72121 – ביוכימיה של התא תרגיל מס` 3: כימוטריפסין
– 72120ביוכימיה של התא מנגנוני קטליזה אנזימתית - כימוטריפסין 1 כימיה אורגנית 0 • נוקלאופיל – ריאגנט אשר יוצר קשר על ידי תרומת שני אלקטרוני הקשר .צריך להכיל זוג אלקטרונים בלתי קושרים. • אלקטרופיל – ריאגנט אשר נמשך לאלקטרונים ,ומקבל את שני אלקטרוני הקשר בתגובה .בדרך כלל נושא מטען או מטען חלקי חיובי. • התקפה נוקלאופילית – תגובה שבה נוקלאופיל "תוקף" באמצעות אלקטרוני הקשר את האלקטרופיל. • פחמן קרבונילי מהווה אלקטרופיל נפוץ בתגובות ביולוגיות) C=O ( . 2 אסטרגיות של קטליזה • –Covalent catalysisהאתר הפעיל מכיל בדרך נוקלאופיל חזק שיוצר קשר קוולנטי זמני עם הסובסטרט. + X +B A OH2 B + X A X + B A שני השלבים צריכים להיות מהירים יותר מהריאקציה ללא קטליזה. 3 אסטרגיות של קטליזה • –Metal ion catalysisיון המתכת באנזים יכול לפעול בכמה אופנים: – ייצוב מטען. – יצירת נוקלאופיל חזק יותר. – הידוק הקשר בין האנזים והסובסטרט. – עיצוב הקשר בין האנזים והסובסטרט. 4 אסטרגיות של קטליזה • –General acid/baseהאנזים מגלם תפקיד של חומצה או בסיס. • בסיס/חומצה ספציפיים – תגובות בהם הבסיס או החומצה בעצמם משתתפים בתגובה (מים). • בסיס/חומצה כלליים – הסרה או הוספה של פרוטונים לזירוז התגובה ,מסייע בבניית נוקלאופיל חזק. • לעתים קרובות Hisישחק את תפקיד הבסיס או החומצה. 5 אסטרגיות של קטליזה • –Catalysis by approximationהאנזים מאפשר אוריינטציה ספציפית אשר מגבירה את הסיכוי להתרחשות ריאקציה. 6 כימוטריפסין פרוטאז = אנזים המקטלז ביקוע של קשרים פפטידים ,בתגובת הידרוליזה. שייך למשפחת .serine proteases למרות שהידרוליזה של קשר פפטידי היא תהליך מועדף תרמודינמית ( ,)0<Gזוהי ריאקציה מאוד איטית בהעדר קטליזטור (.(Ea>>0 אנזים מתגבר על מכשולים אלו על ידי כך שמספק סביבה ספציפית (האתר הפעיל) שבה הריאקציה יכולה להתרחש מהר יותר. 7 התפקיד הביולוגי של כימוטריפסין כימוטריפסין שייך לאנזימי מערכת העיכול .מיוצר ומופרש מהלבלב אל המעי הדק. אנזימי העיכול מיוצרים בלבלב כ zymogensשהם פרקורסורים לא-פעילים שהופכים לאנזימים פעילים רק כאשר מגיעים לאתר הפעולה שלהם במעי הדק. 8 הביקוע הספציפי בשרשרת הפפטידית של כימוטריפסינוגן גורם לשינוי קונפורמציה שחושף את האתר הפעיל של האנזים. שלוש השרשראות הפפטידיות המרכיבות את האנזים הפעיל מחוברות זו לזו באמצעות קשרים דיסולפידיים. צהוב – קשרים דיסולפידיים 9 הסובסטרט לכימוטריפסין יש העדפה ברורה לביקוע קשר פפטידי אחרי שייר נפחי והידרופובי. כימוטריפסין מבקע באופן סלקטיבי את הקשר הפפטידי בקצה ’ Cשל חומצות האמינו הארומטיות. כיס הקישור ההידרופובי אחראי לספציפיות של האנזים לסובסטרט. 10 המבנה של כימוטריפסין אתר הקישור ירוק –כיס הקישור בו יושב השייר הצידי של החומצה האמינית הארומטית אדום – חומצות האמינו המרכיבות את האתר הפעיל. חלבון גלובולרי ,מבנה שניוני שרובו בקונפורמצית .