmåter for å utføre 'omstokking' kan finnes i EPO 752
008, EP1 138 763, EP1 103 606. Omstokking kan også kombineres med andre former for DNAmutagenese som beskrevet i US 6,180,406 og WO 01/34835.
30
[0317] Det er dermed mulig å fremstille tallrike seterettede eller tilfeldige mutasjoner i en
nukleotidsekvens, enten in vivo eller in vitro, og deretter å screene for forbedret funksjonalitet av
det kodede polypeptidet på forskjellige måter. Ved anvendelse av in silico- og exo-formidlede
rekombinasjonsfremgangsmåter (se WO 00/58517, US 6,344,328, US 6,361,974), kan f.eks.
molekylær utvikling utføres der den fremstilte varianten har svært lav homologi med kjente
NO/EP2190296
52
enzymer eller proteiner. Slike derved oppnådde varianter kan ha betydelig strukturell analogi med
kjente transferaseenzymer, men har meget lav aminosyresekvenshomologi.
[0318] Som et ikke-begrensende eksempel kan i tillegg mutasjoner eller naturlige varianter av en
polynukleotidsekvens rekombineres med enten villtypen eller andre mutasjoner eller naturlige
5
varianter for å fremstille nye varianter. Slike nye varianter kan også screenes for forbedret
funksjonalitet av polypeptidet det kodes for.
[0319] Anvendelsen av de ovennevnte og tilsvarende molekylære utviklingsfremgangsmåtene
tillater identifisering og valg av varianter av enzymene ifølge foreliggende oppfinnelse som er
foretrukne karakteristikker uten forutgående kjennskap til proteinstruktur eller funksjon, og
10
tillater produksjon av ikke-forutsigbare, men fordelaktige mutasjoner eller varianter. Det finnes
mange eksempler på anvendelsen av molekylær utvikling i teknikken for optimalisering eller
endring av enzymaktivitet, slike eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til ett eller flere av
følgende: optimalisert uttrykking og/eller aktivitet i en vertscelle eller in vitro, økt enzymatisk
aktivitet, endret substrat- og/eller produktspesifisitet, økt eller redusert enzymatisk eller
15
strukturell stabilitet, endret enzymatisk aktivitet/spesifisitet i foretrukne miljøforhold, f.eks.
temperatur, pH, substrat.
[0320] Som det vil være åpenbart for en fagperson på området, kan anvendelse av molekylære
utviklingsverktøy for et enzym endres for å forbedre funksjonaliteten til enzymet.
[0321] Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase som anvendes i foreliggende
20
oppfinnelse
kan
hensiktsmessig
kode
for
en
variantlipidacyltransferase,
dvs.
at
lipidacyltransferasen kan inneholde minst én aminosyresubstitusjon, sletting eller tilsetning, i
forhold til et moderenzym. Variantenzymer har igjen minst 1 %, 2 %, 3 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30
%, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % homologi med moderenzymet. Egnede
moderenzymer kan inkludere ethvert enzym med esterase- eller lipaseaktivitet. Fortrinnsvis
25
sammenstilles
moderenzymet
med
pfam00657-konsensussekvensen.
[0322] I en foretrukket utførelsesform har eller inkorporerer et variantlipidacyltransferaseenzym
minst ett eller flere av pfam00657-konsensussekvensaminosyrerestene funnet i GDSx-, GANDY- og
HPT-blokkene.
[0323] Enzymer, slik som lipaser med ingen eller lav lipidacyltransferaseaktivitet i et vandig miljø
30
kan muteres ved anvendelse av molekylære utviklingsverktøy for å innføre eller forbedre
transferaseaktiviteten, for derved å gi et lipidacyltransferaseenzym med sterk transferaseaktivitet
egnet for anvendelse i sammensetningene og fremgangsmåtene ifølge den foreliggende
offentliggjøringen.
[0324] Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som
35
helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan
NO/EP2190296
53
hensiktsmessig kode for en lipidacyltransferase som kan være en variant med forbedret
enzymaktivitet på polare lipider, fortrinnsvis fosfolipider og/eller glykolipider sammenlignet med
moderenzymet. Slike varianter har fortrinnsvis også liten eller ingen aktivitet på lysopolare lipider.
Den forbedrede aktiviteten på polare lipider, fosfolipider og/eller glykolipider kan være resultatet
5
av
hydrolyse
og/eller
transferaseaktivitet
[0325] Variantlipidacyltransferaser
kan
ha
eller
redusert
en
kombinasjon
aktivitet
på
av
begge.
triglyserider,
og/eller
monoglyserider og/eller diglyserider, sammenlignet med moderenzymet.
[0326] Variantenzymet kan hensiktsmessig ha ingen aktivitet på triglyserider og/eller
monoglyserider og/eller diglyserider.
10
[0327] Alternativt kan variantenzymet ha økt aktivitet på triglyserider, og/eller kan også ha økt
aktivitet på én eller flere av de følgende: polare lipider, fosfolipider, lecitin, fosfatidylkolin,
glykolipider, digalaktosylmonoglyserid, monogalaktosylmonoglyserid.
[0328] Varianter av lipidacyltransferaser er kjent, og én eller flere slike varianter kan være egnet
for anvendelse i fremgangsmåtene og anvendelsene ifølge foreliggende oppfinnelse og/eller i
15
enzymsammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Kun som eksempel kan varianter
av lipidacyltransferaser beskrevet i de følgende referansene anvendes i samsvar med den
foreliggende oppfinnelsen: Hilton & Buckley J Biol. Chem. 15. jan. 1991: 266 (2): 9971000; Robertson et al J. Biol. Chem. 21. jan. 1994; 269(3):2146-50; Brumlik et al J. Bacteriol 1996
Apr; 178 (7): 2060-4;Peelman et al Protein Sci. mars 1998; 7(3):587-99.
20
AMINOSYRESEKVENSER
[0329] Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelsen av aminosyresekvensene kodet for
av en nukleotidsekvens som koder for en lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som helst av
fremgangsmåtene
og/eller
anvendelsene
ifølge
den
foreliggende
oppfinnelsen.
[0330] Som anvendt i dette dokumentet er begrepet "aminosyresekvens" synonymt med
25
begrepet "polypeptid" og/eller begrepet "protein". I noen tilfeller er begrepet "aminosyresekvens"
synonymt med begrepet "peptid".
[0331] Aminosyresekvensen kan fremstilles/isoleres fra en egnet kilde, eller den kan lages
syntetisk
eller
fremstilles
ved
anvendelse
av
rekombinante
DNA-metoder.
[0332] Aminosyresekvensene kan hensiktsmessig oppnås fra de isolerte polypeptidene vist i dette
30
dokumentet ved standardteknikker.
[0333] En egnet fremgangsmåte for bestemmelse av aminosyresekvenser fra isolerte
polypeptider er som følger:
[0334] Renset polypeptid kan frysetørkes og 100 µg av det frysetørkede materialet kan løses opp i
50 µl av en blanding av 8 M urea og 0,4 M ammoniumhydrogenkarbonat, pH 8,4. Det oppløste
35
proteinet kan denatureres og reduseres i 15 minutter ved 50 °C etter overlegg med nitrogen og
NO/EP2190296
54
tilsetning av 5 µl 45 mM ditiotreitol. Etter avkjøling til romtemperatur kan det tilsettes 5 µl 100
mM jodacetamid for cysteinrestene som skal derivatiseres i 15 minutter ved romtemperatur i
mørket under nitrogen.
[0335] 135 µl vann og 5 µg endoproteinase Lys-C i 5 µl vann kan tilsettes til den ovennevnte
5
reaksjonsblandingen og fordøyelsen kan utføres ved 37 °C under nitrogen i 24 timer.
[0336] De resulterende peptidene kan separeres ved reversfase-HPLC på en VYDAC C18-kolonne
(0,46 x 15 cm; 10 µm; The Separation Group, California, USA) ved anvendelse av løsningsmiddel A:
0,1 % TFA i vann og løsningsmiddel B: 0,1 % TFA i acetonitril. Valgte peptider kan
rekromatograferes
10
på
en
Develosil
C18-kolonne
ved
anvendelse
av
det
samme
løsningsmiddelsystemet, før N-endesekvensering. Sekvensering kan utføres ved anvendelse av en
Applied Biosystems 476A-sekvenserer ved anvendelse av raske sykluser med pulserende væske
ifølge produsentens instruksjoner (Applied Biosystems, California, USA).
SEKVENSIDENTITET ELLER SEKVENSHOMOLOGI
[0337] Her betyr begrepet "homolog" en enhet som har en viss homologi med de foreliggende
15
aminosyresekvensene og de foreliggende nukleotidsekvensene. Her kan begrepet "homologi"
likestilles med "identitet".
[0338] Den homologe aminosyresekvensen og/eller nukleotidsekvensen bør gi og/eller kode for
et polypeptid som beholder den funksjonelle aktiviteten og/eller øker aktiviteten til enzymet.
[0339] I den foreliggende sammenhengen regnes en homolog sekvens for å inkludere en
20
aminosyresekvens som kan være minst 75, 85 eller 90 % identisk, fortrinnsvis minst 95 eller 98 %
identisk med den foreliggende sekvensen. Vanligvis vil homologene omfatte de samme aktive
setene osv. som den foreliggende aminosyresekvensen. Selv om homologi også kan vurderes med
hensyn på likhet (dvs. aminosyrerester som har lignende kjemiske egenskaper/funksjoner), er det
foretrukket å uttrykke homologi med hensyn på sekvensidentitet i sammenheng med den
25
foreliggende oppfinnelsen.
[0340] I den foreliggende sammenhengen regnes en homolog sekvens for å inkludere en
aminosyresekvens som kan være minst 75, 85 eller 90 % identisk, fortrinnsvis minst 95 eller 98 %
identisk med en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid (den foreliggende sekvensen).
Vanligvis vil homologene omfatte de samme sekvensene som koder for de aktive setene osv. som
30
den foreliggende sekvensen. I sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen er det foretrukket
å uttrykke homologi med hensyn på sekvensidentitet selv om homologi også kan vurderes med
hensyn på likhet (dvs. aminosyrerester som har lignende kjemiske egenskaper/funksjoner).
[0341] Homologisammenligninger kan utføres av øyet, eller mer vanlig, ved hjelp av lett
tilgjengelige sekvenssammenligningsprogram. Disse kommersielt tilgjengelige dataprogrammene
35
kan beregne % homologi mellom to eller flere sekvenser.
NO/EP2190296
55
[0342] Prosent homologi kan beregnes over sammenhengende sekvenser, dvs. at en sekvens
sammenstilles med den andre sekvensen, og hver aminosyre i en sekvens sammenlignes direkte
med den tilsvarende aminosyren i den andre sekvensen, én rest av gangen. Dette kalles en
sammenstilling "uten mellomrom". Vanligvis utføres slike sammenstillinger uten mellomrom bare
5
over et forholdsvis kort antall rester.
[0343] Selv om dette er en meget enkel og konsistent fremgangsmåte, mislykkes den i å ta hensyn
til at for eksempel i et ellers identisk par av sekvenser, vil en innsetting eller sletting få de følgende
aminosyrerestene til å bli satt ut av sammenstilling, og dermed potensielt føre til en stor reduksjon
i % homologi når det utføres en global sammenstilling. Følgelig utformes de fleste
10
sekvenssammenligningsfremgangsmåtene for å fremstille optimale sammenstillinger som tar
hensyn til mulige innsettinger og slettinger uten å straffe den totale homologiscoren utilbørlig.
Dette oppnås ved å sette inn "mellomrom" i sekvenssammenstillingen for å forsøke å maksimere
lokal homologi.
[0344] Imidlertid tildeler disse mer komplekse fremgangsmåtene "mellomromstraffer" til hvert
15
mellomrom som forekommer i sammenstillingen slik at en sekvenssammenstilling med så få
mellomrom som mulig, for det samme antallet identiske aminosyrer, - på grunn av økt slektskap
mellom de to sammenlignede sekvensene - vil oppnå en høyere score enn en med mange
mellomrom. Det anvendes vanligvis "affine mellomromskostnader" som krever en relativt høy pris
for eksistensen av et mellomrom og en mindre straff for hver påfølgende rest i mellomrommet.
20
Dette er det mest anvendte mellomromscoresystemet. Høye mellomromstraffer vil selvsagt gi
optimaliserte sammenstillinger med færre mellomrom. De fleste sammenstillingsprogrammene
tillater endring av mellomromstraffene. Det er imidlertid foretrukket å anvende standardverdiene
ved anvendelse av slik programvare for sekvenssammenligninger.
[0345] Beregning av maksimal % homologi krever derfor først produksjon av en optimal
25
sammenstilling, med hensyn på mellomromstraffer. Et datamaskinprogram som er egnet til å
utføre en slik sammenstilling er Vector NTI (Invitrogen Corp.). Eksempler på annen programvare
som kan utføre sekvenssammenligninger inkluderer, men er ikke begrenset til, BLAST-pakken
(se Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4. utg. - kapittel 18), og FASTA
(Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410). Både BLAST og FASTA er tilgjengelig for offline- og
30
onlinesøking (Ausubel et al 1999, s. 7-58 til 7-60). For noen anvendelser er det imidlertid
foretrukket å anvende Vector-NTI-programmet. Et nytt verktøy, kalt "BLAST 2 Sequences" er også
tilgjengelig for sammenligning av protein- og nukleotidsekvens (se FEMS Microbiol Lett 1999
174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 og [email protected]).
[0346] Selv om den endelige % homologien kan måles med hensyn på identitet, er vanligvis ikke
35
sammenstillingsprosessen i seg selv basert på en alt-eller-ingenting-parsammenligning. I stedet
NO/EP2190296
56
anvendes generelt en skalert likhetsscorematrise som tildeler poeng til hver parvise
sammenligning basert på kjemisk likhet eller evolusjonær avstand. Et eksempel på en slik matrise
som vanligvis anvendes er BLOSUM62-matrisen - standardmatrisen for BLAST-pakken av
programmer. Vector-NTI-programmene anvender vanligvis enten de offentlige standardverdiene
5
eller en egendefinert symbolsammenligningstabell hvis de følger med (se bruksanvisningen for
mer informasjon). For noen anvendelser er det foretrukket å anvende standardverdiene for
Vector-NTI-pakken.
[0347] Alternativt
kan
prosent
homologi
beregnes
ved
anvendelse
av
flersammenstillingsfunksjonen i Vector NTI (Invitrogen Corp.), basert på en algoritme, analogt med
10
CLUSTAL
(Higgins
DG
&
Sharp
PM
(1988),
Gene
73(1),
237-244).
