TruSeq ChIP (サンプル調製ガイド) ®
TruSeq® ChIP (サンプル調製ガイド) 研究目的のみに使用 Introduction (はじめに) What’s New (最新情報) DNA Input Recommendations (DNA インプットに関する推 奨事項) Additional Resources (追加のリソース) Sample Prep Workflow (サンプル調製ワークフロー) Quant and Profile (定量とプロファイル) Perform End Repair (末端修復の実行) Adenylate 3' Ends (3' 末端のアデニル化) Ligate Adapters (アダプターのライゲート) Purify Ligation Products (ライゲーション産物の精製) Enrich DNA Fragments (DNA 断片の濃縮) Validate Library (ライブラリーの確認) Normalize and Pool Libraries (ライブラリーのノーマライズと プーリング) Acronyms (頭字語) Kit Contents (キットの内容物) Consumables and Equipment (消耗品および器具) ILLUMINA PROPRIETARY パーツ番号 15023092 改訂 B JPN カタログ番号 IP-202-9001DOC 2013 年 10 月 4 5 6 8 10 11 12 15 17 21 25 29 30 32 33 36 Indexed Adapter Sequences (のインデックスアダプター のシーケンス) 39 テクニカルサポート 42 この文書およびコンテンツの所有権は Illumina, Inc. およびその関連会社( "Illumina") に帰属し、ここで記述される製品 の使用に関連する顧客によって契約のもと使用されることを意図し、その他の目的はありません。この文書およびコンテ ンツはその他のいかなる目的で使用または配布してはならず、および/または Illumina の書面による事前同意なしには いかなる方法においても、その他の方法での伝達、開示、または複製をしてはなりません。Illumina はこの文書によっ て、特許、商標、著作権、判例法における第三者の権利または同様の権利のもと、いかなるライセンスも譲渡することは ありません。 この文書に含まれる説明は、ここで記述される製品の使用を適切かつ安全なものにする目的で、適格で、適切なトレー ニングを受けた担当者が正確および明確に使用する必要があります。この文書の内容はすべて、そのような製品を使 用する前に全体を読み、理解する必要があります。 ここに含まれるすべての説明を完全に読み、それに明確に従わない場合は、製品の損傷、ユーザーまたその他を含め た人体への傷害、その他所有物への損害につながることがあります。 Illumina はここに記述される製品( その部品またはソフトウエア) の不適切な使用、また、顧客がそのような製品を購入し た場合に関して、Illumina によって付与された明示的な書面によるライセンスまたは許可範囲外でそのような製品を使 用することによって発生するいかなる状況においても責任を負いません。 研 究 目 的 のみに使 用 © 2012–2013 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina、 IlluminaDx、 BaseSpace、 BeadArray、 BeadXpress、 cBot、 CSPro、 DASL、 DesignStudio、 Eco、 GAIIx、 Genetic Energy、 Genome Analyzer、 GenomeStudio、 GoldenGate、 HiScan、 HiSeq、 Infinium、 iSelect、 MiSeq、 Nextera、 NuPCR、 SeqMonitor、 Solexa、 TruSeq、 TruSight、 VeraCode、パンプキンオレンジ色、および Genetic Energy ストリーミングベースデザインは Illumina, Inc. の登録商標または商標です。ここに含まれるその他すべてのブランドおよ び名称の所有権はそれぞれの所有者に帰属します。 このプロトコールでは、後続のクラスター形成および DNA シーケンスのために、Illumina® TruSeq® ChIP 検体調製キットに含まれている試薬を使用して、最大 24 プールのインデックス染 色体免疫沈降 (ChIP) DNA ライブラリーを調製する方法について説明します。このプロトコールの 目標は、アダプターシーケンスを ChIP DNA の末端に追加して、インデックスシングルリードまた はペアエンドのシーケンスライブラリーを生成することです。 インプット ChIP DNA (5–10 ng) は平滑末端でリン酸化されています。単一塩基の 'T' オーバーハ ングを持つアダプターへのライゲーションへの準備として、断片の 3' 末端に単一の 'A' ヌクレオ チドが追加されています。ライゲーション産物は精製され、アガロースゲル電気泳動により、サイズ が正確に選択されます。サイズが選択された DNA は精製され、PCR 増幅されて、両端にアダプ ターを持つ断片が濃縮されます。次に、精製された最終産物は、クラスター形成の前に定量化さ れます。 サンプル調製プロトコールにより、以下が実現されます。 ワークフローの合理化 } 試薬の容器やピペット操作時間を削減するマスターミックス試薬 } シングルリード、ペアエンド、およびインデックスの調製に対するユニバーサルアダプター すべてのサンプルをタグ付けするインデックスアダプターの提供 } シーケンス用に 24 サンプル以下を調製およびプーリングする際に使用することが推奨され るアダプターインデックスチューブが含まれています。 } 追加のアダプターやプライマーは不要です。 } プロセスの早期にインデックスを有効化 プロトコールは、インデックスなし、またはさらに低いインデックスプーリングレベルまで対応できま す。生成されたライブラリーでは、クラスター形成を有効にするために PCR 増幅を実行する必要 はありませんが、ほとんどの標準アプリケーションに対する収率要件を確実に満たすためには、 標準プロトコールでの PCR が推奨されます。 注意 このガイドにて説明されているプロトコールでは、ユーザーがキットの内容物を確認して、必要な消 耗品と器具をすべて揃えていることを想定しています。 TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 4 Introduction (はじめに) Introduction (はじめに) What’s New (最新情報) 今回のガイド改訂では、以下の点が変更されました。 } 新しい Additional Resources (追加のリソース) セクションには、以下に関する参照が含まれま す: • トレーニング • Illumina Web サイト上のベストプラクティスに関するコンテンツ • Experienced User Card と Lab Tracking form を組み合わせた文書 • TruSeq サンプル調製プールガイド内に文書化されているプールのガイドライン • Illumina Experiment Manager (IEM) } 移動した頭字語、キットの内容物、消耗品と器具、巻末のインデックスアダプターのシーケン ス。 } 最初の融解後に変更された 2° ～ 8℃ の Resuspension Buffer (RSB) の貯蔵。 5 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN TruSeq ChIP サンプル調製 を実行前に、インプット DNA を定量し、DNA 品質の評価をすること が重要です。 Input DNA Quantitation (インプット DNA の定量化) DNA インプットに関する以下の推奨事項に従ってください: } ChIP DNA の正確な定量は非常に重要です。 } 5 ～ 10 ng の 濃縮 ChIP 断片化インプット DNA を推奨します。 } ライブラリーの調製の最終的な成否は、正確に定量化された量のインプット DNA を使用して いるかどうかによって大きく左右されます。 } 収率が低い (<10 ng) ため、ChIP DNA 開始量を正確に測定することは困難です。 } ChIP のプルダウンと断片化の方法は、個々の抗体および手順によって異なります。推奨事 項については、該当の論文や他のソースを参照してください。 } Illumina では、ChIP DNA を正確に定量するため、Qubit または PicoGreen など、蛍光定量 ベースの定量法を使用することを推奨します。Nanodrop のような UV スペクトラムベースの方 法では、RNA、dsDNA、ssDNA、フリーの核酸などの、多くの核酸も同時に検出するた め、ChIP DNA の測定が不正確になる恐れがあります。 } DNA 溶液の濃度が Qubit dsDNA HS Assay の検出範囲内になるようにすることが重要となり ます。 } 複数の定量化方法を使用して結果を確認してください。 } 蛍光色素のインターカレーションに依存する DNA 定量化方法は、二本鎖 DNA のみを検出 し、余分な核酸の影響を受けにくくなっています。 • これらの方法には補正曲線の準備が必要となり、ピペット操作の誤差によって結果が大 きな影響を受けます。 • 用いるピペットについては、正しく補正されていることを確認し、性能的仕様で定められ ている容量の極限値では使用しないようにしてください。 TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 6 DNA Input Recommendations (DNA インプットに関する推奨事項) DNA Input Recommendations (DNA インプットに関する 推奨事項) Assessing DNA Quality (DNA 品質の評価) } DNA 品質の評価には、260 nm での吸光度測定が一般的に使用されます。 • 260 nm と 280 nm での吸光度の比がサンプルの純度を示すものとして使用され、1.8 ～ 2.0 の値は比較的純度の高い DNA を示していると見なされます。 • RNA または核酸の小断片 (ヌクレオチドなど) があることにより、260 nm と 280 nm での吸 光度は、精度が落ちることがあります。 • コンタミネーションが起きないよう、ChIP DNA サンプルの抽出は慎重に行ってください。 } High Sensitivity チップを用いた Agilent Bioanalyzer を使用すると、さらなる確認ステップ (ChIP DNA サイズ分布の正確さ、コンタミネーションの有無など) を実行できます。 7 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN プロトコールのガイダンスとトラッキング用に TruSeq ChIP サンプル調製 以下のリソースをご利用 いただけます。Illumina Web サイト support.illumina.com/sequencing/kits.ilmn で、本リソースや その他のリソースにアクセスします。次に、TruSeq ChIP サンプル調製キット サポートを選択しま す。 リソース 説明 トレーニング TruSeq ChIP サンプル調製 プロセスの要素を説明します。新た なユーザーや経験の少ないユーザーの場合は、サンプルの調 製を開始する前にこのビデオを見ることをお勧めします。 TruSeq ChIP サンプル調製キット サポートのトレーニングをク リックします。 ベストプラクティス このプロトコールに固有のベストプラクティスを提示します。サン プルの調製を開始する前に、このベストプラクティスを参照してく ださい。トピックは次のとおり: • 溶液の取扱い • マスターミックス試薬の取扱い • 磁気ビーズの取扱い • Avoiding Cross-Contamination (クロスコンタミネーションの防 止) • 潜在的な DNA コンタミネーション • 温度に関する注意事項 • 器具 サポートのベストプラクティスTruSeq ChIP サンプル調製キット をクリックします。 TruSeq ChIP サンプル調製 Experienced User Card と Lab Tracking Form (パーツ番号 15036179) TruSeq ChIP サンプル調製ガイド プロトコールの説明が含まれていますが、このユーザーガイドに 記載されている内容ほど詳しくはありません。経験の少ないユー ザーは、EUC や LTF を使用するのではなく、このユーザーガイ ドに従うことが推奨されます。 TruSeq ChIP サンプル調製キット サポートのドキュメント&文献 をクリックします。 8 Additional Resources (追加のリソース) Additional Resources (追加のリソース) リソース 説明 TruSeq サンプル調製プールガイド (パーツ番号 15042173) サンプル調製のための TruSeq プールガイドを提供します。ライブ ラリーの調製を開始する前に、このガイドを参照してください。 TruSeq ChIP サンプル調製キット サポートのドキュメント&文献をク リックします。 Illumina Experiment Manager (IEM) 9 Illumina シーケンサーおよび分析ソフトウェア用の適切なサンプ ルプレートの作成と編集、およびサンプルプレート用のパラメータ の記録を可能にします。 ソフトウェアをダウンロードするには、TruSeq ChIP サンプル調製 キット サポートのダウンロードをクリックします。または、 ドキュメントをダウンロードするには、TruSeq ChIP サンプル調製 キット サポートのドキュメント&文献をクリックします。 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN Sample Prep Workflow (サンプル調製ワークフロー) Sample Prep Workflow (サンプル調製ワークフロー) 次の図は TruSeq ChIP サンプル調製プロトコールでの手順を示しています。 図 1 TruSeq ChIP サンプル調製のワークフロー TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 10 Quant and Profile (定量とプロファイル) このプロトコールは 5 ～ 10 ng のインプット ChIP DNA に最適化されています。この手順で は、ChIP 実験の後、ライブラリー調製を開始する前に、インプット ChIP DNA の量と質を評価する 方法について説明します。Illumina では、200 ～ 800 bp のDNA インサートサイズを推奨します。 注意 このプロトコールでは、開始物質として 5 ～ 10 ng の ChIP DNA を必要とします。通常、3 つの独 立した ChIP 実験のプール結果からのものです。プールされた量が 50 µl よりも多い場合には、加 熱せずに SpeedVac を使用して、ChIP DNA をおよそ 50 µlまで濃縮してください。 Consumables (消耗品) アイテム 数量 貯蔵庫 提供者 96 ウェル 0.3 ml PCR プレート 96 サンプルに つき 3 ml 15° ～ 30℃ ユーザー Agilent 高感度 DNA キット 12 サンプルに つき 3 ml 製造会社が示すとおり ユーザー ChIP DNA 5 ～ 10 ng -15° ～ -25℃ ユーザー Qubit アッセイチューブまたは Axygen PCR-05-C チューブ 1 サンプルにつ き1本 15° ～ 30℃ ユーザー Qubit dsDNA HS Assay Kit 1 製造会社が示す通り ユーザー Procedure (手順) 1 サンプルから1 µl を取り分け、Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer を使用してAgilent High Sensitivity DNA チップで検査し、ChIP DNA サンプルごとのサイズ分布を確認してください。 2 Qubit dsDNA HS アッセイキットを使用して、各 ChIP DNA サンプルの 1 µl を定量します。 3 Illumina では、ChIP DNA サンプルをノーマライズして最終的に 100 ～ 200 pg/µl、50 µl の量 にし、新しい 96 ウェルの 0.3 ml PCR プレートの各ウェルに入れることを推奨します。 11 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN このプロセスでは、End Repair Mix (ERP) を使用して、断片化によって生じたオーバーハングを平 滑末端に変換します。このミックスの 3' → 5' のエキソヌクレアーゼ活性は 3' オーバーハングを 取り除き、ポリメラーゼ活性は 5' オーバーハングを埋めます。 Consumables (消耗品) アイテム 数量 貯蔵庫 提供者 End Repair Mix (ERP) 48 サンプルにつ き 1 チューブ -15° ～ -25℃ Illumina Resuspension Buffer (RSB) 1 チューブ -15° ～ -25℃ (最初の融解後は 2℃ ～ 8℃) Illumina 96 ウェル 0.3 ml PCR プレート 1 15° ～ 30℃ ユーザー AMPure XP beads 1 サンプルにつ き 160 µl 2° ～ 8℃ ユーザー 新しく調製した 80% エタノール (EtOH) 1 サンプルにつ き 400 µl 15° ～ 30℃ ユーザー Microseal ‘B’ 粘着シール 1 15° ～ 30℃ ユーザー RNase/DNase フリーの試薬リ ザーバー (マルチチャネルピ ペットを使用する場合) 2 15° ～ 30℃ ユーザー RNase/DNase フリーのストリッ プチューブとキャップ ( マルチ チャンネルピペットを使用する 場合) 2 15° ～ 30℃ ユーザー Preparation (準備) } -15° ～ -25℃ の貯蔵庫から以下を取り出し、室温で解凍します: • End Repair Mix TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 12 Perform End Repair (末端修復の実行) Perform End Repair (末端修復の実行) • Resuspension Buffer 注意 Resuspension Buffer (RSB) は、最初の融解後に 2° ～ 8℃ で保管できます。 } ベストプラクティスで「Handling Magnetic Beads (磁気ビーズの取り扱い)」を参照してくださ い。 Illumina Web サイト上の TruSeq ChIP サンプル調製 ベストプラクティスにアクセスする方 法の情報に関しては、 8ページの「Additional Resources (追加のリソース)」 } 貯蔵庫から AMPure XP Beads を取り出し、室温になるように少なくとも 30 分間置いたままに します。 } サーマルサイクラーを 30℃ に予熱します。 } サーマルサイクラーのプレヒートリッドオプションを選択し、100℃ に設定します。 Procedure (手順) 1 10 µl の Resuspension Buffer を、50 µl の ChIP DNA を含む 96 ウェルの 0.3 ml PCR プレート の各ウェルに添加します。 