ברוםטוגרפיה הידרופובית בחקר אנזימים המופקדים על המטבוליזם של גלי קו ק
l l l l l
7 7
ברוםטוגרפיה הידרופובית
בחקר אנזימים המופקדים על המטבוליזם
של גלי קו ק
חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה
מאת
צב• אראל
הוגש למועצת המדעית ׳ויל מכוו *»1מן למדע .רחובות
מרץ975 ,י
אדו״ ,תשל׳ה
ברומטוגרפיה הידרופובית
בחקר אנזימים המופקדים על המטבוליזם•
עול Aליק וגן
ח״בור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה
מאת
צב• אראל
ח«ש למועצת המדעית של מנון ו»»מ 1למדע ,רחובות
א י ר ,תשל״ה
מרץ,
975ו
SYSTEM NO.
מס׳ מערכת
12003-2.
<VXf«
lit
יי י
.
..' ־
•: t \ \ K i t o
>Ctt*\i
עבודה
זו
בוצעה
לאימונולוגיה
מכון
בהדרכת
ויצמן
פוופ'
במחלקה
כימית,
למדע,
שמואל
רחובות,
שא ל ת י א ל ״
תודתי נתונה לפרופ'
שמואל שאלתיאל
על הדרכתו המסורה וההדוקה במהלך
עבודתי.
וכן לחברי הקבוצה והמחלקה שסייעו
לי כמיטב יכולתם.
תודתי נתונה לד״ר אברהם אמסטרדם
על עזרתו הרבה בחקר המבנה.
האולטדהסטרוקטורלי
ברצוני
של הקו.ל ונוח.
להודות לנאוה בשן
על מרצה הרב והתמדתה בבידודגל י ק ו
סינטתז
מכדוריות דם אדומות.
מבוא
.1
שיטות
.2
אנזימים
מטרות
כלליות
לבידוד
המופקדים
וניקוי
על
חלבונים
ה מ ט ב ו ל י ז ם של
גליקוגן
העבודה
ושיטות
חומרים
.1
חומרים
.2
שיטות
תוצאות
ס פ ר ו ז -ג ל י ק ו ג ן:
.1
תלות
.2
כושר
הקשורות
האומנם
הטפיחה
לספדוז
באודך
השוקווח
-
כרומטוגרפיה
בקולונות
הידדופוביות
.3
שימושים
.4
כרומטוגדפיה
הידרופובית
ק ו נ ב ד ט י ב י ל י ו ח של
אודות
מנגנון
אלקיל
אגרוזות
.5
כ ד ו ס ט ו ג ר פ י ה של
ה פ ע ו ל ה של
י
)!(
-
האליפטיות
הידרופובית
לבידוד
בחקר.הצורות
פוספורילז
אנזימים
האינטר-
וסינטתז
סדרות
אםינו
זיקה?
הומולוגיות
אלקיל
של
אגרוזות
יי י ז.
המעורבים
.1
הכוחות
.2
ת ר ו ם ת ם של
בכרומטוגרפיה
אפקטים
הידרופובית
אלקטרוסטטיים
בכרומטוגרפיה
הידוווונית
.3
אפקטים
.4
שימושים
הידרופוביים
מעשיים
0י כ י ם Vבעברית(.
י,
־־־־־־־־:.. T*T
ס פ ר ו ת־ "י
רשי^ת
קיצורים
ס י:כ ו ם
גלי
) בא ג
ת(
ב כ ד ו מ ט ו ג ר פ י ה של
בכרומטוגרפיוו
זיקה
הידרופובית
מ ב ו א
ש י ט ו ת
. 1
מחקר
כ ל ל י ו ת
ת כ ו נ ו ת י ה ם
ה ב י ו כ י מ א י
מ ג ו י .
ל ב ו ד ד
מ ש י מ ה
נ מ צ א
ב כ מ ו ת
ס ו כ ר י ם
ל י פ י ד י ם
ו ב י נ י ה ם
ב ת כ ו נ ו ת י ה ם
פ י
על
על
ב ע י ק ר
ה ב ד ל י ם
ש א י נ ם
ח ל ב ו נ י ם
ה מ ב ו ק ש ,
ו ע ל ו ל י ם
נ ס ק ר ו
)•(1
על
ה ב ד ל י ם
במשקל
ב ס פ ר ו ת
ה ש י ט ו ת
ח ל ב ו נ י ם
על
ח ל ב ו נ י ם
ה ש י ט ו ת
ה מ ו ל ק ו ל ר י ,
מ פ ו ר ט
ה ק ל ט י ו ת
ב ש י ט ו ת
ס ק י ר ה
מ פ ו ר ט ת
ה כ ו ל ל ת
נ כ ת ב ה
ע ״ י • ( S o b e r et al (4
ח ל ב ו נ י ם
על
פ י
ה ק ל ט י ו ת
ב י צ י ב ו ת
ב א ו פ ן
ש ו נ ו ת
פ י
מספר
ע ״ י
כן
בה
ה ד ר ו ש
ה ח ל ב ו ן
ל פ ו ל י -
ל מ צ ו ת
של
רב
ל ה י ו ת
להמצא
ה ו א
קשור
יש
מ ס פ ר
ע ל ו ל י ם
של
ה ש ת נ ו
ה ב ד ל י ם
רב.
של
ש י ט ו ת
ד י ו ן
מעט
ל ב י ד ו ד
מ ר כ י ב י ם
ה ע ו ל ה
ב כ מ ו ת
הרבה
ת י א ו ר ט י
-
ה כ ר ך
ה מ ו ל ק ו ל ר י
מם'
ב ש י ט ו ת
22
של
ה ש ו נ ו ת .
, pII
ה ב י ו ל ו ג י ו ת ,
נ ז כ י ר
בשיטת
ע •יי
על
ה
כסה
כאן
-
ג ב י
ק ו ל ו נ ו ת
, ( M o o r e and Stein (3
ח ל ב ו נ י ם
ו מ ע ש י
ו
מ ב ו ס ס ו ת
ם Von Travel and Signer .
ח ל ב ו נ י ם
ל ה פ ר ד ת
ח ל ב ו נ י ם
פ ע מ י ם .
ש ו נ י ם
ת ו א ר ה
במשך
ו ב ה כ ר ו י ו ת
חלב ו נ י
שתי
בשיטת
ו ב ד י ק ת
השקעת
נ ק י ו נ ם
ח ל ב ו נ י ם
(»
Dixon and Webb
( 5
ע ל ג ב י ק ו ל ו נ ו ת נ ס ק ר ה ע ״ י • ( P o r a t h (6
ב ה פ ר ד ת
כ ו ל ו
( M e t h o d s in Enzymology (7
ה פ ר ד ת
משקלם
א ו ת ו
ד ו ס י ם
ט מ פ ר ט ו ר ה
ב צ ו ר ה
ה פ ר ד ת
ב מ ט ע ן
אך
ל ש י נ ו י י
•(Countercurrent Distribution
ע ו ס ק
או
ה מ כ י ל י ם
ה פ ר ד ת
על
שהוא
ק ו ו ל נ ט י י ם .
מ ס י ם ו ת ם
פי
ח ל ב ו נ י ם
א ח ר י ם .
א ח ר י ם
ב מ מ ס י ם
נ כ ת ב
שכן
ה ח ל ב ו ן
אלה
ל ב י ד ו ד
ו ב ע י ק ר
Salting Out
הרבה
ת ר ח י ף
ס ת ו ך
ב י כ ו ל ת ו
הרקמה
של
ז ה .
ה ח ש מ ל י ,
ח ש ו ב ו ת
סקרו
ה
ה ב ד ל י
הפרדת
ת מ י ס ה
ל ח ל ב ו ן
מ ס י ס ו ת ,
ה ה פ ר ד ה
ס ק י ר ו ת
(2
ח ל ב ו נ י ם
או
א ח ר י ם .
ה א ח ר ו נ ו ת
ב מ ט ע ן
ש י ט ו ת
ב ק ש ר י ם
ב י ן
כ ל ל ,
ח ל ב ו נ י ם
ח ז ק י ם
השאר
נ ט י ב י
פשוטיה
ה מ כ י ל ה
עם
ת ל ו י
ב מ ג ב
א י נ ה
כ ק ו מ פ ל ק ס
ה ב י ו כ י מ י י ם
ה ש נ י ם
ה מ ב ו ק ש
ר ב י ם
מתקבלת
ח ל ב ו ן
ה ח ל ב ו נ י ם
ברקמה
ה פ י ז י ק ל י ו ת
ה ע ק ר ו נ ו ת
עשרות
ב ל ב ד
ו כ ו י
ו א ז י
הרבה
כמה
ה ח ל ב ו ן
ל פ ע מ י ם
הרקמה
של
ב מ ק ר י ם
ז ע י ר ה
ה מ ב ו ק ש
ו ג י ק ו י
ו ם ב נ ם
את
זו
מ צ ו י
מ ת ו ך
ל ב י ד ו ד
ו ז ל ב ו ג י ם
ח ל ב ו נ י ם
כפו
2
א.
קולונה
פתוח
חומרי
שיטת
הברומטוגרפיה
ה ר ו ס יTswett(8
המדען
התפתח
במרכז
אשר
המחקר
במסננים
ויוצרים
משיקולים
במימדים
כ י ניתן
ו
100
בשבדיה
Tiselius
סביב
נבעה
הוצע כי
קולונות
דלתונים
גדולות
חלקית.
לקולונות
ספציפית
ותלמידיו
) (9י
תחילת
חומרי
אינם
תווך
מסיסים
תווך
והזרימה
מולקולות
על פי
על
קולונות
הנובעים
לתנופת
מתאימים
בטמפ'
ראשוניים
תווך
דרך
זה
עמילן
מורתח
חלבונים
מטענים וכן
).(10
הראו
המולקולרי
המולקולריים.
בהפרדת
מנוכחות
שמשקלן
חדר
תלויים
( L a t h e and JSuthven
מימדיהן
עמילן
אשר
לראשונה
מחקר
כחומרי
הדיפוזיה
חסרונות
זכתה
ע״י
רצינית
למצוא
הטבעיים,
שמשו
פותחה
A,
מהצורך
עמילן,
להפרדה
אשר
המאה
ה מ ק ר ו מ ו ל ק ו ל ה)• ( H(12
י ו ת ר ניתנות
םפיחה
קולונוח
ס מ י כ י ם )כמו העמילן(,
1,000
לא
במסננים
בתחילת
הפוליסכרידים
ל ה פ ר י ד על
-
על
( M .
תיאורטיים
של
גבי
מולקולריים
ל א ל קט ר ו פ ו ר ז ה .
גלים
הפועלים
מולקולריים
בין
מולקולות
שעבר
בגלל
דגרדציה
אפקטים
מתכונות
של
זרימה
לקויות.
העיקרית
התנופה
מולקולריים
דקםטרן
.><1-1,6
הגדלות
יותר
את
באה
הוא
עם
ע"י
תמיסת
טיפול
החדירות
)אפוקסיד
של
בדקסטרן
להפרדת
מלחים
להפריד
דקםםרנים
(15
משקל
סוכר.
הדקםטרן
כדי
מולקולות
הוצע
הבנוי
מולקולרי
בחומצה.
המסוגל
לחלבונים
השמוש
חלבונים
בדקםטרניס
פולימר לינארי
לפולימר
על
להפרדת
לקשור
לראשונה
מולקולות
מים
גבוה
ע"י
של
,(Porath
על פ י
נ ו ב ע ת מ ה וי* ר ו ת ם
מחוץ
לגרגירים
נמצא
פתוח
הכרומטוגרפיה
הם
הציעו
חלקיקים
ומים
עם
כי
הנמצאים
מקטינים
השימוש
כשיטה
על
נעשה
באופן
מעשי
ע ״ י, ( P o r a t h(14
ההפרדה
בתוכם מ י ם .
בתוכם.
מתאימה
י ד ם כ י ניתן
השיטה
יכולת
הכולאים
קטנות
(epichlorhydrin (7
דקסטרן זו ל ז ו ( .
משקלם
בקטריות
מולקולריים
כן
בקשרי
לחיתוך ליחידות
ריאקציה
המולקולרי.
במנגנון
הקשורות
מ ו פ ר ש ע" י
מסננים
םתלבונים
של
של
.(Cross linking
צלוב )
גלוקוז
ה נ ט י ב י ניתן
בדומה
תיאורטי
קשרי
והוא
לדיאליזה.
ודיון
הזורמים
מיחידות
יand Fiodin(13
( G e l o l t eו • ( F i o d i n(16-
הדקסטרנים
קולונות
שעברו
ליצור
הדקםסרן
ע״
על
הפועלות
במסננים
חלבון
של
קיפים
מומם
אשר
-
אינו
יכול
ואילו
אחרת
מסיבות
חלבון
החלבונים
החלקיקים
חומרי
אינן
המולקולרי קטן א ו
מ ע ט מאוד
לפיכך
מסוגלים ליצור
למולקולות
חדירים
פ ו לימר
ו שימש ל ג י ד ו ל
גלים
בתמיסה מימית
בסמפ'
מולקולרי
גבוה.
ל הפרדת
יצ י ב
ה א ג רו ז
ש ל ה א גר ש ב ה
הא ג רו ז
האגרופקטין
זה מכיל
של
ל -
הופך
להפריד את
אגר
כמות
קטנה
גרגירי.
. m e s h
60
להפריד
האגד
םונן
בתמיסה
C. Araki
ואגרופקטין.
מהגרגירים שנאספו
וריבונוקלאז(.
הפרדה
טובה
פולימר
אחוז.
להפרדה
ה א ג רו ז
C.
פת ח
ה א ג ר ) 18ו ז
אצ י ל צ י ה
מהאגרופקטין.
שיטה מיגעת
חורים
ערבוב
וארו כה.
האגר
עם
ומעלה שוקעת
תרכובת
בנקל )•(19
אגרוז
פיתח
הולכים
קולו נ ו ח
וקטנים
ק ו ל ו נ ו ת ,וניחן
)למשל
ס ו כ רי
השיטה כ ו ל ל ת
ומופרד
הוכנו
המולקולרי
ט-.גלקסוז
Araki
מ ה א ג ר ע"י
בעלי
מ א צו ת
אשר
בכמות
זוהי
אשר
יהיו
הופק
גבוהה.
C45°
במסננים
משקלם
לעיכול
פ ו ל י מ ר זה
מ א ו ד ש ל ג ו פ ר י ת ( P o i s o n (20 .
ח ל ב ו נ י ם ע ל יע י
המוגלובין
האגרוז
.
והאגרוז
בעלי
היה
) ה פ ר י ד את
המקורי.
נשאר
עמידות
מתחלפות של
מ ס י ס וניתן
האגרו ז
גלים
מעבדה
ע״ י
ת ו ו ךב א ל ק ט ר ו פ ו ר ז ה .
לבלתי
הקולונות
החדר ו ע ם זאת
האגרופקטין ה נ ו
מהאגד
ו פ קט י ן Hjerten
c e t y l p y r i d i n i u mב ט מ פ ' של
זו
וחוסר
אגרוז
במים כבד ב ריכוז של 1
מביאה לקבלת
Hjertenמ צ א כ י ניתן
עם
עיקריים:
המורכב מיחידות
בשיטה זו והשתמש ב ו כחומר
chloride
גב ו ה ה ב פ נ י
מ רכיבים
עם זאת
גבוה.
חיידקי
ו ת ג ו פ רתי ו ת ו ק ר ב ו ק ם י ל י ו ת
קבוצ
מסוגל ליצור גל
ד ד - .א צ י ל צ י ה
נמוך
אל
בחיפוש אחר פולימרים נוספים
- Lג ל קט ו ז ) . ( 1 7
אנהידרו
מסועף המכיל
שיטה
משקל מולקולרי
נ ח ק ר באו פ ן א י נ ט נ ס י ב י
אגרו ז ה ו א פ ו ל י מ ר ל י נארי
ו -
לשימוש נרחב.
ת י י דק י ם ב מ עב ד ה כב ס י ם ל ק ר ק ע מ ז ו ן .
ה א ג ר מ ו רכ ב מ ש נ י
6 ,3
ענין
ב ע ל ע מ יד ו ת
ב שם אגר-אגר והוא
מ צ א כי
תלויה לכן
בצפיפות
קשרי ה צ י ל ו ב .
חוזק מיכני
משקל
הפרדה.בין
לבין א ל ה א ש ר
בעלי
התעורר
תתקבל
מולקולרית
מסוגלים
ה ה פ ר ד ה זבו
בעלי
בעלות
םוכרי
תרכובת
נשטף מ ה ר
נמוך
החוצה
לחדור
ההפרדה
חלבונים
צ י ל ו ב הם
בקטריות.
ידוע
לחדור
ושיטות
בהפרדת
קשרי
החלקיקים
ה ח ל ק י ק ו י ע ו כ ב ו .ע"י כ ך
מסוגלים
קולונה אלה
יהיו
לחדור אל ת ו ך
ולהתעכב על ידם.
יעילות
ע"י
תוך
שאינם
3
סטריות
שמשקלו
יחדרו א ל
-
הפרדה ב י ן
ביניהם מצא
Poison
היה
המוציאנין,
בגלים
-
-
4
•ו
שיל fo7ואילו
טען
בגלים מרוכזים יותר היחה ההפרדה גרועה.Poison
שההפרדה תלויה יותר בקבוע הדיפוזיה ופתות במשקל ה מ ו ל ק ד ל ר.י..
חסרונן של קולונות אלה הוא בכך שהאגר מכיל מטענים רבים
Hjerten
את צורת ההפרדה.
).(21
בריכוזי גל שונים
האגרוז בגל:
תמונות
פתר בעיה זו ע" י
הוא מתאר את תלות
ככל שהאחוז גבוה יותר כך
שימוש בקולונות אגרוז
Bfשל החלבונים באחוז
מתקרב ל -
r?f
ריכוז נמוך של אגרוז
בקטריופגיים
מלתים.
לבין
הצליח
חלבונים אחרים ,בין
שיטת ההכנה של גרגירי
Hjerten
האגרוז שופרה ע״ י . ( H j e r t e n (22
המכילה נוזל אורגני בלתי מםיס במים,
מ י ם בתוך אמול טית שמן ולאחר
ה ח ומרים
רתיחה אמולסיה
למשל פחמן טסרה כלורי וטולואן
. Sorbitan sesquioleale
חידרופובי כמו
להפריד בין
ריבוזומים ,ובין תאים לבין
בשיטת ההכנה המשופרת מוסיפים לאגרוז מותך בטמפ'
קירור נ וצרים
האגרוז מתנהג כטיפות
כדורים מושלמים.
האורגנ י י ם מ סו לקים והתלקיקי ם עוברים סינון לפי גודל.
בשיטה זו
מהקב לים ח ו מ ר י קולונה בעלי זרימה טובה ועמידות גבוהה.
א ג רוזות המוכנו ת בשי ס ה זו משווקות כ יום באופן מסחרי.
Hjerten
ל
.1
על סמך
ההפרדה הוא טוען שההפרדה מתבצעת על פי המשקל המולקולרי.
בגלים בעלי
ומיצב
המעוותים
ד
and Philipson
Beugtsson
הצל ח ו
במקביל
) ל ק ב ל פנינים )23
כ ד וריוח של אג ר» ב אחו ז אגר נסוך ,ע" י התזת אגד בלחץ גבוה דרך
כדורי הא גר הנוצרים מידית שוקעים
נ ק ב דק לתוך את ר ק ר מ א וד.
ר
הכדורים מ ו עבר ם אל פאזה מימ ית ועוברים סינון לפי גודל.
ב א תר.
ב א חוזי גל נמו כים התק ב לה זרימה טובה אשד אפשרה הפרדה בין וירוסים
ל את ר ו נ ה ה תרבו
העדויות על ה hמו םם ו ת ח לקית של אגרוז תוך כדי
שימוש רצוף ב ק ולונות.
בכמות
קטנה.
ולצמצום
צילוב
al
המטענ ים
Porath et
השי טה כוללת יצירת קשרי
לאחר החזור
epichlorhydrin
בצורתו ה כדור י ת ע" י
אצטי לצ י ה של ה כ דו רי ם
התוצר לממס או רגני שבו
גבוהה.
) (24הצי ע ו שיט ה לביטול ההתמוטטות
בכדורי אגר ו א גרוז .
באגר או באגרוז
בסביבה מחזרת
כמו .כן נ מצ א שאגרו ז עדיין מכיל מטעני ם
מבוצ ע חז ו ר כ
אצםיל
-
4
L i A1H
מבוצעת דאצ טילצ י ה ע" י בסים
כלוריד והעברת
בטמפרטורה י חסי
בסביבה מחזרת 0
נ ו ת ו הוא בעל תכונות זרי מה
נמצא כי גל ז ה מכיל פחות קב וצו ת ט עו
טובות וחוזק מכני רב־
המולקולרי
של
ניתן לקב ל ה פרדה י ע ילה על פי
המקרומולקולות
«
המשקל
5
ב.
שפעו ל
רב-םוברים
קישור
מסיסים
הבעיה
בלתי
קוולנסי
זכה
של
לאחרונה
הטכנית
מסים״
בלתי
מסיסיס
חומדים
לקשת
המגבילה
בעלי
רחבה של
השימוש
את
נושא אידאלי
חייב
)א(
עליו
להיות
בלתי
)ב(
עליו
להיות
יציב
באופן
)ג(
היווופילי.
)ד(
במידה
באופן
מספקת
אופטימלי
כדי
את
ציאגוגן
תפקוד ביולוגי
שימושים
בשיטה זו
ל מ ל א אח
םםיס
חדיר
ע״י
שסח
הלידים
לנושאים
בביוכימיה
היא
).(25
בחירתו
התנאים
בלתי
של
נושא
הבאים )-:(26
לחלוטין־
מכני
)בלתי
שהמדלקולות
המגע בין
דחיס(.
המגיבות תוכלנה
חומר
הקולונה
לנצל
למולקולות
הפגיבוח,
צורתו
הפיזיקלית
)ה(
)בדרך
כלל
צורתו
)ו(
ע ל יו
לה י ו ת
)ז(
ח י י בת
בלתי
טע
דרך
כי
לה מ צ א
לנ ו ש א א י ד א ל י
נ ו ת יה ם
מת כ ו
כאלה פ ו ת ח ה
מסיסים
השיטה
חלקיקים
זכ תה
אשר
)(1
ל שי מ ו ש
ת ג ו בת
)(2
הגב ת
ו כ ו י(
כזה
ע"י
נרתב
רב-הסוכ
ב ת נ אים
בסיסיי
תוצר
הבי
במדיום
י ח ס י ת ) - 250C
התנאים
נ מ צ א כ י נית ן
הבאים:
כדוריים(.
ה ק ו ל ו נ ה שפ י ת ו ח ם ת
חומרי
בלתי
חייבת
לאפשר
זרימה
מ ה י ר ה של
נוזל
דרכו
ה ניסוי ים
לריאקצי
לקשור בשיטה
צ ל ו ל וז ו נ גז ר ו ת י ו,
זו
ספ
השיטה
Ernback
הכימית
להפעלת
Porath and
וב-סונוים
Axen,
)(28,27
6
אנזימים פ ר ו טא ו ל י ם י י ם כ כ י פ ו ט ר י פ ס י ן ,םריפסין ,פפאין רבן
נקשרו
פפםידים
כגליציל-לאוצין.
של המדיום.
נמצא כי שתי
שפעול אופטימלי מתקבל
בסמוך ל 11 -
. pH
תוך דקות ספורות.
ב -
שעות
ב -
pK
בסיסי גבוה
pHזה מסתיימת מרבית ריאקציה השפעול
גם ריאקציה הצימוד דורשת סביבה בסיסית.
היעילות רבה יותר ככל שה -
)0(72
הריאקציות תלויות ב pH -
pHגבוה יותר והריאקציה נמשכת מספר
מבין ה צ י א נ ו ג ן-ה ל י ד י ם נמצא כי
לשימוש מבחינת משך הזמן שבו
הברומיד.נוח ביותר
מתבצע השפעולand Vretblad(30.
( A x e n
חקרו את הכימיה של הריאקציה ע ״ י אנליזה של הספקטרום באינפרה-אדום
אנליזה אלמנטרית של חלק מהתוצרים ,והציעו אח הסכימה דלהלן
וע״י
מם' .(1
)תמונה
של ציאנט.
הידרוקםיל
הוצע שתוצר השפעול בסביבה בסיסית הוא בעל מבנה
ציאנטים אליפטיים הם פעילים מאוד ,מגיבים עם קבוצת
סמוכה ונותנים טבעת מחומשת של א י מ י ד ו ק רב ו נ ט .
יכול גם להגיב עם מים ולתת כתוצר קרבמאס.
גם
האיםידוקרבונטים להתפרק ולתת
הציאנט
בתנאים בסיסיים יכולים
קרבמאטים .יי הפבעח המחופשת של
ה א י פ י ד ו ק רב ו נ ט י ם משתתפת כנראה בריאקציה הצימוד״
היא מגיבה עם
קב וצות אמיניות ראשוניות ובלתי מיוננות )ומכאן התלות ב pH -בסיסי(,
הריאקציה הם לפי הצעה
תוצרי
אימידוקרבונט ונגזרוח
ז ו ,נ ג ז ר ו ת איזואוריאה ,נגזרות
קרבמאטים.
הכסוח היחסית של תוצרים אלה
לא נקבעה.
לשיטה יתרונות רבים :שלב השפעול מתבצע בתנאים שבהם נשמרת
צורתם של חלקיקי הגל;
בשלב הצימוד שומרים
רב-הםוכר על מרבית פעילותם.
חלבונים הנקשרים אל
)הפעילות הספציפית של האנזימים
הקשורים נשמרת עד כדי ^ 90לעומת מצבם המסיס(et al (31 .
קשרו
כיפוסריפםין לםפדקם G-200
המוצקה
ע"י הפעלח האנזים
( A x e n
ולאחר מכן מוססו את המטריצה
דקססרנאז.
הם הגיעו
למסקנה כי פעילותו
הנמוכה של האנזים הקשור למטריצה המוצקה ביחס לאנזים המסים נובעת
מקשיים
)עקב
בדיפוזיה ומהפרעח המטריצה המוצקה בריאקציה האנזימתית
הקבוצות היוניות(.
כאשר מפעילים את ה ם פ ד ק ם בכמות קטנה של
ציאנוגן
בדומיד מקבלים לאחר ההם ס ה את מלוא הפעילות של האנזים
הקשור.
כפו כן ,עקומת הפעילות אשר בדרך כלל מוםסח לכיוון הבםי-סי,
ד
0
CNBr
|־OH
2 ־0־C"N
Carbamate (non -reactive)
4-OH
4*
1־°
Imidocarbamate
|-0-?־NH
NHg^-O-C-NH-^T *
|־0H
N-substituted
Carbamate
(reactive)
K1H
2
A/-substituted
Imidocarbonate
|־
0
NH
2
H
Jsoureo
derivative
1 חמו נ ה פסי
םו כרים-אפשרי לריאקציה הקשור של חלבונים ופפםידים לרב
.ברומיד
בציאנוגן
מנגנון
המשופעלים
8
שבה למצבה הנורמלי.
( W i d e et al (32
-
ריאקציה הקישור אשד תוארה לעיל נוצלה ע" י
לפיתוח קביעה רדיואימונולוגית של אנטיגנים ע" י
קשירת נוגדנים לכדורי םפדקס.
ובאמת ,ניתן לקשור חלבונים ולא רק
לשמור על פעילות ביולוגית ,אלא אפילו
מבנה ומנגנון
ג.
לחקור שאלות יסוד בקשר שבין
הפעולה של אנזימים ).(33,34
החפחחותה של הכרומטוגרפיה של זיקה
כרומסוגרפיה של זיקה
ה י א ש י & ה לבידוד חלבונים המבוססח על
יכולתן של מקרומולקולות ביולוגיות להתקשר לליגנדים בלחי מסיסים
באופן
ספציפי ורברסיבילי .כאשר הליגנד עצמו הוא בלתי מסיס ,או
למצות את המקרומולקולה
כאשר הוא קשור לנושא בלתי סםיס ,ניתן
מתערובת של תלבונים רבים אשר אינם מתקשרים באופן
ספציפי עם הליגנד.
השיטה פוחחה כבר בתחילת שנות החמישים ע" י( C a m p b e l l et al(35
כאמצעי
לבידוד נוגדנים ספציפיים והפכה לשיטה סטנדרטית
באימונולוגיה
הוא מצא
) ( L e r m a n(36•(25יישם עקרונות אלה בבידוד אנזימים.
שאם קושרים צבעי אזו )המעכבים את האנזים טירוזינאז( לצלולוז ,ניתן
להשתמש בצלו לו ז המוחמר כדי לםפוח באופן ספציפי אנזים זה.
זו נוקה האנזים באופן
זו הונחהLa IIaba(37
פוספורילז
פרפרסיבי.
שמונה שנים לאחר פרסומה של עבודה
( D eע"י רעיונות זהים ופיתח שיטה לבידוד
ממיצוי שריר.
הוא חומר בלחי מסים.
מימי של שריר ארנבת;
במקרה זה הליגנד עצמו )עמילן
תפוחי-אדםה(
קולונה של עמילן ספחה את הפוםפורילז ממיצוי
והאנזים ניתן היה לאלוציה ע״י שטיפה בתמיסה
של גליקוגן מסיםand McCormick (38 .
צלו לו ז לבידוד האנזים פלבוקינאז.
בפלבין-םונו-נוקלאוטיד
( A r s e n i sהשתמשו
בפלבין-
אנזימים נוספים התלויים
כקופקטור בודדו
פוספט קשור ל צ ל ו ל ו ז ( M c C o r m i c k(39.
ע ל ק ו ל ו נ ה ש ל ריבופלבין
בודד אוידין שהוא חלבון
הקושר בחוזקה ביוטין ע"י שימוש בביוטין
קשור לצלולוז.
לחומר הקולונה צלולוז יש כמה חסרו נוח בהיותו
בלחי אחיד
במבנהו ובעל חדירות נמוכה למולקולוח גדולוח בחלבונים.
הכימיות
בשיטה
לנגזרות צלולוז שהוצעו בעבר לא היו
לוותה לעתים באפקטי״ם של םפיחה בלתי
הקשירוח
פשוטות ,ו הכר ו פט ו גרפ י ה
ספציפית.
הכנסתו של האגרוז
9
כנושא
בלתי
השפעול
םסיס
בציאנוגן
קישור
ואילו
עצמו.
הליגנד
חומרי
בעלי
תכונות
ספציפית
של
t
(
a
l (40
פתרה חלק
e
ישירות
זרימה
אך
הקולונה
אמינוקפרואיח
םפיחה
העברת
מעכב של
חאר
די-אמינים
וחיבור
אגרוז,
הקרבוקםילי
כמה
הפרעות
ללא
להיות
את
מאפשרת
מקובלת
בידודם
גם
שיטות
או
NADע ״ י
חומצה
3
פוספט
וניתנים
.2
מורכבת
אנרגיה
דהידרוגנאז
האנזימים
לשעת
תירום.
לספרוז
).(46
דהידרוגנאז
ה מ ט ב ו ל י ז ם של
בקרה
,
ע״י
זו
תופעה
ו ח ל ב ו נ י ם ע" י
חומר
אל
קשירת
הקולונה
הדחקת
הליגנד
כדי
כ י
הקשירה של
עבודות
והפכה
),(44
בעקרונות אלה
ו ח ל ב ו נ י ם
חלבונים
אפשר
כנוקלאז
פ פ ם י ד א ז A (40
שרשרתי
האנזים
(
אחרים
כאוידין
,
)•(41
קופקטורים
צ ד ד י ת של
כ
AMP -
שייר
אנזימים
כגליצראלדהיד
נספחים
אלה
ל ק ו ל ו נ ו ת
נוסו
ספציפיים.
המופקדת על
בעת
וקרבוקםי
על
או
חלה
האמיני
השימוש
אנזימים
החומצה
החופשי
בכמה
קופקטורים אלה ד ר ך
בתנאים
לתהליכי
זיקה.
הקולונה
או
א נ ז י מ י ם אשר להם
ולאקטס
המופקדים על
הנתונה
ז ו
ו מ ס פ ר רב של
ל ב י ד ו ד ם של
אמינוקפרואית
החמצה
אנזימים
היתה
מתיל-אסטר(
אנגססרמים,
בהסתמכו
הודגשה
מ ס פ ר רב של
),(44
קשירות
לאלוציה
אנזימים
מערכת
כלליות
£,
להגיע
מספר
הקצה
Cuatrecasas
לקולונה ד ר ך
לאינטראקציה עם אתר
04כימוטריפםין
־ pג ל ק ט ו ז י ד א ז
£
חדירים,
שהועבר על
אמינוקפרואית,
מסקנחו
תיאוריה
ה מ ו צ ל ח של
המעכב
םובסטרטים אל
ב כ ר ו מ ט ו ג ר פ י ה של
מסטפילוקוקוס,
),(45
או
).(43,42
סטריות.
האנזים
.
הבלחי-
ס ו י פ ט ו ג ן
לאלוציה ע ״ י
לבידוד
חומצה
מעכבים או
אנגםםרםים
המקדים
הקולונה כ ד י
כלליות
יציבים,
להזנחה.
)D
-
פ ג ע ו ב ל י ג נ ד
).(41
נקשר
ניחן ה י ה
ו י ע י ל ה ,
הטפיחה
פ נ י ל -פ ר ו פ י ו נ א מ י ד .
שיטות
החופשי
ברוב
כאשר
מחומר
ה א נ ז י ם אשר
אליפטיים,
גבוה
מהירה
) (40ה י ו
נ ד י ד ת ו של
נספח.
האנזים
ז ו
לעיל.
מספיק שלא
> מ כ י מ ו ס ר י פ ס י ן
א ג ר ו ז .
והורחק
Cuatrecasas
בשיטה
נחנה
מעכב של
פשוטה,
עדינים
ו ק י ב ו ל
אחרים
האנזים לא
מלאה של
שהוכנו
הקשיים
היתה
בתנאים
טובות
חלבונים
קשרו
)(28,27
בוצע
הקולונה
לחומר
עוכבה,
ברופיד
ניכר מן
שתוארו
שיטת
פירוק
ג ל י ק ו ג ן
ו ס י נ ט ז ת
קפדניים.
מאמץ א ו
סכנה,
ג ל י ק ו ג ן
עובר
הגליקוגן ה י א
מהווה
הגליקוגן
בשריר
מערכת
מקור
תהליכי
פירוק
10
-
מידיים שבהם משתחרר סוכר פושפס המשמש חומר מוצא ליצירת אנרגיה בתהליך
האנזים המופקד על פירוק הגליקוגן
האנאירובי של הגליקוליזה.
ליחידוח
של גל ו ק ו ז-1-פ ו םפט הוא האנזים גליקוגן פוספורילז.
גליקוגן
»—+
e
פוספורילז מזרז אח הריאקציה הבאה:־
s
c
o
u
l
= +0.73 K c a l
,&G°
G
+ I
״
' ו ל ב ן היא רברםיבילית ופגיעה לשיווי
r־l״ P i /cשל 3.6ב H(48,476.8 -
פשקל ביחס
n
)(4PO1Glucose
p
(
.
פיקרופול של האנזים.
מסוגל בדקה אחת )בפצב הדיפרי( לייצר 3,000פיקרומול של סוכר פוספט).(49
הםופקד על םינטזת הגליקוגן הוא גליקוגן
האנזים
שייר סוכר פהנוקלאוטיד
גליקוגן
n+1
לגליקוגן
UDFG
סינטתז המעביר
).(50
סינסחז סזרז אח הריאקציה הנאה-:
) UDP - ( G l u c o s e
פ י כ ך היא מעשית בלתי
^
הפיכה,
n
)+ (Glucose
2 Kcal^ /
UDP-Glucose
.
•
מעונת נוספת של אנזיפים פופקדת על בקרת הפעילות של הפוספורילז
והםינטתז )תמונה מם' .(2
גליקוגן
א.
נדון
בתכונותיהם הפיזיקליות והכיפיות של
פוספורילז וסינטתז.
תכונות כימיות ופיזיקליות של גליקוגן
פוםפורילז
פוספורילז
האחת -
משריר ארנבת קיים בשתי צורות מולקולריוח.
פוספורילז bשהינה דימר בעל משקל מולקולרי 200,000דלתונים )(51
שאינו
פעיל אלא בנוכחות . A M P
טטראפר שמשקלו
הצורה השניה -פוספורילז £היא
הםולקולרי כפול והוא פעיל גם בהעדר
מכיל שייר פוספט אחד בכל פ ר ו' ט ו פ ר ).(52
לצורה
a.נעשה ע"י
קינאז
)•(53
. AMP
המעבר של צורת האנזים b
פוספורילציה אנזימתיח של החלבון ע"י
פוםפורילז
a
הטסראמר
הופך חזרה ל o -
פוםפורילז-
בריאקציה המזורזת
ע״י פוםפורילז פוספטז) .(54שתי צורות האנזים נתנות להפיכה
למונומרים ע"י הפעלת ריאגנטים כ -
או דפורםרים כאימידאזול ציטרט ).(56
לאסוציאציה
?-כלורומרקוריבנזואט )(55
סילוק ריאגנטים אלה גורם
פחודשת של התת יחידות לקבלת האנזים הנטיבי.
כל אחד
ATP
HORMONE
NON ACTIVATED
PHOSPHORYLASE KINASE
+
C
A
;
C
E
L
N
A
Y
S
L
GLYCOGEN
E
CYCLIC
SYNTHETASE D
AMP
CYCLIC
AMP-DEPENDENT
ACTIVATED
PHOSPHORYLASE
PROTEIN KINASE
KINASE
PHOSPHORYLASE b
GLYCOGEN SYNTHETASE I
PHOSPHORYLASE Q
GLYCOGEN
(n-1 glucose units)
GLYCOGEN
(n+l glucose units)
GLYCOGEN
(n glucose units)
2
המוגה מסי
האנזימים המופקדת על פירוק וסינתזה של גליקדגן
מערכת
.(ועל הבקרה )בסכימה לא מוצגות הפוספטזות
12
מן
הפרוטומרים
הקטליטי
האתר
של
האנזים
את
קושר
מכיל
מספר
הסובםטרטים
ג ל ו ק ו ז - 1 -פ ו ס פ ט ו א ינ הי בי ט ו ר י ם
הנוקלאוטיד
נקשר
אתר
נקשר
במעבר
האתר
גם
האנזים
הרביעי
( 3
הויטמין
מעורב
מצורה
הוא
בקישורם
המכי ל
את ר
הכימי
שיסו ת יעילות
אלה כ ו ללים
L
)
ה ח ל בי ן
אח
מ לו א
פיריד ו קםל
b
ו
של
a
רבות
,
ב.
אלה
ורצ ף
פירידוקסל
פוספט
אזור
ע"י
חומצות
ע בו ר
מופה
מיוחד
האמינו
פוםפורילז
האתר
המעורב
פוםפורילציה.