[0348] Når programvaren har fremstilt en optimal sammenstilling, er det mulig å beregne %
homologi, fortrinnsvis % sekvensidentitet. Programvaren gjør vanligvis dette som en del av
sekvenssammenligningen
og
genererer
et
numerisk
resultat.
[0349] Dersom mellomromstraffer anvendes når man skal avgjøre sekvensidentitet, anvendes
15
fortrinnsvis de følgende parameterne for parvis sammenstilling:
FOR BLAST
ÅPENT MELLOMROM
0
UTVIDET MELLOMROM
0
FOR CLUSTAL
DNA
PROTEIN
ORDSTØRRELSE
2
1
MELLOMROMSSTRAFF
15
10
UTVIDET MELLOMROM
6,66
0,1
K-trippel
[0350] I én utførelsesform bestemmes fortrinnsvis sekvensidentiteten for nukleotidsekvensene
ved anvendelse av CLUSTAL med mellomromstraff- og mellomromutvidelsen som definert
ovenfor.
20
[0351] Graden av identitet med hensyn på en nukleotidsekvens bestemmes hensiktsmessig over
minst 20 sammenhengende nukleotider, fortrinnsvis over minst 30 sammenhengende nukleotider,
fortrinnsvis over minst 40 sammenhengende nukleotider, fortrinnsvis over minst 50
NO/EP2190296
57
sammenhengende nukleotider, fortrinnsvis over minst 60 sammenhengende nukleotider,
fortrinnsvis over minst 100 sammenhengende nukleotider.
[0352] Graden av identitet med hensyn på en nukleotidsekvens kan hensiktsmessig bestemmes
over hele sekvensen.
5
[0353] I en utførelsesform kan graden av aminosyresekvensidentitet ifølge den foreliggende
oppfinnelsen hensiktsmessig bestemmes ved hjelp av datamaskinprogrammer kjent i teknikken,
som f.eks. Vector NTI 10 (Invitrogen Corp.). For parvis sammenstilling er matrisen som anvendes
fortrinnsvis BLOSUM62 med mellomromåpningsstraff på 10,0 og mellomromforlengelsesstraff på
0,1.
10
[0354] Graden av identitet med hensyn på en aminosyresekvens bestemmes hensiktsmessig over
minst 20 sammenhengende aminosyrer, fortrinnsvis over minst 30 sammenhengende aminosyrer,
fortrinnsvis over minst 40 sammenhengende aminosyrer, fortrinnsvis over minst 50
sammenhengende aminosyrer, fortrinnsvis over minst 60 sammenhengende aminosyrer.
[0355] Graden av identitet med hensyn på en aminosyresekvens kan hensiktsmessig bestemmes
15
over hele sekvensen.
[0356] Sekvensene kan også ha slettinger, innsettinger eller substitusjoner av aminosyrerestene
som fremstiller en stille forandring og gir en funksjonell ekvivalent substans. Bevisste
aminosyresubstitusjoner kan foretas på basis av likhet i polaritet, ladning, oppløselighet,
hydrofobisitet, hydrofilisitet og/eller den amfipatiske egenskapen til restene så lenge den
20
sekundære bindingsaktiviteten til stoffet beholdes. Negativt ladde aminosyrer inkluderer
fortrinnsvis asparaginsyre og glutaminsyre; positivt ladde aminosyrer inkluderer lysin og arginin;
og aminosyrer med uladde polare hodegrupper som har lignende hydrofilitetsverdier inkluderer
leucin, isoleucin, valin, glycin, alanin, asparagin, glutamin, serin, treonin, fenylalanin og tyrosin.
[0357] Konservative substitusjoner kan foretas f.eks. ifølge tabellen nedenfor. Aminosyrer i den
25
samme blokken i den andre kolonnen og fortrinnsvis i den samme linjen i den tredje kolonnen kan
erstatte hverandre:
ALIFATISK
Ikke-polar
GAP
ILV
Polar - uladd
CSTM
NQ
Polar - ladd
DE
NO/EP2190296
58
KR
AROMATISK
HFWY
[0358] Den foreliggende offentliggjøringen omfatter også homolog substitusjon (substitusjon og
erstatning anvendes begge i dette dokumentet som å bety utvekslingen av en eksisterende
aminosyrerest, med en alternativ rest) som kan forekomme, dvs. like-for-like-substitusjon som
f.eks. basisk for basisk, sur for sur, polar for polar osv. Ikke-homolog substitusjon kan også
5
forekomme, f.eks. fra én klasse av resten til en annen eller alternativt involvere inkludering av
unaturlige aminosyrer, slik som ornitin (heretter referert til som Z), diaminosmørsyreornitin
(heretter referert til som B), norleucinornitin (heretter referert til som O), pyridylalanin,
tienylalanin, naftylalanin og fenylglysin.
[0359] Erstatninger
10
kan
også
foretas
av
unaturlige
aminosyrer.
[0360] Variantaminosyresekvenser kan inkludere egnede avstandsstykkegrupper som kan settes
inn mellom hvilke som helst to aminosyrerester i sekvensen, inkludert alkylgrupper, slik som
metyl-, etyl- eller propylgrupper, i tillegg til aminosyreavstandsstykker, slik som glysin- eller βalaninrester. En ytterligere form for variasjon som involverer nærværet av én eller flere
aminosyrerester i peptoidform, vil være godt forstått av fagfolk på området. For å unngå tvil
15
anvendes
"peptoidformen"
for
å
referere
til
variantaminosyrerester,
der
α-karbon-
substituentgruppen er på restens nitrogenatom i stedet for α-karbonet. Prosesser for fremstilling
av peptider i peptoidformen er kjent i teknikken, f.eks. Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 93679371 og Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
[0361] Nukleotidsekvenser for anvendelse i foreliggende oppfinnelse eller som koder for et
20
polypeptid som har de spesifikke egenskapene som er definert i dette dokumentet, kan inkludere
syntetiske eller modifiserte nukleotider innenfor dem. En rekke forskjellige typer av modifiseringer
til oligonukleotider er kjent i teknikken. Disse inkluderer metylfosfonat- og fosfortioatryggrader
og/eller tilsetning av akridin- eller polylysinkjeder ved 3'- og/eller 5'-endene i molekylet. For
formålene ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det underforstått at nukleotidsekvensene
25
beskrevet i dette dokumentet kan modifiseres av hvilken som helst fremgangsmåte tilgjengelig i
teknikken. Slike modifiseringer kan utføres for å øke in vivo-aktiviteten eller levetiden til
nukleotidsekvensene.
[0362] Den foreliggende oppfinnelsen omfatter også anvendelse av nukleotidsekvenser som er
komplementære med sekvensene omtalt i dette dokumentet, eller hvilket som helst derivat,
30
fragment eller derivat av disse. Hvis sekvensen er komplementær med et fragment av denne kan
NO/EP2190296
59
den sekvensen anvendes som en probe for å identifisere tilsvarende kodende sekvenser i andre
organismer osv.
[0363] Polynukleotider som ikke er 100 % homologe med sekvensene kan oppnås på en rekke
måter. Andre varianter av sekvensene beskrevet i dette dokumentet kan oppnås f.eks. ved å probe
5
DNA-biblioteker laget fra en rekke individer, f.eks. individer fra forskjellige populasjoner. I tillegg
kan andre virale/bakterielle eller cellulære homologer, særlig cellulære homologer som finnes i
pattedyrceller (f.eks. rotte-, mus-, storfe- og primatceller), oppnås og slike homologer og
fragmenter av disse vil generelt være i stand til selektivt å hybridisere til sekvensene vist i
sekvenslisten i dette dokumentet. Slike sekvenser kan oppnås ved å probe cDNA-biblioteker laget
10
fra eller genomiske DNA-biblioteker fra andre dyrearter, og probe slike biblioteker med prober
omfattende hele eller en del av hvilken som helst av sekvensene i de vedlagte sekvenslistene
under forhold med middels til høy stringens. Tilsvarende vurderinger gjelder for å oppnå
artshomologer
og
alleliske
varianter
av
polypeptid-
eller
nukleotidsekvensene.
[0364] Varianter og stamme-/artshomologer kan også oppnås ved anvendelse av degenerert PCR
15
som vil anvende primere utformet for å målrette sekvenser innenfor variantene og homologene
som koder for konserverte aminosyresekvenser i sekvensene. Konserverte sekvenser kan forutses,
f.eks.
ved
å
sammenstille
aminosyresekvensene
fra
flere
varianter/homologer.
Sekvenssammenstillinger kan utføres ved hjelp av datamaskinprogramvare kjent i teknikken. F.eks.
er GCG Wisconsin PileUp-programmet anvendt mye.
20
[0365] Primerne som anvendes i degenerert PCR vil inneholde én eller flere degenererte
posisjoner og vil anvendes ved stringensforhold som er lavere enn de som anvendes for kloning av
sekvenser
med
enkle
sekvensprimere
mot
kjente
sekvenser.
[0366] Slike polynukleotider kan alternativt oppnås ved seterettet mutagenese av karakteriserte
sekvenser. Dette kan være nyttig der f.eks. stille kodonsekvensendringer kreves for å optimalisere
25
kodonpreferanser for en bestemt vertscelle som polynukleotidsekvensene uttrykkes i. Andre
sekvensendringer kan være ønskelig for å innføre restriksjonspolypeptidgjenkjenningsseter, eller
for å endre egenskapen eller funksjonen til polypeptidene kodet for av polynukleotidene.
[0367] Polynukleotider (nukleotidsekvenser) kan anvendes til å fremstille en primer, f.eks. en PCRprimer, en primer for en alternativ forsterkningsreaksjon, en probe f.eks. merket med en
30
avslørende etikett på konvensjonell måte ved hjelp av radioaktive eller ikke-radioaktive merker,
eller polynukleotidene kan klones inn i vektorer. Slike primere, prober og andre fragmenter vil
være minst 15, fortrinnsvis minst 20, f.eks. minst 25, 30 eller 40 nukleotider i lengde, og er også
omfattet
av
begrepet
polynukleotider
som
anvendt
i
dette
dokumentet.
[0368] Polynukleotider som f.eks. DNA-polynukleotider og prober ifølge oppfinnelsen kan
NO/EP2190296
60
produseres rekombinant, syntetisk, eller på hvilken som helst måte som er tilgjengelige for fagfolk
på området. De kan også klones ved standardteknikker.
0369] Primere vil generelt fremstilles syntetisk, som involverer en trinnvis fremstilling av den
ønskede nukleinsyresekvensen med ett nukleotid av gangen. Teknikker for å oppnå dette ved hjelp
5
av automatiserte teknikker er lett tilgjengelige i faget.
[0370] Lengre polynukleotider vil generelt fremstilles ved hjelp av rekombinante fremgangsmåter,
f.eks. ved hjelp av PCR-kloningsmetoder (eng.: PCR (polymerase chain reaction)). Dette vil
involvere å fremstille et primerpar (f.eks. på omtrent 15 til 30 nukleotider) som flankerer en region
av lipidmålsekvensen som det er ønskelig å klone, bringe primerne i kontakt med mRNA eller cDNA
10
oppnådd fra en dyre- eller menneskecelle, og utføre en polymerasekjedereaksjon under forhold
som fører frem til forsterkning av den ønskede regionen, isolere det forsterkede fragmentet (f.eks.
ved å rense reaksjonsblandingen på en agarosegel) og gjenvinne det forsterkede DNA. Primerne
kan utformes til å inneholde egnede restriksjonsenzymgjenkjenningsseter slik at det forsterkede
DNA kan klones inn i en egnet kloningsvektor.
15
HYBRIDISERING
[0371] Foreliggende
oppfinnelse
omfatter
også
anvendelsen
av
sekvenser
som
er
komplementære med sekvensene ifølge den foreliggende oppfinnelsen eller sekvenser som er i
stand til å hybridisere enten til sekvensene eller til sekvenser som er komplementære med disse.
[0372] Begrepet "hybridisering" som anvendt i dette dokumentet skal inkludere "prosessen
20
hvorved en streng av nukleinsyre kobles med en komplementær streng gjennom baseparring"
samt
forsterkningsprosessen
som
utføres
i
polymerasekjedereaksjon-(PCR)-teknologier.
[0373] Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelsen av nukleotidsekvenser som er i stand
til å hybridisere til sekvensene som er komplementære med de foreliggende sekvensene omtalt i
dette dokumentet, eller hvilket som helst derivat, fragment eller derivat av disse.
25
[0374] Foreliggende offentliggjøring omfatter også sekvenser som er komplementære med
sekvenser som er i stand til å hybridisere til nukleotidsekvensene diskutert her.
[0375] Hybridiseringsbetingelser
er
basert
på
smeltetemperaturen
(Tm)
for
det
nukleotidbindende komplekset, som vist i Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning
Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA), og gir en definert
30
"stringens" som forklart nedenfor.
[0376] Maksimal stringens forekommer vanligvis ved omtrent Tm-5 °C (5 °C lavere enn Tm for
proben); høy stringens ved omtrent 5 °C til 10 °C under Tm; middels stringens på omtrent 10 °C til
20 °C under Tm; og lav stringens på omtrent 20 °C til 25 °C under Tm. Som det vil bli forstått av
fagfolk, kan en maksimal hybridiseringsstringens anvendes til å identifisere eller detektere
35
identiske nukleotidsekvenser, mens en middels (eller lav) stringenshybridisering kan anvendes til å
NO/EP2190296
61
identifisere
eller
detektere
lignende
eller
beslektede
polynukleotidsekvenser.
[0377] Den foreliggende oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis anvendelse av sekvenser som er
komplementære med sekvenser som er i stand til å hybridisere under høye stringensforhold eller
middels stringensforhold til nukleotidsekvenser som koder for polypeptider som har de spesifikke
5
egenskapene som definert i dette dokumentet.
[0378] Den foreliggende oppfinnelsen omfatter mer foretrukket anvendelse av sekvenser som er
komplementære med sekvenser som er i stand til å hybridisere under høye stringensforhold (f.eks.
65 °C og 0,1 x SSC {1xSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-citrat pH 7,0}) til nukleotidsekvenser som
koder for polypeptider som har de spesifikke egenskapene som definert i dette dokumentet.
10
[0379] Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelsen av nukleotidsekvenser som kan
hybridisere til nukleotidsekvensene omtalt i dette dokumentet (inkludert komplementære
sekvenser
med
de
som
er
omtalt
i
dette
dokumentet).