2 ChIP DNA を含む PCR プレートの各ウェルに End Repair Mix 40 µl を追加します。全体を上 下に 10 回そっとピペッティングしてしっかり混ぜ合わせます。 3 Microseal ‘B’ 粘着シールで PCR プレートを密封します。 4 密封した PCR プレートを30℃に予熱しておいたサーマルサイクラーの上にセットします。リッ ドを閉じ、30℃ で 30 分間インキュベートします。 5 サーマルサイクラーから PCR プレートを取り出します。 注意 ベストプラクティスで「Handling Magnetic Beads (磁気ビーズの取り扱い)」を参照してください Illumina Web サイト上の TruSeq ChIP サンプル調製 ベストプラクティスにアクセスする方法の情報 に関しては 8ページの「Additional Resources (追加のリソース)」 6 粘着シールを PCR プレートから取り除きます。 7 十分に懸濁するまで AMPure XP Beads をボルテックスします。 8 十分に混合された AMPure XP ビーズ 160 µl を、End Repair Mixが 100 µl が含まれている PCR プレートの各ウェルに添加します。全体を上下に 10 回そっとピペッティングしてしっかり 混ぜ合わせます。 9 PCR プレートを室温で 15 分間インキュベートします。 10 磁気スタンド上に PCR プレートを室温で 15 分間 (または、溶液が濁っている場合は透明に なるまで) 置いたままにします。 13 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN 12 ステップ 11 をもう一度繰り返します。 注意 以下の 80% EtOH 洗浄ステップ (13 ～ 15) を実行している間は、PCR プレートを磁気スタンド 上に置いたままにしてください。 13 PCR プレートを磁気スタンド上に置いたまま、新しく調製した 80% EtOH 200 µl を、ビーズの 塊を崩さないように各ウェルに添加します。 14 PCR プレートを室温で 30 秒間インキュベートした後、各ウェルから上清をすべて取り除いて 廃棄します。ビーズの塊を崩さないように注意してください。 15 ステップ 13 および 14 をもう一度繰り返し、80% EtOH による洗浄を合計 2 回行います。 16 PCR プレートを室温で 15 分間置いたままにして乾かした後、磁気スタンドから取り外します。 17 Resuspension Buffer (RSB) 17.5 µl を含む各ウェル内で、乾いたペレットを再懸濁します。全 体を上下に 10 回そっとピペッティングしてしっかり混ぜ合わせます。 18 PCR プレートを室温で 2 分間インキュベートします。 19 磁気スタンド上に PCR プレートを室温で 5 分間 (または、溶液が濁っている場合は透明にな るまで) 置いたままにします。 20 PCR プレートの各ウェルから透明な上清 15 µl を取り出し、新しい 96 ウェルの 0.3 ml PCR プ レートの対応するウェルに移します。 安全な停止ポイント 「15ページの「Adenylate 3' Ends (3' 末端のアデニル化)」へと直ちに進まない場合は、プロトコー ルはここで安全に停止できます。 停止する場合は、Microseal ‘B’ 粘着シールで PCR プレートを 密封し、-15° ～ -25℃ で保管してください (最長で 7 日間)。 TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 14 Perform End Repair (末端修復の実行) 11 127.5 µl に設定した 200 µl のシングルチャネルピペットまたはマルチチャネルピペットを使用 して、PCR プレートの各ウェルから上清 127.5 µl を取り除いて廃棄します。 Adenylate 3' Ends (3' 末端のアデニル化) アダプターライゲーション反応の間に DNA 断片同士が互いにライゲートするのを防ぐ目的で、平 滑化された 3' 末端に 1 塩基の「A」ヌクレオチドを添加します。これに対応する形で、アダプター の 3' 末端に相補的にオーバーハングして存在する 1 塩基の「T」ヌクレオチドによって、アダプ ターと断片がライゲートします。この方法により、キメラ (連結したテンプレート) の生成率が低減さ れます。 Consumables (消耗品) アイテム 数量 貯蔵庫 提供者 A-Tailing Mix (ATL) 48 サンプルに つき 1 チュー ブ -15° ～ -25℃ Illumina Resuspension Buffer (RSB) 1 チューブ 2° ～ 8℃ Illumina Microseal ‘B’ 粘着シール 1 15° ～ 30℃ ユーザー RNase/DNase フリーの試薬リ ザーバー (マルチチャネルピ ペットを使用する場合) 2 15° ～ 30℃ ユーザー RNase/DNase-free Strip Tubes and Caps( マルチチャンネルピ ペットを使用する場合) 2 15° ～ 30℃ ユーザー Preparation (準備) } -15° ～ -25℃ の貯蔵庫から A-Tailing Mix (ATL) を取り出し、室温で解凍します。 } 2° ～ 8℃ の貯蔵庫から Resuspension Buffer (RSB) を取り出し、室温になるようそのまま置 いておきます。 } 12ページの「Perform End Repair (末端修復の実行)」の終わりで PCR プレートを保管した場 合は、それを -15°～ -25℃ の貯蔵庫から取り出します。 • PCR プレートを室温で置いたままにして解凍します。 • PCR プレートを 280 xg で 1 分間遠心します。 • 粘着シールを PCR プレートから取り除きます。 15 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN Procedure (手順) 1 PCR プレートの各ウェルに、Resuspension Buffer (RSB) 2.5 µl を添加します。 2 PCR プレートの各ウェルに、溶解した A-Tailing Mix 12.5 µl を添加します。全体を上下に 10 回そっとピペッティングしてしっかり混ぜ合わせます。 3 Microseal ‘B’ 粘着シールで PCR プレートを密封します。 4 密封した PCR プレートを、事前にプログラミングしたサーマルサイクラー上に置きます。リッド を閉じ、[ATAIL70] を選択します。 a プレヒートリッドオプションを選択し、100℃ に設定 b 37℃ で 30 分間 c 70℃ で 5 分間 d 4℃ で保持 5 サーマルサイクラーの温度が 4℃ になったら、PCR プレートをサーマルサイクラーから取り出 し、「17ページの「Ligate Adapters (アダプターのライゲート)」」へと直ちに進みます。 TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 16 Adenylate 3' Ends (3' 末端のアデニル化) } 以下のプログラムでサーマルサイクラーを事前にプログラミングし、ATAIL70 として保存しま す。 • プレヒートリッドオプションを選択し、100℃ に設定 • 37℃ で 30 分間 • 70℃ で 5 分間 • 4℃ で保持 Ligate Adapters (アダプターのライゲート) このプロセスでは、複数のインデックスアダプターを DNA 断片の末端にライゲートし、フローセル へのハイブリダイゼーション用に調製します。 Consumables (消耗品) アイテム 数量 貯蔵庫 提供者 Ligation Mix (LIG) 48 サンプルにつ き 1 チューブ -15°～ -25℃ Illumina Resuspension Buffer (RSB) 1 チューブ 2°～ 8℃ Illumina RNA アダプターインデックス (AR001–AR016, AR018–AR023, AR025, AR027) (使用する RNA アダプターイン デックスによる) 8 反応のカラムに つき 1 チューブ -15°～ -25℃ Illumina Stop Ligation Buffer (STL) 48 サンプルにつ き 1 チューブ -15° ～ -25℃ Illumina 96 ウェル 0.3 ml PCR プレート 2 AMPure XP beads 1 サンプルにつ き 42.5 µl 2° ～ 8℃ ユーザー 新しく調製した 80% エタノール (EtOH) 1 サンプルにつ き 800 µl 15° ～ 30℃ ユーザー Microseal ‘B’ 粘着シール 1 15° ～ 30℃ ユーザー RNase/DNase フリーの試薬リ ザーバー (マルチチャネルピ ペットを使用する場合) 6 15° ～ 30℃ ユーザー RNase/DNase フリーのストリップ チューブとキャップ ( マルチチャ ンネルピペットを使用する場合) 6 15° ～ 30℃ ユーザー 17 ユーザー パーツ番号 15023092 改訂 B JPN } -15° ～ -25℃ の貯蔵庫から以下を取り出し、室温で解凍します: • 適切な RNA アダプターチューブ • Stop Ligation Buffer 注意 手順内で指示されるまでは、-15° ～ -25℃ の貯蔵庫から Ligation Mix チューブを取 り出さないでください。 } ベストプラクティスで「Handling Magnetic Beads (磁気ビーズの取り扱い)」を参照してくださ い。 