)אחת
בכל
מצורות
פרוטומר
ב ט ס ר ה ד ק ה פ פט י ד
משריר
) (58
ארנבה
באופן
כימי ) ( 5 9
והתכונות
אופן
של
הקופקטור
לח קר
מאתרו
דפורםצי ה ) ( 5 6
באנזים.
את
)אפופ וספורילז(
הקשירה
ע"י
א ח רי
הנטיבי
בתנאים
עדינים.
תנאים
הגורם
לתשיפה
ר ב ר ם י בי ל י ת
מחקר
חסר
עם
החאפשר
זה
ראגנם
הפירידוקםל
הינו
לחלבון,
שפ ותחו
הוספת
רקונםטיטו צ י ה
בעבודת
. a
אינם
מתנהלים
מם'
ונוצרים
(3
פוספט
קרבונילי
מן
פעילות.
כמויות
החלבון
ניתן
).(61
להחזי ר
םטכיומטריוח
של
ספציפי
לו
של
במצב
מחקר זו
יש
הפוספורילציה
בדרך
תוצרי
של
לא ינ ט רק ו נ ברסי ה
של
הכל או
ביניים
אשר
פוםפורילז
לא
b
כלום.
עברו
של
פוספורילז
והדפוםפורילציה
ראקציות
פוםפורילציה
אלה
הן
חלקית
).(63,62
כימיות
אנזים
נבדלות
שלישי
הסדין
הקרובה ) . ( 6 0
להרחיק
תהליך
תכונות
גם
בו פ ר
ניתן
מיוחד
שלבים
)תמונה
הוא
באותו
פוספט.
עניין
-
נמצא
האתר
האנזים״
העובר
האנזים״
הקופקטור
פוספס
פעילותו
אתר
של
הוא
בו
אחרים.
סבי בתו
הפעלת
המתקבל
אתר
האלוסםרי
קופקסור
נקבע
שים ש ו
להוצאת
ציםסאין(
£
נחקר
פוספט
ה א נ ז ים
הפי ר י ד ו ק ם ל
-
ובו
לפעילות
הםרינ י
של
האפקטור
הקושר
ממקורו ת
של
כגלוקוז.
נוסף
על.זה
לזה.
הפירידוקסל
ה ס פ קס ר ל י ו ת
-
אתר
זה
השייר
ו פ ו ספ ו ר י ל ז ו ת
אתר
b
השונים:
גליקוגן,
פוספט,
כאינהיביםור־
ל
הפוםפורילצי ה
את
ו ה א ופ י
הפועל
ה ח י ו נ י
G
אתר
AMP
ATP
שהוא
אהרים
המשפיעים
זה
)(57״
זה
ופיזיקליות
קיים
בשתי
של
צורות
גליקוגן
סינסתז
אי נ ט ר קו נ ברסי ב י לי ו ת״
הפוםפורילציה ו ב ת ל ו תן .ב אפ קט ו ר
צורות
ג ל ו ק ו ז-6-פ ו ם פ ט
1
3
Phosphatase
>
ם
—
י
מ
—
י
Glucose
<
Kinase
תמונה
שיווי
מסי
3
המשקל
הצורות
בין
עליהן.
ריבועים
קםליסית
ועיגולים
פלאים
מייצגים
םונוםרים
שעברו
ה ש ו נ ו ת של
צ ו ר ו ת של
מייצגים
מייצגים
מונומרים
צורות
שעברו
דהפוםפורילציה.
פוספורילז
האנזים
בלתי
שהינן
פעילות.
פוםפורילציה
והגורמים
בעלות
עיגולים
ואילו
המשפיעים
פעילות
וריבועים
הפתוחים
הם
-
14
לפעילות.
בשריר ארנבת ,הצורה שבה בל תת היחידות עברו
מכונה )1£
הצורה
והיא תלויה
תת היתירות אינן
בגלוקוז-6-פוספט לפעילות.
מכילות זרחן מכונה
הסוכר פוספט לפעילות )(§4־
פוםפורילציה,
שבהבל
, Iוהיא אינה תלויה בנוכחות
כאשר הצורה
Iעוברת לצורה
, D
כל תת יחידה שמשקלה המולקולרי 90,000דלתונים קושרת 6אטומי
לפי דעה אחרת ,תת היחידה בת 91,000דלתונים קושרת
זרחן ).(65
זרחן אחד בלבד ).(66
ע"י
מעבר האנזים מצורה
האנזים סינסתז פוםפטז.
המעבר מצורה
Dלצורה
I
I
לצורה
D
מזורז
מזורז
ע״י הקינאז המכונה . ( d A M P — dependent protein Kinase (66
הרקמות
קשור הםינטחז לגליקוגן בחזקה )(67,64״
במרבית
לאתר ניתוקו
מהגליקוגן הוא עובר אגרגציה המוגברת בטמפ' נמוכות ,ומלווה בירידת
פעילות ).(68
הקשיים המתעוררים בבידוד האנזים הביאו לכך שעד כה
נחקרו אך מעט מאוד מתכונותיו
הכימיות.
משקלו
המולקולרי של האנזים
הוערך ב 400,000 -דלחונים עבור הצורה ( I(66״
מיקרוסקופ
על פי תמונות
אלקטרוני הוערך משקל מולקולרי גבוה יותר ).(69
האחר היחיד בםינטתז אשר נחקר מבחינה כימית הוא האתר העובר
פוםפורילציה.
מפפטיד
פפטיד כימוטריפסי של םינטתז D
כימוטריפטי של פוםפורילזa(70
(
מראה הרכב שונה
; בעוד שהקםהפפטיד
המתקבל ע"י עיכול טריפםי הוא בעל סדר חומצות אמינו זהה לפפטיד
הטריפטי של פוספורילז
& ).(71
-
15
מסרות העבודה
הראשונית של עבודה זו היתה להשוות את התכונות הפול,קולויות
מטרתה
של אנזימי,מפתח במטבוליזם הגליקוגן:
משריר ארנבת־
סינטתז
וגליקוגן
בחיפוש אחר שיטת ניקוי לגליקוגן פוספורילז
םינטתז המבוססת על כרומטוגרפיה של .זיקה־ !,הוכנו
אגרוז-גליקוגן
אמינו
ע" י שפ עול גליקוגן
אלקיל אגרוז שבו
שקולונת
גליקוגן פוםפורילז וגליקוגן
האגרוז-גליקוגן
בציאנוגן
ברופיד והגבתו עם - >JJ
שרשרת האלקיל היא בעלת 8אטומי פחמן־
קשרה פוספורילז
b
קולונת
נמצא
באופן ספציפי והא נ זים ניתן
היה לאלוציה ע"י בופר רפורמציה איפידזול צ י ט ר ט »
ביקורת של
קולונות.
להפתעתנו ,קשרה
- {SOאמינו אלקיל אגרו ז הנ״ל גם היא פוםפורילז __b
למרות שלא הכילה גליקוגן כלל־
לעומת זאת,כאשר נבדקה קולונת
אגר ו ז-גל י ק ו ג ן שבה השרשרת ה;א.ל'.ק,לל<» 1ה י ת ה בעלת 4אסופי פחמן,לא היתה
כלל ספיחה של פוםפורילז _ h־
הצדדית ה אל ק י ל י ת״ה מגשרת״ בין
נראה היה שהספיחה תלויה באורכה של השרשרת
הגליקוגן והאגוו ז.
כדי להבין את ההופעה
ולברר את האפשרויות הטמונות בניצולה כגישה חדשה להפרדת חלבונים,
נקבעו
א־
היעדים הבאים-:
לחקור את תלות הםפיחה באורכן של השרשרות הצדדיות האלקיליות
ע יי י העברת גליקרגן פוםפורילז ו ג ל י ק ר ג ן סינטתז על סדרות הוםולוגיוח
של קולו נוח אלקיל אגרוזות ו -(jj -אפינו
אלקיל אגרוזות־
להשת
כ־
מעשי ת לג
הקול נ ו ת
ו
להשו
ג־
ספ ר י ל
פו ו
הסדרו ת ה
לבדו
ד־
נ
במב
ה הא
ו שו נו ת ז
ה־
לחקור את מהות 'הכוחות הפועלים בעת מעבר אנזים
אלקיל אגרוז על פי
ותרומת
קולונוח
הקיבולת המקסימלית לטפיחה ,תנאי
המטען החשמלי
לםפיחה.
מהסדרות שנחקרו
לעיל־
להציע מנגנון
דרךקולונת
האלוציה
לספיחה של חלבון על
-
16
ושיטות
חומרים
חומרים
. 1
אנאורגניים
חומרים
מלחים,
כמו
ובסיסים
חומצות
מדרגה
היו
אנ ל י ס י ת .
2,c
היה
מ ת ו צ ר ת Fluka
ונשמר
בנוכתות
.3
מ י ב ש ) • ( CaC12
תוצרת
ammonium sulphate
מדרגת
Merck
של
חומר
בכלי
זה
מלח
ניקיון
סוננו
אמינים
.4
ו -
דיר
ניר
אליפטיים
ודי
לאחר
אצטט
חם
נרכש
פ-
.7
ריאגנטים
לפני
אמינים
ומתו צרת
puriss
הרוויות
התמיםות
השימוש.
אליפטיים
נרכשו מ -
, Fluka
, EGA
•
היה
טיפול
בנורים
והוא
Merck
)פחם
לפני
גובש
השימוש
פאתיל
פעיל(.
ה י ה ת ו צ רח
6,glycero phosphateל| sodium
. B. D. H
.Trizma
base
. Sigma
ו -
תיוליים:
— mercapto ethanolל ן
Mercapto acetic acid
.8
ניקיון
, f u r biochemische
Whatman 1
מתוצרת
imidazole
מדרגת
Fluka
Zwecke
Merck schuchardt
.5
סגורEastman
או
תוצרת
—
היה
תוצרת
Eastman
• Merck
- phosphate
רהוא
גובש
מתמיםה
1
אתנוליח
הרחקת
לאחר
_glucose-6uridine diphospho glucoseן
מלחי
נתרן
ושאר
הנוקלאוטידים
.9
היו
Glycogen
המסה
במים
מתוצרת
היה
רותתים
Sigma
תוצרת
היו
מתוצרח
תוך
בחישה.
Amberlite Besin M B - 3
וכן
Sigma
.
והוא
התמיסה
)קולונה
החופשי
שניהם
phosphateגם
Fluka
הפוםפט
בעזרת
קצרה
monophosphate
הוכן
לשימוש
המקו ררח
שטופה
adenosine
בדרך
הו עברה
במים(.
. BaC12
הבאה:
דרך
לאחר
ההעברה
17
.קטן
-
משקע
כ
הורחק
והכילה
.דקות
כחלחל
10
צבע
במשך
ובעלת
שולחן
צלולה
בצנטריפוגת
היתה
.שהומס
-
שהתקבלה
הגליקוגן
מתוצרת
Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala
:רדיואקטיביים
היו
באיזוטופים
הגליקוגן
סורכז
העליונה
מכמות
אחוז
וספדקס
מסומנים
התמיסה
90-80
ספרו ז
.10
תומרים
.11
(14C) methyl amine hydrochloride
.א
(U-14C) ethylenediamine hydrochloride
.ב
Putresceine -1, 4, -C14 dihydrochloride
.ג
adenosine-5' —triphosphate - y -P32, ammonium salt
•ד
(high specific activity
>15 C i / mmol
uridine diphospho (D־glucose-6-H3), ammonium salt
.ה
uridine~5' ־diphospho (glucose—C14 (U)), ammonium salt
.ו
תוצרת
היו
האלה
המסומנות
התרכובות
כל
Amersham, The Radiochemical Centre
ethyl-1-C14-amine
.א
hydrochloride
N C S - t i s s u e solubilizer
.
•
מתוצרת
New England Nuclear
:כדלקמן
הוא
Bray
הםנטילציה
mg Dimethyl P O P O P
=Phenyloxazolyl)j-Benzen-bis -12
(4 methyl —
Diphenyloxazole2. 5
תמיסת
ב
היו
הרכב
.12
200
5-1,4
ב
-
,
.
.
0
0
2
5
0
7
6
2
Dioxane dist
ml
Methanol dist
ml
1
anal
הרכב
תמיסת
g Naphtalene
Ethylene g l y c o l
הסינםילציה
50
למעלה(
.ב
)ראה
להשלים
,13
אמולסיות
.14
הרכבי
א.
mM
18
anal
4
)ראה
-
צילום
רגישות
בופר
שהוכנו
ושמותיהם
פוספט -
מתוצרת
מובא ל
-
מרקפםו
אתנול
GP-ME
50
יל:
EDTA
S - m e r c a p t o ethanol
mM
עם .. 1N. HC6.
פוספט -
מרקפטו
EDTA
m e r c a p t o acetic acid
ל
-7.0
p Hעם N NaOH5
••!.־••,י.'::
אצטית
P-glycero phosphate
1
mM
glycero
mM
pH 7 . 0
גליצרו
י , Ilford. :
המקוצרים:
phosphate-3
50
מובא
.
י~
עב ו• ר• •א ו © ו רד י ו ג רפ יה היו
1
ב.
g
Toluene anal.
ג
בופר
mg
PPO4
עד 1
גליצרו
כדלקםן:
Dimethyl P O P O P
ליטר עם
50מכיל
סולואן הוא
למעלה(
הכופרים
ml
.
mM
GP-MA
mM
- 19
Im-Cit .
ג .בופר רפורמציה אימידזול ציטרט
מכיל אימידזול בריכוז , M0.4אלא,אם כן צוין
30
ח
א
ר
ת
.
.
mM mercapto acetic acid
ומובא ל pH 7.0 -
בדרך כלל השחמשנו
עםחוםצהציםרית.
אימידזול של 0.4מולר ו
בריכוזי
-
0.8מולר.
קולונה הידרופוביים
.15מינוח של חומרי
המינוח של חומרי
הקולונה ההידרופוביים בהם השתמשנו
זו פורסם על ידינו בםפרות ).(74,73
הוכנו ע ״י אקםיבציה של Sepharose 4B
אמין
בעבודה
סדרות הקולונות בהם השתמשנו
בצי א נ וגן ברופיד והגבתו עם
אליפטי או די אמין אליפטי.
בטבלה מסי 1נתונות שתי סדרות הקולונות אשר בהם השתמשנו,
Seph-Cnשבה הוגב אמין אליפפי בעל n
הסדרה
' 2 S e p h - C n - N H
ה
אטומי פחמן עם
שבה הוגב די
א מ י ן א ל י פ ס י בעל
nאסופי פחמן עם םפרוז מופעל.
רשיםת
)0(H20
קיצורים נוספים אשר אינם פו פיעים
Seph- C
בטבלה תנתן להלן:
ספרו ז פופעל בציאנ ו גן ברופיד ואשר הקבוצות
הפעילות עברו הידרו ליזה בסביבה בסיסית )בבופר
)9(NH3
Seph-C
הפעילות עברו
N H N H - g l y c o
הטרמינלי
םפרוז
B
ספר יו ז מופעל בציאנו גן ברופיד ואשר הקבוצות
הידרו ליזה בסביבה בסיסית בנוכחות
אשר אלהאמין Seph-C־
8
2
נקשר גליקוגן מופעל בציאנוגן ברופיד.
.
ביקרבונם , ( pH 9.6
שטוף במים בלבד
אפוניה.
-
20
A'hyl - Sephoroses
Structure
Abbreviation
Seph-C|
|־NH-CH
Seph-Cg
J־NH-CH ־CH
Alkylomine - S e p h o r o s e s
Abbreviation
3
2
Structure
i
Seph-C -NH
3
2
2
|-NH-CH -CH ־NH
2
Seph-C
3
|־NH-CH -CH -CH3
2
2
| ־N H - CH־2CH ־CH2• C H
Seph־C
^•NH־CH -CH -CH ־CH -CH
5
2
2
2
2
3
2
3
Seph-Cg
|־NH-CH -CH ־CH -CH -CH־2CH
Seph-Cg
|־NH-CH2-CH־2CH -CH -CH -CH -CH -CH
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
J-NH-CHg-O^-CH^N^
2
Seph-Qj־NH
2
l-NH-CHjj-CH^Chk-CHg-NHg
Seph־C־5NH
2
^-NH-CH^O^-O^-C^-Ct^-NHg
Seph-Cg-NH
3
2
Seph־C -NH
3
Seph־C4
2
2
Seph-C ־NH2
8
I-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2
|-NH-<>H -CH -CH -CH -CH־2CH־2CH -CH2-NH
2
2
2
1
2
'מם
2
סבלה
2
-
21
סרת
הכנת
חומרי
א־
קולונה
Seph-Cn
ה ס ד ר ה
B4Sepharose
) גו=
עם
ש ו פ ע ל
-
-
ע"י
0־ 1 1
דיאוקםן הובאה
המשופעל והמסונן
שווה של תמיסת
ל ה ב י א
4
סו
נ
ציאנוגן
ברומיד
צ
ן
הספווז,
מ ו ל י ם
ר י א ק צ י ה
ג
־
pH
ל
ב
ה ו ר ח ף
ב ר ו מ י ד
-0,1
ע " י
ל כ ל
הקישור נמשכה
05
י
מ י ם ,
, 0
סינון
מ ו ל
שעות
ב
1N
ה ספ רו ז
־
מ י ד
לתערובת
ה ו ס ף
עם
תמיסת
ה א ל ק י ל
א מ י ן
צ י א נ ו ג ן
ב ר ו פ י ד
שבו
4
-
2
CH COOH0,2
,
N
s
ו ל ב ס ו ף
-
הכילה
ה ש ת מ ש נ ו
ולאחר
C4°
NaHCOg,o,1
ב כ מ ו ת
נ פ ח
כדי
ז א ת
, M
ג ד ו ל ה
של
יי
מ י ם .
8
ם פ ר ו ז
נשמר בין
ע ״ י
ו ע ו ר ב ב
דיאוקםן
של
HC6
M
דיאוקםן.
40$
א מ י ן
הוספת
ן הםפרוז ונשטף בתמיסות הבאות :מים
NaOH
ל
גרם
1 0
השפעול הופסק
NaHCOg
אמין.
ה א ל ק י ל
א ל ק י ל
N
ב
-
p H 1 0 0 5 - 1 1 , - 0
תמיסת האמין א ש ר הוכנה קודם לכן ב -
לריכוז סופי של
של
יאנו
הוספתNNaOH5
ה ג ל ושטיפתו במי קרח.
-9.040$
ב ד ר ך
הריאקציה נמשכה כ 8 -דקות וה p H -
מסונן(־
ל
105־
לשפעול
( 6 - 1
ג ר ם
)משקל
הוכנה
הבאה
) 0 ( 7 4 , 7 3
Seph-Cn-NH
=
הסדרה
Seph-Cn
ה י ד ר ו פ ו נ י
ולעיתים
,
ב
-
הקולונות
)
בהבדלים אלה:
האמין
ו ק ש י ר ת
pH
n
גבוה
ל ס פ ר ו ז
י ו ת ר
-
(
הוכנה כמתואר
תמיסת
ל ע י ל
לא הכילה ממם
ה א מ י ן
המשופעל התבצעה בהעדר דיאוקסן
. 9 . 5
הסדרות נשמרו ב C -4°
משתי
עבור
בנוכחות מעם סו לד א ן ־
קולונות שבהן נעשה שימוש חוזר תוך חודשיים נשמרו ל ל א תוספת
חומר משמר.
בדרך
ה
ג ל י ק ו ג ן
ר ו מ י ד
ב -
1 1 . 0
.p H
ריאקציה
מומס במים
ה -
pH
נש
מ ר
ב
א
)20
ע"
ה
n
e
g
o
c
y
l
g
-
H
מייל( שופעל ע " י הוספת
י
1
ה ו ס פ ת
השפעול נמשכה 5דקות ב C -0°
נפח שווה של אתנול אבסולוטי
קר־
N
20
-
8
.
200
מ"
ג
מ" ג ציאנוגן
NaOH
N
.
והופסקה ע " י הוספת
ה ג ל י ק ו ג ן
הושקע ב
g-5,000
.
22
במשך
דקות
וב
5
•20ג ר ם
)
NH- Seph-C
2
עדין
-
ב
של מ י ם .
הכנת
בוגרות
הומתו
ולאחר
צנטריפוגציה
עד
משריר
ההומוגנט
סוגי
הפרווה
* O.lMNaHCOs
כמות
ובהעדר
סלסול
גדולה
סולואן•
פיצוי
הורחקה
הועברו מיד
שריר
והורדו
לקרח.
בהתאם
לניסוי.
שרירים
הזמן
משך
פן
ארנבות
הרגליים
מהמוות ועד
סיום
דקות.
20
:1
נטחן
בטמפרטורת
במשך
במטחנה בשר
החדר.
ם ו נ ן דרך
מיצוי
שכבה
זכוכית
ו ע ו ר ב ב עם
נעשה
השריר
כ פ ו ל ה של ג ז ה ע ל
דקות ב
0
ונשמר
-
4
בחדר ק ו ר לא
2.5
במשך
משפך
מים
ליטר
דקות
15
לאחר
ניבנו.
g4,000
הועבר
יותר מ
-
הנוזל
שעות
12
שריר מסי
ק" ג
:2
שרירים
4 °עם
C
50
הועבר
ו נ ש ט ף עם
4°C -
עורבבה
שעות ת ו ך
24
עם
לכרומטוגרפיה.
1
-
ביקדבינמ
כותש
ארנבת
שלושה
דרך צמר
מיצוי
90
קולונה
שרירים
מכן
העליון
שניות ב
חומר
זה
נשמר
במים ב
שריר מסי
התםנין
הגליקוגן
בעזרת
הפשו פעל
נמשכה
.4°C
ה ש ר י ר י ם לא עלה על
מזוקקים
בופר
לאחר מ כ ן
באתר,
1ק"ג
ל
קישור
קרים
ה ג ל י קו ג ן
םונן
השרירים
מיצוי
תמיסת
במים
ה מפרוז
בדרך כלל
האחוריות,
הרחקת
ריאקציה
םיצויים
הוכנו
של
C0°
הומם
"ם-50ב
. »( pE
9.0
»2
והמשקע
( glass - teflon pestle־
)
8
-
-
הועבר
5
pH
צנםריפוגציה
והתםנין
לקבלת
השימוש
במשך
.
הומוגניזציה
2
בו
שהרכבו
50 m M E D T A ,
30
דקות ב
הועבר דרך צמד
מיצוי
ליטר
שריר מם'
-
+
m M TriS'HCl
מיצוי
נשמר
( Waring
להלן:
10,000
זכוכית.
3או
בבלנדר
)
במשך
במשך
8,1
g
שדיר
24
זה
שעות
הועבר
מיד
בתדר ק ו ר
לפני
ל כ ר ו מט ו ג רפ י ה .
ו
מיצוי
שריר מסי
החלבונים
:3
במיצוי
שריר מם'
2
הושקעו מ י ד
לאחר
הכנתו
ע"י
-
23
הוספת
שעות ב
-
סורכז
C4°
נפח
המשקע
המשקע
נפשך
0
הורחף
בנפח
נ פ ח י ם של
400
םורכז
ש ו ו ה של
ב א ו ל ט ר צ נ סר יפ ו ג ה
כונה
העליון
םינסחז.
אפוניום
מיצוי
לכרומטוגרפיה
-
זה
והועבר
שעות
24
השתנות
דיאליזה
מקור
לשבוע
נ י כ ר ת של
להכנת
כנגד
הנוזל
גליקוגן
בחדר ק ו ר ) ( 4 ° C
פעילות
־
בדיאליזה,
.
g
והווה
נשמר עד
g
בחדר ק ו ר
100,000
3
). ( p H 7.0
16,000
GP-ME
לאחר
שריר מסי
שריר
ללא
בופר
הבופר.
וב
רווי
דקות ב
כ פ ו ל של
1שעה
מיצוי
-
3
או.חו
במשך
םולפט
ומנוטרל
.
גליקוגן
עד
סינטחז
ופוםפורילז.
הבנת
3״
פוםפורילז
פוספורילז
יה
של
76
,77
b
מגובש
b
(
et
al
חרר מ
שלושפעמים
s
e
b
K
r
הוכן לפי
איחםון
( .
שיטת
al
האנזים
et
Fischer
נעשה
בבופר
0°C
A M Pעל י ד י
העברה ד ר ך
2.0-1.5ם״מ ) « ( 7 8
ל
של
משריר
ארנבת
-
חישוב
56־>0״
ה ח ל ב ו ן = ^5113.1
4־
et
שימש
פוספורילז
גובש
-
Charcoal
הכנת
המוליזאט
מנות
נלקחו
ש לa l(79
et
דם
(
נוקה
חלקי
לאחר
השימוש
באופן
לפעילות
a
משריר
הקינאז
ה ש י ט ה ש ל a l (76
ובמידת
הצורך
-
et
ארנבת לפי
הכנת
-לצורך
השיטה
פוםפורילז
»30,000rpm
. ( F i s c h e r
הועבר דרך
של
קולונה
הכנת
האנזים
קצרה
לעיל.
מ כ ד ו ר י ו ת דם
ממתנדבים
נעשה
עפ״י
אינדקס
הבליעה
ז
צנסריפוגציה ב
כמתואר
( M o s e s־
Jb
AMP -נע ב י ן
0.52
־
קינאז
נעשתה ל פ י
לפני
n
כמקור
שחרור ה
פוספורילז
X
2
לאחר
ופוספורילז
קינאז
המתקבל
a
פעמיים
Sephadex
5־
A
( K r e b s־
התסנין
בבליעה
ה ר י כ ו ז של
פוספורילז
פדםפורילז
a l (77
היחס
(
הבנת
ק ו ל ו נ ה של
Sephadex
-
ב א ו ר ך של
Charcoal
.
אדומות
בריאים.
הפוליזאט
הוכן לפי
השיטה
של"
-
.6
פעילות
קביעת
הפעילות
) ( 8 0עי• י
גליקוגן,
(81
גליקוגן
AMP
• ( a n d
בקולוריטטר
שהשתחררה
(82
אי
לשחרור
לפי
אורגני
הםשתתרר
הפוספט
ששותרר
התפיסות
הצבועות
גרף
עפ״י
פעילות
, AMP
יוחסה
זו
שהתקבלו
קביעת
פעילות
קביעת
פעילות
גליקוגן
םינטתז
נעשתה
ובתלקה
האתרון
ש ל ( S o d e r l i n g et al (66
, ( T h o m a s el alע ם ה פ ו ד י פ י ק צ י ו ת
ע ר ב ו ב של 5 0
ע״י
תפיסת
לאתר 15
ריאקציה.
תפיסת
דקות
נקראו
הפוםפט
גם
נפדדה
.
ב ח ל ק ה של
של
העבודה
העבודה
קביעת
בודד
בשיטה
בשיטת
הפעילות
מ ה ו ל עם 1 0 0
אינקובציה
ככפות
בדקה
הנ״ל
וכפות
דלהלן:
אנזים
Fiske
אורגני
בשיטה
a
בנוכתות
הוגדרה
האנזיפתית
לפוספורילז
גליקוגן
אי
(66
הפעילות
שיטת
האנזים
פוספט
סינסתז
מיקרוליטד
פ ג ל ו ק ו ז - 1 -פ וטפט
נקבע לפי
)פילטר פסי
כיול.
Hedrick and Fischer
אקטיביות
פ י ק ר ו פ ו ל א ח ד של
Klett - Summerson
נקבעה
ה ש י ט ה של
י ת י ד ה אחת של
מ ג ל ו ק ו ז - 1 -פ ו םפס .
.7
נקבעה
פוספט
הגורפת
בהעדר
פוספורילז
והאנזים.
Subbarow
האנזים
24
האנזימתית
קביעת
-
נעשתה
םיקרוליטר
הגליקוגן
פשתי
באחת
שיטות :
א.
ע״י
השקעה
ב.
ע" י
העברת 50
הניר
גליקוגן
של
בסיס
גליקוגן
יתידה
-
לגליקוגן
רדיואקטיבי
מושקע
מתנול
רדיואקטיבי
פעילות
יוחסה
ובהעדר
לצורה
כמויות
לעמוד
ריאקציה,
ז מ ן של 3 0
של
אנזים
או
60
מכונה
םינסילציה
מוגדרתככמות
D
-
U
1דקה
הפעילות
ושטיפת
Whatman ET
נמנה
BRAY
תוזדת
בנוזל
(.
על
ואילו
ב ס י ס של
האנזים
וב
סינטילציה
נידות
בהעדר
שהכילו
טולואן.
המעבירה
.C30°
על
1פ י .ק ו ו ס ו ל
הפעילות
הסוכר
נמדדה
פוספט
האנזים.
שנמדדו
כמות
הורצו
P
ומבודד
בנוזל
אנזים
ל נ י ר 31
ג ל ו ק ו ז - 6 -פ ו טפס.
I
על
)להלן
נמנו
G
בנוכחות
פיקרוליסר
בכוהל 66$
דיאוקסן
אתת של
הפסת
).(82
ב
כדי
באתנול
הפשקע
והשקעה
).(66
בשתי
השיטות
הרדיואקטיביות
מספר
דוגמאות
דקות.
המתוארות
נחנו
ערכים
זהים.
המקסימלית
שהוכנסה לכל
תמיסת
אנזים
גדולה
לפרקי
המכילות
בכמות
-
קביעת
.8
נעשתה
ריכו ז
לפי
התלבו ן
שיטת
טר י כל ו ר ו אצטית .
ב
מ" ל
2.5 -
גרף
בעזרת
תלבון
בשיטה
גם
שהוכן
et al (84
חמר
פוספט
םינםתז
גליקוגן
לאחר
החלבון
בצנטריפוגציה
טרום
מ -
שבו י ל ה
2-1
למחציח
שהוכן
עבור
מכדוריות
דיאליזה
של
ישירות
הופם
החלבון
נקבע
מבקר.
-מ״ל
ל
המתואר
סדום
דם
6$
ריכוז
מיליגרם
הנפח
ב
בקור
. Sigma
אלבומין
-
חומצה
במאמר
אלבומין
אדומות
הדוגמאות
נמדד
מבקר.
נקבע
כנגד
המקורי
)(83
התלבון
בופר
עפ"י
גליצרו
פרקפטואחנול.
מדידות'אנאליטיות
/
עבור
כיול
השקעת
תוצרת
נמוכים
בגרף
( L o w r y
שהתקבל
Biuret
בריכוזים
השתמשנו
בהפקת
.9
המשקע
ריאגנט
ביול
לאחר
Biuret
Microbiuret
כאן
-25
נופפו ח
.
/
קביעת
כמתואר
ריכוז
במכשיר
פפקסרופוטופסריות
בוצעו
ב ם פ ק פ ר ו פ ו ט ו מ ט ר Zeiss PMQII
. Cary 15
מדידות
תוצרת
בשיטת
חומצה
ע " י. ( D u b o i s et al(85
מדידות
או
הגליקוגן
נעשתה
הפנול
גופרתית
פל ו א ו ר י מטר י ו ת
בוצעו
ב ספ קט ר ו פ ל ו א ו ר ו מ ט ר
Spectro210
. Turner
הימודוח
אנליזח
לפיקרואנליזה
טיטרציות
של
פחמן,
מכון
מימן
וחנקן
בוצעה
ע״י
המעבד*•
ויצמן.
פ ו ט נ צ י ו מט ר י ו ת
אוטומטיות
בוצעו
במערכת
ה מ צ ו י ד 'ב
הבאה:
Radiometer
TTTlcת ו צ ר ת
דגם
Titrator
הרושם ה א ו ט ו מ ט י היה דגם
.Man.Temp. Compד ג נ ^ . PHA 924
. Radiometer
ה ם י ק ר ו ס י ט ר צ י ה ד ג ם TTA 31ב ו ל ם ת ו צ ר ת
ומערכת
אלקטרודה
המדידה
היחה
זכוכית
ואלקטרודח
היחוס
-
קלומל.
גשר
20SBR
אגד
-
-
26
בצינורית
הטיטרציה
נתון
בתרמוסטט
יבש
חנקן
ונשמר ב
במשך 5
אלקטרופורזוח
פולפט
דודציל
א־
(86
באקריל
בשתי
and
עבור
סריס-גליצין ב
מערכה
S o l . C : 10% SDS
מ״ל
5.85
,
2.5
,
מייל
A
TEMED
בופר
SDS6
הועברו
תנאי
מערכת
כופרים א.
.
הטיטרציה.
נחון
+
o
0.1פ ״ ל
ע"י
המתוארים ע"י
בנוכחות
5$
.
הכנת
et• a l
נתונים
נתרן
0.1$
הגלים
Dudai
נעשתה
כמתואר
להלן:
Sol. A : 30°/o
B: 1.5M T r i s - H C l
Sol,
הבאות:
C
מיקרוליסר
4 0מ י ק ר ו ל י ט רpersulfate(10$
. ( A m m o n i u m
ן ,
1 -
3
,
ליטר:
+ 28:1 g glycine• HC1
T r i s • £ CI ,
ר מ י ק ר ו ג ר ם
מהדו ור יתקהי ום ב מ ש ך
לפני
הא ל ק ט ר ו פ ו ר ז ה ,
הוזרם.
בנוכחות
המתוארת
Acrylamide
ערבוב
+ 10 m l of 10 90
על כל גל מ י ד
ריכוזי
0.89/0
gH0.1,
SDS-6.72$
^ Bromophenolbluר ו ל
0.75MP-ME,1 0 $ג ל י צ
ב
מהלך
בדרך כלל
החומרים
הכפויות
הכיל ב
-מ "Cל .ו נ הפ ד וח ג ימ אםו ת
8.3
S D S , p H &8':.
מ״ל מים,
ההרצה
pH
+ 0Ao/
הוכנו ע"י
B
-
כאשר
bisacrylamide
הגלים
עפ"י
בוצעה
בופר א , .
הטיטרציה
ובמשך
השיטה
ב ג ל י ם של
דודציל
ל תא
תא.
כופרים:
( W e b e rעם
סולפט.
ב.
בוצעו
השינויים
) ( 8 7־
האלקטרודות.
הטיטרציה
אמיד גל
pH 7 . 2
האלקטרופורזה
בבופר
א
C
התחלת
מ ע ר כ ו ת של
-
ח י ב ר ב י ן
.30°
לפני
ב ו פ ר פ ו ספט ב
Osborn
פוליאתילן
-
דקות
-
3
ךקות
ב
g
Tris
,
M
100
100°
ההרצה.
צביעת
הגלים
ושטיפתם
נעשה
כמתואר
עבור
27
-
תוצאות
ספ ר ו ז -ג ל י ק ו ג ן :
גליקוגן
מצויים
בעמדות
לאחרונה
זיקה,
ניסינו
של
לטינטזה
ברומיד
להקטין
נשטף
שימוש
לבידוד
פוםפורילז
וסינסחז
לגליקו גן
(4
מהאימה
של
של
סכנת
בגליקוגן
טבלה
כמות
גליקוגן
האםינים
עודף
).(85
םינטזות
ע"י
של
ההישגים
את
שהו גבה
הנ״ל.
האפשרות
הזיקה
להשתמש
בו
עשה
ע״י
(28-27
על
ידי
והגבת
)•(43
שעל
שג ק ש ר ה
;
הגליקוגן
דוגמא
שונוח
הקבוצות
עודף
הספרוז
ע״י
שנשטף
פיעה
לאתר
כמות
בטבלה
מיועד
הדיאמין
ע״י
נבדקה:
קביעת
הפעילות
הדיאפין
עודף
ל ק יו ל ו נ ה
חישוב
פ
הספרוז
הדיאמין.
החו פ ש י י ם
ב.
שפעול
בציאנוגן
ההפרש
שפעולו
א.
ע" י
בין
כמות
התגובה,
בשיטת
הגליקוגן
בשיטה
.2
מטי
הקישור
של
ר דיי ו א ק ט י ב י ו ת
של ה ד ג ם
)מניות
לדקה(
גילי קו ג ז
מסומן
רדיואקםיביות
שנקשרה
)מניות
ל ט פ ר.ו ז
נ גולת
מ״ג
הקשירה
קשור
*ליקוגן
למייל
200
מ"ג
273,000
67,000
25$
200
מ"ג
122,000
63.500
52$
4
הםינטזות
מסונן(.
הוגב
דגם
הגליקוגן
ק ו לונה
לדקה(.
2
) משקל
של
2
נ צ ו לת
בשתי
שהושגו
כרומטוגרפיה
האנזימים
העלתה
ל׳ נ א ר י
הגליקוגן
בפחמן
לבין
גופדתית
הרדיואקטיבית
פסי
כמות
בשתי
ספרוז
ספרוז
סינטתז
לאור
),C.2.4.1.11
זה•
אליפטי
של
אל
מסומן
שהוגבה
הפנול-חומצה
דיאסין
נקשר
ברומיד.
בג :י ד ו ד ם
) Porath et al
הצילוב
והגליקוגן
לצורך
לרב-הםוכר
השיטה
)פי
הגליקוגן
מהירות
אנזימים
להפעיל
גליקוגן
בציאנוגן
המטבוליזם
שיטות
קולונה
את
של
של
וגליקוגן
גליקוגן.
עקרונוח
לפי
עודף
)2.4.1.1
של
(EjC.
אלה
של
קישור
עם
מפתח
בפיתות
הגבוהה
האומנם
פוםפורילז
ב ר ו מט ו ג רפ י ה
זיקה?
המשופעל
עם
15
גרם
ספרו ז
אמין
28
פוספורילז
ניחן
ולא
פאתר
לנתקו
שלא
הפעלת
ניתן
ריכוזי
פתוארת
בתנאי
לאלוציה
הסר
חלבון
התאפשרה
היה
כדי
רברזיביליים
פוםפורילז
כמותית
פעילותו
לאחר
במקרה
עקבות
סילוק
קרובה
)נתרן
כלורי(,
האנזים
ל
-
ל
-
מ" ג.
42
רפורמציה
ע״י
הבלתי
באותו
חוזק
נויקה
ע״י
מכאן
התוצאות
גליקוגן
שבה
שקולונה
זו
שהושם
בעת
ל
על
היה
ניתן
פן
של
5
לקולונה
זוהי
כי
פעילות
לציין
היתה
ואומנם
ספציפית
שריכוז
לא
א י מי ד ז ו ל -צ י ט ר ט ,
של
כמתצית
האנזיםתיח.
לקבל
הראוי
מתוארת
הספציפית
נמצא
הפעילות
לשי נ ו י י
מם'
כלומר,
הקולונה.
קביעת
מטופל.
יוני
-
נ ים ינ ו
נספח
פעילותו
מ"ג,
א נ זים
במכ נ ה
הגורם
בחמונה
פ עיל
מלח
הביא
לאלוציח
הקולונה.
ארנבת.
הנ״ל
עדי נים
י ותר,
הנ״ל.
