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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
EFECTO DEL USO DEL SUELO SOBRE COMUNIDADES MICROBIANAS DE
SISTEMAS DE PASTOREO Y CULTIVOS DE CAÑA DE AZUCAR DEL VALLE
DEL CAUCA
JOHAN SEBASTIÁN SÁENZ MEDINA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MAGÍSTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
DIRECTOR: ZIV ARBELI, Ph.D.
Bogotá D.C.
2014
NOTA DE ADVERTENCIA
"La
Universidad no se hace responsable por los conceptos
emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará
porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y porque las tesis no contengan ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de
buscar la verdad y la justicia".
Artículo 23 de la Resolución No13 de Julio de 1946.
EFECTO DEL USO DEL SUELO SOBRE COMUNIDADES MICROBIANAS DE
SISTEMAS DE PASTOREO Y CULTIVOS DE CAÑA DE AZUCAR DEL VALLE
DEL CAUCA
JOHAN SEBASTIÁN SÁENZ MEDINA
APROBADO
________________________
Ziv Arbeli, Ph.D
Director
________________________
______________________
Sandra Baena, Ph.D
Daniel Uribe, Ph.D
Jurado
Jurado
__________________________
Wilson Teran, Ph.D
Jurado
EFECTO DEL USO DEL SUELO SOBRE COMUNIDADES MICROBIANAS DE
SISTEMAS DE PASTOREO Y CULTIVOS DE CAÑA DE AZUCAR DEL VALLE
DEL CAUCA
JOHAN SEBASTIAN SÁENZ MEDINA
APROBADO
__________________________
Concepción Puerta B., Ph.D
Decana Facultad de Ciencias
__________________________
Manuel Antonio Franco, MD., Ph.D
Director de Posgrado Ciencias
AGRADECIMIENTOS
A todos los que de una u otra manera me apoyaron durante este proceso formativo.
TABLA DE CONTENIDOS
1.
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................ 1
2.
MARCO TEORICO ............................................................................................................................ 3
2.1. EFECTO DE LOS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ADN Y LA PURIFICACIÓN SOBRE LA
ESTIMACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS .......................................... 3
2.1.1.
Estudios de diversidad microbiana y sesgos de los métodos utilizados ...........................3
2.1.2.
Sesgos generados por el método de extracción de ADN de suelo ........................................4
2.1.3.
Uso del gen 16S ARNr para estudios de diversidad microbiana ......................................4
2.1.4.
Sobrestimación de la diversidad ........................................................................................................5
2.1.5.
Herramientas bioinformáticas ...........................................................................................................6
2.2. EFECTO DEL USO DE SUELO SOBRE LA DIVERSIDAD MICROBIANA EN SUELOS DEL
VALLE DEL CAUCA .................................................................................................................................................. 8
2.2.1.
Efecto de la actividad agrícola sobre la calidad del suelo .....................................................8
2.2.2.
Sistemas agroecológicos alternativos..............................................................................................9
2.2.3.
Factores ambientales que afectan las comunidades bacterianas ......................................9
2.2.4.
Perturbaciones en los procesos ecosistémicos ......................................................................... 11
2.2.5.
Indicadores de la calidad del suelos ............................................................................................. 12
3.
OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN ........................................................................................... 14
4.
MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................... 15
4.1. EFECTO DE LOS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓN Y REPRODUCIBILIDAD DE LA
PCR EN LA ESTIMACIÓN DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA. ...................................................................... 15
4.1.1.
Obtención de las muestras ................................................................................................................. 15
4.1.2.
Diseño experimental ............................................................................................................................ 15
4.1.3.
Extracción, cuantificación y purificación del ADN metagenómico................................. 16
4.1.4.
Amplificación y secuenciación de la región V4 del gen 16S ARNr............................... 17
4.1.5.
Ensamblaje y limpieza de las secuencias ................................................................................... 18
4.1.6.
Análisis de diversidad. ........................................................................................................................ 18
4.2. EFECTO DEL USO DEL SUELO SOBRE LA DIVERSIDAD MICROBIANA ................................... 19
4.2.1.
Diseño experimental y muestreo de suelo con diferentes usos ....................................... 19
4.2.2.
Bosque seco tropical ............................................................................................................................ 21
4.2.3.
Pastura convencional .......................................................................................................................... 21
4.2.4.
Sistema silvopastoril intensivo ........................................................................................................ 21
4.2.5.
Caña de azúcar ....................................................................................................................................... 22
4.2.6.
Manejo de las muestras ...................................................................................................................... 23
4.2.7.
Extracción, cuantificación y amplificación de la región V4 del ADN
metagenómico de los diferentes usos de suelo ............................................................................................. 24
4.2.8.
Análisis bioinformatico y de diversidad...................................................................................... 24
5.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................................... 25
5.1. EFECTO DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ADN. ................................ 25
5.1.1.
Estandarización del protocolo de extracción ........................................................................... 25
5.1.2.
Concentración y pureza del ADN .................................................................................................. 25
5.1.3.
Calidad ensamblaje y filtración de las librerías de la región V4 .................................... 28
5.1.4.
Efecto de la extracción y purificación de ADN y la reproducibilidad de la PCR en
la discriminación de comunidades .................................................................................................................... 30
5.1.5.
Efecto de la extracción y purificación sobre la estimación de la α y β diversidad . 32
5.1.6.
Efecto del método de extracción sobre la abundancia de los Fila ................................. 36
5.2. EFECTO DEL USO DEL SUELO SOBRE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS DE SUELOS
DEL VALLE DEL CAUCA. ...................................................................................................................................... 42
5.2.1.
Diferencias en las propiedades físico-químicas en los diferentes usos de suelo del
Hatico y la Lucerna .................................................................................................................................................. 42
5.2.2.
Filtración y asignación de las de las secuencias .................................................................... 47
5.2.3.
Variación de la alfa diversidad entre los usos de suelo ....................................................... 48
5.2.4.
Variación de las comunidades microbianas entre los usos de suelo ............................. 51
5.2.5.
Los usos de suelo y la diferencia entre las fincas afectan la abundancia de algunos
Fila…………………. .............................................................................................................................................. 54
5.3. Relación de las variables fisicoquímicas y la estructura de las comunidades
microbianas del suelo .............................................................................................................................................. 57
6.
CONCLUSIONES ............................................................................................................................. 61
7.
PERSPECTIVAS Y RECOMENDACIONES............................................................................ 63
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................................ 64
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. . Factores ambientales que influyen sobre la estructura, composición y diversidad de las
comunidades bacterianas edáficas en suelos nativos (bosque, pastizal, desierto) y en suelos con
actividades agrícolas y agropecuarias (suelos con diferentes manejos)……………………………11
Tabla 2. Indicadores físicos, químicos y biológicos que deben ser incluidos en un set de datos para
evaluar la calidad del suelo (Wienhold et al;; 2004)………………………………………………...13
Tabla 3. Muestras de diferentes usos de suelo recolectadas en el departamento del Valle del
Cauca………………………………………………………………………………………………..22
Tabla 4. Métodos utilizados en el análisis de propiedades fisicoquímicas llevado a cabo en el
Instituto Geográfico Agustín Codazzi………………………………………………………………23
Tabla 5. Concentración y pureza del ADN metagenomico extraído con dos métodos con o sin
purificación de las muestras. Las letras representan la formación de grupos con diferencias
significativas (p<0,05)………………………………………………………………………………27
Tabla 6. Índices de Riqueza expresada en número de OTUS únicos y diversidad obtenida de
diferentes usos de suelo con dos métodos de extracción de ADN y efecto de la purificación de las
muestras. Se muestra el promedio ±1ds. No se encontraron diferencias significativas entre los
valores……………………………………………………………………………………………….32
Tabla 7. Significancia de las distancias entre las comunidades microbianas recuperadas con dos
métodos de extracción de ADN y el efecto de la purificación sobre esta. Las comunidades fueron
comparadas mediante pairwise-Unifrac de diferentes usos de suelo, y el valor p se calculó con la
prueba no paramétrica de ANOSIM y el Test de Montecarlo (n=999, α=0,05)……………………34
Tabla 8. Parámetros fisicoquímicos de los usos de suelo muestreados en dos zonas del Valle del
Cauca. Los usos de suelo son: bosque, sistema silvopastoril, pastura convencional, caña de azúcar
con manejo convencional y agroecológico. Se presenta el promedio ± 1ds………………………..45
Tabla 9. Valores propios de la influencia de las variables fisicoquímicas evaluadas sobre la
separación de los usos de suelo en las fincas del Hatico y la Lucerna. Se presenta la el porcentaje de
la varianza que explica el análisis y se resaltan los valores propios con mayor efecto en la
varianza……………………………………………………………………………………………...46
Tabla 10. Ranking de los cinco OTUS más abundantes clasificados a nivel de Orden encontrados
en cinco distintos usos de suelo en dos zonas geográficas, finca el Hatico (H) y la Lucerna (L) del
Valle del Cauca. Los usos de suelo evaluados fueron; Bosque (B), Caña de azúcar ecológica (CO),
Caña de azúcar convencional (CC), Sistemas Silvopastoriles (S) y Pastura convencional
(P)…………………………………………………………………………………………………...49
Tabla 11. Comparación de índices de riqueza y diversidad de cinco usos de suelo. Se muestra el
promedio 1ds………………………………………………………………………………………50
Tabla 12. Forward selection de las variables fisicoquímicas con influencia significativa sobre la
distribución de los diferentes Fila en los usos de suelo. Se resaltan los valores P significativos y se
muestra la varianza explicada por cada variable……………………………………………………59
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema general del flujo de trabajo de análisis de comunidades microbianas en QIIME.
Tomado de Caporaso Et al; 2010 (1)………………………………………………………………..7
Figura 2. Esquema general del diseño experimental para evaluar el efecto de los métodos de
extracción, purificación y reproducibilidad de la PCR en la estimación de la diversidad
microbiana…………………………………………………………………………………………..16
Figura 3. Diseño de los primers para la construcción de los amplicones de la región V4 del gen 16S
ARNr: adaptadores (rojo), barcodes y zona de hibridación de los primers (Azul), zona de
hibridación de los primers de secuenciación (Amarillo), linker (Blanco) y target de la región
conservada V4 (verde)………………………………………………………………………………18
Figura 4. Ubicación geográfica de dos fincas agroecológicas del Valle del Cauca. Dentro de la
Lucerna (Buga la grande, A) y en el Hatico (Palmira, B) fueron muestreados sistemas
silvopastoriles y cañas de azúcar de manejo ecológico. Los demás sistemas, pasturas
convencionales y caña de azúcar de manejo convencional fueron muestreadas en fincas cercanas de
ambas zonas. Adicionalmente se muestreo un bosque nativo dentro del Hatico…………………...20
Figura 5. Tamaño de los amplicones de la región V4 del gen 16S ARNr evaluado mediante gel de
agarosa (B) y BioAnalyzer (A)……………………………………………………………………...29
Figura 6. Distancias de las comunidades microbianas calculadas mediante Pairwise-Unifrac tanto
en matrices de ausencia/presencia (A) y abundancia (B) visualizadas en una gráfica de componentes
principales (PCoA), la varianza explicada se denota entre corchetes al lado de cada
eje…………........................................................................................................................................31
Figura 7. Curvas de rarefacción de la riqueza de muestras de bosque (A), sistemas silvopastoriles
(B) y pasturas convencionales (C) a partir de ADN extraído con diferentes métodos y sin o con
purificación de las muestras. Las curvas fueron calculadas a una profundidad de 30.000 secuencias
por muestra. Powersoil (Rojo), PowerSoil-purificado (Azul), Griffiths (Verde) y Griffithspurificado (Amarillo)………………………………………………………………………………..33
Figura 8. Abundancia relativa de los 13 Fila más abundantes encontrados en tres diferentes usos de
suelo con dos diferentes métodos de extracción y el efecto de la purificación de las muestras…37
Figura 9. Análisis de componentes principales (PCoA) de muestras de bosque (A), sistema
silvopastoril (B) y pasturas convencionales (C), con dos métodos de extracción de ADN y efecto de
la purificación de las muestras basados en las distancias calculadas mediante UniFrac. Los
ordenamientos de la izquierda fueron elaborados con matrices de distancia ausencia/presencia
(Unweighted) y las de la derecha con matrices de abundancia (Weighted)………………………...38
Figura 10. Correlación de la abundancia relativa de los Fila, expresada en el porcentaje del número
de secuencias, obtenida con diferentes métodos de extracción de ADN y purificación en muestras
de bosque (A), sistemas silvopatoriles (B) y pasturas convencionales (C)……………….39
Figura 11. Comparación por pares mediante la prueba de t-test corregida por Benjamin de las
abundancias relativas obtenidas en los diferentes usos de suelo de dos métodos de extracción de
ADN. Power soil (verde) y Griffiths (Azul)………………………………………………………...41
Figura 12. Análisis de componentes principales (PCA) relacionando las propiedades fisicoquímicas
del suelo y los usos de suelo en el Hatico. Abreviaciones: A: porcentaje de arena, Ar: porcentaje
de arcilla, L: porcentaje de limo, CO: carbón orgánico, N: nitrógeno total, Cl: cloro, Ca: calcio,
Mg: magnesio, K: potasio, Na: sodio, BT: bases totales, NH4: amonio, NO3: nitrato y P: fosforo...44
Figura 13. Rangos de abundancia-especie donde se presenta la acumulación de secuencias por los
OTUS encontrados con una similitud de 97% con la base de datos de greengenes………………...49
Figura 14. Distancias de las comunidades microbianas de 5 diferentes usos de suelo calculadas
mediante Pairwise-Unifrac basado tanto en matrices de ausencia/presencia (A) y abundancia (B)
visualizadas en una gráfica de componentes principales (PCoA), la varianza explicada se denota
entre corchetes al lado de cada eje…………………………………………………………………..52
Figura 15. Boxplot de la comparación por pares de las distancias calculadas mediante Unifrac
entre los cinco distintos usos de suelo. Los datos se encuentran organizados de izquierda a derecha
de menor a mayor distancia…………………………………………………………………………54
Figura 16. Comparación por pares de la abundancia de los Fila significativamente diferentes entre
el bosque (verde), sistema silvopastoril (azul oscuro), pasturas convencionales (rojo), caña de
azúcar de manejo ecológico (azul claro) y caña de azúcar de manejo convencional (amarillo). La
significancia se determinó mediante la prueba t-test paramétrica corregida por Benjamin-FDR…..56
Figura 17. Comparación por pares de la abundancia de los Fila significativamente diferentes entre
la finca de la Lucerna (morado) y el Hatico (negro)………………………………………….57
Figura 18. Análisis de correspondencia canónica (CCA) entre las variables fisicoquímicas (Flechas
rojas) y los diferentes Fila (triángulos oscuros) encontrados en dos fincas agroecológicas; Lucerna
(L) y Hatico (H) en cinco usos de suelo bosque (B), sistema silvopastoril (S), pastura convencional
(P), caña de azúcar convencional (CC) y caña de azúcar ecológica (CO)………………………….58
INDICE DE ANEXOS
ANEXO A. Parámetros fisicoquímicos en los usos de suelo seleccionados para evaluar el efecto de
los métodos de purificación y extracción del ADN. Se presenta el promedio ± 1ds de los dos
eventos de muestreo más las diferencias fisicoquímicas evaluadas por Tukey.
ANEXO B. Estandarización de a extracción de ADN metagenómico de suelo del protocolo
reportado por Griffiths y colaboradores. Se evaluó 1) 5% CTAB -5% PEG, 2) 5% CTAB -20%
PEG, 3) 10% CTAB -5% PEG y 4) 10% CTAB -20% PEG. Se encontraron diferencias
significativas en la recuperación de A) ADN (P=0,007) pero no en la B) purificación (p>0,05).
ANEXO C. Representación gráfica de la calidad de las secuencias, de 250 pb, obtenida de 72
librerías secuenciadas en la plataforma Miseq de Illumina para la evaluación del efecto de los
métodos. El parámetro de calidad se presenta en un intervalo de 0-40 graficado en el eje Y. Se
muestran las secuencias en sentido A) forward, B) reverse y después de ser C) ensambladas.
ANEXO D. Diagrama de flujo y parámetros por defecto para filtrar los datos crudos (secuencias)
en la herramienta bioinformática QIIME.
ANEXO E. Resumen de los resultados del número de secuencias conservado por cada muestra
después de filtrarlas por los parámetros de calidad.
ANEXO F. Representación gráfica de la calidad de las secuencias, de 250 pb, obtenidas de 27
librerías secuenciadas en la plataforma Miseq de Illumina para la evaluación del efecto de los usos
de suelo. El parámetro de calidad se presenta en un intervalo de 0-40 graficado en el eje Y. Se
muestran las secuencias en sentido A) forward, B) reverse.
ANEXO G. Resumen de los resultados del número de secuencias conservado por cada muestra
después de filtrarlas por los parámetros de calidad. El número inicial de secuencias era 11.910.693.
ANEXO H. Establecimiento del número mínimo de secuencias que debe contener un OTU para ser
considerado OTU único A) Sin filtro, B) 10, C) 30, D) 50 y E) 100. Las comparaciones se
realizaron con las secuencias de las muestras de la comunidad artificial (12 OTUS esperados Rojo), Cepa pura T30B (1 OTU esperado - Naranja) y Cepa pura T30A (1 OTU esperado - Azul).
ANEXO I. Comparación de índices de riqueza y diversidad de cinco usos de suelo muestreados en
dos fincas separadas geográficamente en el Valle del Cauca. Se muestra el promedio.
RESUMEN
Los diferentes usos que se le dan a los suelos afectan las propiedades físico-químicas de estos, lo
que puede tener un efecto sobre las comunidades microbianas nativas de dichos ambientes. Para
determinar estos efectos se debe conocer cómo los diferentes métodos utilizados en los estudios de
ecología microbiana pueden afectar la estimación de la diversidad. En el presente estudio se
analizó: 1) el efecto que tienen el método de extracción (Kit PowerSoil vs método Griffiths), la
purificación de ADN (eliminación de contaminantes) y la reproducibilidad de la PCR y 2) el efecto
que tiene el uso del suelo (sistemas de pastoreo y cultivos de caña de azúcar) en dos regiones del
Valle del Cauca sobre la estructura y composición de las comunidades microbianas. Las
comunidades microbianas fueron estudiadas utilizando la región V4 del gen 16S ARNr y
secuenciándola mediante Secuenciación de Siguiente Generación (Miseq, Illumina). El método de
extracción de ADN tiene la mayor influencia sobre la estimación de las comunidades microbianas
mientras no se observó efecto de la purificación y la reproducibilidad de la PCR. Además, el
método de Griffiths favorece la abundancia de Verrucomicrobia, Armatimonadetes, Planctomycetes
y Crenarchaeota mientras que la abundancia de WS3, Bacteroidetes y Firmicutes se favorece por el
método de Power Soil. Con respecto al uso del suelo, se encontró que las comunidades microbianas
del bosque se discriminan de los sistemas de pastoreo y cultivos de caña de azúcar, siendo más
similares estas dos últimas. Además, la estructura de las comunidades microbianas de los mismos
sistemas productivos (caña o pastoreo) se agrupan entre sí, mientras que el manejo agronómico
(convencional vs. agroecológico) y las diferencias geográficas y espaciales entre ambas fincas
tienen un efecto menor sobre la separación. La mayor diferencia entre los suelos se debe a cambios
de la abundancia de los Fila WS3 (p=0,0002), Chlamydiae (p=0,0004), Firmicutes (p=0,0008),
Acidobacteria
(p=0,0095),
Planctomycetes
(p=0,0125),
Proteobacteria
(p=0,0370)
y
Crenarchaeota (p=0,0443). De las propiedades fisicoquímicas evaluadas el pH, la concentración de
Amonio y potasio tienen un efecto significativo sobre la estructura y composición de las
comunidades microbianas. Aunque se observó que el manejo agronómico, afecta las propiedades
fisicoquímicas del suelo, su influencia sobre las comunidades microbianas del suelo fue menor que
la influencia de la diferencia geográfica. En conclusión la estimación de la estructura de las
comunidades microbianas utilizando el mismo método de extracción de ADN para la amplificación
de la región V4 del gen 16S ARNr es robusta. Además, el sistema productivo determina la
estructura y composición de las comunidades microbianas independiente de la zona geográfica.
ABSTRACT
The different uses that are given to soils affect their physicochemical properties, which may have an
effect on microbial communities. To determine these effects it must be understood how the different
methods used in microbial ecology studies may affect the estimation of diversity. In the present
study it was analyzed: 1) The effect of the ADN extraction (PowerSoil Kit vs Griffiths method) and
the purification method (removing contaminants) and 2) the effect of land use in a conventional or
agro-ecological way, in grazing systems and sugar cane crops in two regions of Valle del Cauca.
The microbial communities were studied by the sequencing of the V4 region of the 16S rRNA gene
by Next Generation Sequencing (MiSeq, Illumina). The ADN extraction method had the greatest
influence on the estimation of microbial communities, while no effect was observed with the
purification. Furthermore, it was observed that the PowerSoil kit favors the abundance WS3,
Bacteroidetes and Firmicutes phyla, while Griffiths protocol favors Verrucomicrobia,
Armatimonadetes, Planctomycetes and Crenarchaeota. Regarding to land use, it was found that
forest microbial communities are discriminated from grazing systems and sugarcane crops, being
more like the latter two. In addition, microbial communities of land uses are grouped with each
other, regardless of geographic and spatial differences between the two farms. The biggest
difference between soils is due to changes in the abundance of phyla WS3 (p = 0.0002),
Chlamydiae (p = 0.0004), Firmicutes (p = 0.0008), Acidobacteria (p = 0.0095), Planctomycetes (p =
0.0125), Proteobacteria (p = 0.0370) and Crenarchaeota (p = 0.0443). About the physicochemical
properties evaluated pH, ammonium and potassium concentration have significant effect on the
structure and composition of microbial communities. Comparing the agro-ecological and
conventional type of management in sugarcane, it was noted that this has no influence on microbial
communities but on the physicochemical properties of the soil. In conclusion the estimation of the
microbial community structure using the same ADN extraction method for the amplification of the
V4 region of the 16S rRNA gene is considered robust. And the land use determines the structure
and
composition
of
microbial
communities
independent
of
the
geographic
area
1. INTRODUCCIÓN
La conversión de bosques en sistemas agronómicos convencionales es una de las principales causas
de deterioro del ambiente en Latinoamérica (2). En Colombia, la transformación de áreas naturales
con objetivos agropecuarios y el uso inadecuado de los suelos ha generado que el 12,6% (137.340
ha) del área total del país se encuentre degradada (baja calidad del suelo) en un nivel leve (2,78%,
31.669 ha), moderado (5,29%, 60.287 ha) y de manera severa (3,98%, 45.384 ha) (2). La
intervención humana conlleva a diferentes procesos de degradación del suelo. Estos procesos son la
perdida de materia orgánica, erosión, inundaciones, salinización, deslizamientos, compactación y
contaminación (3). Estos procesos se presentan en el manejo agronómico convencional del suelo ya
que involucran arado, manual o con maquinaria pesada, y aplicación de agroquímicos, lo que
conduce a la degradación física, química y biológica de los suelos, afectando su fertilidad y
sostenibilidad a largo plazo, lo que va en contravía de la “Calidad del suelo” y “Salud del suelo” (4–6)(7).
