トラブルシューティングトラブル予想される原因 Competent が温度上昇により溶解導入組換えプラスミドの純度が低い ATP が反応系に含まれていない対策他の Competent を用意して下さい。組換えプラスミドを再度精製して下さい。 ATP を添加して下さい。末端を確認して下さい。特に認識配列に Py、Pu、N を含む制限酵素断片の場合には要注意です。制限酵素反応で生ずる短い DNA 断片をゲル電気泳動などで除去して下さい。 PCR 断片は、末端が不ぞろいなので結合しにくい。極端に効率が低い場合には DNA Polymerase などで末端を揃えて下さい。 T4 DNA Ligase は高塩濃度で反応阻害を受けるのでエタノール沈殿などで余分な塩を除いて下さい。 PEG はトランスフォーメーションを阻害するのでエタノール沈殿などで除去して下さい。 DNA 断片の末端の不一致短い DNA 断片の混入高いトランスフォーメーション効率が得られない PCR 断片ライゲーション反応が不十分高塩濃度 PEG の混入セルフライゲーションの有無をあらかじめ確認して下さい。ベクターの脱りん酸化が不十分文献 1）Mandel, M. and Higa, A. : ., 53, 159（1970） 2）Cohen, S. N., Chang, A. C. Y. and Hsu, L. : 3）Hanahan, D. ： ., 166, 557（1983） 4）Chung, C. T., Niemela, S. L. and Miller, R. H. : 5）Hara, N. .: ., 16, 8727（1988） 4. Electroporation の原理エレクトロポレーション法によるプラスミドの大腸菌への導入は、限られた量の臓器、組織からクローンサイズの大きいプラスミド cDNA ライブラリーを作製するために研究されてきた技術である。電気パルスにより細胞が DNA を取り込む機構の詳細は不明であるが、おそらく高い電場強度により細胞膜にプラスミド DNA が通過する一過性の小孔ができるためと考えられている。 5. Electroporation の実際，69，2110（1973），86，2172（1989） Ⅱ. （ 1. Packaging Packaging Kit LAMBDA INN） Packaging Kit LAMBDA INN の原理 1975 年に Becker と Gold によって初めて発表されたλファージ DNA の Packaging は、以来改良を重ねられ、108 pfu/ g λDNA を越えるパッケージング効率を示すまでとなった。（用いられたλファージ DNA 分子の 0.05 ∼ 0.5％の分子がファージ粒子として得られる計算になる）パッケージングは大まかに、①外殻前駆体形成、② cos site で連結して concatemer を形成しているλファージ DNA の外殻前駆体への挿入、③ cos site での切断、④ファージ粒子の成熟という課程で進む。 Packaging Kit LAMBDA INN に含まれる Packaging Extract は、1985 年に Rorsenberg らが発表した、1 種類の溶原菌（cos site を持たないλファージ DNA が溶原化している）を用いて extract を調製する方法を改良して調製しており、より簡便にパッケージングを行うことが可能である。 Packaging Kit LAMBDA INN の実際 Packaging の反応 ① Packaging Extract を− 80℃のフリーザーから氷中に移し、速やかに溶かす。 ② DNA 溶液（∼ 1 g/ ）を 1 ∼ 6 加える。 ③ 室温（約 22℃）にて 1 ∼ 2 時間放置する。 ④ ファージバッファー注 2）を 1 m 加え、穏やかに混合する。（数日 4℃に保存する場合にはクロロホルムを一滴加える） 25 Basic Protocol 2. 注 1）注 1）p.160 参照。HB101 （Code No. 317-02581）、JM109 （Code No. 314-02591）注 2）ジーンパルサーキュベット 0.1cm（Bio‐Rad 社製）注 3）ジーンパルサー（Bio‐Rad 社製）文献 Bottger, E. C. : , 6, 878（1988） 447 http://www.wako-chem.co.jp 25_2013_P437_472.indd 447 http://www.nippongene.com 13.2.12 1:54:34 PM 宿主菌への導入 ① 宿主菌の調製 ⓐ VCS257 の単一コロニーを 2 m の LB broth（20％マルトースを 70 含む）に植菌し、37℃にて一晩培養する。 ⓑ 菌液 1 m を 1.5 m のチューブに取り、上清を残さぬように取り除き、10 mmol/ MgCl2（または MgSO4）0.5 m に懸濁する。 ② パッケージングの反応後のファージ液を軽く遠心して残査を落とし、上清を 105 希釈した液から 100 取り、調製した菌液 100 と混合し、室温（約 22℃）にて 15 分間放置する。 ③ 48℃に保温しておいた LB top agar 注 3）3 m と速やかに混合し、すでに固化している LB-plate に重層する。注 1）「2. Packaging Kit LAMBDA INN の実際」に示したプロトコールは、 Packaging Kit LAMBDA INN に含まれているλファージ DNA を用いた対図 1 Packaging 反応における温度の影響照実験の手順である。組換え DNA のパッケージング効率が、λファージ DNA のパッケージング効率より低下すると考えられる場合には、DNA 溶液の濃度を高くするなどの変更が必要となる。注 2）Phage Buﬀer 2.9 g NaCl MgSO4 . 7H2O 1g 1 mol/ Tris-HCl（pH 7.5） 25 m 2％ gelatin 2.5 m 以上を H2O にて 500 m とし、オートクレーブ処理し、4℃にて保存する。注 3）LB top agar Tryptone 10 g 5g Yeast Extract 5g NaCl agar 7.5 g 以上を H2O にて 1 とし、オートクレーブ処理し、4℃にて保存する。図 2 Packaging 反応における Incubation time の影響備考）Packaging Extract を調製する際に混入する溶原化λファージ DNA が、目的 DNA のパッケージング反応時にパッケージングされ、プラークが形成されることはほとんどない。図 3 Packaging 反応におけるλDNA 量とプラーク数の関係 LAMBDA INN Basic Protocol 25 トラブルシューティングトラブル高いパッケージング効率が得られない予想される原因 Packaging Extract が温度上昇により溶解したライゲーション産物が、挿入 DNA とベクターが交互に線状に連なったコンカテマーを形成していないパッケージングに用いた DNA が高度にメチル化されている対策他の Packaging Extract を用意して下さい。挿入 DNA とベクターのモル比などのライゲーションの条件を再検討して下さい。メチル化されていない DNA を用いて下さい。文献 1）Sambrook, J. “ . 2）Rorsenberg, S. M. 3）Rorsenberg, S. M. .: .: ”, A Laboratory Manual, 2nd ed. 2. 3（1989） , 39, 165（1985） , 39, 313（1987） 448 http://www.wako-chem.co.jp 25_2013_P437_472.indd 448 http://www.nippongene.com 13.2.12 1:54:34 PM