יתירות
דיאליזה,
ה גל יק ו ג ן-ספרו ז
שריר
מ״ג
העברת
של
פוספורילז
של
א נ ז י0
זה
בממס
ה ב י אה
ו י צ י אה
חל י ם
גאפ״ד.
הבופר
,10
מה י ר
פסי 4
לא
שי נ ו י י ם
זה
שלו
ל
-
ע ״ י.
ואלו ציה
,
)•(56
עם
.
נ ית ק
בחנאים
באנזים
ב חפ ו נ ה
אל ו צ יה
א ימ י ד זו ל-ציטרט
האנזים
האנזים
מן
קולונת
ממיצוי
של
pH
כמותי
מה ק ו ל ו נ ה
pH
-
לאל ו צ יה
היתה
הדפורמר
לזו
של
זה
ר
חל
ניחו ק
בגרף(.
5.8
ל
-
הידוע
ע"י
נופו
של
שסם ו
פחערובח
ממנה
-
ל
)דפורמר(
הספציפיח
נוכחות
של
בב ו פ ר
מוצג
pH -
pHעד
ה
מזה
בא ו פ ן
כל ו רי
נתרן
ספרו ז -ג ל י ק ו ג ן
של
העלאת
)לא
טמ י ר
להב י א
להשתמש
פוםפורילז
כ
ה ס פ י חה
גב ו ה
PH
קטלי ט י ״
כמותי.
כאלואנט
וניתק
ב
י דו ע
האנ ז י ם
הפרדת
b
פעיל
ב
pH
-.
ניטרלי
0.5מול ר
)עד
אנזים
לק ו ל ו נ ה
ו ת ו מצ י י ם .
החפצה .
).(88
מ לח
גבוהים
תל ו ח
אח
-
גליקוגן-ספדו ז ב
ה קי ל ו נ ה
פוספ ו ר י ל ז
פעילות
באופן
מבנה
בדק נ ו
האנזים.
ע"י
של
ב רי כ ו ז י
לנתק מן
בסיסיים
של
לק ו ל ו נ ה
פמ נ ה
פלת,
ספיתת
pH
פעיל
נםפ ח
-
גדולים
הם
נוספים
הכרחיח
על
העברה
מבטיחות
חוברו
שני
כ
-
שהועבר
וקשה
שריר
כרופםוגרפיה
נראו
פוספורילז
מיצוי
שע" י
הכילה
שתוארה
היה
עד
זו
לולא
4
מ"ג
להבין
בעל
כדי
הקולונה
דרך
גליקוגן
כמו
מדוע
פוספורילז
כן
ל
פעילות
ניקוי
במקרה
טט רה
-
ס"ל
נראה
היה
הרחקת
אל.יו,
יעילה
פעילות
חל
סונסזה
הרב-סוכרים
דרכה.
לספיחת
לעיל
שהיה
נמצאה
לבידוד
ספציפית
ספציפית
של
אחר
מתילן
הגליקוגן
כדי
של
1
יחידות
40
יחידות
ה א נ ז י ם פי *40
מ ס י (£<,
)חמונה
קולונה
די
קולונה,
שממדי
של
פוספורילז
של
אמין.
לא
חלה
מולקולוח
6-5
ספרו ז -
למרות
ספיחה
גליקוגן
אנגםטרם
-
-
29
T
rן
T
Acidic
Range
Alkaline
_ Range
0.7
0.6
ו—1
1
ר
1
A
E
0.5 o
00
CM
« a4
o
0
.2
|3
0.
Oin
w
0.1
QO
»» 4 ** 4
L
60
ת מ ו נ ה
מסי
ס פ י ח ה
של
pH
שנשספו
שה
א.
בו פר
-
ג .
50
מ י ל י מ ו ל ר
ק ו ל ו נ ה
כ ו פ ר י ם
אלה
ה ב ל י ע ה
ב נ ו כ ח ו ת
על
ג ב ו ה
7.8
אחת
לאחר
פ
7.0
-
כ ו פ ר
ו ה כ י ל ו
נשטפה
60
40
ה ו כ נ ו
א xט י ח
ב א ו ר ך
גל
AMP
)
50
משתי
ספרו
ק ו ל ו נ ו ת
ס פ י ח ח
ה ס ו ו
בי
10.2
ם י ל י מ ו ל ו
.
-
כל
שלהם
ב מ י ם
).(3:1
נ א ס פ ו
פ ו ק נ י ו ת
-
)
m28011
(.
)
ג ו מ ר
מ ״ ל
Glycogen־Seph-C -NH
של
g
ק ו ל ו נ ח
pH
H
נ מ י ר
-
״•־
-
J p
הבו ס ר י ם
GP-ME
(,
ל
-
0
ו ה ו ב א ו
ה
א ל ו נ י ה
0.5
ב ת נ א י
ב כ ו פ ר י ם
אחת
ה ב א ; ־
.pH
pH
ב
נשטטח
קרבו נ
ME
b
ז ה ו ת
ה א נ ז י ם
ל פ י
שה
ז -ג ל י ק ו ג ן :
פ ו ס פ ו ר י ל ז
אמו נ י ו ם
ב כ ו פ ר י ם
o
של
ם ״ ג
א פ ו נ י ו ם ב י ק ר ב ו נ ט
ש נ י ה
ע" י
בל
GP-ME8.0
ח ו ם נ ה
b
ב ו פ ר .
שלהם
ב ו פ ר
ל ק ו ל ו נ ה
ו ב ס י ס י י ם .
ב א ו ת ו
pR0
20
20
Fraction number
40
פ ו ס פ ו ר י ל ז
ה ו ע ב ר ו
pH
I
I
I
I
4
ח ו פ ג י י ם
GP-ME
J
L
I
I
J
pH
9.0
הי ו
-
ס
ה מ ת א י ם
ב נ ו ח
(
ג ר י כ ו ז
של
.7.0
) ר א ה
1.5
ב ג ר ף (
מי• ל
ו פ ע י ל ו ת
ו נ פ ר ד ה
פ ו ס ס ו ר י ל ז
-
30
-
£
c
O
־1.6
00
1.2
cvJ
>a
a
§ 0.8
I< 0.4
־0
0
4
ז
.6 30CO
־ 20
< 10
0
o
10 20 30
Fraction Number
תמונה 5 *0 0
הפרדת
פוספורילז
-
מ
4מ" ג פוספורילז
C
8
קוטר(.
םפותים.
G A P D bעל קולו נ ה של
b
ו 4 -מ" ג
NH-Glycpgen-־Seph
הקולונה נשטפה בבופר
אלוציה בוצעה בנופו
פעילות
G A P Dב 1.4 -מייל כופר GP-ME
שנפחה)0.9מייל
6
סיים
GP-MEעד לשטיפת כל החלבונים שאינס
6 . 0Im-Cit)pHר א ה חץ(.
בנות 2מייל נאספו ונפרדה הבליעה באורך גל
A—)GAPD־־־(
Glycogen־NH־eph-C8
8
280
nm
) ״•י, ( -
ופעילות פוםפורילז )־,(-»-
טרקציות
31
Fraction Number
תמונה
בידוד
מם'
פוספורילז
מ •י ל ש ל
5
ולאחר
מייל נ פ ח ,
ממיצוי
שריר
הנ״ל
0 . 9ס״מ
באורך
) ־ . ( ~ o -
ארנבת
ארנבה מם'
ק ו ל ו נ ה של
על
הועברו
1
ה ם פ צ י פ י ח של
הועברה
קוטר(
על
שהוכנה
) 280
(
נאספו
דיאליזה
הפוםפורילז
והיא
בבופר
פרקציות
n
פ
m
1.0
יחידות
8
הקולונה
. GP-ME
בנוח
GP-ME
Seph-C-NH-Glycogen
ואז
ו
םפווז־גל-יקוגן!
בנגד
ק ו ל ו נ ה של
o.D. 280nm
)Im-Cit6.0pHר א ה ח ץ ( .
גל
שריר
הפעילות
>
הבו פר
רן
נקבעה
הדוגמא
0.1
הבליעה
מיצוי
מכן
למ״ג.
)6
6
באלוציה
הוחל
"
ע
י
ל
נשטפה
ע"י
פ1.5ל
ו
ת
םוםפורילז
32 -
NH - Olye«Q«n־ C־ I t p t i
!S t p h - C , - WH
t
SO 4 0
20
-
40
10
NUMBER
50
JO
10
FRACTION
תמרנה מם * 7
ספיחה של פוםפורילז _b
התלות
למספר קולונות ספרוז מותפרות:
באמין האליפטי .תערובות של פוםפורילז _bו GAPD -
על סדרה של קולונות בנות 6מייל נפח שנשטפו ב . GP-ME -
הועברו
) PH 6.0 Im-Citראה חץ(.
אלוציה בוצעה ע" י העברת בופר
נאספו פרקציות בנות 1.5מ יי ל ונמדדה הבליעה באורך גל 280 nm
( ,פעי לו ח ) GAPD
)
התערובות
פ" ג פוםפורילז
יי -
ו
״ -
Seph-C
י
״ -
8
שהועברו
— & —(
הן:־
4.5
ו
״
_
־
-
לז )fc-־(-־
ופעילות פוספורי
9
4.1
-
י
5.1
bו -
4
.
9»4
-
3.6
5.0
4.9
5.0
5.0
ג" GAPD0ב 1.0 -מ" ל ״
-יי
ז!
יי
ב
ב
ב
יי -ב -
0.6״ .
1.0
0.6״ ־
0*9
בדי לאתר את סיבה ההופעה בקו לונה הנדונה הוחלס•על .מספר ניסויי
ביקורת
המתוארים בתמונה סם' .7
םפרוז בלתי מטופל.
ב
ע
ל
)Seph-C
NH־־Seph-C2
א ו
ע
בלבד.
בן אין
חהליך השפעול כשלעצמו
0
ל
4
.
מצ א נ ו שפ ו ספ ו ר י ל ז א י נ ו סעונב על
כ
מ
כמו כן נ מג א
א
2
C ) 0 ( H־
3
אחראי
לקשירה,מאחר
S e p h 0 ( N H
או
ן שהםפיחה אינה נגרמת מנוכחותו של אמין ראשוני
ש
־
Seph-C -1N(H2
8
מבודד פוםפורילז מחפיסה עם גאפי׳
מניסויי
באותה מידת הצלחה במו הקו לו נ ה המכילה בנוסף לכך גם גילי קו גן.
ביקורה אלה ברור היה שלגליקוגן תפקיד משני בקישור פוספורילז לקולונה,
אם בבלל.
א.
נתעוררו מספר שאלוח:
אם לגליקוגן אין תפקיד בקישור ,כיצד מסוגלת קולונה זו לנקות
פוספורילז
ב.
ממיצוי שריר ולהבדיל בינו ילבין גאפ"ד?
אם הקשירה לקולונה נובעת מנוכחותו של אמין טעון והקולונה
)NH0(C־ . Sephי י .־
י
פועלת המחליף י ו נ י ם ,מ ד ו ע
קושרים פוספורילז? מהי תרומתה של השרשרת הארוכה
לקישור?
א
י
3
tiH־ C־ Seph
4
2
C2NH־Seph8־
שאלות אלה הניעו אותנו לחקור אח סיבת הקישור של פוםפורילז
לקולו נות מסוג אסי נ ו -אל ק י ל-א גרו ז ו ח.
.2
תלות כושר הספיחה נאורו השרשרות האליפסיות הקשורות לםפדוז -
ברומסוגרפיה
הידרופובית
תמונה מסי 8מתארת אח הגישה שבה נקטנו
האליפסיות.
כנפרד יחיא
הוכנה סדרה הומולוגיח
לבידור תפקידן של השרשרות
שלקולונות
Seph-Cnשבה כל קולונה
ת ו צ ד ה ח ג ו ב ה בין אמין אליפטי לינארי בעל n,אטומי פחמן לבין
םפרוז םשופעל )ראה טבלה בשיטות(.
קישור האמין לםפרוז בסדרה זו נעשה
בנוכתות 4 0 $דיאוקסן ,בדי להגביר את מסיםותם של האמינ ים האליפטי ים
הגבוהים יותר.
כל אחת מן
גדולה של םפדוז משופעל.
הקולונות בסדרה סו נ ם ז ח.ב ת נ א י ם זהים מכמות
כפי שרואים בתמונה םס'
ביכולתן של הקולונות לספות את האנזים,
נספח לקולונה הראשונה )
6קיימת הדרגתיות.
ב pH -ניטרלי האנזים לא
! ,( Seph-Cהוא עוכב מעט בעוברו י דרך הקולונח
34
Stph-Cfc
-
Seph-C
C4־Seph
rr־—rד—1—1—1—1
r
Del A00H
Del. (pH5fl)(Q2N
I I
1
ד
1
§ 18
§.2
i 0.6
| 0.0
rr
18
גז
12
.r o
§ < 6
Oef.
I
o
I
0.
I I I -
ט
3
? 4 0גו
**
2T£20
I I
I
60
I
40
c a
w S 10
I
I
-I
20
0
חמו נה
מסי
8
םפיחה
של
30 40
0
10 20
30 40
number
הועברו
על
פוםפורילז
הקולוניה
על
b
) x 0 . 9ם ״ ם ( - :
פוםפורילז
ו
-
פ ו ספ ו ר י ל ז
ו
5 0פ •י ג
פ״ג
0 . 9 -מ» ל
על
1 . 0מ •י ל
על
, Seph-C4
1.0מ ״ ל
על
Seph-C
.
בנות
1. 6
-
4.0
פוספורילז
ו י -
4.9
פ"ג
GAPD
ב
-
פוםפורילז
-
4.9
מ"ג
GAPD
ב
-
)ב
-
(22°C
נמדדה
הבליעה
ופעילות
אלוציה
באורך
פוספורילז )
ב
ולבסוף
גל
אף ב
-
nm280
•. ( -•18
)
לאחר
fl
ו פ ר קצ י ו ת
( .
מולד
אגסיה
6
אף
!, Seph-C
4.2
פ"ג
, Seph-C
4.1
סייג
4.1
מ״ג
GAPD
שסיפת
ובמקרה
0.2
s
(,
ש ל C-Im-Cit־ S e p h
חומצה
)1-6
0 . 7 5מ» ל
מ"ג
הוכנו
Seph-Cn
= n
על
GAPD
ונשטפו
10 20
8
GAPDכ .־
בבופר1£ג־ G P
-1
30 40
0
הקו לו נ ו ח
ב
ו
׳
0
Fraction
סורח
5.1
10 20
•
c
a.
החלבון
ב
)ראה
-
שאינו
־Cit
חיצים(.
הקולונות
נאספו
מ"ל
)Ar-פעילות( -
ספוח
בוצעה
Im5.8 pH
35
ב
ד
ו
מ
-
.
ה לקולונה של גליקוגן-םפווז
ניתן היה לנתק את הפוםפורילז פקולונה זו
צ י טרט ,ב
-pH
ניםרלי.
ע"י הפעלה ר פ ו ר ם ו ,
על קולונה של
באופן כה חזק עד שגם דפורפר בעל
5.8
Seph-C
6
אימידזול
נספח הפוספורילז
pHלא היה מסוגל להוציאו.
ניחן היה לנתקו פהקולונה רק כתנאים דרסטיים הפבי א י ם ל ד נ ט ו רצי ה של
החלבון ואובדן פעילותו.
לעופת התנהגותו
ההדרגתית של פוםפורילז,
עבר ג א פ •יד אלוציה פידית פ סדרת קולונוח זו ללא עכוב.
כאשר השווינו את הםפיחה של פוספורילז על סדרת הקולונות ההופולוגיח
Seph-Cn.
,לםפיחה על קולונות הםפרוז-גליקוגן שבהן םקשר בין
לספרוז
הגליקוגן
אוקטה מתילן די אמין לעומת טסרה מתילן די אמין ,ניחן היה
להסיק שיש קשר בין הםפיחה ובין אורך השרשרות האליפסיות הקשורות לספרוז
בחםונה מם' 9מתוארת העברתם של שלושה חלבונים אחרים על הקולונה
נמצא כי בתנאי הניסוי שלנו
Seph-C
4
מסרום בקר אינם נספחים על קולונה של
.
ו -גלובולי,
ליזוזיםאלבומין
. Seph-C4
»;'• י
ה נ י ם ו י י ס הפח ו א ר י 0בתפונות 8ו 9 -העלו אח האפשרות שניחן
להשתמש
בקולונוח אלה לניקוי של פוםפורילז ,בשיטה כרוטטוגרפיה חדשה המבוססת
על הכושר של חלבונים שונים להספח לאלקיל אגווזות.
בחפונוח פסי 10ו,11-
Seph-Cn
המיצוי
וםינטחז
הועבר פיצוי משריו ארנבת על סדרת הקולונוח
ועל סדרה הופולוגיח נוספת
מסי 3.מכיל מספר רב של
בניסויים הפחוארים
2
. Seph-Cn-NH
מיצוי משריו אונבח
חלבונים ו ב יו מול ק ו ל ו ת אחרות ,כפו כן מכיל
פוספורילז בעל פעילות ספציפית של כ 10 -יחידות ל -מ"ג
בעל פעילות ספציפית של כ -
כאשר
0.15יתירות ל -מ״ג.
מעבירים 10מייל מיצוי שריר המכילים בסנהיינ כי 240 -מ״ג חלבון על
הסדרה
ונים
nm
, Seph-Cnמרבית החלבונים )בדי (90$אינם נספחים.
שאינם נספחים יורדת ככל שעולים במספר
יוצא
ללאםפיחה פ -
78$מ-Seph-C
3
!
$
6
8
ורק 65$ם4-Seph-C
ג וו י א ניט טל ת נתון כלורי.
89$
,
,
n
Seph-C
.
במות
מהחלבון
מ
r
Seph-C
,
אלוציה בוצעה ע״י העברה
פוספורילז וםינטחז נפרדים יפה על הקולונוח.
36 -
E
c
O
00
CM
>a
u
c
o
XI
o
1/1
20
30
number
תמונה
השואת
!Seph-C
יכולת
DOי
9
ה ט פ י ח ה של כסה
מייל
מסרום
מ״ג
נאספו
אלו ציה
ב-
ב ק ר 10 -
0.7מ ״ ל ,
סוספורילז
מ״ג
ב-
פ ו ם פ ו ר י ל זb-4.2
מייל
נעשתה
בבופר
ר
ב
ע
נ ש ם פ ו בכופר
ל י ז ו ז י ם 4,0 -מ" ג ב 0.7 -ם •י ל,
0.4מ ״ ל ,
ונמדדה
א
סיים(
)0,9x8
ה ו ע ב ר ו ע ל י ה ן -1
הנאות
פרקציותבנות
של
לקולוגה
4
• Seph-C
בנוח
5
והוגיפות
אלבומין
3,3
חלבונים
כ ל אחת
GP-ME
10
Fraction
גלובולין
מ"ג
הבליעה
Im-Cit
ב-
באורך
)ראה
מסרום
0.6
בקר
ם"ל,
ג ל . nm2801.6
חץ(,
-
37
nארבע
ו
תמונה
מם'
ספיתה
הדרגתית
קולונות
בתנאים
זהים
10
של
של
פוםפורילז
ממיצוי
וםינתטז
הועברו
קולונה
סמוך
של 1
מולי
מייל
10
נשטפה
לאפס.
אלוציה
NaCl
)
עד
בוצעה
ע״י
בבופו1£ן.0?-
(,
סינסמז
מיצוי
שריר
בנופו
מייל
וגליקוגן
שריר
"
בבופר
המוליכות
א ר נ ב ת על 0דרח
) . ( S e p h - C nכ על
.
קולונה
כל
-
ונמדדה
פעילות
בנוכחות
.
מסי
3
)חלבון
שהבליעה
24
באורך
העברת
ג ר ד י א נ ט מלח
ובנפח
של
עבורן
פוםפורילז
גלוקוז
על
סופי
40
ב
מ״ג
-
-6פוםפט
מייל(
NaClע ד לריכוז
נאספו
מייל.
0
)•--
כל
ג לnm280GP-MEירדה
nm
הבליעה באורך גל
ב נ ו כ ת ו ת ) AMP־(_-.-
(.
ן וו
)—•
38
100
-
60
80
number
תמונה מם'
םפיחה
-
h
e
p
S
2
הדרגתית ש ל פוםפורילז וםינתטז ממיצוי שריר ארנבת על סדרת
'
השטופות
m
מייל של מיצוי שריר
.
280
בכופר
הבופר.
nm
. GP-ME
ריכוז
ם••
חלבון שאינו
ספוח נשטף עד שהבליעח באורר
,
ל א פ ס א ל ו צ י ה נ עשת ה ע׳ י
העברת גרדיאנט
פ ר ק צ י ו ת ב נ ו ח 1.7מייל נאספו ו הבליעה שלהן
נמדדה )
-6פוספט
מ ם ) 3בריכוז
מ)0.9x8
ירדה סמוך
באוחו
40
Fraction
11
"
n
20
)—«—(
( ,כן נמדדה פעילות םינסחז בנוכחות גלוקוז
ופעילות •פוספורילז
המלח בפרקציות
שימוש בגרף כיול.
באורך
השונות)
בנוכחות
« ( • — o — ) AMP
( נקבע על פי
המוליכות 'חיך
מלח
גל
39
!Seph-C
כבר ב _
כדי לנתקו מ -
לא הצלחנו
נספח הסינסחז וניחן
Seph-C
לאלוציה במלח ) 0.5מילר(,
יש להפעיל ריכוז מלח גבוה יוחר )0.6מולד(.
2
לנתק סינטתז פעיל מהקולונוח
3
ע״י הגדלח ריכוז המלח עד ל 0.85-פולר.
S e p h - Cה פ ע י ל ו ח הנספחת ל
חת ל
Seph-Cו -
4
Seph-C
פוספורילז אינו
מעוכב
.
4
השתמשנו
אינה ניחקח מהקולונה בגרדיאנט המלח בו
כאשד מעבירים 10מ״ל מיצוי שריר המכילים כ 260 -מ״ג חלבון
S e p h - C n - N Hש ו ב מרבית החלבונים
מ ולוגית של הקולונוח
2
אינם נספחים.
הירידה
במקרה זה קטנה יוחר מאשר על הסדרה
2
-
S e p h - C
3
2
נספחים רק
עוברים קרוב ל
מכלל
9 9 $
היא 96$ו מ-Seph-C -NH
5
2
2
Se
2
.
-C
מלח.
וא נ
4
NH-־
5
.
2
H
2
N
-
N H־ S e p hאי ל -
2
פוספורילז מעוכב ונספח חלקית כבר על
ל קו לונה של
האנזים ואלוציה במלח
יוצאים רק
ואינו ניחן לאלוציה במלח
2
)עד לריכוז של 0.7סולר(.
6
בקולונה
וניחן ל א ל ו צ י ה ע ״ י גרדיאנסSeph
הוא נספח בחוזקה ל-Seph-C -NH
ע
בקו לונה
מהחלבונים ללא םפיחה-100$
2
כ -C -.91$ -םינטחז אינו נספח בסדרה זו ל
פח ל
, n
מה ח ל ב ו נ י ם ב מ ו ח החלבונים היוןיאח ללא.
טפיחה מ-Seph-C -NH
4
עלפי.
. Seph-Cn
החלבונים.0.35$
עוברים
0ה
,
גם כאן כמות החלבונים שאינם נספחים יורדח עם עלית
NH- Seph-C
nm280
.
על
Seph-C
מקבלים ספיחה מלאה של -NH
2
6
( .מולדNH- Seph-C )0.5לא ניחן היה
8
2
לבצע א ל ו צ י ה על ידי העלאת ריכוז המלח )עד ל 1.0 -פולו( ,אך ניתן
היה לנתק את האנזים ע •יי נופיו רפורמציה )לא מודגם(,
הממצאים
ניתנים
א.
הדרגתית
המודגמים בשלוש התמונות האתרו נ ו ח ו בטבלה מם' 3
לסיכום באופן הבא- :
קיימים תלבונים נוספים ) פ ר ס ל פ ו ס פ ו ר י ל ז ( המגלים ספיחה
התלויה ב
. 'n -
תופעה זו ה ו ד גמה לגב י ס י נ ט ת ז•'.:,״'
על פי ירידת כמות החלבון א ש ר י א י נ ה נספחת לסדרת קולונות
הופולוגיוח ניחן להניח שחלבונים נוספים פמיצוי שריר,
עוברים
ספיחה ככל שמגדיליים את םספר הפחםנים בשרשרוח הפתמיפניות.
-
ב.
40
-
התופעה אינה מוגבלת לסדרת הקולוניה
2 S e pק י י מ י ם הבדלים בין הסדרות
למשל,
.
,
Seph-C4אך בסדרת ה -
פוםפורילז נספח כבר על
נחוצות
Seph-Cn
בלבד ,היא
שרשרות בנות 6פחמנים כדי לספות אנזים זה.
Seph-Cn-NH
2
בדומה לכך,
! Seph-Cבסדרת האלקיל אגרוזות ,אך בסדרת
סינטתז נספת כבר על
ת
4
2
פחמנ י ם.
ג.
המפיחה ההדרגתית של פוםפורילז שהודגמה קודם לכן עבור
תערובות של שני אנזימים קיימת גם עם פוםפורילז ממיצוי שריר
המכיל מספר רב של חלבונים נוספים.
כללי ,כאשר עוברים בסדרת קולונות הומולוגיות מקולונה
באופן
nקסן יותר לקולונה בעלח
בעלת
מ גדול יותר ,עוברות הקולונות ממצב
של חוסר יבולה םפיחה לגבי חלבון נתון ,דרך עיכוב ,י כ ו ל ח ם פ י ח ה
י־ב ר ז י ב י ל י ת ,לספ י ח ה כה חזקה שקשה לנחק אח החלבון כשהוא פעיל.
טבלה מסי' 3
טבלה מסכמת של
ספיחתפוספורילז וםינסחז לסדרות
ההומולוגיות של הקולונות
6
8
) (+
) (+
)(+
(*-) .
)<±
)frmCit ) (imCit
)( .
) (+
ft
)(s
) (+
) (+
+
)(i
)(imCit
5
)*(
4
) - (-האנזים לא נספה
3
2
1
)־(
)־(
)־(
)(+
) (+
)־(
)־(
ill
Seph-Cnו -
)־(
לקולונהזו.
ף.ו
& .
)־(
;7
)־(
7
Sepfr-Cn-NH
?
Phos.b
Sepiwuu
II
Syn.
Phos.b
2
NH־Seph-Cn
Syn.
) - (-האנזים נספח וניחן לאלו צ יה,
) - (Sאלוציה במלח )נחרן כלורי( ב pH -ניטרלי.
)
- (ImCitאלו ציה בנופו א י מ י ד ז ו ל צ י טרט ) 0.4מול ר( ב pH -ניטרלי,
)- (+
םפיחה חזקה שבה לא הצלח נ ו לקבל אלו צ י ה של אנז ם פעיל.
-
.3
41
-
שימושים בקולונות הידרופוביות לבידוד אנזימים
השתמשנו
בכמויוח
המצוי
בקולונוח הידרופוביוה לבידודם של אנזימים המצויים
שונוח ברקפוח.
בכמויות של מ -
נתאר תחילה בידודו של פוספורילז משריר ארנבת
3-1גרם לכל ק״ג שרירים
)•(99
אנזים נוסף
שבודד הוא ג ל י ק ו ג ן ם י נסתז משריר ארנבת המצוי ככמות של 100-50מ״ג
).(90
בק״ג שרירים
לבסוף נדון בבידודו של גליקוגן סינטתז מכדוריות
דם אדומות שבהן הוא מצוי בכמות של מיליגרמים בודדים בק״ג של תאי דם
אדומים )
א.
• ( packed cells
בידוד פרפרטיבי של פוספורילז משריר ארנבה
אנליזה של התוצאות המתוארות בתמונוח 8ו 9 -מראה שהקולונה
Seph-C
4
מתאימה לבידוד פוםפורילז . b.
העברת מיצוי שריר על גבי
בספיתת
)לפי
פוספורילז b
קולונה זו.
מתוארת12
בתמונה מם'
נמצא שהקולונה יעילה מאוד
ממיצוי שריר ארנבת.
יותר מ -
95$מהתלבונים
הבליעה ב ( n m -280אינם נספחים על הקולונה ויוצאים מיד
הראשונות שנאספו עבור קו.לונה זו• .י בפרקציות אלה אין
בפרקציות
במוח ניכרת של פעילות פוםפורילז.
על הקולונה בדפורמד אימידזול ציטרט
של חלבון ולה•פעילות פוםפורילז b
לעומת זאת ,באשר מוחלף הבופר
)7.0
(pHיוצאת כמות קטנה
גבוהה מאוד.
פעילותו
הספציפית
של החלבון היוצא )שנמדדה לאחר דיאליזה לסילוק הדפורמר( היא
68יתידות ל -מ •י ג תלבון.
פעילות זו קרובה לפעילות המדווחת
עבור אנזים נקי ומגובש המגיעה לכדי
הפעילות
80יחידות ל -מ״ג תלבון
הםפציפיח אינה קבועה בפרקציוח האלוציה.
לכך היא נוכחוח חלבון או
)(80
הסבר אפשרי
חלבונים נוספים בפרקציוח האלוציה.
בתמונה מם' _ 13נראית אלקטרופורזה בפולי אקריל אמיד גל ובנוכחות
SDS
ו -
. ME
מהתמונה ניתן •לראות שפוםפורילז מתנקה על הקו לונה
באופן ניכר ,אך האנזים המנוקד .עדיין מכיל כמות קטנה של תלבונים
נוספים
בהשוואה לאנזים שגובש שלושה גיבושים חוזרים.
42
60
40
50
-
30
10
20
Fraction number
S
4
תמונה
מם *
ניקוי
כמותי
של
'
יחידות
שנשטפה
2
פוםפורילז
מייל
-
m
o
n
בבופר
.
של
םפוח
GP-ME
אלוציה
ש ל פ ו ספ ו ר י ל ז
של
GP-ME
.
שריר
ל
מ ם 1
בעלי
פעילות
פוספורילז
)4Seph-C
פרקציוח
.
ופעילוח
בוצעה
ממיצוי
מיצוי
שריר
ארנבת
על
קולונה
של
נ קבעה
ע"י
פ ר ם פ ו ר י ל ז ל א ח ר
בופר
לאחר
בנות
2.6
) Im-Citר א ה
דיאליזה
של
ס״מ(
מייל
נאספו
שטיפח
חץ(.
הפרקציוח
ונםדדח
החלבון
הפעילות
כנגד
100
הבליעה
שאינו
הספציפית
נפחים
-
43
©
תמונה
לפוםפורילז
באקריל
בשלבי
אמיד גל
הניקוי.
-
'
בנוכחות
הדוגמאות
שנבדקו-:
חלבון
-
ME
.(Y50
!Seph-G30
פוספורילז b
האלקטרופורזה
10
©
©
S.D.Sו
) 1נמות
- C
B
A
13
אלקטרופורזה
שריר מם
0
©
©
מסי
-
מילימולר
בוצעה
מדקפטו
מגובש
) ( Y
שלוש פעמים ) \. (24
ב ג ל י ם ש ל ,5$
אחנול ב -
7.2
בנוכחות
pH
0.1$
)ראה
S.D.Sו
שיטוח(.
-
- 44
על פי
יעילותה של קולונה זו גבוהה.
מדידת
לאחר אלוציה נמצא כי נצולת הניקוי היא .95$
במיצוי
הפעילות המת קבלה
הו איי ל .ו לפ ו ספ ו רי לז ־
שריר פעילות ספציפית של 0.7יחידות ל -מ " ג חלבון והפעילות
של האנזיס לאחר ניקוי
ב ק ו ל ו נ ה ה י א עד כדי 68יחידות ל -ם"ג חלבון
הרי שהאנזים נוקה על קולונה זו עד כדי פי .100
הפוםפורילז
יש להדגיש שמרבית
במיצוי שריר ומוכיח האנזיח באלו ציה היו בצורה b
)ראה סעיף 4של פרק ההוצאות(.
ב.
בידוד םינסתז משריר ארנבת
התוצאות
S e p
4
המתוארות בתמונה פסי 11מראות שקולונה נוחה להפרדת
.
14. N H -בתמונהמסי
מ
2
ס
העברה כמותית של מיצוי שריר ארנבת על קולונה זו,
מיצוי
ו כמת
70מייל של
שריר המכילים 1,750פייג חלבון ופעילות םינטתז של 0,2יחידות
ל -מ״ג חלבון הועברו על קולונה קצרה של C־ NH־)Seph102.4x
4
במוח חלבון גדולה עברה בקולונה ללא ספיחה.
ס״מ
2
פ ר ק צ י ו ת אלו הכילו
אח האנזים גליקוגן פ ו טפ ו ר י ל ז א ך לא פעילות של גלי קו גן טינטתז.
עייי הפעלת גרדיאנט פלת לינארי ניתק .ה ס י נ טח ז פה ק ו ל ו נ ה.
הפעילות
שי א
האנזיפחית יוצא מהקולר נ ה בריכוז פלח של 0.18 -טולר.
לפרקציות אלה פעילות ספציפית של 7יחידות ל -פ״ג חלבון.
שהניקוי על קולונה זו היא פי .35
האנזים
פכאן
נצולח הקולונה היחה 70$מכפות
שהושמה על הקולונה )על פי חישובי פעילות(,
פותתה שיטת ניקוי לגליקוגן סינטתז המבוססת על שימוש בשתי
ק ו ל ו נ ו ת ה י דרו פ ו ב י ו ת .
ו על קולונה של
NH־ C־-Seph
2
השיטה כוללת הפקת מיצוי
ב
3
H
p
.
שריר)ךא,1
ניטרליהפרקציוח
אשר לא •נספחות לחו מר קו• לו נ ה ־.זה מועברות על קולונה של
י
שיטוח(,
Seph-C-NH
2
4
האלו ציה יפכו צעת ע יי י גרדיאנט מלח והאנזים שן אסף מושקע פעמיים
ע יי י הוספת גליקוגן ) '0,5מ*• ג ל -מייל( ואתנול ) 30$בהשקעה
הראשונה ו 15?$ -בהשקעה השניה(,
-
45 -
Fraction Number
תמונה
מס*
ניקוי
ל
-
של
על
מ״ג
קולונה
בכופר
חלבון
וגליקוגן
C
של
. GP-ME
סינסמז
מייל
4
1,750
מ״ג
כמותי
גליקוגן
Seph-C -NH2
. 70
הועברו
•14
־
לאחר
2
H
של
ממיצוי
מיצוי
סינססז
N
שהחלבון
-
שריר
שריר
בפעילות
4
ארנבת
ארנבת
על
פסי
ספציפית
קו ל ו נ ה
3
של
הבלתי
ספוח
נשטף
)על
פי
נאספו
ופעילות
נקבע
ע״י
בהן
פוספורילז
מדידת
פעילות
סינסמז
בנוכחות
בנוכחות . ( — o —) AMP
המוליכות
תוך
שימוש
בגרף
ריכוז
כיול.
-6פו0פם
המלח
שנשטפח
הבליעה
7
גלוקוז
יחי
0.2
x 2 . 4 )Seph"100מ (
(
ונקבעה
המכילים
מייל
)
• ( -
) • • • ״ (
-
46
10
20
30
Fraction Number
חמו ג ח סם' 15
השגת ניקוי יחר של גליקוגן
בעלות n
Seph-Cn-NHj
על קולו נ ה של
מייל נפח(.
NH־
2
שונה.
Seph-C
4
MNaCl0.5
200מ" ל,
280
nm
קולונה
3 0 0מייל של מיצוי שריר סס' 3הועברו
שנשטפה בבופר
(GP-ME2
ס יי מ קו סו,100
הקולונה נשטפה באותו נופו עד שהבליעה באורך גל
ירדה ל ) 0.2 -שלב זה אינו
נט מלח עד לויכוז של
םינסחז ע"י
השימוש בקולונוח מסדרת
בנופו
נאספו
) — • — ( ,
-: A
מופיע בגרף הנייל(.
E
M
-
P
G
.
מוקציוח ננוח 7מייל ו נמדדו-:
280nm
האלוציה ג ו צ ע ח ב -
ובנפח
סופישל
הבליעה באורך גל
פעילות םינםסז )־־0־•( והמוליבות )״״׳״(.
מיצוי
השריר טופל קודם להעברתו ב ק ו ל ו נ ה של Seph-Cj-NHj
בעלת מיםוים זהים לקולונה הנ״ל.
הפרקציוח הקדמיות שהכילו אח כל
הפעילות ונפחן היה גם כן 300מייל הועברו על הקו לו נד• ה נ יי ל.
ק ו ל ו נח
-: B
מיצוי
השריר הועכר ישירות על הקולונה הנייל.
שחי חכרו מטו גרפ י ו ח טופלה הקולונה הנייל כמתואר נפרק שיטוח.
כין
-
47
B
תמונה מם'
אלקטרופורזה
A
16
באקריל אמיד גל בנוכחות
מנוקות של גליקוגן םינטתז.
pH 7.2
A25
C4 -
-
בנוכחות S . D . Sו
Y
-
S.D.Sו M E -
של פר קצי ו ח
האלקסרופורזה בוצעה בבופר פוספט
M E -עבור הדוגמאות-:
של מיצרי שריר מם'
סינטחז מנוקה לאחר הקולונה של
3.
SephNHj־־
-
48
-
—*
P
vi
^P
—3
—נ!י
P
to
Ol •
<t
o>
•
-JU
3
p5
a
־
K
I
a
u
\T
3
•J* -
1
טן
&ו
0ו
03
&ר
•
_
j
I-o
o
—1
u
^
a
*A
ו
5!
טז
3 U
CD
3-J O3
O
! "
י3
Oo
»יט3
3*
o•
a טט
•
ו
3U
1
wo
o
W
oOD
ו->גכ
O
oco0נ
wo
CD
Oo
I?ט
1
wo •טן
w o טז
D
0
tf*
•
עי
<»
J•J•
—J
oOlOl
a
3
NTS
ט
P=
ט
UvT_j
3'
u
ן
ט
1
J
= %
Oloטן
o
P
CD
? ט-o
o W
?ט
o
VJU
3
U8
3
_J
a
uט
a
M
3
oo
0כ
oo •
o•
Oi • 01
o
CO iw |w
CD
&׳
מa a
O D ט
ן1 _• ו6
a
<3
_J3•x 14 >J
D D
•*
ט
u
p 3
VJ
PU <a
3
-13%
4
ט%r 3
• ו%f
3«« VjJ
ט
טu
3ט
t
l
•»
4
*»
_»
1
4
-J
t
o
_J
K
3
UvT
Q
49
ה עקרון
זו
תמונה
ישירות
מראה
על
את
כפי
שרואים
קולונה
חלק
יותר
מהשוואה
של
יותר
אם
השתמשנו
נראה
לכתף
שיטת
באקריל
מתמונת
מכן
גל
גליקוגן
סינון
B4
•
של
NH .־Seph-C4
את
ההמוגלובין.