Por lo anterior, se ha propuesto la implementación de manejos agronómicos ecológicos que
disminuyan o eviten la degradación del suelo y permitan el aprovechamiento del mismo. Por
ejemplo, los sistemas silvopastoriles intensivos, desarrollo Colombo-Mexicano (8), combinan el
arado no intensivo, el aumento de la cobertura vegetal, la disminución en la intensidad de pastoreo y
otras más para evitar la degradación del suelo producida por el pastoreo convencional (9). En
Colombia, más específicamente en fincas en el Valle del Cauca se han establecido sistemas
agroecológicos de pastoreo (sistemas silvopastoriles intensivos) y de cultivos de caña de azúcar.
Los sistemas silvopastoriles intensivos han sido utilizados como modelo para determinar el efecto
que tiene el manejo ecológico sobre las comunidades microbianas comparados con manejos
convencionales (10, 11). Estos estudios han sido realizados utilizando técnicas como Fatty acid
methyl esters (FAME) y Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), los cuales no capturan
toda la comunidad microbiana y tienen múltiples sesgos como la estimación de los
microorganismos más abundantes (12, 13). En estos estudios se ha reportado que las comunidades
microbianas del suelo encontradas en los sistemas silvopastoriles intensivos son más similares a las
de los bosques que a las de las pasturas convencionales. Sin embargo, uno de los principales retos
es entender la influencia de estos usos de suelo sobre las propiedades fisicoquímicas y las
comunidades microbianas, ya que se ha demostrado la relación entre estas variables.
1
El rápido desarrollo de las tecnologías de secuenciación masiva de ADN ha permitido la generación
de un volumen de secuencias sin precedentes, desde el análisis de unos pocos clones a millones de
secuencias, con múltiples ventajas relacionadas con los costos, rapidez, profundidad, cobertura y la
posibilidad de procesar múltiples muestras al mismo tiempo (14, 15). Además, se ha impulsado el
diseño de herramientas bioinformáticas que permiten procesar millones de secuencias desde su
filtración hasta la asignación taxonómica de esta información (1, 16). De ahí que, dichas tecnologías
han sido aprovechadas en estudios como los del Human Microbiome Project, Earth Microbiome
Project, TerraGenome Project y del Marine Microbial Genome Sequencing Project (17, 18). Estos
buscan ayudar entender el rol de los microorganismos en los diferentes hábitats desde el propio
cuerpo humano hasta todo el planeta. Específicamente, se busca la integración de la información de
miles de muestras incluyendo variables temporales y espaciales para revelar patrones a gran escala
acerca del comportamiento de las comunidades microbianas.
Sin embargo, todas las conclusiones acerca de estos patrones que se encuentren serán el resultado
de una investigación basada en diferentes métodos que incluyen procesos en el laboratorio hasta
análisis in silico. Se ha demostrado que diferentes métodos utilizados comúnmente en el laboratorio
como la extracción de ADN (19, 20) y amplificación por PCR (21) tienen diferentes sesgos que
pueden influir en el análisis de los datos. Además, nuevos métodos como la secuenciación masiva
de la siguiente generación pueden producir inflación en la estimación de la diversidad microbiana si
esta información no es procesada adecuadamente. Sin embargo, no se conoce la influencia de los
métodos de purificación. Por lo anterior, se debe develar la influencia de los métodos de extracción,
purificación y amplificación de ADN utilizados en la estimación de la diversidad microbiana para
proponer patrones acerca del establecimiento de las comunidades microbianas.
2
2. MARCO TEORICO
2.1. Efecto de los métodos de extracción de ADN y la purificación sobre la estimación de
la estructura de las comunidades microbianas
2.1.1. Estudios de diversidad microbiana y sesgos de los métodos utilizados
Las bacterias constituyen un gran componente de la biomasa y de la diversidad en la Tierra y de
igual forma se reconoce su importante papel para el mantenimiento de la vida y los ciclos
biogeoquímicos (22, 23). Sin embargo, no se conocen todos los factores que alteran la diversidad, la
composición y la estructura de la comunidad microbiana (24). Aunque se ha escrito mucho sobre la
revolución que ha generado la introducción de métodos moleculares a los estudios de ecología
microbiana, se reconoce que estos métodos tienen diversos sesgos. La complejidad de estudiar la
diversidad microbiana se debe primero a factores objetivos como la heterogeneidad espacial, alta
diversidad y clasificación taxonómica y segundo a factores metodológicos como la dificultad de
cultivar microorganismos (25). Dentro de estas limitaciones se encuentra la heterogeneidad con la
que se distribuyen las comunidades en el suelo, lo que conlleva a la necesidad de un buen diseño de
muestreo. Estos muestreos deben cubrir los micro hábitats o “hotspots” donde se encuentran diferentes organismos (26). Una de las mayores limitantes hace referencia a la ambigüedad
taxonómica, ya que la plasticidad genética de las bacterias permite que el ADN sea intercambiado
por varios mecanismos, dificultando la definición de especie (25). Además, los primeros estudios de
diversidad se realizaron con técnicas dependientes de cultivo pero al conocerse que solo
aproximadamente el 1% de los microorganismos son cultivables se debieron explorar otras técnicas
como las moleculares. Sin embargo, estas técnicas moleculares dependen de varios procedimientos
de los cuales se conocen múltiples sesgos.
Es así como el método de extracción del ADN comunitario no logra romper la pared celular de
todas las bacterias de manera homogénea (27), la amplificación del gen 16S ARNr por PCR
presenta formación de diversos artefactos (21), los métodos de huellas moleculares, tales como la
electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE) sólo captura los miembros más
dominantes de la comunidad (28), y recientemente, se descubrió que los métodos de secuenciación
de la nueva generación (NGS) producen sobrestimación de la diversidad (29). Por estos motivos es
de gran importancia la discusión e investigación de los efectos que presentan los diferentes métodos
sobre la estimación de la estructura de las comunidades microbianas.
3
2.1.2. Sesgos generados por el método de extracción de ADN de suelo
Debido a la heterogeneidad de los suelos donde se ubican los microorganismos y de los
microorganismos es necesario utilizar métodos capaces de romper estas microestructuras. Existen
dos aproximaciones, extracción directa donde la células se rompen en el suelo e indirecta donde se
retiran las células del suelo y se rompen (30). Los métodos de extracción directa son más usados,
sin embargo cada uno tiene sus ventajas y desventajas. Los métodos de extracción directa son más
rápidos y pueden extraer entre 10-100 veces más ADN (31). Mientras que los métodos de
extracción indirecta obtiene ADN de mejor calidad en términos de tamaño y pureza.
Dentro de los métodos de extracción directa, son usados tratamientos físicos como disrupción
mecánica con perlas, el cual es considerado el mejor para la extracción de bacterias Gram-positivas
y Gram-negativas a diferencia de congelar/descongelar, calentamiento en microondas o maceración
con nitrógeno (32–34). Para obtener mayor eficiencia en la extracción los métodos físicos han sido
combinados con métodos enzimáticos. Se considera que el 90% de las bacterias del suelo pueden
ser lisadas (27), posterior a la liberación de ADN este interactúa fuertemente con las partículas del
suelo, mediado por los iones divalentes causando que en menos de 20 minutos 80% de este se ha
adsorbido, factor que es más relevante en suelos ricos en arcilla. Por esta razón altas
concentraciones de sal son utilizadas en los buffer para promover la desorción del ADN de las
partículas del suelo (35). Además, la extracción de contaminantes como los ácidos húmicos,
inhibidores de la reacción de la polimerasa, obliga a la purificación del ADN por medio de varios
procedimientos, como gel de agarosa, cromatografía, columnas con resinas y otros más. Sin
embargo, del ADN total extraído, que corresponde al 60% de ADN que puede ser recuperado, se
pierde el 30% por los posteriores procedimientos de purificación (36, 37). Por lo anterior es de gran
interés estudiar como todas estas limitantes en la extracción del ADN de suelo afectan la estimación
de la estructura de las comunidades microbianas ya que ha sido poco estudiado.
2.1.3. Uso del gen 16S ARNr para estudios de diversidad microbiana
Una de las aplicaciones emergentes es la secuenciación masiva de diferentes regiones del gen 16S
ARNr, para establecer perfiles de diversidad filogenética de las comunidades microbiana (38, 39).
La gran limitante de la secuenciación de siguiente generación es la extensión de las lecturas (100600 pb) (14, 15) es por esto que los estudios de diversidad han buscado flanquear las diferentes
4
regiones variables del gen 16S ARNr. La precisión de la clasificación taxonómica de los
organismos utilizando el gen 16S ARNr depende de dos aspectos: la universalidad de los primers y
que tan informativa es la región específica seleccionada (40). Se ha observado que
independientemente de la tecnología de secuenciación (pirosecuenciación o Illumina) la precisión
es más alta si flanquean las regiones en tándem V3/V4 y V4/V5, pero por otro lado la longitud de
las lecturas afecta drásticamente la precisión de las mismas. Sin embargo las regiones variables en
tándem V1/V2, V2/V3, V3/V4, V4/V5, V5/V6, V6/V7, V7/V8 clasificadas a diferentes niveles
taxonómicos pueden generar alta variabilidad, más específicamente a niveles de similitud del 97 %
o de género. Se ha demostrado que la precisión, de cada una de las regiones en tándem, se mantiene
cuando los organismos son clasificados en Filum, Clase, Orden y Familia pero disminuye
drásticamente en género. Igualmente, se ha propuesto que las regiones hipervariables V3, V4 y V5
tienen una precisión muy similar a las regiones en tándem y que las regiones V1 y V9 presentan
los resultados más pobres seguidos por la V7 y V8 con respecto a clasificación taxonómica de las
secuencias (40). Otros estudios sugieren que la región V6 contiene información suficiente para
identificar afinidad filogenética utilizando secuencias de longitud corta (41, 42).
Así mismo, se ha demostrado que la selección de los primers tiene influencia directa sobre la
estimación de la estructura y composición de las comunidades microbianas. Específicamente el
Filum Verrucomicrobia ha sido considerado poco abundante en los suelos. Sin embargo, la
comparación entre la abundancia obtenida con set de primers diferentes, 27F/337R (0,9%) y
515F/806R (14,9%), demostró que esto se debe a la subestimación provocada por la región
hipervariable seleccionada (43). Por lo tanto la selección de los primers debe estar acompañada de
varios análisis, como son la cobertura y temperatura óptima. Otro de los problemas de la
amplificación de las regiones hipervariables del gen 16S ARNr es la formación de artefactos. Estos
han sido clasificados en heteroduplex (duplex y homoduplex), quimeras y errores de la polimerasa
(21). Se ha encontrado que los errores de la polimerasa tienen el mayor efecto sobre la estimación
de las comunidades microbianas, ya que una PCR de 35 ciclos aumenta en un 30% el número de
secuencias únicas con respecto a una de 15 ciclos (44), conllevando a una inflación de la diversidad.
2.1.4. Sobrestimación de la diversidad
Debido al gran número de lecturas que produce la secuenciación de siguiente generación, se ha
alcanzado una profundidad sin precedentes en el estudio de la diversidad microbiana. Mediante esta
5
información descubrió que existen una gran cantidad de organismos en una baja abundancia
denominados la “biosfera rara” (45), concluyendo que la biosfera rara es dos órdenes de magnitud
más grande y más diversa de lo que se creía (41). Aun así, estos estudios han sido altamente
discutidos, ya que se ha encontrado que las tecnologías de secuenciación de nueva generación
sobreestiman la diversidad de los filotipos raros por un error intrínseco (29). Esta sobre estimación
se ha reportado mediante la secuenciación de la región V1-V2 del gen 16S ARNr de la cepa E. coli
MG1655 ya que de uno y cinco OTUS teóricos se han obtenido 643 y 16 a una similitud de 100 y
97% respectivamente (46). Igualmente la secuenciación de la región V6 del gen 16S ARNr de una
cepa de E. coli puede representar entre 775 y 15000 OTUS a un 100% de similitud (47). Basándose
en análisis bioinformático es posible depurar las lecturas obtenidas durante la secuenciación,
eliminando aquellas que puedan causar una sobre estimación en la diversidad (46). Se considera que
es importante eliminar aquellas secuencias únicas (singletons) producto de los errores intrínsecos de
la secuenciación (29, 46). Del mismo modo se ha propuesto conservar aquellas secuencias que estén
representadas por más del 0,005% en la abundancia total de las secuencias (48). Por lo anterior se
ha llegado a la conclusión que existen algunos parámetros bioinformaticos para filtrar las lecturas.
Estos parámetros son la calidad de cada base, el número de bases consecutivas consideradas de
buena calidad, bases sin resolver (N), errores en los adaptadores o códigos de barras y lecturas de
tamaños irregulares y eliminación de artefactos.
2.1.5. Herramientas bioinformáticas
La secuenciación de alto rendimiento se caracteriza por combinar la relación costo/profundidad, y
capacidad de analizar simultáneamente varias muestras. Las plataformas más reconocidas, Roche
454 y Solexa illumina (Hiseq2000), pueden generar 0,7 G y 600 G de información por corrida en
menos de 10 días respectivamente (49). Grandes proyectos como los del Human Microbiome
Projects (50), Earth Microbiome Project, TerraGenome Project (17) y del
Marine Microbial
Genome Sequencing Project han aprovechado este tipo de tecnologías para describir patrones a
gran escala. Sin embargo, el gran reto consta en aprovechar la cantidad de información generada sin
precedentes que sigue en crecimiento. Diferentes grupos han desarrollado herramientas
bioinformáticas para el análisis de estos datos, dentro de estas están: QIIME (1), Mothur (16) y los
paquetes de CLC (51). QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology) es una herramienta
para la comparación y análisis de comunidades microbianas basada en amplicones generados por
NGS. Esta herramienta permite al usuario filtrar los datos crudos (48), hacer selección de OTUS
(52), asignación taxonómica (53) y alineamiento de secuencias (54) para construcción de árboles
6
filogenéticos, además de algunos análisis estadísticos y visualización gráfica de los resultados
(Figura 1). Otro gran avance aplicado en esta herramienta ha sido la construcción de tablas de
formato BIOM (The Biological Observation Matrix) (55) con la finalidad de representar de forma
sencilla y estandarizada las muestras biológicas con sus respectivas observaciones en tablas de
contingencia. Además, dentro de la herramienta se incluye el método UniFrac (56) diseñado para
calcular las distancias entre comunidades microbianas basado en la información filogenética.
Unifrac puede ser usado para determinar las diferencias significativas, teniendo en cuenta la
ausencia/presencia (Unweighted) o abundancia (Weighted) de los OTUS, de múltiples comunidades
microbianas usando métodos de ordenamiento o agrupamiento (57). El desarrollo e implementación
de estas herramientas computacionales permite el análisis de millones de secuencias de alta calidad
obtenidas en la nueva era de la secuenciación masiva.
Figura 1. Esquema general del flujo de trabajo de análisis de comunidades microbianas en QIIME.
Tomado de Caporaso Et al; 2010 (1)
7
2.2. Efecto del uso de suelo sobre la diversidad microbiana en suelos del Valle del Cauca
2.2.1. Efecto de la actividad agrícola sobre la calidad del suelo
La actividad agrícola puede conllevar a procesos de degradación del suelo. Dentro de estos procesos
se encuentra la perdida de materia orgánica, erosión, inundaciones, salinización, deslizamientos,
compactación y contaminación (3). Estos procesos se presentan en el manejo convencional del
suelo ya que involucran arado, manual o con maquinaria pesada, y aplicación de agroquímicos, lo
que conduce a la degradación física, química y biológica de los suelos, afectando su fertilidad y
sostenibilidad a largo plazo (4–6). Debido al establecimiento de cultivos, se reduce la entrada de
materiales orgánicos (p.e., hojarasca, ramas, raíces) provenientes de árboles o arbustos,
disminuyendo el ingreso de nutrientes al suelo y consecuentemente se generará una pérdida del
contenido de carbono orgánico y nitrógeno total (9, 10). Así mismo, las prácticas de arado generan
disminución del contenido de carbono orgánico del suelo, por lo cual se genera una alta
dependencia de fertilizantes orgánicos e inorgánicos, lo que aumenta los costos para la producción
(5). La pérdida del carbono orgánico, sumado a una menor cobertura de las raíces, profundidad de
las mismas y presión física por el pisoteo constante del ganado, en sistemas de ganadería, produce
cambios en la estructura del suelo; generando compactación, disminución en la estabilidad de los
agregados, en la porosidad total del suelo, la aireación, la capacidad de infiltración, lo que acelera
los procesos de erosión deteriorando la calidad y fertilidad del suelo (11, 12).
Por otro lado, Perú, Colombia y Brasil son los mayores productores de caña de azúcar en el
continente. Recientemente la producción de caña de azúcar ha sido destacada debido a su
importancia en la obtención de nuevas tecnologías limpias para la producción de bioetanol. Se
espera en el 2020 que más del 80% del etanol producidos en países en desarrollo provenga del uso
de la caña de azúcar (58). Es tal el caso que los cultivos de caña han aumentado hasta un 300% en
algunos países en los últimos cinco años (59). Por tanto, es de gran preocupación los efectos que
puede tener el aumento de este tipo de cultivos sobre el ambiente. Se ha documentado que los
cultivos de caña tienen efectos negativos efecto de sobre, el agua, estructura del suelo, gases
invernadero, actividades enzimáticas, reservas de carbono y la fertilidad (60). Estos estudios han
demostrado que la quema de los residuos de cultivos tiene un pequeño efecto sobre las reservas de
carbono en el suelo a corto plazo. Sin embargo, el arado, fertilización y compactación tiene efectos
más marcados sobre la actividad enzimática, biomasa y agregados del suelo en este tipo de cultivos.
8
2.2.2. Sistemas agroecológicos alternativos
Los sistemas silvopastoriles intensivos, desarrollo colombo-mexicano (8), combinan árboles,
arbustos y pasturas que tienen beneficios importantes tanto en la conservación del suelo, reciclaje
de nutrientes, aumento de la biodiversidad y ofrecen beneficios económicos adicionales. La
introducción de árboles en las zonas de pastoreo mejoran la productividad de las pasturas, ya que
los árboles extraen agua y nutrientes desde los horizontes del suelo inaccesibles para los pastos (9).
El aumento de la biomasa incrementa la fijación de carbono y la biomasa vegetal que se reintroduce
al suelo. La ausencia de labranza, mejora la estructura y la porosidad del suelo aumentando la
aeración e infiltración de agua. La disminución del número de cabezas de ganado por ha disminuye
el efecto del pisoteo. Los árboles también pueden proporcionar beneficios directos, económicos, en
forma de productos como frutas, leña, forraje y madera. Finalmente los árboles brindan sombra y
diversifican los alimentos para el ganado (p.e. mayor proteínas) lo que puede mejorar la
productividad, especialmente de la leche y carne (61). Este tipo de sistemas son considerados por la
FAO de gran importancia para la mitigación del cambio climático y aprovechamiento de los
beneficios ambientales (62).
Por otro lado el manejo ecológico de los cultivos de caña de azúcar implica la no quema y reciclaje
de los residuos, los cuales pueden ser utilizados como fertilizante y el corte manual de las cañas
evitando la compactación por el peso de la maquinaria (63, 64).
2.2.3. Factores ambientales que afectan las comunidades bacterianas
El efecto de la actividad agropecuaria sobre la calidad del suelo afecta la biodiversidad y
funcionalidad del ecosistema (3). Estos cambios están asociados a los efectos que tiene el uso del
suelo sobre las propiedades fisicoquímicas del suelo. Sin embargo, la relación entre cómo el uso del
suelo y los cambios en las plantas y propiedades del suelo puede afectar específicamente la
abundancia de algunos grupos taxonómicos, esta aun en discusión. Algunos de los factores que
influencian la proliferación de las poblaciones bacterianas en un hábitat específico son: textura del
suelo, pH, tipo de vegetación, concentración de carbono y nitrógeno, humedad, temperatura y
precipitaciones, agregación del suelo y concentración de nutrientes (P, Ca, Mg) (2, 3, 15-17)
(Tabla1).
9
Por ejemplo, estudios intercontinentales, realizados con 98 muestras de suelo con alta variabilidad
fisicoquímica han sugerido que aquellos suelos con propiedades ambientales similares presentan
comunidades bacterianas parecidas, sin importar la distancia geográfica. Además que, el pH resalta
como un factor de gran importancia que influye la composición y asentamiento de las comunidades
bacterianas (65–71). Así mismo, la saturación y disponibilidad de agua ha sido asociada a una
disminución en la abundancia de hongos y bacterias Gram negativas y al aumento de bacterias
Gram-positivas, sulfato reductoras y bacterias anaerobias (72). De igual manera, la actividad
agropecuaria como la adición de fertilizantes nitrogenados tiene un mayor efecto sobre aquellas
poblaciones bacterianas nitrificantes y desnitrificantes, o poblaciones que crecen rápidamente en
presencia de altas concentraciones de fuentes de nitrógeno inorgánicas (73). Sin embargo se ha
demostrado que la concentración de nitrógeno tiene mayor influencia sobre las comunidades en la
superficie del suelo, mientras que el carbono la tiene en suelo más profundo (74) . También, se ha
encontrado que las bacterias anaerobias, reductoras de sulfato, sulfuro y metales pertenecientes a
Firmicutes y Proteobacteria están altamente asociados a la textura y compactación (75, 76). Es
más se ha identificado que cambios en la cobertura vegetal, bosques a pasturas convencionales,
producen discriminación en el tipo de comunidades microbianas que allí se establecen (71, 77–79).
Aunque existen diversos estudios que demuestran la influencia de las propiedades fisicoquímicas
sobre las comunidades microbianas, es necesario centralizar esta información para estimar los
patrones más importantes.
10
Tabla 1. Factores ambientales que influyen sobre la estructura, composición y diversidad de
las comunidades bacterianas edáficas en suelos nativos (bosque, pastizal, desierto) y en
suelos con actividades agrícolas y agropecuarias (suelos con diferentes manejos).
Referencias
Factor ambiental
Textura del suelo
(68, 77, 80)
(65–71)
pH
Tipo de vegetación
Carbono, Nitrógeno
Humedad
Temperatura y
(71, 77–79)
(65, 71, 81, 82)
(72, 83–85)
(85–87)
precipitaciones
Agregación del suelo
Nutrientes (P, Ca, Mg)
(88)
(82, 89, 90)
*Tomada de Cubillo; 2012.
2.2.4. Perturbaciones en los procesos ecosistémicos
Algunos estudios se han enfocado en determinar cómo las perturbaciones ambientales afectan la
diversidad y estructura de las comunidades microbianas y en consecuencia los procesos
ecosistémicos. En unos estudios se ha encontrado que los cambios en la diversidad y estructura de
las comunidades generan variaciones en los procesos funcionales del ecosistema, pero en otros
casos la relación no es evidente (91–94). Por ejemplo, en sistemas agronómicos semiáridos de
manejo orgánico se ha demostrado que el aumento de biomasa y actividad enzimática está ligado al
incremento en el ciclaje de nutrientes y una lenta liberación de las reserva de los mismos (95) (96).
