3 - St. Olavs Hospital
Slektskapsanalyser av molekylærgenetiske data Andreas Radtke Smittevernoverlege St.Olavs hospital 1 Molekylærgenetiske metoder • PFGE • MLST • MLVA • • • • AFLP SNP CRISPR … • Helgenomsekvensering 2 Ernst Haeckel, 1866 3 4 5 Ned-opp eller opp-ned tre • Kan være vanskelig å vite hvem som er grunnleggeren av en cluster • Enklere å definere slektskap mellom par av stammer og definere opprinnelse derfra 6 Mikrobiologisk phylogeni • Ingen tokogeni • Mutasjon og genopptak som drivende • Generasjonstid • Egenskap A Egenskap B Stamme 1 x1 y0 Stamme 2 x0 y1 7 Typingens formål? • Overvåkning av infeksjonssykdom – Nasjonal og internasjonal • Undersøkelse av et utbrudd • Patogenese og forløp av en infeksjon – Virulente og avirulente stammer • Bakteriell populasjonsgenetikk – Species eller subspeciesnivå • Epidemiologisk konkordans – Gir analysen et sant bilde av epidemiologien? – Gjelder både metoden og analysen 8 Overveininger for en typing • Tid og geografi – Enklere å finne korrekt slektskap mellom stammer fra samme tid og geografisk område • Bias i stammesamlingen? – F.eks. stammesamling GBS fra storfe i Trøndelag 9 Oppløsningsevne av typingsmetoder Høy oppløslighet, stor datamengde, f.eks. helgenomsekvensering Lav oppløslighet, liten datamengde, f.eks. antibiogramm 10 Genetisk klokke og typingsmetoder Mål: utbruddsoppklaring Mål: epidemiologisk overvåkning • hurtige forandringer/mutasjoner • Konserverte områder • Mindre diversitet • Bringe frem mest mulig diversitet MLST, MLVA? PFGE (, AFLP), MLVA 11 Dynamikk av genomer • Evolusjonær mutasjonsrate – Mutasjonsrate av et gen kjent? • Isersjon/delesjon av sekvenser gir «hopp» i evolusjonen • Plasmider 12 Monomorphe species • Lav diversitet i sequensen • Gir lav oppløsning i en rekke metoder, f.eks. MLST • Viktige monomorfe species: – – – – – M.tuberculosis Y.pestis B. anthracis Salmonella enterocolica (serovar thyphi) M. leprae 13 Interpretasjon av DNA fragmentmønster • F.eks. PFGE • Antall bånd • Prosentuell likhet av mønstrene • Mutasjoner må være i restriksjonsområde for å gi forskjell 14 Interpretasjon av PFGE (etter Tenover) • Ingen forskjell • 1-4 bånds forskjell: nært beslektet • 5-8 bånds forskjell: mulig beslektet • …men hvor mange mutasjoner ligger bak? • Best å ha 10-15 bånd valg av restriksjonsenzym Tenover et al, J Clin Microbioll, 1995, 2233ff 15 Analyse av MLVA profiler • Populasjonsanalyser kan indikere mutasjonsraten i repetisjonsområder • Mutasjonsmønster kjent? – Stegvis mutasjon mot tilfeldig • Mutasjoner kan forekomme under et utbrudd 16 Interpretasjon av data fra DNA sekvenser • Kvalitetssjekk av sekvenser svært viktig • Kuratorer forlanger ofte rådataen fra sekvenseringen før de godkjenner nye alleler 17 Typingsmetoder og standartisering • Gelbaserte metoder mot molekylære metoder • Databaser må bli bygget på – Standardiserte protokoller – Strenge kuratorer – Ringtester • F.eks. PulseNet, MLST.net, spa-typing 18 eBurst • Utviklet for MLST • Analyserer hovedsakelig relasjonen mellom nært beslektede genotyper (klonale komplekser) • Slektskap (distanse) mellom klonale komplekser blir ikke analysert • Tar ikke hensyn til antall stammer i hver ST 19 Minimum spanning tree MST er et resultat av en graph som knytter alle hjørner sammen og gi dem en vekt. 20 Neighbor joining • Det initiale treet er stjerneformet, nye noder blir tilføyet endene • Forutsetter ikke en konstant evolusjonsrate • Distans mellom to par må være kjent og er sentral • Rask og ok for store dataset • Avhengig av korrekt evolusjonsmodell 21 UPGMA • Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean • Gir dendrogram • Forutsetter en konstant evolusjonsrate “Molekylær klokke” Enkleste metode for konstruksjon av et tre 22 Konklusjon • Analyse må ta hensyn til: – Epidemiologisk spørsmålstilling – Typingsmetode – Interpretasjonsmetode – Tilgjenglige epidemiologiske data må trekkes inn i tolkningen 23
© Copyright 2024