βשלוש שרשראות מחוברות בקשרים דיסולפידים. 11 ניסוי של הרטלי וקילבי משנת :1954 Burst phase כימוטריפסין פועל ב 2-שלבים .קטליזה קוולנטית. + X +B A B + X A X + B A 12 תוצאות ניסוי זה היוו חלק מההוכחות לקיומו של תוצר הביניים אציל-אנזים קוולנטי. הריאקציה מתחילה בקצב מהיר שאחריה התמתנות של הקצב .שלב הקצב המהיר ( burst )phaseמשקף את האצילציה המהירה שעוברות כל מולקולות האנזים (משוחררת כמות ניטרופנול כמעט מקבילה סטוכיומטרית לכמות האנזים) והקצב עבור ערך ה turnoverשל האנזים מוגבל ע"י שלב הדה-אצילציה האיטי. 13 מנגנון הפעולה של כימוטריפסין תוצר ביניים קוולנטי - שלב האצילציה ( - )acylation phaseביקוע הקשר הפפטידי ויצירת קשר אסטרי בין הפחמן הקרבונילי של הפפטיד והאנזים (יצירת אציל-אנזים קוולנטי שהוא תוצר ביניים זמני). שלב הדה-אצילציה ( – )deacylation phaseהידרוליזה של הקשר האסטרי ורגנרציה של האנזים. 14 מנגנון הפעולה של כימוטריפסין -מפורט שלב האצילציה ()acylation phase אתר הקישור ההידרופובי קובע את הספציפיות של כימוטריפסין. 15 הנוקליאופיל בשלב האצילציה הוא אטום החמצן של .Ser195ה pKaשל ההידרוקסיל של סרין בד"כ גבוה מכדי שהצורון המיונן יהיה נוכח ב pHפיזיולוגי ,אולם הסביבה הכימית של Ser195בכימוטריפסין גורמת להנמכת ה pKaשלו. כיצד? The catalytic triad 16 The catalytic triad 17 שלב – 1הסובסטרט נקשר לאנזים Ser195 .מעביר פרוטון ל His57ומבצע התקפה נוקליאופילית על הפחמן הקרבונילי של הסובסטרט. מתקבל תוצר ביניים טטרהדרלי קצר-חיים שבו יש מטען שלילי על החמצן הקרבונילי של הסובסטרט .מטען זה מיוצב ע"י קשרי מימן ב “."oxyanion hole 18 שלב – 2חוסר יציבות של המטען השלילי על החמצן הקרבונילי מוביל לפירוק תוצר הביניים .יצירה מחדש של הקשר הכפול עם הפחמן מחליפה את הקשר בין הפחמן וקבוצת האמינו של הקשר הפפטידי וכך נשבר הקשר הפפטידי. נוצר אציל-אנזים. קבוצת האמינו עוברת פרוטונציה ע"י .His57 19 שלב – 3 אמין השתחרר מהאנזים. 20 שלב הדה-אצילציה ()deacylation phase שלב – 4מולקולת מים נכנסת דרך קשר מימן עם .His57מולקולת המים עוברת דה-פרוטונציה ( His57מקבל פרוטון) .יון ההידרוקסיד תוקף את הקשר האסטרי של האציל-אנזים. תוצר ביניים טטרהדרלי נוצר .מטען שלילי על חמצן קרבונילי מיוצב על ידי קשרי מימן ב “."oxyanion hole 21 שלב – 5חוסר יציבות מוביל לפירוק תוצר הביניים Ser195 .משתחרר His57 .עובר דה-פרוטונציה ומעביר פרוטון ל .Ser195 22 שלב – 6קומפלקס אנזים-תוצר (.)EP 23 בשלב 7התוצר משתחרר מהאתר הפעיל כך שהאנזים מוכן שוב לפעולה. 24 מנגנון הפעולה של כימוטריפסין מדגים עקרונות קטליטיים המצויים בשימוש ע"י אנזימים רבים: – Covalent catalysisהאתר הפעיל מכיל קבוצה ריאקטיבית ,בד"כ נוקלאופיל חזק ,שבמהלך הקטליזה עובר מודיפיקציה קוולנטית זמנית. בכימוטריפסין – יצירת אציל-אנזים. – General acid-base catalysisמולקולה אחרת מ H2Oמשמשת בתפקיד .proton donor/acceptor בכימוטריפסין His57 -תיפקד כבסיס בשלבים מסוימים וכחומצה בשלבים אחרים במהלך הריאקציה. 