RT-PCR og subcellulær
lokalisering
Bio4600
RT-PCR



for å klone transkripter raskt
for å undersøke exon-intron-overganger
for å undersøke når og hvor et gen er uttrykt



isolering av mRNA
1. tråd cDNA syntese med Revers Transkriptase
PCR med genspesifikke primere
RT-PCR –
rask kloning av
transkripter



isolering av mRNA
revers transkripsjon
innsetting i egnet
vektor
Isolering av mRNA




homogenisering av vev
binding av oligo dT til polyA
haler
isolering ved hjelp av
magnetisk kuler
oligo dT som primer for
revers transkriptase
RT-PCR –
rask kloning av
transkripter



spesifikke primere
egnet polymerase
metode for å sette
PCR-produkt inn i
vektor
Tradisjonell kloning –
bruk av restriksjonsenzymer
og ligase

Vi trenger



enzymer med et egnet
antall gjenkjenningsseter i
fragmentet vi vil klone og i
vektoren
tid til kutting og ligering
metoder til å selektere
rekombinante plasmider
Nye kloningsmetoder



enzymatisk rekombinasjon
kortere tid
mer effektiv seleksjon

Topo-systemet (topoisomerase)
Kloning ved hjelp av topoisomerase


topoisomeraseI fra
Vaccinia virus
kovalent bundet til en
linearisert vektor med
T-overheng I 3’enden
meget rask reaksjon
Subcellulær lokalisering

subcellulær lokalisering forteller om
proteinfunksjon

metode for å se hvor proteinet er


fusjonsprotein med Green Fluorescent Protein (GFP)
egnete celler for å se proteinet
Subcellulær
lokalisering



sterkt konstitutive
promoter (35S)
løkceller
partikkel
bombardement
Nye kloningsmetoder



enzymatisk rekobinasjon
kortere tid
mer effektiv seleksjon

Gateway-teknologi (λ setespesifikk
rekombiansjon)
Litt λ-biologi!
Litt λ-biologi
DNA
replication
head
right end
left end
recombination
immediate
early
tail
lysis
pE
delayed early
pL
pM pO
OL
OR delayed
COS
B
C Nu3 D E FI FII Z U V G T
LEFT ARM
p – promoter
O - operator
H
M L K I
J
att int xis
exo bet gam
N
late
pR’
pR
Nu1 A W
early
cI cro cII O
P
Q
RIGHT ARM
S R
COS
late
Sete-spesifikk
rekombinasjon



λ og E.coli att-seter
har 15 bp felles
kjerne-sekvens,
men ulike
flankeområder
int og IHF er
nødvendig for
integrering
int, xis og IHF er
nødvendig for
eksisjon
Gateway-kloning
Gateway-kloning


effektiv
rekombinasjon
positiv og negativ
seleksjon
Gener vi arbeider med

IDA og IDA-like gener (IDL)
koder trolig for liagander
antas å være eksportert ut av cellen
små gener uten intron



AtIDL2
AtIDL3
AtIDL1
IDA
AtIDL4
AtIDL5
:
:
:
:
:
:
*
20
*
40
*
60
*
80
*
100
*
MSSRNQRSRITSSFFVSFFTRTILLLLILLLGFC-NGARTNTNVFNSK-----------PHKKHNDAVS-SSTKQFLGFLPRHFPVPASGPSRKHNDIGLLSW--HRSSP
MSSRSHRSRK----YQLTRTIPILVLLLVLL-SCCNGART-TNVFNTSSPPKQKDVVSPPHDHVHHQVQDHKSVQFLGSLPRQFPVPTSGPSRKHNEIGLSST---KT-----------------MFMT-LYIVFLLIF-GSYNATARI------GPIKLSETEIVQTRSRQEIIGGFTFKGRVFHSFS-KRVLVPPSGPSMRHNSV-VNNL--KH-------------MAPCRTMMVLLCFVLFLAASSSC-VAA---------------ARIGATMEMKKNIKRLTFKNSHIFGYLPKGVPIPPSAPSKRHNSF-VNSL--PH---MYPTRPHYWRRRLSINRPQAFLLLILCLFFI-HHCDASRF----SSSS-----VFYRNPNYDH--SNNTVRRGHFLGFLPRHLPVPASAPSRKHNDIGIQALLSP-------------MGNKRIKAMMILVVMIMMVFSW-RICEADSLR-RYSSSS--RPQRFFKNQG----FNGDDYPPESFSGFLPKTLPIPHSAPSRKHNVYGLQSTNS-HRCP
6
A
f g lp4 p6P S PS 4HN 6
:
:
:
:
:
:
95
99
79
77
93
91
Gener vi arbeider med

SET-domene
gener


proteiner
involvert i
kromatinmodulering
SET-domene
som
modifiserer
histon-haler