2
ואין
אלוציה
גליקוגן
מימדי
הקולונה
לשטיפה
כל
בטבלת
םינטתז
הםוליזאט
.
כן
בהן
אך
של
כ מ ו ת יק.טנה
המוגלובין.
טינטחז
הקולונה
במידה
של
ואח
ניכרת.
ההמוגלובין
דם
מסי
באותם
המחקבל
NH־־Seph-C3
2
הפרקציות
תמונה
כ
אשר
אינן
פסי
-
גבוהה
30$
_.(15
השיא
השני
הדבר
בניסוי
םינטתז.
של
נראה
מהקולונה
.4
כמוח
בתמונה
)מאדם(
על
המבודד
קטנה
שלא
פרקציות
חלבון
נספחו
מאדם,
כמויוח
ונראה
גדולות
שהפעילות
של
2
המוליזאט
על
הקולונה
כל
קולונה17
מכילות
מלחלינארי
האנזים
ס י נ טח ז ,
נוחה
להפרדה
שכאשר
הגדלנו
יותר
םפרוז
פעילות
גודיאנס
ב פיק ב י ל
שלבים
NH־Seph-C4
קולונה
את
פעילות
המועברת
בשני
של
על
אלו
נמצא
בודד
על
ה י ה ש ק ו ל ו נ ה ז ו
אך
מטי
קולונה
של
ע " י .הפעלתי
ובה
.16
אדומות
דםאדומות
ההמוליזאט
הענות
דם
אדומות
החלבון
האליקםרופו רזה
מופיעה
האנזים
הענות
םאריחרוציטים
במוח
2
Aהיא
שבה
ניקוי
מכילות
אין
)ראה
המנוקה
פרקציוח
כמו
השיא
B
בניסוי
מכדוריות
מולקולרי
.
דיר Seph-C4־ . NH
2
כדוריות
מראה
קודם
.
הפרק צ יה
של
ניסוי
מועבר
בקולונה
מועברות
ב nm -280
ס י נ ט ת• ז .מ כ ד ו ר י ו ת
ת מ ו נ ה מטי
הפוםפורילז
של
A
מושם
Seph-C4־ ובאמת,
בניסוי
הבליעה
ההפקה
העברת
בה
מקבילות
פםוכפת
גליקוגן
חלה
פרקציות
בלבד
אמיד
ולאחר
של
מכן
שריר
השריר
הניקוי
לכן
.15
(Aואילו
מכן
.
בניסוי
בידוד
ע" י
ורק
אלה
קודם
לאחר
מיצוי
ו ר ק •לאתר
ניסויים
N
הספציפית
מפרקציות
ג.
3
מיצוי
)Bניסוי
כאשר
2
סהחלבונים
גם
המתקבלת
כתמונה.׳'00
כאשר
2
NH -Seph-C
H
הפעילות
הופך
של
סינטתז
שני
הוא יעיל
2
הזה
של
של
המתוארים
NH־4Seph-C
תמונתהאלוציה
לכן
להרחקת
את
בניסויים
האלוציה
קולונה
דרך
תנאים
דלעיל
מראה
מודגם
-
אח
ירדה
יעילות
דורשת
רב
האנזימתית
זמן
אובדת
-
40
חסונה
מסי
בידוד
גל י ק ו ג ן
מייל
20
מייל
הועברו
על
ב
של
ג ל יקו ג ן
200
ם י נ שח ז
מ"ל
מכדוריות
המכילים
)(3:1
בבופר
GP-ME
עבורן
נשטף
-
באורך
גל
.
( •A
והאנזים
. I M NaCl
(—0
אדומות
דם
המוגלובין
על
C NH־Seph4־
2
בריכוז
של
) 1 0 x 2־ ( 4
פ ר ק צ י ו ח ב נ ו ת 300ט י פ ו ת
פעילות
פוספורילז ) ,
ל
10
מ״יג
97
ם״משנשטפה
2
פפוח
והבליעה
35
25 30
number
15 20
Fraction
5
17
ונמדדה
שאינו
r
ן
ח—1
Seph-C NH
C23° -
נאספו
50
1
המוליזאט
קולונה
-
גליקוגן
וריכוז
הועבר
םינסחז
ההמוגלובין
אלוציה
לפרקציוח
)—, (--#
אלה
. ( — n m 280
ע״י
נמדדה
-6
פעילות
)—.(—Q
העברח
גם
)כ
מ"
גרדיאנט
המוליכות
החלב
בן
)•״•
51
OJ
CD
.:
-
3
(-י
OJ
Oo
CD
&י
—
J
•
o
u
-«
%
O
0
O
o
u<
ב3.3
o
©
o
0
יחיד
to
CO
b
U
a
—r
גז
עי
Ul
o
O
O)
o
ro
.1
&
_*
3
to
H•
O
o •
OJ
O
O
o
0)
o
- י
דרגח
נם
0ג
M
3—1
Oto
X
ט
6 •׳
*3
ט נם
OJ
o
O
o
עי
w
r o
a
J
ID
i
a
-*'
u
•J•
h
-*
ט3
1
ט ן
<e
_l
-!
״Jf
uט
-«
3
o
0
I-
o
s
Ol
1
o
.
b
o
בי
r o
o
D
o
Ol
-HI
י
u
עי ט
_l
o
G
e
o
—<
y
_j
י
צ
-*
o
to
o
©
Ol
OD
<-׳
%r
sP
י3
w
a
»»
O
D
:a
NT
u
U
G
o
to
Ol
o
P
ose •
>-i
W
OO
o
o
©
Seph
%r
Ol
f-i
©
OJ
o
CD .
CO
U
׳a
-טו
O
ם
t,
2
a
עי
NT
-4
a
3;
X vr 3
OJ 3
tf עי
י019
O
' » ־ ״
~J
a
u
3ט
UJ
״
,
-J
-י
^
,
J
a
עי
;ע.$
3
N*j
*J
v•T
H
־
D
3
U
63
52
החשיפה
בגלל
לא
האנזים
ע"י
על
חומר
עם
כ מ ו ת ה מ ו ל י •ז א ט
עד
נשטף
העברת
ו ר ו כ ז ו ע״י
לאחר
הקפת
אח
וי
המרשים
שמושג
כולל
בשפע
שהושג
ולהפריד
)ב -
מייל(,
גליצרו
קצרה
נאספו
יבש
ואלוציה
והועברו
בקור
הועבר
פוספט
על
נעשתה
דיאליזה
) . (c4°
של
קולונה
גל
על
.5
ולאחר מכן
600
מתנקה
פי
נקי
למדי
נראה
6
פוליאקרילאמידי.
ה נ י ס ו י שח ו .א ד .ל ע י ל
Seph-C -NH
בין
חלבון
2
לבין
ויכולתה
4
חלבון
אחר
המצוי
( Seph-C
עך כה
שהאנזים
הוא
3 , 6 0 0ה א נ ז י ם
קולונח
בכרומטוגרפיה
2
על
להפריד
בריכוז
- N H
ק ו ל ו נ ו ת של
4
נמוך
ה ו א
אגרוז
עם
מאוד.
היעיל
שרשרות
אליהן.
הידרופוביח
הצורות
ה ה פ ר ד ה של
בין
ה צ ו ר ו ת ה א י נ ט ר ק ו נ ברטי ב י ל י ו ת
בחקר
לנחק
)
ה ש ו נ ו ת של
הקולונות
הצורות
האנזימים
7.0
ניקוי
פי
מסי
נמצא
מתנקה
מדגים
)על
בין
Seph-Cn
ניסוי
-
חומר
של
וסינטחז
הבחנה
כושר
4
פי
קשורות
פוםפורילז
=
הפעילות
ל
במשך•.15דקוו!
כופר
קולונה
והאנזים
בטבלת
(.
)המוגלובין(
כרומטוגרפיה
שני
מ" ג
ג ד ו ל ה של
Sephadex
דיאליזה
מהקולונה
ה ה פ ר ד ה של
פ חם י מ נ י ו ת
א.
הלבן
ספיחהפרפרסיבית
עורבבה
130
נשפכה
הפרקציות
מסוכם
ושחרורו
בשלב אחד
ביותר
זכוכית
שוב
הםינטתז
כושר
כאן
בכמות
ע"י
שטוף
מ" ל,
ה ש ק י ת ב G - -100
אלקסרופורזה
המצוי
) כ 100 -
הקולונה
הועברו
ספיחחו
ע"י
קולונה
התהליך
. 4B
)ניקוי
B4
מסנן
דרך
כדי
קולונה ,אלא,
תומר
גרדיאנט מלח.
ניקוי
ע״י
גדולה
מתומר
הריכוז
ספ ר ו ז
מ נ ה ישל
על
שהלבין.
ע"י
על
העברה
איטית
הקולונה.
הקולונה
םפרוז
הממושכת
לטמפ'
התדר.
ל ק צ ר את
נוקה
פוספורילז
n
(
חלבון
-: ( p H
ההידרופוביות
הודגם
פוספורילז
וםינטתז.
ה ש ו נ ו ת של
.
נוסף
a
ו פ ו ס פ ו ר י ל ז _b
מקולוניה
ע"י
פוםפורילז
וסינטתז
אלו
נשטף
הפעלת ישני
הועברו
גם
ביכולתן
תערובות
על
ה ח ל ב ו ן אשר
גרדיאנטים
משריר
סדרת
לא
בזה אחר
להבח י
של
הקולר נוח
נספח
זה
ונעשה
53
בתמונה
פסי
_1
)(1
גרדיאנם
)(2
גרדיאנט
גליקוגן
-Seph-C
ו
.
4Seph-C
,
עם
ככל
מ
(,
mmho
גרדיאנט
תוצאות
פוםפורילז
ו
על
כן,
כפי
האנזים
על
לאחר
של
Sep
4
מכן
5.8
ועובר
גרדיאנט
במקרה
כאשר
האנזים
אחרים
b
Seph-C
4
כבר
על
של
ניתן
הוא
ל
לקולונות
כפי
)תנאים
שנראה
אלה
הכופר
קיצוניים
מלח
אפילו
ל
יותר
בריכוז
פ ו ס פ ו ר י ל ז _a
_ . aע " י
מגיעה
גבוה
עלSeph-C
השונות
פוםפורילז
מוליכות
חלקי
-
וכן
!
לנתק
ריכוז
נספח
ונספח
לספרו ז ,
האנזים
כאשר
ניתק
Seph-C
b
מנסים
ע״ י
מעבר
ב ק ו ל ו נ ה של
בתמונה
ו ע"י
מסי
הורדת ה
)
כ
מלח
מהקולונה
ע"י
אפשרות
אחרת
פוםפורילז
-
שמוליכו
ע״י
רק
19
ל
בופר
שיא
שאינה
b
ללא
עיכוב,
ציטרט
ל
-
האנזים ב
-
0.38
ל י י ש ם את
מולד
מולו
תמונה
התלויה
במיצוי,
למשל
בפוםפורילז
קינאז
באותו
ניתן
pH
יוצא
היא
להעביר
חערובח
אינו
ניתן
וב
נספח
לניתוק
-
ע"י
ניטרלי.
pH
אימידזול.
התוצאות
ממיצוי
מהקולונה
בריכוז
אימידזול
הנ״ל
שריר
צורות
א י מ י ד וז ו
כאן
a
Seph-C
2
שתי
פוספורילז
פוםפורילז
0.7
מתגלה
רפורמציה
של
אי
לנתק
הפעילות
שבו
a
ל ס פ ו ת את
-5.8
מודגמת
מתערובת
!Seph-C
ניתן
pH-
הפעלח
פ ו ם פ ו ר י ל ז ^. a
הקולונה
ניתק
כי
ניתן
להפריד
בלבד.
אימידזול
זה
b
אינו
3
הקשורה
דרוש
הניתוק
4
שמתואר
p
דרך
מופיע
Seph-C
-
מולר.
H
-
0.8
מולר.
פ ו ם פ ו ר י ל ז _a
!Seph-C
Seph-C
מראות
ל נ ת ק את
0.35
של
2
Seph-C
אלה
פוםפורילז
ל
ל
מולר.
). (2
a
את
הפעילות
של
ji
לאלוציה
מ -
3
ובמקרה
העברת
ב
ושיא
-
0
על
נספח
הפתמימנית
הדרושים
לניתוק מ
mmho16
יתר
זו.
nגדל(.
)(1
-
-
_
ו
מעוכב
הזיקה
השרשרת
התנאים
ש
ה
א
פוםפורילז
בסדרה
התארכות
גרדיאנט
23
ציטרט
בין
בין
0
0.'5 -
S
לעומתו,
מקיצוניות
.mm
נתרן
איםידזול
2
שאר ה ק ו ל ו נ ות
יותר
לינארי
של
של
בלורי
פוםפורילז
Seph-C
גדלה
-
בהפרדת
כנראה
הצורות
השונות
בפעילותם
ובפוספורילז
של
פוספטז.
של
אנזימים
-
-
54
FRACTION NUMBER
תמונה פסי
18
הבחנה בין
הצורות השונות של פוםפורילז ע״י
.
אךבעק ו ל ו נ ו ח
כרומטוגרפיה על פדות
) ( S e p h - C n
מימדים זהים ) 1x8ס״מ( ־MAנשטפו והוכנו
בתנאים זהים
בעלות
ב ב ו פ ר , G P
על כל קולונה הועברה חערובח של אנזימים מנוקים 9 :ם״ג פוספורילז a
5 . 7מ"ג פוםפורילז
ו -
לא נספח נשטף באוחו
N
a
.
5
b
ב -
0 . 9מ״ל נופו
בופר ו א ל ו צ'י ה נוסחה ע" י
ע ר ל ריכוז של
0
4 0מייל.
סופי של
. GP-MA
מיד לאחריו
,
M
שטיפה בנופו
חלבון אשר
החמיםוח הבאות-:
בבופר
G P - M Aובנפח
G P - M Aעד שהמוליכוח
חזרה לערכה ההתחלחי.
C
־
I
m
8
.
עד לריכוז של
0
M
ב -
p H 7 . 0ובנפח כללי
של 4 0מייל.
נאספו
)
-
פרקציות בנות 25טיסות
(
)עירור
(—•—) A M P
ב
) 1 . 6מייל( ונמדדה הםלואורסנציה
nm280
ובהעדר ( — O — ) A M P
' , ( — Aפ ע י ל ו ת םוםפורילז בנוכחות
ו המו ל יכו ח )
(.
-
80
40
NUMBER
a
מפוספורילז
3.5
ם יי ג פוספורילז
בופר
20
FRACTION
19
חסונה מם'
רדת פוםפורילז
55
60
-
aו
bעל קו לו נה של
4 . 6מיי ג פוספורילז
G P - M Aהועברו על קולו נד)8x1של.
. pH
פה 'בנופו
GP-MA
.
0
7
ש
b
0 . 7 5מייל
סייס(.
Seph-C
נ
4
ב -
4
י
Seph-C
.
הקילו נה
האנזימים נספחו על הקו לו נ ה
והאלוציה נוסחה בתנאים הבאים-:
א.
ע יי י הורדת ה -
pH
של הבופר
GP-MA
ל -
5.8
pH
ע" י
חומצה אצטית קרחית.
ב ,ע •י י העברת גרדיאנט
ה -
נאספו
גל
280
pH
ב -
.5.8
פרקציוח בנות
nm
פוםפורילז
)
Clt־Im
עד לריכוז של
M0.61
תוך שמירח
— » , ( — £
1 . 6מ יי ל נפח ו נמדדה הבליעה של הפרקציות באורך
המוליכות )
בנוכחות ) A M P
(,
הפעילות האנזיסטיח של
— • — ( ובהעדר הנוקלאוטיד ) — • ( — O
56
אחד ההיבטים של פעילות זו נבדק בניסוי הבא :מיצוי שריר ארנבת
פסי
5
£הועבר אינקובציה בקור ב נ ו ב ח ו ת ,10!.1M c A M P
24 . mM A T Pהפוםפורילז מראה לאחר
הפעילות
בנוכחות
A M Pלבין
שעות ) (C4°יחם של 1.9בין
הפעילות בהעדר הנוקלאוטיד.
מיצוי שריר מראה פעילות הסינטחז יחם של 2.1בין
ג ל ו ק ו ז-6-פ ו ספ ט לבין
מיצוי
הפעילות בהעדר סוכר זה.
שריר כזה על קולונה של
המתוארת
בתמונה מם' . 2 0
2
»12mM MgCl
!
הפעילות בנוכתות
נמצא שהעברת 15מייל
1ם״מ ( x 9 )Seph-Cמתקבלת התוצאה
פעילות פוםפורילז מעוכבת מעט על הקולונה
שכן שיא הניעילות מופיע במבחנה מסי 11ואילו שיא החלבון
מסי .7
באותו
בפבתנה
םינטחז נחפם על הקולונה וניתק ממנה לאחר העברת ג ר ד י א נ ט
לינארי של נתרן בלווי )שיא הפעילות נמצא בריכוז מלח של 0.52מולר(.
כאשר מחשבים אח יחס הפעילות עם ובלי נוכחות ) A M Pעבור פוספורילז(
ועם או בלי
המתוארח
גלוקוז-6-פוםפט )עבור םינטתז( ,
בחלקו
החחתון של אותו ציור.
הפעילות עבור פוםפורילז ועבור םינטחז.
מהקבלת ההתנהגות
על הקולונה משתנה יחם
יחס הפעילות עבור פוםפורילז
יורד עם שטיפת החלבון שאינו םפוח לקולונה.
בפרקציה ,7שבה נמצא
שיא החלבון שאינו ספות ,היתם הוא 5והוא יורד בהדרגה עד למבחנה
מסי ,19שבה הוא מגיע ליחס של 1.1אשר בו הוא נשאר קבוע )בשאר
הפרקציוח(.
עבור סינטחז משחנה היחס מ 1.2 -עבור הפרקציות
הראשונות ב גרד י א נ ט )פרקציה (66ועולה בצורה תלולה ל 5.7 -במבחנה
מם' .72
השתנות
הפעילויות הנמדדות בנוכחותם ובהעדרם של הקופקטורים
האלוםטריים של פוספורילז ושל סינטתז מהווה אולי ראיה נוספת )(62-63
לקיומם של היברידים בתהליך ה א י נ ט ר ק ו נ ב רם י ה של אנזימים אלה.
היברידים אלה שההבדלים ביניהם נובעים ממספרן השונה של תת היחידות
אשר עברו
הקולונה
פוםפורילציה בכל מולקולת אנזים מעוכבים במידה שונה
ההידרופובית.
ע"י
57
80
חםונה
מסי
הפרדה
חלקית
8
מייל
)3.1
3
נפח
שנשטפה
מלח
הבליעה
AMP
-6םוספס
)(--•--
לא
אשר
לריכוז
גל
nm280
נספח
NaCl
IM
)
)—,(—O
ובהעדרו
)
1
על
נאספו
נשטף
באותו
בופר
כללי
( פ ע י ל ו ת
פעילות
. (- o
ק ו ל ו נד.
פרקציוח
ובנפח
• ,
האנזים
םינטןןז
Seph-C .מייל
הועברו
••»
ושל
על
. GP-MA
בבופר
ובהעדרו
פוםפורילז
העברחם
קונברםיה
של
באורך
)—•—(
האנזים
ע" י
בו
החלבון
עד
של
שריר(
שהושרחה
מ״ל(.
גרדיאנט
נמדדו
בהיברידים
במיצוי
מם'
10 20 3 0 4 0 50 6 0
F r a c t i o n Number
SO
)15המושרים
שריר
70
0
כמו
ס י נ טח ז
כן
של
של
Seph-Cjב ח
50
טיפות
ולאחריו
הופעל
בנוח
120
מייל.
פוספורילז
בנוכחות
נמדדה
של
מיצוי
בנוכחות
גלו קו ז
המוליכות
)•'*•(,
58
ב.
-
ברומטוגרפיה הידרופוביח בחקר קיומה של מערכת
לםיגטחז
אינטרקונברסיה
בכדוריות דם אדו מוח
בעית קיומה או העדרה של מערכת א י נ ט ר ק ו נ ב רם י ה לאנזים גליקוגן
םינטתז
).(79
מבדורית דם אדומה מאדם,
הם הראו
, D
בצורה
לצו רה
בהםוליזאט כדוריות דם אדומות
םינטתז מצוי
הדורשת גל ו ק ו ז-6-פ ו םפט לפעילות.
לקיום צורה
הועלתה
שגליקוגן
הועלתה ע" י
Gutman
and
M o s e s , Bashan
לא נמצאה כל עדות
Iשל האנזים ,שאינה תלויה ב ג ל ו ק ו ז-6-פ ו םפט לפעילוח.
Iנובע ממעבר צורה זו )אם היא קיימת(
האפשרות שהעדר הצורה
הימצ אותו של קינאז פעיל
, Dתוך כדי תהליך ההמוליזה,
ב ה מ וליזאט
הודגמה ע"י
אינקובציה של המולי ז אם עם גליקוגן םינטתז
ד
מ נ ו קה תלקית משריר ארנבת ובעל פעילות אנז מחית גבוהה,
ם י נטח ז משריר שמרביתו
לג ליקוגן
בצורה
גליקוגן
Iעבר באינקו בציה של 30דקות )(30°C
םינטתז שמרבית פעילותו . D
השתמשנו
בשיטת ההפרדה של םינטתז מהמו ל יזאט
ד
הגישה היתה לב צ ע המוליזה בנוכחות כמות
לע ל ,כדי לחקור בעיה זו.
גבו הה של
כדוריות דם המתוארת
ATPמסומן בזרחן 32בעמדה Y
.
היחה קיימת צורה I
אילו
וליזאט והיחה מחרחשת א י נ ט רק ו נ ב ר ם י ה ,הי ה הםינסתז Dהנוצר מסומן
ב המ
בידוד האנזים והנאח ואיה למיקו מו של הסימון
ב ז ר חן .32
ה י ו מצביעות על אפשרות קיומה של צורה
של מערכת
Iא נדוגנית וקיום אפשרי
בכדוריות דם אדו מות ריכוז ה -
אינםרקונברםיה.
ביצענו
ה אנ דוגני הוא 2מילימולר.
הרדיואקטיבי
ATP
המוליז ה של מנת דם שלמה בנוכתות
ATPמסומן בזרחן 1 0 ) 32מיליקירי( ובעל פעילות ספציפית גבוהה.
לאחר סילוק שיירי
Seph
הממברנות בצנםריפוגציה
במשך
2
הורחק
5
1
חומר הקו לונה ע"י
)
'
13,000
דקות
g
(
,ע ו רבב
ב ט מ פ ח ד ר ,ולאחר מכן
הרחקה זו ׳כנוכחות
צנטריפוגציה קצרה.
חומר קולונה שאינו סופח• סינטחז שיפרה את תכונות הזרימה של הנוזל
האדום והמרוכז שהתקבל ,אך לא פגעה בפעילותו של הםינטחז.
מייל הועבר על קולונה של
3
ונשטף עד שחומר הקולונה הלבין.
מלחלינארי.
2
החסנין
ם״מ(
אלוציה בוצעה ע״י הפעלה גרדיאנט
בתמונה מס* 2 1מתואר שיא האלוציה המתקבל נעת העברה
-
SO
-
50
20
30
40
Fraction Number
21
תמונה
מס
העברת
המוליזאט
32
240
טיפול ב -
מ״ל של
NH־ Seph-C
NH־4Seph-C
הסימון
מתתח
מופיע
נאספו
32
ל -
2
(
שיירי
-P
פרקציות
,
אדומות
והקולונה
0.2ו ה ד ד י ו א ק ט י ב י ו ח ב מ י
בגרף הנ ״ ל ( .
אלוציה
בבופר עד
השטיפה
ב ו צ ע ה ע"י
GP-MEו ב נ פ ת סופי של
בבופר
ש ל M NaCl1
)-
ז
ת
ט
נ
י
ס
ת
ו
ל
י
ע
פ
,(--X
)
מייל ו נ מ ד ד ה ה ב ל י ע ה ב א ו ר ך ג ל
3.1בנות
קולונה
ם מ ( .
ה מ כ י ל ו ת אח
נשטפה
ו המוליכות )
רחבה
הקו ל ו נ ה
מרבית
ירדה
העברת
. 2 0 0
של
ה ו כ נ ה בבוסר"
ההמוגלובין
שהבליעה ב
nmב -
2,8(0-ה ס י מ ו ן
(.
F
הממברנות ב צ נטרי פ וגצי ח ,
הועברו על
ש נ פ ח ה 5 0ם" 2ל ) ק ו ט ר ה
2
ב
)לאחר
על
הרחקת
ו ה ר ח ק ת ו
2
. GP-ME
מסומן ב
המוליזאט
-P
הקו ל ו נ ה
2
NH־Seph-C
4
ומרבית
nm280-
ירדה
לאפס ) ,ח ל ק זה
גרדיאנס מ ל ח עד
מיילנאספו
2
3
—• )
)P
—( ו ב
אינו
לריכוז
פרקציוח
־(-
nm415
1
r
-
60
1
1
-
1
r n
ן
c
70
22
חםוגה מם'
פילטרציח
20 30 40 50 60
Fraction Number
גל
של
גליקוגן
5
פרוז
4B
) x 2 . 2ס ״ מ (
שנשטפה
פותחה
וגרפיה
m
n
נעשתה
פ
ע
י
-
ב
ל
בקצב
Cו נ א ס פ ו
ו
ת
סי נטהז
םינטחז
בבופר
אחיד
מנוקה
ח לק ית
מאר יnר ו צ י ט י ם
על
4.
GP-ME
60
של
פרקציוח
20
מייל
ב
בנוח
(—•—),
הרדיואקטיבי
-
שעה,
ב
תוך
280
-
שימוש
במשאבה
.
הקולונח
פריסטלטיח
4°
32
והסימון
10
"
P
) —. (—0
)—•—(
61
-
תמונה סס' 23
32
הערכת המשקל המולקולרי של החלבון המסומן
P
ב-
על פי
האלקטרופורזה של סינמתז מנוקה מהמוליזאט של כדוריות דם אדומות,
האלקטרו פורזה בוצעה בגל פוליאקריל אמידי
ובבופר
-Tris-glyclne
מנוקה הושמו על הגל.
שוות אשר הומסו ב -
בנוכחות
)כמתואר בפרק שיטות(.
עליהם הושמו
NCSונמנו
הראו
סינםתז מנוקה מ
לאחר צביעה ב -
של םינתטז
בנוזל םינטילציה על בסים טולואן
, bמיוזין ואלבוםין םרום הבקר.
כמויות•שלי גליקוגן
S.D.Sו -
בחום ההרצה גל זה הוקפא ונחתך לפרוסות
גרף כיול למשקל המולקולרי נקבע ע״י הרצה בו
פוספורילז
Y120
ME
-4
Y
0
coomassie blue
גרף הכיול מחאים לחח יחידה במשקל .105,000
זמנית של החלבונים:
גלים נוספים אשר
5
ועד
Y
פס אחד אשר על פי
-
גרדיאנם הפלח.
62
עקבנו אחר הבליעה באורך גל
28011mי • 415nm -
נמצא שכמות קםנה של המוגלובין מעוכבת על הקולונה ומופיעה ב א ל ו צ י ה
במלת.
באלוציה מופיעים שני שיאים של תלבין מסומן בזרחן ,32כאשר
השיא השני
חופף•לפעילות האנזימתיח.
או לםרהפי לסרצי ה עם דיאליזה.
ספרו ז
B4
האנזים המרוכז הועבר על קולונה של
)תסוגה ( •22ע ל הקולינה םופיעים שני שיאים של חלבון
הםופרדים באופן חלקי.
פרקציות 50-44
פעילות הסינטתז אינה חופפת לאף אחד מהם.
מקולונה זו מראות חפיפה מקסימלית בין פעילות
האנזים והםימין
פורזה
שיא זה נאסף ורוכז ע" י
הרדיואקטיבי.
באקרילאמיד גל בנוכחות
בתמונה מסי 23
פרקציית אלה ריכזי ונערכה אלקטרו-
SDSו . ME -
מתוארת התוצאה.
בצבע ק ו סס י כחול ומשקלו
בגל מופיע פס אחד הנצבע
המולקולרי מתאים )בהשוואה לםמנים ידועים(
ל 100,000 -דלתון לערך ,שהוא בקירוב משקל תח היחידה של סינטחז,
הסימון
,
הרדיואקטיבי אוחר עי י
חיתוך הגל לפרוסות דקות ,המסתן
ומניתן ,והוא נמצא בסמוך לנדידת הצבע ב רו מו פ נ ו ל בתו ל וקרוב למשקל
מולקולרי של .60,000
מסתמן
בזרחן .32
מכאן שבתנאים בהם בוצע הניסוי הםינטתז אינו
חוסר האפשרות להראות קיומה של א י נ ט ר ק ו נ ב רם י ה
נמצא בהתאמה עם התוצאות של
Moses et alשהזכרנו ).(79
אודות מנגנון הפעולה של סדרות הומולוגיות של אל ק י לאגדו ז ו n
ו -
) 0א מ י נ ו -אלקיל אגרוזות
א.
מבנה אלוטרה-םמרוקטורלי
לאור
הועלתה
באופן
העובדה שהקולונות הנדונות הן בעלות מבנה בלתי צפיד,
האפשרות
שעם
קישורן של •שרשרות אליפטיות לאגרוז ,תל
הדרגתי שינוי אולטרה-םטרוקטורלי בתוםרים אלה אשר מעורב
בצורה זו או אתרת בשינוי הדרגתי של תכונות הספיהה שלהן.
לפיכך
חקרנו את המבנה האולטרה-םטרוקטורלי של הסדרות ההוסולוגיות הנ״ל
במיקרוסקופ אור ובמיקרוםקופ אלקטרוני.
נערכה השוואה בין מבנה
הכדורים של חומרי הקולונוח לבין מבנה האגרוז הבלחי מטופל.
63
אור
במיקרופקופ
-
הםפרוז
נראה
אידאלי ים
ככדורים
40
מיקרו ן
ועד
200
מיקרון.
לא
הכדורים
לאחר
השפעו ל
בציאנוגן
ברומיד
וגם
באורכים
שונים
קטרים
מ
מבנה
-
פנימי
במבנה
אליהם .
עדין
לבדוק
מקישור
ח צפיח
וכדורי
הם ו פ י ע
שרשר ו ת
זו
)(1
אוסמיוו,
חומרי
ובסופו
מן
ה ק ו ל ו נה
לאחר הט י פ ו ל
ע" י
של
דבר
הקשיחו
לאחר
אנגםטרם
)(2
חופר
אוםמית
נחתך
וצולם
מיד
שלאלףאנגםטרם
במהלך
הדהידרטציה(
זו
צורה
שטופלו
טיפול
הוצאו
נשמרה
נעשתה
באתנול
epon
החומר
באו לטרה
ללא
דהידרטציה
מדגמים
מענינת
תצפית
)ריאקציות
ובהם
עקבנו
יציבותן
של
ש ל H (92
(
p
האגרוזות
.
במבנה.
דרסטיים־ )ללא
ההזהרות
בחנאים
ה ו עב ר
Van Tubergen
).(91
של • א ל ף
לחתכים
הדרגתית
בגלוטראלדהיד
לאור
הת ו מ ר
ו גדלים
נחחך
ובחומצה
צורתם
הדרגת י ח
הולכים
של
לפרוסות
אוםמית
בטיפולים
עם
הכימי
במהלך
זה,
מכן
חומצה
בגלוטראלדהיד
טיפולים
לא
כדורי
ובחומצה
אלה.
נמצאו
ספרו
מיצוק
מיקרוטום
כמתוארעבור
הבדלים
כדי
אופנים-:
ד ה י ד ר ט צ יה
ע" י
לא
אלקט ר ו נ י .
ו ל אחר
בריכוזים
שינוי
ואף
.(24
של
נראה
אלקטרוני.
הטיפול
השונים
מם'
בשני
אוקםיד.
כ מ חיו• א ר
השפ ע ו ל
ב מ י ק ר ו ס קופ
הוכנו
שרשרות
כל
ניכר
חת כ י ם
צולמו
הנ״ל,
בפרופילן
וצולם
הטיפולים
יותר
)תמונה
קישו ר
כמבנה
הפא ז ו ת
לא
מן
גלוטראלדהיד
הכימי
במיקרוסקופ
הק ו ל ו נ ה
הועבר
עם
טיפול
ה ורחף
שונות
שינויי 0
ב ט כ נ י קת
כ ת ו צ אה
אלקטרוני
ה ו גב
(embeddingב -
)
הסדרות
לא
בעלי
ל אתר
מטופל.
הכדו ר ים
גבוהה
מיק רוםקופ
הקולונה
הבלתי
פחמימניות
שונ ים
עבור
חומר
של
ברז ו לוציה
ק ו ל ו נ ות
תתכ ים
היא
בםפרוז
האולטרהםטרוקט ו ר ל י
כהוצאה
על
בהסתכלות
בכדורים
הובח נו
פיזור
).(1
כימיות,
אתרי
כאשר
השווינו
יכולתם
יצרני
אלמי מ י י ם
שטיפות
צורת
לחומרי
הצטמקות(
של
ומיצוק,
הכדורים
אח
גם
חומרים
ו בחשיפה
אשר
כדורי
בהערר
במיקרוסקופ
חומרי
הקולונה
של
באתנול
הקולונה
לא
הספרוז
קיבוע
אלה
לערכים
בדבר
ו
-
עברו
לשמור
כימי,
אי
קיצוניים
64
-
-Co
חסונה מסי
24
ה ש ו ו א ה בין
חומרי
במיקרוסקופ
פאזוח.
ופוטפיקסציה
יש
. Seph-C8
)
לשים לב
-Seph-Co
קולונה
חומרי
באוםיום
לעוצמת
הידרופוביים
הקולונה
לבין
הועברו
ספרוז
פיקםציה
ט ט ר ה א ו ק ס י ד ו צ ו ל מ ו דרך
הצביעה
העולה מ
-Seph-Co
ב ת מ ו נ ה זו
2
כפי ש ת ו א ר
-Co
בפרק
שיטות(.
בלתי
מטופל
בגלוטראלדהיד
מיקרוסקופ
פאזות.
־4Seph-C
-NH
ל
מתאים ל ־0)Seph-C0(H
2
2
-
תמונה מסי
2 5
המבנה העדין
שונים.
עובי
במיקרוסקופ אלקטרוני של חתכי
חתכים של חומרי
קיבוע ב -
5
6
-
Epon
.
כדורים מתומרי קולונה
קולונה הוכנו לאתר שחומרי הקולונה עברו
החתכים נצבעו ב -אוראניל אצטט ובעופרח ניטרט.
התתכים הוא כ 1 , 0 0 0 -אנגםםרם.
66
.,J
תמונה
הש1ואה
עם
26
מם
בין
חומצה
עוצמת
אוםמית.
טטרהאוקסיד
I
=
H
=
ונשטפו
2
ה ה ש ח ר ה של
חומרי
היטב.
Seph-C -NH
2
8
C -NH־Seph
4
= HI
)Seph-C0( 0
= IV
Seph Co
!!H
חומרי
הקו לונה
לאחר
קולונה
הועברו
השםיפה
שונים
פיקםציה
הורחפו
לאחר
התגובה
באוסמיום
במים.
67
של
המבנה
מספר
ספרוז
מצולמים
.
,
4
ל
-
של
בתתך
0.5
אוחו
על
דומים
פי
זה
הדמיון
חומצה
אוםמיח.
אוםםית
תומר
)גם
הקולונה
,24
. (26
היא
בעלת
ב.
פיזור
שרשרת
כדי
שווה
לענות
תומר
יפיח
של
עיי
םפרוז
משופעל
)כמתואר
זו
בלתי
טטרה
עם
ותעלות
אקראי
בחתכים
שונים
תומרי
הקולונה
השטוף
גלוטראלדהיד(
נראיח
השחרה
והן
זה
קטנה
פזורות
1
אוטורדיוגרפיה
אמין
לאתר
ונבדקה •יכולתה
ב צ י ו ר פסי
לקשור
«27
נבל
מסומנות
המסומן
ע״י
תמונות
מם
ג ל י קו גן׳
די
הפתמימניות.
אור
2
מ
אמין
םינטתז,
״ ל ( 0 . 7 5
בטריטיום
האמין
הוכנה
מהחומר
סינטתז
מנוקה
חלקית.
נשטף
,1
4
NH־.4Seph-C
גליקוגן
מסומן
של
להכנת
בפתמנים
הקולונה
לספרה
ל א ת ר ה כ ר ו מ ס ו ג רפ.י ה
הקולונה
בטריטיום.
בטריטיוס
כושרו
מתילן
עודף
חומר
במיקרוסקופ
)
שטיפת
של
כ כ ל שה ק ו ל ו נד.
מתקבצות׳ השרשרות
•
mCi
חומצה
אור )ראה
יותר
ע" י
לםפרוז
הפחמימניות
טטרה
הקולונה
במיקרוסקופ
רבה
שלמרות
יותר.
הפחמימניוח
ניחן
לציין
עם
הקשורות
לבדיקה
יש
המושגת
של
א י ז ו ר י ם בהם
די
ברזולוציה
המדידה.
ב צ ב י ׳ $ת ם
ההידוופוביות
תומרי
ארוכה
ביצענו
הקולונות
אפילו
בוצעה
מזוינת
השרשרות
מתילן
דומים
8
שגודלם
C i / m m o lח ו מ ר
בשיטות(.
מתוארת
כי
תומר
עם
הפחמימניות
זו
ז ה לזהSeph־ C
מגיע
באופן
)האוסמיאופיליות(
השרשרות
אמין
כסות
הגבת
קודמת
(.
סדי
הגבת
קצרה
שאלה
נבחר
)23
שםונתז
הוכנה
על
לאחר
שקיימים
ק ו ל ו נ ה שבו
הקולונה
גבוהה
או
לקבוע
קיים
הידרופובית
אם
,
שונים.
ניתן
ההשחרה
השאלה
חללים
מפוזרות
שוני
בעין
השרשרות
ובה
בתנאים
תגובה
עוצמת
נשאלה
במידה
כשעה
הן
NH־
שבהם
הקולונות
ללא
נראים
האולטרה-םטרוקטורלי
אלקטרוני
במבנה
אלה
הנ״ל
במבנה
!B4,
עדינה
בכדורים
התוצאות
במיקרוסקופ
י
תעלות
וכן
לזה
-
2
נ ר א י ת רשת
מיקרון.
כדור
אלקטרוני
'25
S e p h - C־ S e p h - C 4
בצורתם.
4S
חתכי.ם
במיקרוסקופ
מוצג
חומר
קולונה
כרומטוגרפיק
הקולונה
-
תמונה
מם'
בדיקת
יכולת
מסומנות
0.3
27
מייל
)2
ס"ג
כל
אחת.
נוספו ח
חלבון
פסטר.
לערך(
15
אוחו
קולונה
ם י ב 0ח ז
פ ר קצי ו ת
מהאימה.