También, se ha encontrado que perdidas en la biomasa microbiana o diversidad pueden conllevar a
una disminución hasta de 4-5 veces de la actividad denitrificante. Además, la presencia de otros
recursos como el carbono, incrementan este potencial en el suelo (94). Por otro lado, Wakelin y
colaboradores propusieron que la capacidad denitrificante y nitrificante se ve alterada por la
11
intensidad del pastoreo y la fijación de nitrógeno por la carga animal de ese tipo de sistemas (86).
Además, estos cambios fueron acompañados por perturbaciones a las comunidades microbianas
más específicamente la de los hongos. Más aun, Horz y colaboradores (97) demostraron que las
bacterias nitrificantes se ven afectadas por cambios en el CO2 atmosférico, fijación de nitrógeno,
precipitaciones y temperatura lo que conlleva a alteraciones en el ciclo del nitrógeno.
Es más, se ha demostrado que el crecimiento de los árboles, está asociado al flujo de metano lo que
influencia directamente la abundancia de grupos específicos como las bacterias metanotroficas (93).
Esto cobra importancia debido a la conversión de bosques en sistemas de pasturas convencionales.
En contraste, otro estudio relacionado con la diversidad microbiana involucradas en el ciclo del
carbono no ha demostrado que perturbaciones en la comunidad impliquen cambios en el ecosistema
(21). Lo anterior se puede explicar debido a que la degradación de materia orgánica es una función
altamente redundante entre los microorganismos mientras que la nitrificación es más específica. Por
lo anterior se considera que perturbaciones en las comunidades bacterianas afectaran las funciones
del suelo específicas y no aquellas globales. Lo anterior se debe a la capacidad de la redundancia
funcional para mantener la estabilidad y resiliencia de las comunidades microbianas en el suelo
después de una perturbación, lo que contribuye al mantenimiento de los ciclos biogeoquímicos (98).
2.2.5. Indicadores de la calidad del suelos
La mala administración del suelo ha resultado en la erosión, salinización e inundación de
aproximadamente 10 millones de ha por año. Por lo tanto se ha introducido el concepto “Calidad del suelo” y “Salud del suelo” para diagnosticar el estado de este, con respecto a diferentes factores. La calidad del suelo puede ser definida como la capacidad de funcionar como un sistema
vivo y vital en un ecosistema o uso de suelo específico y la salud del suelo de ser capaz de
mantener o aumentar la productividad biológica, promover la calidad del agua y del aire y mantener
la salud vegetal, animal y humana (7, 91). Adicionalmente, se ha propuesto que un suelo con buena
calidad deberá tener una alta diversidad y actividad biológica, un ciclaje de nutrientes adecuado y
presentar resiliencia ante la aparición de un disturbio ambiental determinado que pueden ser
producidos por el mismo uso de suelo (99). Sin embargo, un suelo puede tener calidad para un
único uso de suelo, pero no para todos, por lo tanto la calidad del suelo se puede reducir a
“adecuado para un único uso”. La calidad y procesos del suelo pueden ser evaluados con un set de
variables físicas, químicas y biológicas (Tabla 2). La colección de dos sets de datos permite la
12
comparación entre dos sistemas, sin embargo se ha destacado que colección de datos en diferentes
periodos de tiempo permite el análisis de las dinámicas de los usos de suelo. Estas dinámicas
permiten determinar la dirección y magnitud de los cambios producidos por el manejo (7). Las
dinámicas de la calidad del suelo pueden ser medidas en agradación (aumento de la calidad),
sostenibilidad (mantenimiento de la calidad) y degradación (disminución de la calidad) (7). Uno de
los mayores avances en la determinación de la calidad del suelo ha sido la conversión de los
parámetros físicos, químicos y biológicos en índices que pueden ser comparados. Estos índices
están basados en la normalización de parámetros dinámicos o inherentes en escalas de valores. De
ahí que, el concepto de la calidad del suelo se haya unificado para evaluar los tipos de manejo que
se le dan los usos de suelo y se puedan proponer prácticas alternativas, con la finalidad de enfrentar
los retos en el deterioro del ambiente.
Tabla 2. Indicadores físicos, químicos y biológicos que deben ser incluidos en un set de datos para
evaluar la calidad del suelo (Wienhold et al; 2004).
Físicas
Químicas
Biológicas
Textura
Carbón orgánico
Biomasa microbiana
Profundidad
Nitrógeno total
N potencialmente mineralizable
Infiltración
pH
Respiración del suelo
Densidad aparente
Conductividad eléctrica
Capacidad de retención de agua
N,P,K
13
3. OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN
Objetivo general
Evaluar el efecto del uso del suelo sobre comunidades microbianas de sistemas de pastoreo y
cultivos de caña de azúcar del Valle del Cauca.
Objetivos específicos
Evaluar el efecto del protocolo de extracción y la pureza del ADN, sobre la estimación de la
comunidad bacteriana.
Comparar la comunidad bacteriana edáfica entre cultivos de caña de azúcar con manejo
convencional y agroecológico, pastura convencional, sistema silvopastoril intensivo y
bosque.
14
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Efecto de los métodos de extracción, purificación y reproducibilidad de la PCR en la
estimación de la diversidad microbiana.
4.1.1. Obtención de las muestras
Para evaluar el efecto del método de extracción, purificación y reproducibilidad de la PCR se
utilizaron suelos provenientes de la reserva natural de carácter privado “El Hatico” (Valle del Cauca) con tres diferentes usos; bosque seco tropical (> 100 años de edad), sistema silvopastoril
intensivo y pasturas convencionales (>30 años de establecimiento) (100). La muestra del sistemas
silvopastoril correspondía a la parcela burras, 10 años de establecimiento, que fue considerada de
edad intermedia en estudios anteriores (10, 11). Las muestras fueron recolectadas en el tercer evento
de muestreo realizado por Cubillos (100) durante la época de lluvia de septiembre de 2010. En cada
uso de suelo se estableció un cuadrante de 2.5 m x 2.5 m, a partir de los cuales se tomaron al azar
20 submuestras a 10 cm de profundidad aproximadamente, mediante el uso de barrenos. Las
muestras de cada cuadrante fueron mezcladas y homogenizadas para obtener muestras compuestas
de aproximadamente 500g, las cuales se depositaron en bolsas y fueron transportadas al laboratorio
en neveras con hielo. De estas muestras compuestas, aproximadamente 30g fueron congelados a 80ºC para posteriores análisis. Las muestras de los usos de suelo presentaron diferente clases
texturales. Además se encontraron diferencias significativas en el contenido de arcilla, arena, limo,
carbono orgánico, en la densidad aparente, resistencia a la penetración y pH (Anexo A).
4.1.2. Diseño experimental
El diseño experimental se presenta en la Figura 2. De cada uno de los 3 suelos, se tomaron 12
muestras (0.25 g) para la extracción de ADN (en total, 36 muestras), seis utilizando un kit comercial
(PowerSoil™ ADN Isolation Kit MoBio) y seis utilizando el método de Griffiths modificado
(Griffiths et al, 2000). La mitad de las muestras extraídas con cada método, tres muestras, fueron
purificadas. Adicionalmente, de cada muestra se realizó la amplificación del gen 16S ARNr de dos
maneras. La primera con 3 reacciones y la respectiva mezcla de estas y la segunda únicamente con
una sola reacción por muestra. Lo anterior se llevó a cabo con la finalidad de evaluar la
reproducibilidad de la PCR.
15
4.1.3. Extracción, cuantificación y purificación del ADN metagenómico
La extracción con el kit se realizó siguiendo las recomendaciones de la casa comercial
(PowerSoil™ ADN Isolation Kit MoBio), mientras que el protocolo de Griffiths se modificó en la
etapa de la precipitación del ADN. En este caso el ADN fue precipitado con una concentración de
5 % de Polietilenglicol en vez de 20 %. Esta modificación se realizó de acuerdo a Arbeli & Fuentes
(101) y después de la estandarización con 6 distintos suelos (Anexo B). La mitad de las muestras
procesadas con cada método fueron purificadas utilizando columnas de Sefarosa 2B y Polivinil
Polipropioide (101). Arbeli & Fuentes (101) utilizaron Sefarosa 4B, sin embargo, esta se modificó
por 2B ya que se reportó un mejor rendimiento en la eliminación de contaminantes (36). El ADN
metagenomico fue cuantificando utilizando el método fluorometrico QUBIT (Invitrogen GmbH,
Karlsruhe, Germany). Otros parámetros de pureza del ADN fueron medidos mediante método
espectrofotométrico (NanoDrop). Las diferencias estadísticas entre los parámetros evaluados se
comprobaron mediante una prueba de ANOVA ( =0,05) y el respectivo posthoc Tukey. Aquellos
datos sin homogeneidad de varianzas se evaluaron mediante Kruskal-Wallis.
Figura 2. Esquema general del diseño experimental para evaluar el efecto de los métodos de
extracción, purificación y reproducibilidad de la PCR en la estimación de la diversidad microbiana.
16
4.1.4. Amplificación y secuenciación de la región V4 del gen 16S ARNr
La región V4 ha sido descrita como una buena herramienta para clasificación taxonómica, ya que
presenta buena cobertura de los taxones bacterianos con pocos errores utilizando secuencias cortas
como las que produce la secuenciación por Illumina (43, 102). La amplificación de la región V4 se
realizó utilizando los primers 515F (5’ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
TATGGTAATT GT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA (3’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
XXXXXXXXXXXX
‘3)
y
AGTCAGTCAG
806R
CC
GGACTACHVGGGTWTCTAAT ‘5) (39). El primer 515F contenía un adaptador para la
plataforma de Illumina, una región complementaria para el primer de secuenciación, un linker y
una secuencia diana complementaria de la región conservada. El primer 806R
contenía un
adaptador para la plataforma de Illumina, un barcode de 12 pares de bases, una región
complementaria para el primer de secuenciación un linker y una secuencia diana complementaria de
la región conservada (Figura 3). Cada uno de los extractos, de los tratamientos evaluados, fue
amplificado tres veces en un volumen final de 30 μL que contenía: 10 ng ADN molde, 1X buffer,
0,2 mM de cada dNTP, 2 mM MgSO4, 0,05 μM de cada primer y 0,02 U/μL de polimerasa (Platinum Taq ADN Polimerasa High Fidelity–Hot Start, INVITROGEN). Las condiciones de
amplificación fueron las siguientes: denaturación inicial 94°C por 3 minutos; 30 ciclos que
consistieron de denaturación a 94°C por 45 segundos, anillamiento a 50°C por 60 segundos y
extensión a 72°C por 90 segundos; y un ciclo de extensión final a 72°C por 10 minutos. El tamaño
de los productos (350 pb) se verifico en gel de agarosa al 1,5 % P/V. Las tres amplificaciones de
cada extracto fueron unificadas en un solo tubo y purificadas utilizando el kit UltraClean™ PCR Clean-up. Adicionalmente, se realizó una amplificación de cada extracto con una única reacción
para evaluar el efecto de la reproducibilidad de la PCR y no la del método de extracción de ADN,
Finalmente, las librerías de cada muestra fueron cuantificadas utilizando el método fluorometrico
QUBIT y mezcladas en un solo tubo en cantidades equi-molares para ser secuenciadas.
Adicionalmente, se incluyó como control una librería de la región V4 del gen 16S ARNr de la cepa
pura Pseudomonas putida KT2440. El servicio de secuenciación se llevó a cabo en ADN Facilities,
(University of Iowa) con la plataforma MiSeq de Illumina (2x250 pb) siguiendo las
recomendaciones del protocolo de secuenciación de Caporaso et al. (39). Este protocolo permite
aprovechar los 250 ciclos de secuenciación ya que los primers de secuenciación fueron diseñados
para hibridar adelante de los adaptadores, con lo cual estos no se secuencian.
17
Forward primer
5’ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC TATGGTAATT GT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA ‘3
Reverse primer
3’ CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT TCCCTTGTCTCC AGTCAGTCAG CC GGACTACHVGGGTWTCTAAT ‘5
Figura 3. Diseño de los primers para la construcción de los amplicones de la región V4 del gen 16S
ARNr: adaptadores (rojo), barcodes y zona de hibridación de los primers (Azul), zona de
hibridación de los primers de secuenciación (Amarillo), linker (Blanco) y target de la región
conservada V4 (verde). Caporaso et al, 2012.
4.1.5. Ensamblaje y limpieza de las secuencias
Las 250 pares de bases de los paired-end reads (Secuencias) fueron ensambladas en su totalidad
utilizando la herramienta Fast Length Adjusment of Short Reads to improve Genome Assemblies
(FLASH) (103). El ensamblaje se realizó con parámetros conservativos. Durante el ensamblaje se
estableció un sobrelapamiento mínimo de 240 pb y un máximo de 255 pb y un porcentaje de error
de coincidencia (mismatch) inferior a 3%, permitiendo la eliminación de información de baja
calidad. Las secuencias ensambladas de forma exitosa fueron filtradas según sus puntajes de calidad
(q) utilizando la herramienta QIIME 1.7 (1) según los siguientes parámetros: el 90% de las bases de
las secuencias debían ser de alta calidad (q>30), si se encuentran 3 bases consecutivas de baja
calidad (q<30) se trunca la secuencia (r = 3) y no se permitió ninguna base ambigua (N) (n = 0)
(48). De igual manera, no se permitió ningún error en las secuencias de los barcodes y se
incluyeron en el análisis solo aquellos OTUS con mínimo 10 secuencias (ver siguiente numeral).
Las secuencias que no cumplieron con estos parámetros fueron descartadas para posteriores
análisis.
4.1.6. Análisis de diversidad.
Los análisis de diversidad se llevaron a cabo utilizando QIIME v 1.7 y el paquete Phyloseq 1.5.21
en R 3.0 (104). La asignación de los OTUS se realizó mediante un proceso denominado pick Open
reference otus (Selección de OTUS) que consiste de los siguientes pasos: 1) se descartaron las
secuencias con menos de 60% de similitud con las secuencias del set de referencia de Greengenes
(eliminación de quimeras), 2) agrupamiento en OTUS de las secuencias con un 97% de similitud
18
calculado con UCLUST (52) utilizando la base de datos de referencia de 16S ARNr de Greengenes
(105), 3) selección de una secuencia representativa de cada OTU y asignación taxonómica mediante
RDP, 4) alineamiento de las secuencias mediante PyNast y construcción de un árbol filogenético
usando Fastree y 5) construcción de tablas de OTU en formato BIOM (55). Los OTUS con una
frecuencia menor de 10 considerando todas las muestras fueron descartados ya que pueden
representar los errores intrínsecos de la secuenciación (c = 10). Las tablas fueron re muestreadas a
una profundidad de 30000 secuencias por cada muestra, con la finalidad de normalizar el número de
secuencias que sería utilizado para los análisis de diversidad Alfa y Beta de las muestras. Este valor
se seleccionó teniendo en cuenta el mínimo número de secuencias encontrado en una muestra.
La diversidad-α se visualizó mediante curvas de rarefacción de las cuales se obtuvieron algunos
índices de diversidad como riqueza, Shannon y distancia filogenética. Los índices fueron
comparados mediante una prueba de t-test no paramétrica utilizando Test de Montearlo (número de
permutaciones =999 y α=0,05). Por otro lado la diversidad beta se analizó con matrices de
distancias calculadas con el método de UniFrac teniendo en cuenta la ausencia/presencia y la
abundancia de los OTUS (56). Las diferencias entre las comunidades microbianas se evaluaron
mediante el test no paramétrico ANOSIM (número de permutaciones =999 y α=0,05), utilizando las matrices de distancia. Adicionalmente las diferencias estadísticas de la abundancia de los Fila se
evaluó mediante ANOVA y un t-test paramétrico (corregido mediante Bonferroni y α=0,05), utilizando la herramienta STAMP 2.01.
4.2. Efecto del uso del suelo sobre la diversidad microbiana
4.2.1. Diseño experimental y muestreo de suelo con diferentes usos
Se recolectaron 27 muestras de suelo en el departamento del Valle del Cauca (Tabla 3), en el
municipio el Cerrito y de Buga la grande los cuales se encuentran a una distancia aproximada de 75
kilómetros (Figura 4). Las muestras correspondían a cinco distintos usos de suelo: bosque seco
tropical, pastura convencional, sistema silvopastoril intensivo y caña de azúcar con manejo
convencional y agroecológico. De cada uso de suelo, se tomaron 3 muestras de
parcelas
físicamente separadas, de cada municipio (en total 6 muestras de cada uso). La única excepción fue
el bosque, ya que existe solo uno sin intervención agrícola en El Hatico. Por esta razón, el bosque
fue dividió en tres franjas, desde la zona sur hasta la zona norte, para así obtener tres muestras como
en los demás sistemas, aunque en este caso, no fueron de 3 bosques separados.
19
A partir de cada uno de los sistemas se tomaron 30 submuestras a una profundidad de
10-15 cm.
Las muestras se recolectaron en septiembre de 2012 durante la época seca del año. El muestreo en
el municipio del Cerrito se llevó a cabo dentro y a los alrededores de la reserva natural “El Hatico” (N 3° 38' 39'', W 76° 19' 12''), la cual presenta una extensión de 288 ha y se encuentra a una altitud
de 1000 msnm. La zona presenta precipitaciones que alcanzan valores medios anuales de 850 mm,
distribuidas en forma bimodal (marzo a mayo y octubre a noviembre). La temperatura promedio es
de 24°C y presenta una humedad relativa del 75% (100). El muestreo en el municipio de Buga la
grande se realizó dentro y a los alrededores de la finca agroecológica “La Lucerna” (N 4° 14' 54'', W 76° 8' 40''), la cual se encuentra a 941 msnm, un promedio anual de precipitaciones de 1.166 mm
y una temperatura media anual de 23 °C. Según la clasificación de Holdridge, las fincas del Hatico
y la Lucerna están localizadas en la zona biogeografía de bosque seco tropical, lo que indica la
transformación que allí se ha llevado a cabo.
Figura 4. Ubicación geográfica de dos fincas agroecológicas del Valle del Cauca. Dentro de la
Lucerna (Buga la grande, A) y en el Hatico (Palmira, B) fueron muestreados sistemas
silvopastoriles y cañas de azúcar de manejo ecológico. Los demás sistemas, pasturas
convencionales y caña de azúcar de manejo convencional fueron muestreadas en fincas cercanas de
ambas zonas. Adicionalmente se muestreo un bosque nativo dentro del Hatico
20
4.2.2. Bosque seco tropical
El bosque seco tropical de más de más de 80 años de edad, ocupa 14 ha en la finca el Hatico
ubicada en El Cerrito. Las plantas dominantes que allí se encuentran son: Anacardium excelsum,
Xylopia ligustrifolia, Ficus sp., Cecropia sp., Bombacopsis sp., Myrcia popayanensis y Ceiba
pentandra. El bosque fue dividió en tres franjas, desde la zona sur hasta la zona norte, para así
obtener tres muestras como en los demás sistemas. Sin embargo, se debe aclarar que estas replicas
no se encontraban separadas físicamente puesto que no se contaban con tres sistemas de bosques
diferentes.
4.2.3. Pastura convencional
Las pasturas convencionales muestreadas en El Cerrito y Buga la grande están compuestas de
monocultivos de pastos los cuales en época de lluvia reciben adiciones de fertilizantes del tipo NPK
combinado con estiércol y se aplican herbicidas como Picloran para controlar malezas. Las pasturas
se encontraban en descanso del pastoreó de toro de Lidia (El Cerrito) y ganado lechero (Buga la
Grande). Las muestras fueron tomadas fuera del dosel de los arboles presentes en el terreno en baja
densidad recorriendo el terreno en zigzag y muestreando cada 10 metros.
4.2.4. Sistema silvopastoril intensivo
Los sistemas silvopastoriles intensivos tenían, según la clasificación de estudios previos (10, 11)
edades intermedias de establecimiento, entre 10 y 12 años. El estrato inferior de estos sistemas se
compone de las gramíneas: Cynodon plectostachyus y Paniccum máximum var. Tanzania y
Mombasa y Cynodon plectostachyous. El nivel intermedio es un sotobosque de arbustos de
Leucaena leucocephala (10.000 por hectárea), con una distancia de 1,3 m entre los surcos. Por
último, el estrato superior se compone principalmente de árboles nativos, que han quedado dentro
de los sistemas. Dentro de estos sistemas pastan 4-7 cabezas /ha de ganado durante tres o cuatro
días. Estos sistemas tenían ~25 días de descanso del pastoreo del ganado lechero. Las submuestras
fueron tomadas fuera del dosel de los árboles y entre la Leucaena sp sembrada recorriendo el
terreno en zigzag y muestreando cada 10 metros.
21
Tabla 3. Muestras de diferentes usos de suelo recolectadas en el departamento del Valle
del Cauca.
Municipio
Uso de suelo
Nombre
Coordenadas
Cerrito
Sistema Silvopastoril
Eles
N 3° 38' 51'', W 76° 19' 23''
Cerrito
Sistema Silvopastoril
Burras 3
N 3° 38' 44'', W 76° 19' 20''
Cerrito
Sistema Silvopastoril
Palmas 3,4
N 3° 38' 49'', W 76° 19' 9''
Cerrito
Pastura convencional
Trejito 4
N 3° 39' 49'', W 76° 19' 42''
Cerrito
Pastura convencional
Trejito 6
N 3° 39' 47'', W 76° 19' 39''
Trejito 2
N 3° 39' 48'', W 76° 19' 47''
Cerrito
Pastura convencional
Cerrito
Bosque
Bosque
N 3° 38' 40'', W 76° 19' 32''
Cerrito
Bosque
Bosque
N 3° 38' 40'', W 76° 19' 32''
Cerrito
Bosque
Bosque
N 3° 38' 40'', W 76° 19' 32''
Cerrito
Caña agroecológica
756-2
N 3° 38' 44'', W 76° 20' 6''
Cerrito
Caña agroecológica
756-3
N 3° 38' 49'', W 76° 20' 8''
Cerrito
Caña agroecológica
756-4
N 3° 38' 46'', W 76° 20' 11''
Cerrito
Caña convencional
Santa Rosa L3
N 3° 39' 23'', W 76° 20' 31''
Cerrito
Caña convencional
Santa Rosa Lote L4N
N 3° 39' 22'', W 76° 20' 29''
Cerrito
Caña convencional
Santa Rosa Lote L4S
N 3° 39' 17'', W 76° 20' 29''
Buga
Sistema Silvopastoril
B11
N 4° 14' 44'', W 76° 8' 44''
Buga
Sistema Silvopastoril
B12
N 4° 14' 54'', W 76° 8' 40''
Buga
Sistema Silvopastoril
B2
N 4° 14' 54'', W 76° 8' 30''
Buga
Pastura convencional
La Isabella 7
N 4° 13' 41'', W 76° 9' 17''
Buga
Pastura convencional
La Isabella 8
N 4° 13' 41'', W 76° 9' 17''
Buga
Pastura convencional
La Isabella 4
N 4° 13' 41'', W 76° 9' 17''
Buga
Caña agroecológica
Suerte 27 - Tablón 1
N 4° 14' 47'', W 76° 8' 58''
Buga
Caña agroecológica
Suerte 26 - Tablón 1
N 4° 14' 56'', W 76° 9' 1''
Buga
Caña agroecológica
Suerte 25- Tablón 1
N 4° 14' 56'', W 76° 9' 5''
Buga
Caña convencional
Tablón Oeste
N 4° 14' 37'', W 76° 8' 44''
Buga
Caña convencional
Tablón Este
N 4° 14' 40'', W 76° 8' 40''
4.2.5. Caña de azúcar
En cada una de las zonas se muestrearon cultivos de caña de azúcar con manejo convencional y
agroecológico. El manejo agronómico ecológico de la caña de azúcar se diferencia en gran medida
del convencional en la reutilización de los residuos del bagazo como abono para posteriores
22
cultivos. Además, los residuos cortados en el manejo agronómico convencional son quemados. Las
submuestras fueron tomadas en las calles del cultivo y en el caso de la caña con
manejo
agroecológico únicamente en las calles que no contenían los residuos de cortes anteriores. La toma
de muestras se realizó desde dos de las esquinas del cultivo avanzando diez pasos por las calles y
avanzando cinco surcos para cada una de las submuestras.