[0380] Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelsen av nukleotidsekvenser som er
komplementære med sekvenser som kan hybridisere til nukleotidsekvenser omtalt i dette
15
dokumentet
(inkludert
komplementære
sekvenser
av
de
som
er
diskutert
her).
[0381] Innenfor omfanget ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det også inkludert anvendelsen
av polynukleotidsekvenser som er i stand til å hybridisere til nukleotidsekvensene diskutert her
under forhold av middels til maksimal stringens.
[0382] I et foretrukket aspekt dekker den foreliggende oppfinnelsen anvendelse av
20
nukleotidsekvenser som kan hybridisere til nukleotidsekvensene diskutert her, eller komplementet
av
disse,
under
stringente
betingelser
(f.eks.
50
°C
og
0,2
x
SSC).
[0383] I et mer foretrukket aspekt dekker den foreliggende oppfinnelsen anvendelse av
nukleotidsekvenser som kan hybridisere til nukleotidsekvensene omtalt i dette dokumentet, eller
komplementet av disse, under høye stringensforhold (f.eks. 65 °C og 0,1 x SSC).
25
UTTRYKKING AV POLYPEPTIDER
[0384] En nukleotidsekvens for anvendelse i foreliggende oppfinnelse eller som koder for et
polypeptid som har de spesifikke egenskapene som definert i dette dokumentet kan føres inn i en
rekombinant replikerbar vektor. Vektoren kan anvendes til å replikere og uttrykke
nukleotidsekvensen, i polypeptidform, i og/eller fra en kompatibel vertscelle. Uttrykking kan styres
30
ved
hjelp
av
kontrollsekvenser
som
inkluderer
promoterer/forsterkere
og
andre
uttrykkingsregulerende signaler. Det kan anvendes prokaryote promoterer og promoterer som er
funksjonelle i eukaryote celler. Det kan anvendes vevsspesifikke eller stimulispesifikke promoterer.
Det kan også anvendes kimære promoterer omfattende sekvenselementer fra to eller flere
forskjellige promoterer beskrevet ovenfor.
NO/EP2190296
62
[0385] Polypeptidet som fremstilles av en vertscelle ved uttrykking av nukleotidsekvensen kan
skilles ut eller kan inneholdes intracellulært avhengig av sekvensen og/eller vektoren som
anvendes. De kodende sekvensene kan utformes med signalsekvenser som dirigerer utskillelse av
de stoffkodende sekvensene gjennom en bestemt prokaryot eller eukaryot cellemembran.
5
KONSTRUKTER
[0386] Begrepet "konstrukt" - som er synonymt med begrep som "konjugat", "kassett" og
"hybrid" - inneholder en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som har de spesifikke
egenskapene som definert i dette dokumentet for anvendelse ifølge den foreliggende
oppfinnelsen direkte eller indirekte festet til en promoter. Et eksempel på en indirekte festing er
10
bestemmelsen av en egnet avstandsgruppe, slik som en intronsekvens, slik som Sh1-intronet eller
ADH-intronet, mellom promoteren og nukleotidsekvensen. Det samme gjelder for begrepet
"sammensmeltet" i forhold til den foreliggende oppfinnelsen som inkluderer direkte eller indirekte
festing. I noen tilfeller dekker ikke begrepene den naturlige kombinasjonen av nukleotidsekvensen
som koder for proteinet som vanligvis forbindes med villtypegenpromoteren og når de begge
15
befinner seg i sitt naturlige miljø.
[0387] Konstruktet kan også inneholde eller uttrykke en markør som muliggjør valget av det
genetiske konstruktet.
[0388] For noen anvendelser omfatter konstruktet fortrinnsvis minst en nukleotidsekvens eller en
nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som har de spesifikke egenskapene som definert i
20
dette dokumentet operativt bundet til en promoter.
ORGANISME
[0389] Begrepet "organisme" i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen inkluderer hvilken
som helst organisme som kan omfatte en nukleotidsekvens ifølge den foreliggende oppfinnelsen
eller en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som har de spesifikke egenskapene som
25
definert
i
dette
dokumentet
og/eller
produkter
oppnådd
derfra.
[0390] Begrepet "transgen organisme" i forhold til den foreliggende oppfinnelsen inkluderer
hvilken som helst organisme som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som
har de spesifikke egenskapene som definert i dette dokumentet og/eller produktene oppnådd
derfra, og/eller der en promoter kan tillate uttrykking av nukleotidsekvensen som koder for et
30
polypeptid som har de spesifikke egenskapene som definert i dette dokumentet i den organismen.
Nukleotidsekvensen
innføres
fortrinnsvis
i
genomet
til
organismen.
[0391] Begrepet "transgen organisme" dekker ikke naturlige nukleotidkodende sekvenser i sitt
naturlige miljø når de er under kontroll av sin naturlige promoter som også er i sitt naturlige miljø.
[0392] Derfor inkluderer den transgene organismen en organisme omfattende hvilken som helst
35
av, eller kombinasjoner av, en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som har de spesifikke
NO/EP2190296
63
egenskapene som definert i dette dokumentet, konstrukter som definert i dette dokumentet,
vektorer som definert i dette dokumentet, plasmider som definert i dette dokumentet, celler som
definert i dette dokumentet eller produktene av disse. F.eks. kan den transgene organismen også
omfatte en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som har de spesifikke egenskapene som
5
definert i dette dokumentet under kontroll av en promoter som ikke er knyttet til en sekvens som
koder for en lipidacyltransferase i naturen.
TRANSFORMASJON AV VERTSCELLER/ORGANISME
[0393] Vertsorganismen
kan
være
en
prokaryot
eller
en
eukaryot
organisme.
[0394] Eksempler på egnede prokaryote verter inkluderer bakterier som E. coli og Bacillus
10
licheniformis, fortrinnsvis B. licheniformis.
[0395] Læren om transformasjonen av prokaryote verter er godt dokumentert i teknikken, se
f.eks. Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave 1989, Cold Spring Harbor
Laboratory Press). Hvis en prokaryot vert anvendes kan nukleotidsekvensen trenge å bli
hensiktsmessig modifisert
15
[0396] I
en
annen
før transformasjon - slik
utførelsesform
kan
som ved fjerning av
den transgene
organismen være
introner.
en
gjær.
[0397] Filamentøse soppceller kan transformeres ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter som er
kjent i teknikken - som f.eks. en prosess som involverer protoplastdannelse og transformasjon av
protoplastene, etterfulgt av regenerering av celleveggen på kjent måte. Anvendelsen av
Aspergillus
20
som
en
vertsmikroorganisme
er
beskrevet
i
EP
0
238
023.
[0398] En annen vertsorganisme kan være en plante. En gjennomgang av de generelle teknikkene
som anvendes til å transformere planter finnes i artiklene til Potrykus (Annu Rev Plant Physiol
Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) og Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech mars/april 1994 17-27).
Ytterligere lære om plantetransformasjon finnes i EP-A-0449375.
[0399] Generell lære om transformasjon av sopp, gjær og planter er presentert i de følgende
25
avsnittene.
TRANSFORMERT SOPP
[0400] En vertsorganisme kan være en sopp - som f.eks. en filamentøs sopp. Eksempler på slike
egnede verter inkluderer ethvert medlem som tilhører slektene Thermomyces, Acremonium,
Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma og lignende.
30
[0401] Læren om transformering av filamentøs sopp er gjennomgått i US-A-5741665 som fastslår
at standardteknikker for transformasjon av filamentøs sopp og dyrking av sopp er godt kjent i
teknikken. En omfattende gjennomgang av teknikkene som anvendes for N. crassa finnes f.eks. i
avis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.
[0402] Ytterligere lære om transformasjon av filamentøs sopp er gjennomgått i US-A-5674707.
35
[0403] I ett aspekt kan vertsorganismen være av slekten Aspergillus, slik som Aspergillus niger.
NO/EP2190296
64
[0404] En transgen Aspergillus ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan også fremstilles ved å
følge f.eks. læren til Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. i: Martinelli S.D., Kinghorn
J.R.(utgivere) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier
Amsterdam 1994. s. 641-666).
5
[0405] Genuttrykk i filamentøse sopper er gjennomgått i Punt et al. (2002) Trends Biotechnol mai
2002;20(5):200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4):273-306.
TRANSFORMERT GJÆR
[0406] I
en
annen
utførelsesform
kan
den transgene
organismen være
en
gjær.
[0407] En gjennomgang av prinsippene for heterolog genuttrykking i gjær er tilveiebrakt i f.eks.
10
Methods Mol Biol (1995), 49:341-54 og Curr Opin Biotechnol okt. (1997);8(5):554-60
[0408] I denne forbindelse kan gjær - slik som arten Saccharomyces cerevisi eller Pichia
pastoris (se FEMS Microbiol Rev (2000 24(1):45-66), anvendes som en vehikkel for heterolog
genutrykking.
[0409] En gjennomgang av prinsippene for heterolog genuttrykking i Saccharomyces cerevisiae og
15
utskillelse av genprodukter er gitt av E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the
expression of heterologous genes", Yeasts, bind 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, utg., 2.
utgave, Academic Press Ltd.).
[0410] Det er blitt utviklet flere transformasjonsprotokoller for transformasjon av gjær. F.eks. kan
en transgen Saccharomyces ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles ved å følge læren til Hinnen
20
et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D
(1978, Nature, London, 275, 104); og Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168).
[0411] De transformerte gjærcellene kan velges ved anvendelse av forskjellige selektive markører
-
slik
som
auksotrofe
markører
som
dominerer
antibiotikaresistensmarkører.
[0412] En egnet gjærvertsorganisme kan velges fra de bioteknologisk relevante gjærartene, slik
25
som, men ikke begrenset til, gjærarter valgt fra Pichia spp., Hansenula spp., Kluyveromyces,
Yarrowinia spp., Saccharomyces spp.,
inkludert S.cerevisiae eller Schizosaccharomyce spp.,
inkludert Schizosaccharomyce pombe.
[0413] En stamme av de metylotrofe gjærartene Pichia pastoris kan anvendes som
vertsorganismen.
30
[0414] I
en
utførelsesform
kan
vertsorganismen
være
en
Hansenula-art,
slik
som
H. polymorpha (som beskrevet i WO01/39544).
TRANSFORMERTE PLANTER/PLANTECELLER
[0415] En vertsorganisme som er egnet for foreliggende oppfinnelse kan være en plante. En
gjennomgang av de generelle teknikkene kan finnes i artiklene til Potrykus (Annu Rev Plant Physiol
35
Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) og Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech 17-27. mars/april
NO/EP2190296
65
1994), eller iWO01/16308. Den transgene planten kan gi økte nivåer av f.eks. fytosterolestere og
fytostanolestere.
[0416] Derfor vedrører den foreliggende offentliggjøringen også en fremgangsmåte for
produksjon av en transgen plante med økte nivåer av fytosterolestere og fytostanolestere,
5
omfattende trinnene med å transformere en plantecelle med en lipidacyltransferase som definert i
dette dokumentet (nærmere bestemt med en uttrykkingsvektor eller konstrukt omfattende en
lipidacyltransferase som definert i dette dokumentet), og dyrke en plante fra den transformerte
plantecellen.
UTSKILLELSE
10
[0417] Det er ofte ønskelig at polypeptidet skal skilles ut fra uttrykkingsverten inn i
dyrkingsmediet hvorfra enzymet lettere kan utvinnes fra. Ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan
utskillelsesledersekvensen
velges
på
grunnlag
av
den
ønskede
uttrykkingsverten.
Hybridsignalsekvenser kan også anvendes i sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen.
[0418] Typiske eksempler på utskillelsesledersekvenser som ikke er forbundet med en
15
nukleotidsekvens som koder for en lipidacyltransferase i naturen, er de som stammer fra det
fungale amyloglukosidasegenet (AG-genet) (glaA - både 18 og 24 aminosyreversjoner, f.eks. fra
Aspergillus), a-faktorgenet (gjær, f.eks. Saccharomyces, Kluyveromyces og Hansenula) eller αamylasegenet (Bacillus).
DETEKTERING
20
[0419] En rekke protokoller for å detektere og måle uttrykkingen av aminosyresekvensen er kjent
i
teknikken.
Eksempler
radioimmunanalyse
(RIA),
inkluderer
og
enzymbundet
fluorescerende
immunosorbentanalyse
aktivert
cellesortering
(ELISA),
(FACS).
[0420] Et bredt utvalg av merker og konjugeringsmetoder er kjent av fagfolk på området og kan
anvendes i forskjellige nuklein- og aminosyreanalyser.
25
[0421] En rekke selskaper som Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), og US
Biochemical Corp (Cleveland, OH) leverer kommersielle sett og protokoller for disse prosedyrene.
[0422] Egnede rapportørmolekyler eller merker inkluderer de radionuklidene, enzymene,
fluorescerende, kjemiluminescerende eller kromogene midlene, så vel som substrater, kofaktorer,
hemmere, magnetiske partikler og lignende. Patenter som lærer anvendelsen av slike merker
30
inkluderer US-A-3,817,837; US-A-3,850,752; US-A-3,939,350; US-A-3,996,345; US-A-4,277,437; USA-4,275,149 og US-A-4,366,241.
[0423] Rekombinante immunglobuliner kan også fremstilles som vist i US-A-4,816,567.
FUSJONSPROTEINER
[0424] Lipidacyltransferasen for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse kan fremstilles som et
35
fusjonsprotein, f.eks. for å behjelpe ekstraksjon og rensing av denne. Eksempler på
NO/EP2190296
66
fusjonsproteinpartnere inkluderer glutation-S-transferase (GST), 6xHis, GAL4 (DNA-binding
og/eller transkripsjonelle aktiveringsdomener) og β-galaktosidase. Det kan også være fordelaktig å
inkludere et proteolytisk spaltningssete mellom fusjonsproteinpartneren og proteinsekvensen av
interesse for å tillate fjerning av fusjonsproteinsekvenser. Fusjonsproteinet vil fortrinnsvis ikke
5
hindre aktiviteten til proteinsekvensen.
[0425] Genfusjonsuttrykkingssystemer i E. coli har blitt gjennomgått i Curr. Opin. Biotechnol.
(1995) 6(5):501-6.
[0426] Aminosyresekvensen til et polypeptid som har de spesifikke egenskapene som er definert i
dette dokumentet kan ligeres til en ikke-naturlig sekvens for å kode for et fusjonsprotein. For
10
screening av peptidbiblioteker for midler som er i stand til å påvirke stoffaktiviteten kan det f.eks.
være nyttig å kode for et kimært stoff som uttrykker en ikke-naturlig epitop som gjenkjennes av et
kommersielt tilgjengelig antistoff.