בכופר
השרשרות
של
נשטפה
המנוקה
דרכה.
שהכיל
ישירות
קטנה
הקולונה
הועברה
הבופר
נעשחה
ריאקציה
2
גל יקו ג ן
לאחר
של
של
שבו
NH־Seph-C4
הוכנה
בפיפטת
תמיסת
האנזימחית
המיםח
המפיחה
בטריטיום.
ם״ל(
)0.75
6a
בבופר
תלקית
נאספו
GP-ME
גם
NaCl
על הנפח
המלא
החומר
המוזכר
משריר
נשטפה
כל
לעיל
GP-MEו
פ רק צ י ו ח
.IM
של
הפחמימניוח
-
ארנבת
בנות
3
טיפו
הקולונה
ב
15
מדידח
פרקציה
-
הפעילות
ע״י
הוספת
69
-
-
50 fj.
וזמו נ ה
מסי
תמונה
אוטורדיוגרפית
המושוות
28
הפחמימניות
הא ו ט ו דד י ו ג רפ י ה
מוצקו
וקובעו
nford L
היא
ו -
חומר
של
מסומנות
של
חתכים
, Epon
הקולונה
NH־Seph-C4
2
בטריסיום
בפחמנים
1
מיקרון.
בעובי
נחתכו
וצולמו
שבו
1
באםולםית
ו
-
•4
כדורי
הספרוז
צילום
4.
70
-
to
c
CD
Q
o
"a
70
30
50
)(fJL
מם'
חמו ג ה
השוואה
של
2 9
צפיפוח
אוחו
כדור
שונים
חולקו
הטבעח
הגדולה
טבעת
זה
שורטט
עבור
חחך
נמנו
במחוגה
מסי
3
חלוי
הגרגירים
ב )
צוינו
( A
חצלומים
קונצנטריוח
של
בקוטרו
r
המהווה
אח
ב
, (O
עבור
ועבור
)
חתך
טסי
של
שווח
חחכים
ארבעה
עובך.
החתך ש ב ת מ ו נ ה .
הא ו ט ו ר ד י ו ג ר פ י י ם
המרחק
^1
שונים.
לטבעוח
ביותר
עבור
חתך
מסי
הגרגירים
ובכדורים
הא ו ט ו ר ד י ו ג רפ י י ם
באיזורים
וחושבה
אמצע
תתך
)
ם (
4ב
עובי
בכל
הצפיפוח.
הטבעח.
מסי
שוגים
2ב
ערכי
)
•
ערך
הצפיפות
(,
עבור
71
היטר והוכן למיקרוסקופ באופן המחואר בסעיף הק ודם.
לאחר סי צ ו ק
ב epon -נחתך החומר במיקרוטום והחתכים של 1מיקרון הונחו על
משטח
K5
זכוכית וצופו
לפי השיטה של
באםולסיח צילום משני סוגי ם
Van Tubergen
)
ה
Ilford L4ו -
א ו •)91ט ו רדיוגרפיוח פו ת nו
בזמנים שונים ,חלק מהן לאחר שלושה ימים ולאח ר מבן במשך בל שבו ע
עד לשבעה שבועוח.
בחמונה מסי
לאחר הפיתוח צולמו החתכי ם במיקרוסקופ או ר.
28נראה חתך.של כדור רדיואקטיבי מצולם בשיטה זו.
בתמונה רואים גרגירים או ט ורדיוגרפיים שחורים ה פ זורים על פני
החתך העגול כולו.
צפיפו ח הגרגירים יל ח י דח שט ח הושוותה עבור
איזורים שו נים באותו תת ך ועבור
חושבה עבור סדרה של טב עו ח קונצנטריו ח
צ פיפוח הגרגירים
חתכים שונים.
טבעת נספרו וחולקו
לשטח ה שי* הטבעת ,ב אופן זה ה ח קבלה צפיפות הגרגירים
ר.
ליתידת שטת במרחקים שוני ם ממרכז הכדו
ארבעה תתכ י ם מכדורים שונ י ם.
קבועה )(-15$
שונוח
•
הגרגירים בכל
מד י ד ו ח אלה נ עשו עבור
נמצא שצ פיפות הגר ג ירים ליחידח שטח
ד
בחחכים שונ י ם של אוחו כדור ו ב תת ב ם של כדורים שונים.
תמונה מ ם י .29
ניתן ל הסיק מהוצאה ז ו בי בכושר ה הפרדה אשר בידינו
הפתמימניות הקשורות לספ רו ז פזו רוח בא ופן
אקראי בחומר הקולונה.
יחד עם זאת אין באפשרו תנ ו לקבוע בוודאות ,אם לא קיימים
של שרשרוח שגו דלם קטן םכ ו שר הרזולוצי ה שהופעלה כאן
ג.
א י פ י ו ן תוצרי
השרשרות
מצבורים
) 0.2מיקרון(.
הריאקצ י ה שבין ספרו ז משו פ על ל בין אמינים
אליפטיים
בושר הטפיחה של אלקיל אגרוזות ו -
-0J
אמינואלקילאגרוזות
עבור חלבון מסויים תלוי באורך השרשרוח הפחמימניוח הקשורוח אליהן.
על מנח לבחור את הקולונה המתאימה לבידוד אופטימלי של חלבון םםויים
ולתקור אח מנגנון הפעולה של קולונוח כאלה ,יש לבצע ניסויים מקבילים
על סדרות הוםולוגיות של קולונות כתנאים אתידים.
חייבות
בסדרות כאלה
הקולונוח להיוח זהות בכל סרס לאורך השרשרות הפתמיסניות
הקשורות לנושא הבלחי מסים.
בסעיף הקודם הודגמה אחידוחן
האולטרה-
-
של
סטרוקטורל ית
ברזולוציה
מיק רוסקופ
של
נ ח אר
הבא ים
ובסעיפים
72
ק ו ליונוח.
את
-
אלקיל
אור
ו
אגרוזות
-
ומיקרוסקופ
אחידות
בדיקה
-C.QJ
אמינואלקיל
אלקטרוני.
המבנה
אגרו ז ות
בסעיף
של
הכימי
זה
ה ק ו ל ו'נ ה
חומרי
הנ ״ל .
קיומה
לאתר
של
ה ס י נ תyז ה י
שלנו,
חומר י
ידועה
האלמנטרית
שכמותם
פס'1
קולונה.
חומרי
אך
נ יחן
להסיק
לגבי
הקו לו נ ה
אי נ ם
שונים
בהונה
מרמ זח
המבנה
החוזרות
ביניים
חומר
במבוא(.
לחו צרים
ניכר
מם'
של
כימית
פעיל
מכן
שב עת
ב כמות
לא
ריאקציה
המכיל
תנקן.
ורק
החנקן
מם'
מזה
טבלה
מרבית
קושר
שבהרכב
של
זו
בין
השאר
את
תומר
לבנות
של
$
פחמן
<foמ י מ ן
0
f
חמצן
f
חנקן
Sepharose 4 B ( 1
44.40
7.08
48.57
אין
(2
)C0(H 0־Seph
38.90
5.93
50.59
4.58
(3
!Seph-C
40.72
6.43
48.19
4.66
(4
Seph-C
42.04
6.35
47.27
4.34
2
)^.(4.5
תוצר
מתפרקות
מבלי
'הקולוניה.
נוסחאו nיהם
יתידות
יצירת
הפעילות
האמינים
תוצרי 0
השפ ע ו ל .
שלהם
6
הק ו ל ו נ ה
4
מספר
החנקן
אחוז
הקבוצות
אי נ ה
האנליזה
גבוה
הכולל
ציאנוגן
היחסית
בריאקציה
בחכולח
עובר
כימי
תלק
היווצרותם
התוצרים
השפעול
האגרוז
אינרטיים
זה
6
ע״י
שכמותם
נתונה
התרכובות •
של
המשופעלים
מנתוני
אופי
לבדק
המבנה
תוצרים
בגלל
ניתן
שינוי
אטומי
מספר
בסבלה
היחסית
תוצאה
טבלה
הם
ונוסחאות
פוליסוכרים
אי נ ה
זו
שינוי
הכימי
ידועה,
התוצרים
לאחר
הקולונה
מספ ר
של
ההרכב
תרכובות
המ ב י א ה • ל ה י ו ו צ ר ו ת
ת מונה
)ראה
חומרי
קביעת
בריאק ציה
ברומיד
של
שורה
11
במקרה
הומר ל ו ג י ת
של
אורגניות
בדרך
כלל
שתל
-
הערכה
כפותיה
של
הפבנה
החוזרת
הפפוצעת
ו
6
,3
י-
בקירוב
ראשון,
השפעול
בחהליך
השפעול
פבנה
כיפי
י
יבש
1ר א ה
בפול
הםבנה
1,000
הפכילים
כ
כל
כמות
התלות
כמות
הולכה
ועולה.
של
ובקבוצה
הנמוכים(.
לבקבוק
)ע״י
יחידות
לשפעול
כמות
שעברו
אליפטית
ונוחנח
חוצרים.
מול
)4
לכל
האליפטיוח
חלויה
חומר
)שבהן
הנקשרות
בפובן
הפ ו כ נ ס ת
ספרוז
האמין
בקבוקים
המנות
הצימוד
הבקבוקים
שטיפוח(.
משקל
השוות
(14
מנות
הוגבו
כאשר
היטב
)למניעת
קבוע
של
מורחף
במהלך
חומר
ב
-
יחידיו!
של
גרם
אתת
ברומיד
החב צעה
זהה
השחםשנו
בנוכחות
ב נ ו כה ו ח
באופן
כשהוא
למספר
40
פכפות
בפפוצע
ששיטש
גדול
לשפעול(.
קבועה
בריאקציה
בדרך
שוות
עם
50$
של
זו,
הבאה.
מבחינה
סדרה
במוח
שייו־יס
ספרוז*
עודף
בכמות
נבדקה
גוס
החוזרות
רק
המשתתף
הצימוד
בפחמן
פקוקים
טופלו
ונמנה
בכפות
מסומן
זהים
האמין
כ
1,000
ל ס פ ר ו ז ,המשו פעל
וחולקה
מםונן(.
הוכנו
ציאנוגן
לריאקציה
שופעלה
ריאקציה
סנטילציה
מול
פסי
של
6
היבוש
הפרודוקטיבית
שפעול
חת
מופיעות
פי
יחידת
-
זו
שפונה
פילימול
יחידות
בטבלה
רטוב(
לכל
חוזרות
של
אלקיל
התוצר
פשופעל
ברופיד,
אמין
היא
כלופר,
החוזרוח
בחהליך
המבנה
כפי
-
פחפן,
הםבנה
כי
חופר
שיודגם
30
אסופי
לאחר
אפשרי
בהפשך,
בבמות .האמין
םשקליח
. ( 1 7 H 1
כי
12
מאחד
הקשירה
אשר
)משקל
0.13
של
יש ב
פחמנים.
וריאקציה
נפצא
)פשקל
-
-
של
ציאנוגן
המתאים
גדולה
אחד
ברופיד.
פולים
12
-
גלקסוז
חנקן
ברופיד
המושוות
ציאנוגן
אטום
כיפי
ם
D
יחידת
בכל
הפהווה
הקולונות
האמין
כפעט
כל
כזה
הבאים.
להעריך
יחידוח
שינוי
כ
כזו
בתוצר
ספרוז
8
פבנה
עודף
ארבע
שרשרת
דו-םוכר
על
פםונן
-
0
9
לספרוז
שעל
קושרת
של
בעודף
הבנוי
כל
במםוצע
ציאנוגן
השיקולים
שבטבלה,ניחן
עובדות
מכילים
פי
ביחידה
חנקן
דו-םוכר.
החוזרות.
אםיניים
אחד
גרם
של
םפרוז
על
היא
התוצאות
אגרוז
אהד
פכאן
של
םכל
םפרוז
C
של
מתבצעת
פקבלים
אטום
לבצע
גלקטוז.
פי
שחוצריו
ח ו זרח
השפעול
L
ניתן
של
-
על
יש
שינוי
2
אנהידרו
בערך
73
התוצרים
-
של
האמין
די
מחיל
תמיסות
בםדוה
פורפאפיד
החנופות .האסינית
הסינתזה
והניקוי
של
מסונן
)1.0
גרם(
מייל
נוזל
םנטילציה,
10
הועבר
74
חומר הקולונה נשקל לאחר סינונו ממים על גני משפך זצונית םינסר
- 1
)מסי
( Coarseהנתון
בבקבוק יניקה והמחובר למשאבה מים.
גובה תומר הקולונה שעל גבי מסנן
הזכוכית היה כ 1 -ם"מ.
עם
הופעת סדקי ההתיבשות הראשונים הופסקה השאיבה והחומר ךמסו נ ן׳
נשקל.
40מדגמים שונים
מהימנותן של קביעות אלו נקבעה על
שהרדיואקטיביות
דיוק של .2$
שלהם נמנתה׳בדופליקסים והם נמצאו
הרדיואקטיביות הספציפית של האמין
שווים J1nn3
המסומן נמדדה
בנוכחות אגרוז באותם תנאים כדי לאמוד אח מידת הדיכוי של
הרדיואקטיביות
כמויות
הולכות וגדלות של האמין
קטנות מן
בתנאי
תוקנו
שנגרמת
ע"י נוכחות האגרוז.
נמצא כי כאשר מונים
בנוכחות אגרו.ז ,הרי שהקריאות הן
הקריאות שמתקבלות עבור האמין כאשר הוא נמנה בהעדר אגרוז,
הניסוי הדיכוי נקבע כ -
בהתאם לכך.
הפחמימניוח
3$i17$
)
מדגמים6עבור
( וכל הקריאות
מתוצאות המניה של חומרי ה ק ו ל ו נ ה שבהם השרשרות
מםומנוח בפחמן
14ניחן לכן לתשב את כמות השרשרות
הקשורות לגרם אחד של חומר ק ו.לונה.
לשיטה זו יתרונות על פני
השיטה של מדידה אבטולוטית המבוססת יעל המסת הספדו ז וקביעת הכמות
הרדיואקטיבית
בנובתות הידרוליזאט אגרו ז.
הידרוליזאט זה מדכא
את הקרינה הרדיואקטיבית של הדוגמא וכן נגרמים קשיים במניעת
התנדפותם של אלקיל אמינים קצרים במהלך הטיפול הממושך.
תלות "צפיפות״ השרשרות הפחמימניוח בתוצר,
לריאקציה
עבור
שבו
בכמות האמין
הצימוד ,נבדקה עבור מספר חומרי קו לונה והיא מודגמת
! Seph-Cו -
האמין
שהוכנסה
4Seph-C
)30תמונות
ו -
. (31
כאשר כמות
בריאקציה הצימוד גדולה ממול אמין למול של ציאנוגן ברו מי ד
השתמשנו כדי
הפחמימניות
לשפעל את הספרוז,
ההבדלים ב״צפיפות" השרשרות
הקשורות לתומר הקולונה ניתנים
להזנחה)*כ
.(10$
מהשוואה בין תמונות אלה ומתוצאות נוספות ניחן להעריך כי כמות
השרשרות
Seph-Cn
בתנאי
הפתמימניות הקשורות לסדרה של קולונות אלקיל אגרוזות
היא כ
סינתזה אלה
הםפרוז(
3 6מיקרו מולים לגרם תומר קולונה מסונן.) 4-1מול אמין למול ציאנוגן
ההבדלים בין
ברומיד שבו
שופעל
הקולונות השונות בסדרה הומולוגית הםםונתזת
בבת אחת מכמות גדולה של ספרוז םשופעל אינם גדולים מ -
.^10$
75
l_l
100
I
I
I
075
0.50
025
I
)Methyl Amine (moles/mole CNBr
30
תמונה מסי
צפיפות
השרשרות המתיליות בתומר ה ק ו ל ו נ ח כתלות בכמות המחיל אמין
לריאקציה.
המוכנסת
תמיסת אם של מתיל אמין
הידרוכלוריד 1סולרי ח
DMF
ובאה ל
התמיסה הכילה
,
1 . 2 5 ^ 0 1 / 1 1 1 1של מחיל אמין
הידרוכלוריד מסומן ב -
14
כמויות הולנוח ועולות מתמיסת אם זו
. c
הועברו
ריאקציה פקוקים והושלמו 'ל 40 -פ"ל בבופר ה נ ״ל.
של מפרוז משופעל סוננה ותולקה על פי משקל רטוב )
למנות שוות
) 10גרם(•
24שעות ו ב • 4 ° C -
וכמויות
)•(BRAY
הנגרם
למספר בקבוקי
כמות גדולה
(wetweight
מנות אלה הוגנו עפ המיסות האמין במשך
לאחר תום הריאקציה סוננו ונשטפו חומרי חקו לו נחי.
חומר מסומן בנות 1גרס נמנו ב 10 -מייל נוזל םינטילציח
ערכי המנ י ו ח הרד י ו אקט י ב י ו ת חוקנו עבור ה ד י כ ו י ) ( quenching
מנוכחותם של כדורי הספווז ע״י שימוש בגרף כי ו ל ובמרידות
של סטנדרטים מת א י מ י . 0
הםחיליוח
מערב י ם מתוקנים אלה חושבה צפיפות השרשרות
שבחומר חקולונה.
10גופ פווווז היא
0 , 0 1פול,
כמות ה -
CNBrשבה שופעלה מנה בת
76
0.75
1.00
0.25
0.50
)Butyl Amine (moles/mole CNBr
תמונה מסי
צפיפות
אמין
31
השרשרות הבוטיליות ב,חומר הקולונה בתלות בכמות הבוםיל
המוכנסת לריאקציה.
הוכנה כבו פר
התמיסה הכילה
14
C
ב -
בחומרי
מסי
.30
*
חמיםת אם של בוסיל אמין 1מולריח
DMF50$;O.lMNaHCOsוהובאה ל
J.Ci/ml|2.5
של
אחיל אמין
.-9.5pH
הידרוכלוריד מסומן
תלוקת תמיסת האם לסינתיזה של מספר קולונות והטיפו
הקולונה ,כולל עיבוד הנתונים ,הוא זהה למתואר בתמונה
77
אחידות
של
המבנה
נוספים
כמו
ה
המדיום
שבו
מתבצעת
ריאקציה
-
ריכוז
פוםפורילז
b
-
50$
כמו ת
כדי
לקבל
ל
עולה
ק ו ל ו נ ה.׳
ריאקציה
השונים
הצימוד
הם
ריכוז
ל
הופולוגית
כי
בתנאים
של
האמין
דיאוקםן
או
הקולונה
השייכים
אליפסי
כדי
די
האם
לברר
שאלה
אגרו ז )..הסופה
כמחליף
יונים
כרומסוגרפיה
מטען
בעל
(b
כושר
עם
האליפטיים
בהרכב
זהה.
הראינו
ברומיד
והצימוד
אמין
אליפסי
מיוננות
וקישור
לאגרו ז
ב ושר
את
של
b
שחי
אלוציה
כמותיח
b
DEAEשל
.
ממצא
הינה
זה
גדולה
כה
ובנוכחות
)31
- LSJ
32
זהות
נשאלה
של
אמינו
DEAE
מם י
אמין
(.
הספיחה
Sephadex • A - 2 5
קולונוח
2
סדרה
המתקבלת י ב ת ו מ ר י
ברו מי ד
חשמלי
NH־8Seph-C
ננ?!
הנופר
עד
חיובי,
פוספורילז
את
)(50$
בחמונה
על
-
. ( 0 $ ) i l
בציאנוגן
המפיחה
מייל
ואולם
של
זהה
מ״ג
ל
לבצע
הצימוד
השרשרות
הקובעים
הקולונה?
אוקטיל
המקובל
מודגמת
במימדיהן
בתנאים
אח
כל
של
האנזים
ב א ו ח ם ח נ א י ם ה ק ו ל ו נ ה ש ל
פיספירילז
Sephadex
הם
יש
ציאנוגן
גדול
היא
קבוצות
אח
של
צפיפוח
הוםולוגיח
וכמוהו
בממס
13
מ״ג
האםינים
ריאקציה
מ י י ל חומר-
הדיאוקםן
והשניה
לבצע
צ י סרס.
נעשה
בעודף
פוספווילז
של
סו פחח
וניחן
הםפרוז
אגרוז
שבהם
של
ל
הקולונה
לתזרה
פורמאםיד
בעודף
השווינו
2 5-DEAESephadex
זהים
הוכנו
המטען
זו
בעת
כל
מביאים
סוג
בתנאים
הקולונות
להכנסת
סופחה
וניתנות
או
ב י.שפעו ל
ג
מתבצעת
b
הנספחת' פגיעה' לכדי
די
לסדרה
מ
1 1
פוםפורילז
וכאשר
מתיל
מחיל
235$
םופתת
קול.ונה
14
כללנו
פורמאמיד,
בהרכב
הבופר
הריכוז
אמינות
לפיכך,
המשופעל
בספרות
אליו
השאלה
כל
),27
והרכב
שבו
31$
קולונה
בגורםים
(28
של
הקולונית
םשופעל
לספרוז
נמסר
חיצאית
)(40$
שבהם
חומר
ש
תלויה
הצימוד
ל
7.9
הינו
הפו םפו רי ל ז
של
שנוסחה
בריכוז
הדיאוקםן
מ"ל
מסיסים,
דיאוקםן
כאשר
ניטרלי
pH
הומולוגיח
ריאקציה
זו.
דיאוקסן
-
-
בסדרה
מתבצעח
ריאקציה
נכלל
8Seph-C
קולונה.
שבו
ב
כאשר
קולוניה
pH
הצימוד
-
היא
נפוח• הפוספווילז•' המועברת
מחליף
מענין
באופן
ע״י
לאור
משמעותי
העברה
היונים
דפורמר
אינה
העובדה
מזי
איםידזול
סופחה
שצפיפוח
שלה -
מס׳ מערכת
)6
מג"
כלל
המטען
2Seph-Cs - N H
SYSTEM NO.
(
-
78
-
DEAE-Sephadex
20 30 40
תמונה מסי
10
20 30 40 50 60 70
Fraction Number
קיבולת תומר הקו לונה
מחליף היונים
פוססורילז b
. GP-ME
A - 25
גל
280
2
8
DEAE-Sephadex
לבין
בתנאים זהים.
קיבולת
6מ׳יג
הקולונוח שנשטפו והובנו
נפח כל קולו נהי 6מ״ ל ) 0.9סייס קוטר(,נאספו
אלו ציה נוסחה בבופר1£ג־?ם המכיל
I m - C i tנ ס ד ר ה הבליעה באורך
. n m
Seph-C-NH
הועברו על בל אחח משחי
פ ר קצי ו ח בנוח 1.5מייל.
אחר מכן בנופו
10
32
השוואה בין
ב-
8NH2־Seph-C
.
79
בטיסרציה
E
Sephad
E
A
-
פ ו ט נ צ י ו מ ט ר י ח ).ל ( p H 7 . 0 -
-
D
g
r
q
/
m
e
נמצא
בעוד
,
שצפיפות
הקבוצות
שצפיפוח ה -
הטעונות
NH-8 Seph-C
2
ה י ח ה ל ע ר ך פ י 5פ ח ו ת .
הבנח
בדרך
חומרי
הבאה.
הממיםים,
פעמיים
מזוקקים
ע״י
כמחואר
שטיפתם
24
במשך
בבקבוק
של
כ
חנקן
יבש
סגור
ע"י
אלה
בא ו פ ו
תמיסת
א ו ט ו מט י
לפני
של
ב
-
2
כניסוי
את
ביקורה.
ה
-
ה -
את
pH
לאותו
כמות
של
בתמונה
לבין
הטיטרציה
^Seph-C
Sephadex
התאטה
מסי
טובה
גרף
הוא
של
-50
הטיטרציה
נבחרה
ביוחר
-
h
נותן
את
פבחינח
לטטר
של
בין
. DEAE
הפבנה
G -50
הכימי
ל
באווירה
היבש
11.6
מבן
לא
מהסדרוח
מטופל(
הםוםפת
ואח
כדי
לקבל
אחד
מערכי
הביקורת
הקולונה
של
כניסוי
וכניסוי
-
לאחר
בכל
ניסוי
תומר
1IM
הקולונה
להפחית
הטיטרציה
Seph-Co
מכן
הטיטרציה.
את
יבש
הקולונה
החומצה
שהובא
Sephadex
הטיטרציה
במוח
ונשמרה
)אגרו ז
S
יובשה
KC
טוטר
כתמונות.
השוואה
של
e
יש
הטיטרציה
של
לאחר
אנליטי
חומר
של
לתומרי
במהלך
הקולונה
של
חומר
הקולונה
p
מכך
הגרף
A
מייל(
הובא
אתנול
שמן(
כמות
יובשו
המומס
שההקבלה
)משאבה
במקביל
הדרושה ׳בדי
נערכה
נבחרה
DEAE
C
שבין
הביקורת
חומר
הנ״ל
השטיפה
הלבנה
)3.0
pH -
מלחית.
חומר
התומצה
.ההפרש
. pH
הסי ט רצי ה
האמיתית
וה
כהוצאה
של
בללה
בסדרת
ובמים
אבסולוטי
Cב ח י ש ה
הטיטרציה
המתקבלים
pH
הטיטרציה
גרף
אתנול
נשקלה
מדוד
טינטר
ב M K O H -0.05
גבוה
הםיטרציה
מרוכזת.
o
מסנן
האבקה
בנפח
זנוניה
0ה ח ו מ ר י ם
של
ואקום
דקות
חומצה
טוטו
ערכי
10
גבי
לבסוף
.25°
KOH
ע" י
וגדלים
תתת
הפוטנציופטריות
מבן
2
אבסולוטי.
עורנבה
מווסתת
ולאחר
וםורחחים.
החדר
והיא
נמשכה
C
על
(.
הולכים
אנליטי
בטםפ'
מ״ג(
הוספת
)להרחקת
הרמטית.
ובטמפ'
בתנאים
Seph-Cn-NH
שעוח
25
נפרק
נשטפו
שיטוח,
פעמיים
ואחו
עבור
הקולונה
בריכוזים
מזוקקים
אבסולוטי
)
חומרי
ומורחחים
במים
-
הקולונה
הטיטרציוה
נעשתה
גרף
לבין
4Seph-C33
ביקורת
הביקורת
עבור
עבור
f.Sephadex
)אשר
לו
בדווי
חופו
ה ק ו ל ו נ ל
וגודל
-
80
-
meq HCl/1 gram
המוגה
מסי
33
ט י ט ר צ י ה פ ו ט נ צ י ו מ ס ר י ת א ו ט ו מ ט י ת של Seph-Cו ש ל -DEAE-Seph. A 5 0
f).26מ ״ ג פ ו ל י ס ר ה ו ר ת פ ו
ב 0.2 -מ ו ל ר ת ו מ צ ק פ ל ת י ת )=1 002
C30°
כ -3.0ס ״ ל ת מ י ס ת א ש ל ג ן כ ל ו ר י 1ס ו ל ר י ת ו ס ו ט ר ו ב -
4
״
תחת
4 C־ p H S e p h
א ו ו י ר ה של
תגקן•
ערבי ה
הורדה בכל
pHח ו ש ב והטיטרציה
ב י ק ו ר ה ש ה ו א 26מ ״ ג Seph-Co
DEAE-Sephadexה ו א ס י ס ר צ י ח של 26מ ״ ג
•
ניסוי
50
מהגרף
שהתקבל.
ה מ ק ב י ל ה של
חביקורח
f
ניסוי
עבור
־ Sephadex G
81
ניחן
מיוננות
צות
5
C
-
לראות
בסיסיות
p
h
מהתמונה
בעלות
e
כן
של
מתליף
הושוותה
ל
נ1
בתנאים
שניתנת
להזנחה,
K
חומרי
-
בי
מ״ ל
כ
p
לציין
קולונה
-
על
פי
בפרק
האלקיל
ם״ג
כך
שיטות.
ו
Seph-C־4
-NH
פחות
ד.
2
מ
10$
-
ה ג ו רמי ם
של
קולונת
b
ניכרים
למשל
,
על
ה ס פ י הה
כ
-
מחליף
היונים
כלומר.
טפיחה
ה פ ו ס נ צ י ו מט ר י ו ת
הוכנו'
המטענים
בתנאים
במספר
אחידים
הקבוצות
-pH9.5
בתחום
הניסויית
השגיאה
מ"ג
10
ב"צפיפות״
הבדלים
פי
(NH0C
3
הטיטרציה
של
שהיתה
הם ק ג י ם
אלקיל
לקולונות
את
אגרוזות
הספיחה
יכולת
חלבונים
הקשירה
בהם
אגרו ז
אף
יכולת
םפחה
קיימות
.-
לקולונות
להגיע
,
הטיטרציות
הומולוגית
היונים
לעומת
אם
4Seph-C
-
4
ואילו
הבדלים
בסדרה
ל
ף
פוםפורילז
תוצאות
אין
י
בקולונה
»)Seph-C2-NH2ע ב ו ר
הם
מ
קולונה
0.3
נוספים,
השונוח
בפרוטרוט
תומר
מ
כי
של
ח
Seph-C4
קולונת
של
פחות
הקולונוח
שתוארו
המפיחה
נמצא
םפתה
הראוי
פני
יכולח
היונים,
זהים
על
Seph-
.9.5
יל
DEAE Sephadex
מאשר
פוםפורילז
עבור
ל
A - -50
S
כאשר
מן
כי
-
של
על
אלקיל
השרשרוח
סמך
אגרוזוח
הניסויים
שח ו א ר ו
הועברו
חלבונים
על
שהיו
דומוח
בכל,פרט
לאורך
תלות
כושר
המוזכרות
הוכנו
!Seph-C
הקו ל ו נ ה
המפיחה
נחקרה
שחי
י כ ו לח
האליפטיוח
של
שבהן
עולה
וסדרה
שניה
לחומר
של
בפרק י ם
הקודמים
הומולוגיוח
השרשרות
של
קולונוח
ה ה י ד ר ו פ ויב י ו n
בצפיפוחן
של
זו
ואשר
אגרוז
הקשו רו ת
השרשרות
ניחן
לקו לו נ ות .
האליפטיוח
הבא,
קולונוח
"צפיפות"
של
הקולונה.
למסקנה
ב הרחבה
הקולונוח
בניסוי
סדרות
סדרות
םפיחה
לחלבוניט
המוקנית
ע ן! י
בחנאים
השרשרות
קולונוח
הפתיליות
Seph-C
4
זהים.
שבהן
סדרה
אחח
הקשורוח
עולה
של
קולונוח
לחומר
״צפיפות"
02
השרשרות
בבת
הבוסיליות
מכמות
אחת
כמויות•אלקיל
הכמות
בל
אחת
מסדרת
של
העקום
אמין
מסדרת
הםקםיםליח
הניסוי
הנספחת
בשני
המקרים
ל״צפיפות״
על
השרשרוה
שבו
השרשרוח
הספיתה
תלות
בצפיפות
ב״צפיפות״
עבור
תהיה
שלהן
רה
נקבעה
. b
של
b
פחד
ורק
ל
בין
של
כי
b
היא
יכולת
הפחמימניוח
כמו
אלו
בניסוי
הבא
תלות
השרשרות
השרשרוח
ה קיבולה
הקולונה
נקבעה
מקסימלית
"צפיפות"
בתמונה
מם'
36
של
פ
המטען
מתוארת
!Seph-C
לבין
ב ו קיר
ניכר
a
גם
אחד
הטפיחה
והיפרבולית
בעקומות
ואילו
שיפועים
הקולונות.
אנזימים
דומוח
מסקנה
בשאר
החשמלי,
בסעיף
הקול ו נ ו ח
מאידך.
פ
b
טיטרציה
הטיטרציה
י
פ
לקולונוח
נ
י
ולאחר .יבוש
ח
ו
של
הקודם
• Seph-Cj
המטען
מהסדרה
"
,
תופרי
פוטנציומטרית
שלושה
זו
הגורמים
בצפיפות
ח
עבור
לפחות.
בחופר
פוםפורילז
ע"י
בין
הקולונה
הפחםימניוח
ה
הבדל
חלוח
שני
חהיינה
קיבול
הומולוגיח
בחחום
בחומר
K
פרופורציוניח
"צפיפות"
הקו ל ו נ ה .
p
האנזים
הראשון
קולונות
הקו ל ו נ ה
(
כל
הקולונות
לספוח
למשל
אתת
ה״צפיפות"
ישר
שתי
המטען
) 9 . 6
על
קו
הכמות
כמות
פוספירילז
בעלת
בין
של
של
ת וצאו ח
היא
תלות
הםפיחה
מקבלים
זה
קולונוח
ל -׳••
עבור
עקומי
הבדל
המפיחה,
וב״צפיפות״
צפיפוח״
-
כי
זו
נ י כ ר .קיים
םיגמלאידיח
להסיק
אם
הקודם.
a
אח
של
בחלקו
סדרת
C4־. Seph
הלוגריתמית
מקורו
על
באופן
פוםפורילז
נראה
חח ו ם
של
פוםפורילז
הבדל
השרשרוח
אך
לםפיחה
7.0
עולה
פוםפורילז
מיוננוח
לעמוד
. pH
הספיחה
ניתן
להשפיע
plateau״
)1
מייל(
הטפיחה
הוא
שנידונו
מה
זה
מדוייקח
קבוצוח
|M120
בהרחבה
ב״צפיפוח״
ניסינו
מעל
כושר
מ"ל(
מסוכמות
J J L Mח ל ו ח
בסעיף
העקומה
עדיין
העשויים
של
של
עם
נמדדה
קבענו
השרשרות.
על
עבור
a
מניסוי
הקולונות
(15
ואילו
בהתאם.
ב"צפיפות"
השרשרות נ יראי ת
פוספורילז
תלויה
של
השרשרות
של
הלוגריתמיות.
לא
בתמונ וח
הוגבו
קבוע
)1
-3£3
היכנו
הקודם.
השני
קבוע
34ו
סינתזה
פוספורילז
ברור
.
לנפח
שוות
לנפת
בניסוי
מחאיםה
כושר
הספיחה
b
תלויה
כאשר•מקפידים
השיקולים
a
הסדרות
בסעיף
הנםפתת
הנםפחח
א י ז ו ר זה ה ״
לרוויה.
פי
וגדלות
שחי
מנות
כמתואר
!. Seph-C
הסדרות
שרשרות
הקולונה.
משופעל.
פוםפורילז
4Seph-C
עבור
המתקבל
לעיל
של
שתי
מגיע
ראינו
הולכות
פוםפורילז
הקולונות
)עד
של
לחומר
םפרוז
הקולונות
של
ל״צפיפוח"
קיומן
הקשורות
גדולה
המקסימלית
-
חומרי
ל -
קולונה
-
83
8
)L o g ( Rod Density
L
40
I
J
_L
)Density tyxmoles/g
םס'
תמונה
כמות
3
-
נפח
0.3
ם״ל
)פיפטת
פרקציוח
נפח
nm280
האנזיס
של
החלבון
נ0וק1יוה
שהושמה
על
1.5
על
ועל
פי
הקו לו נה
פרט
קוניות
נפחה.
נא0פה
במדויק
בבופר
כדי
כמות
והנפת
280
לוודא
החלבו ן
חאל ו xיח
שלא
בת
אחת
הבליעה ב
נקבע.
nm
של
חלח
לכמות
-
GP-MA.
כמות
הטוטאלית
והושווחח
ונאספושחי
פרקציה
.IM
ס״ל
בבוסר
ב כ ו פ ר GP-MA
מכוילות
-
1
a
הקבוצות
ונשטפו
נמדדה
NaCl
הבליעה ב
חושבה
נשטפו
הפרקציוח
בנוח
לצפיפות
הוכנו
בצפיפות
סו0פורילז
!Seph-C
כאלוציח
המכיל
ונפוקגיוח
הקולונה.
אליהן
מייל.
נמחלו
פי
לזו
כחלות
ם״ג
7»5
הקולונות
נ00ח
למבחנות
חושבה
חספיחח
זו
בכל
GP-MA
הצורך
האלוציה
מספר
קולונות
ו השוות
בנפח
נא0פו
על
על
ן Seph-C
הקולונה.
הקולונח.
ובכופר
לקולונה
פרקציוח
אחח
לקולונות
שבחומרי
שהאנזיפ
ובמידת
הפרקציוח
שנ0פחה
פסטר(
שבחומר
כל
הנקשרת
הועברו
ולאחר
GP-MA
מייל
a
המחיליוח
הפתיליות
3
34
פוםפורילז
הקבוצות
Rod
דנסורציח
שנמדדה
החלבון
84
מסי
ווםו גה
35
כמוחפוםפורילז
הקבוצוח
ב
0.2 -
מייל
הועברו
על
נפח
בהרכב
ש י מש
b
מספר
קולונות
)בפיפטת
פסטר(
והשוות
שבחומר
זהה
במקרה
זהה
הקולונה.
אשר
באלו צ י ה .
המתואר
GP-ME
ה
-
pH
בשתי
שלו
מ״ג
6.6
בנות
זו
לזו
שיטח
בכל
פרט
השטיפה
מם'
פרקציוח
הובא
בצפיפות
פוספורילז
-
לצפיפות
והאלוציה
34
פרט
השטיפה
5.7
ע״י
הקבוצות
ובן
להרכב
הראשונוח.
חומצה
b
מ" ל
1 S e p h
בתמונה
ל
כתלות
!Seph-C
הקולונה.
4
לניסוי
זה
לקולונות
שבחומרי
C־
הה ו צ א ו ח
שהיה
הנקשרת
המתיליות
הבוטיליוח
-
חישוב
הבופר
בופר
אצמית
קרח
-
0.30
וזמונה מסי
טיטרציה
זו מזו
85
-
0.10
meq
0.20
HCl/g
36
פוטנציומסריח אוטומטית של קולונוח
מייל
-3.0
KC1
ח ו פ f=1.00) 0 . 0 5 1צהמלחית
pH
0
וי הביקורח שהוא
סוטרו
500
4
20ס״ג
בצפיפוח השרשרוח הבוטיליוח שבחומר הקו לונה.
של חומר הקולונה הורחפו ב
ה -
Seph C־
השונות
חושבו מהגרף שהחקבל.
2
4
בכל
1Mוסוטרו נ
M
(
.
ערכי
pHהורדה הטיסרציח המקבילה
מייג םפרוז B
מכילות 700 -:מיקרו מול שיירים
מיקרומול בגרם )
־C30°
.
הקולונוח אשר
בוטילייםבגרם
(—oו 45 -מיקרומול בגרם )
)—•—(,
—.(—A
86
-
ה שיו ניס זה מזה ב" צפיפות!• השרשרות הפחמימניוח.
נערכה השוואה בין
קולונות אלו לגבי שלושת החכונוח אשר נמדדו.
בן מופיעה ׳בטבלה קולונת מחליף היונים A -50
השוואה.