4.2.6. Manejo de las muestras
Las 30 submuestras de cada uno de los suelos fueron mezcladas para obtener una muestra
compuesta. A partir de la muestra compuesta se realizaron algunos análisis fisicoquímicos en el
laboratorio de suelos del Instituto Geográfico Agustín Codazzi (Tabla 4). Adicionalmente, 45 g de
cada una de las muestras compuestas fueron mezclados con 5 mL de agua estéril y homogenizados
hasta obtener una consistencia lodosa. Dichas muestras se almacenaron a -80 °C para
posteriormente realizar la extracción de ADN para los análisis de las comunidades microbianas.
Tabla 4. Métodos utilizados en el análisis de propiedades fisicoquímicas llevado a cabo en el
Instituto Geográfico Agustín Codazzi.
Análisis
Método
Textura
Bouyoucos
Acidez intercambiable
KCl
Conductividad eléctrica
Extracto de saturación
Carbón orgánico
Walkley-Black
Fosforo disponible
Bray II
Capacidad de intercambio cationico
Acetato de amonio 1N y neutro
Nitrógeno total
Kjeldahl
Nitratos y Amonio
KCl 2N
pH
Potenciomentrico
23
4.2.7. Extracción, cuantificación y amplificación de la región V4 del ADN
metagenómico de los diferentes usos de suelo
La extracción de ADN de cada uno de los usos de suelo se realizó utilizando el kit comercial
PowerSoil™ ADN Isolation Kit de MoBio según las recomendaciones del fabricante. El ADN
metagenomico fue cuantificando utilizando el método fluorometrico QUBIT (Invitrogen GmbH,
Karlsruhe, Germany) y su integridad se visualizó en gel de agarosa al 1.5% p/v. La amplificación y
secuenciación de los amplicones de la región V4 se realizó siguiendo la misma metodología
utilizada en la evaluación de los métodos de extracción y purificación (ver numeral 4.1.4).
4.2.8. Análisis bioinformatico y de diversidad.
Las secuencias obtenidas en la secuenciación de estas muestras no fueron ensambladas ya que la
calidad de las secuencias del sentido Reverse fue menor a lo esperado, y no permitió el ensamblaje.
Por lo anterior para los posteriores pasos solo se utilizaron las secuencias que correspondían al
sentido Forward. La limpieza y análisis bioinformatico de los secuencias se realizó siguiendo el
flujo de trabajo establecido en el análisis del efecto de los métodos (ver numeral 4.1.5) con cambios
en algunos parámetros. El número mínimo de secuencias que debía contener un OTU para ser
considerado OTU fue mayor (c = 50). Así mismo, las tablas de OTUS fueron re muestreadas a una
profundidad de 10000 secuencias por muestra. Los anteriores parámetros se establecieron basados
en el número de OTUS obtenidos en las muestras de dos cepas puras Stenotrophomonas sp (T30A)
y Rhizobium sp (T30B) y de la comunidad artificial compuesta por Azomonas sp, Pseudomonas sp,
Pseudoxanthomonas sp (x2), Stenotrophomonas sp (x3), Rhizobium sp (x2), Achromobacter sp y
Arthrobacter sp las cuales fueron incluidos como controles en la investigación. Además, se
realizaron Análisis de Correspondencia Canónica utilizando la herramienta CANOCO.
24
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1.
Efecto del método de extracción y purificación del ADN.
5.1.1. Estandarización del protocolo de extracción
La modificación del protocolo de Griffiths permitió una mayor recuperación de ADN pero no una
diferencia en la eliminación de contaminantes (Anexo B). Griffiths y colaboradores reportaron en
su estudio que el protocolo utilizado permitía la obtención de ADN y ARN con la calidad suficiente
para ser amplificados por PCR y utilizados en análisis de huellas moleculares (106). Sin embargo,
otros autores determinaron que concentraciones menores de 10% de polietilenglicol disminuían la
coextracción de ácidos húmicos con los ácidos nucleicos (101). En tal caso Arbeli y Fuentes
propusieron que 5% de Polietilenglico disminuye la concentración de ácidos húmicos pero no
aumenta la de ADN. Al contrario en el presente estudio si se observó mayor extracción de ADN,
con 5% de polietilenglicol, pero no diferencias en la extracción de los contaminantes. Aun así, los
valores de absorbancia a 340nm de los extractos finales, fueron bajos encontrándose entre 0,043 y
0,158. En esta longitud de onda no absorbe el ADN pero si algunos otros contaminantes como los
ácidos húmicos. Es importante destacar que, a diferencia de Arbeli y Fuentes, los extractos
obtenidos mediante el método de Griffiths antes de la precipitación eran totalmente transparentes, y
son prueba de la efectividad de este método en la eliminación de contaminantes.
5.1.2. Concentración y pureza del ADN
La concentración de ADN extraída con cada uno de los métodos fue significativamente diferente
en dos de los tres suelos evaluados (Tabla 5, p < 0.01 ANOVA α= 0,05). El método que mayor
ADN extrajo fue el Power Soil con un promedio de los tres suelos de 41,1 ± 8,07 ng/µL de ADN
comparado con 30,72 ± 5,64 ng/µL del protocolo de Griffiths. Como se observa en la (Tabla 5) el
kit de Power Soil extrajo, significativamente, mayor concentración de ADN en las muestras de
bosque y pasturas convencionales mientras que no se observó una diferencia significativa entre el
método de Griffiths y Power Soil en suelos de sistemas silvopastoriles. El método comercial de
extracción de ADN de suelo tiene mayor rendimiento que el método casero, pero no mejor calidad
25
del ADN. El kit de Power Soil permitió la extracción, en promedio, de 25% de ADN más que el
método de Griffiths, pero ambos presentaron valores similares en los parámetros de calidad del
ADN. Esta diferencia en el rendimiento puede deberse a que el método de disrupción física de
Power Soil, fue estandarizado para separar las partículas del suelo, disolver los ácidos húmicos y
proteger los ácidos nucleicos de la degradación. Igualmente, el protocolo de Griffiths fue
estandarizado para la rápida coextacción de ADN y ARN para análisis de comunidades microbianas
(106). Además, los dos protocolos utilizan diferentes materiales y tamaños de perlas para el
tratamiento físico, siendo de mayor tamaño las de Power Soil con respecto a las utilizadas en el
método de Griffiths.
En la literatura no se encuentra una clara ventaja de los métodos comerciales con respecto a los
caseros ya que en múltiples comparaciones algunas veces unos u otros son considerados mejores
(19, 107–109). El protocolo de MoBio cuenta con la patente Inhibitor Removal Technology® la
cual consiste en la mejora de la remoción de ácidos húmicos, proteínas y otros contaminantes que
pueden inhibir la reacción de la polimerasa (108). La efectividad de esta tecnología se ha
comprobado al comparar diferentes métodos comerciales, dando como resultado que el kit Power
Soil obtiene los mejores parámetros de calidad del ADN con diferentes tipos de suelo (110).
Además, es utilizado en proyectos a nivel mundial como el Earth Microbiome Project donde
colaboran múltiples grupos de investigación (111). Por el contrario, el método de Griffiths utiliza
reactivos comúnmente utilizados en muchos protocolos de extracción de ADN como Bromuro de
hexadeciltrimetilamonio (CTAB), Fenol-Cloroformo-Isoamilalcohol y Cloroformo-Isoamil-Alcohol
(19, 112, 113). Estos reactivos son utilizados para eliminar las proteínas, polisacáridos,
contaminantes orgánicos y ácidos húmicos. Los dos métodos de extracción permitieron la
amplificación de 250 pb de la región V4 del gen 16S ARNr de todos los extractos de cada uno de
los suelos sin necesidad de una purificación adicional, lo que confirma la efectividad en la
eliminación de algunos contaminantes inhibidores de la polimerasa.
Durante la purificación de las muestras con las columnas de Sefarosa-PVPP se perdió entre 34 y
56% del ADN original. La efectividad de la purificación no se comprobó ya que no se encontraron
diferencias significativas (p>0,05) en el parámetro A340nm, aunque este valor disminuyó en las
muestras después de ser pasadas por las columnas de Sefarosa-PVPP. Dentro de este rango de
absorción se encuentran los ácidos húmicos, los cuales son inhibidores de la ADN polimerasa.
Posterior a la purificación esta relación A260nm/280nm aumento (>2), valor que no es esperado en
la determinación de este parámetro, posiblemente la Sefarosa 2B libera sustancias que tienen alta
26
absorbancia a 260 nm. Además, con respecto a la relación 260nm/280nm se observó que los dos
métodos de extracción tienen valores cercanos a dos, sin diferencias significativas (p>0,05) lo que
indica que hay baja concentración de proteínas con respecto a la de ADN (Tabla 5).
Tanto las
muestras purificadas como sin purificar presentaron las características adecuadas para la posterior
amplificación de los fragmentos de la región V4.
Tabla 5 Concentración y pureza del ADN metagenomico extraído con dos métodos con o sin
purificación de las muestras. Las letras representan la formación de grupos con diferencias
significativas (p<0,05)
Muestra
Método
Purificado
ADN (ng/uL)
A260nm/280nm
A340nm
No
45,63 (± 1,21)a
2,02 (± 0,01)
0,075 (± 0,23 )
Si
21,57 (± 2,06)
b
1,77 (± 0,43)
0,044 (± 0,04 )
No
25,57 (± 3,01)b
2,03 (± 0,05)
0,091 (± 0,03 )
Si
16,70 (± 1,18)
c
2,17 (± 0,21)
0,098 (± 0,08 )
No
31,36 (± 3,96 )a
1,99 (± 0,05)
0,158 (± 0,11 )
Sistema
Si
19,20 (± 0,87)b
2,34 (± 0,39)
0,050 (± 0,02 )
silvopastoril
No
36,17 (± 5,41)a
1,93 (±0,15)
0,115 (± 0,03 )
Si
18,21 (± 1,72)
b
2,38 (±0,21)
0,043 (± 0,17 )
No
46,06 (± 6,01)a
1,98 (± 0,05)
0,074 (± 0,02)
Pastura
Si
28,50 (± 1,15)b
2,28 (± 0,23)
0,053 (± 0,02 )
convencional
No
30,43 (± 2,21)b
1,93 (±0,04)
0,076 (± 0,01 )
Si
19,07 (± 1,97)
c
2,19 (±0,16)
0,054 (± 0,01)
Power Soil
Bosque
Griffiths
Power Soil
Griffiths
Power Soil
Griffiths
Arbeli y fuentes evaluaron el efecto de la mezcla Sefarosa 4B con PVPP para eliminar altas
concentraciones de ácidos húmicos (A320 1.03- 139.7). Esta mezcla permitió la eliminación del 97
% de los ácidos húmicos y se perdió aproximadamente 60% del ADN (101). La purificación del
ADN ha sido evaluado con diferentes resinas donde se determinó que la Sefarosa es la mejor resina
para eliminar los contaminantes que pueden ser coextraidos y que la Sefarosa 2B disminuye el
27
tiempo de elución de los ácidos nucleicos y aumenta el de los ácidos húmicos con respecto a la
Sefarosa 4B Y 6B (36). En este estudio se perdió aproximadamente 10% del ADN y se eliminó
90% de los ácidos húmicos. Se esperaba que esta nueva mezcla de Sefarosa 2B y PVPP permitiera
un mayor rendimiento en la eliminación de los contaminantes, sin embargo esto no pudo ser
observado probablemente por la eficiencia de los métodos de extracción de ADN ya que la máxima
absrobancia a 340 nm fue de 0,150.
5.1.3. Calidad ensamblaje y filtración de las librerías de la región V4
Se prepararon 72 librerías de la región V4 del gen 16S ARNr que correspondían a muestras de
sistemas silvopastoriles, pasturas convencionales y bosque extraídas con dos métodos diferentes y
con y sin purificacion. La mitad de esta librería correspondía a las réplicas para la evaluación del
efecto de la PCR. Se determinó que la mezcla de las librerías contenía 29,9 ng/uL de ADN con un
pico de tamaño aproximado de 300-500 pb determinado mediante el BioAnalyzer mientras que en
el gel de agarosa se observó que el tamaño de las librerías era de alrededor 400 pb. Mediante ambos
métodos se confirmó que el tamaño de los amplicones (aproximado de 400 pb) es cercano al valor
teórico esperado (419 pb). Además, se observó que las muestras contenían, en menor concentración,
ADN de tamaño aproximado a 35 pb y a 10380pb. Estos picos corresponde probablemente a los
primers y ADN metagenomico, respectivamente (Figura 5).
Con la secuenciación se obtuvieron un total de 11.910.893 paire-end reads con una calidad de los
nucleótidos de las secuencias Forward entre 28 y 38 y de las secuencias Reverse entre 24-38 de un
máximo puntaje de calidad de 40 (Anexo C). Mediante el control de la secuenciación de la región
V4 del gen de 16S ARNr de la cepa pura Pseudomonas sp no se pudieron establecer los parámetros
de calidad que serían aplicados en el set de secuencias ya que esta muestra fue contaminada con
otros amplicones. Por lo anterior se decidieron aplicar paramentos astringentes en las demás
muestras. Del total de las secuencias 8.188.365 de estas secuencias fueron ensambladas con un
porcentaje de error de coincidencia igual o menor al 3% (mismatch). De las secuencias ensambladas
el 93 % tenían una longitud de 249 pb mientras que las secuencias restantes tenían una longitud
entre 262 y 240 pb. El 100% de estas secuencias presentaron valores de calidad por base mayores a
32 de un máximo de 40. Las secuencias que no fueron ensamblados se descartaron para los
posteriores pasos de filtración. Durante la filtración basada en la calidad de los nucleótidos (q > 30,
28
p = 0.9 r = 3 y n = 0) se eliminaron las siguientes cantidades de secuencias: 3900 que no contenían
barcodes, 791.795 que excedían los errores permitidos en los barcodes, 160.192 que eran muy
cortas (<220) después de ser truncadas debido a que más de 3 bases presentaban baja calidad y 73
que contenían bases no resueltas (N). Finalmente, se obtuvieron 7.232.405 secuencias de alta
calidad de las cuales el 99% tenían una longitud de 249 pb (valor teórico esperado) mientras que el
porcentaje restante una longitud entre 259 y 229 pb.
Figura 5. Tamaño de los amplicones de la región V4 del gen 16S ARNr evaluado mediante gel de
agarosa (B) y BioAnalyzer (A).
El ensamblaje de las secuencias y la filtración astringente permitieron retener un set de secuencias
de alta calidad. Se obtuvieron, aproximadamente, un total de 12 millones de paired-end reads de las
cuales el 69% fueron ensambladas y de estas 11,7 % fueron descartas por no pasar los filtros de
calidad. La cantidad de secuencias ensambladas fue mayor que lo reportado en otros estudios, pues
estos reportan entre 53,8 y 62,4 % de secuencias ensambladas (114). En total se descartaron 42,7 %
de las secuencias iniciales lo que es comparable con otros estudios realizados con la misma
tecnología de secuenciación, donde eliminan entre 40-70% de la información (38, 47, 115). Durante
la filtración de los datos se aplicaron parámetros astringentes comparados a los reportados en otras
publicaciones y los parámetros por defecto de la herramienta QIIME v 1.7 (48): ultimo valor de
calidad considerado baja calidad (q = 30), porcentaje mínimo de bases de alta calidad para retener la
secuencia (p = 0.9 correspondiente a 90%) y errores permitidos en los barcodes , con respecto a los
valores por defecto de QIIME q=3, p= 0.75 y 0.5 respectivamente (Anexo D). El parámetro C o
número de secuencias mínimas que debe contener un OTU para ser retenido no fue astringente ya
29
que se recomienda que este sea laxo si los parámetros previos no lo fueron. Este parámetro permitió
la eliminación de 15.649 OTU que correspondían a secuencias únicas (singletons) que pueden ser
producto de errores en la secuenciación como han sido reportado en otros estudios (46) (41), o parte
de la “biosfera rara” (29). Finalmente se mantuvo un set de 30.000 secuencias por muestra, mayor
numero que en otros estudios utilizando Pirosecuenciación, corresponde al número mínimo de
secuencias en una muestra. Este valor depende totalmente de los parámetros de la corrida de
secuenciación, como son el número de muestras y la influencia de la química de la tecnología. Este
número de secuencias permitió una buena cobertura ya que en las curvas de rarefacción se observa
el inicio de la formación del plató o saturación de la curva. En otros estudios se han utilizado desde
16.000 hasta 141.000 secuencias por muestra lo que indica que este valor es único por estudio (116,
117).
Con relación a los métodos de secuenciación se debe destacar que la plataforma MiSeq de Illumina
utilizada en el presente estudio tiene una mayor profundidad comparada con la Pirosecuenciacion,
~25 millones de secuencias por corrida comparado con ~1 millón de secuencias respectivamente
(14, 15). Igualmente, la plataforma de mayor profundidad existente hasta el momento pertenece a
Illumina, Hiseq2500, la cual produce ~2 billones de secuencias por corrida. Es importante destacar,
que la baja profundidad de las plataformas de Roche, comparadas con las de Illumina, se ve
balanceada por la longitud de sus secuencias. Pirosecuenciación produce lecturas de ~1000 pb
mientras que las plataformas de Miseq Illumina <300pb y Hiseq ~100 pb (última actualización,
2014). En nuestro parecer, la plataforma de Miseq es una herramientas adecuada para la
secuenciación de amplicones ya que permiten la obtención de una alta profundidad, el ensamblaje
del amplicon, una buena clasificación taxonómica y el aumentando de la confianza en los datos
5.1.4. Efecto de la extracción y purificación de ADN y la reproducibilidad de la
PCR en la discriminación de comunidades
De manera global en los ordenamientos de componentes principales (PCoA Figura 6) construidos
con las matrices de distancia de ausencia/presencia, donde se explica 37,1% de la varianza
(Unweighted Unfrac), se puede observar que las muestras de bosque, sistemas silvopastoriles y
pasturas convencionales se discriminan entre sí de forma clara (Figura 6). Las comunidades
microbianas de cada uno de los sistemas se agrupan independientemente del método de extracción y
purificación que haya sido aplicado. Lo que indica que no hay un claro efecto de estos métodos
30
sobre la detección de OTUS específicos. Por otro lado, este mismo análisis con matrices basadas en
la abundancia de los OTUS, que explica 77,3% de la varianza (Weighted Unifrac), no permite
diferenciar claramente entre los sistemas ya que las muestras se separan dependiendo del método de
extracción, pero no de la purificación. Dentro de estos análisis se incluyeron las muestras
amplificadas con el protocolo alternativo y se observó que no se ve una separación de la misma ni
alta variabilidad tanto con las matrices de ausencia/presencia y de abundancia, indicando que la
amplificación de PCR es reproducible.
A
B
Figura 6. Distancias de las comunidades microbianas calculadas mediante Pairwise-Unifrac tanto
en matrices de ausencia/presencia (A) y abundancia (B) visualizadas en una gráfica de componentes
principales (PCoA), la varianza explicada se denota entre corchetes al lado de cada eje.
Adicionalmente en la (Figura 6) se incluyen las réplicas de la PCR que fueron amplificadas una vez
sin ser mezcladas. Esta figura permite deducir que la reproducibilidad de la PCR no tiene efecto
sobre la estimación de la diversidad microbiana. Se observa que las muestras se agrupan
dependiendo del uso del suelo. A pesar, de que algunos reportes indican que los errores de la PCR
como formación de artefactos heteroduplex y quimeras (21, 44) son comunes, estos no influyen en
la diferenciación de comunidades provenientes de diferentes usos de suelo. Sin embargo, la
31
preparación de las librerías para secuenciación masiva de ADN aconseja la mezcla de tres
reacciones por muestra para evitar este tipo de errores.
Tabla 6. Índices de riqueza expresada en número de OTUS únicos y diversidad obtenida de
diferentes usos de suelo con dos métodos de extracción de ADN y efecto de la purificación de las
muestras. Se muestra el promedio ±1ds. No se encontraron diferencias significativas entre los
valores.
Muestras
Índice
Método
OTUS
Únicos
(97% similitud)
Sistema
Silvopastoril
Pastura
convencional
Power Soil
2.936 (± 45)
3.767 (± 113)
2.599 (± 27)
Power Soil - purificado
2.846 (± 129)
3.688 (± 155)
2.610 (± 22)
Griffiths
2.484 (± 45)
3.569 (± 90)
2.358 (± 53)
Griffiths - purificado
2.465 (± 64)
3.653 (± 108)
2.365 (± 13)
9,827 (± 0,041) 9,269 (± 0,177)
9,269 (± 0,066)
9,76 (± 0,031)
9,058 (± 0,216)
9,058 (± 0,064)
Griffiths
9,231 (± 0,042) 9,633 (± 0,060)
9,633 (± 0,042)
Griffiths - purificado
9,193 (± 0,069) 9,602 (± 0,127)
9,602 (± 0,037)
Power Soil
Shannon
Bosque
Power Soil - purificado
5.1.5. Efecto de la extracción y purificación sobre la estimación de la diversidad
αyβ
Las curvas de rarefacción muestran que con el número de secuencias utilizado (30.000) el número
de OTUS se aproxima a la saturación o plato, indicando que la cobertura del muestreo fue buena
(eficiencia del muestreo). Esto se observa más claramente en las curvas de bosque (A) y pasturas
convencionales (C) (Figura 7). En todas las muestras extraídas con el Kit de Power Soil se observó
un mayor número de OTUS (entre 0.96 y 18.2%) que en las muestras extraídas con el protocolo de
Griffiths tanto con y sin purificación (Tabla 6). Además, los resultados tuvieron una alta
reproducibilidad con coeficientes de variación entre el rango de 0.56 y 4.2 %. Sin embargo, la
prueba de t-test con el Test de Montecarlo, corregido por Bonferroni no sugirió en ninguna muestra
que las diferencias entre el número de OTUS (riqueza) y la diversidad (Shannon) son significativas;
bosque (p=0.528, p=0,081), sistema silvopastoril (p=1.0, p= 0.198) y pastura convencional
(p=0,282, p=0,288) respectivamente. Indicando que los métodos de purificación y extracción no
afectan la estimación de estos índices. Así mismo, entre las muestras de Power Soil v.s Power Soil32
purificado; bosque (p=1.0, p=0,197), sistema silvopastoril (p=1.0, p=1.0) y pastura convencional
(p=1.0, p=1.0) y Griffiths vs Griffiths-purificado; bosque (p=1.0, p=0,491), sistema silvopastoril
(p=1.0, p=1.0) y pastura convencional (p=1.0, p=1.0). Es importante resaltar que el método
estadístico utilizado para la comparación, aún se encuentra en discusión, y ha sido recientemente
actualizado (Comunicación personal foros QIIME).
