Slektskapsanalyser av
molekylærgenetiske data
Andreas Radtke
Smittevernoverlege
St.Olavs hospital
1
Molekylærgenetiske metoder
• PFGE
• MLST
• MLVA
•
•
•
•
AFLP
SNP
CRISPR
…
• Helgenomsekvensering
2
Ernst Haeckel, 1866
3
4
5
Ned-opp eller opp-ned tre
• Kan være vanskelig å vite hvem som er grunnleggeren
av en cluster
• Enklere å definere slektskap mellom par av stammer og
definere opprinnelse derfra
6
Mikrobiologisk phylogeni
• Ingen tokogeni
• Mutasjon og genopptak som drivende
• Generasjonstid
•
Egenskap A
Egenskap B
Stamme 1
x1
y0
Stamme 2
x0
y1
7
Typingens formål?
• Overvåkning av infeksjonssykdom
– Nasjonal og internasjonal
• Undersøkelse av et utbrudd
• Patogenese og forløp av en infeksjon
– Virulente og avirulente stammer
• Bakteriell populasjonsgenetikk
– Species eller subspeciesnivå
• Epidemiologisk konkordans
– Gir analysen et sant bilde av epidemiologien?
– Gjelder både metoden og analysen
8
Overveininger for en typing
• Tid og geografi
– Enklere å finne korrekt slektskap mellom stammer fra samme tid og
geografisk område
• Bias i stammesamlingen?
– F.eks. stammesamling GBS fra storfe i Trøndelag
9
Oppløsningsevne av typingsmetoder
Høy
oppløslighet,
stor
datamengde,
f.eks. helgenomsekvensering
Lav
oppløslighet,
liten
datamengde,
f.eks.
antibiogramm
10
Genetisk klokke og typingsmetoder
Mål:
utbruddsoppklaring
Mål:
epidemiologisk overvåkning
• hurtige
forandringer/mutasjoner
• Konserverte områder
• Mindre diversitet
• Bringe frem mest mulig
diversitet
 MLST, MLVA?
 PFGE (, AFLP), MLVA
11
Dynamikk av genomer
• Evolusjonær mutasjonsrate
– Mutasjonsrate av et gen kjent?
• Isersjon/delesjon av sekvenser gir «hopp» i evolusjonen
• Plasmider
12
Monomorphe species
• Lav diversitet i sequensen
• Gir lav oppløsning i en rekke metoder, f.eks. MLST
• Viktige monomorfe species:
–
–
–
–
–
M.tuberculosis
Y.pestis
B. anthracis
Salmonella enterocolica (serovar thyphi)
M. leprae
13
Interpretasjon av DNA fragmentmønster
• F.eks. PFGE
• Antall bånd
• Prosentuell likhet av
mønstrene
• Mutasjoner må være i
restriksjonsområde for å gi
forskjell
14
Interpretasjon av PFGE (etter Tenover)
• Ingen forskjell
• 1-4 bånds forskjell: nært beslektet
• 5-8 bånds forskjell: mulig beslektet
• …men hvor mange mutasjoner ligger
bak?
• Best å ha 10-15 bånd
valg av restriksjonsenzym
Tenover et al, J Clin Microbioll, 1995, 2233ff
15
Analyse av MLVA profiler
• Populasjonsanalyser kan indikere mutasjonsraten i
repetisjonsområder
• Mutasjonsmønster kjent?
– Stegvis mutasjon mot tilfeldig
• Mutasjoner kan forekomme under et utbrudd
16
Interpretasjon av data fra DNA sekvenser
• Kvalitetssjekk av sekvenser svært viktig
• Kuratorer forlanger ofte rådataen fra sekvenseringen før
de godkjenner nye alleler
17
Typingsmetoder og standartisering
• Gelbaserte metoder mot molekylære metoder
• Databaser må bli bygget på
– Standardiserte protokoller
– Strenge kuratorer
– Ringtester
• F.eks. PulseNet, MLST.net, spa-typing
18
eBurst
• Utviklet for MLST
• Analyserer hovedsakelig relasjonen mellom nært
beslektede genotyper (klonale komplekser)
• Slektskap (distanse) mellom klonale komplekser blir ikke
analysert
• Tar ikke hensyn til antall stammer i hver ST
19
Minimum spanning tree
MST er et resultat av en graph som knytter alle hjørner
sammen og gi dem en vekt.
20
Neighbor joining
• Det initiale treet er stjerneformet, nye noder blir tilføyet
endene
• Forutsetter ikke en konstant evolusjonsrate
• Distans mellom to par må være kjent og er sentral
• Rask og ok for store dataset
• Avhengig av korrekt evolusjonsmodell
21
UPGMA
• Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean
• Gir dendrogram
• Forutsetter en konstant evolusjonsrate
“Molekylær klokke”
Enkleste metode for konstruksjon av et tre
22
Konklusjon
• Analyse må ta hensyn til:
– Epidemiologisk spørsmålstilling
– Typingsmetode
– Interpretasjonsmetode
– Tilgjenglige epidemiologiske data må trekkes inn i
tolkningen
23