25 שאלה :1 להלן פרוטאזות הדומות לכימוטריפסין .נתונים אתרי הקישור של שתיים מהן ,נסו לנחש מה יהיה אופי הסובסטרטים של כל אחת מהן: כימוטריפסין קושר בעיקר חומצות אמינו הידרפוביות גדולות (ארומטיות) ,כפי שרואים יש לו כיס קישור גדול .טריפסין חותך אחרי שיירים טעונים חיובית (ליזין וארגינין) בעוד אלסטאז חותך אחרי שיירים קטנים. 26 שאלה 2 במחקר נעשתה מוטציה ב Asp102בכימוטריפסין ל Asnוהוחלט לבדוק את הפעילות של האנזים המוטנט. מה יהיה ההבדל בערכי Kmו kcat -בין האנזים המוטנט ל?WT- תשובה היות ש Asp102משתתף ב catalytic triad-היכולת של האנזים ליצור נוקלאופיל חזק יותר תקטן ,ולכן גם שלב האצילציה וגם שלב הדה-אצילציה יהיו איטיים יותר כך ש kcatיהיה נמוך בהרבה. עם זאת ,לא ניתן לקבוע לגבי Kmבצורה ודאית היות שאנו לא יודעים איזה מהשלבים יואט בצורה משמעותית יותר. 27 שאלה : 3 הריאגנט ) Tosyl-l-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCKמעכב באופן ספציפי כימוטריפסין על ידי קישור קוולנטי ל His57 א .ציינו מדוע המעכב ספציפי עבור כימוטריפסין. ב .הציעו ריאגנט ,בהתבסס על מבנה TPCKשעשוי להיות מעכב יעיל של טריפסין. TPCK פתרון: א TPCK .ספציפי לכימוטריפסין היות והטבעת הפנילית של Pheעוברת אינטראקציה יעילה עם כיס הקישור של האתר הפעיל של כימוטריפסין .כך קבוצת הכלורומתיל מוצבת במיקום המאפשר הגבה עם His57 טריפסין. ב .החלפה של שייר ה Pheב TPCKבארגינין או ליזין תיצור ריאגנטים שיהיו ספציפיים לעיכוב 28 שאלה 4 כאשר כימוטריפסין מפרק סובסטרט מסוים ,Xלא נמדד שלב burstוהריאקציה מתנהגת בצורה לינארית לכל אורכה .מה ההסבר הסביר ביותר? א .כימוטריפסין מפרק את התוצר באסטרטגיה של חומצה ובסיס כלליים ואין תוצרי ביניים בתגובה. ב .הסובסטרט המדובר מתפרק בצורה דומה כמו בניסוי של הרטלי וקילבי אך התוצר אשר אותו "רואים" בניסוי הוא התוצר השני שמשתחרר. ג .שלב יצירת האציל -אנזים הוא שלב קובע המהירות ושלב פירוק האציל-אנזים הוא השלב המהיר. ד .כימוטריפסין אינו מסוגל לפרק את קומפלקס האציל-אנזים במקרה של פירוק סובסטרט .X תשובה ב נכונה מבחינה עקרונית ,אך היא מתארת טעות של הנסיין. תשובה ג נותנת הסבר ביולוגי 29 שאלה 5 איזה משפט הוא הנכון ביותר לגבי השלשה הקטליטית של כימוטריפסין? א .שלושת השיירים משמשים בתגובה כחומצות או בסיסים כלליים. ב .סרין 195משתתף בתגובה וקושר קוולנטית את השייר של היסטידין 57ולכן התגובה נחשבת כקטליזה קוולנטית. ג .סרין 195אשר בדר" כ מהווה נוקלאופיל חלש משמש כנוקלאופיל חזק בריאקציה בכימוטריפסין. ד .אספרטאט 102משמש גם נוקלאופיל וגם אלקטרופיל בריאקציה. ג 30
© Copyright 2024