A
B
Figura 7. Curvas de rarefacción de la riqueza de muestras de bosque (A), sistemas silvopastoriles
(B) y pasturas convencionales (C) a partir de ADN extraído con diferentes métodos y sin o con
purificación de las muestras. Las curvas fueron calculadas a una profundidad de 30.000 secuencias
por muestra. Powersoil (Rojo), PowerSoil-purificado (Azul), Griffiths (Verde) y Griffithspurificado (Amarillo
Terrat et al., que utilizaron la Pirosecuenciación para evaluar el efecto del método de extracción han
reportado diferencias significativas entre el número de OTUS recuperados con dos protocolos
33
caseros y uno comercial MoBio (109). Sin embargo, en este estudio no existía una clara tendencia
ya que la diferencia en la riqueza obtenida con los distintos métodos varía en los diferentes suelos.
Igualmente estos autores encontraron diferencias significativas de la riqueza a nivel de Filum,
Clase, Orden, Familia y Género sin poder establecer una tendencia clara en el efecto de cada
método.
En otros estudios se han comparado el efecto de los métodos de extracción de ADN de suelo y
compost sobre la estimación de la riqueza y diversidad mediante técnicas de huellas moleculares
como DGGE (118), TRFLPs (113), ARDRA y RISA (119). En estos estudios se midió la riqueza
como el número de bandas y la abundancia como la intensidad de la misma. Utilizando DGGE De
Lipthay y colaboradores reportaron que el kit comercial extrajo significativamente mayor número
de OTUS en todos los suelos evaluados (P<0,001), mientras que Inceoglu y colaboradores no
encontraron diferencias significativas (P>0,05). Así mismo, Martin-Laurent y colaboradores
encontraron diferencias en los perfiles de bandas obtenidos mediante las técnicas de RISA y
ARDRA a partir de suelos con diferentes usos, aunque estas diferencias fueron menos claras
utilizando la técnica de ARDRA. Utilizando técnicas de huellas moleculares no queda muy claro el
efecto que tiene el método de extracción sobre la estimación de la riqueza y la diversidad, pues en la
literatura se encuentran algunos resultados contradictorios. Aun así debe ser claro que los métodos
de huellas moleculares tienen muchas variaciones metodológicas lo que hace difícil la comparación
de sus resultados y que estos no son adecuados para evaluar la riqueza y diversidad
Tabla 7. Significancia de las distancias entre las comunidades microbianas recuperadas con dos
métodos de extracción de ADN y el efecto de la purificación sobre esta. Las comunidades fueron
comparadas mediante pairwise-Unifrac de diferentes usos de suelo, y el valor p se calculó con la
prueba no paramétrica de ANOSIM y el Test de Montecarlo (n=999, α=0,05)
Significancia (p-value)
Muestra
Unweighted
Extracción
Weigthed
Purificación Extracción Purificación
Bosque
0,006
0,542
0,001
0,260
Sistema silvopatoril
0,005
0,834
0,005
0,902
Pastura convencional
0,003
0,650
0,002
0,923
34
Con la finalidad de determinar el efecto de los métodos de extracción y la purificación sobre la
descripción de la comunidad microbiana (β diversidad), se realizaron análisis de cada una de las
muestras (bosque, sistemas silvopastoriles y pasturas convencionales) por separado. Los
ordenamientos de componentes principales (PCoA) construidos a partir de las matrices de
ausencia/presencia explican una varianza acumulada entre 19,3 y 38,5 % mientras que las matrices
de abundancia entre 87,2 y 90,3%. Se encontró que el protocolo de extracción tiene un efecto sobre
la β diversidad, pues se observaron diferencias significativas entre las comunidades microbianas a
partir del ADN extraído con los dos métodos en todas las muestras analizadas (p<0,05) (Tabla 7).
Por otro lado, no se detectaron, diferencias significativas entre las muestras, purificadas y no
purificadas (p = 0,260 - 0,923). Lo anterior, puede indicar que el método de extracción de ADN
tiene mayor efecto sobre la abundancia que sobre la ausencia o presencia de algunos OTUS. En los
componentes principales se observa que las mayores distancias entre las comunidades se debe al
método de extracción ya que las muestras extraídas con el método PowerSoil y Griffiths se separan
a lo largo del primer eje el cual explica la mayor varianza. Por otro lado, las muestras purificadas y
no purificadas de cada uno de los métodos se separan a lo largo del segundo eje el cual explica la
menor varianza. Esta tendencia se repite en todas las muestras tanto con las matrices de
ausencia/presencia y abundancia. Además, se pudo observar que las muestras purificadas tiene
mayor variabilidad ya que estos tienden a separarse más entre sí (Figura 9).
Lo anterior, esta correlacionado con los resultados obtenidos en la riqueza de las muestras, puesto
que no se observaron diferencias significativas en el número de OTUS únicos encontrados en los
suelos. Estas diferencias pueden deberse a que un método u otro no rompe o recupera de forma
homogénea las células y el ADN de los suelos. Otros estudios con el microbioma del intestino
humano o rumen de vacas y cabras han mostrado que las mayores diferencias entre comunidades
microbianas extraídas con diferentes métodos se dan por la abundancia de los OTUS más que por la
ausencia o presencia de los mismos (20) (120). Además, los autores reportan que existen diferencias
entre los métodos de extracción ya que se observan estructuras de comunidades microbianas
diferentes que provienen de la misma muestra del rumen de vaca u ovejas. Sin embargo, estas
diferencias permiten observar que las comunidades microbianas del rumen de las vacas y ovejas son
distintas.
A diferencia, Terrat y colaboradores (2012) encontraron resultados contradictorios evaluando el
efecto de los métodos de extracción utilizando Pirosecuenciacion (109). Determinaron que no
35
existía efecto de los métodos sobre la estimación de la estructura de la comunidad microbiana y que
las comunidades microbianas se discriminaban principalmente por el efecto del pH de cada muestra.
Aunque no se encontró efecto de la purificación sobre la estructura de las comunidades microbianas
otros autores han propuesto que la perdida de ADN por la purificación con Sefarosa 2B si puede
causar diferencias en el agrupamiento de las comunidades evaluado mediante perfiles de bandas con
DGGE (121).
La evaluación del método de purificación era uno de los principales objetivos a discutir en el
presente estudio. Aunque, se encontró una tendencia, no significativa, donde las muestras
purificadas tenían menores valores de A340 nmn, no fue posible correlacionar esto con cambios en
la estimación de la estructura y composición de las comunidades. Se deben tener en cuenta algunos
factores que conllevaron a este resultado. Primero, los métodos de extracción de ADN utilizados,
co-extraen contaminantes en muy baja concentración, lo que inicialmente se pudo observar con la
transparencia de las muestras. Debido a la inexistencia de información inicialmente se planteó que
los posibles efectos que causara la purificación de ADN serian el efecto de 1) la disminución de la
concentración y 2) la generación de errores de la polimerasa mediada por la presencia de
contaminantes. Ninguna de las dos teorías se pudo comprobar ya que no se encontraron diferencias
significativas en la concentración de contaminantes y para la preparación de las librerías se
estandariza la cantidad de ADN. Lo que elimina el factor de la perdida causada por la purificación.
Sin embargo, un autor ha propuesto indirectamente que la perdida de ADN por la purificación con
Sefarosa 2B si puede causar diferencias en el agrupamiento de las comunidades evaluado mediante
perfiles de bandas con DGGE (121).
5.1.6. Efecto del método de extracción sobre la abundancia de los Fila
La comparación entre las abundancias relativas de los diferentes Fila sugiere que existe un efecto
del método de extracción sobre la abundancia de estos. Por otro lado, no se observa un claro efecto
de la purificación de las muestras sobre la abundancia relativa (Figura 8). Como se observa en la
(Figura 9) la correlación entre las abundancias obtenidas con el método de Power Soil y Griffiths
es de 0,897 ± 0,009 mientras que las correlación entre las muestras purificadas y no purificadas de
ambos métodos es mayor (0,997 ± 0,001 y 0,967 ± 0,010 para Griffiths, y Power Soil,
respectivamente). La menor correlación entre los métodos de extracción se debe a que la
abundancia de algunos Fila en el método de Griffiths es aproximadamente 10% menor con relación
36
a la abundancia obtenida por el método de PowerSoil. Se pudo observar que algunas diferencias en
las abundancias de los Fila, causada por los métodos, tienen la misma tendencia entre todas las
muestras (de bosque, pasturas convencionales y sistemas silvopastoriles). La abundancia de los Fila
Verrucomicrobia, Armatimonadetes, Planctomycetes y Crenarchaeota fue mayor con el método de
Griffiths, mientras que la abundancia de WS3, Bacteroidetes y Firmicutes se favorece por el método
de Power Soil (Figura 11). En el caso de Verrucomicrobia, la diferencia fue significativa (p<0,05)
en los tres muestras, mientras que los demás Fila las diferencias significativas se repetían solo en
dos muestras pero la tercera muestra presento la misma tendencia que las otras dos.
Figura 8. Abundancia relativa de los 13 Fila más abundantes encontrados en tres diferentes usos de
suelo con dos diferentes métodos de extracción y el efecto de la purificación de las muestras.
37
A
B
C
Figura 9. Análisis de componentes principales (PCoA) de muestras de bosque (A), sistema
silvopastoril (B) y pasturas convencionales (C), con dos métodos de extracción de ADN y efecto de
la purificación de las muestras basados en las distancias calculadas mediante UniFrac. Los
ordenamientos de la izquierda fueron elaborados con matrices de distancia ausencia/presencia
(Unweighted) y las de la derecha con matrices de abundancia (Weighted).
38
A
B
C
Figura 10. Correlación de la abundancia relativa de los Fila, expresada en el porcentaje del número
de secuencias, obtenida con diferentes métodos de extracción de ADN y purificación en muestras
de bosque (A), sistemas silvopatoriles (B) y pasturas convencionales (C).
39
Cada uno de los métodos favoreció un Fila considerado difícil de detectar, Crenarchaeota (Metodo
Griffiths) y Firmicutes (Kit Power Soil), debido a sus fisiología, hábitat y capacidad de formar
esporas específicamente algunos Firmicutes. Así mismo cada método favoreció Fila considerados
poco abundantes, recientemente descritos o aun considerados como candidatos, Griffiths
(Verrucomicrobia y Armatimonadetes) y Power Soil (candidatos WS3) (43, 122). Esto es muy
importante debido al interés de conocer estos grupos de organismos de los cuales existe poca
información o son considerados poco abundantes. Igualmente cada método favoreció la abundancia
de Fila considerados fáciles de sobre estimar debido a la composición de su pared celular, lo que los
hace más vulnerables a la disrupción física. Algunos investigadores han reportado que métodos
comerciales de MoBio desfavorecen la abundancia de grupos abundantes como Proteobacteria y
Acidobacteria, lo que no se observó en este estudio. También se ha comprobado que algunos
métodos caseros tienden a subestimar grupos importantes del suelo como Actinobacteria. Por todo
esto se ha propuesto que el paso de rompimiento de la pared, tanto de forma enzimática o física
causa una subestimación de Gram positivos y una sobrevaloración de los Gram negativos en las
muestras, presuntamente por la facilidad de lisar unos con respecto a los otros (123). Lo anterior
indica la importancia de la selección del método de extracción de ADN considerando los objetivos
de cada estudio.
40
A
B
C
Figura 11. Comparación por pares mediante la prueba de t-test corregida por Benjamin de las
abundancias relativas obtenidas en los diferentes usos de suelo, Bosque (A), Sistema silvopastoril
intensivo (B) y Pastura convencional (C) de dos métodos de extracción de ADN. Power soil (verde)
y Griffiths (Azul).
41
5.2. Efecto del uso del suelo sobre las comunidades microbianas de suelos del valle del
cauca.
5.2.1. Diferencias en las propiedades físico-químicas en los diferentes usos de
suelo del Hatico y la Lucerna
Los suelos evaluados en el Valle del Cauca se diferencian en mayor medida (42,06%, eje 1) por tres
características fisicoquímicas; el porcentaje de arcilla, las bases totales y el contenido de arena. Así
mismo, la variación entre los usos de suelo esta explicada en un menor porcentaje (20,49 %, eje 2);
por el pH, el contenido de carbón orgánico corregido por la concentración de arcilla y el nitrógeno
total (Figura 12) (Tabla 9). Sin embargo, la tendencia más fuerte de separación está dada por la
zona geográfica de origen de las muestras (representada por la línea azul). Mientras que la segunda
tendencia de separación, menor efecto, está dada por el uso del suelo (representada por la línea
roja). Los suelos provenientes de la finca El Hatico se agrupan a la izquierda del primer eje mientras
que los suelos de La Lucerna se agrupan hacia la derecha de este mismo eje. Además, los sistemas
de caña de azúcar, tanto de manejo convencional como ecológico, de cada zona se encuentran más
cercanas entre sí que los sistemas de pastoreo. No obstante, los sistemas silvopastoriles los cuales
involucran pastoreo, son los sistemas más cercanos al bosque seco tropical de la zona del Hatico. Es
importante destacar, que las propiedades fisicoquímicas de los sistemas silvopastoriles de la
Lucerna son altamente variables, por lo que no se observa una clara agrupación entre estas
muestras.
Estudios en la misma zona en la finca del Hatico (realizados en sistemas silvopastoriles, caña de
azúcar y bosque) determinaron que la textura, compactación, concentración de amonio, nitratos,
carbono orgánico, la humedad y el pH tienen el mayor efecto en la separación de los usos de suelo
(10, 11, 100). Únicamente el pH y el carbón orgánico son variables comunes que explican la
diferencia en los usos de suelo y han sido encontrada en otros estudios (95, 124). Aunque se debe
tener en cuenta que en el presente estudio se incluyeron más sistemas y más muestras, es importante
destacar que estas dos variables cobran importancia por los cambios que puede sufrir debido al
efecto del uso del suelo. Estas diferencias podría asociarse principalmente a que la orina y
excremento de las vacas pueden contribuir a la disminución del pH del suelo (125), efecto que se
encontró en los sistemas silvopastoriles y pasturas convencionales del Hatico. Sin embargo en la
Lucerna, donde los suelos son más ácidos, este efecto no es claro ya que el pH de las cañas de
42
azúcar es similar al de los usos de suelo con pastoreo. Por otro lado, el contenido de carbón
orgánico puede verse afectado por la labranza y uso de maquinaria pesada que rompe la estructura
del suelo lo que conlleva a la perdida de nutrientes (126).
Utilizando los análisis de varianza se determinó que el contenido de arcilla, limo, arena, carbón
orgánico normalizado por arcilla, amonio, fosforo y pH son significativamente diferentes entre los
usos de suelo (Tabla 8). Las diferencias encontradas en la concentración de amonio y fosforo
pueden deberse al tipo de fertilización que se realiza en cada uso, NPK para los sistemas de
pastoreo y Urea para los sistemas de caña (65, 74). La urea, proveniente de fertilizantes y residuos
animales, al ser utilizada por microorganismos de la superficie del suelo, es rápidamente hidrolizada
produciendo amonio (125). En el bosque se encontraron las mayores diferencias, ausencia de
amonio, menores valores de fosforo y mayores valores de pH, el cual no ha sido intervenido por el
hombre. El uso de suelo y su respectivo manejo tiene una influencia sobre las propiedades
fisicoquímicas ya que estas se diferencian de las propiedades de un suelo no intervenido como es el
bosque encontrado en la finca del Hatico.
Vallejo y colaboradores (10, 11) propusieron que la arcilla (propiedad inherente del suelo) puede
enmascarar la influencia del uso del suelo sobre el contenido de carbón orgánico, por lo tanto es
necesario normalizar dicha información, dividiendo el contenido de carbono por el de la arcilla. De
las diferencias en las propiedades fisicoquímicas es importante destacar, que el contenido de carbón
orgánico normalizado por arcilla presento una clara tendencia de acuerdo al uso de suelo
independiente de la zona geográfica. Este parámetro fue menor en sistemas productivos de caña,
indicando que esta actividad agropecuaria genera perdida de carbono orgánico de suelo. Sin
embargo, se observa que el manejo ecológico aumenta el contenido de carbón orgánico (5,07±0,30
Hatico y 4,07 ±0,70 Lucerna) comparado con el manejo convencional (3,64±0,32 % Hatico y 3,23
±0,28 % Lucerna) (Tabla 8). Esto se debe a que una de las prácticas en este tipo de suelo es reciclar
los residuos del bagazo y utilizarlo como abono. A diferencia, en los cultivos de manejo
convencional este residuo fue quemado durante años y hoy en día es retirado. Un estudio demostró
que la práctica de reciclar los residuos aumenta un 25% el rendimiento del cultivo, pero no mejora
la reserva de carbono en el suelo (127). Además, el reciclaje de los residuos tiene un gran potencial
en la mitigación de la emisión de CO2 tanto por la quema como por su uso en la producción de
bioetanol.
43
Figura 12. Análisis de componentes principales (PCA) relacionando las propiedades fisicoquímicas
del suelo y los usos de suelo en el Hatico. La línea azul divide las cañas de azúcar vs pastoreo +
bosque, y la línea roja divide los usos según su zona geográfica. Abreviaciones: A: porcentaje de
arena, Ar: porcentaje de arcilla, L: porcentaje de limo, CO: carbón orgánico, N: nitrógeno total, Cl:
cloro, Ca: calcio, Mg: magnesio, K: potasio, Na: sodio, BT: bases totales, NH4: amonio, NO3:
nitrato y P: fosforo.
44
Hatico (El cerrito)
Sistema
Silvopastoirl
Franco
arcilloso
Bosque
Textura
Franco
arcilloso
Arena (%)
24,30 ±3,14
Limo (%)
49,10 ±2,05
Arcilla (%)
26,60 ±1,21
pH
7,50 ±0,10
Carbóno orgánico
(%)
1,93 ±0,12
Carbóno orgánico
(C.O%/Ar %)
ab
abc
c
a
41,13
bcd
±5,32
b
29,50 ±5,63
c
9,37 ±3,42
c
39,83 ±3,67
a
abc
b
6,77 ±0,06
1,80 ±0,26
a
Arcilloso Limoso
50,80 ±1,14
6,70
bcd
±0,10
a
6,77 ±0,92
29,37 ±5,76
Pastura
b
a
6,69 ±1,17
a
2,53 ±0,15
6,39 ±0,65
ab
Lucerna (Buga la grande)
Caña
convencional
Franco arcillolimoso
abc
9,87 ±4,41
48,87 ±3,16
41,27 ±2,45
abc
abc
a
7,67 ±0,06
c
1,50 ±0,10
c
3,64 ±0,32
Caña
agroecológica
Franco arcillolimoso
15,80 ±1,21
abc
49,97 ±1,15
ab
34,23 ±1,18
7,47 ±0,12
a
1,73 ±0,06
5,07 ±0,30
bc
b
abc
Sistema
Silvopastoril
Franco
arcilloso
25,80 ±9,37
ab
39,47 ±4,97
cd
34,73 ±11,92
bc
d
6,40 ±0,10
a
2,27 ±0,59
6,72 ±1,32
a
Pastura
Caña
convencional
Franco arcillolimoso
Arcilloso
19,40 ±5,02
43,93 ±1,27
abc
abcd
36,67 ±4,43
abc
bcd
6,67 ±0,12
2,67 ±0,59
7,22 ±0,91
a
a
14,15 ±5,02
37,70 ±2,97
48,15 ±2,05
c
d
ab
cd
6,45 ±0,07
1,55 ±0,05
c
c
3,23 ±0,28
Caña
agroecológica
Arcilloso
limoso
11,03 ±3,99
bc
36,60 ±5,17
d
52,37 ±7,19
a
bc
6,73 ±0,21
ab
2,10 ±0,10
bc
4,07 ±0,70
Nitrógeno Total (%) 0,18 ±0,01
0,17 ±0,03
0,24 ±0,02
0,14 ±0,01
0,18 ±0,01
0,22 ±0,06
0,26 ±0,06
0,15 ±0,00
0,20 ±0,01
Cloro (cmol(+)/kg)
26,97 ±4,66
20,57 ±1,97
30,00 ±2,25
29,70 ±2,13
24,70 ±0,30
28,73 ±8,49
31,03 ±1,29
38,50 ±1,90
37,13 ±0,31
Calcio (cmol(+)/kg)
15,03 ±2,87
17,80 ±0,10
17,87 ±2,22
22,17 ±1,10
19,47 ±0,12
16,93 ±3,88
14,47 ±0,91
17,80 ±1,10
20,87 ±1,42
7,13 ±2,66
5,27 ±0,29
10,07 ±0,15
8,17 ±0,55
6,50 ±0,26
10,90 ±4,66
13,90 ±0,56
13,20 ±0,90
15,57 ±2,03
1,42 ±0,53
0,57 ±0,06
1,20 ±0,00
0,79 ±0,18
0,57 ±0,03
1,20 ±0,10
0,48 ±0,02
0,55 ±0,06
0,81 ±0,14
0,14 ±0,04
0,11 ±0,02
0,17 ±0,04
0,23 ±0,02
0,17 ±0,02
0,20 ±0,11
0,44 ±0,02
0,28 ±0,01
0,48 ±0,04
23,73 ±6,09
23,73 ±0,42
29,30 ±2,39
31,33 ±1,59
26,70 ±0,17
29,23 ±8,74
29,27 ±1,37
31,85 ±2,05
37,70 ±3,30
Magnesio
(cmol(+)/kg)
Potasio
(cmol(+)/kg)
Sodio
(cmol(+)/kg)
Bases totales
(cmol(+)/kg)
Amonio
(mg/Kg)
Nitrato
(mg/Kg)
Fosforo
(mg/Kg)
0,00 ±0,00
c
ab
2,28 ±1,58
28,00 ±5,46
27,67 ±6,93
21,90 ±3,90
bc
84,07 ±4,09
a
5,87 ±0,76
abc
19,80 ±5,37
67,27 ±18,72
ab
abc
5,50 ±2,43
9,03 ±5,14
41,17 ±18,15
abc
7,47 ±1,55
ab
24,00 ±6,17
78,63 ±7,36
a
abc
5,70 ±4,80
20,13 ±4,57
51,13 ±27,04
ab
abc
4,93 ±1,90
30,20 ±3,96
18,77 ±4,97
c
ab
7,10 ±1,97
5,05 ±0,21
49,97 ±0,14
a
9,00 ±1,91
37,60 ±42,57
d
2,10 ±21,30
ab
Tabla 8. Parámetros fisicoquímicos de los usos de suelo muestreados en dos zonas del Valle del Cauca. Las letras indican diferencias significativas entre los usos de
suelo evaluados (p<0.05). Se presenta el promedio ± 1ds.