[0427] Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet, kun i form av eksempler, med henvisning til de følgende
figurene og eksemplene.
15
Figur 1 viser aminosyresekvensen til en moden, mutert Aeromonas salmonicidalipidacyltransferase
(GCAT) med en mutasjon av Asn80Asp (særlig er aminosyre 80 i den modne sekvensen) (SEQ ID
16);
Figur 2 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 1) en lipidacyltransferase fra Aeromonas hydrophila
(ATCC #7965);
20
Figur 3 viser en pfam00657-konsensussekvens fra databaseversjon 6 (SEQ ID No. 2);
Figur 4 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 3) oppnådd fra organismen Aeromonas hydrophila
(P10480; GI:121051);
Figur 5 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 4) oppnådd fra organismen Aeromonas salmonicida
(AAG098404; GI:9964017);
25
Figur 6 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 5) oppnådd fra organismen Streptomyces
coelicolorA3(2)(Genbank-tiltredelsesnummer NP_631558);
Figur 7 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 6) oppnådd fra organismen Streptomyces
coelicolor A3(2) (Genbank-tiltredelsesnummer: CAC42140);
Figur 8 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 7) oppnådd fra organismen Saccharomyces
30
cerevisiae (Genbank-tiltredelsesnummer P41734);
Figur 9 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 8) oppnådd fra organismen Ralstonia (Genbankaksessnummer: AL646052);
Figur 10 viser SEQ ID No. 9. Scoe1 NCBI-proteinaksesskode CAB39707.1 Gl:4539178 konservert
hypotetisk protein [Streptomyces coelicolor A3(2)];
NO/EP2190296
67
Figur 11 viser en aminosyresekvens vist som SEQ ID No. 10. Scoe2 NCBI-proteinaksesskode
CAC01477.1 Gl:9716139 konservert hypotetisk protein [Streptomyces coelicolor A3(2)];
Figur 12 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 11) Scoe3 NCBI-proteinaksesskode CAB88833.1
Gl:7635996 putativt utskilt protein. [Streptomyces coelicolor A3(2)];
5
Figur 13 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 12) Scoe4 NCBI-proteinaksesskode CAB89450.1
GI:7672261 putativt utskilt protein. [Streptomyces coelicolor A3(2)];
Figur 14 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 13) Scoe5 NCBI-proteinaksesskode CAB62724.1
GI:6562793-putativt lipoprotein [Streptomyces coelicolor A3(2)];
Figur 15 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 14) Srim1-NCBI-proteinaksesskode AAK84028.1
10
GI:15082088 GDSL-lipase [Streptomyces rimosus];
Figur 16 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 15) av en lipidacyltransferase fra Aeromonas
salmonicida subsp.Salmonicida (ATCC#14174);
Figur 17 viser SEQ ID No. 19. Scoe1 NCBI-proteinaksesskode CAB39707.1 Gl:4539178 konservert
hypotetisk protein [Streptomyces coelicolor A3(2)];
15
Figur 18 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 25) av fusjonskonstruktet som anvendes for
mutagenese av Aeromonas hydrophila-lipidacyltransferasegenet. De understrekede aminosyrene
er et xylanasesignalpeptid;
Figur 19 viser en polypeptidsekvens av et lipidacyltransferaseenzym fra Streptomyces (SEQ ID No.
26);
20
Figur 20 viser en polypeptidsekvens av et lipidacyltransferaseenzym fra Thermobifida_SEQ ID No.
27);
Figur 21 viser en polypeptidsekvens av et lipidacyltransferaseenzym fra Thermobifida_ (SEQ ID No.
28);
Figur 22 viser et polypeptid av et lipidacyltransferaseenzym fra Corynebacterium efficiens GDSx
25
300 aminosyre_(SEQ ID No. 29);
Figur
23
viser
et
polypeptid
av
et
lipidacyltransferaseenzym
fra
Novosphingobium
aromaticivorans GDSx 284 aminosyre_(SEQ ID No. 30);
Figur 24 viser et polypeptid av et lipidacyltransferaseenzym fra Streptomyces coelicolor GDSx 269
aa (SEQ ID No. 31);
30
Figur 25 viser et polypeptid av et lipidacyltransferaseenzym fra Streptomyces avermitilis\GDSx
269-aminosyre (SEQ ID No. 32);
Figur 26 viser et polypeptid av et lipidacyltransferaseenzym fra Streptomyces (SEQ ID No. 33);
Figur 27 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 34) oppnådd fra organismen Aeromonas
hydrophila (P10480; GI:121051) (merk at dette er den modne sekvensen);
NO/EP2190296
68
Figur 28 viser aminosyresekvensen (SEQ ID No. 35) av en moden, mutert Aeromonas salmonicida
lipidacyltransferase (GCAT) (merk at dette er den modne sekvensen);
Figur 29 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 36) fra Streptomyces thermosacchari;
Figur 30 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 37); fra Streptomyces thermosacchari;
5
Figur 31 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 38) fra Thermobifida fusca/GDSx 548-aminosyre;
Figur 32 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 39) fra Thermobifida fusca;
Figur 33 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 40) fra Thermobifida fusca/GDSx;
Figur 34 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 41) fra Corynebacterium efficiens/GDSx 300aminosyre;
10
Figur 35 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 42) fra Corynebacterium efficient;
Figur 36 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 43) fra S. coelicolorl GDSx 268-aminosyre;
Figur 37 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 44) fra S.coelicolor,
Figur 38 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 45) fra S. avermitilis;
Figur 39 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 46 fra S.avermitilis;
15
Figur 40 viser en aminosyresekvens (SEQ ID No. 47) fra Thermobifida fusca/GDSx;
Figur 41 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 48) fra Thermobifida fusca/GDSx;
Figur 42 viser en sammenstilling av L131 og homologene fra S. avermitilis og T. fusca illustrerer at
konserveringen av GDSx-motivet (GDSY i L131 og S. avermitilis og T. fusca), GANDY-boksen, som er
enten GGNDA eller GGNDL, og HPT-blokken (ansett å være det konserverte katalytiske histidinet).
20
Disse tre konserverte blokkene er uthevet;
Figur 43 viser SEQ ID No. 17 som er aminosyresekvensen til en lipidacyltransferase fra Candida
parapsilosis;
Figur 44 viser SEQ ID No. 18 som er aminosyresekvensen av en lipidacyltransferase fra Candida
parapsilosis;
25
Figur 45 viser en båndrepresentasjon av 1IVN. PDB-krystallstruktur som har glyserol i det aktive
setet. Figuren ble fremstilt ved hjelp av Deep View Swiss-PDB viewer;
Figur 46 viser 1IVN.PDB krystallstruktur - sideriss ved anvendelse av Deep View Swiss-PDB viewer,
med glyserol i det aktive setet - rester innenfor 10A av det aktive glyserolsetet er farget svart;
Figur 47 viser 1IVN.PDB-krystallstrukturen - Top View ved anvendelse av Deep View Swiss-PDB
30
viewer, med glyserol i det aktive setet - rester innenfor 10A av det aktive glyserolsetet er farget
svart;
Figur 48 viser sammenstilling 1;
Figur 49 viser sammenstilling 2;
NO/EP2190296
69
Figurene 50 og 51 viser en sammenstilling av 1IVN til P10480 (P10480 er databasesekvensen for A.
hydrophila-enzymet), denne sammenstillingen ble oppnådd fra PFAM-databasen og anvendt i
modellbyggeprosessen; og
Figur 52 viser en sammenstilling der P10480 er databasesekvensen for Aeromonas
5
hydrophila. Denne sekvensen ble anvendt for modellkonstruksjonen og det valgte setet. Merk at
det fulle proteinet (SEQ ID No. 3) er avbildet, det modne proteinet (ekvivalent med SEQ ID No. 34)
starter på rest 19. A. sal er Aeromonas salmonicida (SEQ ID No. 35) GDSX-lipase, A. hyd er
Aeromonas hydrophila (SEQ ID No. 120) GDSX-lipase. Konsensussekvensen inneholder en * i
stillingen av en forskjell mellom de oppførte sekvensene.
10
Figur 53 viser et genkonstrukt som anvendes i eksempel 1;
Figur 54 viser et kodonoptimalisert genkonstrukt (nr. 052907) anvendt i eksempel 1; og
Figur 55 viser sekvensen av XhoI-innsettingen som inneholder LAT-KLM3'-forløpergenet, -35- og 10-boksene er understreket;
Figur 56 viser BML780-KLM3'CAP50 (omfattende SEQ ID No. 16 - øvre koloni) og BML780 (den
15
tomme vertsstammen - lavere koloni) etter 48 t vekst ved 37 °C på 1 % tributyrinagar;
Figur 57 viser en nukleotidsekvens fra Aeromonas salmonicida (SEQ ID No. 49) inkludert
signalsekvensen (preLAT - stillingene 1 til 87);
Figur 58 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 50) som koder for en lipidacyltransferase ifølge den
foreliggende oppfinnelsen oppnådd fra organismen Aeromonas hydrophila;
20
Figur 59 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 51) som koder for en lipidacyltransferase ifølge den
foreliggende oppfinnelsen oppnådd fra organismen Aeromonas salmonicida;
Figur 60 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 52) som koder for en lipidacyltransferase ifølge den
foreliggende oppfinnelsen oppnådd fra organismen Streptomyces coelicolorA3(2) (Genbankaksessnummer NC_003888.1:8327480..8328367);
25
Figur 61 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 53) som koder for en lipidacyltransferase ifølge den
foreliggende oppfinnelsen oppnådd fra organismen Streptomyces coelicolorA3(2) (Genbankaksessnummer AL939131.1:265480..266367);
Figur 62 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 54) som koder for en lipidacyltransferase ifølge den
foreliggende oppfinnelsen oppnådd fra organismen Saccharomyces cerevisiae(Genbank-
30
aksessnummer Z75034);
Figur 63 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 55) som koder for en lipidacyltransferase ifølge den
foreliggende oppfinnelsen oppnådd fra organismen Ralstonia;
Figur 64 viser en nukleotidsekvens vist som SEQ ID No. 56 som koder for NCBI-protein aksesskode
CAB39707.1 Gl:4539178 konservert hypotetisk protein [Streptomyces coelicolor A3(2)];
NO/EP2190296
70
Figur 65 viser en nukleotidsekvens vist som SEQ ID No. 57 som koder for Scoe2 NCBl-protein
aksesskode CAC01477.1 Gl:9716139 konservert hypotetisk protein [Streptomyces coelicolor A3(2)];
Figur 66 viser en nukleotidsekvens vist som SEQ ID No. 58 som koder for Scoe3 NCBI-protein
aksesskode CAB88833.1 Gl:7635996 putativt utskilt protein. [Streptomyces coelicolorA3(2)];
5
Figur 67 viser en nukleotidsekvens vist som SEQ ID No. 59 som koder for Scoe4 NCBI-protein
aksesskode CAB89450.1 GI:7672261 putativt utskilt protein. [Streptomyces coelicolorA3(2)];
Figur 68 viser en nukleotidsekvens vist som SEQ ID No. 60, som koder for Scoe5-NCBI-protein
aksesskode CAB62724.1 GI:6562793 putativt lipoprotein [Streptomyces coelicolor A3(2)];
Figur 69 viser en nukleotidsekvens vist som SEQ ID No. 61 som koder for Srim1 NCBI-protein
10
aksesskode AAK84028.1 GI:15082088 GDSL-lipase [Streptomyces rimosus];
Figur 70 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 62) som koder for en lipidacyltransferase fra
Aeromonas hydrophila(ATCC #7965);
Figur 71 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 63) som koder for en lipidacyltransferase fra
Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (ATCC#14174);
15
Figur 72 viser en nukleotidsekvens (SEQ ID No. 24) som koder for et enzym fra Aeromonas
hydrophila, inkludert et xylanasesignalpeptid;
Figur
73
viser
aminosyresekvensen
av
en
mutert
Aeromonas
salmonicida
moden
lipidacyltransferase (GCAT) med en mutasjon av Asn80Asp (merk at aminosyre 80 er i den modne
sekvensen) - vist i dette dokumentet som SEQ ID No. 16 - og etter å ha gjennomgått
20
posttranslasjonell modifisering av SEQ ID No. 68 - er ikke aminosyrerestene 235 og 236 ifølge SEQ
ID No. 68 kovalent bundet etter posttranslasjonell modifisering. De to peptidene som dannes
holdes sammen av én eller flere S-S-broer. Aminosyre 236 i SEQ ID No. 68 tilsvarer aminosyrerest
nummer 274 i SEQ ID No. 16 vist i dette dokumentet;
Figur 74 viser en turbiscanmåling fra de øverste 5 mm;
25
Figur 75 viser en turbiscanmåling fra de nederste 5 mm;
Figur 76 viser overflatespenningen av pasteurisert melk 12983-1-11 (kontroll), 12983-1-12
(enzymbehandlet) og UHT-melk 12983-1-13 (kontroll), 12983-1-14 (enzymbehandlet);
Figur 77 viser målinger av melkefritt kolesterol og kolesterolester ved gasskromatografi. 11 og 12
var pasteurisert melk, og 13 og 14 var UHT-melk. Prøve -12 og -14 ble enzymatisk behandlet med
30
KLM3 ved 5 °C i 20 timer. En kommersielt tilgjengelig UHT-melk fra Arla ble inkludert i analysen for
sammenligning;
Figur 78 viser HPTLC av ekstraherte, pasteuriserte (90 °C) og UHT (142 °C) melkelipider oppløst i
CHCl3:MeOH (2:1). Standard (Std) 16 inneholder SpectraLipid Soyalecitinblanding standard (nr.
SLM43) oppløst i CHCl3:MeOH (2:1);
35
Figur 79 viser resultatene av lumifugering av sjokolademelk med KLM3 ((DK 14636-2-3);
NO/EP2190296
71
Figur 80 viser resultatene av lumifugering av sjokolademelk uten KLM 3 (DK14636-2-4):
Figur 81 viser utskillelse (% integral transmisjon);
Figur 82 viser resultatene av fremsporing, dvs. overvåking av bevegelsen av fronten av utskillelse
ved 15 % overføring; og
5
Figur 83 viser resultatene av fremsporing, dvs. overvåking av bevegelsen av fronten av utskillelse
ved 50 % overføring.