לצורכי
בטבלה מם' 7
DEAE Sephadex
בחלקה ה ח חת ו ן של הטבלה מושווים היחסים שבין
גדלים אלה הנמדדים עבור קולונוח 1ו־ 2שהן בעלוה "צפיפוח"
שרשרות גבוהה לבין קולוניה מם' 3אשר בה "צפיפות" השרשרוח היא
נמוכה.
טבלה מם י 7
"צפיפות״ השרשרות "צפיפות" המטען קיבולת לאנזים
H mole/gram
)(1
Seph-C
700
313
8.0
)(2
C־Seph
500
295
6.2
)(3
C־Seph
45
116
0.6
2,000
0.3
2.70
13.0
4
4
4
DEAE Sephadex A-50
,״
n
meq/gram
mg/ml column
)Seph-C (1
)Seph-C (S
4
*2,000
15.60
4
.
ןזס
)Seph-C. (2
)Seph-C (3
)Seph-C (1
DEAE Seph.
11.10
2.54
10.0
4
י ח ס
4
*0.35
* בהנחה שצפיפות המטען זהה לצפיפות השרשרות,
0.16
27.0
הערכה זו ניראית סבירה
לאור העובדה שהמטען במקרה זח מקורו בעיקר בשרשרוז! עצמן.
87
לו
היתה
המםענים
היחד.
אינה
עומדת
כי
במקביל
אז
במבחן
השרשרות
השרשרות
בקולונה
מם'
פי
1
13
מיכולח
•1גדולה
2.7
הקולונה
פי
לםפוח
"צפיפות
נתונים
לא
אלה
השפעה
גדולהבקביעח
יכולח
מחליף
יונים
המטען
גבוהה
פי
שאם
מכאן
-
.6.4
הגבוהה
A
מ"צפיפות"
םופחח
המטענים
היונים.
בתדירו־ת
בו
השונות
אשר
היא
הקולונה
להסביר
זהות
למולקולות
הדומיננטי
תפקודה
4Seph-C
חומרי
כדי
זהה
היתה
יכולת
כמו
אופן
פי
על
הקולונה
ביכולת
הקולונה
הוא
בעל
קולו נה
מם'
2
בהשוואה
זו
בקולונה
4Seph-C
)(1
לקולונת
"צפיפות"
ולמרוח
אנזים
הקטנה
פי
את
יכולת
הקולונה
קובעת
.27
,
ל ע ו מ ת ) (1
אין
בולט
של
כמוה
המטען
באותו
בקולונה
.(7
.DEAE
הקולונה
בלבד
מם י
קולונה
הקולונה.
על
א גרוז
המטען
,
בהשוואת
) םב לה
Sephadex
זו .יעילה .פי
מחליף
השרשרות
הא ל ק י ל
מס
פני
אולי
ההבדלים
של
יכולחה
של
אלה
קולונת'
הפחמימניות
עם
שלהן
ה
באופן
פוםפורילז
שמצאנו
משיקולים
קולונח
לייחסו
ב א ו ל ט ר ה ם ט ר ו ק ט ו רה
השרשרות
ה י א כ נ ר א ה מ ש נ י ח .
יעיל
למולקולות
האנזים.
בקביעח
"צפיפות"
את
מ ק ו ל ו נח
הבלחי
ניחן
זו
השרשרות
.3
דומיננטי
הקולונה,
דומה
קולונת
לחומר
כגורם
הנחה
של
כמות
טוב
אנזיט
"צפיפות"
הםפיחה
.3
בקירוב
למטען
._7
בקולונה
הקשורות
שמספר
תופעה
של
המטען
לםפיחת
מ״צפיפות"
יכולת
מסי
בצפיפות
הטעונות.
סם'
לערך
קולונה
משתנה
ה ק י ביו ל ישל
-50
צפיפות
b
בטבלה
15.6
בעיקר
שהקיבולת
הקבוצוח
גבוהה
מכמות
ונראה
מתגלה
כ
כמות
b
הםפיחה
המטען
המפיחה
להתייחם
לםפוח
לקולונה
של
הפחמימניות
פוםפורילז
פסי
ובמקביל
בלבד
של
פי
תלויה
לצפות
המופיעים
גבוהה
;3
ניתן
3
היה
צפיפותן
פוםפורילז
השרשרות
, ,
של
הנתונים
בקולונה
הקו לו נ ו ת
אפשר
לעליח
מ ם ' JL
מם'
י
הםפיחה
החיוביים
גדלה
מם'
קולונה
יכולת
-
-
Sephadex
חלקי
b
,
אולם
קולונות
ולפיכך
ניתן
אלקיל
אגרוז
להבדלים
טיעון
זה
ה4-Seph-C
יש
לאמור
לפחוח
DEAE
להן
כי
חדירות
הגורם
לםפוח
בהו מד •הקו ל ו נהי ו ה ח ל ו ת
חלבונים
במטען
-
אחרח
גישה
המביאים
יוחר
ניחן
להפריד
החלבון
כי
אל
כל
יות
אחד
כלל
מקום
יש
הבופר,
הבליעה
ב
זה.
מזה
בתמונה
העברת
בעיון
מסובך.
מדוקדק
באופן
השפעחם
גם
של
על
תיאורט
המפיחה
של
מסי
אשר
אוראה
לא
גורר
אחריו
ניחן
לבחור
תנאי
אלוציה
מ"ל
נפח(
בנפח
קבוע
של
נוספות.
של
מבנה
חלקית
השפעתו
(5
אותו
עקבנו
של
הבופר
אחרי
השפעתן
מלאה
מחרחשח
b
על
תרכובות
מהקולונה
מקבלים
גבי
ב
על
מבנה
1
מולר
היא
מביאה
לאלוציה
לחומר
זה
יש
כידוע
השפעה
על
מבנה
pH
ל
-
5.9
נמוך
הקדלונה.
העברת
החלבון
בריכוז
-
של
pH
על
נחקרה
הרכב
מ ם 3 7
_
חומר
באופן
גם
לאחר
םפיחח
החלבון
סמוך
נוספוח
ע"י
מ ג (
שונה
ב
)•(88
מקולונה
הועבר
במוח
פהקולונה
באנזים
פוספורילז
של
b
לאחד
b
"
החלבון.
בשינוי
שבהם
בתמונה
פוםפררילז
ניכרים
מלווה
ניטרלי.
'
החלבון
בוודאוח
פוםפורילז
pH
המשתחררת
אנזים
במבנה
אלוציה
פוםפורילז
ב
של
שינוי
החלבון
של
-
של
לקבוע
כלל
ששינוי
שונים.
מלאה
מתוארת
למשל,
המטען
)5
כמוח
אלוציה
גם
ניחן,
המממ.
לאלוציה
של
פרקציות
שינויי
38
אלה
היוני
להביא
.nm280
דנטורציה
מהקולונה.
אח
והחוזק
עשוי
דומיננטית.
מם'
אלוציה
מהקולונה.
ציטרם,
ולחקור
pH
אינו
ושטיפחה
_
מתוארת.החלוח
חלה
עם
קולונות
ונאספו
שבו
הוא
לסייע
ה כ ר ו מט ו ג רפ י ה .
-
זאת
זהות
האנזים
חלים
יכול
בהבנת
החלבון.
ה
לסברה
נחקרה
Seph
בופר
הממס
השפעה
לקולונה
פי
כזה
חקר
הקולונה.
המתקבלות
מעשית
בתנאים
4
מדרת
של
הממס,
שלו.
יש
בחנאי
כלשהוא.
שינרי
C
לחומר
הבאים
מגורמים
פרלריוח
הקונפורםציה
השונות
החלבון
פולריוח
מהגורמים
הנ״ל
שמחקר
היחה
התנאים
הקולונה-:
קולונה
בדרך
נראה
האנזים
הגורמים
)(2
מחומר
על
ניחוח
בין
בחקר
התוצאות
הקונפררמציה
שינוי
על
בםפיחת
)(1
של
בה
הבעיה
האנזים.
מטען
)(3
של
של
המשתתפים
מחברו
כי
שנקטנו
לאלוציה
הכוחות
88
האלוציה
בופר
מפורט
של
אימידזו
).(56
אנזים
האנזים.
-
חמונה
של
פוספורילז b
מם'
4.7מ ״ ג
הוח של
C
-
h
C־
מקולונה של
p
e
זהים
נפח
S
.3:1
4
4
פוספורילז
E
M
-
הפיקציה
הבליעה
האלוציה
h
כחלוח ב
P
) 5מ"ל נ פ ה ,
נמדדה
נופו
09
-
1.6
ב
b
-
0.3
מייל
בופר
G
0.9
מייל.
20
GP-ME
-
קוסר(.
נאספו
פרקציוח
נוספוח
nm200
באידך גל
הובא ל
p
שהוכנו
ם יי מ
pH
הםחאים
10
)—•—( יה
ע יי י
e
חומצה
S
הועברו
על
בבופר
בחנאים
פרקציוח
נאספו
-
-
.pH
H
P
באותו
בבופר
)
אצטיח
הבוסר,
האלוציה,
( ,
קרחיח
מהילה
-
90
E
c
O
00
(VI
>a
o
c
o
XI
o
(A
<
20
15
5
10
Fraction number
תמונה מסי
b
C
-
p
h
e
38
מקולונה של
S
4.8מ״ג פוםפורילז b
ות זהות ש<
C־
4
שהוכנו
בחנאים
בבופר
בתנאים שן ניט.
4
ב 0.1 -מייל נוער
h
p
GP-MEהועברו על כל
e
ז ה י 5) 0מ״ל נפח 0.9 ,ם״מ קוטר(.
M E ^ ^ a־ , G Pכל פרקציה בנפת 1.6מייל.
S
E
M
נאספו 10פרקציוח
20פרקציוח נוספות נאספן
בכופר האלוציה שהרכבו היה כמצוין בגרף )מעל לחץ(.
גליקול
בנופו . GP-ME
= Ureaבנופו
E.G.־־ אתילן
GP-MEבריכוז הנקוב.
Cit־ = Imכופר אימידזול ציטרט )שיטוח(.
האלה היה , 7,0
-
P
G
ה _ pHשל כל הכופרים
-
פענינת
בבופר.
במיוחד
בריכוז
מ ה ו מ ר ; ; ה ק ו'ל ו נ ה .
אלואנט.
ובנפח
כמו
קטן
כן
אתילן
של
נפטר
גליקול
מחזקה
בפו
בריכוז
אח
לפשל
10$
בריכוז
של
של
30$
שהחכונוח
ידוע
האלוציה
אתילן
אלואנט.
ההנחה
עם
של
91
חלוח
-
אחילן
בריכוז
שהםפיתה
אל
את
החלבון
בריכוז
אתילן
קיימח
אלוציה
איטיח
של
קטן
יוחד
גליקול
האלוציה
גליקול
זה
הספקטרליות
כמקטין
השרשרוח
20$
של
בבופר
לאנזים
של
הקולונה
של
מלווה
הקשורות
האלוציה
פעילות
האנזים
הפולריות
הפחמיפניות
מחרחשת
בנפת
אינן
הממט
חלבון
של
היא
מלאה.
קטליםית
מלאה.
משתנות
).(99
וחלוח
באינטראקציה
לחומר
גליקול
זו
בריכוזו
הידרופובית,
הקולונה.
-
לכוחות
חומצות
האמינו
תומצות
אמינו
חומצות
אמינו
מרבית
כ
שיירי
ואילו
בדומה
להווצרות
או
הידרופוביות
תרכובות
מעין
אלה
ניתנת
את
בשעה
ז ו ,אלא,
לשימוש
הממס,
ליגנד
לא
קשר
החלבו ן
מספ ר
לא
תמיד
החשופות
מספ י ק של
מלווה
הידרופובי
אינן
כדי
אופרטיבי
רק
ושינוי
מכ ו ח ו ח
פני
על
ה ס ד ר של
בשינוי
גישה
לפי
בין
עבור
אותן
האנרגיה
אמ י נ ו
לקשירת
פח ם י מ נ י ם
הכוחות
הה י ד ר ו פ ו ב י י ם
אשר
מולקולות
לנו
תאפשר
או
לקב ו ע
המים.
פשוטה.
יצירת
המביא
לירידה
ניתן
לאיתור
כאשר
יהיה
מולקולות.
ואחרים
באנרגיה
ה ש י נ ו י החל
לאינטרפרטציה
ו במרב י ח
חומצו ת
ה מ ע ר כ ת ( N ^ m e t h y (95 .
ל מ ד ו ד את
כל
ה י ד ר ו פ ו ב י י ם•
אנסרופיה
זו
לחלבו ז
>
שטח ה ח ל ב ו ז
י ו ת ר של( N ^ m e t h y(95
גדל
הידרופובי
ניתנות
אתרים
מחרץ
אפשרי ת ,
שיירי
אד פ ר ט י ב י ת
נ ד ב עת
ומאוחר
פולריים
גרעינית,
ש י נ ו י י הא נ ת ל פ י ה
Tanford
)(93
מציין
שהכ ו ו נ ח
בהגדרה
וחלבון
אל
ההידרופ
נדון
נתרכז
פנ ים
החלבון
ליות
במפורט
ש מ ת ה ו ו ה קשר
עדיין
פונים
במק ו רם של
ה ת ר ם ו ד י נ מ י י ם של
תהודה
מועדפות
אותן
הק ו נ פ ו רמצ י ו ת
בשקעים א ל ה ,
ההידרופובית
הגדלים
ועוד.
כאשר
י דוצרו
לא
ניתן
פונים
חוך
כאשר
למנות
השרשרת
בהם
בין
. J\F°
בספקטרום
המים,
שטחיים.
מוםםים
האינטראקציה
ימדדו
אמי נ ו
שליש
אל
ה ידרופוביות
ש ל( K a u z m a n(94
סביב
החופשית
האמינ ו
אל
נטיב י ,
ביניהן
ההידרופוביוה
דטרגנט.
חומצות
נוכח
אינטראקציה
היא כי
האמינו
חומצות
פנ יל
שלי ש ו נ י
ההידרופוביות
לקשירה
הגישה
לאוצין ,
במבנה
אמפיפיליוח.
המביאים
כי
ואלין,
מ צ ל ה של
בשקעים
הפוליפפטידיות
אל נ י ן
חומצות
נ ו ת ר ו• ח
מצויות
השרשרות
כרבע•עד
הן
אופי
שיירי
האמינו
החלבונים
-
בקביעת
מבנה•החלבו נים.
מכלל,,
ה י ד ר ו פ ו נ י ),(94,93
מתארגנת
מרבית
חומצות
חשיבות רבה
ה מ ר כ י ב ו ת את
בעלות
הפוליפפטידית
שבהן
92
הידרופוביים
-
ממליץ
בסדר
הוא
להשתמש
מולקולות
מציין
גישה
כי
תיאורטית
מדידות
זו
מערכות ב ה ן ,
כאמור,
ניתן
לקבוע
את
השינוי
בסדר
מולקולות
החופשית
או
-
93
גישה
אופרטיבית
ע"י ( J e n c k s (96
מולקולות,
בין
לא
ואשר
למעברי
של
מסען״.
לנו
מולקולה
יותר
Reynolds
במים
אשר
אמח
כי
פשטות
םםיסותה
אין
קיומה של
יורדת.
הוכנו
במים.
במים.
ספרם ) ( 9 7
עוצמח
בעבודה זר
ע"י
המוסכמה
בה
כנפרד
הדרכה
עם.מים,
מימן או
לקביעה ו ו ד א י ת
האינטראקציה
קישור
לפחו ת ב מקרים
ההידרופובית
הקשירה
השחמשנר
שרשרדח
במים a
ה ט י פ ו ס ה נ "ל ,חשד נו
במים
בכל
על
ב כ ר ו פט ו גרפי ה,
בסדרה
חוז ק
ל אשר חשד
בכרומטוגרפיה
זיקה.
השרשרת,
כלומר,
ה ד ר ג ת י ו ת מן
בדיקת
מאינטראקציה
ה ש פ ע ת ם של
הפרדה זו
הראי ו ח
הניסוי י ו ת לקיום
ה א ו פ ר ט י ב י ו ת הנ״ל.
לגבי
חשובות
נדון
השרשרת
ונמצא
בשם
*
תכנונן
השלכות
אגרוז
הרב-סוכר.
בעיקר
הקישור ,צהע נ ו ל כ נ ו ת שיטת
זה ,נ נ ת ח אח
נגזרוח
הארכח
להראות
זה ,ג ם עי• י
השי פ ו ש של ה כ ר ו מ ס ו ג ר פ י ה הה י דרו פ ו ב ית
של
ככל
תרכובות
שהפםיסות
שונים אל
ופו התת עם
ובכושר
זו
עולה
באורכים
הידרופובית.
ה ו ם ו ל ו ג י ת של
החלבו ן
בהשתמשנ ו ב ה ג ד ר וח
י ש לו
Steinhardt
ה ו מ ו ל ו ג י ו ח של
הצלחנ ו
הידרופוביח
אינטראקציה
פסויים
בסדרוח
הולכת
ע"י
לקולו נ ה נ ו ב ע
״כ ר ו פט ו גרפי ה ה י ד ר ו פ ו ב י״ח) ( 74
בפס גרת דיון
לחלבון
מקרה בו
כי ק ישו ר
הואיל ו ה צל חנו
פ ר מ ט ר י ם נום פים
כי:
פחמיםנירת
שהמולקולה
נוצלה
אופרטיבי
קובעים
למדידת
כבל
הידרופוביותה
שחקרנ ו ,ח ו ז ק הק ישו ר גבר עם הארכה
עם ה קט נ ת מס י ם ו ת ה
ד .י ד ר ו פ ו בית.
על
תכונה זו
הם
ה פ ח מ י מ נ י ם הא לה
רבים
מוסכם כי
כדי 'להגדיר באופן
פחמימניוח(
בעבודה
מולקולה
אינטראקציה
אלקטרוםטטיים,לקשרי
הגדרה זו
שכן
המידה
פםיסדתה
and
מם י ם ו ת ם של
כי,
אינטראקציה
קוולנטים,
הידרופובית,
ה ס י כ ו ם של
)לפשל
הידרופובית "היא
מ א י נ ט ר א ק צ י ה של כל
לכוחות
למרות
היא
כך תקטן
בפרק
כי
אינה נוחה י ו ח ר
דרך השלי לה.
נראה
של
הטדען
ניתן•ליחסה
על
למרוח
החזקה י ו ח ד
אינטראקציה
נקבע
אשר
פשטותה
לשימוש ניתחה
גם
בהשלכות
אלה
ההפרדה
של
האפקט
נדון
שלה.
קולונות
בפירוט.
ההידרופו
באפשרויות
המידע
לשימוש
שנאם
94
-
1״ ה ה כ ו .ח ד nהסע י רב י ם ::ב כ ר ומסד .גרפי הי ה יד ר וי פ ו ב י n
קיוםם של אפקטים הידרופוביים בעח מעבר חלבונים על קולונות
אגרוזות ,הודגם בעבודה זו עבור שתי סדרות
אלקיל
קולונות:
ועבור שני
Seph-Cnו-Seph-Cn-NH
2
הומולוגיותשל
אנזימים ,ג ל י ק ו ג ן .
אנזימים
פוםפורילז וגליקוגן סינטתז על צורותיהם הפיזיולוגיות השונות.
אלה מגלים תכונות הדרגתיות של ספיחה בהיותם מועבר י aע ל• .כ ל אחת משתי
הסדרות
ההומולוגיות של הקולונות )ראה תמונות ,10 ,8
<> האנזים
המועבר על סדרה הומולוגית של קולונוח ,החל פקולונה בעלת
וכלה
בקולונה בעלת
n
n
גדול יותר ,עובר ממצב של חוסר ספיחה לקולונה,
לםצב של מפיחה רברםיבילית ועד למצב של ספיחה חזקה ביותר.
האלוציה נעשים דרסטיים ככל ש -
אלה נובעים מהאינסראיקציה שבין
האחרים
ניתן להניח שכוחות הידרופוביים
השרשרות האליפסיות הקשורות לאגד ו ז לבין
כיסים הידרופוביים על פני
ההידרופוביים של
תנאי
nגדול יותר עד שלא ניתן לנתק את
האנזים פן הקולונה ,אלא ,במצב לא פעיל.
אתרים או
קטן
החלבון.
קיומם של הבדלים בין
חלבונים שונים הודגם בעבודה זו בכמה
מימצאים-:
א.
יכולת
לבודד אנזים פחוך תערובת של
הקולונות ה ה י דר ופוביות
חלבו נים רבים.
יכול ת ז ו מצביעה על ספציפיות ניכרת של האינ טרא קצ י
גליק ג 7פ רםפורילז פי 100ע"י העברת מיצוי משריר
בעבו דה זו נוקה
ו
ג ליקוגן םינסתז נוקה פי 40ע"י העברה
על ק ולונה הידרופובית .
מ י צו י משריר על קולונ ה ה י דרופובית
גלי קוגן
אחרת ועל קולדנה זו נוקה
סינסתז מכד ור י ו ת דם אדומות פי
.600
המולקולרי של החלבו ן לבי ןה י כ ו לח
לא נמצא קשר ישי ר בי ן המשקל
ב.
אנז י מי ם בעלי משקל מולקולרי
להספ ח לקולונות.
דומה נספחים
לקו לו נ
השו נ ות באורך השושוו ח הה י דרופוביות ).(107
ג.
היכולת
להםפח לק ולונ ה אינה תלויה ברצף חומצות האמינו.
כמעט זהה כמו
פוספור
ילז
א נ ז י מים בעלי רצף חו מצו ת אפינו
מגלי ם ספיחה לקולונו ת ב על ות אורך שרשרות שונה )אנזי מים אל ה
a
ו ־ b
95
שונים זה מזה רק בשייר סדין אחד בפר ו'סומר בעל משקל מולקולרי
של 100אלף.
בצורה
• aהזייו הסריני עבר פ ו ספ ו ר ילצי ה(.
תופעות אלה ניתנוח להסביר אם מניחים בי
מתרחשת בין אתרים או
לבין
האינטראקציה ההידרופובית
איזורים הידרופוביים מ ו גד ר י ם.ב ג ו ד ל ם ופיזורם
שרשרוח אליפסיוח הידרופוביות שבחומר הקדלונה.
מסקנה זו נמצאת
בהתאמה עם אינפורמציה רבה המתוארת בספרות אודות קישור פחמימנים
שונים
לחלבונים־
ראוי לציין כי and Reynolds (97
(Steinhardt
אשר דנים בקישור פחמימנים לחלבונים קובעים כי "חלבונים גלובולריים
שונים זה מזה ביכולתם לקשור פחמימנים ,יותר מאשר בכל תכונה פיזיקלית
אחרת הניתנת למדידה בקלות־
ואיכותית
נראה שתכונה זו נותנת אינפורמציה כמותית
לגבי אופי שסח פניהם".
ומרי ק ו ל ו נ ה
ה
הא ינסראקציה שבין אתר ים הי דר ופוב י ים בה לב ונים לב ין ח
נבדקה
לי די ביטוי גם ב ח נא י האלו צי ה של החלב ו ני ם מה ו מר י הקו לונה.
צ י ה מהקולונ ה
א.
בשני א ו פנים- :
ע״י העברח ח ו מרי ם ה משפי עי ם על מבנה ה חלבון ו גורם ים לו שינויי
מבנ ה המתבטא ים באת ריס
ב.
הה י דר ופ ו בד ד
ם שעל נפ י ו .
ע"י העבות חומרים המגדילים את אופיו האפולרי של ממס הא ל וציה
ומאפשרים לו לנתק אח
החלבון מן השרשרות ה הידרופוביו ת •
חשיבות הקונפורפציה הנטיבית של החלבון בא ה לידי ביטו י בתנאי
bהספוח על ק ולונה של
האלוציה של פוםפורילז
{ . Seph-Cפ ו ם פ ו ר ילז b
ניחק מחומר הקולונה כאשר מעבירים דר ך הקולונה בופר אימי ד זול צי ס רט
)
.(0.4
Mל ע ו מ ת זאת ,כאשר מעבירים ב ו פ ר המכ יל נתרן כלור י בהו ז ק
יוני דומה לזה של תמיסת האיסידזול צ י טרט אין אלוציה מה קו לונה.
כידוע גורפת תמיסת אימידזול ציטרט ) בריכוז זה ( לשינויים רב רס י בל י י ם
בפבנה האנזים הפתבטאים במבנה התת יח ידחי )הופ עת מונומרי ם( ,באי בו ד
ד
חלקי של הפעילות הקטליטית ,בהשתנות התכונוח ה ספקטרליות הוכ י מ י ו ת )(56
וכנראה גם באתרים ההידרופוביים שעל פני האנזי
ם .ל נ ת ר ן כ לדרי ב
י דכ ו ז י ם
96
-
אלה א ין השפעה כה גדולה על מבנה פ ו ספ ו ר ילז
פ ו ספ ו וילז
ואבן ניתן
קחי ה כללת נתרן כלורי
םפו ר י ל ז
להביא לאלוציה של פו
של
b
רגיש לריכוזי נת רן כלו רי ו ח לים בו שינויים במבנה־
a
^Seph-C
מבנהו
הנסיבי.של
באלואנט־
aהספ ו ח על קולונה של !Seph-C
כאשר ם ופחים פ וספווילז a.
על קולונה
האינטראקציה שבין חומר ה ק ולו נה ל בין האנזים היא כנראה
חזק ה יותר וכדי להביא לאלוציה של הא נ ז י ם הספ ו חיש לגרום לשי נ ו י י
מב נ ה דרסטיים יוחר מאלה שמסוגל לגרום ר יכוז ה נ הרן כלורי שבו אנו
דני ם )ראה תפונה (19־
פעי ל חייב
במקרה ז ה כדי להב י א לאל וציה של פוםפורילז 11׳.
האלואנס לכלול בופר אימידזול צ יטרט ־
שינויים במבנה הנטיבי של פ וםפורילז נ ג רמים לא רק ע"י נופו
א י מי ד זול ציטרט )ב pH -ניטרל י( ,אלאy ,גםי 11שינוי ה _ . pH
ב םמי ר ל 5.9 -
לידי ביטוי בפעילות הקסליטיח,
bשי נ ויי מבנה ניכרים הבאים
pHחלים בפוספו רילז
בתכונות הכי מידת והאופטיות
).(88,60
מבדי ק ח אופן האלוציה של פוםפור
י ל ז נ] מ קולו נ ה של Seph-C4ב pH -י ם
שו ני ם ,נמצא כי בסמוך ל pH 5.9 -ה א ל ו צי ה היא יעילה ביותר )מבחינת
כמו ת האנזים
המקסימלית הניתנתלאל ו צ י ה ב נ פ ח קם ן של אלואנם(.
שה ו נ פ ורמציה
מתנאי האלו צ יה המתוארים לעיל ניחן להםי ק ק
של החלבון היא ב עלת חשיבות רבה לםפיחה אל חו מר הקול ונה ההידדופובי.
הנסיביח
על אופי האתרי ם
ניתן
»
אשר שלמותם חי ונית
לםפיחח ה חלב ונים אל חומרי הקולונה
ללמוד מתלו ת הא לוציה של פ וםפורילז
בקולונה־
מקוב ל כ י תפיסות של אתילן
כ"ממס" טוב יות ר לקב וצות
נ1
בפול ר י ו ח הממס המועבר
גליקול ו ח מ
י ס ו ח של א ו ראה משמשו ח
הידרו פוביות מאשר םי ם בלבד ).(97-93
אלה נוטות להחלי ש א י נטראקציות
יעילה של פוספו ר ילז bמ ק ו ל ו נ ה של
תפיסות
הידרופוביות ,ו אכן נ י תן להביא לאלוציה
^Seph-C
גליקול או 1מו ל ר או ראה בהרכב האלואנט־
פוסו ר י ל ז
על הקונפורמציה הנסי בית של פ
עיי י הכ ללת 30$אתילן
לתנא י ם אלה השפעה מעסה יחסית
. b
כר למשל ,פוםפורילז b
ר
ב נ ו כת ו ת 30$את לן ג ליקול הוא בעל פעילות ק םל י טי ת מ לאה ,והחשיפה
לאתילן
גליקול רב י כ וז זה אינה משנה את התכונ ו ח הספ ק ם דליות של האנזים
) .(98ראו י לצי ין כ י אתילן גל יקול
מבנה רציניים ג ם בחל בונים
אחרי ) .(99
ם
י נ ו גורם לשינויי
בריכוז ז ה א
נ י תז אם כן לייחס אח האלוציה
97
ע״י
הנגרמת
לשינויי
אתילן
קונפורמציה
סביר
עליו
להניח
כוחות
נובעים
כי
נוספים
פרס
לאינטראקציות
קשרי
מעשית
בספרות
בלבד.
חומר
קרוב
להגביר
ניתן
להלן
נדון
בעבודה
מתקרב
)(103
מציין
כלל.
לשינויים
שהראינו
שהבחירה
לצימוד
ע"י
חלב ו נ י ם
או
בצורה
זו.
אמינו ל י ז ה
משמעו ת י ת
באגרוז,
השרשרות
של
חקירת
ראו י
הומולוגיח
כנושא
את
שבהם
הגדלים
זו.
הקולו נ ה
נגזרות
אי דיאלי
נקשרי ם
לאגרו ז ,
אלא
עבדנ ו
ב רו מ י ד
נוחה,
דרםטיים
כי
נמצאה
מםי ם
ב קיומן
"סדרה
של
כן
א ג רו ז
Porath
החוזק
בלתי
הי וני
ספציפי ת
ואינה
גו רמת
ריא קציח
השפ ע ו ל
( Seph-C0(H 0) ,
עד
הולמת
אינטראקציו ת
פי
אינם
2
שבדקנ ו
הומולוגית
שבו
שעברו
למט דתנו.
ניתן
השחמשנו
חו מ ר
ובשפעול
על
אינטראקציות»
ופשוטה
בצי א נ ו ג ן
ני ראית
קולו נה(
הקולונה,
3
אחד
שונות:
וכדי.
המבוא(.
אם
אחד
כפי
במבנה
מהחלבונים
מסוג
קו לונ ה«
םפיחה
מהי רה
תוצרי
חלבונים
)חומרי
של
חומרי
של
אלה
הפרדת
אגרוז
)כםחואר
לא
מעין
מטען
אחד
בפרק
הת ר מ ו ד ר נ מ י י ם ,
האינטראקצ י ה
סוג
) Seph-Co (NH
ב לחי
עם
של
חומר
לה כ נ ת
לציי ן
ה פ ח מ י מ נ י ו ת,
חו שדים
תרומתן
)
אף
הפרדה
של
שבהם
בצ י א נו גן
מעורבות
גבוהה
אינטראקציות
תרכובות
אי נ ם
ב תנאים
השפעול
בעב ו דה
במקרים
המדידה
מתכונותי ו
כי
לנ ו שא
שתתקיים
להיות
אינטראקציה
אינטראקציות
א ו ל ט ר ה ם ט ר ו ק ט ו ר לי י ם
הידרוליזה
סופחים
כחו מ ר
לנו
המטען,
קשרי
לבצע
של
גישה
םו צ א
כי
בסעיף
מקרים
ניתן
אלה
הבא(
יכולה
כמה
לא
של
מעברי
ב סדרה
של
היחסית
פועלים
נו חוח
בהרחבה
הקולונה
ולהבטיח
שיטת
ס י ם ט מ טי ת
בצורה
ביותר.
שיטת
נראה
בכל
משת משים
מתאים
בכמה
הוא
כי
חומר
נדון
ה ה י ד ר ו פ ו ב י י ם״
כלשהוא
ביתרונותיה
זו
נמוך
חלבונים
הכוחות
אל
הידרופוביח
ההידרופוביות.
וכדומה־
הידרופוביוח,
כאשר
דרך
הממס
החלבון.
קולונה
התרומה
).(102-100
לוודאי
פני
אלקטרוםטטיות
קולונה
אל קט ר ו םטטי ו ת ,
אולם,
של
חלבון
החל
)בהן
מימן
לטפיחת
התרומה
על
האתרים
בעת
המימן־וכדומה
מתוארים
שעל
מעבר
של
את
בעיקר
במבנה
מאינטראקציות
מהיוצרותם
ולמסך
גליקול
לשינוי
בפולויות
ולא
כה.
מכאן
ברומיד
כריאק ציה
הידרופוביות
Tanford
וקשה
להראות
של מ ו ל ק ו ל ו ת
השונות
זאת
זו
98
-
זו מזו א ך ורק באור ר השרשרח הפ חמ ימנית" )(93
שבה נ ק ט נ ו והיא,כאמרו ,שי מ ו ש בסד ר ר ת ה ר מ ר ל ו ג י ו ת של הו מרי
גישה זו דומה לגישה
קולונה
ד
להגברה מ כוונת של אנ ם רא ק צ י ה י דועה ־
מאז פרסום השימו ש בסדרו ת ה ו מ ולוגיות של ו קל ו נ ו ת אלקיל אגרו ז ו ת
כמו כן
) , (74 ,73נעשו מספ ר עבודות נוס פ ות ברוח זו ) . (109-104
התפרסמו מספר עב ו דו ת נוספות שב הז מעורבים כו חו ת הידר ופוביים
חלבונים ). (114-110
עבודות אלה מעידות על כ ר שהתנהג ותם של פוספורילז
בהפרדת
ו ס י נ ס ת ז על קולונות אל ק י ל אגר ו ז ו ת אינה מקרה בודד.
השו ואת.ההתנהגות
של ק ו ל ו נו ת בסדרה מ
הוו ל ו ג י ת היא בעלת משמעוח אך ורק אם ניתן
להראות
שהקולונו ת דומות ככ ל האפשר ) ו רצו י שתהיינה ז הו ת( בכל תכונותיהן,
פרס לאור ך השרשרות ה פחמימני ו ״ ) ז הות במבנה או לטרהםטר ו קסוולי,
השרשרות ,במסען וכו <( .
זהו ת הקו לונות נבדקה בכמה שי טות )ראה פרק 5
בצפיפות
של התו צא ות( ונמצא כ י בתנאי ם ז ה ם של סינתזה ניתן לק בל צפיפות שרשרו ת
אחידה ,ח דירות זהה ו מטען זה ה ב ס ד רה של קו לו נ ות ה ו מ ו לו גי ו ת.
על תנאי סינתזה ,שב ה ם נ עשה השפעו ל בעודף .גדר ל של צ י א נוגן ברופיד
ההקפדה
וקישור האמי ן
קיבולת
השרשרות
של
בעודף גדול של אמי ז ,היא הקפדה חיונית־
הקולונות לטפיחה של כמוה מקםיםליח של חלבון תלויה בצפיפות
ההידרופוביות בחומר הקולונה.
!Seph-C
קואופרטיבית
תלויה במספר הקבוצות הפתיליות שבקולונה והתלות היא
במידת מה.
משיקולים תרמודינמיים ניתן להעלות על הדעה
כי חלבון גדול כפוםפורילז
מתיליות
6
5
-10
ספיחת פוספורילז jiלקולונה
a
יקשר לחומר הקולונה אם מספר קבוצות
תעבורנה מםדיום הידרופילי
להידרופובי.
,10כמתבקש מהיכולת לבודד אנזימים על
ורק אם על ידי
קבוע ספיחה בן,
קולונות,יכול להתקבל אך
הקישור קטנה האנרגיה החופשית ב -
7-6קילוקלוריות למול.
במדידות עבור מולקולות פשוטות ביותר ובתמיסה נמצא כי
בעוברה ממדיום הידרופילי
למול ).(96,93
שמספר
להידרופובי עשויה לתרום כדי
0.8קילוקלוריות
מכאן שאם התרומה ההידרופובית היא דומיננטית יתכן
קבוצות פתיליות קושרות מולקולה אחת של פוםפורילז
אח הירידה הדררשה באנרגיה החרפשית.
ניתן
קבוצת מתילן
להרארת
במקרה של פרםפורילז
קראופרטיביוח בקשירה בתנאי הניסוי שלנו.
נדי לספק
a
b
לא
99
ת ר ו מת ם של אפ ק ס י ם אלקטרוםטטיים ב ב ר ו םס ו ג רפ י ה הידרופובית
.2
חומרי
מטענים.
מטענים
אמין
הקולונה בהם השתמשנו
לכרומטוגרפיה הידרופובית מכילים
מטענים שליליים קיימים בכמות קטנה על אגווז.מנוקה
חיוביים מתקבלים לאחר שפעול של אגרו ז בציאנוגן
ראשוני ב -
ובאיזו
pH
אלקלי
טפיחתם
קבוצות אמפיפיליות כמו יונים אליפטיים,
לחלבונים תלויה בכוחות הידרופוביים יותר מאשר בכוחות
הנובעים
מהקבוצות הטעונות
לז וסינטתז על
נמצא שבסדרה
קולוםביים
ראיה לדעה זו נמצא בהשוואת
).(97,93
לספיחה על
S e p h - C n - N H S e p i i - C n
Seph-Cn-NH2
o
2
מתרחשת םפיחה רברםיבילית על קולונה בעלת
גדול יותר מאשר על הסדרה
בשתי
סוגם
מידה הם תורמים לקשירה?
הדעה הרווחת היא כי
n
ברומיד וקישור
מהי כמותם של המטענים,
).(31,30
).(103
Seph-C11
.
עבור פוםפורילז יש צורך
קבוצות מתילניות נוספות כדי לקבל םפיחה מלאה.
עבור םינסתז
יש צורך בשלוש קבוצות מחילן נוספות כדי לקבל םפיחה מלאה )ראה טבלה
מם' . ( 3
ההבדל בין שתי סדרות אלה הוא בנוכחותה של קבוצה אמיניח
בקצה השרשרות הפחמיפניות שהיא מיוננת ב p K -ניטרלי.
של קבוצה טעונה זו
הדרגתית,
מגלים האנזימים על הסדרה
התלויה בגודלו של
ב כ ר ר מם ו ג רפ י ה .
( T a n f o r d (93
,n
Seph-Cn-NH2
למרות נוכחותה
םפ י חה
כמצופה ממעורבותם של כוחות
מהיכן נובעים ההבדלים בין שתי
הסדרות?
כי שרשרת פחמימנית שבקצה שלה מטען
הידרופוביים
נראה לפי
חשמלי תעבור ממים
לממס הידרופובי אם הקצה הטעון יוכל להשאר במגע עם הסביבה המימית.
תהליך זה יצא לפועל כתוצאה מירידה באנרגיה החופשית של המערכת.
במקרה שלפנינו
מסים,
השרשרת הפחמימנית קבועה באחד מקצותיה לפרלימר בלתי
לפיכך הארכתה של השרשרת הפחםימנית תאפשר אינטראקציה הידרופובית
מספקת עם החלבון מצד אחד ואפשרות לשמור על הקבוצה האמינית הטעונה
בסביבה
מימית•
מאידך ניתן לתאר מקרים שבהם קיומה
י .
של קבוצה מיוננת בקצה השרשרת הפחמימנית מביא לדחיה אלקטרוםטסית עם
קבוצות טעונות חיובית המצויות בשכנותו של האתר ההידרופובי.