Illumina Web サイト上の TruSeq ChIP サンプル調製 ベストプラクティスにアクセスする方 法の情報に関しては、 8ページの「Additional Resources (追加のリソース)」 } 貯蔵庫から AMPure XP Beads を取り出し、室温になるように少なくとも 30 分間置いたままに します。 } 2° ～ 8℃ の貯蔵庫から Resuspension Buffer (RSB) を取り出し、室温になるようそのまま置 いておきます。 } サーマルサイクラーを 30℃ に予熱します。 } サーマルサイクラーのプレヒートリッドオプションを選択し、100℃ に設定します。 注意 同じ行の共有プールに組み合わせ、また各カラムには共有インデックスを含めるようにサンプ ルを調整することを、Illumina では推奨します。後にプロトコールでインデックスアダプターを 分配してインデックスライブラリーをプーリングするときのピペット操作が、これによって行いや すくなります。 Procedure (手順) 1 Stop Ligation Buffer と使用する解凍済み RNA アダプターチューブを 600 xg で 5 秒間遠心 します。 2 Ligation Mix チューブを、使用する直前に -15° ～ -25℃ の貯蔵庫から取り出します。 3 粘着シールを PCR プレートから取り除きます。 4 PCR プレートの各ウェルに、Resuspension Buffer (RSB) 2.5 µl を添加します。 5 PCR プレートの各ウェルに、Ligation Mix 2.5 µl を添加します。 6 Ligation Mix チューブを、使用後直ちに -15° ～ -25℃ の貯蔵庫に戻します。 7 PCR プレートの各ウェルに、溶解した RNA Adapter Index 2.5 µl を添加します。全体を上下 に 10 回そっとピペッティングしてしっかり混ぜ合わせます。 8 Microseal ‘B’ 粘着シールで PCR プレートを密封します。 TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 18 Ligate Adapters (アダプターのライゲート) Preparation (準備) 9 PCR プレートを 280 xg で 1 分間遠心します。 10 PCR プレートを、蓋を閉めた状態で、30℃に予熱したサーマルサイクラー上で、30℃ で 10 分間インキュベートします。 11 サーマルサイクラーから PCR プレートを取り出します。 12 粘着シールを PCR プレートから取り除きます。 13 Ligation を不活性化するため、PCR プレートの各ウェルに Stop Ligation Buffer (STL) 5 µl を 添加します。全体を上下に 10 回そっとピペッティングしてしっかり混ぜ合わせます。 注意 ベストプラクティスで「Handling Magnetic Beads (磁気ビーズの取り扱い)」を参照してください Illumina Web サイト上の TruSeq ChIP サンプル調製 ベストプラクティスにアクセスする方法の情報 に関しては 8ページの「Additional Resources (追加のリソース)」 14 十分に懸濁するまで AMPure XP Beads をボルテックスします。 15 混合した AMPure XP Beads 42.5 µl を、PCR プレートの各ウェルに添加します。全体を上下 に 10 回緩やかにピペッティングしてしっかり混ぜ合わせます。 16 PCR プレートを室温で 15 分間インキュベートします。 17 磁気スタンド上に PCR プレートを室温で 5 分間 (または、溶液が濁っている場合は透明にな るまで) 置いたままにします。 18 PCR プレートの各ウェルから上清 80 µl を取り除いて廃棄します。 注意 以下の 80% EtOH 洗浄ステップ (19 ～ 21) を実行している間は、PCR プレートを磁気スタンド 上に置いたままにしてください。 19 PCR プレートを磁気スタンド上に置いたまま、新しく調製した 80% EtOH 200 µl を、ビーズの 塊を崩さないように各ウェルに添加します。 20 PCR プレートを室温で 30 秒間インキュベートした後、各ウェルから上清をすべて取り除いて 廃棄します。 21 ステップ 19 および 20 をもう一度繰り返し、80% EtOH による洗浄を合計 2 回行います。 22 磁気スタンド上に PCR プレートを置いたまま、サンプルを室温で 15 分間風乾させた後、磁 気スタンドからプレートを取り外します。 23 Resuspension Buffer (RSB) 52.5 µl を含む各ウェル内で、乾いたペレットを再懸濁します。全 体を上下に 10 回そっとピペッティングしてしっかり混ぜ合わせます。 24 PCR プレートを室温で 2 分間インキュベートします。 19 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN 26 PCR プレートの各ウェルから透明な上清 50 µl を取り出し、新しい 96 ウェルの 0.3 ml PCR プ レートの対応するウェルに移します。 27 十分に懸濁するまでボルテックスした AMPure XP Beads 50 µl を、二次精製のために PCR プ レートの各ウェルに添加します。全体を上下に 10 回そっとピペッティングしてしっかり混ぜ合 わせます。 28 PCR プレートを室温で 15 分間インキュベートします。 29 磁気スタンド上に PCR プレートを室温で 5 分間 (または、溶液が濁っている場合は透明にな るまで) 置いたままにします。 30 PCR プレートの各ウェルから上清 95 µl を取り除いて廃棄します。 注意 以下の 80% EtOH 洗浄ステップ (31 ～ 33) を実行している間は、PCR プレートを磁気スタンド 上に置いたままにしてください。 31 PCR プレートを磁気スタンド上に置いたまま、新しく調製した 80% EtOH 200 µl を、ビーズの 塊を崩さないように各ウェルに添加します。 32 PCR プレートを室温で 30 秒間インキュベートした後、各ウェルから上清をすべて取り除いて 廃棄します。 33 ステップ 31 および 32 をもう一度繰り返し、80% EtOH による洗浄を合計 2 回行います。 34 磁気スタンド上に PCR プレートを置いたまま、サンプルを室温で 15 分間風乾させた後、磁 気スタンドからプレートを取り外します。 35 Resuspension Buffer (RSB) 22.5 µl を含む各ウェル内で、乾いたペレットを再懸濁します。全 体を上下に 10 回そっとピペッティングしてしっかり混ぜ合わせます。 36 PCR プレートを室温で 2 分間インキュベートします。 37 磁気スタンド上に PCR プレートを室温で 5 分間 (または、溶液が濁っている場合は透明にな るまで) 置いたままにします。 38 PCR プレートの各ウェルから透明な上清 20 µl を取り出し、新しい 96 ウェルの 0.3 ml PCR プ レートの対応するウェルに移します。 安全な停止ポイント 21ページの「Purify Ligation Products (ライゲーション産物の精製)」」 へと直ちに進まない場合は、 ここでプロトコールを安全に停止できます。停止する場合、PCR プレートを Microseal ‘B’ 粘着 シールで密封し、それを -15° ～ -25℃ で最大 7 日間まで保管します。 TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 20 Ligate Adapters (アダプターのライゲート) 25 磁気スタンド上に PCR プレートを室温で 5 分間 (または、溶液が濁っている場合は透明にな るまで) 置いたままにします。 Purify Ligation Products (ライゲーション産物の精製) このプロセスでは、ゲルでライゲーション反応の産物を精製し、ライゲートされていないアダプター と、互いにライゲートしたアダプターを取り除きます。クラスター形成に適した ChIP ライブラリー構 成物が得られるように、幅の狭い 250 ～ 300 bp のサイズ範囲の DNA 断片を選択します。 注意 前もって電気泳動ユニットをテストして、1000 塩基対未満の範囲の DNA をすぐに分解できること を確認してください。選択した狭いサイズのバンドで実行することが可能なように、DNA スメアは、 標準偏差が中央値の 5% 程度となるまで、十分に分解できる必要があります (たとえば、ゲルスライ スが 300 bp の場合、± 1 の標準偏差は、280 ～ 320 bp のサイズ範囲と同等です)。ここで記述し ている条件は、ゲル電気泳動で典型的かつ検証された条件のことです。 アダプターライゲーションの後、過剰なアダプターとアダプターダイマーを除去し、断片サイズを狭 められるよう、ゲル電気泳動とバンド切除を実行してください。ライゲーション反応の産物はアガ ロースゲル上で分離します。希望するサイズの、DNA を含む 2 mm 幅のゲルスライスを切除してく ださい。 注意 2% のアガロースゲル上で 250 ～ 300 bp のバンドを切除すると、インサートのサイズは約 150 ～ 200 bp になり、ゲルの移動性に対するアダプターの影響を考慮する必要が生じます。 注意 これらの手順は、本ガイドで指定された消耗品を使用し、以下で指定したゲル法を実行するという 条件のもとでのみ検証されています。これらの材料および手順の使用から何らかの点で逸脱した 場合、サイズ切除が不正確になること、またはユーザーによる追加の最適化が必要になることがあ ります。 