EKSEMPEL 1
Uttrykking av KLM3' i Bacillus licheniformis
[0428] En nukleotidsekvens (SEQ ID No. 49) som koder for en lipidacyltransferase (SEQ. ID Nr. 16,
10
heretter KLM3') ble uttrykt i Bacillus licheniformis som et fusjonsprotein med signalpeptidet fra B.
licheniformis [alfa]-amylase (LAT) (se FIG. 53 og 54). For optimal uttrykking i Bacillus ble et
kodonoptimalisert genkonstrukt (nr. 052907) bestilt på Geneart (Geneart AG, Regensburg,
Tyskland).
[0429] Konstrukt nr. 052907 inneholder en ufullstendig LAT-promoter (bare -10-sekvensen) i front
15
av LAT-KLM3'-forløpergenet og LAT-transkripsjonen (Tlat) nedstrøms for LAT-KLM3'-forløpergenet
(se FIG. 53 og 55). For å opprette et XhoI-fragment som inneholder LAT-KLM3'-forløpergenet
flankert av den komplette LAT-promoteren på 5'-enden og LAT-terminatoren ved 3'-enden, ble en
PCR (polymerasekjedereaksjon)-forsterking utført med primerne Plat5Xhol_FW og EBS2Xhol_RV
og genkonstruktet 052907 som mal.
20
Plat5Xhol_FW:
EBS2XhoI_RV: tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc
[0430] PCR ble utført på en thermocycler med Phusion High Fidelity DNA-polymerase (Finnzymes
OY, Espoo, Finland) ifølge instruksjonene fra produsenten (hybridiseringstemperatur på 55
25
[grader.] C.).
[0431] Det resulterende PCR-fragmentet ble fordøyd med begrensingsenzym XhoI og ligert med
T4 DNA-ligase til XhoI-fordøyd pICatH ifølge instruksjonene fra leverandøren (Invitrogen, Carlsbad,
Calif. USA).
[0432] Ligeringsblandingen ble transformert inn i B. subtilis-stammen SC6.1 som beskrevet i
30
amerikansk patentsøknad US20020182734 (internasjonal publikasjon WO 02/14490). Sekvensen
av XhoI-innsettingen som inneholdt LAT-KLM3'-forløpergenet ble bekreftet ved DNA-sekvensering
(BaseClear, Leiden, Nederland) og ett av de korrekte plasmidklonene ble betegnet pICatH-KLM3'
(ori1) (figur 53). pICatH-KLM3 '(ori1) ble transformert til B. licheniformis-stammen BML780 (et
derivat av BRA7 og BML612, se WO2005111203) ved den betingede temperaturen (37 [grader.]
NO/EP2190296
72
C.).
[0433] En neomycinresistent (neoR) og kloramfenikolresistent (CmR) transformant ble valgt og
betegnet BML780(plCatH-KLM3'(ori1)). Plasmidet i BML780(plCatH-KLM3'(ori1)) ble integrert inn i
catH-regionen på B. licheniformis-genomet ved å dyrke stammen ved en ikke-permissiv
5
temperatur (50 [grader] C) i et medium med 5-[mu]g/ml kloramfenikol. Ett CMR-resistent klon ble
valgt og betegnet BML780-plCatH-KLM3'(ori1). BML780-plCatH- KLM3'(ori1) ble dyrket igjen på
den tillatelige temperaturen i flere generasjoner uten antibiotika for å dra ut vektorsekvenser og
deretter ble et neomycinsensitivt (neoS), CmR-klon valgt. I denne klonen skjæres
vektorsekvensene av plCatH på kromosomet ut (inkludert neomycinresistensgenet), og bare catH-
10
LATKLM3'-kassetten er igjen. Deretter ble catH - LATKLM3'-kassetten på kromosomet forsterket
ved å øke belastningen i/på mediet med økende konsentrasjoner av kloramfenikol. Etter
forskjellige runder med forsterkning ble en klon (resistent mot 50 [mu]g/ml kloramfenikol) valgt og
betegnet BML780-KLM3'CAP50. For å verifisere KLM3'-uttrykkingen ble BML780-KLM3'CAP50 og
BML780 (den tomme vertsstammen) dyrket i 48 t ved 37 [grader] C på en hjerteinfusjons (Bacto)
15
agarplate med 1 % tributyrin. En utskillelsessone, en indikasjon på lipidacyltransferaseaktivitet, var
godt synlig rundt kolonien av BML780-KLM3'CAP50, men ikke rundt vertsstammen BML780 (se
figur 56). Dette resultatet viser at en betydelig mengde av KLM3' er uttrykt i B. licheniformisstammen BML780-KLM3'CAP50 og at disse KLM3'-molekylene er funksjonelle.
SAMMENLIGNENDE EKSEMPEL 1
20
Vektorkonstrukt
[0434] Plasmidkonstruktet er pCS32new N80D, som er et pCCminiderivat som bærer sekvensen
som koder for den modne formen av den naturlige Aeromonas salmonicida-glycerofosfolipidkolesterolacyltransferasen med en Asn- til Asp-substitusjon i stilling 80 (KLM3'), under kontroll av
p32-promoteren og med en CGTase-signalsekvens.
25
[0435] Vertsstammen som anvendes for uttrykkingen er i bacillus subtilisOS21ΔAprE-stammen
[0436] Uttrykkingsnivået måles som transferaseaktivitet, uttrykt som % kolesterol forestret,
beregnet fra forskjellen i fritt kolesterol i referanseprøven og fritt kolesterol i enzymprøven i
reaksjoner med PC (TPC) som donor og kolesterol som akseptormolekyl.
Kulturbetingelser
30
[0437] 5 ml LB-buljong (kaseinenzymatisk fordøyelse, 10 g/l; lav-natriumgjærekstrakt, 5 g/l;
natriumklorid, 5 g/l; inerte tabletteringshjelpemidler, 2 g/l) supplert med 50 mg/l kanamycin, ble
inokulert med en enkelt koloni og inkubert ved 30 °C i 6 timer ved 205 rpm. 0,7 ml av denne
kulturen ble anvendt til å inokulere 50 ml SAS-medium (K2HPO4, 10 g/l; MOPS (3morfolinopropansulfonsyre), 40 g/l; natriumklorid, 5 g/l; Antifoam (Sin 260), 5 dråper/I; avfettet
35
soyamel, 20 g/l; Biospringer 106 (100 % dw YE), 20 g/l) supplert med 50 mg/l kanamycin og en
NO/EP2190296
73
løsning av høymaltosestivelseshydrolysater (60 g/l). Inkuberingen ble fortsatt i 40 timer ved 30 °C
og 180 opm før kultursupernatanten ble separert ved sentrifugering ved 19000 opm i 30 min.
Supernatanten ble overført til et rent rør og anvendt direkte for transferaseaktivitetsmåling.
Fremstilling av substrater og enzymatisk reaksjon
5
[0438] PC (Avanti Polar Lipids #441601) og kolesterol (Sigma C8503) ble skalert i forholdet 9:1,
oppløst i kloroform og fordampet til tørrhet. Substratet ble fremstilt ved dispergering av 3 %
PC:kolesterol 9:1 i 50 mM Hepes-buffer pH 7. 0,250 ml substratløsning ble overført til et 3 ml
glassrør med skrulokk. 0,025 ml kultursupernatant ble tilsatt og blandingen ble inkubert ved 40 °C i
2 timer. En referanseprøve med vann i stedet for enzym ble også fremstilt. Oppvarming av
10
reaksjonsblandingen i et kokende vannbad i 10 minutter stanset enzymreaksjonen. 2 ml 99 %
etanol ble tilsatt til reaksjonsblandingen før den ble underlagt kolesterolanalyseanalyse.
Kolesterolanalyse
[0439] 100 µl substrat som inneholdt 1,4 U/ml kolesteroloksidase (SERVA Electrophoresis GmbH
kat. nr. 17109), 0,4 mg/ml ABTS (Sigma A-1888), 6 U/ml peroksidase (Sigma 6782) i 0,1 M Tris-HCl,
15
pH 6,6 og 0,5 % Triton X-100 (Sigma X-100) ble inkubert ved 37 ° C i 5 minutter før 5 µl
enzymreaksjonsprøve ble tilsatt og blandet. Reaksjonsblandingen ble inkubert i ytterligere 5
minutter, og OD405 ble målt. Innholdet av kolesterol ble beregnet fra analysene av
standardløsninger av kolesterol inneholdende 0,4 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,20 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,05
mg/ml, og 0 mg/ml kolesterol i 99 % EtOH.
20
Resultater
[0440] Tabellen viser gjennomsnittet av 8 separate uttrykkingskulturer
Stamme
TPCa
OS21ΔAprE[pCS3 2new]
74,2 ±10,1b
a
TPC er transferaseaktiviteten, uttrykt som % kolesterol
forestret, beregnet fra forskjellen i fritt kolesterol i
referanseprøven og fritt kolesterol i enzymprøven i
reaksjoner med PC som donormolekyl og kolesterol som
akseptormolekyl.
b
gjennomsnittet av 8 separate uttrykkingskulturer
Eksempel 2: Emulsjonsstabilitet, fjerning av kolesterol i UHT-melk
NO/EP2190296
74
[0441] Anvendelsen av lipidacyltransferasen vist her som SEQ ID No. 68 (heretter referert til som
"KLM3") for interforestring og/eller transforestring mellom fosfolipider og kolesterol i UHT-melk
har en effekt på å forbedre emulsjonsstabiliteten, og sammenligner resultatene i vanlig UHT-melk
og smakssatt UHT-melk, fremstilt på grunnlag av fersk melk samt rekombinert melk.
5
[0442] For å unngå tvil er rekombinert melk et generelt begrep for melk, som er produsert fra
opprinnelige melkebaserte faste komponenter blandet med vann og bearbeidet på en slik måte for
å produsere melk med lignende egenskaper som den opprinnelige melken.
Test av KLM3 i UHT-melk og fløte
[0443]
SAMMENSETNING
I 1
2
3
4
5
6
7
8
99,90
99,90
94,16
Skummet melkepulver
9,00
9,00
9,00
9,00
Smørolje (AMF)
3,50
3,50
3,50
3,50
PROSENTANDELER
Melk, 3,5 % fett
99,90
Sukrose
5,50
5,50
Jordbærsmak T10063
0,12
0,12
Karminekstrakt (rød)
0,02
0,02
RECODAN™ RS 100
0,10
K460 (KLM3) enheter/liter
0,10
0,10
0,20
75
40
enhet
er/l
0,15
0,15
0,20
75
75
40
75
enhet
enhet
enhet
enhet
enhet
er/l
er/l
er/l
er/l
er/l
87,35
87,35
87,35
81,66
100,00
100,00
100,00
100,00
Vann (tappet)
Total prosentandel
100,0
100,00
100,00
100,00
0,15
0
10
[0444] Prøvene (rekombinert melk) ble bearbeidet i meieripilotanlegget som følger:
Pilot (satsfremstilling)
[0445]
1. - Varm opp vann/melk til 40 °C i blandetanken og tilsett enzymer
NO/EP2190296
75
2. - Tilsett skummet melkepulver, sukker, andre tørre ingredienser til vannet og hold det der i 30
minutter
3. - Smelt smørolje ved 70 °C
4. - Tilsett stabilisator/emulgator til den smeltede smøroljen
5
5. - Tilsett smørolje, stabilisator/emulgator til melken
6. - Tilsett smakstilsetninger.
7. - Forbland på Silverson - middels hastighet i 1 minutt
8. - Luft ut i rundt 30 minutter i bøtten
[0446] Den ferske melken fulgte trinn 1, 2, 6, 7 og 8.
10
UHT - (PHE)
[0447]
9. - Forvarm til 90 °C (hold cellen i 30 sekunder)
10. - Indirekte oppvarming 142 °C i 3 sekunder
11. - Nedstrøms homogenisering 200 bar, 75 °C
15
12. - Avkjøl til 15 °C
13. - Aseptisk fylling
[0448] Ingrediensene som ble anvendt i forsøkene var kommersielt kjøpt helmelk og/eller
standard
råvarer
som
ble
anvendt
for
flertallet
av
forsøk
i
meieripilotanlegget.
[0449] Den anvendte enzymløsningen var en prøve av KLM3 (K460 - vist som SEQ ID No. 68 i dette
20
dokumentet). K460 inneholder 1400 TIPU enheter/ml.
TIPU-ANALYSE
Substrat
[0450] 0,6 % L-α-fosfatidylkolin 95 % Plant (Avanti #441601), 0,4 % Triton X-100 (Sigma X-100) og
5 mM CaCl2 ble oppløst i 0,05 M HEPES-buffer pH 7.
25
Analyseprosedyre:
[0451] 400 µl substrat ble tilsatt til et 1,5 ml Eppendorf-rør og plassert i en Eppendorftermoblander ved 37 °C i 5 minutter. Ved tid T= 0 min ble det tilsatt 50 µl enzymløsning. En
blindprøve med vann i stedet for enzym ble også analysert. Prøven ble blandet ved 10*100 opm i
en Eppendorf-termoblander ved 37 °C i 10 minutter. Ved tid T = 10 min ble Eppendorf-røret
30
plassert i en annen termoblander ved 99 °C i 10 minutter for å stoppe reaksjonen.
[0452] Fri fettsyre i prøvene ble analysert ved hjelp av NEFA C-settet fra WAKO GmbH.
Enzymaktivitet TIPU pH 7 ble beregnet som mikromol fettsyre produsert per minutt under
analysebetingelser.
[0453] Doseringsnivået til enzymene var 75 og 40 enheter per liter. Reaksjonstiden og
35
temperaturen i dette forsøket var konstant ved 40 °C i 30 min.
NO/EP2190296
76
[0454] For å evaluere resultatene fra prøven ble alle prøvene analysert som følger:
5
•
Gjenværende innhold av kolesterol og fosfolipider
•
Partikkelstørrelsesfordeling i vann og med 1 % SDS tilsatt
•
Viskositet og sediment (DLA-standard fremgangsmåter i meieripilotanlegget)
viskositet ble målt i centipoise på et Brookfield-viskosimeter med spindel 2 ved 60 opm og 4 °C.
Bunnsettingen ble målt av bunnsettingstesten i % ved utsette en produktprøve for sentrifugalkraft
på 2800 g i 20 minutter og 20 °C (Ultracentrifuge) og deretter ble pelleten beregnet ved % av den
totale prøven.
