Kloningsstratgier
RT-PCR og subcellulær lokalisering Bio4600 RT-PCR for å klone transkripter raskt for å undersøke exon-intron-overganger for å undersøke når og hvor et gen er uttrykt isolering av mRNA 1. tråd cDNA syntese med Revers Transkriptase PCR med genspesifikke primere RT-PCR – rask kloning av transkripter isolering av mRNA revers transkripsjon innsetting i egnet vektor Isolering av mRNA homogenisering av vev binding av oligo dT til polyA haler isolering ved hjelp av magnetisk kuler oligo dT som primer for revers transkriptase RT-PCR – rask kloning av transkripter spesifikke primere egnet polymerase metode for å sette PCR-produkt inn i vektor Tradisjonell kloning – bruk av restriksjonsenzymer og ligase Vi trenger enzymer med et egnet antall gjenkjenningsseter i fragmentet vi vil klone og i vektoren tid til kutting og ligering metoder til å selektere rekombinante plasmider Nye kloningsmetoder enzymatisk rekombinasjon kortere tid mer effektiv seleksjon Topo-systemet (topoisomerase) Kloning ved hjelp av topoisomerase topoisomeraseI fra Vaccinia virus kovalent bundet til en linearisert vektor med T-overheng I 3’enden meget rask reaksjon Subcellulær lokalisering subcellulær lokalisering forteller om proteinfunksjon metode for å se hvor proteinet er fusjonsprotein med Green Fluorescent Protein (GFP) egnete celler for å se proteinet Subcellulær lokalisering sterkt konstitutive promoter (35S) løkceller partikkel bombardement Nye kloningsmetoder enzymatisk rekobinasjon kortere tid mer effektiv seleksjon Gateway-teknologi (λ setespesifikk rekombiansjon) Litt λ-biologi! Litt λ-biologi DNA replication head right end left end recombination immediate early tail lysis pE delayed early pL pM pO OL OR delayed COS B C Nu3 D E FI FII Z U V G T LEFT ARM p – promoter O - operator H M L K I J att int xis exo bet gam N late pR’ pR Nu1 A W early cI cro cII O P Q RIGHT ARM S R COS late Sete-spesifikk rekombinasjon λ og E.coli att-seter har 15 bp felles kjerne-sekvens, men ulike flankeområder int og IHF er nødvendig for integrering int, xis og IHF er nødvendig for eksisjon Gateway-kloning Gateway-kloning effektiv rekombinasjon positiv og negativ seleksjon Gener vi arbeider med IDA og IDA-like gener (IDL) koder trolig for liagander antas å være eksportert ut av cellen små gener uten intron AtIDL2 AtIDL3 AtIDL1 IDA AtIDL4 AtIDL5 : : : : : : * 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * MSSRNQRSRITSSFFVSFFTRTILLLLILLLGFC-NGARTNTNVFNSK-----------PHKKHNDAVS-SSTKQFLGFLPRHFPVPASGPSRKHNDIGLLSW--HRSSP MSSRSHRSRK----YQLTRTIPILVLLLVLL-SCCNGART-TNVFNTSSPPKQKDVVSPPHDHVHHQVQDHKSVQFLGSLPRQFPVPTSGPSRKHNEIGLSST---KT-----------------MFMT-LYIVFLLIF-GSYNATARI------GPIKLSETEIVQTRSRQEIIGGFTFKGRVFHSFS-KRVLVPPSGPSMRHNSV-VNNL--KH-------------MAPCRTMMVLLCFVLFLAASSSC-VAA---------------ARIGATMEMKKNIKRLTFKNSHIFGYLPKGVPIPPSAPSKRHNSF-VNSL--PH---MYPTRPHYWRRRLSINRPQAFLLLILCLFFI-HHCDASRF----SSSS-----VFYRNPNYDH--SNNTVRRGHFLGFLPRHLPVPASAPSRKHNDIGIQALLSP-------------MGNKRIKAMMILVVMIMMVFSW-RICEADSLR-RYSSSS--RPQRFFKNQG----FNGDDYPPESFSGFLPKTLPIPHSAPSRKHNVYGLQSTNS-HRCP 6 A f g lp4 p6P S PS 4HN 6 : : : : : : 95 99 79 77 93 91 Gener vi arbeider med SET-domene gener proteiner involvert i kromatinmodulering SET-domene som modifiserer histon-haler
© Copyright 2024