Consumables (消耗品) アイテム 数量 貯蔵庫 提供者 Resuspension Buffer (RSB) 1 チューブ 2° ～ 8℃ Illumina 6X Gel Loading Dye サンプルごとに 8 µl + 4 µl 15° ～ 30℃ ユーザー 50 X TAE Buffer 150 ml 15° ～ 30℃ ユーザー 96 ウェル 0.3 ml PCR プレート 1 15° ～ 30℃ ユーザー 50 bp DNA ラダー 1 -15° ～ -25℃ ユーザー 21 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN 数量 貯蔵庫 提供者 100 bp DNA ラダー 1 -15° ～ -25℃ ユーザー Certified Low-range Ultra Agarose 3g 2° ～ 8℃ ユーザー GeneCatchers または清潔なメ ス 2 15° ～ 30℃ ユーザー MinElute Gel Extraction Kit 1 15° ～ 30℃ ユーザー SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain 15 µl -15° ～ -25℃ ユーザー Preparation (準備) } 1X TAE Buffer (> 1 L) を用意します。 } 17ページの「Ligate Adapters (アダプターのライゲート)」の終わりで PCR プレートを保管した 場合は、それを -15℃～ -25℃ の貯蔵庫から取り出します。 • プレートを室温で置いたままにして解凍します。 • PCR プレートを 280 xg で 1 分間遠心します。 • 解凍した PCR プレートから粘着シールを取り除きます。 } Resuspension Buffer (RSB) が室温になっていることを確認します。 } クロスコンタミネーションを避けるため、トレー、コーム、およびゲルタンクをエタノールで洗浄 し、脱イオン水でしっかりすすぎます。 注意 推奨のゲルシステムに付属の 12 ウェルコームを使用してください。 Procedure (手順) 1 150 ml の 1X TAE Buffer を使用して、以下のように SYBR Gold 入りの 2% アガロースゲルを調 製します。 a 適当な容器内でアガロースパウダー 3 g を 1X TAE バッファー 150 ml に添加します。 b アガロースパウダーが溶解するまでゲルの入った容器をレンジで加熱します。 c ゲルの入った容器をベンチで 5 分間冷やし、その次に SYBR Gold を 15 µl 添加します。 スターラー等で内容物を混ぜます。 d ある程度冷めたらゲル全量をゲルトレーに注ぎ、適当なコームを刺して固めます。 TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 22 Purify Ligation Products (ライゲーション産物の精製) アイテム 注意 アガローセゲルバッファーでの SYBR Gold の最終濃度は 1X である必要があります。 警告 ゲルを SYBR Gold で事前染色することは重要です。他の染色色素を使用したり、ゲルを後染 めしたりすると、DNA はラダーよりも低い速度で泳動します。これは、間違ったサイズの断片 を切り出すことにつながります。 2 6X Gel Loading Dye 4 µl を PCR プレートの各ウェルに追加します。 3 17 µl Resuspension Buffer (RSB) および 6X Gel Loading Dye 4 µl を 50 bp DNA ラダー 1 µl に 追加します。 4 17 µl Resuspension Buffer (RSB) および 6X Gel Loading Dye 4 µl を 100 bp DNA ラダー 1 µl に追加します。 警告 DNA ラダーはオーバーロードしないでください。バンドが明確ではっきりしていない場合、正 確な断片サイズの切り出しは困難です。また、オーバーロードされたラダーは、DNA サンプ ルライブラリーより速く作動する可能性があります。 5 アガロースゲルが用意できたら、それを電気泳動槽に入れ、泳動槽に 1X TAE Buffer を泳動 に適した量まで加えます。 電気泳動ユニットで推奨される寸法: 12 cm x 14 cm ( 幅 x 長さ) 、800 ml のバッファー量 6 50 bp ラダー溶液全量をゲルの 1 つのレーンにロードします。 7 100 bp ラダー溶液全量をゲルの別のレーンにロードします。 8 サンプルとラダーの間に、少なくともサンプルを入れないレーン 1 つを残しつつ、PCR プレー トの各ウェルからサンプル溶液を取りゲルにロードします。 注意 ライブラリーの両側をラダーで隣接させると、ライブラリーの切除がより容易になる可能性があ ります。 注意 複数のサンプルを取扱うときは、ライブラリー間のクロスコンタミネーションの危険を避けるた め、サンプルの間に少なくとも空のレーン 1 つ分の隙間を残します。ゲルの最初と最後のウェ ルでラダーを使用し、切除されるゲル領域を設定します。 9 ゲルで 120 V で 10 分間、さらに 60 V で 180 分間電気泳動を行います (6 V/cm)。 10 ゲルを Dark Reader ライトボックスまたは UV ライトボックスで見ます。 11 スライスの切除を行う前に、ゲルの写真を撮影します。 23 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN 13 マーカーをガイドとして、正確に 250 ～ 300 bp になるよう、サンプルレーンのゲルスライスを 切除します。必要な場合には、このバンド範囲に合わせて、2 つの GeneCatchers を使用して ください。 14 ゲルスライスを新しい 2.0 ml DNA LoBind チューブに入れます。 15 スライスの切除後にゲルの写真を撮影します。 16 MinElute Gel Extraction Kit の指示に従って、各サンプルを精製します。ゲルの切片が溶け るまで、2 分ごとにボルテックスしながら室温 ( MinElute キットの手順で指示された 50℃ で はなく) で、ゲルの切片を QG 溶液内でインキュベートします。 17 MinElute Gel Extraction Kit の手順に従い、、1 サンプルずつ MinElute カラムで精製し、最 終的にQIAGEN EB バッファー 25 µl で溶出します。 18 シングルチャネルピペットを使用して、各サンプル 20 µl を MinElute Collectionチューブから 新しい 96 ウェル 0.3 ml PCR プレートに移します。 安全な停止ポイント 「25ページの「Enrich DNA Fragments (DNA 断片の濃縮)」」に直ちに進まない場合は、ここでプロ トコールは安全に停止できます。停止する場合は、Microseal ‘B’ 粘着シールで PCR プレートを 密封し、-15° ～ -25℃ で保管してください (最長で 7 日間)。 TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 24 Purify Ligation Products (ライゲーション産物の精製) 12 ゲルのサンプル上の、テンプレートの望ましいサイズの位置に、GeneCatcher または清潔な メスを垂直に当てます。 Enrich DNA Fragments (DNA 断片の濃縮) このプロセスでは PCR を使用して、両末端にアダプター分子のある DNA 断片を選択的に濃縮 し、ライブラリー内にある DNA の量を増幅します。PCR は、アダプターの末端にアニールする PCR Primer Cocktail (PPC) を用いて実行されます。ライブラリーの発現を保持するために、PCR サイクル数は最小限にしてください。 注意 PCR は、アダプターが両端にライゲートされている断片を濃縮します。末端にアダプターが 1 つだ けしかない、または全く付いていない断片は、非効率的なライゲーション反応の副産物です。いず れの種もクラスターを形成するために使用することはできません。アダプターを持たない断片は、 フローセルの表面結合プライマーにハイブリダイズできません。片端にのみアダプターを持つ断片 は表面結合プライマーにハイブリダイズできても、クラスターを形成できません。 Consumables (消耗品) アイテム 数量 貯蔵庫 提供者 PCR Master Mix (PMM) 48 サンプルにつき 1 チューブ -15° ～ -25℃ Illumina PCR Primer Cocktail (PPC) 48 サンプルにつき 1 チューブ -15° ～ -25℃ Illumina Resuspension Buffer (RSB) 1 チューブ 2° ～ 8℃ Illumina 96 ウェル 0.3 ml PCR プレート 1 15° ～ 30℃ ユーザー AMPure XP beads 1 サンプルにつき 50 µl 2° ～ 8℃ ユーザー 新しく調製した 80% エタノール (EtOH) 1 サンプルにつき 400 µl 15° ～ 30℃ ユーザー Microseal ‘B’ 粘着シール 1 15° ～ 30℃ ユーザー RNase/DNase フリーの試薬リ ザーバー (マルチチャネルピ ペットを使用する場合) 4 15° ～ 30℃ ユーザー RNase/DNase-free Strip Tubes and Caps( マルチチャンネルピ ペットを使用する場合) 4 15° ～ 30℃ ユーザー 25 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN } -15° ～ -25℃ の貯蔵庫から PCR Master Mix (PMM) と PCR Primer Cocktail (PPC) を取り 出し、室温で解凍します。解凍したら、氷の上にチューブを置いておきます。 } 解凍した PCR Master Mix (PMM) と PCR Primer Cocktail (PPC) のチューブを 600 xg で 5 秒 間遠心します。 } ベストプラクティスで「Handling Magnetic Beads (磁気ビーズの取り扱い)」を参照してくださ い。 Illumina Web サイト上の TruSeq ChIP サンプル調製 ベストプラクティスにアクセスする方 法の情報に関しては、 8ページの「Additional Resources (追加のリソース)」 } 貯蔵庫から AMPure XP Beads を取り出し、室温になるように少なくとも 30 分間置いたままに します。 } 2° ～ 8℃ の貯蔵庫から Resuspension Buffer (RSB) を取り出し、室温になるようそのまま置 いておきます。 } 21ページの「Purify Ligation Products (ライゲーション産物の精製)」の終わりで PCR プレート を保管した場合は、それを -15° ～ -25℃ の貯蔵庫から取り出します。 • プレートを室温で置いたままにして解凍します。 • PCR プレートを 280 xg で 1 分間遠心します。 • 粘着シールを解凍した PCR プレートから取り除きます。 } 以下のプログラムでサーマルサイクラーに事前にプログラムを作成し、PCR として保存しま す。 • プレヒートリッドオプションを選択し、100℃ に設定 • 98℃ で 30 秒間 • 以下を 18 サイクル: — 98℃ で 10 秒間 — 60℃ で 30 秒間 — 72℃ で 30 秒間 • 72℃ で 5 分間 • 4℃ で保持 注意 強固なプロトコール性能を実現するために 18 サイクルの PCR を行うことを、Illumina で は推奨します。ただし、PCR サイクルの滴定を実行して、サイクル数に対する収率を最 適化することも可能です。 TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 26 Enrich DNA Fragments (DNA 断片の濃縮) Preparation (準備) Procedure (手順) 警告 サンプルのクロスコンタミネーションを避けるため、PCR 反応 (テンプレート DNA を除くすべてのコ ンポーネント) のセットアップは指定された清潔なエリアで行ってください。望ましいのは UV 殺菌と 陽圧のエアフローの備わった PCR フードです。 1 PCR プレートの各ウェルに、溶解した PCR Primer Cocktail (PPC) 5 µl を添加します。 2 PCR プレートの各ウェルに、溶解した PCR Master Mix 25 µl を添加します。全体を上下に 10 回そっとピペッティングしてしっかり混ぜ合わせます。 3 Microseal ‘B’ 粘着シールで PCR プレートを密封します。 4 密封した PCR プレートを、事前にプログラミングしたサーマルサイクラー上に置きます。リッド を閉じて PCR を選択し、プレートを増幅させます。 a プレヒートリッドオプションを選択し、100℃ に設定 b 98℃ で 30 秒間 c 以下を 18 サイクル: — 98℃ で 10 秒間 — 60℃ で 30 秒間 — 72℃ で 30 秒間 d 72℃ で 5 分間 e 4℃ で保持 注意 ベストプラクティスで「Handling Magnetic Beads (磁気ビーズの取り扱い)」を参照してください Illumina Web サイト上の TruSeq ChIP サンプル調製 ベストプラクティスにアクセスする方法の情報 に関しては 8ページの「Additional Resources (追加のリソース)」 5 粘着シールを PCR プレートから取り除きます。 6 十分に懸濁するまで AMPure XP Beads をボルテックスします。 7 懸濁した AMPure XP Beads 50 µl を、PCR 増幅ライブラリー 50 µl を含む PCR プレートの各 ウェルに添加します全体を上下に 10 回そっとピペッティングしてしっかり混ぜ合わせます。 8 PCR プレートを室温で 15 分間インキュベートします。 9 磁気スタンド上に PCR プレートを室温で 5 分間 (または、溶液が濁っている場合は透明にな るまで) 置いたままにします。 10 PCR プレートの各ウェルから上清 95 µl を取り除いて廃棄します。 27 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN 11 PCR プレートを磁気スタンド上に置いたまま、新しく調製した 80% EtOH 200 µl を、ビーズの 塊を崩さないように各ウェルに添加します。 12 PCR プレートを室温で 30 秒間インキュベートした後、各ウェルから上清をすべて取り除いて 廃棄します。 13 ステップ 11 および 12 をもう一度繰り返し、80% EtOH による洗浄を合計 2 回行います。 14 磁気スタンド上に PCR プレートを置いたまま、サンプルを室温で 15 分間風乾させた後、磁 気スタンドからプレートを取り外します。 15 乾いたペレットを各ウェルで 17.5 µl のResuspension Bufferで再懸濁します。全体を上下に 10 回そっとピペッティングしてしっかり混ぜ合わせます。 16 PCR プレートを室温で 2 分間インキュベートします。 17 磁気スタンド上に PCR プレートを室温で 5 分間 (または、溶液が濁っている場合は透明にな るまで) 置いたままにします。 18 PCR プレートの各ウェルから透明な上清 15 µl を取り出し、新しい 96 ウェルの 0.3 ml PCR プ レートの対応するウェルに移します。 安全な停止ポイント 「29ページの「Validate Library (ライブラリーの確認)」 または「TruSeq Enrichment (TruSeq の濃 縮)」をすぐに実行する予定がない場合、プロトコールはここで安全に停止できます。 停止する場 合は、Microseal ‘B’ 粘着シールで PCR プレートを密封し、-15° ～ -25℃ で保管してください (最長で 7 日間)。 TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 28 Enrich DNA Fragments (DNA 断片の濃縮) 注意 以下の 80% EtOH 洗浄ステップ (11 ～ 13) を実行している間は、PCR プレートを磁気スタンド 上に置いたままにしてください。 Validate Library (ライブラリーの確認) サンプルライブラリーでの品質管理分析と ChIP DNA ライブラリーテンプレートの定量化のために 以下の手順を実行してください。 Quantify Libraries (ライブラリーの定量化) Illumina のシーケンスプラットフォームで最高品質のデータを取得するには、フローセルのすべて のレーンにわたって、最適な濃度でクラスターを作成することが重要です。クラスター密度を最適 化するには、DNA ライブラリーテンプレートの正確な定量化が必要とされます。Illumina の 『Sequencing Library qPCR Quantification Guide (シーケンスライブラリー qPCR 定量化ガイド) (パーツ番号 11322363)』に従い、qPCR を使用してライブラリーを定量化してください。 Quality Control (品質管理) PCR 増幅した断片のサイズ分布を確認するために、テンプレートサイズの分布をチェックしま す。DNA ライブラリーの一部を、High Sensitivity DNA チップまたは DNA 1000 チップを用いたゲ ルまたはAgilent Technologies 2100 Bioanalyzer で検査してください。Bioanalyzer のサンプル実 行は定性目的にのみ使用してください。 } Agilent Bioanalyzer をHigh Sensitivity DNA チップとともに使用する場合: • 水を使用して 1:20 のライブラリーの希釈物を作成します • 薄められたライブラリー 1 µl を Agilent High Sensitivity DNA チップにロードします } Agilent Bioanalyzer を DNA 1000 チップとともに使用する場合は、1 μl のライブラリーを Agilent DNA 1000 チップにロードします。 図 2 TruSeq ChIP サンプル調製 ライブラリーにおける DNA ライブラリー分布の例 29 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN このプロセスでは、クラスター形成のための DNA テンプレートを調製する方法について説明しま す。インデックス DNA ライブラリーは 10 nM にノーマライズされ、それから同じ量にプールされま す。プーリング用ではない DNA ライブラリーは、プーリングされずに 10 nM にノーマライズされま す。 Consumables (消耗品) アイテム 数量 貯蔵庫 提供者 96 ウェル 0.3 ml PCR プレート (プーリングを行う場合のみ) 1 15° ～ 30℃ ユーザー 96 ウェル MIDI プレート 1 15° ～ 30℃ ユーザー Microseal ‘B’ 粘着シール 1 15° ～ 30℃ ユーザー Tris-HCl 10 mM、pH8.5 + 0.1% Tween 20 各サンプルを 10 nM にノーマライズするの に必要な量 15° ～ 30℃ ユーザー Preparation (準備) } 25ページの「Enrich DNA Fragments (DNA 断片の濃縮)」 の終わりで PCR プレートを保管し た場合は、それを -15℃～ 25℃ の貯蔵庫から取り出します。 • プレートを室温で置いたままにして解凍します。 • PCR プレートを 280 xg で 1 分間遠心します。 • 粘着シールを解凍した PCR プレートから取り除きます。 Procedure (手順) 1 PCR プレートの各ウェルから透明な上清 10 µl を取り出し、新しい 96 ウェルの MIDI プレート の対応するウェルに移します。 2 Tris-Cl 10 mM、pH 8.5 + 0.1% Tween 20 を使用して、MIDI プレートの各ウェル内のサンプ ルライブラリーの濃度を 10 nM にノーマライズします。 TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 30 Normalize and Pool Libraries (ライブラリーのノーマライズとプーリング) Normalize and Pool Libraries (ライブラリーのノーマライズ とプーリング) 注意 各サンプルライブラリーの収率定量化データによって、MIDI プレートの最終量は 10 ～ 400 µl の幅で異なります。 3 ノーマライズされたサンプルライブラリー全体を上下に 10 回そっとピペッティングしてしっかり 混ぜ合わせます。 4 生成するライブラリーのタイプに応じて、以下から 1 つを実行します。 • 非プールライブラリーの場合は、プロトコールはここで終了です。以下から 1 つを実行し ます。 — クラスター形成に進みます。詳細については、ご使用の Illumina プラットフォームの ユーザーガイドでクラスター形成に関するセクションを参照してください。 — Microseal ‘B’ 粘着シールで MIDI プレートを密封し、-15°～ 25℃ で保管します。 • プールライブラリーの場合は、手順 5 に進みます。 5 各プールで、一緒に組み合わされるサンプルの数を決定します。 注意 同じインデックスを持つ 2 つのサンプルをプーリングすること避けるため、各ウェルに入ってい るサンプルを記録してください。 6 MIDI プレートからプーリング対象のノーマライズされた各サンプルライブラリー 10 µl を取り出 し、新しい 96 ウェルの 0.3 ml PCR プレートの 1 つのウェルに移します。 PCR プレートの各ウェルの合計量は、組み合わされたサンプルライブラリーの数の 10 倍とな るはずであり、20 ～ 240 µl (2 ～ 24 ライブラリー) になります。たとえば、2 サンプルに対する 量は 20 µl、12 サンプルに対する量は 120 µl、24 サンプルに対する量は 240 µl です。 7 全体を上下に 10 回そっとピペッティングしてしっかり混ぜ合わせます。 8 以下から 1 つを実行します。 • クラスター形成に進みます。詳細については、ご使用の Illumina プラットフォームのユー ザーガイドでクラスター形成に関するセクションを参照してください。 • Microseal ‘B’ 粘着シールで PCR プレートを密封し、-15°～ 25℃ で保管します。 31 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN Acronyms (頭字語) Acronyms (頭字語) 表 1 頭字語 頭字語 定義 ATL A-Tailing Mix ChIP 染色体免疫沈降 (Chromatin immunoprecipitation) dsDNA 二本鎖 DNA (double-stranded DNA) ERP End Repair Mix EUC Experienced User Card IEM Illumina Experiment Manager LIG Ligation Mix LTF Lab Tracking Form PCR ポリメラーゼ連鎖反応 (Polymerase Chain Reaction) PMM PCR Master Mix PPC PCR Primer Cocktail RSB Resuspension Buffer STL Stop Ligation Buffer TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 32 Kit Contents (キットの内容物) TruSeq ChIP サンプル調製 プロトコールを開始する前に、このセクションで示されている TruSeq ChIP サンプル調製 試薬がすべて揃っていることを確認してください。 48 Samples - Set A Box or Set B Box (48 サンプル - セット A ボック スまたはセット B ボックス) 注文したセットに応じて、ボックス A またはボックス B が含まれたキットを受け取ります。 Store at -15° to -25℃ (-15° ～ -25℃ での保管) これらのボックスはドライアイスを使用して出荷されます。受け取り後すぐに、以下のコンポーネン トを -15° ～ -25℃ で保管してください。 Set A (セット A) 図 3 TruSeq ChIP サンプル調製キット、48 サンプル - セット A ボックス、パーツ番号 15034288 スロット 1 2 3 4 5 6 7 8 9 33 試薬 RSB ERP ATL LIG STL AR002 AR004 AR005 AR006 パーツ番号 15026770 15012494 15012495 15026773 15012546 15026634 15026636 15026637 15026638 説明 Resuspension Buffer End Repair Mix A-Tailing Mix Ligation Mix Stop Ligation Buffer RNA Adapter Index 2 RNA Adapter Index 4 RNA Adapter Index 5 RNA Adapter Index 6 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN 試薬 AR007 AR012 AR013 AR014 AR015 AR016 AR018 AR019 パーツ番号 15026640 15026645 15024655 15024656 15024657 15024658 15024660 15024661 Kit Contents (キットの内容物) スロット 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 説明 RNA Adapter Index 7 RNA Adapter Index 12 RNA Adapter Index 13 RNA Adapter Index 14 RNA Adapter Index 15 RNA Adapter Index 16 RNA Adapter Index 18 RNA Adapter Index 19 空 空 空 Set B (セット B) 図 4 TruSeq ChIP サンプル調製キット、48 サンプル - セット B ボックス、パーツ番号 15034289 スロット 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 試薬 RSB ERP ATL LIG STL AR001 AR003 AR008 AR009 AR010 AR011 AR020 TruSeq ChIP サンプル調製ガイド パーツ番号 15026770 15012494 15012495 15026773 15012546 15026633 15026635 15026641 15026642 15026643 15026644 15024662 説明 Resuspension Buffer End Repair Mix A-Tailing Mix Ligation Mix Stop Ligation Buffer RNA Adapter Index 1 RNA Adapter Index 3 RNA Adapter Index 8 RNA Adapter Index 9 RNA Adapter Index 10 RNA Adapter Index 11 RNA Adapter Index 20 34 スロット 13 14 15 16 17 18 19 20 試薬 AR021 AR022 AR023 AR025 AR027 パーツ番号 15024663 15024664 15024665 15024667 15024668 説明 RNA Adapter Index 21 RNA Adapter Index 22 RNA Adapter Index 23 RNA Adapter Index 25 RNA Adapter Index 27 空 空 空 48 Samples - PCR Box (48 サンプル PCR ボックス) Store at -15℃ to -25℃ (-15° ～ -25℃ での保管) このボックスはドライアイスを使用して出荷されます。受け取り後すぐに、以下のコンポーネントを 15° ～ -25℃ で保管してください。 図 5 TruSeq ChIP サンプル調製キット、48 サンプル -PCR ボックス、パーツ番号 15027084 スロット 1 2 35 試薬 PMM PPC パーツ番号 15026785 15026786 説明 PCR Master Mix PCR Primer Cocktail パーツ番号 15023092 改訂 B JPN TruSeq ChIP サンプル調製のプロトコールを開始する前に、ユーザーが用意する必要な消耗品と 器具がすべて揃っていることを確認してください。 