[0455] Partikkelstørrelsen ble målt ved Malvern Mastersizer S lang seng, konfigurasjon Alpha,
10
linse 300R. Instrumentet ble kalibrert med en polymerstandard til en spesifikasjon på 0,993 µm ±
0,021 µm. Prøven ble fortynnet i vann (2 g prøve til 10 ml vann med 1 % SDS). SDS ble tilsatt for å
unngå partikkelaggregering, ettersom aggregering vil gi et feilaktig resultat.
RESULTATER
Analyseresultater:
15
[0456]
Kolesterol
Prøve 1 Prøve 2
Prøve 3
Normalt Fullstendig
nivå
forestret
Fosfolipider Normalt Ikke
nivå
Prøve 5
Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8
Fullstendig Fullstendig
Normalt
Delvis
forestret
nivå
forestret forestret forestret
til Ikke
stede
Prøve 4
forestret
til Ikke
stede
til Normalt
Ikke
nivå
stede
stede
Delvis
til Ikke
Delvis
til Ikke
stede
til
stede
Partikkelstørrelsesanalyse:
[0457]
Prøve 1
Prøve 2
Prøve 3
Prøve 4
Prøve 5
Prøve 6
Prøve 7
Prøve 8
0,57
0,58
0,58
0,53
0,55
0,54
0,53
0,49
Gjennomsnittlig
partikkeldiameter
µm
[0458] Alle
prøvene
har
en
gjennomsnittlig
partikkelstørrelse
under
1
µm.
[0459] Prøvene veies og underkastes deretter ultrasentrifugering ved 2800G i 20 minutter og ved
20
20 °C. Etter sentrifugering fjernes supernatanten, og den tørre pelleten veies og sediment
beregnes som prosentandel av opprinnelig prøvestørrelse. Som nevnt ovenfor måles viskositeten i
centipoise og bunnsetting i %.
NO/EP2190296
77
Prøve 1
Prøve 2
Prøve 3
Prøve 4
Prøve 5
Prøve 6
Prøve 7
Prøve 8
Viskositet
5
6
6
22
15
15
17
28
Sediment
2,1
0,8
1,2
0,7
1,4
0,6
0,5
0,5
[0460] Resultatene viser at anvendelsen av KLM3 kan forbedre emulsjonsstabiliteten i UHT-melk,
og fjerne kolesterolen.
Eksempel 3 Effekt av KLM-3-enzym i pasteurisert eller UHT-behandlet melk
Materialer og fremgangsmåter
5
[0461]
Glycerofosfolipidkolesterolacyltransferase KLM3 (K460)
Recodan RS 100: Stabilisatorsystem
Fløte: Kommersiell kilde
Skummet melk: Kommersiell kilde.
10
EKSPERIMENTELT
[0462] For ytterligere å fastslå hvorvidt anvendelsen av KLM3 i melk har en effekt på å forbedre
emulsjonsstabiliteten ble følgende prøvekjøring kjørt og sammenligner resultatene i alminnelig
UHT-melk og pasteurisert melk, fremstilt på grunnlag av rekombinert fersk melk. I dette forsøket
ble enzymreaksjonen utført ved 5 °C.
15
Test av KLM3 i pasteurisert melk (prøve 11 og 12) og UHT-melk (prøve 13 og 14)
[0463]
Sammensetning i %
11
12
13
14
RECODAN RS 100
0,15
0,15
0,13
0,13
Fløte, 38 % fett
8,61
8,61
8,66
8,66
Skummet melk
91,24
91,24
91,21
91,21
KLM3, 100 U/ml
-
+
-
+
Temperatur °C
90
90
142
142
Holdetid i sekunder
30
30
3
3
[0464] Prøvene ble bearbeidet i meieripilotanlegget som følger:
Prøve 11, 12, 13 og 14:
UHT-melk - Pilot (PHE)
NO/EP2190296
78
1. - Bland skummet melk og fløte
2. - Tilsett KLM 3-enzymet og rør godt.
3. - La stå i kjølerom over natten (20 timer.)
4. - Varm opp melk til 60 °C og tilsett Recodan
5
Prøve 13 og 14:
5. - Forvarm til 90 °C (hold cellen i 30 sekunder)
6. - Indirekte oppvarming 142 °C i 3 sekunder
7. - Nedstrøms homogenisering 200 bar, 75 °C
8. - Avkjøl til 15 °C
10
9. - Aseptisk fylling
PRØVE 11 og 12:
10. - Homogeniser oppstrøms ved 70 °C og 200 bar
11. - Pasteuriser ved 90 °C i 30 sek.
12. - Avkjøl til 5 °C og fyll
15
[0465] Ingrediensene som ble anvendt i forsøkene var kommersielt kjøpt helmelk og/eller
standard
råvarer
som
ble
anvendt
for
de
fleste
forsøkene
i
meieripilotanlegget.
[0466] Doseringsnivået til enzymene var det samme som i de andre eksemplene i dette
dokumentet som vises med KLM3-enzymeringen av melk ved 5 °C.
[0467] For å evaluere resultatene fra prøven ble alle prøvene analysert som følger:
20
25
•
Turbiscan over 5 dager
•
Belastningstest av UHT-prøvene (langtidsstabilitet)
•
Overflatespenning.
•
Kolesterol og fosfatidyletanolamin
•
Sensorisk analyse av trekanttesten
Turbiscan:
[0468] Turbiscan MA 2000 ble anvendt til å måle stabiliteten av emulsjoner ved å måle
tilbakespredningen av en laserstråle fra produktet. Melkeprøvene ble fylt aseptisk i et sterilt
testrør, testrørene ble holdt ved omgivelsestemperatur. Prøvene ble målt med regelmessige
intervaller over en periode på 5-7 dager. Prøvene ble målt fra de øverste 5 mm og nederste 5 mm
30
av testrøret, der økningen i tilbakespredning fra det øverste laget indikerer skumming og økningen
i det nederste laget indikerer bunnsetting av partiklene i prøven.
BELASTNINGStest av nøytrale UHT-melkeprodukter
[0469]
1. Etter aseptisk fylling (typisk ved omgivelsestemp.) Prøve 13 og 14 ble plassert over natten i
35
kjølerom ved 5 °C
NO/EP2190296
79
2. Prøvene ble deretter overført til en inkubator ved 35 °C i 24 timer
3. Prøvene ble overført til kjølerom ved 5 °C i 24 timer
4. Prøvene ble overført til omgivelsestemperatur ved 20-25 °C i 24 timer
5. Prøvene ble overført til kjølerom ved 5 °C i 24 timer
5
[0470] Etter temperaturbehandlingen ble prøvene etterlatt ved omgivelsestemperatur i 2-3 dager
og deretter undersøkt visuelt for skumming, flokkulering, bunnsetting og mulige fasesepareringer.
[0471] Korrelasjonen av denne testen med reell lang levetidsstabilitet av produktene har i løpet
av observasjoner over 2 år vist seg å ha en meget høy korrelasjon.
Overflatespenning:
10
[0472] Overflatespenningen i melkeprøvene ble målt med en Wilhelmy-plate ved hjelp av et
Tensiometer K10 fra Krüss
Gasskromatografi:
[0473] Gasskromatografi ble anvendt til å måle innholdet av kolesterol og kolesterol-ester i
melkeprøvene.Følgende CG-oppsett ble anvendt: Perkin Elmer Autosystem 9000 kapillær
15
gasskromatograf utstyrt med WCOT-sammensmeltet silikakolonne 12,5 m x 0,25 mm ID x 0,1 µ
filmtykkelse 5 % fenyl-metyl-silikon (CP Sil 8 CB fra Chrompack).Bærergass: Helium.Injektor. PSSI
kald splittinjeksjon (innledende temp. 50 °C oppvarmet til 385 °C), volum 1,0 µl Detektor FID:
395 °C
Ovnstemperatur:
1
2
3
Ovnstemperatur, °C.
90
280
350
Isotermal, tid, min.
1
0
10
Temperaturhastighet, °C/min.
15
4
Fremstilling av melkeprøver for GC-analyse:
20
[0474] Melkelipidene ble ekstrahert ifølge Mojonnier AOAC 989.05 ved anvendelse av etanol,
NH3, MTBE (metyl-tert-butyleter) og p-eter. Lipidfraksjonen ble løst opp på nytt i heptan/pyridin
(2:1) inneholdende heptadekan som indre standard og kolesterol ble målt med GC.
[0475] Fremstilling av prøvene for kolesterol-estermålinger av Squalane ble tilsatt som en ekstra
indre standard. Lipidfraksjonen ble løst opp på nytt i heksan og kolesterolestere ble konsentrert
25
ved hjelp av en NH2-bindingselueringskolonne og heksaneluering. Prøvene ble løst på nytt i
heptan/pyridin (2:1) og kolesterol-estere ble målt med CG.
NO/EP2190296
80
HPTLC:
[0476] HPTLC ble anvendt til å måle innholdet av fosfatidyletanolamin (PE) i pasteuriserte
melkeprøver og UHT-melkeprøver.
Applikator: CAMAG-applikator AST4.
5
HPTLC-plate: 20 x 10 cm (Merck nr. 1.05641)
Platen ble aktivert før anvendelse ved tørking i en ovn ved 160 °C i 20-30 minutter. Påføring: 6,0 µl
ekstraherte lipider ble løst opp i CHCl3:metanol (2:1) påført på HPTLC-platen ved hjelp av AST4applikatoren.
0,1, 0,3, 0,5, 0,8, 1,5 µl av en standard løsning som inneholdt standardkomponenter med kjent
10
konsentrasjon ble også påført HPTLC-platen
Kjørebuffer 6: Metylacetat:CHCl3:1-propanol:MeOH:0,25 % KCl (25:25:25:10:9) Elueringslengde: 7
cm
Utviklingsvæske: 6 % kobberacetat i 16 % H3PO4
[0477] Etter eluering ble platen tørket i en ovn ved 160 °C i 10 minutter, avkjølt og nedsenket i
15
utviklingsvæsken (10 sek), og deretter tørket ytterligere i 6 minutter ved 160 °C. Platen ble vurdert
visuelt og skannet (Camag TLC-skanner).
Trekanttest.
ISO 4120:2004 Sensorisk analyse - Metodologi - Trekanttest
[0478] ISO 4120:2004 beskriver en prosedyre for å avgjøre om det finnes en merkbar sensorisk
20
forskjell eller likhet mellom prøver av to produkter. Trekanttesten er en tre-alternativtest der én
prøve er forskjellig fra de to andre.
[0479] Testen balanseres for identiteten til den rare prøven (både ABB og BAA anvendt) og dens
stilling i smaking (ABB, BAB, BBA, AAB, ABA, BAA). Sjanseytelse er en tredjedel, og ytelse i en
gruppe over det nivået gir bevis for en lesbar forskjell. Fremgangsmåten er en tvunget-valg-
25
prosedyre. Fremgangsmåten gjelder enten en forskjell kan eksistere i en enkelt sensorisk egenskap
eller flere egenskaper.
RESULTATER
TURBISCAN-målinger
[0480] Resultater fra Turbiscan-målinger av pasteurisert melk eller UHT-melk er vist i tabellen
30
nedenfor, og også i figur 74 og figur 75.
Tabell: Turboscan-måling av pasteurisert melk 12983-1-11(kontroll), 12983-1-12(enzymbehandlet)
og UHT-melk 12983-1-13(kontroll), 12983-1-14(enzymbehandlet)
NO/EP2190296
81
Gjennomsnittlig
Relativ 12983-1- 12983-1-12
12983-1-13
12983-1-14
topp 5 mm Tid 11
(min)
0
0,00
0,00
0,00
0,00
1
-0,04
-0,51
-0,11
0,08
1225
1,31
2,55
-0,53
-0,68
2683
2,11
2,81
-1,09
-0,02
6951
4,30
2,89
-0,58
0,04
Gjennomsnittlig
12983-1-11
12983-1-12
12983-1-13
12983-1-14
0
0,00
0,00
0,00
0,00
1
-0,25
0,09
-0,06
-0,12
1225
-1,80
-1,91
-0,10
0,11
2683
-3,03
-2,21
-0,50
0,12
6951
-4,22
-2,71
-0,65
0,17
bunn 5 mm Tid
(min)
[0481] TURBISCAN-målingene viser redusert skumming og redusert bunnsetting i de pasteuriserte
prøvene,
oppbevaringstiden
var
for
kort
til
å
bestemme
effekten
i
UHT-melken.
Lagringsstabiliteten av UHT-melken ble derfor bestemt av belastningstesten.
Belastningstest av enzymatisk behandlet melk i prøven DK 12938
5
[0482]
Prøve
Evaluering etter belastningstest, plassert 3 uker ved 30
°C
13 (ingen enzymatisk behandling)
Lett skumming 0-1 mm
14 (enzymatisk behandling)
Prøven er stabil
NO/EP2190296
82
[0483] Etter 3 uker ved 30 °C ble det observert en vesentlig forskjell mellom kontrollen og den
enzymbehandlede prøven.
Overflatespenning
[0484] Overflatespenningen av melkeprøvene ble målt ved 20 °C hjelp av et Kruss-tensiometer.
5
[0485] Resultatene er illustrert i figur 76.
[0486] Resultatene fra overflatemålingen indikerer en vesentlig effekt på enzymatisk behandling
av melk med KLM3.
Gasskromatograf av fritt kolesterol og kolesterolester.
[0487] Resultatene av gasskromatografimålingene av melkekolesterol og kolesterolester er vist i
10
figur
77.
[0488] Generelt bekrefter GC-resultatene fra enzymatisk behandling av både pasteurisert melk og
UHT-melk med KLM3-acyltransferase dette enzymets evne til å omdanne kolesterol til
kolesterolester. KLM3-behandling av melkeprøvene reduserer fritt kolesterol ved 85-90 % i UHT så
vel som pasteurisert melk. I tillegg økte KLM3-behandling kolesterolesternivået i pasteurisert melk
15
og UHT-melk med en faktor på henholdsvis ~6 og ~10. Det observeres dermed en klar effekt fra
KLM3-behandling av pasteurisert melk og UHT-melk med hensyn på reduksjon av fritt kolesterol.
[0489] Både pasteuriserte melkekontroller og UHT-melkekontroller lignet på den kommersielle
UHT-melken fra ARLA med hensyn på nivåer av fritt kolesterol og kolesterolester.
HPTLC av melkefosfatidyletanolamin:
20
[0490] Resultatene av melkelipider ekstrahert fra pasteurisert melk og UHT-melk og målt ved
HPTLC er vist i figur 78.
HPTLC-målinger.