45
Tabla 9. Valores propios de la influencia de las variables fisicoquímicas evaluadas sobre la
separación de los usos de suelo en las fincas del Hatico y la Lucerna. Se presenta la el porcentaje de
la varianza que explica el análisis y se resaltan los valores propios con mayor efecto en la varianza.
Factores
Arena
Valores propios
Hatico
Eje 1
Eje 2
(44,50%) (27,56%)
0.8927
-0.2073
Lucerna
Eje 1
Eje 2
(43,76)
(23,65)
-0.8883
0.0234
Limo
-0.3409
0.2638
-0.5818
-0.5794
Arcilla
-0.9814
0.1027
0.9454
0.2313
pH
Carbóno
orgánico/Arcilla
Nitrógeno total
0.0087
0.9662
0.3508
-0.4948
-0.2347
-0.8287
0.0880
-0.6114
-0.2347
-0.8287
0.0993
-0.5660
Cloro
-0.8780
-0.2723
0.8949
0.2248
Calcio
-0.6622
0.6801
0.8366
0.4189
Magnesio
-0.8604
-0.3826
0.9418
-0.2083
Potasio
-0.2826
-0.7389
-0.2241
0.5300
Sodio
-0.8441
0.3563
0.7116
-0.6395
Bases Totales
-0.9215
0.2129
0.9523
0.1467
Amonio
-0.7771
0.0085
0.7769
0.1877
Nitrato
0.5756
-0.2799
0.0101
-0.4037
Fosforo
-0.1463
-0.6455
-0.2819
0.0649
La propuesta de Vallejo y colaboradores (10, 11) de normalizar el contendió de carbón orgánico les
permitió encontrar diferencias entre los sistemas que ellos evaluaron, reportando mayor contenido
de carbón orgánico en el bosque y sistemas silvopastoriles. Sin embargo, en el presente estudio
dicha corrección no mostro el mismo patrón, ya que las pasturas convencionales presentaron el
mismo contenido de carbón orgánico que el bosque y los sistemas silvopastoriles. Ademas, los
mayores contenidos de arcilla se encontraron en las cañas de azúcar, lo que no está relacionado con
sus bajos valores en los contenidos de Carbón Orgánico siendo mayor en la caña de manejo
ecológico. Aunque se considera que la Textura es una propiedad inherente del suelo que cambia
solo en amplios periodos de tiempo (128), tanto en este estudio como en los de Vallejo y
colaboradores se encontraron diferentes clases texturales entre los usos de suelo. Esto se puede
46
deber a que el arado con maquinaria pesada puede mezclar suelo más profundo con mayor
contenido de arcilla. Lo anterior es importante ya que la arcilla ha sido asociada a la humedad, el
contenido de nutrientes, el contenido de carbono orgánico y la compactación del suelo (128, 129).
5.2.2. Filtración y asignación de las de las secuencias
Se extrajo el ADN de 27 muestras de suelo con diferentes usos, a partir de este se amplificó la
región V4 del gen 16S ARNr y se secuencio por la tecnología de MiSeq de Illumina. Se obtuvieron
un total de 11.910.693 paired-end reads (Secuencias) de 251 pb. Los paired-end reads no fueron
ensamblados por la baja calidad y alta variabilidad en los valores de calidad. Esta alta variabilidad
de los datos obligo a descartar estas secuencias (Anexo F). Por lo tanto, la filtración por los
parámetros de calidad se realizó a las secuencias del sentido forward. Durante la filtración se
eliminaron las siguientes secuencias: 168.294 secuencias que no fueron asignadas a ninguna
muestra, 2.708.698 secuencias muy cortas después de ser truncadas por baja calidad (< 220 pb),
1.131 secuencias que contenían bases no resueltas (N) y 4.396.461 secuencias que excedían el
número de errores permitidos en los barcodes. Finalmente se conservó un set de 4.636.109
secuencias de las cuales el 88,9 % tenían una longitud de 247 pb y las restantes entre 227 y 237 pb.
Las secuencias descartadas suman el 64 % de la información general, valor superior a lo perdido en
la primera secuenciación en el presente estudio. Sin embargo, se encuentra dentro del rango normal
de perdida con este tipo de tecnologías como ya antes se ha mencionado (40-70%) (38, 47, 115).
Por lo tanto para los posteriores análisis se utilizaron únicamente secuencias en sentido 5’ a 3’. El análisis de comunidades microbianas ha sido ampliamente realizado utilizando únicamente
secuencias en un sentido, sobre todo con la tecnología de Roche 454-Pirosecuenciación (130–132).
Además, la beta diversidad obtenida con secuencias ensambladas y no ensambladas mediante las
medidas de distancia de Bray-curtis (basada en la abundancia de los OTUS) y Unweighted-Unifrac
(basada en la estructura filogenética) están correlacionadas en R2=0,993 y R2=0,982
respectivamente (133). Indicando, que se obtienen los mismos resultados utilizando secuencias
ensambladas o en un solo sentido. Sin embargo, la medida de distancia Weighted-Unifrac entre las
dos aproximaciones, basada en la estructura filogenética con el peso de la abundancia de los OTUS,
presenta una correlación más baja de R2=0,811 (133).
47
Utilizando las secuencias de los controles, dos cepas puras y una comunidad artificial de 12 cepas,
se determinó el número mínimo se secuencias que debía contener un OTU evaluando 10, 30, 50 y
100 (Anexo) secuencias mínimas. Se seleccionaron 50 secuencias mínimo, sin embargo no se
obtuvieron los OTUS esperados por cada control. Con el valor de 50 secuencias mínimos por OTU
los resultados de los controles fueron: Cepa T30A 24 OTUS, cepa T30B 35 OTUS y comunidad
artificial (12 cepas) 65 OTUS (Anexo H). Con la inclusión de controles de secuenciación se
pretendía determinar los parámetros de calidad que permitieran la eliminación de los errores
producidos durante la amplificación y secuenciación del ADN (29, 46). Sin embargo, como se ha
reportado en otros estudios, utilizando cepas puras y comunidades microbianas artificiales, se debe
contemplar que un OTU debe contener mínimo el 1% de las secuencias para ser considerado OTU.
En el presente estudio el 1% de las secuencias correspondían a 43.964 secuencias. Aplicar estos
parámetros altamente astringentes para obtener los OTUS teóricos de los controles, resulta en una
disminución dramática del número de filotipos en las muestras ambientales. Por lo anterior se
seleccionó 50 como valor mínimo, con el cual se observó mayor caída de los filotipos en los
controles pero no en las muestras.
5.2.3. Variación de la alfa diversidad entre los usos de suelo
El agrupamiento de las secuencias en OTUS en un porcentaje de similitud del 97% permitió
observar que los más abundantes se encuentran en menor proporción con respecto a los menos
abundantes. Esto se debe a que menos de 10 OTUS estan representados entre 50-300 secuencias por
muestra mientras que entre 10-1000 OTUS están representados por menos de 50-0 secuencias por
muestra (Figura 13). No fue posible asignar taxonómicamente todos los OTUS a este nivel de
similitud (97%) sin embargo esta tendencia se repite a otros niveles taxonómicos. Los Fila con más
de 1% de abundancia fueron Proteobacteria (31,6%), Acidobacteria (21,6%), Actinobacteria
(13,9%), Verrucomicrobia (6,8%), Firmicutes (4,7%),
Bacteroidetes (4,3%), Planctomycetes
(4,1%), Chloroflexi (3,7%), Nitrospirae (3,4%), WS3 (1,7%), Crenarchaeota (1,6%) y
Gemmatimonadetes (1,5%). Los demás Fila identificados, en total 21, presentaron menos del 1% de
abundancia. El máximo nivel taxonómico donde fue posible asignar la mayoría de los OTUS fue en
Orden. El más abundante de estos fue iii1-15 perteneciente a Acidobacteria. La abundancia a nivel
de Orden varía entre los usos de suelo (Tabla 10). Generalmente estos Fila son los más abundantes
tanto en suelo como en las bases de datos de genes de 16S ARNr (134).
48
.
Figura 13. Rangos de abundancia-especie donde se presenta la acumulación de secuencias
por los OTUS encontrados con una similitud de 97% con la base de datos de greengenes.
Tabla 10. Ranking de las cinco secuencias más abundantes clasificadas a nivel de Orden
encontrados en cinco distintos usos de suelo en dos zonas geográficas, finca el Hatico (H) y la
Lucerna (L) del Valle del Cauca. Los usos de suelo evaluados fueron; Bosque (B), Caña de azúcar
ecológica (CO), Caña de azúcar convencional (CC), Sistemas Silvopastoril (S) y Pastura
convencional (P).
Orden (Filum)
iii1-15
(Acidobacteria)
Rhizobiales
(Proteobacteria)
Chthoniobacterales*
(Verrucomicrobia)
Actinomycetales
(Actinobacteria)
Bacillales
(Firmicutes)
* Orden candidato
Acumulado
HB
Abundancia relativa (%)
HCO LCO HCC LCC
12,7
18,6
13,4
12,4
12,8
9,8
13,2
8,7
13,3
11,9
6,5
6,8
6,5
5,3
6,1
7,0
5,5
6,8
5,8
8,2
4,5
2,0
2,9
4,6
3,6
6,1
5,9
5,0
5,4
7,3
4,2
3,1
4,6
4,0
4,7
5,1
4,4
3,3
4,2
3,9
4,1
1,0
3,5
2,3
3,9
4,0
4,9
5,1
6,2
5,9
HP
LP
HS
LS
49
Se observaron diferencias significativas entre los índices de Shannon y distancia filogenética pero
no en la riqueza en los diferentes usos de suelo. Las cañas de azúcar, tanto de manejo ecológico
como convencional, presentaron los mayores valores mientras que los sistemas silvopastoriles
presentaron los menores (Tabla 11). Estas tendencias también se presentaron en cada una de las
fincas cuando fueron analizadas individualmente, lo que indica que el efecto de los usos del suelo es
mayor que el de la distancia geográfica (Anexo I). Las diferencias entre los índices de Shannon y
distancia filogenética se observaron entre las cañas de azúcar de manejo ecológico y el bosque
(p=0,08 y p=0,07), los sistemas silvopastoriles (p=0,05 y p=0,03) y las pasturas convencionales
(p=0,03 y p=0,02) respectivamente. Los demás sistemas no presentaron diferencias significativas
entre sí. Por otro lado, no se observaron diferencias significativas de los índices entre las fincas y el
tipo de manejo. Lucerna vs Hatico (Shannon p=0,248, riqueza p=0,129, DP p=0,319) y manejo
ecológico vs manejo convencional (Shannon p=0,697, riqueza p=0,557, DP p=0,388). Sin embargo
se observa una leve tendencia donde el manejo ecológico tiene mayores valores en los índices con
respecto al manejo convencional. Lo anterior se encontró en las cañas de manejo ecológico y en los
sistemas silvopastoriles.
Tabla 11. Comparación de índices de riqueza y diversidad de cinco usos de suelo. Se muestra el
promedio 1ds. Las letras indican diferencias significativas p<0.05.
Índices de diversidad
Muestras
Riqueza
(OTUS)
Bosque
2012 ( 23)
Pastura
convencional
1998 ( 62)
Sistema
silvopastoril
1984 ( 146)
Caña de
azúcar ecológica
2223 ( 90)
Caña de
azúcar convencional
2112 ( 67)
Distancia
Filogenética (DP)
Shannon
a
9,66 ( 0,03)
a
a
a
9,70 ( 0,08)
a
b
b
b
9,61 ( 0,15 )
9,97 ( 0,09 )
9,92 ( 0,11 )
a
ab
116,227 ( 0,365)
116,143 ( 3,746)
115,557 ( 5,924)
127,306 ( 4,208)
120,348 ( 3,154)
b
b
b
a
ab
50
En otros estudios, realizados con NGS, no se han encontrado diferencias entre la diversidad ni la
riqueza de sistemas de caña de azúcar con diferentes manejos y los bosques evaluados (135). La
diversidad en estos sistemas es considerablemente menor (Shannon 5,78-6,17) comparada con los
sistemas encontrados en el presente estudio (Shannon 9,61-9,97). No obstante, mediante la técnica
qPCR se ha detecto menor número de copias del gen 16S ARNr en las muestras de cultivos de caña
comparadas con el bosque (135). Igualmente Suleiman y colaboradores reportaron que la diversidad
microbiana de los sistemas de pastoreo no se diferencia de los bosques, sin embargo este último es
más diverso, efecto encontrado en este estudio (136). Aunque se ha reportado que los suelos que
son arados son menos diversos que los que no reciben arado (137, 138), las cañas de azúcar del
Valle del Cauca tanto de manejo convencional como ecológico tienen mayor diversidad microbiana
que los demás sistemas. Además, se ha encontrado que la introducción de nitrógeno (fertilización)
tiene un efecto negativo en la riqueza y la diversidad de los suelos (139). No obstante, se ha
discutido que la α-diversidad presentan mayores variaciones en el tiempo que en el espacio, por lo
tanto las comparaciones basadas en un solo tiempo de muestreo deben ser cuidadosas ya que los
patrones suelen cambiar en el tiempo (140).
5.2.4. Variación de las comunidades microbianas entre los usos de suelo
Mediante los análisis de componente principales se estimó la distancia entre las comunidades
microbianas de los diferentes usos de suelo. Se encontraron diferencias significativas (p=0,01) entre
las comunidades microbianas de los distintos usos de suelo evaluados, las comunidades microbianas
de los bosques son las que se separan más claramente de los demás sistemas (Figura 14). Mientras
que, tanto las cañas de azúcar como los sistemas que involucran pastoreo se encuentran más cerca
entre sí. Esta tendencia es mucho más clara cuando se tiene en cuenta la abundancia de los OTUs,
donde se forman 3 grupos separados: de bosque, de caña de azúcar, y de ganadería, independiente
del tipo de manejo (convencional o agroecológico) y de la zona geográfica (Cerrito o Buga la
Grande). No se observó diferencia estadística entre los sistemas de manejo convencional y los de
manejo ecológico (p>0.05). En las cañas de azúcar se observa, mediante los matrices de
ausencia/presencia, un efecto de la zona geográfica sobre la comunidad microbiana mayor que del
tipo de sistemas, ya que se observa una separación entre las cañas de azúcar de la finca del Hatico
con respecto a las de la finca de la Lucerna (Figura 14A). A pesar que esta tendencia solo es clara
en las cañas de azúcar, se encontró que existen diferencias significativas entre las comunidades
microbianas de una finca y otra (p=0,01).
51
B
A
.
Figura 14. Distancias de las comunidades microbianas de 5 diferentes usos de suelo calculadas
mediante Pairwise-Unifrac basado tanto en matrices de ausencia/presencia (A) y abundancia (B)
visualizadas en una gráfica de componentes principales (PCoA), la varianza explicada se denota
entre corchetes al lado de cada eje.
Las comunidades microbianas de los usos del suelo se agrupan entre sí a pesar de su distancia
geográfica y propiedades fisicoquímicas (Figura 14, 15, y Tabla 11). Estos resultados contradicen
lo obtenido por otros estudios realizados en la finca del Hatico con el Bosque, pastoreo
convencional y los sistemas silvopastoriles. En estos estudios, mediante DGGE y FAME (cuantifica
e identifica los ésteres metilados de los ácidos grasos) se determinó que las comunidades
microbianas de los suelos de los sistemas silvopastoriles son más similares a las de los bosques,
mientras que las pasturas convencionales se diferencian de los otros dos usos de suelo (10, 100). No
obstante el presente estudio se realizó con un mayor número de muestras, tres más por cada sistema,
y con la profundidad que permite las tecnologías de secuenciación masiva. Estas diferencias pueden
deberse a que la técnica de DGGE está limitada a los OTUS más abundantes, mientras que en este
estudio se comprobó que las comunidades están compuestas en su gran mayoría por OTUS poco
abundantes (28). Otra explicación a estas diferencias en los resultados puede deberse a que las
52
muestras fueron tomadas en tiempos diferentes, no obstante se ha discutido que la estructura y
composición de las comunidades microbianas varían más a través del espacio que del tiempo (140).
Al igual que Cubillos se determinó que los grupos más abundantes eran Proteobacteria y
Acidobacteria y la gran contradicción se encontró en la abundancia de Actinobacterias (100).
Mediante la prueba de t-test no paramétrica (999 iteraciones método de Montecarlo) se observó que
existen distancias significativas entre las comunidades microbianas de los usos de suelo evaluados
(P=0.001) (Figura 15). Estas diferencias se observaron tanto con las matrices de ausencia/presencia
y abundancia de los OTUS. Las Mayores distancias se encontraron entre los bosques y las cañas
convencionales mientras que las menores entre los sistemas silvopatoriles y las pasturas
convencionales. Las diferencias significativas de las distancias entre las comunidades microbianas
de los usos de suelo evaluados en pares fueron las siguientes: bosque vs caña convencional
(P=0,001), bosque vs sistema silvopastoril (P=0,001), caña convencional vs pasturas
convencionales (P=0,001), bosque vs pastura convencional (P=0,001), caña convencional vs
Sistema silvopastoril (P=0,001), bosque vs caña ecológica (P=0,001), pastura vs caña ecológica
(P=0,001), sistema silvopastoril vs caña ecológica (P=0,001) y caña ecológica vs caña convencional
(P=0,010). Estas distancias están organizadas de mayor a menor respectivamente. No se
encontraron diferencias significativas entre las pasturas convencionales y los sistemas
silvopastoriles.
53
Figura 15. Boxplot de la comparación por pares de las distancias calculadas mediante Unifrac
entre los cinco distintos usos de suelo. Los datos se encuentran organizados de izquierda a derecha
de menor a mayor distancia.
5.2.5. Los usos de suelo y la diferencia entre las fincas afectan la abundancia de
algunos Fila
Se observaron diferencias significativas de la abundancia de los Fila Crenarchaeota,
Euryarchaeota, Acidobacteria, Armatimonadetes, Chloroflexi, Firmicutes, Gemmatimonadetes,
Planctomycetes, Proteobacteria y Verrucomicrobia entre los distintos usos de suelo (P<0.05,
ANOVA corregido con Benjamin (Anexo J). Así mismo, se encontraron diferencias entre algunos
Fila candidatos como WS3, NC10 y Caldithrix pero no entre los OTUS clasificados como no
asignados. Como se observó con las distancias entre las comunidades microbianas, las abundancias
de los Fila encontradas en el bosque son las que más se diferencian de los demás sistemas (Figura
16). No existen diferencias significativas de las abundancias de los Fila entre los sistemas
silvopastoriles y las pasturas convencionales y entre las cañas de azúcar de manejo convencional y
54
la de manejo ecológico. Las mayores diferencias entre las abundancias de los Fila (9 Fila diferentes)
se encontraron entre el bosque y los sistemas silvopastoriles (Figura 16A) y las menores diferencias
(6 Fila diferentes) entre los bosques y las cañas de azúcar de manejo convencional (Figura 16D).
Nitrospirae fue el único Filum que fue significativamente diferente entre el bosque y todas las
demás muestras, siendo mayor siempre en el bosque. La abundancia del Filum Firmicutes,
significativamente diferente entre el bosque y las muestras de sistemas silvopastoril, pastura
convencional y caña de azúcar de manejo convencional, siempre fue menor en el bosque. Además,
el Filum Crenarchaeota pertenecientes a Archaea fue significativamente diferente entre el bosque y
los sistemas de caña pero no con los sistemas de pastoreo. Adicionalmente los Fila más abundantes,
Acidobacteria y Proteobacteria fueron significativamente más abundantes en los bosques que en
los sistemas de pastoreo mientras que no fueron diferentes con los sistemas de caña de azúcar.
La estructura de las comunidades microbianas de los suelos de caña de azúcar se diferencia de las
de los bosques (Figura 16C y D). Estas diferencias están marcadas por la abundancia de los Fila
Firmicutes y Bacteroidetes (mayor en cañas) y Acidobacteria (mayor en bosque). Rachid y
colaboradores reportaron mayor abundancia de Firmicutes asociado a los manejos ecológicos y
menor abundancia de Acidobacterias asociado a manejos convencionales. Además, de la
disminución de miembros del Filum Verrucomicrobia con los dos tipos de manejo (135). Las clases
Gp1, Gp3 y Gp6, pertenecientes a Acidobacteria están asociadas a las diferencias de pH que se
pueden presentar entre los tipos de manejo de las cañas de azúcar, por el efecto de la quema de los
residuos. Aunque, en el presenten estudio el pH de las cañas de azúcar no presento una tendencia
clara, se ha reportado que el manejo convencional conlleva a un pH más acido lo que tiene efecto
sobre el Filum Acidobacteria (130). Así mismo, el pH fue otra de las variables con mayor
significancia sobre la estructuras de las comunidades microbianas encontradas en estos usos de
suelo. Contrario a lo esperado, la concentración de carbón orgánico, mayor en las cañas de manejo
ecológico, no tiene un efecto significativo ya que no se encontraron diferencias en la abundancia de
los Fila entre las cañas ni en los análisis de correspondencia canónica.
55
A
B
C
D
Figura 16. Comparación por pares de la abundancia de los Fila significativamente diferentes entre
el bosque (verde), sistema silvopastoril (azul oscuro), pasturas convencionales (rojo), caña de
azúcar de manejo ecológico (azul claro) y caña de azúcar de manejo convencional (amarillo). La
significancia se determinó mediante la prueba t-test paramétrica corregida por Benjamin-FDR
56
El manejo ecológico o convencional de los sistemas no tiene un efecto sobre la abundancia de todos
los Fila ya que no se encontraron diferencias significativas entre estos (p>0,05). Mientras que si se
encontraron diferencias entre la finca del Hatico y la Lucerna de los Fila Verrucomicrobia,
Gemmatimonadetes, Crenearchaeota y Planctomycetes (p<0,05). La mayor diferencia se observó
entre la abundancia del Filum Verrucomicrobia siendo este más abundante en la finca de la Lucerna
(Figura 17).
Figura 17. Comparación por pares de la abundancia de los Fila significativamente diferentes entre
la finca de la Lucerna (morado) y el Hatico (negro)
5.3. Relación de las variables fisicoquímicas y la estructura de las comunidades
microbianas del suelo
La relación de las variables fisicoquímicas evaluadas con la abundancia de los Fila fue significativa
(p=0,0170). En este modelo se excluyeron las variables fisicoquímicas: bases totales, arcilla,
magnesio, cloro y carbón orgánico normalizado y no normalizado. Dichas variables fueron
excluidas ya que su valor de inflación del modelo superaba el 20%. Las demás variables explican
79,8 % de la varianza de la relación entre las variables fisicoquímicas y biológicas (Figura 18).
