TruSeq DNA PCRFree Sample Prep のご紹介酒井名朋子 Sr Technical Applications Scientist イルミナ株式会社 © 2010 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminaDx, Solexa, Making Sense Out of Life, Oligator, Sentrix, GoldenGate, GoldenGate Indexing, DASL, BeadArray, Array of Arrays, Infinium, BeadXpress, VeraCode, IntelliHyb, iSelect, CSPro, GenomeStudio, Genetic Energy, HiSeq, and HiScan are registered trademarks or trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners. Outline 2 1. TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep kitのご紹介 2. 従来のTruSeq DNA キットとの違い 3. TruSeq DNA PCR-Free の操作手順とベストプラクティス 4. トラブルシューティング TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep kit のご紹介半日で終わるPCR-Free プロトコル – ビーズで行うサイズセレクション   ビーズもキットに含まれます。 Gel free – 2 種類のinsert sizeに対応  350bp と550bp – LT (24 sample) とHT (96 sample) をご用意 Reference 配列に対して高いCoverage – GapとPCR biasをクリア – high GC/AT rich regionsに対しても高いCoverage 3 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prepのご紹介 -Data 品質の改善 PCRによるバイアスを低減 Library 間のバイアスとギャップを低減 GC/AT リッチな領域のCoverageを増加 *詳細はData sheetをご確認ください。 4 従来のTruSeq DNA キットとの違い -特徴について従来のTruSeqDNA TruSeq DNA PCR-Free PCR step の有無有無平均Insert サイズ 300-400bp 350 bp 550 bp (gel size selectionの場合) 5 Input DNA 量 1ug 1ug 2ug 1kitでのサンプル数 LT: 48サンプル HT: 96サンプル LT: 24サンプル HT: 96サンプル Indexの数 LT: 24 種類 HT: 96種類ご準備いただくビーズ AMPure XP beads SPBビーズはkitに付属所要時間 1-2日～5時間 (350bp) (550bp) (kit A, kit Bで12種類ずつ) 従来のTruSeq DNA キットとの違い TruSeq DNA 6 -手順について TruSeq DNA PCR-Free TruSeq DNA とTruSeq DNA PCR-Free Sample Prep どちらのキットを使用するか？ http://www.illumina.com/applications/detail/sequencing/dna_sequencing.ilmn TruSeq DNA TruSeq DNA PCR-Free Whole Genome 解析 Yes YES TruSeq Enrichment YES NO YES (LT only) NO YES (1ug) Yes (1ug/2ug) ≤ 2x101 ≤ 2x101 for 350 bp ≤ 2x151 for 550 bp アプリケーションメチル化解析 DNA の量が限られている場合推奨リード長 7 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prepの手順 -手順と重要なポイント A) DNAの断片化 B) 平滑末端化 C) サイズセレクション D) 3’ Add A E) Adapterのライゲーション 8 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prepの手順 -ビーズによるSize Selection C) 断片のサイズ分布を限定する – Bead によるsize selection  350 bp  550 bp 9 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep の手順 Sample Purification ビーズ (SPB) ビーズはKit に含まれますサイズセレクションと精製に使用希釈に使用するビーズの使用量で DNAのサイズ分布を決定 http://core-genomics.blogspot.jp/2012/04/how-do-spri-beads-work.html 10 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep の手順 -2段階ビーズ精製によるサイズセレクション Step 1: 高分子側を除くビーズの希釈希釈率はインサートサイズにより異なるサンプルとビーズの混合 Magnetに乗せる上清にDNAが含まれる Step 2: 低分子側を除く希釈無しでビーズを使用 Magnet に使用済ビーズを捨てる乗せる上清を捨てる上清を保持 ※上清にターゲットサイズ分布を含むDNAが含まれます。 DNAはビーズに吸着 EtOH でWash Pellet を乾燥させる beads を RSBに懸濁 11 第2段階では希釈無でビーズを使用 ※希釈無しビーズがターゲットサイズの DNAを吸着し、RSBに懸濁するまでビーズと結合をしています。 Size Selection Workflow 2段階ビーズ精製によるサイズセレクション断片化されたDNA, サイズセレクション前 Step 2: 低分子側を除去 12 サイズセレクション後 Step 1: 高分子側を除去 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prepの手順手順と重要なポイント E) Adapterのライゲーション – BioAnalayzer結果ではLibrary サイズが高分子側に出現 – 定量はqPCRにて行う 13 TruSeq DNA PCR-Free librariesの定性評価 Bioanalyzer 結果 Bioanalyzer フォークアダプターが原因で高分子側に結果が出る Libraryの定性評価には有効、定量評価には無効 350bp 550bp 14 TruSeq DNA PCR-Free librariesの定量評価 qPCR による定量 qPCR 最終的なLibraryの定量にはqPCR を使用 KAPA社製 kit （standard付き）を推奨 -Bioanlayser とQubit は定量には無効 -Picogreen による定量は再現性が低い × × × × 完全なLibraryのみqPCRで定量可能 15 qPCRでの定量方法定量レンジ 2-40nM User Guideに記載のあるqPCR による定量法  できるだけ多容量で定量を行うこと(2µl)  誤差を防ぐため、スタンダードは独立に調整すること  Fragment size別に異なる Library長を計算に使用すること x Bioanalzyerの定量結果は使用不可  計算例 16 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep 代表的なトラブルシューティング例問題内容 • 収量が極端に低い • 収量が低い • qPCRにて定量 • • 期待しないサイズ分布 17 • • 期待値: ≥2nM ユーザーガイドを参照 KAPA kitと付属の standard ビーズの操作手順をチェック • 低収量につながる BioAnalyzerトレースが有効トラブルシュート • • • • • qPCR の定量手順を確認 Input DNAのQualityが低い・量が少ないビーズ精製中のハンドリングでサンプルをLost サイズセレクションのステップを確認 • 希釈を確認 Input DNAが分解されている Questions? 18