[0491] Enzymatisk behandling av både pasteurisert melk og UHT-melk med KLM3 viser en markert
reduksjon i melkefosfatidyletanolamin-(PE)-innhold som vist i tabellen nedenfor.
25
Tabell:
Melkefosfatidyletanolamin
kvantifisert
fra
HPTLC-plateskan.
SpectraLipid,
soyalecitinblandingsstandard (nr. SLM43) ble anvendt ved kvantifisering.
Pasteurisert melk
UHT-melk
12983-1-11 12983-1-12
12983-1-13 12983-1-14
18,7 ppm
23,3 ppm
1,5 ppm
3,4 ppm
[0492] Reduksjonen i melke-PE-innhold som en respons på KLM3-enzymatisk behandling og
dermed dannelsen av delvis hydrolysert PE (Lyso-PE) samsvarer med en bedre emulsjonsstabilitet
og mindre tendens til skumming over tid. I tillegg tilsvarer den reduserte melke-PE dannelsen av
NO/EP2190296
83
kolesterolestere, og en reduksjon av fritt kolesterol som gitt i figur 77, og videre en bedre
emulsjonsstabilitet.
Trekanttest
[0493] Organoleptiske forskjeller mellom kontroll- og enzymbehandlet pasteurisert melk eller
5
UHT-melk ble evaluert av en trekanttest. Resultatene fra testene er angitt i tabellen nedenfor:
Tabell: Trekanttester av UHT-melk og pasteurisert melk (PAST).
Test
Resultater av testene (Alpha- Uten
Mengde
Korrekte
nr.
risikoer)
svar
svar
1
UHT uten enzym/UHT med 0
8
1
0,961
8
4
0,259
8
5
0,088
24
10
0,2538
Signif.
svar
Signif.
enzym
3
UHT uten enzym/UHT med 0
enzym
5
UHT uten enzym/UHT med 0
enzym
Gjennomsnitt
1-3-5
UHT uten enzym/UHT med 0
enzym
Test
Resultater av testene (Alpha- Uten
Mengde
Korrekte
nr.
risikoer)
svar
svar
2
PAST uten enzym/PAST med 0
8
3
0,532
8
2
0,805
svar
enzym
4
PAST uten enzym/PAST med 0
enzym
NO/EP2190296
84
Test
Resultater av testene (Alpha- Uten
Mengde
Korrekte
nr.
risikoer)
svar
svar
6
PAST uten enzym/PAST med 0
8
5
0,088
24
10
0,2538
svar
Signif.
enzym
Gjennomsnitt
2-4-6
PAST uten enzym/PAST med 0
enzym
[0494] Trekanttesten viser at behandling med enzymet (KLM3) ikke påvirker smaken av UHTmelken eller den pasteuriserte melken negativt sammenlignet med melk uten enzymtilsetning.
EKSEMPEL 4 - Fremstilling av sjokolademelk
Materialer og fremgangsmåter
5
[0495] Glycerofosfolipidkolesterolacyltransferase KLM3 (K932) (SEQ ID No. 68): 1128 LATU/g
[0496] Standard soyalecitinblanding (ST16) fra Spectra Lipid, Tyskland.
Oppskrift
[0497]
Ingrediensnavn
Prøve nr. 1 DK14636-2-3
Prøve nr. 2 DK14636-2-4
Skummet melk
89,496
89,496
Fløte, 38 % fett
2,804
2,804
Sukrose
6,000
6,000
Kakaopulver D-11A (lys alk.)
1,500
1,500
GRINDSTED® Carrageenan CL 0,020
0,020
220
CREMODAN®
monodiglyserid
SUPER- 0,180
0,180
NO/EP2190296
85
Ingrediensnavn
Prøve nr. 1 DK14636-2-3
KLM3
+ 0,01 LATU/ml
Total %
100
Prøve nr. 2 DK14636-2-4
100
Prosedyre
[0498] Tilsett KLM3 (100 U/ml) til den pasteuriserte skummede melken for prøven DK14636-2-3, i
en dose på 0,100 ml KLM3 per liter melkRør om i to minutterPlasser i kjølerom ved 5 °C i 24
5
timerPlasser også melken for prøve nr. DK14636-2-4 i kjølerommet ved 5 °C i 24 timer.
[0499] Etter 24 timers oppbevaring ved 5 °C, varm opp melken til 70 °C og tilsett alle de andre
ingrediensene.Varm opp til 90 °C i 30 sekunderUHT-behandling (platevarmeveksler) 139-142 °C/24 sek.Homogeniser ved 150 bar/50 bar og 75 °CAvkjøl til 10-15 °COverfør til kjøleromOppbevar
under 5 °C.
10
Fremstilling av kakaomelkeprøver for GC- og TLC-analyse:
[0500] 2 gram kakaomelk ble skalert i et 12 ml testrør med skrulokk. 10 heksan:isopropanol 3:2
ble tilsatt.
[0501] Prøven ble blandet på en Whirley og ekstrahert på en rotablander 30 opm i 30 minutter.
[0502] Testrøret ble sentrifugert ved 1720 rcf i 10 minutter. Den øvre fasen som utgjorde 8,5 ml
15
ble isolert.
[0503] 5 ml løsningsmiddelfase ble overført til et 10 ml Dramglass og fordampet til tørrhet ved 50
°C under en damp av nitrogen. Prøven ble oppløst på nytt i 0,400 ml kloroform: Metanol 2:1 og
anvendt til TLC-analyse.
[0504] Ytterligere 2 ml av løsningsmiddelfasen ble isolert, fordampet ved 50 °C under en damp av
20
nitrogen, og anvendt for GLC-analyse.
Gasskromatografi:
[0505] Gasskromatografi ble anvendt til å måle innholdet av kolesterol og kolesterolester i lipidet
fra kakaomelkeprøvene.
[0506] Følgende
25
CG-oppsett
ble
anvendt: Perkin
Elmer
Autosystem
9000
kapillær
gasskromatograf utstyrt med WCOT-sammensmeltet silikakolonne 12,5 m x 0,25 mm ID x 0,1 µ
filmtykkelse 5 % fenyl-metyl-silikon (CP Sil 8 CB fra Chrompack).Bærergass: Helium.Injektor. PSSI
kald splittinjeksjon (innledende temp. 50 °C oppvarmet til 385 °C), volum 1,0 µl Detektor FID:
395°C
NO/EP2190296
86
Ovnsprogram
1
2
3
Ovnstemperatur, °C.
90
280
350
Isotermal, tid, min.
1
0
10
Temperaturhastighet, °C/min.
15
4
HPTLC:
[0507] HPTLC ble anvendt til å måle innholdet av fosfatidyletanolamin (PE) og fosfatidylkolin(PC) i
det isolerte lipidet fra kakaomelkprøvene.
Applikator: CAMAG-applikator AST4.
5
HPTLC-plate: 20 x 10 cm (Merck nr. 1.05641)
Platen ble aktivert før anvendelse ved tørking i en ovn ved 160 °C i 10 minutter. Påføring: 6,0 µl
ekstraherte lipider løst opp i CHCl3:metanol (2:1) ble påført på HPTLC-platen ved hjelp av AST4applikatoren.
0,1, 0,3, 0,5, 0,8, 1,5 µl av en standard løsning som inneholdt standardkomponentene av
10
fosfolipidene med kjent konsentrasjon ble også påført til HPTLC-platen.
Kjørebuffer 6: Metylacetat:CHCl3:1-propanol:MeOH:0,25 % KCI (25:25:25:10:9) elueringslengde: 7
cm
Utviklingsvæske: 6 % kobberacetat i 16 % H3PO4
[0508] Etter eluering ble platen tørket i en ovn ved 160 °C i 10 minutter, avkjølt og nedsenket i
15
utviklingsvæsken (10 sek), og deretter tørket ytterligere i 6 minutter ved 160 °C. Platen ble vurdert
visuelt og skannet (Camag TLC-skanner). Fosfolipidkomponentene ble kvantifisert basert på
kalibreringskurver fra standard fosfolipidsammensetningen.
Turbiscan:
[0509] Turbiscan MA 2000 ble anvendt til å måle stabiliteten av emulsjonene ved å måle
20
tilbakespredningen av en laserstråle (lumifugering) fra produktet.
RESULTATER
[0510] Resultatene fra GLC- og TLC-analyse av lipid ekstrahert fra kakaomelk behandlet med
KLM3' og en kontrollprøve uten enzymbehandling er sett i tabell 1.
25
Tabell 1: GLC- og TLC-analyse av lipid fra kakaomelk
NO/EP2190296
87
GLC-analyse
Kakaomelk enzymbehandlet ppm
Kakaomelkkontroll-ppm
Frie fettsyrer
300
292
Kolesterol
33
60
Kolesterolester
48
6
Fosfatidyletanolamin
10,5
27,3
Fosfatidylkolin
2,8
24,9
TLC-analyse
[0511] Resultatene i tabell 1 tyder på at nesten halvparten av kolesterolet i kakaomelken er blitt
forestret ved enzymbehandling. Og mengden av fosfolipider i den enzymbehandlede prøven ble
redusert. Resultatene indikerer at KLM3' er mer aktive på fosfatidylkolin enn på
fosfatidyletanolamin i kakaomelken.
5
Lumifugering av sjokolademelk med og uten KLM 3 (DK14636-2)
[0512] Eksperimentelt: Lumifugering ble utført med 300 opm (12xg), sentrifugeglass nr. 2, og
resultatene er vist i figur 79 (DK 14636-2-3) og figur 80 (DK14636-2-4).
Utskillelse (% integral transmisjon):
[0513]
10
Prøve nr.
% endring i overføring/time x 103
Prøve 1 DK 14636-2-3
64
Prøve 2 DK14636-2-4
72
[0514] Resultatene er vist i figur 81.
[0515] Ettersom endringen i transmisjonen er et mål på hastigheten i utskillelsen er prøve 2 den
mest ustabile.
NO/EP2190296
88
[0516] For
å
undersøke
hastigheten
av
utskillelsen
ble
frontsporing
utført.
[0517] Frontsporing, dvs. overvåking av bevegelsen til fronten av utskillelsen, ved 15 %
transmisjon (se figur 82)
Prøve nr.
µm/sek ved 12 x g
mm/måned ved 1 x g
Prøve 1 DK 14636-2-3
0,0067
1,45
Prøve 2 DK 14636-2-4
0,0242
5,23
[0518] Frontsporing ved 50 % transmisjon (se figur 83) sammen med frontsporing ved 15 % (se
5
figur 82) viser forskjellen i utskillelsen av de to prøvene, ettersom prøve 1 har omtrent 1 mm
utskillelse (50 % T) supernatant, mens prøve 2 har en 2 mm mindre gjennomsiktig supernatant.
Dette er resultatet av en bredere partikkelstørrelsesfordeling i prøve 2.
Konklusjon:
[0519] Den enzymbehandlede prøven er den mest stabile prøven, og videre har den den mest
10
snevre partikkelstørrelsesfordelingen
EKSEMPEL 5 - Sammenligning av KLM3' (K932) med forskjellige fosfolipaser
Materialer og fremgangsmåter
Lipidacyltransferase - KLM3' (K932)
[0520] Et fungalt lipolytisk enzym oppnåelig fra Fusarium heterosporum CBS 782.83 (heretter
15
referert til en "KLM1" fra Danisco A/S) som vist i WO2005/087818. Fosfolipase A1 fra Fusarium
oxysporum (LIPOPAN F™) fra Novozymes-fosfolipase A2 fra Porcine pancreas (LIPOMOD 699 L™)
fra Biocatalysts, UK
Standard pasteurisert helmelk (3,5 % fett) fra ARLA i Danmark.
Standard pasteurisert helmelk (3,5 % fett) fra ARLA i Danmark
20
[0521] Enzymbehandlet melk ble undersøkt i forhold til referansemelk med hensyn på stabilitet
mot skumming, visuell evaluering av skumming, bunnsetting og faseseparasjon i prøvene
oppbevart over 60 dager.
[0522] Videre ble mengden av frie fettsyrer i melken analysert for å evaluere nivået av harskhet i
sluttproduktet, og mengden av kolesterol og/eller fosfolipider ble analysert for å få en indikasjon
25
på enzymatisk reaksjonsnivå.
EKSPERIMENTELT
Fremstilling av melk
[0523]
NO/EP2190296
89
Tabell: Oppskrift
Ingredienser i %
Ingrediensnavn
1
2
3
4
Helmelk 3,5 % fett
100 000
100 000
100 000 100 000
KLM1
5
6
100 000
100 000
10
LATU/ml
KLM3'
0,01
0,25
LATU/ml
LATU/ml
LIPOPAN F
5
LATU/m
l
Lipomod 699 L
0,25
e-
PLU/ml
Total %
100
100
100
100
100
100
Prosess
[0524]
5
1. Kald melk ble blandet med enzymporsjon og blandingen ble etterlatt i kjølerom over natten
2. Forvarm til 90 °C i 30 sekunder
3. UHT-behandling ved 142 °C i 3 sek
4. Homogeniser ved 75 °C og 200 bar
5. Avkjøl til 20 °C og fyll aseptisk i 6 flasker
10
Tabell: Sanntidsholdbarhetstest
Fløtelag
Prøve 1
Prøve 2
Prøve 3
Prøve 4
Prøve 5
Prøve 6
4 mm
1 mm
3 mm
2 mm
3 mm
2 mm
NO/EP2190296
90
Bunnfall-lag
Prøve 1
Prøve 2
Prøve 3
Prøve 4
Prøve 5
Prøve 6
0 mm
0 mm
12 mm
1 mm
2 mm
<1 mm
Organoleptisk
evaluering
Typisk
UHT-smak,
lett kokt
Som prøve
1, men litt
mindre
kokt
Kornete
tekstur
med veldig
sterk
Som prøve Som prøve Som prøve
1
1
1
harskning
[0525] Prøver fremstilt ved UHT-bearbeiding som beskrevet tidligere ble oppbevart ved
omgivelsestemperatur (18-25 °C) i en periode på 60 dager, deretter ble prøvene evaluert for
skummingslag samt eventuelt faseseparering eller bunnsetting i bunnen av flaskene.
[0526] Prøvene ble dessuten testet av et trenet panel av 6 personer, der en smaksøkt ble utført
5
som en randomisert trekanttest med prøve 1 (vanlig UHT-melk) anvendt som referanseprøven i
alle testøktene.
[0527] Både for sanntidsobservasjon av stabilitet samt organoleptisk vurdering kan det ses at
prøve 3 (enzymbehandlet med LIPOPAN F™) gir betydelig avvikende resultater, med lavere
stabilitet og sterkt lipolytisk smak i prøvene.