Esto indica que aproximadamente 20 % de la varianza restante esta explicada por otras variables
que no fueron medidas. Mediante el análisis de correspondencia canónica (Figura 18) se puede
observar que algunos Fila están asociados directamente con las variables fisicoquímicas. Algunos
de estos casos son; Filum candidato Caldithrix con la saturación de bases, Chlamydiae con el pH y
el limo, los Fila candidatos AD3, WS4 y FBP con el calcio, Spirochaetes y Euryarcheota con el
sodio y el nitrógeno, el Filum candidato NC10 con los nitritos y el Filum candidato SBR con la
57
arena. Los demás Fila no se ven claramente influenciados por las variables fisicoquímicas y por eso
se agrupan en el centro del análisis. De las variables incluidas únicamente el pH (p=0,001), potasio
pH (p=0,001) y amonio pH (p=0,001) tienen un efecto significativo sobre la abundancia y
distribución de la comunidad microbiana en los usos de suelo evaluados (Tabla 12). Estas variables
tienen la mayor magnitud en el análisis representado por el tamaño de las flechas, mientras que el
fosforo calcio y la saturación de bases la menor magnitud o efecto. El Filum candidato Caldithrix es
el único que se separa claramente junto al bosque indicando que el pH encontrado en estas muestras
es determinante para la presencia de estos organismos.
Figura 18. Análisis de correspondencia canónica (CCA) entre las variables fisicoquímicas (Flechas
rojas) y los diferentes Fila (triángulos oscuros) encontrados en dos fincas agroecológicas; Lucerna
(L) y Hatico (H) en cinco usos de suelo bosque (B), sistema silvopastoril (S), pastura convencional
(P), caña de azúcar convencional (CC) y caña de azúcar ecológica (CO).
58
Tabla 12. Forward selection de las variables fisicoquímicas con influencia significativa sobre la
distribución de los diferentes Fila en los usos de suelo. Se resaltan los valores P significativos y se
muestra la varianza explicada por cada variable
P
F
% explicación de
la varianza
Variable
LambdaA
NH4
0,02
0,001 3,49
28,6
K
0,01
0,001 3,07
14,3
pH
0,01
0,001 3,18
14,3
P
0,01
0,061 1,77
14,3
Na
0
0,106 1,56
0,0
A
0,01
0,08
1,67
14,3
N
0
0,383 1,06
0,0
Ca
0,01
0,374 1,12
14,3
L
0
0,271 1,19
0,0
SB
0
0,888
0,5
0,0
NO3
0
0,784 0,62
0,0
En la literatura se encuentra que el pH es la variable que más influye sobre la comunidad
microbiana (65–71) seguido de tipo de vegetación (71, 77–79), contenido de carbón y nitrógeno
(65, 71, 81, 82), humedad (72, 83–85), temperatura y precipitaciones (85–87), textura (68, 77, 80)
y contenido de nutrieres (82, 89, 90). Sin embargo, los estudios realizados en el Hatico demuestran
que existen otras variables importantes como son la concentración de K.
Estudios, realizado por Vallejo y Cubillos, determinaron que la concentración de amonio fue la
variable con mayor importancia en la diferenciación de las comunidades, posiblemente debido a la
fertilización en las pasturas convencionales. Lo que puede conllevar a la selección de grupos
específicos como las bacterias oxidadoras de amonio, y otros organismos que proliferan en la
presencia de alta concentración de nutrientes (microorganismos copiotrofos) (65, 141). Del mismo
59
modo, en el presente estudio se encontró que el amonio es una de las variables con mayor peso en la
diferenciación de las comunidades, aunque estas no se agruparon de igual forma que en los estudios
anteriormente mencionados. Incluso, se encontraron diferencias de la abundancia, entre las pasturas
y los bosques, de los Fila Nitrospira (disminución) y Acidobacteria (aumento) los cuales responde a
la presencia de nitrógeno que puede provenir de la fertilización (139). Análogamente, estas mismas
diferencias se presentaron entre el bosque y los sistemas silvopastoriles, lo que puede estar
explicado por el amonio que entra al suelo por medio de los excrementos y orina de los animales,
aunque no haya fertilización directa (125). Más aun, la deposición de estos excrementos animales
puede aumentar la abundancia de Firmicutes, como se observó en este estudio, el cual es un Filum
considerado de los más abundantes en el rumen de las vacas (142). Ademas, el Filum Acidobacteria
(Grupos 5 y 6) siempre fue más abundante en los suelos de bosque comparado con los demás, lo
que se peude atribuir a la diferencia de pH el cual era más acido en los sistemas con pastoreo y
cañas (124). Por otro lado se ha reportado que Bacteroidetes y Actinomicetes varian poco en
grandientes de pH. Puesto que, se encontraron diferencias de la abundancia de los Fila Nitrospira,
Proteobacteria, Actinomycetes, Plactomycetes, Gemmantimonadetes y Ammatinadetes, se puede
deducir que hay otras variables que pueden ejercer sobre estos grupos. Dentro de estas variables
esta la compactación, que puede disminuir la cantidad de oxígeno y promover bacterias anaerobias,
arado que puede destruir la estructura del suelo y la inclusión de plantas no nativas del sitio (129,
143, 144).
60
6. CONCLUSIONES
El kit comercial Power Soil extrajo la mayor concentración de ADN con respecto al
protocolo de Griffiths, pero no se encontraron diferencias significativas en su pureza.
El método de Griffiths favorece la abundancia de Verrucomicrobia, Armatimonadetes,
Planctomycetes y Crenarchaeota mientras que la abundancia de WS3, Bacteroidetes y
Firmicutes se favorece por el método de Power Soil.
No se observó diferencia significativa entre la riqueza y la diversidad obtenida con
diferentes métodos de extracción de ADN de suelo, sin embargo el Kit Power Soil siempre
tuvo los mayores valores de estos parámetros.
La purificación de ADN con columnas de Sefarosa 2B y PVPP no influencia la estimación
de la α y β diversidad.
La amplificación del gen 16S ARNr por PCR fue altamente reproducible.
La zona geográfica tiene mayor influencia sobre las propiedades fisicoquímicas que el uso
del suelo.
El cultivo de caña convencional tiene efecto negativo sobre la concentración de carbono
orgánico mientras que el cultivo de caña agroecológica aumenta el contenido de carbono
orgánico en el suelo.
La composición y estructuras de las comunidades microbianas de suelos del Valle del
Cauca está determinada por el uso del suelo (pastoreo, cultivos de caña y bosque) más que
por la distancia geográfica y tipo de manejo agroecológico o convencional.
La comunidad microbiana del bosque, sin intervención humana, fue la más diferente en
comparación con las de los usos de suelo tanto de manejo convencional como
agroecológico.
El manejo convencional o ecológico de sistemas de ganadería o cultivos de caña de azúcar
tiene una baja influencia sobre la estructura y composición de las comunidades
microbianas.
El pH, amonio y potasio fueron las variables que explicaron significativamente la estructura
y composición de las comunidades microbianas.
La abundancia de Nitrospirae Firmicutes, Crenarchaeota, Acidobacteria y Proteobacteria
fue significativamente diferente en los bosques que en otros sistemas. Por otro lado, no se
observaron diferencias significativas de la abundancia de los Fila entre los demás sistemas.
61
62
7. PERSPECTIVAS Y RECOMENDACIONES
Evaluar el efecto de la polimerasa y el termociclador en la estimación de la estructura y
composición de las comunidades microbianas.
Evaluar el efecto de distintos métodos de purificación, como precipitación, columnas, gel,
etc en la estimación de la estructura y composición de las comunidades microbianas.
Evaluar el efecto del uso de secuencias ensambladas y no ensambladas y los parámetros
bioinformáticos en la estimación de la estructura y composición de las comunidades
microbianas.
Realizar un estudio a mayor escala de los usos de suelo, donde se puedan tomar muestras de
suelos de distintos departamentos y evaluar a mayor profundidad el efecto de la distancia
geográfica.
Realizar estudios metagenómicos para determinar cómo los usos de suelo afectan la
capacidad metabólica de la comunidad microbiana edáfica.
63
BIBLIOGRAFÍA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, Costello EK, Fierer N,
Peña AG, Goodrich JK, Gordon JI, Huttley GA, Kelley ST, Knights D, Koenig JE, Ley RE,
Lozupone CA, Mcdonald D, Muegge BD, Pirrung M, Reeder J, Sevinsky JR, Turnbaugh
PJ, Walters WA, Widmann J, Yatsunenko T, Zaneveld J, Knight R. 2010. QIIME allows
analysis of high- throughput community sequencing data Intensity normalization improves
color calling in SOLiD sequencing. Nat. Publ. Gr. 7:335–336.
Nair PKR, Nair VD, Kumar BM, Haile SG. 2009. Soil carbon sequestration in tropical
agroforestry systems: a feasibility appraisal. Environ. Sci. Policy 12:1099–1111.
Elsacker S Van. 2011. Effects of land use and soil management on soil quality in the
Mekong Delta , Vietnam. Universiteit Gent.
Science B, Rashidi M, Keshavarzpour F. 2008. Effect of different tillage methods on soils
physical properties and crop yield of melon (Cucumis melo ). J. Agric. Biol. Sci. 3:41–46.
Gómez JA, Giráldez J V, Pastor M, Ferese E. 1999. Effects of tillage method on sil physical
properties, infiltration and yield in olive orchard. Soil Tillage Res. 52:167–175.
Liu Y, Gao M, Wu W, Tanveer SK, Wen X, Liao Y. 2013. The effects of conservation
tillage practices on the soil water-holding capacity of a non-irrigated apple orchard in the
Loess Plateau, China. Soil Tillage Res. 130:7–12.
Wienhold BJ, Andrews SS, Karlen DL. 2004. Soil quality: a review of the science and
experiences in the USA. Environ. Geochem. Health 26:89–95.
Calle Z, Murgueitio E, Chará J, Molina CH, Zuluaga AF, Calle A. 2013. A Strategy for
Scaling-Up Intensive Silvopastoral Systems in Colombia. J. Sustain. For. 32:677–693.
Calle Z, Murgueitio E. 2012. Integrating forestry, sustainable cattle-ranching and landscape
restoration 63:31–40.
Vallejo VE, Arbeli Z, Terán W, Lorenz N, Dick RP, Roldan F. 2012. Effect of land
management and Prosopis juliflora (Sw.) DC trees on soil microbial community and
enzymatic activities in intensive silvopastoral systems of Colombia. Agric. Ecosyst.
Environ. 150:139–148.
Vallejo VE, Roldan F, Dick RP. 2010. Soil enzymatic activities and microbial biomass in
an integrated agroforestry chronosequence compared to monoculture and a native forest of
Colombia. Biol. Fertil. Soils 46:577–587.
Fromin N, Hamelin J, Tarnawski S, Roesti D, Forestier N, Gillet F, Aragno M, Rossi P.
2002. Statistical analysis of denaturing gel electrophoresis ( DGE ) fingerprinting patterns.
Evironmental Microbiol. 4:634–643.
Jackson CR, Roden EE, Perry F. 2000. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Can Fail to
Separate 16S rADN Fragments with Multiple Base Differences. Mol. Biol. Today 1:49–51.
Illumina. 2014. http://www.illumina.com/systems/sequencing.ilmn.
Roche 454. 2014. http://454.com/products/gs-flx-system/index.asp.
Schloss PD, Westcott SL, Ryabin T, Hall JR, Hartmann M, Hollister EB, Lesniewski R a,
Oakley BB, Parks DH, Robinson CJ, Sahl JW, Stres B, Thallinger GG, Van Horn DJ,
Weber CF. 2009. Introducing mothur: open-source, platform-independent, communitysupported software for describing and comparing microbial communities. Appl. Environ.
Microbiol. 75:7537–41.
TerraGenome. http://www.terragenome.org/
Caporaso JG, Lauber CL, Costello EK, Berg-Lyons D, Gonzalez A, Stombaugh J, Knights
D, Gajer P, Ravel J, Fierer N, Gordon JI, Knight R. 2011. Moving pictures of the human
microbiome. Genome Biol. 12:R50.
64
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
Zheng L, Gao N, Deng Y. 2011. Evaluation of ADN extraction methods for the analysis of
microbial community in biological activated carbon. Environ. Technol. 33:437–44.
Kennedy N a, Walker AW, Berry SH, Duncan SH, Farquarson FM, Louis P, Thomson JM,
Satsangi J, Flint HJ, Parkhill J, Lees CW, Hold GL. 2014. The impact of different ADN
extraction kits and laboratories upon the assessment of human gut microbiota composition
by 16S rRNA gene sequencing. PLoS One 9:e88982.
Kanagawa T. 2003. Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR). J.
Biosci. Bioeng. 96:317–23.
Whitman WB, Coleman DC, Wiebe WJ. 1998. Perspective Prokaryotes  : The unseen majority. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6578–6583.
Van der Heijden MG a, Bardgett RD, van Straalen NM. 2008. The unseen majority: soil
microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems. Ecol. Lett.
11:296–310.
Horner-Devine MC, Carney KM, Bohannan BJM. 2004. An ecological perspective on
bacterial biodiversity. Proc. Biol. Sci. 271:113–22.
Kirk JL, Beaudette L a, Hart M, Moutoglis P, Klironomos JN, Lee H, Trevors JT. 2004.
Methods of studying soil microbial diversity. J. Microbiol. Methods 58:169–88.
Franklin RB, Mills AL. 2003. Multi-scale variation in spatial heterogeneity for microbial
community structure in an eastern Virginia agricultural field. FEMS Microbiol. Ecol.
44:335–46.
Zhou J, Bruns MANN, Tiedje JM. 1996. ADN recovery from soils of diverse composition.
Appl. Environ. Microbiol. 62:316–322.
Blackwood CB, Hudleston D, Zak DR, Buyer JS. 2007. Interpreting ecological diversity
indices applied to terminal restriction fragment length polymorphism data: insights from
simulated microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 73:5276–83.
Kunin V, Engelbrektson A, Ochman H, Hugenholtz P. 2010. Wrinkles in the rare biosphere:
pyrosequencing errors can lead to artificial inflation of diversity estimates. Environ.
Microbiol. 12:118–23.
Lombard N, Prestat E, van Elsas JD, Simonet P. 2011. Soil-specific limitations for access
and analysis of soil microbial communities by metagenomics. FEMS Microbiol. Ecol.
78:31–49.
Gabor EM, de Vries EJ, Janssen DB. 2003. Efficient recovery of environmental ADN for
expression cloning by indirect extraction methods. FEMS Microbiol. Ecol. 44:153–63.
Purswani J, Martín-Platero AM, Reboleiro-Rivas P, González-López J, Pozo C. 2011.
Comparative analysis of microbial ADN extraction protocols for groundwater samples.
Anal. Biochem. 416:240–2.
Yeates C, Gillings MR, Davison a D, Altavilla N, Veal D a. 1998. Methods for microbial
ADN extraction from soil for PCR amplification. Biol. Proced. Online 1:40–47.
Leff LG, Dana JR, McArthur J V, Shimkets LJ. 1995. Comparison of methods of ADN
extraction from stream sediments. Appl. Environ. Microbiol. 61:1141–3.
Ranjard L, Poly F, Combrisson J, Richaume A, Nazaret S. 1998. A single procedure to
recover ADN from the surface or inside aggregates and in various size fractions of soil
suitable for PCR-based assays of bacterial communities. Eur. J. Soil Biol. 34:89–97.
Miller DN. 2001. Evaluation of gel filtration resins for the removal of PCR-inhibitory
substances from soils and sediments. J. Microbiol. Methods 44:49–58.
Howeler M, Ghiorse WC, Walker LP. 2003. A quantitative analysis of ADN extraction and
purification from compost. J. Microbiol. Methods 54:37–45.
65
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
Caporaso JG, Lauber CL, Walters W a, Berg-Lyons D, Lozupone C a, Turnbaugh PJ, Fierer
N, Knight R. 2011. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of
sequences per sample. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108:4516–22.
Caporaso JG, Lauber CL, Walters W a, Berg-Lyons D, Huntley J, Fierer N, Owens SM,
Betley J, Fraser L, Bauer M, Gormley N, Gilbert J a, Smith G, Knight R. 2012. Ultra-highthroughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.
ISME J. 6:1621–4.
Claesson MJ, Wang Q, O’Sullivan O, Greene-Diniz R, Cole JR, Ross RP, O’Toole PW. 2010. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly
complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic
Acids Res. 38:2–13.
Sogin ML, Morrison HG, Huber J a, Mark Welch D, Huse SM, Neal PR, Arrieta JM,
Herndl GJ. 2006. Microbial diversity in the deep sea and the underexplored “rare biosphere”. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103:12115–20.
Huse SM, Dethlefsen L, Huber J a, Mark Welch D, Welch DM, Relman D a, Sogin ML.
2008. Exploring microbial diversity and taxonomy using SSU rRNA hypervariable tag
sequencing. PLoS Genet. 4:2383–2400.
Bergmann GT, Bates ST, Eilers KG, Lauber CL, Caporaso JG, Walters W a, Knight R,
Fierer N. 2011. The under-recognized dominance of Verrucomicrobia in soil bacterial
communities. Soil Biol. Biochem. 43:1450–1455.
Acinas SG, Sarma-rupavtarm R, Polz MF, Klepac-ceraj V. 2005. PCR-Induced Sequence
Artifacts and Bias  : Insights from Comparison of Two 16S rRNA Clone Libraries Constructed from the Same Sample. Appl. Environ. Microbiol. 71:8966–8969.
Reeder J, Knight R. 2009. The “rare biosphere”: a reality check. Nat. Methods 6:636–7.
Huse SM, Welch DM, Morrison HG, Sogin ML. 2010. Ironing out the wrinkles in the rare
biosphere through improved OTU clustering. Environ. Microbiol. 12:1889–98.
Degnan PH, Ochman H. 2012. Illumina-based analysis of microbial community diversity.
ISME J. 6:183–94.
Bokulich NA, Subramanian S, Faith JJ, Gevers D, Gordon I, Knight R, Mills DA, Caporaso
JG. 2013. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon
sequencing 10:57–59.
Liu L, Li Y, Li S, Hu N, He Y, Pong R, Lin D, Lu L, Law M. 2012. Comparison of nextgeneration sequencing systems. J. Biomed. Biotechnol. 2012:251364.
The NIH HMP Working Group. 2009. The NIH Human Microbiome Project. Genome Res.
19:2317–2323.
Frey KG, Herrera-Galeano JE, Redden CL, Luu T V, Servetas SL, Mateczun AJ, Mokashi
VP, Bishop-Lilly K a. 2014. Comparison of three next-generation sequencing platforms for
metagenomic sequencing and identification of pathogens in blood. BMC Genomics 15:96.
Edgar RC. 2010. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.
Bioinformatics 26:2460–1.
Wang Q, Garrity GM, Tiedje JM, Cole JR. 2007. Naive Bayesian classifier for rapid
assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Appl. Environ. Microbiol.
73:5261–7.
Caporaso JG, Bittinger K, Bushman FD, DeSantis TZ, Andersen GL, Knight R. 2010.
PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics
26:266–7.
McDonald D, Clemente JC, Kuczynski J, Rideout JR, Stombaugh J, Wendel D, Wilke A,
Huse S, Hufnagle J, Meyer F, Knight R, Caporaso JG. 2012. The Biological Observation
66
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
Matrix (BIOM) format or: how I learned to stop worrying and love the ome-ome.
Gigascience 1:7.
Lozupone C, Knight R. 2005. UniFrac  : a New Phylogenetic Method for Comparing
Microbial Communities. Appl. Environ. Microbiol. 71:8228–8235.
Lozupone C a, Hamady M, Kelley ST, Knight R. 2007. Quantitative and qualitative beta
diversity measures lead to different insights into factors that structure microbial
communities. Appl. Environ. Microbiol. 73:1576–85.
OCDE-FAO. 2011. Perspectivas Agrícolas 2011-2020.
Macedo IC, Seabra JE a., Silva JE a. R. 2008. Green house gases emissions in the
production and use of ethanol from sugarcane in Brazil: The 2005/2006 averages and a
prediction for 2020. Biomass and Bioenergy 32:582–595.
Galdos MV, Cerri CC, Cerri CEP. 2009. Soil carbon stocks under burned and unburned
sugarcane in Brazil. Geoderma 153:347–352.
Yamamoto W, Dewi IA, Ibrahim M. 2007. Effects of silvopastoral areas on milk production
at dual-purpose cattle farms at the semi-humid old agricultural frontier in central Nicaragua.
Agric. Syst. 94:368–375.
Ibrahim M, Guerra L, Casasola F, Neely C. 2010. Importance of silvopastoral systems for
mitigation of climate change and harnessing of environmental benefits, p. 189–196. In
Integrated Crop Management.
Blair N. 2000. Impact of cultivation and sugar-cane green trash management on carbon
fractions and aggregate stability for a Chromic Luvisol in Queensland, Australia. Soil
Tillage Res. 55:183–191.
Núñez O, Spaans E. 2008. Evaluation of green-cane harvesting and crop management with
a trash-blanket. Sugar Tech 10:29–35.
Jangid K, Williams M a., Franzluebbers AJ, Sanderlin JS, Reeves JH, Jenkins MB, Endale
DM, Coleman DC, Whitman WB. 2008. Relative impacts of land-use, management
intensity and fertilization upon soil microbial community structure in agricultural systems.
Soil Biol. Biochem. 40:2843–2853.
Wakelin S a., Macdonald LM, Rogers SL, Gregg a. L, Bolger TP, Baldock J a. 2008.
Habitat selective factors influencing the structural composition and functional capacity of
microbial communities in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 40:803–813.
Lauber CL, Hamady M, Knight R, Fierer N. 2009. Pyrosequencing-based assessment of soil
pH as a predictor of soil bacterial community structure at the continental scale. Appl.
Environ. Microbiol. 75:5111–20.
Lauber CL, Strickland MS, Bradford M a., Fierer N. 2008. The influence of soil properties
on the structure of bacterial and fungal communities across land-use types. Soil Biol.
Biochem. 40:2407–2415.
Fierer N, Jackson RB. 2006. The diversity and biogeography of soil bacterial communities.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103:626–31.
Da C Jesus E, Marsh TL, Tiedje JM, de S Moreira FM. 2009. Changes in land use alter the
structure of bacterial communities in Western Amazon soils. ISME J. 3:1004–11.
Xue D, Yao H-Y, Ge D-Y, Huang C-Y. 2008. Soil Microbial Community Structure in
Diverse Land Use Systems: A Comparative Study Using Biolog, DGGE, and PLFA
Analyses. Pedosphere 18:653–663.
Drenovsky R, Steenwerth K, Jackson L, Scow KM. 2014. Land use and climatic factors
structure regional patterns in soil microbial communities. Natl. Inst. Heal. 19:27–39.
Zhao J, Ni T, Li Y, Xiong W, Ran W, Shen B, Shen Q, Zhang R. 2014. Responses of
bacterial communities in arable soils in a rice-wheat cropping system to different fertilizer
regimes and sampling times. PLoS One 9:e85301.
67
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
Li C, Yan K, Tang L, Jia Z, Li Y. 2014. Change in deep soil microbial communities due to
long-term fertilization. Soil Biol. Biochem. 75:264–272.
Hartmann M, Niklaus P a, Zimmermann S, Schmutz S, Kremer J, Abarenkov K, Lüscher P,
Widmer F, Frey B. 2014. Resistance and resilience of the forest soil microbiome to loggingassociated compaction. ISME J. 8:226–44.
Chau JF, Bagtzoglou AC, Willig MR. 2011. The Effect of Soil Texture on Richness and
Diversity of Bacterial Communities. Environ. Forensics 12:333–341.
