Laboration:DNA-analysmedsnabb-PCR(nivå3) Syftetmedlaborationen: SyftetärattförståhurPCR-metodenfungerarochattlärasigattutförametodenipraktiken. PCR-metodenskervanligtvisi3steg: ”Snabb-PCR”innebärattreaktionenenbartskeri2steg IvanligafallskerPCR-metodenitresteg(somovanståendebildvisar).Understeg2sänks temperaturentillräckligtmycketsåattprimrarnakanbindaoptimalttilldesekvensersomska kopieras.Förhögtemperaturinnebärattprimrarnaharförhögrörelseenergiochdärmedharsvårt attbindaoptimalt.Idenna”snabb-variant”användsdockprimerssomkanbindatillDNA:tviden relativthögtemperaturochvidsammatemperatursomävenkrävsförsteg3.Detinnebärattsteg2 och3kanskesamtidigtvilketminskarPCR-tidenmedcaentredjedel.Idennalaborationkrävs dessutomenbart20cykler(iblandkrävsuppemot40cykler)förattfåtillräckligamängderDNAvilket ytterligareminskartiden. Moment1:KopieraDNA-provetmedPCR VarjeelevgruppkopierarettvarsittDNA-provmedPCR(max10elevgrupper): Optimaltärocksåomläraren(ellerenelevgrupp)förberederkontroll-DNA(kräver ejPCR): Moment2:Tillverkagelochbuffert A) Tillverkaelektroforesgelenmedhjälpavnedanståendebildserieochtabell1. B) Tillverkaelektroforesbuffertenmedhjälpavtabell2. Tabell1:Tillverkaelektroforesgelen(agaroskoncentration1,0%). Agarospulver(g) 0,25 Koncentrerad buffert(ml) 0,5 Destilleratvatten (ml) 24,5 Tabell2:Tillverkaelektroforesbufferten Koncentrerad buffert(ml) 8 Destilleratvatten (ml) 392 Totalvolym(ml) 400 Totalvolym(ml) 25 Moment3:AppliceraDNA-provernaochkörelektroforesen A) Kontrolleraattnihargjortpunkt5under”Moment1”innannigårvidaretillB. B) AppliceraDNA-proverna,32ul,enligtnedanståendebilder.Ibrunn1applicerasDNA-stegen (lärarenhardetprovröret).Ibrunn2appliceras”kontroll-DNA”omensådanharförberetts.I övrigabrunnarapplicerasgruppernasDNA-prover.Fleragrupperkanalltsåanvändasamma gel.Obs.FörattunderlättaappliceringenavDNA-provernaigelenkansteg9görasföresteg 8. C) Körigångelektroforesen.Minst35minuterskadenkörasmenoptimalastär60minuter. Moment3:Färgagelenochanalyseraresultatet A) Färgagelenmedhjälpavnedanståendebildserie.Använd”kort”medetidiumbromid.Tabort skyddsplastenochläggsedankortetmotgelen.Obs.Användskyddshandskarochhålltilli ettdragskåp! B) Vänta10minuter(ävenomdetstår5minibildserien!)innannitarbortkortenochkollar resultatetpåUV-bordet. C) Slängetidiumbromidkorteniensärskildbehållare(lärarenvisar).
© Copyright 2024