Laboration:DNA-analysmedsnabb-PCR(nivå3)
Syftetmedlaborationen:
SyftetärattförståhurPCR-metodenfungerarochattlärasigattutförametodenipraktiken.
PCR-metodenskervanligtvisi3steg:
”Snabb-PCR”innebärattreaktionenenbartskeri2steg
IvanligafallskerPCR-metodenitresteg(somovanståendebildvisar).Understeg2sänks
temperaturentillräckligtmycketsåattprimrarnakanbindaoptimalttilldesekvensersomska
kopieras.Förhögtemperaturinnebärattprimrarnaharförhögrörelseenergiochdärmedharsvårt
attbindaoptimalt.Idenna”snabb-variant”användsdockprimerssomkanbindatillDNA:tviden
relativthögtemperaturochvidsammatemperatursomävenkrävsförsteg3.Detinnebärattsteg2
och3kanskesamtidigtvilketminskarPCR-tidenmedcaentredjedel.Idennalaborationkrävs
dessutomenbart20cykler(iblandkrävsuppemot40cykler)förattfåtillräckligamängderDNAvilket
ytterligareminskartiden.
Moment1:KopieraDNA-provetmedPCR
VarjeelevgruppkopierarettvarsittDNA-provmedPCR(max10elevgrupper):
Optimaltärocksåomläraren(ellerenelevgrupp)förberederkontroll-DNA(kräver
ejPCR):
Moment2:Tillverkagelochbuffert
A) Tillverkaelektroforesgelenmedhjälpavnedanståendebildserieochtabell1.
B) Tillverkaelektroforesbuffertenmedhjälpavtabell2.
Tabell1:Tillverkaelektroforesgelen(agaroskoncentration1,0%).
Agarospulver(g)
0,25
Koncentrerad
buffert(ml)
0,5
Destilleratvatten
(ml)
24,5
Tabell2:Tillverkaelektroforesbufferten
Koncentrerad
buffert(ml)
8
Destilleratvatten
(ml)
392
Totalvolym(ml)
400
Totalvolym(ml)
25
Moment3:AppliceraDNA-provernaochkörelektroforesen
A) Kontrolleraattnihargjortpunkt5under”Moment1”innannigårvidaretillB.
B) AppliceraDNA-proverna,32ul,enligtnedanståendebilder.Ibrunn1applicerasDNA-stegen
(lärarenhardetprovröret).Ibrunn2appliceras”kontroll-DNA”omensådanharförberetts.I
övrigabrunnarapplicerasgruppernasDNA-prover.Fleragrupperkanalltsåanvändasamma
gel.Obs.FörattunderlättaappliceringenavDNA-provernaigelenkansteg9görasföresteg
8.
C) Körigångelektroforesen.Minst35minuterskadenkörasmenoptimalastär60minuter.
Moment3:Färgagelenochanalyseraresultatet
A) Färgagelenmedhjälpavnedanståendebildserie.Använd”kort”medetidiumbromid.Tabort
skyddsplastenochläggsedankortetmotgelen.Obs.Användskyddshandskarochhålltilli
ettdragskåp!
B) Vänta10minuter(ävenomdetstår5minibildserien!)innannitarbortkortenochkollar
resultatetpåUV-bordet.
C) Slängetidiumbromidkorteniensärskildbehållare(lärarenvisar).