Garbeva P, Elsas JD, Veen J a. 2007. Rhizosphere microbial community and its response to
plant species and soil history. Plant Soil 302:19–32.
Berg G, Smalla K. 2009. Plant species and soil type cooperatively shape the structure and
function of microbial communities in the rhizosphere. FEMS Microbiol. Ecol. 68:1–13.
Lamb EG, Kennedy N, Siciliano SD. 2010. Effects of plant species richness and evenness
on soil microbial community diversity and function. Plant Soil 338:483–495.
Girvan MS, Bullimore J, Pretty JN, Mark A, Ball AS, Osborn AM. 2003. Soil Type Is the
Primary Determinant of the Composition of the Total and Active Bacterial Communities in
Arable Soil. Appl. Environ. Microbiol. 69:1800–1809.
Buyer JS, Teasdale JR, Roberts DP, Zasada I a., Maul JE. 2010. Factors affecting soil
microbial community structure in tomato cropping systems. Soil Biol. Biochem. 42:831–
841.
Wallis PD, Haynes RJ, Hunter CH, Morris CD. 2010. Effect of land use and management
on soil bacterial biodiversity as measured by PCR-DGGE. Appl. Soil Ecol. 46:147–150.
Fierer N, Schimel JP, Holden P a. 2003. Influence of drying-rewetting frequency on soil
bacterial community structure. Microb. Ecol. 45:63–71.
Dimitriu P a, Grayston SJ. 2010. Relationship between soil properties and patterns of
bacterial beta-diversity across reclaimed and natural boreal forest soils. Microb. Ecol.
59:563–73.
Bell C, McIntyre N, Cox S, Tissue D, Zak J. 2008. Soil microbial responses to temporal
variations of moisture and temperature in a chihuahuan desert grassland. Microb. Ecol.
56:153–67.
Wakelin S a., Gregg AL, Simpson RJ, Li GD, Riley IT, McKay AC. 2009. Pasture
management clearly affects soil microbial community structure and N-cycling bacteria.
Pedobiologia (Jena). 52:237–251.
Waldrop MP, Firestone MK. 2006. Seasonal dynamics of microbial community
composition and function in oak canopy and open grassland soils. Microb. Ecol. 52:470–9.
Aboim MCR, Coutinho HLC, Peixoto RS, Barbosa JC, Rosado AS. 2008. Soil bacterial
community structure and soil quality in a slash-and-burn cultivation system in Southeastern
Brazil. Appl. Soil Ecol. 38:100–108.
Moore J, Macalady JL, Schulz MS, White AF, Brantley SL. 2010. Shifting microbial
community structure across a marine terrace grassland chronosequence, Santa Cruz,
California. Soil Biol. Biochem. 42:21–31.
Faoro H, Alves a C, Souza EM, Rigo LU, Cruz LM, Al-Janabi SM, Monteiro R a, Baura V
a, Pedrosa FO. 2010. Influence of soil characteristics on the diversity of bacteria in the
Southern Brazilian Atlantic Forest. Appl. Environ. Microbiol. 76:4744–9.
Garrigues E, Corson MS, Angers D a., van der Werf HMG, Walter C. 2012. Soil quality in
Life Cycle Assessment: Towards development of an indicator. Ecol. Indic. 18:434–442.
Fierer N, Leff J. 2012. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities
and their functional attributes. Proc. … 109:2–7.
68
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
109.
110.
Nazaries L, Pan Y, Bodrossy L, Baggs EM, Millard P, Murrell JC, Singh BK. 2013.
Evidence of microbial regulation of biogeochemical cycles from a study on methane flux
and land use change. Appl. Environ. Microbiol. 79:4031–40.
Philippot L, Spor A, Hénault C, Bru D, Bizouard F, Jones CM, Sarr A, Maron P-A. 2013.
Loss in microbial diversity affects nitrogen cycling in soil. ISME J. 1609–1619.
Nautiyal CS, Chauhan PS, Bhatia CR. 2010. Changes in soil physico-chemical properties
and microbial functional diversity due to 14 years of conversion of grassland to organic
agriculture in semi-arid agroecosystem. Soil Tillage Res. 109:55–60.
Lagomarsino a., Moscatelli MC, Di Tizio a., Mancinelli R, Grego S, Marinari S. 2009. Soil
biochemical indicators as a tool to assess the short-term impact of agricultural management
on changes in organic C in a Mediterranean environment. Ecol. Indic. 9:518–527.
Horz H-P, Barbrook A, Field CB, Bohannan BJM. 2004. Ammonia-oxidizing bacteria
respond to multifactorial global change. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101:15136–41.
Maron P-A, Mougel C, Ranjard L. 2011. Soil microbial diversity: Methodological strategy,
spatial overview and functional interest. C. R. Biol. 334:403–11.
Bruggen AHC, Semenov AM, Diepeningen AD, Vos OJ, Blok WJ. 2006. Relation between
Soil Health, Wave-like Fluctuations in Microbial Populations, and Soil-borne Plant Disease
Management. Eur. J. Plant Pathol. 115:105–122.
Cubillos A. 2012. Efecto de sistemas silvopastoriles sobre las comunidades bacterianas
edáficas en la reserva natural El Hatico (Valle del Cauca, Colombia).
Arbeli Z, Fuentes CL. 2007. Improved purification and PCR amplification of ADN from
environmental samples. FEMS Microbiol. Lett. 272:269–75.
Liu Z, Lozupone C, Hamady M, Bushman FD, Knight R. 2007. Short pyrosequencing reads
suffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Res. 35:e120.
Magoc T, Salzberg SL. 2011. FLASH  : Fast Length Adjustment of Short Reads to Improve Genome Assemblies. Bioinformatics 1–8.
McMurdie PJ, Holmes S. 2013. phyloseq: An R Package for Reproducible Interactive
Analysis and Graphics of Microbiome Census Data. PLoS One 8:e61217.
DeSantis TZ, Hugenholtz P, Larsen N, Rojas M, Brodie EL, Keller K, Huber T, Dalevi D,
Hu P, Andersen GL. 2006. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and
workbench compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72:5069–72.
Griffiths RI, Whiteley AS, Anthony G, Donnell O, Bailey MJ, Donnell AGO. 2000. Rapid
Method for Coextraction of ADN and RNA from Natural Environments for Analysis of
Ribosomal ADN- and rRNA-Based Microbial Community Composition. Appl. Environ.
Microbiol. 66:5488–5491.
Sagova-Mareckova M, Cermak L, Novotna J, Plhackova K, Forstova J, Kopecky J. 2008.
Innovative methods for soil ADN purification tested in soils with widely differing
characteristics. Appl. Environ. Microbiol. 74:2902–7.
Pakpour S, Olishevska S V, Prasher SO, Milani AS, Chénier MR. 2013. ADN extraction
method selection for agricultural soil using TOPSIS multiple criteria decision-making
model. Am. J. Mol. Biol. 3:215–228.
Terrat S, Christen R, Dequiedt S, Lelièvre M, Nowak V, Regnier T, Bachar D, Plassart P,
Wincker P, Jolivet C, Bispo A, Lemanceau P, Maron P-A, Mougel C, Ranjard L. 2012.
Molecular biomass and MetaTaxogenomic assessment of soil microbial communities as
influenced by soil ADN extraction procedure. Microb. Biotechnol. 5:135–41.
Mahmoudi N, Slater GF, Fulthorpe RR. 2011. Comparison of commercial ADN extraction
kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic ADN from PAH-contaminated
soils. Can. J. Microbiol 57:623–628.
69
111.
112.
113.
114.
115.
116.
117.
118.
119.
120.
121.
122.
123.
124.
125.
126.
Gilbert J a, Bailey MJ, Field D, Fierer N, Fuhrman J a, Hu B, Jansson J, Knight R,
Kowalchuk G a, Kyrpides N, Meyer F, Stevens R. 2011. The Earth Microbiome Project:
The Meeting Report for the 1st International Earth Microbiome Project Conference.
Shenzhen, China.
Mamlouk D, Hidalgo C, Torija M-J, Gullo M. 2011. Evaluation and optimisation of
bacterial genomic ADN extraction for no-culture techniques applied to vinegars. Food
Microbiol. 28:1374–9.
LaMontagne MG, Michel FC, Holden P a, Reddy C a. 2002. Evaluation of extraction and
purification methods for obtaining PCR-amplifiable ADN from compost for microbial
community analysis. J. Microbiol. Methods 49:255–64.
Bartram AK, Lynch MDJ, Stearns JC, Moreno-Hagelsieb G, Neufeld JD. 2011. Generation
of multimillion-sequence 16S rRNA gene libraries from complex microbial communities by
assembling paired-end illumina reads. Appl. Environ. Microbiol. 77:3846–52.
Gloor GB, Hummelen R, Macklaim JM, Dickson RJ, Fernandes AD, MacPhee R, Reid G.
2010. Microbiome profiling by illumina sequencing of combinatorial sequence-tagged PCR
products. PLoS One 5:e15406.
Taş N, Prestat E, McFarland JW, Wickland KP, Knight R, Berhe AA, Jorgenson T, Waldrop MP, Jansson JK. 2014. Impact of fire on active layer and permafrost microbial
communities and metagenomes in an upland Alaskan boreal forest. ISME J. 1–16.
Gibbons SM, Caporaso JG, Pirrung M, Field D, Knight R, Gilbert J a. 2013. Evidence for a
persistent microbial seed bank throughout the global ocean. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
110:4651–5.
De Lipthay JR, Enzinger C, Johnsen K, Aamand J, Sørensen SJ. 2004. Impact of ADN
extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient
gel electrophoresis. Soil Biol. Biochem. 36:1607–1614.
Martin-Laurent F, Philippot L, Hallet S, Chaussod R, Soulas G, Catroux G. 2001. ADN
Extraction from Soils  : Old Bias for New Microbial Diversity Analysis Methods. Appl. Environ. Microbiol. 67:2354–2359.
Henderson G, Cox F, Kittelmann S, Miri VH, Zethof M, Noel SJ, Waghorn GC, Janssen
PH. 2013. Effect of ADN extraction methods and sampling techniques on the apparent
structure of cow and sheep rumen microbial communities. PLoS One 8:e74787.
He Y, Zhao Y, Zhou G, Huang M. 2009. Evaluation of extraction and purification methods
for obtaining PCR-amplifiable ADN from aged refuse for microbial community analysis.
World J. Microbiol. Biotechnol. 25:2043–2051.
Tamaki H, Tanaka Y, Matsuzawa H, Muramatsu M, Meng X-Y, Hanada S, Mori K,
Kamagata Y. 2011. Armatimonas rosea gen. nov., sp. nov., of a novel bacterial phylum,
Armatimonadetes phyl. nov., formally called the candidate phylum OP10. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 61:1442–7.
Yuan S, Cohen DB, Ravel J, Abdo Z, Forney LJ. 2012. Evaluation of methods for the
extraction and purification of ADN from the human microbiome. PLoS One 7:e33865.
Rousk J, Bååth E, Brookes PC, Lauber CL, Lozupone C, Caporaso JG, Knight R, Fierer N.
2010. Soil bacterial and fungal communities across a pH gradient in an arable soil. ISME J.
4:1340–51.
Laubach J, Taghizadeh-Toosi a., Gibbs SJ, Sherlock RR, Kelliher FM, Grover SPP. 2013.
Ammonia emissions from cattle urine and dung excreted on pasture. Biogeosciences
10:327–338.
Richardson C, King KW. 1995. Erosion and Nutrient Losses From Zero Tillage on a Clay
Soil. J. Agric. Eng. Res. 61:81–86.
70
127.
128.
129.
130.
131.
132.
133.
134.
135.
136.
137.
138.
139.
140.
141.
142.
143.
144.
Resende AS, Xavier RP, Oliveira OC, Urquiaga S, Alves BJR, Boddey RM. 2006. Longterm Effects of Pre-harvest Burning and Nitrogen and Vinasse Applications on Yield of
Sugar Cane and Soil Carbon and Nitrogen Stocks on a Plantation in Pernambuco, N.E.
Brazil. Plant Soil 281:339–351.
Bardgett RD. 2009. The Biology of Soil. Oxford University Press.
Martın
́ ez L., Zinck J. 2004. Temporal variation of soil compaction and deterioration of soil
quality in pasture areas of Colombian Amazonia. Soil Tillage Res. 75:3–18.
Jones RT, Robeson MS, Lauber CL, Hamady M, Knight R, Fierer N. 2009. A
comprehensive survey of soil acidobacterial diversity using pyrosequencing and clone
library analyses. ISME J. 3:442–53.
Singleton DR, Richardson SD, Aitken MD. 2011. Pyrosequence analysis of bacterial
communities in aerobic bioreactors treating polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated
soil. Biodegradation 22:1061–73.
Lee J, Lee TK, Löffler FE, Park J. 2011. Characterization of microbial community structure
and population dynamics of tetrachloroethene-dechlorinating tidal mudflat communities.
Biodegradation 22:687–98.
Werner JJ, Zhou D, Caporaso JG, Knight R, Angenent LT. 2012. Comparison of Illumina
paired-end and single-direction sequencing for microbial 16S rRNA gene amplicon surveys.
ISME J. 6:1273–6.
Janssen PH. 2006. Identifying the Dominant Soil Bacterial Taxa in Libraries of 16S rRNA
and 16S rRNA Genes. Appl. Environ. Microbiol. 72:1719–1728.
Rachid CTCC, Santos AL, Piccolo MC, Balieiro FC, Coutinho HLC, Peixoto RS, Tiedje
JM, Rosado AS. 2013. Effect of sugarcane burning or green harvest methods on the
Brazilian Cerrado soil bacterial community structure. PLoS One 8:e59342.
Suleiman AKA, Manoeli L, Boldo JT, Pereira MG, Roesch LFW. 2013. Shifts in soil
bacterial community after eight years of land-use change. Syst. Appl. Microbiol. 36:137–
44.
Dorr de Quadros P, Zhalnina K, Davis-Richardson A, Fagen JR, Drew J, Bayer C, Camargo
F a. O, Triplett EW. 2012. The Effect of Tillage System and Crop Rotation on Soil
Microbial Diversity and Composition in a Subtropical Acrisol. Diversity 4:375–395.
Yu Y, Shen W, Yin Y, Zhang J, Cai Z, Zhong W. 2012. Response of soil microbial
diversity to land-use conversion of natural forests to plantations in a subtropical
mountainous area of southern China. Soil Sci. Plant Nutr. 58:450–461.
Coolon JD, Jones KL, Todd TC, Blair JM, Herman MA. 2013. Long-term nitrogen
amendment alters the diversity and assemblage of soil bacterial communities in tallgrass
prairie. PLoS One 8:e67884.
Lauber CL, Ramirez KS, Aanderud Z, Lennon J, Fierer N. 2013. Temporal variability in
soil microbial communities across land-use types. ISME J. 7:1641–50.
Fierer N, Lauber CL, Ramirez KS, Zaneveld J, Bradford M a, Knight R. 2012. Comparative
metagenomic, phylogenetic and physiological analyses of soil microbial communities
across nitrogen gradients. ISME J. 6:1007–17.
Shanks OC, Kelty C a, Archibeque S, Jenkins M, Newton RJ, McLellan SL, Huse SM,
Sogin ML. 2011. Community structures of fecal bacteria in cattle from different animal
feeding operations. Appl. Environ. Microbiol. 77:2992–3001.
Kurz I, O’Reilly CD, Tunney H. 2006. Impact of cattle on soil physical properties and nutrient concentrations in overland flow from pasture in Ireland. Agric. Ecosyst. Environ.
113:378–390.
Zak DR, Holmes WE, White DC, Peacock AD, Tilman D. 2003. Plant diversity , soil
microbial communities , and escosytem function: are there any links? 84:2042–2050.
71
ANEXO A. Parámetros fisicoquímicos en los usos de suelo seleccionados para evaluar el efecto de
los métodos de purificación y extracción del ADN. Se presenta el promedio ± 1ds de los dos
eventos de muestreo más las diferencias fisicoquímicas evaluadas por Tukey.
Propiedades
Pastura
SS
fisicoquímicas
Bosque
Convencional
Clase textural
Franco arcilloso
Arcilloso limoso
Franco arcilloso
Arena (%)
33.57±2.72 A
10.14±1.27 C
25.98±7.38 B
Limo (%)
39.61±2.06 B
48.71±2.04 A
39.53±7.11 B
Arcilla (%)
26.82±1.52 C
41.15±2.37 A
34.33±3.59 B
DA (g/cc3)
1.35±0.07 B
1.50±0.04 A
1.21±0.11 C
RP (Kg/cm2)*
3.39±0.45 B
4.08±0.22 A
1.70±0.28 D
pH
6.93±0.32 B
7.12±0.36 B
7.6±0.52 A
15.06±2.69 B
13.89±2.42 B
23.07±2.13 A
C total (%)
2.49±0.23 C
3.12±0.20 A
2.84±0.38 B
C arcilla-1x100 (%)
9.29±0.78 A
7.82±0.70 C
8.23±0.89 B
N total (%)
0.24±0.05 A
0.21±0.04 A
0.25±0.05 A
12.93±9.59 A
10.61±3.28 AB
5.79±3.74 B
9.83±0.85 A
4.44±2.73 B
Humedad (%)
Nitrato (mg/kg-1)
Amonio (mg/kg-1)
7.13±4.86 AB
Fósforo (mg/kg-1)
93.56±52.39 A
76.48±38.26 A
(*): Los datos corresponden solamente al primer evento de muestreo.
101.04±60.83 A
72
ANEXO B. Estandarización de a extracción de ADN metagenómico de suelo del protocolo
reportado por Griffiths y colaboradores. Se evaluó 1) 5% CTAB -5% PEG, 2) 5% CTAB -20%
PEG, 3) 10% CTAB -5% PEG y 4) 10% CTAB -20% PEG. Se encontraron diferencias
significativas en la recuperación de A) ADN (P=0,007) pero no en la B) purificación (p>0,05).
A
35
30
DNA (ng/uL)
25
20
15
10
5
A
B
B
B
2
3
4
0
1
Tratamientos
B
0,14
0,12
Abs (320nm)
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
1
2
3
4
Tratamientos
73
ANEXO C. Representación gráfica de la calidad de las secuencias, de 250 pb, obtenidas de 72
librerías secuenciadas en la plataforma Miseq de Illumina para la evaluación del efecto de los
métodos. El parámetro de calidad se presenta en un intervalo de 0-40 graficado en el eje Y. Se
muestran las secuencias en sentido A) forward, B) reverse y después de ser C) ensambladas.
A
B
C
74
ANEXO D. Diagrama de flujo y parámetros por defecto para filtrar los datos crudos (secuencias)
en la herramienta bioinformática QIIME.
75
ANEXO E. Resumen de los resultados del número de secuencias conservado por cada muestra
después de filtrarlas por los parámetros de calidad.
Resumen de los resultados
Media de la longitud de las secuencias: 249.00
Muestra Secuencias Muestra Secuencias
SKP3
179.615
RPK2
107.597
SK1
169.670
RPK3
107.593
SP3
165.253
PP2
106.861
SP1
164.707
BK2
104.903
SPP1
162.816
BKP1
104.865
SP2
162.766
BP1
103.724
SKP2
162.236
RBPP1
102.550
SKP1
157.623
BP3
100.759
SK2
151.231
BKP3
96.356
SK3
142.173
PK2
94.142
SPP2
140.635
PK1
92.310
PKP3
135.140
PP3
91.806
PPP3
133.875
RPKP2
87.759
PPP1
133.840
RPK1
86.718
SPP3
124.868
RPPP3
85.125
PPP2
122.230
RPP3
84.127
PP1
121.286
RSP1
84.021
BPP2
120.112
RPP1
81.864
BK3
118.532
RBP1
80.098
PKP1
117.692
RSKP2
79.447
PKP2
112.340
RSPP1
79.057
BK1
111.923
RPKP3
78.637
BPP1
110.806
RSP2
78.416
BPP3
110.348
RPP2
76.458
BP2
109.774
RBKP1
76.421
Número total de secuencias 7.232.405
Muestra
RBP2
PK3
RSPP2
RPKP1
RBKP3
RBKP2
RSKP1
RSK3
RSPP3
RSKP3
RSK1
RSP3
RBK2
RBK3
RBPP2
RBPP3
RPPP2
RBK1
RSK2
RBP3
Z(Pse)
RPPP1
BKP2
Secuencias
76.159
75.553
75.238
74.754
73.971
73.963
73.462
72.683
71.695
69.656
68.703
68.485
68.192
67.644
67.041
63.053
61.336
60.402
58.612
58.292
56.423
52.858
31.125
76
ANEXO F. Representación gráfica de la calidad de las secuencias, de 250 pb, obtenidas de 27
librerías secuenciadas en la plataforma Miseq de Illumina para la evaluación del efecto de los usos
de suelo. El parámetro de calidad se presenta en un intervalo de 0-40 graficado en el eje Y. Se
muestran las secuencias en sentido A) forward, B) reverse.
A
B
77
ANEXO G. Resumen de los resultados del número de secuencias conservado por cada muestra
después de filtrarlas por los parámetros de calidad. El número inicial de secuencias era 11.910.693.
Numero de secuencias por muestra
Media de la longitud de las secuencias 251.00
Muestra
Secuencias
HS3
511.018
Comunidad artificial
305.618
Cepa puraT30B
252.829
HP1
220.579
Cepa pura T30A
212.500
HS2
198.497
HB2
197.811
HB3
196.267
HS1
176.316
HB1
173.871
HC01
170.412
HC03
163.585
HP2
148.350
HP3
139.367
LC02
138.713
HCC1
132.874
HCC3
131.704
HC02
126.342
LP2
124.296
LP1
119.306
LP3
115.016
LS3
114.378
LCC1
106.692
LC03
104.538
LCC3
102.622
HCC2
95.286
LS2
82.981
LS1
32.304
LC01
31.304
LCC2
10.733
Total de secuencias 4636109
78
ANEXO H. Establecimiento del número mínimo de secuencias que debe contener un OTU para ser
considerado OTU único A) Sin filtro, B) 10, C) 30, D) 50 y E) 100. Las comparaciones se
realizaron con las secuencias de las muestras de la comunidad artificial (12 OTUS esperados Rojo), Cepa pura T30B (1 OTU esperado - Naranja) y Cepa pura T30A (1 OTU esperado - Azul).
79
ANEXO I. Comparación de índices de riqueza y diversidad de cinco usos de suelo muestreados en
dos fincas separadas geográficamente en el Valle del Cauca. Se muestra el promedio.
Índices de diversidad
Muestra
Bosque
Caña
convencional
Caña ecológica
Pastura
Silvopastoril
Finca
Hatico
Lucerna
Hatico
Lucerna
Hatico
Lucerna
Hatico
Lucerna
Riqueza (OTUS)
Shannon
Distancia
Filogenética (DP)
2012,60
2152,57
2051,30
2296,70
2150,00
1987,27
2008,80
2080,53
1887,70
9,67
9,99
9,82
10,05
9,91
9,69
9,72
9,71
9,52
116,23
122,16
117,64
130,88
123,74
113,96
118,33
119,26
111,85
80