表 2 ユーザーが用意する消耗品 器具 サプライヤー 2.0 ml DNA LoBind チューブ Eppendorf、カタログ番号 022431048 6X Gel Loading Dye BioLabs、カタログ番号 B7021S 10 µl バリアピペットチップ 一般のラボサプライヤー 10 µl マルチチャネルピペット 一般のラボサプライヤー 10 µl シングルチャネルピペット 一般のラボサプライヤー 20 µl バリアピペットチップ 一般のラボサプライヤー 20 µl マルチチャネルピペット 一般のラボサプライヤー 20 µl シングルチャネルピペット 一般のラボサプライヤー 50 bp DNA ラダー NEB、カタログ番号 N3236L 50 X TAE Buffer BIO-RAD、パーツ番号 161-0743 96 ウェル保存用プレート、ラウンドウェル、 0.8 ml (「MIDI」プレート) Fisher Scientific、 パーツ番号 AB-0859 100 bp DNA ラダー NEB、カタログ番号 N3231L 200 µl バリアピペットチップ 一般のラボサプライヤー 200 µl マルチチャネルピペット 一般のラボサプライヤー 200 µl シングルチャネルピペット 一般のラボサプライヤー 1000 µl バリアピペットチップ 一般のラボサプライヤー 1000 µl マルチチャネルピペット 一般のラボサプライヤー TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 36 Consumables and Equipment (消耗品および器具) Consumables and Equipment (消耗品および器具) 器具 サプライヤー 1000 µl シングルチャネルピペット 一般のラボサプライヤー Agencourt AMPure XP 60 ml キット Beckman Coulter Genomics、 パーツ番号 A63881 Certified Low-range Ultra Agarose BIO-RAD、パーツ番号 161-3107 ChIP DNA (5 ～ 10 ng) ユーザーの実験サンプル エタノール 200 プルーフ (アブソルート) (分子生物学用) (500 ml) Sigma Aldrich、 パーツ番号 E7023 GeneCatchers または 清潔なメス Gel Company、カタログ番号 PKB4.0 または PKB6.5 一般のラボサプライヤー Microseal ‘B’ 粘着シール Bio-Rad、 パーツ番号 MSB-1001 MinElute Gel Extraction Kit QIAGEN、パーツ番号 28604 PCR グレードウォーター 一般のラボサプライヤー Qubit アッセイチューブ または Axygen PCR-05-C チューブ Life Technologies、 カタログ番号 Q32856 または VWR、パーツ番号 10011‐830 Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies 100 アッセイ、カタログ番号 Q32851 500 アッセイ、カタログ番号 Q32854 RNaseZap (表面の汚染除去用) 一般のラボサプライヤー RNase/DNase-freeのストリップチューブとキャップ 一般のラボサプライヤー RNase/DNase フリーのマルチチャネル試薬リ ザーバー、使い捨て VWR、パーツ番号 89094-658 SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain Invitrogen、 パーツ番号 S11494 37 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN サプライヤー Tris-HCl 10 mM、pH8.5 + 0.1% Tween 20 一般のラボサプライヤー Tween 20 Sigma-Aldrich、パーツ番号 P7949 超純水 一般のラボサプライヤー Consumables and Equipment (消耗品および器具) 器具 表 3 ユーザーが用意する器具 器具 サプライヤー 2100 Bioanalyzer Desktop System Agilent、パーツ番号 G2940CA (オプション) Agilent DNA 1000 Kit Agilent、パーツ番号 5067-1504 Agilent 高感度 DNA キット Agilent、パーツ番号 5067-4626 96 ウェルサーマルサイクラー (ヒートリッド付) 一般のラボサプライヤー Dark Reader ライトボックスまたは UV ライトボックス Clare Chemical Research、カタログ番号 DR195M 電気泳動電力装置 一般のラボサプライヤー Magnetic Stand-96 Life Technologies、カタログ番号 AM10027 マイクロプレート遠心機 一般のラボサプライヤー Qubit 2.0 蛍光光度計 Life Technologies、カタログ番号 Q32866 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/Q32866 Thermo Scientific Owl B2 EasyCast Mini ゲルシステム (米国) Thermo Scientific、パーツ番号 B2 -またはFisher Scientific、パーツ番号 09-528-110B (その他の地域) Fisher Scientific、 パーツ番号 OWL-130-101J B ボルテックスミキサー 一般のラボサプライヤー TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 38 Indexed Adapter Sequences (のインデックスアダプター のシーケンス) TruSeq ChIP サンプル調製キット には、以下のインデックスアダプターのシーケンスが含まれて います。 注意 • インデックス番号付けは連続しておらず、インデックス 17、24、26 はありません。 • かっこ () 内の塩基は、7 番目のサイクルに対する塩基を表しており、インデックスシーケンスの 一部としては見なされません。インデックスを 6 塩基のみとしてサンプルシートに記録します。 インデックス 13 以上に対しては (かっこ内の) 第 7 塩基が A ではない場合があり、これは、イ ンデックスリードの 7 番目のサイクルにて見られます。 • インデックスリードをシーケンスするために使用するサイクル数に関する詳細は、ご使用の装 置のユーザーガイドを参照してください。 39 パーツ番号 15023092 改訂 B JPN Indexed Adapter Sequences (のインデックスアダプターのシーケンス) 表 4 TruSeq ChIP サンプル調製キット セット A インデックスアダプターシーケンス アダプター シーケンス アダプター シーケンス AR002 CGATGT(A) AR013 AGTCAA(C) AR004 TGACCA(A) AR014 AGTTCC(G) AR005 ACAGTG(A) AR015 ATGTCA(G) AR006 GCCAAT(A) AR016 CCGTCC(C) AR007 CAGATC(A) AR018 GTCCGC(A) AR012 CTTGTA(A) AR019 GTGAAA(C) 表 5 TruSeq ChIP サンプル調製キット セット B インデックスアダプターシーケンス アダプター シーケンス アダプター シーケンス AR001 ATCACG(A) AR020 GTGGCC(T) AR003 TTAGGC(A) AR021 GTTTCG(G) AR008 ACTTGA(A) AR022 CGTACG(T) AR009 GATCAG(A) AR023 GAGTGG(A) AR010 TAGCTT(A) AR025 ACTGAT(A) AR011 GGCTAC(A) AR027 ATTCCT(T) TruSeq ChIP サンプル調製ガイド 40 注意 テクニカルサポートに関しては、Illumina カスタマーサポートまでお問い合わせください。 表 6 Illumina 一般問合わせ先情報 Illumina Web サイト 電子メール www.illumina.com [email protected] 表 7 Illumina カスタマーサポート電話番号 地域 問合わせ先番号 北米 1.800.809.4566 オーストリア 0800.296575 ベルギー 0800.81102 デンマーク 80882346 フィンランド 0800.918363 フランス 0800.911850 ドイツ 0800.180.8994 アイルランド 1.800.812949 地域 イタリア オランダ ノルウェー スペイン スウェーデン スイス イギリス その他の国 問合わせ先番号 800.874909 0800.0223859 800.16836 900.812168 020790181 0800.563118 0800.917.0041 +44.1799.534000 MSDSs (化学物質安全データシート) 化学物質安全データシート (MSDSs) は Illumina の Web サイト www.illumina.com/msds でご覧に なれます。 Product Documentation (製品マニュアル) 製品のドキュメントは、Illumina の Web サイトから PDF ファイルでご利用いただけま す。www.illumina.com/support にアクセスして製品を選択し、[Documentation & Literature] をク リックしてください。 TruSeq ChIP サンプル調製ガイド テクニカルサポート テクニカルサポート *15023092* パーツ番号 15023092 改訂 B JPN Illumina サンディエゴ、カリフォルニア 92122、アメリカ +1.800.809.4566 +1.858.202.4566 (北米以外からの場合) [email protected] www.illumina.com
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