דיון
בתרומתן של אינטראקציות
דומות נידון גם ע"
יn(113,102
o
אלקטרוםטטיוח בקישור חלבונים לקולונות
Y
(
ו
. ( H o f s t e e(104-
100
-
-
במות המטענים המתקבלת בריאקציה הצימוד שבין ם פ ר ו ז ואמין ראשוני
תלויה בתוצרי הריאקציה־and Vretbl&d(30
תוצרי
הריאקציה ע" י
נגזרות
( A x e nאשר תקרו .את מהות
ספקםרוםקופיה באינפרה אדום מצביעים ע ל •ק י ו ם
איזואוראה )הטעונות
pHניטרלי( ,נגזרות אימידו
חיובית ב -
קרבו נס )שאינן טעונות או טעונות מעט שלילית( ו נגזרות
אשר אינם טעונים ב pH -
הכמות
ניטרלי )ראה סכימה בפרק המבוא(־
היחסית של כל אחד מהתוצרים־et al(31
גליציל-לאוצין
קרבאמאטים
לספדקס משופעל בציאנוגן
לא .נקבעה
( A x e nאשר דנו
בקשירת
ברומיד מציינים כי מרבית
הדיפפטיד נקשרת לספדקס בקשרים אשר אינם משנים את ה pK-של האמין
החופשי
בדיפפטיד,
התוצאות אינן
כלומר ,תוצרי
עקביות,
הריאקציה הם בעלי מטען
חיובי־
בםינתזות אחרות הם מדווחים כי חלק ניכר מהדיפפטיד
נקשר בקשרים אשר אינם ניתנים לטיטרציה וכמות ם יבולה להגי ע ל כדי 50$
מכמות הדיפפטיד־
מרבית תוצרי
Svensson
הריאקציה־
איזראלקטרי של החלברן
) מ צ א ) 116שנ ג ז רות איזראוראה מה
ו ו ת את
למסקנה זו היגי ע ע" י השוואת עקומו ת מיקו ד
םרבסיליזין לפני ואחרי ש נקשרו
אליו מ םפ ר ד י
קב יעה זו ,שהי א בעי קרה
וטרי םכדידים אשר שרפעלר בציאנרגן ברר מיד־
איכותית ,נעשתה תוך שימוש בחלבון הטרו גני ו ספק אם מערכת הנ ים ו י
בר ו מ ד
יכולה לשמש כמודל לשפעול פולימר רב-םו כרי ב לתי מסים בציאנו ג ן
Yost et al
מרבי ת
) צ י י נ ו )על סמך טיטרצי )117ו ת פום נ צ יומסריות( כ
התוצרים של הצימוד בין אמין אליפסי וס פרוז ה ם טעונים חיר בי ת
מציעים
וטוענים
«
הם
לכנות את הכרומטוגרפיה ההידרופ ובית בשם כרופטוגרפ י ה של דט ר ג
שיכולתן של הקולונות לבודד חל בונים תלויה "ביכול חו של החל ב
הנחקר להתארגן מחדש בקונפורמציה נטיבי ת לאח ר ה אלוציה מהקו לו נהי׳
0
למסקנה זו היגיעו על סמך איבוד הפעילו ת של הא נ זים לאוצין אמ
י נ ופ פ טי
בעת ספיחתו על קולונת טיראמין-אגרו ז .ת כ ו נו ת המפיחה של קו ל ונו ת
אלקיל א ג ר ו ז ו ת •־ יוחסו ,לפי עבודה זו ,ל נוכחו ת ז של קבוצות חי ו ביו ת
םיוננות על גבי הנושא הבלתי מסים.
על פי ה נחה זו ניתן ל צפ ו ת כי
קיבולת ה ק ו ל ו נ ה לטפיחה מקסימלית של חל בון חו מצ י תהיה תלו ה ב ע י קר
במספר הקבוצות הסעונות ;מטענים בעלי
pKבסי ס י
כבר במב ס ר אשו ן
נראה היה שמספר מסענים חיוביים גדול י
א נ ו מבטי ח םפיחת תל בי ז מ י רבי ת
כך למשל םופחת הקולונה ההידרופובית
י 30פ ו ספ ו ר יל ז b
Seph-Cפ
4
מאשר קולונת מחליף היונים
Sephadex A-50
, DEAEזאת כאשר מספר
-
ב -
) Seph-C^,בעלות pK
fvJ
101
-
)
נמוך פי 5מאשר
6.
9
מספר הקבוצות המיוננות כמחליף היונים )בעלות אותו
משמעותי זה לא ניתן היה להסביר רק על סמך הבדלי
הבדל
. ( pK
־
חדירות לפוםפורילז > h
חשוב ה מלאה יותר לגבי תלות יכולת הספיחה במספרן של הקבוצות
הבםיםיוח הםיוננות התקבלה ע"י השוואת שלושה חומריק ו ל ו נ ה
נמצא )כמתואר בטבלה מם' (2
bבין הקולונות תלויה בע יקר
השונים זה מזה בצפיפות השרשרות הבוטיליות.
כי הקיבול ח לםפיחה מקסימלית של פוםפורילז
בצפיפות ה קבוצות
העובדה שלא כל
ההידרופוביות ולא בצפיפות המטען .
האמ ין הנקי׳זרים אל הקבוצות המשופעלות בספרו ז נותנים
שיירי
^Seph-C
טעונים ,נ מצאת ב ו־.ת אפה עם המידע הקיים לגבי
תוצרים
הכימיה של ריאקציה הצימוד
יתר על כן ,נוכחותם של מטענים חי וביים בקולונות
)« (31-29
אינה תנאי מספיק
ההידרופובי ו ח
בתנאים שבהם הם טעונים
לםפיחחם של חלבונים אפילו
Shaltiel etal
שלי ראיה לכך מצאו
במטען לי״
על סדרת הקולונות ההופולוגי ת
Salmonella typhinaurium
החלבון Jמ -
) ג י ( למרוח שחלבון זה הוא בעל= pH1-12איזואלקטרי של
Seph-Cn-NH
) ב ה ע ד ר הםפיחה של )106
2
.5.5
פן
יכולה
המפיחה של הקולונות
תורם
התוצאות הנ״ל נראה לנו כי לפטען יש חשיבות פשניח בקביעה
ההידרופוביות ,ושלפחוח בחלק מן
הפקדים אינו
חרומה חיובית ישירה לקישור.
עם זאת ראוי
מטענים בעלי
pK
להזכיר כי
בסיסי
חומרי
שמקורם בחלק מחוצרי
מטענים אלה תלויה לא מעט בתנאי
של קולונות שהוכנו
החבויות
אך בסדרה הומולוגית
n
להסביר מדוע
אטומי פחמן ואינו נספח לקולונות בעלות
קצרות יותר ,אלא אם כן ,נייחס את יכולת הקישור לאורכה של
הפחמימנית עצמה.
כדטרגנטים
יכולתן
הסינתזה של הקולונה.
בסדרה הומולוגית כזו לא ניתן
חלבון נספח אל קולונה בעלה
השרשרח
ריאקציה השפעול.
כמות
בתנאים זהים ובבת אחת מכפות גדולה של ספרוז משופעל,
כמות המטען נמצאה זהה.
שרשרות
הקולונה אשר הוכנו על ידינו
מכילים
נטענה הטענה )(117
שהקולונות פועלות
בלתי פםיםים אשר אורך השרשרח הפחמימניח שלהם קובע אח
להרופ אח הפבנה הנטיבי של החלבון וע״י
בתוכו.
טענה זו
מפתייעח,
באפור,
כך
לחשוף קבוצות טעונות
באיבוד הפעילוח של האנזים
י
לאוצין
102
-
-
אמינו
פ פ ט י ד ז בשעה שהוא מועבר על ק ולונת סיראמי ן-א גרוז־
רב של חלבונים נ ו קו עד כה בשיטה זו
)(108
מספר
חלק מהם הם ח לבונים
0
רגישים לדנסו רציה אירברסיבילית ויחד עם ז את ניתן היה לבו דדם כשהם
פעילות םפצ י פ ית גבוהה־
בעלי
לפיכך ,קשה להניח שסענה ז ו תופשת בכל
המקרים.
יתר על כ ן ,נמצא שאנזימים שונים שומרים על פעיל ותם הקטליםית
בהיותם ספ וחי ם על הקולונות ההידרופדביות ) ( 1 0 7ואף קי י מת הצעה להשתמש
באנזימים הספ וחים על קולונות הידרופוביות כבאנזיםים בלתי
).(118
להיגרם
נראה לנו שאובדן
מסיסים
י ד ז עלול הלה
הפעילות של לאוצ ין אמינופפט
בגלל סיבה אחרת ,כמו
למשל,
איבוד יוני
מתכת ח יוני ים בזמן
הכרומטוגרפיה ,או בשל תנאי אלוציה לא מספ יק עדינים־
ראוי גם לציין כי יוני ם אורגנים אליפטיי ם צריך שימצאו בריכו ז
גבוה מספ י ק כדי שיהוו 'דטרגנ טים־
בהיותם בריכ וזים נמוכים ,לא זו
בלבד שא י נ ם הורסים אח פבנה החלבון ,אלא שלפעמ ים אף פייצבים חלבוני ם
כר לפשל הראו
)(97־
al
ot
Shatsky
לא רק שא י נו עובר דנטורציה ע" י
)
כ ) 119י גליקוגן
פוםפורילז
'0
קישור קבר צרתי פחםימניות ,אלא שהוא
מיוצב ועמ יד יוחד בפני דנטו רציה טרפית בנוכחו ת אלדה ידים אליפטיים
בעלי אורך שרשרח של 4פחמני ם־
יתכן
ההידרופוב ית כפי שה רצעה על ידינו
שיתרונות יה של
הכרומטוגרפיה
נובעים פכך שהיא מבוצעת ע" י ריכו ז
נמוך למדי של שרשרות פחמימנ יוה ה״שתולות" בנו שא הידרופילי לפדי.
ראיה
נמצאת לפי
למעורבותם של אפקטים אלקטדוםטסיים
al (112
( P o r a t hגם בתנאי
et
בכרדמטוגרפיה הידרופובית
האלוציה של החלבונים פהקולונו
הם ממליצים להשתמש בריכוזי מלח גבוהים כדי לחזק את
ההידרופוביח
שבין
שבהם משתמשים
ואולי
al
החלבון לבין
et
Porath
חומר הקולונה.
כפי שפוצע בעבודה של
לבידוד
Porath
נראה כי
סריפםין,
חשמלי
לחלוטין
אגלוטינין או
החשיפה ל
1-3ME C
,
,במשך השעות הארוכוח הדרושות
כמותי של אנזים אינה חשיפה רצויה־
חומר קולונה חסר פסען
כמעכבי
al
ריכוזי המלח הגבוהים
עלולים להביא לשינויי מבנה ניכרים
לדנטורציה של אנזימים רגישים.
et
האינטראקציה
al
et
Porath
הפכי נ ים
מצליחים לבודד חלבונים קטנים
ציטוכרום C
,
המסוגלים לעמוד בחנאים
103
דרסס
י י ם אלה.
-
בסביבת התלבון ,כמו הו ספת מלחי ם
נראה כי כל שינוי
או כהלים ,יכו ל להביא לשינויי
לש ו ת את פני
קונפורמציה בחלבונים ,נ
שטתם ,ו ע״ י כך את גודלם ופיזורם של אתרים הידרופוביים.
לאתרו נ ה
ראי ה O'carra et al
)
כ
הידרפ י ל י ו ת
ו
קשירת שרשר )120ו ת
י
דיר אמין :מרמי נ לי לספרוז משופעל בציאנוגן
ה ב ל ת י ספציפית בכרומטוגרפיה של
כי ק יום מטעני ם חיוביים על גבי
זיקה...
ברומיד מבטלת את הספי תה
ממצא זה אף הו א תומך בהצעה
הםפרוז אינו
מבטיח,כשלעצמו ,ספי ח ה
יוני ת של חלבו ני ם .
לאור ת ו צ אות אלה הועלתה האפשרות ) (124,108שמחליפ י היוני ם
המק ו בלים,
ר
המכ לים שרשרות פחמימניות מסועפות )קבוצות די את י ל אמי נ ו
את י ל( ,מקיימי ם אינטראקציות
ה ת לב ונים הנםפ ת ים עליהם.
מעורבות,
ויונ ו ת ,עם
י
הידרופוביות
מחליפי יונים אלה מהווים אולי ת ל ק מ סדרה
הומו לוגית של קולונוח אשר טרם נחקרו
להסבי ר כמה תו פ עות שבהן נספחים חלבונים אל מחליפי יוני ם גם כאשר
באופן
ה pH -
.3
האיזואלקטרי של החלבון אינו
אפקטים הידרופוביים
מתאים ).(123
בכרומטוגרפיה של זיקה
בחלקה הראשון של עבודה זו עסקנו
לםטבוליזם של הגליקוגן
סיסטמתי.
ה צעד ,זו יכולה
בבידוד חלבונים הקשורים
בשיטת הכדומטוגרפיה של זיקה.
לשיטת בידוד
זו ,המבוססת על תכונותיהם הביוםפציפיות של החלבונים ,יתרונות על
פני שיטות בידוד אתרות המבוססות על הבדלים בתכונותיהם הב י ו פ י ז י ק ל י ו ת.
השיטה זכתה לשימוש נרחב החל מאמצע שנות השישים עם פיתוחם של חומרי
קולונה מעולים ) (92 ,22ו ש י ט ו ת כימיות נוחות לשפעול וקשירה ).(28-26
et al (40
( C u a t r e c a s a sנסחו
עקרונות לביצוע כרומסוגרפיה של זיקה
מוצלחת.
חומר הקולונה תייב לגלות אינטראקציה מעסה ככל האפשר עם
החלבונים
העוברים בקולונה לפני ואחרי ציפורה של הקבוצה המעורבת
ב כ ר ו מט ו ג רפ י ה .
לאינטראקציה
עקרון נוסף הוא שקבוצות האינהיביטור החיוניוח
הספציפית תייבות להימצא הרתק מהמטריצה המוצקה כדי
104
להקטין את ההפרעה הםסרית בתהליך הקישור
חלבון-ליגנד.
) (43-42ו ( C u a t r e c a s a s and Anfinsen (41 -הרחיבו
Cuatrecasas
עקרונות אלה.
וטענו כי הם מתקיימים כאשר קושרים ליגנד לאגדו ז דרך גשר .של.שרשרת •
אליפטית.
לקישור הליגנד השתמשו
כאמינים אליפטיים ארתם קשרו .לאגדו ז
משופעל ולאחר מכן קשרו את הליגנד לקצה השני של השרשרת האליפטית
ו
דרך קבוצה פונקציונלית נוטפת ,בדרך כלל אמין או
קרבוקסיל.
של השיטה החדשה הודגמה בבידוד כיפוטריפסין ,ק רב ו ק פ יפפט י ד ז
מחלבון
יעילותה
Aואוידין
ביצה ) (41והביאה לבידודם של חלבונים רבים אחרים.
בקולונוח ה ג ל י ק ו ג ן-ס פ ר ו ז שהוכנו על ידינו נקשר הגליקוגן לספרו ז
דרך ״גשר״ של אוקטה מתילן די אמין.
לשרשרות
האליפסיוח המחברוח בין הליגנד לבין
מגשרתא י נ רם י ח.
כאשר נוחרוח
לה ק נ ו ח לחוטר ה ק ולונהתכרנרח
לא ג ר ו ז .
נמצא ,כי אין
להתייחם
חומר הקולונה כאל חרכובח
שרשרוח פחמימניוח
חופשיות הן מסוגלו ת
םפיחה לחלברנים אשר!!׳ לזר לזו וי כ ן ,לא־ היו נ קשר י
ו
אפקטים
הידרפ ו ב י .י ם אלה עלרלים להירח מעררבים בחלק מה מ קרים
הקולונה דרך גשר אל י פ ט י-ה י ד ר ו פ ו ב י
שבהם נ קשר הליגנ ד אל
ארוך •
השיפור אשר חל ב קשירת החלבון אל חופו הקולונה יוחס לאפקטים סטרי ים.
א ו פ י י ני ת היא עב ודתםשל
Streers et al
בעבודה זו אפשר ליחסן לאפקטים
) ־
החופעוח המחןא) 44רוח
הידרופוביים שאינם בהכרח קשורים ב אתר
הפעילו ת הקטליטי ח של החלברן.
ראוי לצייןכי יעילותם של חדפר י קי לונה
הי דרו פ וביים,כאל ה שחו ארד לעיל ,דרפה לזד של קרלרנרת הפרעלרח
בכרו ו
פט ג רפ י ה של זיקה ).(124
ה ב עיות
הנ"ל הביא ו את
Yost and Yaron
אפ י נ ו פפטי ד ז אל ספרו ז דרך
ה י דר ו פ
י ל י שאינו גורם לספיחה
-DLפוליאלנין ) ,(121בו הם רוא ים גשר
הידרופובית.
ה ״ ג ש ר ״ )כ 80 -שיירי אלאנין( לא פצאו
לחומרק ו ל ו נ ה .
ה
לא צ י ן
לקשור פעכב של ו
לפרות אורכו הרב של
קישור משמעוחי של האנ זים
הם פ סיקים פכך שהבעיה המרכזיח בשיטת הכרומטו ג דפי ה
של זיק ה ,היא ב עי ח הא ורינטציה שבין הליגנד הקשור לבין החלבו ז
המסים אשר צריך להגיע לאינטראקציה פורה עפו.
ראוי לציין כי עבודות
רבוח שנעשו
בשטח זה א
ינן לוקות באפקטים בלחי ספ צ י פ י י ם .אל ה .
י
-
המסקנה
-
105
העיקרית הנובעת מעבודה זו לגבי הברו ממוגרפיה של ז י קה
יצו ת ה נ ו ב עוח מעצ ם
היא בי יש לשקול ולאמוד את תרומתן של האינםראק
הה כ נה הכימית של חומר הקולונה״
רצוי להמנע מנ
כוח ו וז ן של שרשרו• n
פחם ימניות "עודפות" העלולות לקשור חלבונים במנ נון אשר אינו כ רוך
בהי כרות שבין האתר הפעיל של החלבון לבין הליגנ ד הב י וםפצ יפי.
כן רצוי )ככל שניתן( שגם תנאי
4־
שימושים מעשיים
האלוציה יהיו ביו
כמו
ספציפיים •
בכרומטוגרפיה הידרופובית
הה כ דלים הקיימים בין
ההידרופוב י ם ב ח לבוני ם שונים מ ק ני ם
י
האתרים
לקולו נ ו ת ההידרופוביות כושר הבחנה ניכר וי בולת ל הפריד ב ין חלבו נ ים .
קי ו נ ו ח
נ י ת ז ל ב ודד חלבונים מרקמות ע"י העברת מיצו י רקמו ת על ל
היד רו פו ביות מתאימות )מבחינת אורך השרשרח האל י י
פטת ( וע IIי התאמת
ה ת נא י ם
שבהם
מתבצעת ה כ ר ו מט ו ג רפ י ה־
תהליך זה ת ו א ר בעב ודה עבור
םינטתז משריר ארנבת ו מכ ד ור יו ת דם
גלי קו גן פוםפורילז וגליקוגן
הידרפ ו ב י ת
ו
הפרדה בין מולקולות חלבון הנספחו ת לאות ה קולו נ ה
אדו מות 0
אפשרית גם בשלב האלוציה.
ע"י העברת בופרי ם המשפ יעים ב א ופן ספצ י פ י
על הקו נ פורמציה של חלבון מבוקש ניתן להביא ל א ל ר צ יה ספצ י פית שלו
כופרים אלה ידועים בשם דפורמרי ם ) (56והם ג ו רמים ע IIי
מה ק ולו נ ה־
א י נט רא ק ציה ספציפית לדנטורציה לוקאלית ורב
רס י ב י לי ת של ה חלבון־
דיו ן מ ק יף על שימוש ביונים ספציפיים לאלוציה מהוקל ו נ ו ת פורסם
לאחרו נ ה ).(122
נופו הדפורמציה הופעל על ידינו
גלי קו ג 7פוםפורילז
ושל של ב האלוציה מביאים לניקוי
מקולונה של
Seph-C4
־
בשלב ה לא ו צ י ה של
הםפצ י פיות של שלב ה ספי הה
האנזים עלה ק ו ל ו נ ה כדי פ י 100
ו לפ עילו ת ספציפית גבוהה של החלבון המבודד.
האלו ציה שלג ל י ק ו גן
Ssph-C -NHפחות ספציפי וד שהרי היא מבו צ עת ע IIי
ם י נטת מז ה ק ו ל ו נ ה
2
העל את ר יכוז
של ה א נ ז ים
4
המלח נתרן כלורי.
יחד עם זאח ניתן
ע"י שימוש בגרדיאנט של מלח.
דרגת ניקוי גבוהה של אנזים אשר נספח באופן
בעלה
n
להביא ל ניקוי נ יכ ר
אטומי פחמן,
אפשרית ע" י העברתו
רברסיבילי על ק ולונה
המוקדמת על קולונה בעלת -1ב1
-
אסופי פחמן־
-
106
כך למשל העברנו גליקוגן
.
םינסתז משריר על קולונה
תחילה וחלק מהחלבונים
נספחו על ק ו לוי נ ה,,ז ו הועברו על
גליקוגן ם י נ ס ת ז ־
נ ס פ ח ו ה ח ל ב ו נ י ם אשר לא
NH־Seph-C4
2
ובחובם גםהאנזים•...
מ ק ו ל ו נ ה ז ו היה בעל
האנזים שנספח והועבר אלוציה
דרגת ניקוי גבוהה יותר מאשר אנזים שהועבר ישירות על הקולונה
NH־ Seph-C־
עקרון זה נוצל גם בניקוי גליקוגן
2
דם אדומות ע" י ניקוי דו
שלבי על
2
Seph-C -NH
2
השימוש בקולונות הידרופוביוח לסילוק
המבוקש,
הודגם גם בבידודו של החלבון
י
םינםתז מכדוריות4
-
2
.
Seph-C -NH
4
חלבונים אחרים ,פרט לאנזים
j
) ( 1 0 6שנוקה פי 1 0 - 7ע״י העברת תמציח
מ
-
typhimurium
Salmonella
חיידקים על קולונה של
«
2
שרובם בעלי אחרים
סגולותיה של
לעיל,
-NH
הידרופוביים רהנםפחים אל חומר הקולונה.
הכרומטוגרפיה ההידרופובית בבידוד חלב ו נ י ם,כמח ו אר
תלויות במידה רבה ביכולתנו
לברור את הקולונה המתאימה
לכרומסוגרפיה ולקבוע תנאים אופטימליים לםפיחתם של האנזימים ולאלוציה
שלהם.
מספר האפשרויות הרב מחייב לפתה דרך מהירה ופשוטה למציאת
קולונה מתאימה ותנאי
כרופטוגרפיה.
שיטה זו פוחחה ע" י
Shaltiel
) , ( 1 0 8 - 1 0 7אך בשל החשיבות הרבה לכרומטוגרפיה הידרופובית ,נתאר
אותה גם כאן.
( .
הוצע על ידו לבנות מערכה אנליטית של קולונות קטנות
ס ״ פ 5ל מ ע ר כ ת הקולונות יוכנסו
וםולוגיים )למשל,
הכוללוח
מדרה של חומרי
, = 1 - 1 0Seph-Cn(nוכן שחי
קולונות ביקורת
ספרוז בלחי מטופל וספרוז אשר שופעל בציאנוגן
עם אמוניה.
קולונה
ברוםיד והוגב
הקו לו נ ות נשטפות בחנאים זהים ונפחים קטנים המכילים
את תערובח החלבונים מועברים עליהם )עד 2 0 0מיקרוליטר(.
נשטפוח
הפעילות
הקולונות
בנפח קטן וקבוע וכמות האנזים נקבעח בשיטה אנזימחית.
אחוז
הנשטפח מתוך כלל הפעילוח המושמת על הקולונה משורטט!.
כפונקציה של
n
)מספר אטומי הפתמן
בשרשרת האליפטית הקשורה לקולונה(.
בדרך כלל מתקבלים גרפים הדומים לגרפי
טיטרציה.
הקולונה בעלת
n
קטן ביותר המסוגלת לקשור את מרבית הפעילות האנזימתית היא קולונה
המתאימה
לקישור רברסיבילי.
כשלב שני של הסריקה ניתן לבנות מערכות
-
107
של קולונות קטנוח הבנויות מאוחו
בהדרגה את תנאי
חומר קולונה שנבחר וניחן לשנות
הכרופםוגרפיה לקבלח ספיחה ו א ל ו צ י ה
מלאים..בשיטה
זו ניתן לקבל במהירות ובנוחות יחסיים את התנאים הכרו מטו גרפ י י ס.
בכל החלבונים אשר עסקנו
במערכת
בעבודה זו ניתן היה להשליך מתוצאות המתקבלות
קולונות זעירות אלה לגבי
פרפרטיביוח.
התנהגותם של האנזימים על קו לו נ ות
הגדלת נפח הקולונה פי 50ויותר אינה מהווה בדרך כלל
קושי־
בעבודה זו
בין פוםפורילז
מתוארת יכולתן של הקולונות ההידרופוביוח להבחין
a.ו -
b
למרוח ששח י צורות אנזים אלה מכילות ארתו
רצף של חומצות אמינו )פרט לסרין אחד בכל פרוטומר של 100,000העובר
פוספורילציה
בספרות
בהפיכה של פוםפורילז
b
(־
ל a. -
מצביעות על כך שקיימים הבדלים קו נ פ ו רםצי ו נ י י ם בין שתי הצורות
של האנזים).(57
הבדלים ניכרים־
הידרופוביות
אפיניות
בכרומםוגרפיה הידרופובית מתגלים בין
נראה כי
לפוספורילז
מאשר לפוספורילז
גבוהה יותר.
b
a
זיקה גבוהה יותר לקולונות
והאתרים ההידרופוביים הם בעלי
( B i r k e t tעבור ״ probe״ פלואורטנסי
הקשור• לפוספודילז בעת מעבר האנזים מצורה
b
תלותם של האתרים ההידרופוביים שעל פני
לצורה
. £
האנזימים בשינוי
באה לידי ביטוי גם בניסוי המתואר בתמונה מם'
עבור
האנזימים
תוצאה זו נמצאת בהתאמה עם המדידות הפלואורי-
מטריות שבוצעו ע" יet al(.75
.20
קונפודמציה
השתנות היחס Syn/Con
האנזימים פוספורילז וםינטתז מרמזת על קיומם של היברידים בין
צורות אשר לא עברו
תואר ע" יet al(63,62
ע"י
כמה וכמה עדויות
פוספורילציה מלאה.
( H u r dעל סמך מדידות פיזיקליות וכימיות.
שימוש בקולונות
)לפחות
הידרופוביות מתאימות ניחן יהיה אולי לבודד
חלקית( את ההיברידים או
בקולונות
קיומם של היברידים בפוםפורילז
לחקור את הכמות היחסית שלהם.
הידרופוביות יאפשר אולי
לחקור שינויי מבנה באנזימים
א י נ ט ד ק ו נ ב רם י ב י ל י י ם כמודגם בעבודה זו.
לסיכום ניחן לאמור כי לקולונות הידרופוביות פוטנציאל רב
בבידוד חלבונים ובמחקר שינויי קונפורמציה החלים בהם־
השימוש
108
-
ס
.1
ספרוז-גליקוגן:
הקלםיות
לבי דוד
חלבונים,
שיטה
נ ו ספת
התפתחה
הבדלי
שזיקתם
בשם
בשנים
גליקוגן
לספרו ז
גל י ק ו ג ן
) ,(28-27ה ק ב
א ל ק י ל ס פ ר ו ז ) ,(43
בשיטה
קולונה
חומר
פוספט
שריר
תומר
זה
קשר
שינויי
מבנה
ניטרלי
ע"י
רברםיבילי
ה עברת
אח
םגולוחיו
של
קולונח
ספרו ז
אמין.
הקולו נ ה
הפוספורילז.
לקולונה
הוא
כי
אם
אוקטה
לקולונה
תומר
גליקוגן
בכלל.
מח י ל ן
די
אמין
או
כמטבוליטים
הביא
נמצא
די
שהכילה
אותנו
שקו ל ו נ ה
בקדחיים
גם
המכילה
היה
זו
בסמוך
ל
היה
ציטרט,
אי נ ו
דומה
בספק
-
אפינו
היבש.
גליצראלדהיד
פוםפורילז
5.8
לניתוק
המסוגל
של
כפות
, pH
ממיצוי
שבו
מהקולונה
לעוות
אמינו
חל ים
ב
pH -
באופן
אחד
פתילן
די
ספחה
את
נקבע
שבהם
פוםפורילז
םפרוז,
מהחומרים
לא
ביקורה
כאשר
במידת
חריגה
םונתזה
ב טס ר ה
בקישור
פוספורילז
היחה
אתר
גליקוגן
ניסויי
אלקיל
זו
אמין
של
חפקיד
תופעה
האנזים.
זהה
של
במקרה
דיי
פשני
לבודד
לאף
כאשר
מתילן
לשורה
מםוגלת
ג ל י ק ו ג ן -ספרו ז.
של
בכ
ברומי ד
ברומיד.
פפשקלו
10$
סינטחז.
לקבלת
בציאנוגן
החלטנ ו
אנזימים
ציאנוגן
אמין
מסוגל
אוקטה
לגל י ק ו ג ן
אמי ן ,
לםפרוז
עם
לבודד
הועמדו
הוחלף
למרו ח
שלפנינ ו
שיטה
וגליקוגן
די
-
זו
(
). (56
שבה
זה
מתילן
ניתן
מולקולרי.
לבודד
שופעל
פשופעל
א •י מ ד ז ו׳ ל
ה ק ו ל ו נה
החדשה,
במ קרה
הקשו ר
בא נ ז י ם .
האנזים
האנ ז ים
מ י מצ א
המלאה
נ יתק
מק ו ,ל ו נ ה
נופו
מבנה
כמו
םפצ י פי
ספרוז
מתסיסה
כן
זה
של
פוםפורילז
גליקוגן
פו ם פ ו ר י ל ז
)גאפ ״ד(.
פוםפורילז
קולונה
גליקוגן
מסיסות
affinity chromatography
כדי
אוקטה
שהכיל
הבדלים
הבדלי
במשקל
לאור
הבאה.
עם
על
הצלחתה
גליקוגן
הוגבו
קו ל ו נ ה
דרםםיים
בחומר
הו גב
אלי ו
דה י ד ר ו ג נ ז
ארנבח.
בבירור
שא י ת ו
של
או
בעיקר
זיקה )
).(46-35
ב דרך
הפעילו ת
של
מטען
דה י י נ ו ,
לספרו ז
וצות
זו
הבדלי
ו ל השח מש
זיקה?
מבוססות
כרומטוגךפיה
גדולה,
התק בל
חלבונים
האחר ו נ ו ח
לגליקוגן
קשרנו
כרומטוגרפיה
יציב וח ,
הידועה
מאוד
לקשור
3
כ ו
האומנם
השיטות
בין
י
ם
האפין
הצלחה
מאחר
הידועים
זהה
שאוקטה
מתי לז
כםובטטרטים
-
תלות
.2
ההפרדה
כושר
כרומטוגרפיה
לעמוד
כדי
שתי
סונתזו
על
סדרות
הוגב
והסדרה
פשופעל.
הקולונות
גאפ״ד
יוצא
אינו
מעוכב
על
על
איםידזול
דפורמר
)0.2
מולר
חומצה
שהתנהגות
עולה
חוזק
סינטחז
הקשירה
כבר ל -
י
במצב
אליפטית
פוםפורילז
נספח
פחםנים )
) , pH
2
המעכבות
את
בסדרה
רק
או
זו
6
הרכב
ניחן
קושרות
כה
להרס
חזק
יוני
היה
אח
עד
וכוי(,
פעילותו
האנזים
של
כי
ניתן
עם
הדבר
האנזים.
נתון
החלבון.
שריר
לא
אחרים
כדי
לנתקו
בידינו
שונה
דררשה
כל
אחד
דרושות
םינטתז
בוצעו
להרציאו
כי
לםפוח
היו
עם
טינטתז
Seph-Cn
אליפטיות
ה י ח י ד אשר
על
נקשר
עלה
כדי
הנ״ל
ארנבת
גליקוגן
כלורי.
גליקוגן
שאינן
נראה
של
חנאים
חלבונים
בסדרה
שרשרות
מהן,
הפעלת
מיצוי
Seph-Cn-NH
רברםיבילי
לניתוק
לאחר
לקולונות.
פקולונות
באופן
כה
רבה
שאף
נמצא
הניסויים
הקשרררת
מהקולונה
ע" י
Seph-Cn
2
b
ונספח
Seph-C
2
לםפיחת
לקולונה
לעבור
שלא
בסדרת
פחמנים
הפחמיםנידת
של
שלנו
3
עבור
.
2
למשל
יודגש
.( Seph-C -NH
אלו
האנזים
המביאים
בנות
השרשרוח
"זרועות"
כך
ארבעה
טמפרטורה,
אורך
יותר
שהוזכרו.
אליפטיות
בפלח
הועברו
הדפורמר
של
האליפטיח.
ו ה ל א ה Seph-Cn-NH.בסדרה
מאשר
מאוד
עם
פוםפורילז
לדנםורציה
נ מ צ א שגם
בסדרה
הניסוי
על
הועבר
רב
לאלוציה
ת
ארוכה
האנזימים
דופן
ומספר
ר
נ ס י ב י מ-Seph-C
שרשרות
היה
ו
המביאים
יוצאת
גם
רק
פחמן
וגאפ״ד
קשירה.
מהקולונה
השרשרת
וניחן
בתנאי
לניתוק
משופעלn
אטומי
Seph-Cgב ע ו צ מ ה
הקולונות.
התארכות
3
שרשרת
משני
אינה
של
ניתן
ניתק
םינסחז
!Seph-C
,
גז
מעוכב
הסדרה
םפרוז
פוםפורילז
או
הוא
לקולונות
מ ם ' ^. (1
עם
בעל
כי
עיכוב
לקולונה
אצטיח(,
זו
ההומולוגיות
=.(6-1
נמצא
ללא
)
אליפטי
אנזימים
Seph-C
והוא
גליקוגן
אמין
האנזים
נספח
חומצי
עם
2
אטומי
טבלה
פחמן
נקיים
אלו
.(8
אינו
הסדרות
)
האנזים
פוספורילז,
מ
ו -
מסי
די
שני
מקולונות
!Seph-C
לוודא
לספרוז
פוספורילז
םפרוז
בעל
הוגב
של
מוציאו
כדי
שתי
שבה
אחת
של
בקישור
נגזרות
אליפטי
Seph-Cn
גיפוס,
דרסטיים
המכיל
אמין
)וזמונה
^Seph-C
הכוחות
תערובות
מכל
האליפטיות
הפועלים
הומולוגיוח
Seph-Cn-NH2
על
באורך
טיב
11Seph-C
סדרת
השרשרות
הקשורות
-
הידרופובית
שבה
ספרוז
109
ואילו
בנות
ששה
בחנאים
זהים
בניסויים
הגדלת
אורכן
אלה
של
סופחות,דרך קו לו נ ו ח
ועד
אלא,
שהכוחות
לקולרנרת
בתנאים
הפועלים
כה
הקושרות
קיצוניים
בקולונות
אלו
110
-
כוחות
הם
כיסים
הידרופוביים,
הידרופוביים
בין
הזרועות
באנזים־
היתרון
הוא
שניתן
להגביר
באופן
ע"י
שימוש
בשרשרת
אליפטית
הקולונה
הצענו
המונות
האופטימלי
לסוג
לקרוא
שי םושים
ב ם סגרת
של
כרומםוגרפיה
עבודה
מחקר זו
לבידודם
1 0 0ממיצרי
שריר
של
נבדקה
ארנבת
ע"י
לאנזים המנוקה
נקי
המבודד
בשיטות
באנ זים
ל אנזים
גליקוגן
םינטתז
האנזים מ ש ר י ר
מח קב ל ה א נ ז י ם
בפעילות
םפציפיח
של
י עילות
מכדר רי ות
ו י כ ו ל הו
של
כדו ריות
אגירת
על
קולונזז
ההפרדה
a
פוםפורילז
הפולקולרי
,100,000
י b -
תוצאות
ואחווה
אלה
ע" י
)9ד(•
העברתה
העובר
לפרות
לעיל
אי
כן
מבוססת
לעו מת
שי ס ת נ י קו י
פותתה
.
ביטוי
על מ י צו י
ל א ח ר ה קולו נ ה
ובניצולת
סופי ח
של
ההידרופובית
,
פרט
לסדין
בעת
ניתן
צורות
להפריד
Seph-C
.
העב רת
המ ול י ז אס
ה וומג נ י ו ת
פוםפור י ל ז ום י נ סת ז
הרדגם
מטברלירת
אחד
מעבר
ר ק ב חו לי ם
נ י כ ר ת של
בדרגה
זה
קטנ ה בי ו ח ר
ביטוי
6 2 0ע״י
השונות
שתי
אנז ים
בכמוח
לידי
נ ו ק ה פי
הצורות
2
בבידוד
האנזים
והתקבל
פוםפורילציה
!Seph-C
ל-
מצוי
האנזים
b
מ"ג
חלברן,
מ"ג
in vivoבאה
האמינר,
האפור
כמו
של
*Seph-C
השיטה
לידי
אלה
בהפרדת
פ ו ם פ ו ר י ל ז נו קה
40־
הכרומטוגרפיה
חומצות
על
באה
הכרופטוגרפיה
Seph-C^-NH
4NH2־Seph-C
של
קרלונה
4יחידות
מ ח נ ק ה פי
פפוספורילז
ברצף
)הטטרפר(.
של
על
2
חלבונים
גליקוגן
ארנבת.
גליקוגן
של
הגבוה
שוות
ל
הסדרה
הידרופוביח" )ראה
לנצל אח
)6ל(»
של
בתאים
הידרופובית
בהפרדה פ ר ם פ ר ר י ל ז
a, -
על
68י ת י ד ו ת ל -
של
סינטחז
מאדם־
גליקוגן
כר ו מ ס ו ג ר פ י ה
כושר
הוא
ס י נ ת ז ה של
העברחר
קולונה
לניקוי
אדומות
לבצע
של
הקולונה
השיטה
דם
מחל ות
.4
סמך
ולמחקר
האנזים
משריר
והעברתו
5 0 $כאשר
האפשרות
קלפיות
על
על
לבידוד
חלבונים־
פעילות
חדשה
זה
נתון־
כך
בתוך
כאלו
ל ה ב י א .ל ב ח י ר ת .חומר.-
"כרומטוגרפיה
הידרופוביוח
ספציפית
80
חלבון
הוםולוגיות
ההידרופובית
א ר ו כ ה יותר ,ו ע" י
לבידודו
בקולונות
ההי דרר פ ו נ י ת
פי
הדרגתי
התרומה
בסדרות
לספרו ז
2 ( i i״
»i
3־
את
הפחמיםניות
בשימוש
הקשורות
לבין
בכל
אלה
פרוםומר
פוספורילז
תערובת
בעבודה ז ו
של
פוספורילז
של
שמשקלו
) bהדיפו(
פוספורילז81
a.