10
[0528] KLM3' (prøvene 2 og 6) reduserte fløtelaget uten å danne et sedimentlag og viste en
markant forbedring sammenlignet med kontroll 1.
[0529] De fosfolipasebehandlede prøvene 3, 4 og 5 kan også redusere fløtelaget sammenlignet
med kontrollen (om enn ikke i samme grad som KLM3'), men dette var på bekostning av dannelse
av et sedimentlag.
15
[0530] Når det gjelder organoleptiske egenskaper hadde prøve 2 (KLM3') en litt mindre kokt smak
sammenlignet med kontrollen 1. Derav har prøve 2 en forbedret smak sammenlignet med
kontrollen 1. Lipopan F™ (prøve 3) produserte melk med dårlige organoleptiske egenskaper,
sannsynligvis på grunn av det høye nivået av frie fettsyrer som ble produsert.
HPTLC- og GLC-analyse
20
[0531] Enzymbehandlet UHT-melk ifølge oppskriftene som er vist i tabellen ble ekstrahert med
organiske løsningsmidler og de isolerte lipidene ble analysert for fosfolipider ved HPTLC og for
kolesterol, kolesterolester og frie fettsyrer (FFA) med gasskromatografi (GLC).
NO/EP2190296
91
Tabell: HPTLC-analyse av hovedfosfolipider i melk-PC = fosfatidylkolin PE = fosfatidyletanolamin.
Prøve
Dosering
PC ppm PE ppm
Sum
PC+PE Hydrolysegrad %
Ppm
Kontroll
26,6
61,4
88,0
0
KLM3*
0,01 TIPU/ml
9,0
10,9
19,9
77
Lipopan F
5 TIPU/ml
3,9
7,8
11,8
87
KLM1
10 TIPU/ml
14,6
14,6
29,2
67
Lipomod 699L 0,25 e-PLU/ml
5,1
2,0
7,2
92
KLM3'
5,0
2,0
7,0
92
TIPU/ml
Tabell: GLC-analyse av kolesterol, kolesterolester og frie fettsyrer (FFA) kolesterol
Prøve
Dosering
FFA total %
Kolesterol %
ester %
Kontroll
0
0,022
0,015
0,0012
0,01
KLM3*
TIPU/g
0,029
0,009
0,0106
Lipopan F
5 TIPU/g
0,620
0,016
0,0014
KLM1
10 TIPU/g
0,159
0,016
0,0015
Lipomod 699L
0,25 e-PLU
0,042
0,014
0,0010
KLM3'
TIPU/g
0,065
0,001
0,0215
NO/EP2190296
92
[0532] Resultatene danner HPTLC-analyse (se tabellen ovenfor) som indikerer at alle enzymene
som ble testet var i stand til å hydrolysere en hoveddel av fosfolipidene i melken fra 77 % til 92 %,
men bare lipidacyltransferasen KLM3' kunne foreta en overføringsreaksjon mellom fettsyre og
kolesterol under dannelsen av kolesterolester.
5
[0533] Selv om alle enzymene produserte en høy grad av fosfolipidhydrolyse, var mengden av
produserte frie fettsyrer vesentlig forskjellig. Basert på mengden av fosfolipidhydrolyse og fri
fettsyre som produseres, er det på molar basis mulig å beregne mengden av fri fettsyre i forhold til
mengden av produserte fosfolipider (se tabellen nedenfor). Disse resultatene viser tydelig at de
mikrobielle fosfolipasene A1 produserer mye mer fri fettsyre enn KLM3, ettersom disse
10
fosfolipasene
ikke
er
spesifikke,
men
også
hydrolyserer
triglyserider
(melkefett).
Bukspyttkjertelfosfolipase (Lipomod 699 L) er kjent for å være veldig spesifikk for fosfolipidene,
men produserer fortsatt mer frie fettsyrer enn den lave doseringen av KLM3'. Ved den høye
doseringen av KLM3' produseres mer fettsyre enn bukspyttkjertelfosfolipase, men dette forklares
ved aktivitet på lyso-fosfolipider. Lipopan F produserte den høyeste mengden av fri fettsyre på
15
grunn av hydrolytisk aktivitet på triglyserider, som bidro til den negative evalueringen i den
organoleptiske testen.
Tabell: Dannelse av fri fettsyre (FFA) i forhold til mengden av hydrolyserte fosfolipider
Prøve
Kontroll
Dosering
0
FFA-endring
PL-endring
FFA/PL-mol.
mmol/kg
mmol/kg
forhold
0
0
-
0,01
KLM3*
TIPU/g
0,279
0,093
3
Lipopan F
5 TIPU/g
21,7
0,103
210
KLM1
10 TIPU/g
4,98
0,080
62
Lipomod 699L
0,25 e-PLU
0,742
0,110
7
KLM3'
TIPU/g
1,58
0,110
14
NO/EP2190296
93
[0534] Konklusjon: KLM3' viste en forbedret stabilitet (med et redusert fløtelag uten dannelse av
et sedimentlag) sammenlignet med både kontroll (uten enzym), og de sammenlignende
fosfolipaseenzymene. Uten ønske om å være bundet av teori kan årsaken til den forbedrede
stabiliteten være på grunn av en redusert partikkelstørrelsesfordeling av fettkulene i melken som
5
behandles med KLM3'.
[0535] En ytterligere viktig effekt er at KLM3' produserer mye mindre fri fettsyre sammenlignet
med den samme konsentrasjonen av fosfolipase. Under forlenget oppbevaring ved
omgivelsestemperaturer kan fri fettsyre lett resultere i mer oksidasjon av melken og dermed
forårsake organoleptiske problemer senere. Dermed kan høyt fritt fettsyreinnhold forårsake
10
betydelige problemer i UHT-melk, som vanligvis oppbevares ved omgivelsestemperatur i mer enn
én måned.
NO/EP2190296
94
Patentkrav
1. Fremgangsmåte for fremstilling av UHT-melk, der fremgangsmåten omfatter blanding av en
lipidacyltransferase og melk eller en fraksjon av denne ved en temperatur og i en inkubasjonstid
som er effektiv for å sikre at det er minst 5 % transferaseaktivitet målt ved den molare mengden
5
av kolesterolester dannet ved acyloverføring fra fosfolipider eller triacylglyserider i melk til
kolesterol, i forhold til mengden kolesterol som opprinnelig er tilgjengelig, beregnet ved hjelp av
den følgende ligningen:
Transferaseaktivitet = (mol/l kolesterolester(t) – mol/l kolesterolester(0))x100
mol/l kolesterol(0)
10
der:
Kolesterolester (t) = mengden kolesterolester ved tidspunktet t
Kolesterolester (0) = mengden kolesterolester ved tidspunktet 0
Kolesterol (0) = mengden kolesterol i melk ved tidspunktet 0,
og behandling av den enzymbehandlede melken ved ultravarmebehandling for å produsere UHT-
15
melk.
2. Anvendelse av en lipidacyltransferase under fremstilling av UHT-melk for minst én av forbedring
av stabiliteten, særlig langtidsstabiliteten, den mottakelige sensoriske forskjellen eller lukten
og/eller smaken av UHT-melken.
3. Anvendelse av en lipidacyltransferase under fremstilling av UHT-melk for å redusere
20
kolesterolinnholdet i UHT-melken.
4. Anvendelse av en lipidacyltransferase under fremstilling av UHT-melk for å eliminere eller
redusere skumming i UHT-melken.
5. Fremgangsmåten eller anvendelsen ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, hvorved
lipidacyltransferasen tilsettes til melken eller en fraksjon av denne, og inkuberes med dette ved en
25
temperatur på mindre enn omtrent 20 °C, fortrinnsvis mindre enn omtrent 10 °C.
6. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, hvorved
lipidacyltransferasen tilsettes til melken eller en fraksjon av denne, og inkuberes med denne ved
en temperatur på mellom omtrent 1 °C og 10 °C, fortrinnsvis mellom omtrent 3 °C og 7 °C, mer
foretrukket omtrent 5 °C.
30
7. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-6, hvorved
lipidacyltransferasen omfatter et GDSx-motiv der X er én eller flere av ett L-, A-, V-, I-, F-, Y-, H-, Q-,
T-, N-, M- eller S- og/eller ett GANDY-motiv.
8. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-7, hvorved
lipidacyltransferaseenzymet omfatter aminosyresekvensmotivet GDSX, der X er én eller flere av de
35
følgende aminosyrerestene L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M eller S.
NO/EP2190296
95
9. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-8, hvorved
lipidacyltransferasen kan oppnås, fortrinnsvis oppnås, fra en organisme fra én eller flere av de
følgende slektene: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium,
Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella,
5
Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia,
Xanthomonas og Candida.
10. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge krav 9, hvorved lipidacyltransferasen er oppnåelig,
fortrinnsvis oppnådd, fra en organisme fra slekten Aeromonas.
11. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-10, hvorved
10
lipidacyltransferasen er et polypeptid oppnådd ved uttrykking av hvilken som helst av
nukleotidsekvensene vist som SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 44, SEQ ID
No. 46, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 53,
SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 59, SEQ ID
No. 60, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 62 eller SEQ ID No. 63 eller en nukleotidsekvens som har 75 %
15
eller mer identitet med denne.
12. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-11, hvorved
lipidacyltransferasen er et polypeptid oppnådd ved uttrykking av:
a. nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 49 eller en nukleotidsekvens som har 75 % eller mer
identitet med denne;
20
b. en nukleinsyre som koder for et polypeptid der polypeptidet er minst 70 % identisk med
polypeptidsekvensen vist i SEQ ID No. 16 eller med polypeptidsekvensen vist i SEQ ID No. 68;
eller
c. en nukleinsyre som hybridiserer under middels stringensforhold til en nukleinsyreprobe
omfattende nukleotidsekvensen vist som SEQ ID No. 49.
25
13. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-12, hvorved
lipidacyltransferasen er et polypeptid omfattende hvilken som helst av aminosyresekvensene vist
som SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No.
8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID
No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 35,
30
SEQ ID No. 68 eller en aminosyresekvens som har 75 % eller mer homologi med denne.
14. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-13, hvorved
lipidacyltransferasen er et polypeptid omfattende aminosyresekvensene vist som SEQ ID No. 68
eller en aminosyresekvens som har 75 % eller mer homologi med denne.
15. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 12-14, hvorved
35
polypeptidet oppnås ved uttrykking i Bacillus licheniformis.
NO/EP2190296
96
FIGUR 1
FIGUR 2
5
FIGUR 3
FIGUR 4
10
NO/EP2190296
97
FIGUR 5
5
FIGUR 6
FIGUR 7
10
FIGUR 8
15
NO/EP2190296
98
FIGUR 9
NO/EP2190296
99
FIGUR 10 (SEQ ID No. 9)
5
FIGUR 11
FIGUR 12
10
FIGUR 13 (SEQ ID No. 12)
15
FIGUR 14 (SEQ ID No. 13)
NO/EP2190296
100
FIGUR 15 (SEQ ID No. 14)
5
FIGUR 16 (SEQ ID No. 15)
10
FIGUR 17 (SEQ ID No. 19)
FIGUR 18 (SEQ ID No. 25)
15
NO/EP2190296
101
FIGUR 19
Figur 20
5
FIGUR 21
10
NO/EP2190296
102
FIGUR 22
5
FIGUR 23
FIGUR 24
10
FIGUR 25
15
NO/EP2190296
103
FIGUR 26
5
FIGUR 27
10
FIGUR 28
NO/EP2190296
104
FIGUR 29
FIGUR 30
5
NO/EP2190296
105
FIGUR 31
NO/EP2190296
106
FIGUR 32
NO/EP2190296
107
FIGUR 33
5
FIGUR 34
NO/EP2190296
108
FIGUR 35
NO/EP2190296
109
FIGUR 36
5
Figur 37
NO/EP2190296
110
FIGUR 38
5
FIGUR 39
NO/EP2190296
111
FIGUR 40
5
FIGUR 41
NO/EP2190296
112
Figur 42
NO/EP2190296
113
FIGUR 43
SEQ ID No 17 som er aminosyresekvensen til en lipidacyltransferase fra Candida
parapsilosis;
5
FIGUR 44
10
SEQ ID No 18 som er aminosyresekvensen til en lipidacyltransferase fra Candida
parapsilosis;
NO/EP2190296
114
FIGUR 45
NO/EP2190296
115
FIGUR 46
NO/EP2190296
116
FIGUR 47
NO/EP2190296
117
NO/EP2190296
118
NO/EP2190296
119
NO/EP2190296
120
NO/EP2190296
121
FIGUR 51
NO/EP2190296
122
FIGUR 52
5
FIGUR 53
NO/EP2190296
123
FIGUR 54
NO/EP2190296
124
FIGUR 55
NO/EP2190296
125
FIGUR 56
NO/EP2190296
126
FIGUR 57 (SEQ ID No 49)
NO/EP2190296
127
FIGUR 58 (SEQ ID No 50)
5
FIGUR 59 (SEQ ID No 51)
FIGUR 60 (SEQ ID No 52)
10
NO/EP2190296
128
FIGUR 61 (SEQ ID No 53)
5
FIGUR 62 (SEQ ID No. 54)
FIGUR 63 (SEQ ID No. 55)
10
NO/EP2190296
129
FIGUR 64 (SEQ ID No. 56)
5
FIGUR 65 (SEQ ID No. 57)
FIGUR 66 (SEQ ID No. 58)
10
NO/EP2190296
130
FIGUR 67 (SEQ ID No. 59)
5
FIGUR 68 (SEQ ID No. 60)
FIGUR 69 (SEQ ID No. 61)
10
NO/EP2190296
131
FIGUR 70 (SEQ ID No. 62)
NO/EP2190296
132
FIGUR 71 (SEQ ID No. 63)
NO/EP2190296
133
FIGUR 72 (SEQ ID No. 24)
NO/EP2190296
134
FIGUR 73
NO/EP2190296
135
FIGUR 74
Topp 5 mm 20 °, tilbakespredning relativ
5
NO/EP2190296
136
FIGUR 75
Bunn 5 mm 20 °C, tilbakespredning relativ
5
NO/EP2190296
137
FIGUR 76
NO/EP2190296
138
FIGUR 77
5
FIGUR 78
NO/EP2190296
139
FIGUR 79
5
FIGUR 80
NO/EP2190296
140
FIGUR 81
5
FIGUR 82
NO/EP2190296
141
FIGUR 83