מגלה
- Ill
וםפורילז bלכל אחת מסדרת הקולונות
ניתן
4-1
לספוח את ש ת י י צ ו ר ו ת האנזים על
b
פוםפורילז
הקולונה
= ( S e p h - C n(11־
^Seph-C
תחילה ואחריו של פוםפורילז , a
ולהביא לאלוציה של
ע"י הפעלת תנאים מ ת א י ם ל ם .
ההידרופובית מתאימה לא רק להפרדה בין פוספורילז 2.י ־־
היא מסוגלת להבחין גם בהיברידים שלהם המושרים במיצוי שריר־
מיצוי
אלה,
שריר כזה על קולונה של
!Seph-C
— י
העברת
מביא להפרדה חלקית של היכר י.דים
הבאה לידי ביטוי בירידה הדרגתית של יחם הפעילות ב נ ו כהות-,,ו כהעדר
)יורד מ 6 -ל ,(1 -
AMP
עבור גליקוגן
הפעילות
באותה קולונה קיימת עליה הדרגתית של יחס.
םינטתז בנוכחות .ובקעדו גלוקוז-6-פוםפט,>,יתופעה
ז .ו מ ר מ ז ת! :על קיום היברידים גם ה באנזים זה־
שיטת הבידוד הנותה של גליקוגן םינסתז שפוחחה בעבודה זו
בתקר שלמותה של המערכת הרגולטורית למטבוליזם הגליקוגן
גליקוגן
אדומות־
)(B
-6פוספט
של האנזים
ההמוליזה
ונשאלה השאלה אם אין צורה זו
מתקבלת כתוצאה מפוםפורילציה
ע"י סינטתז קינאז בתהליך ההמוליזה״
כדי לברר בעיה זו בוצעה
בנוכחוח אדנוזין טרי פוספט מסומן בזרחן 32בעמדה Y־
נמצא
הרדיואקטיבי בזרתן 32אינו מלווה את הפעילות
האנזימתית או את תת היחידה בעלת משקל מולקולרי מתאים.
אחראי
בכדוריות דם
םינטחז קיים בהמוליזאט בצורה מזורחנת הדורשת גלו קו ז-
שבתהליך הניקוי הסימון
הנמצאת
סייעה
תוצאה זו,
בהתאמה עם עבודות קודמות) (79מרמזת על כך ששלב ההפוליזה אינו
להימצאות סינטתז בצורה
D
בהמוליזאט והמערכת הרגולטוריח בכדוריות
דם אדומות היא כנראה פגומה.
אודות מנגנון
.5
במגמה.להבין
הפעולה של הקולונות ההידרופוביות
את מנגנון
הפעולה של .קולו נ ו ת אלקיל אגרוז,
קודם כל אם התכונות אשר מוקנות לאגרוז
ביררנו
ע"י קישור שרשרות פחמימניות
נובעות אך ורק מנוכחותן של שרשרות אלה או משינוי מבנה בכדורי
כתוצאה
תנאי
צורתם
מהמךדיפיקציה הכימית.
האגרוז
נמצא שקישור השר שרו ת;הפחמימניות או
הריאקציה הכימית אינם פוגעים במבנה כדורי האגרוז השומרים על
הכדורית ועל המבנה העל דק שלהם.
ק ו ל ו נ ו ת מהסדרה
לאלה שנתקבלו
או
תתכים מיקרוסקופיים של חומרי
מהסדרה2Seph-Cn-NHSeph-Cnהיו
מהםפרוז הבלתי מותמר.
זהים בצורתם
כולם ניראים כרשת עדינה
112
חללים
ובה
השאלה,
ותעלות
אם
השרשרות
על
הכדורים.
מנת
רדיואקסיביות
השרשרות
מולקולות
האחיד
שיש
היבם
לקולונות
אלה.
בתהליך
מסריות
תומרי
למתליף
ל
4Seph-C
,בעלת
ל
-
היה
מ״ל
שהוזכרו
לעיל
גדולות
מספיק
כדי
)עד
של
ב.
משתי
זו
בספרות
של
תרומת
הוא
שפיזור
כדורים
ושל
מעבר
של
ללא
עיכוב,
מ ס ב י ר את
הקיבול
מיליונים(
אמינים
לא
המסען
מסרו
)(31-29
על
.
אלא,
מ"ג
0.3
פי
נמוכה
מזו
5
-
ל
מ"ל
נמצא
שקיב ולת
הקולונות
לספיחה
פי
על
נתונים
לספות
של
יעילה
הפתמימניות
אלה
פוםפורילז
פוםפורילז
אנזים
של
חו מ ר י ם
מזו
שבתומר
להחייחם
התשמלי
בהשוואה
ההידרופוביוח
פוספורילז
קולונה
מקסימלית
אין
.
פוסנציו-
שלא
DEAE Sephadex
בין
לצפיפוח
במסען
ם״ג
של
תיוביים
סיסרציות
לקולונות
קולו נ ות
השרשרות
מסענים
משמעותיים
נמצא
פוספורילז
4
חלבונים
2NH
, DEAE Sephadex A-50
b
1
0
הראתה
הוספת
לםפרוז.
נמצאו.הבדלים
בקישור
בוצעו
ה ס ד ר ו ת-Seph-C11-Seph-Cnי
סיסרציה
העברח
נמצא
לאפשר
הכדורים
ובתוך
בצפיפות
באותם
השרשרות
פ ו ספורילז
של
הקולונה
לפסען
התנא
ולא
כ ג ו רם
b
לשינוי
דומיננסי
. b
b
ספוח
הגורמים
-
ם
נחקרו
Seph-C4
בשני
ו נ מצא
כי
ניתן
אופנים:
לשינויי
באנזים
מבנה
גם
ו כנראה
ה ה י ד ר ו פ ו ב י י ם.
ע"י
ומאפשרים
תנאי
בעבודה
הקולונה.
האלוציה
באחריו
אותו
-
פחמימניות
כדור
Seph-C
לאלוציה
א.
ובתוך
אור.
השונות
הקולונות
ע"י
של
פני
שרשרות
זו
המטען.
תנאי
על
והקישור
מקובל
פרו פו ר צ י ו נ י ת
בי כולת
פני
כמה
אקראי.
אלה.
עדויות
לקשו ר ,
הפת מ י מ נ י ו ח
מולקולרי
השרשרות
של
בהשוואה
בצפ י פ ו ת
משקל
שנבדק
קולונה,
מסוגל
להב י א
הוא
אחיד
קולונה
קיבולת
זו
קולונה
בחתכים
חומרי
יונים
הוכנה
עם
שונים
האקםיבציה
של
מפוזרות
שווה
א ו ט ו ר ד י ו ג רפ י ה ב מ י ק ר ו ם ק ו פ
לקולוניה
נוסף
שאלה
במידה
על
של
גדולות
והפיזור
של
לברר
ובוצעה
התעלות
מגיע
הפחמימניוח
הפחמימניוח
שונים.
הגדול
שרותבם
עד
0.5
מיקרון
ופיזורן
נשאלת
העברת
לו
אלוציה
באי נטראקציה
הו מ ר י ם
לנתק
אלה
אח
המגדילים
החלבון
מתזקים
ה י ד ר ו פ ו ביח
עם
את
אופיו
את
הנסיבי
ההנחה
השרשרוח
האפולרי
של
ממם
האלוציה
מהשרשרות
ההידרו פו ב י ו ת .
אל
מלווה
שהספיחה
הפחמימניות
הקולונה
שבתומר
הק ו ל ו נ ה .
לסיכום,
הבדלים
ע"י
את
הועלתה
בגודלם
שימוש
התרומה
תלבון
בסדרות
סייע
בכדוריח
זו
עבודות
שיטות
הידרופוביים
נגזרות
מערכת
של
ספרוז
קולונה
בבידודם
הגליקוגן.
הבסיט
הבלתי
של
כמו
בקרה
על
פני
ניתן
השטח
המופקדת
שונים
בקולונה
על
בהדרגתיות
לבידודו
חלבונים
שימוש
שלהם.
להגביר
אופטימלית
שני
כן
חלבונים.על
של
המצויים
הידרופובית
מטבוליזם
שלהן.
הפעולה
של
בכרומםוגרפיה
זיקה.
הגליקוגן
ספציפית
האינהיביטור
מן
המטריצה
המוצקה
הראשוניים
על
כלליותה
האפשרות
הקלפיות
של
של
השיטה
שה כ ר ו מ ט ו ג ר פ י ה
לתלבונים.
הוא
מסביר
כאשר
רלוונטי
לפחות
משתמשים
אליה
ז ו )(74-73
ועל
הקולונות
שנאסף
הוא
של
עבודה
של
המידע
קולונות
המצביעות
הניקוי
ה א ד ל ס ר ה ם ט ר ו ק ט ו רה
כאלה,
המיפצאים
מפתפנח
לחקר
מנגנון
הפועלוח
להרחקה
רבות
).(115-104
בצד
הונח
הספיחה
בעקבוח
קיומה
ולהבנה
קולונות
פחמימנירח
זה
חדשה
ולמצוא
הודגם
להפרדת
פי
האדומה.
ההידרופוביות
מתופעות
של
לקשור
מטבוליזם
לחקר
הדם
בעבודה
לגבי
תהליך
של
של
גישה
אתרים
הוםולוגיות
ההידרופובית
מפחח
מהאימה
בעבודה
זו
ובפיזורם
מבוקש.
בעמדה
113
-
הוא
ההידרופובית
בזרועו
קשור.
הופיעו
הפוטנציאל
חלק
בספרות
הטמון
תתפומ
בה
מקום
113 A -
REFERENCES
1.
Schwimmer, S., and Pardee, A.B. (1953). Adv. i n Enz., 14, 375.
2.
Von T r a v e l , P., and Signer, R. (1956). Adv. i n Prot. Chem., 11, 237.
3.
Moore, S., and S t e i n , W.H. (1956). Adv. i n Prot. Chem., 11, 191.
4.
Sober, H.A., H a r t l e y , R.N., C a r o l l , W.R., and Peterson, E.A. (1965).
i n "The P r o t e i n s " , V o l . 3, ed. Neurath, H., Academic Press.
5.
Dixon, M., and Webb, E.C. (1971). Adv. i n Prot. Chem., 1 6 , 197.
6.
Porath, J . (1962). Adv. i n Prot. Chem., 17, 209.
7.
Methods i n Enzymology, V o l . 22, ed. Jakoby, W.B. (1971).
8.
Tswett, M., "On the new category o f adsorption phenomena and t h e i r
a p p l i c a t i o n i n the biochemical a n a l y s i s " ( i n Russian), Tr.
Varshav. Obshch.
E s t e s v o i s p y t . , Otd. B i o l . , 1£, 20 (1903,
publ. 1905).
9.
Hais, I.M. (1973). J . Chromat., 86, 283.
10.
T i s e l i u s , A., and F i o d i n , P. (1953). Adv. i n Prot. Chem.,
11.
Synge, R.L.M., and T i s e l i u s , A. (1950). Biochem. J . , 4£, 41.
12.
Lathe, G.H., and Ruthven, C.R.J. (1956). Biochem. J . , 62, 665.
13.
Porath, J . , and F i o d i n , P. (1959). Nature, 185, 1657.
14.
Porath, J . (1960). Biochem. Biophys. Acta, 39, 193.
15.
G e l l o t t e , B. (1960). J . Chromat., 3^ 330.
16.
F i o d i n , P. (1962). "Dextran gels and t h e i r a p p l i c a t i o n i n g e l
f i l t r a t i o n " , Thesis, U n i v e r s i t y o f Uppsala, Sweden.
17.
A r a k i , C. (1956). B u l l . Chem. Soc. Japan, 2 3 , 543.
18.
Hjerten, S. (1961). •Biochem. Biophys. Acta, £3, 514.
19.
H j e r t e n , S. (1962). Biochem. Biophys. Acta, 62, 445.
20.
Poison, A. (1961). Biochem. Biophys. Acta, 50, 565.
21.
H j e r t e n , S. (1962). Arch. Biochem. Biophys., 99^, 466.
22.
H j e r t e n , S. (1964). Biochem. Biophys. Acta, 79_, 393.
461.
-
23.
114
-
Bengtsson, S., and P h i l i p s o n , L. (1964). Biochem. Biophys. Acta,
79, 399.
24.
Porath, J . , Janson, J.C., and Laas, T. (1971). J . C h r o m a t 1 6 7,_60,..•
25.
Silman, I . , and K a t c h a l s k i , E. (1966). Ann. Rev. Biochem. 35, 873.
26.
Porath, J . (1973). Biochimie, 5£, 943.
27.
Axen, R., Porath, J . , and Ernback, S. (1967). Nature, 214, 1302.
28.
Porath, J . , Axen, R., and Ernback, S. (1967). Nature, 215, 1491.
29.
Axen, R., and Ernback, S. (1971). Eur. J . Biochem., 18_, 351.
30.
Axen, R., and Vretblad, P. (1971). Acta Chem. Scan., 25, 2711.
31.
Axen, R., Myrin, P., and Janson, J.C. (1970). Biopolymers, 9_, 401.
32.
Wide, L., Axen, R., and Porath, J . (1967). Immunochemistry, 4, 381.
33.
Chan, W.W.
34.
Feldman, K., Z i e s e l , H., and Helmreich, E. (1972). Proc. Nat. Acad.
(1970). Biochem. Biophys. Res. Comun., 41, 1198.
S c i . U.S.A., 69, 2278.
35.
Campbell, D.H., Leuscher, E., and Lerman, L.S. (1951). Proc. Nat.
Acad. S c i . U.S.A., 37_, 575.
36.
Lerman, L.S. (1953). Proc. Nat. Acad. S c i . U.S.A., 39_, 232.
37.
De l a Haba, G. (1962). Biochem. Biophys. Acta, 5£, 672.
38.
Arsenis, C , and McCormick, D.B. (1964). J . B i o l . Chem., 239, 3093;
(1966) J . B i o l . Chem., 241, 330.
39.
McCormick, D.B. (1965). Anal. Biochem., 1_3, 194.
40.
Cuatrecasas, P., WilcheckM., and Anfinsen, C.B. (1968). Proc. Nat.
Acad. S c i . U.S.A. 61, 636.
41.
Cuatrecasas, P., and Anfinsen, C.B. (1971). Meth. i n Enz., 22, '346.
42.
Cuatrecasas, P. (1970). Nature, 228, 1327.
43.
Cuatrecasas, P. (1970). J . B i o l . Chem., 245, 3059.
44.
Steers, E., Cuatrecasas, P., and Polard, H.B. (1971). J . B i o l . Chem.,
246, 196.
45.
Cuatrecasas, P., and Wilchek, M. (1968). Biochem. Biophys. Res.
Consnua, 55, 235.
46.
Mosbach, K., G u i l f o r d , H., Ohlsson, R., and Scott, M. (1972).
Biochem. J . , 127, 625.
-
47.
115
-
Cori, CF., Cori, G.T., and Green, A.A. (1943). J . Biol. Chem., 151,
39.
48.
Cori, G.T., and Cori, C F . (1940). J. Biol. Chem., 135, 733.
49.
Fischer, E.H., Heilmeyer, L.M.G., Haschke, R.H. (1971). Curr. Top.
in Cell. Reg., £, 211.
50.
Leloir, L.F., and Cardini, C.E. (1957). J. Amer. Chem. S o c , 79_, 6340.
51.
Cohen, P., Duewer, T., and Fischer, E.H. (1971). Biochemistry, 10,
2683.
52.
Krebs, E.G., Kent, A.B., and Fischer, E.H. (1958). J. Biol. Chem.,
231, 73.
53.
Krebs, E.G., and Fischer, E.H. (1956). Biochem. Biophys. Acta, 20, 150.
54.
Keller, P.J., and Cori, G.T. (1955). J. Biol. Chem., 214, 127.
55.
Madsen, N.B., and Cori, C F . (1956). J. Biol. Chem., 223, 1055.
56.
Shaltiel, S., Hedrick, J.L., and Fischer, E.H. (1966). Biochemistry,
_5, 2108.
57.
Fischer, E.H., Pocker, A., and Saari, J.C (1970). Essays in
Biochem.,6, 23.
58.
Fischer, E.H., Graves, D.J., Crittenden, E.R.S., and Krebs, E.G.
(1959). J. Biol. Chem., 234, 1698.
59.
Zaidenzaig, Y. (1972). "Chemical Mapping of Active Sites in Glycogen
Phosphorylase", Thesis, The Weizmann Institute of Science,
Rehovot, Israel.
60.
Shaltiel, S., Cortijo, M., and Zaidenzaig, Y. (1972). in "Metabolic
Interconversion of Enzymes", eds. Wieland, 0., Holzer, H., and
Heilmreich, E., p. 73, Springer-Verlag, Berlin.
61.
Shaltiel, S., Hedrick, J.L., and Fischer, E.H. (1969). Biochemistry,
8 , 2429.
62.
Hurd, S.S., Teller, D., and Fischer, E.H. (1966). Biochem. Biophys.
Res. Commun.,'24, 79.
63.
Fischer, E.H., Hurd, S.S., Koh, P., and Teller, D. (1966). Natl.
Cancer Inst. Monog., 27_, 47.
64.
Brown, N.E., and Lamer, J. (1971). Biochem. Biophys. Acta, 242, 69.
-
65.
116
-
Smith, C.H., Brown, N.E., and Larner, J . (1971). Biochem. Biophys.
Acta, 242, 81.
66.
Soderling, T.R., Hickenbottom, J.P., Reimann, E.M., Hunkeler, F.L.,
Walsh, D.A., and Krebs, E.G. (1970). J . B i o l . Chem., 245, 6317.
67.
L e l o i r , L.F., and Goldemberg, S.H. (1962). Meth. i n Enz., 5_, 145.
68.
Smith, C.H., and Larner, J . (1972). Biochem. Biophys. Acta, 264, 224.
69.
Rebhun, L., Smith, C , and Larner, J . (1973). Mol. C e l l . Biochem. 1_,
55.
70.
Rosenkranz, A., and Larner, J . (1973). Biochem. -Biophys. Acta, 315,
317.
71.
Larner, J . , and Sanger, F. (1965). J . Mol. B i o l . , 11, 491.
72.
Stage, D.E., and Mannik, M. (1974). Biochem. Biophys. Acta, 545, 382.
73.
E r - e l , Z., Zaidenzaig, Y., and S h a l t i e l , S. (1972). Biochem. Biophys.
Res. Commun., 49, 383.
74.
S h a l t i e l , S., and E r - e l , Z. (1973). Proc. Nat. Acad. S c i . U.S.A., 7£,
778.
75.
Birkett,
D.J., Radda, G.K., and Salmon, A.G. (1970). FEBS L e t t e r s ,
H_, 295.
76.
Fischer, E.H., Krebs, E.G., and Kent, A.B. (1958). Biochem. Prep.,
־6, 68.
77.
Krebs, E.G., Love, D.S., Bratvold, G.E., Trayser, K.A., Meyer, W.L.,
and Fischer, E.H. (1964). Biochemistry, _3> 1022.
78.
F i s c h e r , E.H., and Krebs, E.G. (1958). J . B i o l . Chem., 251, 65.
79.
Moses, S.W., Bashan, N., and Gutman, A. (1972). Eur. J . Biochem., 30_,
205; (1972) Blood, 40, 836.
80.
Hedrick, J.L., and Fischer, E.H. (1965). Biochemistry, 4, 1337.
81.
F i s k e , C.H., and Subbarow, Y. (1925). J . B i o l . Chem., 66, 375.
82.
Thomas, J.A., Schlender, K.K., and Larner, J . (1968). Anal. Biochem.,
25, 486.
83.
I t z h a k i , R.F., and G i l l , D.M. (1964). Anal. Biochem., 9_, 401.
84.
Lowry, O.H., Rosebrough, A.L., F a r r , A.L., and Randall, R.J. (1951).
J . B i o l . Chem., 195, 265.
-
85.
11?
-
Dubois, M., G i l l s , K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A., and Smith, F.
(1956). Anal. Chem., 28.350
״
.
86.
Weber, K., and Osborn, M. (1969). J . B i o l . Chem., 244, 4406.
87.
Dudai, Y., Silman, I . , Kalderon, N., and Blumberg, S. (1972).
Biochem. Biophys. Acta, 268, 138.
88.
C o r t i j o , M., Steinberg, I.Z., and S h a l t i e l , S. (1971). J . B i o l .
Chem., 246, 933.
89.
Krebs, E.G., and F i s c h e r , E.H. (1964). Vitamins and Hormones, 22,
408.
90.
Smith, C.H., V i l l a r - P a l a s i , C , Brown, N.E., Schlender, K.K.,
Rosenkrans, A.M., and Lamer, J . (1972). Meth.
i n Enz., 28,
530.
91.
Caro, L.G., and Tubergen, J . (1962). J . C e l l . B i o l . , 15, 173.
92.
"Beaded Sepahrose 2B-4B-6B" a booklet by Pharmacia Fine Chemicals AB,
Uppsala, Sweden.
93.
Tanford, C. (1973). "The hydrophobic e f f e c t " , John-Wiley and Sons,
Inc.
94.
Kauzmann, W. (1959). Adv. Prot. Chem., 14, 1.
95.
Nenethy, G. (1967). Angew. Chem., I n t . Ed. !6, 195.
96.
Jencks, W.P. (1969). " C a t a l y s i s i n chemistry and enzymology", chap.
8, McGraw-Hill, Inc.
97.
Steinhardt, J . , and Reynolds, J . (1969). " M u l t i p l e e q u i l i b r i a i n
p r o t e i n s " , Academic Press.
98.
B a r t l e t t , M.L.S., and Graves, D.J. (1970). Biochem. Biophys. Res.
Commun., 38, 255.
99.
Tanford, C. (1968). Adv. i n Prot. Chem., 23, 121 (part A ) .
100.
Weiss, H., and Bucher, T. (1970). Eur. J . Biochem., 17, 561.
101.
Osterman, A. (1971). Anal. Biochem., 43. 254.
102.
Yon, R.J. (1972). Biochem. J . , 126, 765.
103.
Porath, J . (1968). Nature, 218, 834.
104.
Hofstee, B.H.J. (1973). Biochem. Biophys. Res. Comun., 50, 751.
105.
Jakubowski, H., and Pawelkiewicz, J . (1973). FEBS L e t t e r s , 34, 150.
106.
S h a l t i e l , S., Ames, G.F., and Noel, K.D. (1973). Arch. Biochem.
Biophys., 159, 174.
-
107.
118
S h a l t i e l , S. (1974). i n "Metabolic interconversion o f enzymes" (eds.
F i s c h e r , E.H., Krebs, E.G., Neurath, H., and Stadtman, E.R.)
p. 379.
108.
S h a l t i e l , S. (1974).
Meth.
i n Enz., 34B, 126.
109.
E r - e l , Z., and S h a l t i e l , S. (1974). FEBS L e t t e r s , 40, 142.
110.
Rimerman, R.A., and H a t f i e l d , G.W. (1973). Science, 182, 1268.
111.
Hjerten, S. (1973). J . Chromat. 87, 325.
112.
Porath, J . , Sundberg, L., Fornstedt, and Olsson, I . (1973). Nature,
245, 465.
115.
Yon, R.J. (1974). Biochem. J . , 137, 127.
114.
Peters, T., Taniuchi, H., and Anfinsen, C.B. (1973). J . B i o l . Chem.,
248, 2447.
115.
Hofstee, B.H.J. (1973). Anal. Biochem., 52:, 430.
116.
Svensson, B. (1973). FEBS L e t t e r s , 29, 167.
117.
J o s t , R., Miron, T., and Wilchek, M. (1974). Biochem. Biophys. Acta,
362, 75.
118.
Hofstee, B.H.J. (1973). Biochem. Biophys. Res. Commun., 53, 1157.
119.
Shatsky, M.A., Ho, H.C., and Wang, J.H.C. (1973). Biochem. Biophys.
Acta, 303, 298.
120.
O'Carra, P., Barry, S., and G r i f f i n , T. (1974). FEBS L e t t e r s , 43,
169.
121.
J o s t , R., and Yaron, A. (1974). Eur. J . Biochem., 48, 119.
122.
S h a l t i e l , S., Henderson, G.B., and S n e l l , E.E. (1974). Biochemistry,
13, 4330.
123.
Himmelhoch, S.R. (1972).
124.
Henderson, G.B., S h a l t i e l , S., and S n e l l , E.E. (1974). Biochemistry,
13, 4335.
Meth.
i n Enz., 22, 273.
־119 ־
רשימת קיצורים
AMP
־
adenosine 5'-monophosphate
NAD+ -
nicotinamide-adenine-dinucleotide
G-1-P -
glucose-l-phosphate
UDP
uridine 5'-diphosphate
UDPG -
uridine 5'-diphosphoglucose
ATP
adenosine 5'-triphosphate
GP
sodium ^-glycerophosphate
ME
^-mercaptoethanol
Tris
tris(hydroxymethyl) aminomethane
SDS
sodium dodecyl sulphate
EDTA -
ethylene diamine tetraacetic acid
GAPD -
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase -
PBS
phosphate buffer saline (0.01M NaH PO««, 0. 9 $ NaCl pH 7.2)
TEMED -
N, N, N\ N'-Tetramethylenediamine
2
Hydrophobic Chromatography
in the Study of Enzymes
Involved in Glycogen Metabolism
Thesis submitted for the Degree
Doctor of Philosophy
by
ZVI EREL
S u b m i t t e d t o t h e S c i e n t i f i c C o u n c i l off t h e W e i z m a n n I n s t i t u t e off S c i e n c e
M a r c h , 1975
Rehovot
The work described in this thesis
was carried out in the Department
of Chemical Immunology, The Weizmann
Institute of Science, Rehovot, under
the guidance of Professor Shmuel Shaltiel.
I
SUMMARY
1.
Glycogen coated Sepharose:
i s i t a f f i n i t y chromatography?
C l a s s i c a l methods f o r p u r i f i c a t i o n of p r o t e i n s are based mainly on
d i f f e r e n c e s i n s o l u b i l i t y , s t a b i l i t y , charge and molecular weight.
Recently, a method based on the b i o s p e c i f i c i t y of p r o t e i n s has become
widely accepted (35-46).
In view of the dramatic enzyme p u r i f i c a t i o n s
achieved by the use of t h i s method, which i s known as " a f f i n i t y
chromatography",
we attempted to coat Sepharose with glycogen and carry
out p u r i f i c a t i o n o f glycogen synthetase and glycogen phosphorylase.
This was performed by a c t i v a t i o n of Sepharose w i t h CNBr and r e a c t i o n
with octamethylenediamine to obtain w-aminoalkyl Sepharose
(27,28,43),then
binding of CNBr a c t i v a t e d glycogen to i t . The product contained glycogen
about 10% (w/w).
The glycogen-coated Sepharose adsorbed s e l e c t i v e l y
phosphorylase b_ from a mixture w i t h GAPD.
I t also adsorbed the enzyme
from crude r a b b i t muscle e x t r a c t i n which i t i s present with many
other p r o t e i n s .
The adsorbed enzyme can be eluted at pH = 5.8 when the
enzyme i s known to undergo d r a s t i c conformational changes (56).
The
enzyme can be eluted at n e u t r a l pH u s i n g deforming b u f f e r s such as
imidazole c i t r a t e which were shown to have a marked f u l l y r e v e r s i b l e
e f f e c t of the s t r u c t u r e of the enzyme.
However, when glycogen coated
Sepharose was prepared u s i n g tetramethylenediamine instead of octamethylenediamine
the column d i d not adsorb phosphorylase b_ although i t
contained the same amount o f glycogen.
Control experiments that followed
have shown that Sepharose which had reacted with octamethylenediamine
a l s o binds phosphorylase IK
This observation r a i s e d the p o s s i b i l i t y
that the very length of the hydrocarbon chains may be involved i n
endowing the modified Sepharose w i t h the capacity o f adsorbing
phosphorylase lb.
2.
Types o f i n t e r a c t i o n s involved i n the adsorbtion o f proteins t o
a l k y l and aminoalkyl agaroses.
Homologous s e r i e s o f alkyl-Sepharoses (Seph-Cn) and w-aminoalkyl-
Sepharoses (Seph-Cn-N^) were synthesized.
Each o f the columns was
prepared by r e a c t i n g the appropriate aminoalkane or a,to diaminoalkane
with a c t i v a t e d Sepharose (n denotes the number o f carbon atoms).
Mixtures
of phosphorylase b_ and GAPD were passed through i d e n t i c a l l y prepared
columns o f the s e r i e s Seph-Cn (n = 1-6).
I t was found that GAPD i s not
adsorbed or retarded by any o f these columns.
However, while Seph-C^
d i d not r e t a i n phosphorylase b, Seph-C^ retarded the enzyme and higher
alkylagaroses (Seph - C^ t o Seph - C^) adsorbed i t .
r y l a s e b_ from Seph - C^ i s p o s s i b l e u s i n g
citrate.
E l u t i o n o f phospho-
deforming buffer-imidazole
The binding t o Seph - C^ i s t i g h t e r since the enzyme could
not be eluted even by a deforming b u f f e r a t pH = 5.8. Recovery o f the
enzyme was p o s s i b l e only i n the denatured form (using 0.2 M a c e t i c a c i d ) .
When crude extract from r a b b i t muscle was passed on the s e r i e s o f
columns mentioned above, i t was found that a d s o r b i t i o n o f glycogensynthetase a l s o depends on the number o f the carbon atoms i n the a l k y l
side chains. The enzyme i s adsorbed on Seph ־C^ and eluted by a l i n e a r
s a l t gradient (NaCl).
E l u t i o n o f the adsorbed enzyme from Seph - C2
requires higher concentration o f s a l t .
We could not elute the enzyme
from Seph ־C^, Seph ־C^ i n i t s n a t i v e form.
When an extract from r a b b i t muscle was subjected t o chromatography
on Seph-Cn-NH2, i t was found that phosphorylase and synthetase were
retarded by the columns.
However under those circumstances an a l k y l
side chain o f 2-3 carbon atoms longer i s needed f o r r e t a r d a t i o n .
experiments were performed under i d e n t i c a l conditions (pH, temp.,
The
,in
i o n i c strengh, e t c . ) •
Th'e columns were i d e n t i c a l except f o r the length
of the hydrocarbon side chains.
As the side chain i s increased the proteins pass from no r e t e n t i o n
on the column, through r e v e r s i b l e binding, up to very t i g h t binding.
I t seems p l a u s i b l e to assume that the r e t e n t i o n of enzymes on the columns
occurs through i n t e r a c t i o n between the hydrocarbon side chains and
hydrophobic pockets or patches of the enzyme.
Using an homologous
s e r i e s of columns, i t becomes p o s s i b l e to optimize the i s o l a t i o n o f a
p r o t e i n , by choosing the member i n the s e r i e s that i s most e f f i c i e n t
f o r t h i s purpose.
method "Hydrophobic
3.
Therefore i t was proposed to c a l l t h i s separation
chromatography".
P u r i f i c a t i o n o f enzymes using hydrophobic chromatography
The p o t e n t i a l use o f the p r i n c i p l e s described above f o r
q u a n t i t a t i v e p u r i f i c a t i o n of proteins was i n v e s t i g a t e d .
Glycogen
phosphorylase was p u r i f i e d about 100 f o l d by subjecting crude
extract to chromatography on Seph - C^.
muscle
The s p e c i f i c a c t i v i t y of the
i s o l a t e d enzyme was up to 68 units/mg compared with 80 units/mg f o r
the pure and c r y s t a l l i n e enzyme (76).
Aminoalkylagarose column
was u t i l i z e d f o r the p u r i f i c a t i o n o f
glycogen synthetase on a preparative s c a l e .
w a s
to chromatography on Seph-Cn-N^ i t
Upon subjecting the enzyme
p u r i f i e d 40 f o l d , the product
having a s p e c i f i c a c t i v i t y of 4 units/mg.
The procedure has an o v e r a l l
y i e l d of 50%.
Glycogen synthetase was separated also from human erythrocytes.
The enzyme e x i s t s i n erythrocytes i n minute q u a n t i t i e s and i t s synthetic
a b i l i t y i s e x h i b i t e d only i n abnormal c o n d i t i o n s , namely i n glycogen
storage diseases (79). The enzyme was p u r i f i e d 620 f o l d by passing an
erythrocyte hemolysate through Seph־Cn־NH .
2
considerably homogeneous.
The product was found to be
IV
4.
Hydrophobic chromatography i n the r e s o l u t i o n o f the various forms
of glycogen phosphorylase and glycogen synthetase.
The r e s o l u t i o n power o f alkyl.agaroses was demonstrated i n the
separation o f the m e t a b o l i c a l l y i n t e r c o n v e r t i b l e forms of glycogen
phosphorylase.
These two forms are i d e n t i c a l
i n t h e i r amino a c i d
sequence except f o r a unique serine residue i n each o f the enzyme
protomers, which becomes o־phosphorylated upon conversion o f the b^ form
(a dimer) to the a_ form(a •tetramer).
In a mixture o f the two
purified
forms of the enzyme i t i s p o s s i b l e to f i s h out the a_ form o f the enzyme
by passage through Seph - Cj or Seph - C ,
2
The a^ form has greater
a f f i n i t y to each of the columns i n the s e r i e s Seph - Cn, compared with
the b_ form.
Inducing the interconversion o f phosphorylase and synthetase i n a
crude muscle e x t r a c t , there i s formation of p a r t i a l l y phosphorylated
species o f the enzymes.
Those "Phospho-dephospho" hybrids have been
p a r t i a l l y resolved by passing the crude extract through a column o f
Seph - C^.
The p a r t i a l r e s o l u t i o n i s i n d i c a t e d by the peak o f phospho-
r y l a s e a c t i v i t y i n which there i s a gradual change i n the r a t i o of
a c t i v i t i e s measured i n the absence and i n the presence o f AMP.
On the
same column, synthetase a c t i v i t y i s also p a r t i a l l y resolved as
i n d i c a t e d by the gradual change i n the requirement of glucose
־6
phosphate f o r a c t i v i t y .
The i n t e g r i t y o f the network o f regulatory enzymes involved i n
glycogen metabolism i n erythrocytes i s doubtful.
Glycogen synthetase i n
hemolysate was p r e v i o u s l y found to be t o t a l l y dependent on glucose
phosphate f o r a c t i v i t y .
Is i t due to the f a c t that the I form o f the
enzyme i s dominant i n the i n t a c t red blood c e l l ?
phosphorylated during hemolysis?
or i s the D form
Using the p u r i f i c a t i o n
described above, we attempted to answer these questions.
procedures
־6
V
The suspected phosphorylation step was performed i n the presence o f
r a d i o a c t i v e l y labeled ATP and then the product was i s o l a t e d .
I t was
found that the l a b e l d i d not copurify with the enzymatic a c t i v i t y nor
with the corresponding
subunit (m.w.
^ 100.000).
This negative r e s u l t
i s i n accord with previous e f f o r t s (79) i n which no a c t i v i t y other than
the D form could be demonstrated i n the hemolysate of erythrocytes.
5.
On the mechanism of a c t i o n of a l k y l agaroses and W-amino a l k y l
agaroses.
P r i o r to suggesting a p l a u s i b l e mechanism of a c t i o n i t was
necessary to estimate the magnitude of various f a c t o r s c o n t r i b u t i n g to
the r e s o l u t i o n power of these columns.
were considered i s that the
One of the p o s s i b i l i t i e s that
u l t r a s t r u c t u r e of the agarose beads might
have been disrupted or a l t e r e d as a r e s u l t of the manipulations c a r r i e d
out during the chemical modifications.
In that case, the differences i n
d i s c r i m i n a t i n g power of the various columns could be associated, a t
least i n p a r t , with these changes i n u l t r a s t r u c t u r e of the beads. By
l i g h t and e l e c t r o n microscope studies i t was found that untreated agarose
and a r b i t r a r i l y chosen modified agaroses are i n d i s t i n g u i s h a b l e i n t h e i r
ultrastructure.
Thin sections of a l l the above agaroses embedded i n
Epon revealed a net work skeleton with v a r i a b l e pore s i z e up to 0.5 y
i n diameter.
These pores or channels are d i s t r i b u t e d at random i n
d i f f e r e n t sections of the beads.
The hydrocarbon "arms" were found to be d i s t r i b u t e d at random both
outside and w i t h i n the beads as shown by autoradiography
with t r i t i a t e d hydrocarbon chains.
o f Seph־0 NH
i
4
This can account f o r the observed
high capacity of the hydrocarbon-coated agarose columns.
The c o n t r i b u t i o n of i o n i z a b l e groups (implanted on the agarose by
the chemical m o d i f i c a t i o n (29-31), to the d i s c r i m i n a t i n g power o f the
2
VI
columns was also investigated.
Potentiometric t i t r a t i o n s of modified
agaroses, untreated agarose as w e l l as a common ion exchanger DEAESephadex A-50, were c a r r i e d out.
I t was found that there are no s i g n i f -
i c a n t differences i n the number of i o n i z a b l e groups among the various
agarose columns that were prepared simultaneously under i d e n t i c a l
conditions.
In general the modified agaroses have l i t t l e charge compared
with the commonly used ion exchangers.
A Seph -
column which binds
10 mg of phos b_per ml of column has one f i f t h of the i o n i z a b l e charges
(pK
9.6
)׳י׳
compared with DEAE-Sephadex A-50 that binds l e s s than 0.3 mg
phosphorylase b_.
Seph ־
columns that d i f f e r i n the concentration o f hydrocarbon
"arms" were compared.
I t was found that the capacity f o r phosphorylase
b i s proportional to the concentration of the "arms" rather then to the
concentration of i o n i z a b l e groups.
Consequently, i t i s assumed that the
e l e c t r i c charge of the columns i s not the dominant f a c t o r which determines
t h e i r r e s o l u t i o n power.
The requirements f o r e f f e c t i v e e l u t i o n o f phosphorylase b_ from a
Seph - C^ column were studied.
I t was found that f o r the enzyme to remain
adsorbed i t i s c r u c i a l that: a) I t s n a t i v e conformation i s preservede l u t i o n i s obtained by substances that b r i n g about conformational changes
i n the p r o t e i n e.g., i n i t s hydrophobic pockets,
b) The p o l a r i t y of the
medium i s unaltered - by increasing the apolar character o f the eluant,
e f f e c t i v e e l u t i o n i s accomplished.
The data presented here i s i n accord with the suggested mechanism that adsorbtion of proteins to the a l k y l agarose columns involve hydrophobic i n t e r a c t i o n between the hydrocarbon "arms" and the hydrophobic
pockets or regions on the p r o t e i n .
© Copyright 2024