‫‪ – 72120‬ביוכימיה של התא‬
‫מנגנוני קטליזה אנזימתית ‪-‬‬
‫כימוטריפסין‬
‫‪1‬‬
‫כימיה אורגנית ‪0‬‬
‫•‬
‫נוקלאופיל – ריאגנט אשר יוצר קשר על ידי תרומת שני אלקטרוני הקשר‪ .‬צריך להכיל‬
‫זוג אלקטרונים בלתי קושרים‪.‬‬
‫•‬
‫אלקטרופיל – ריאגנט אשר נמשך לאלקטרונים‪ ,‬ומקבל את שני אלקטרוני הקשר‬
‫בתגובה‪ .‬בדרך כלל נושא מטען או מטען חלקי חיובי‪.‬‬
‫•‬
‫התקפה נוקלאופילית – תגובה שבה נוקלאופיל "תוקף" באמצעות אלקטרוני הקשר‬
‫את האלקטרופיל‪.‬‬
‫•‬
‫פחמן קרבונילי מהווה אלקטרופיל נפוץ בתגובות ביולוגיות‪) C=O ( .‬‬
‫‪2‬‬
‫אסטרגיות של קטליזה‬
‫• ‪ –Covalent catalysis‬האתר הפעיל מכיל בדרך נוקלאופיל חזק שיוצר קשר‬
‫קוולנטי זמני עם הסובסטרט‪.‬‬
‫‪+ X +B‬‬
‫‪A‬‬
‫‪OH2‬‬
‫‪B‬‬
‫‪+‬‬
‫‪X‬‬
‫‪A‬‬
‫‪X‬‬
‫‪+‬‬
‫‪B‬‬
‫‪A‬‬
‫שני השלבים צריכים להיות מהירים יותר מהריאקציה ללא קטליזה‪.‬‬
‫‪3‬‬
‫אסטרגיות של קטליזה‬
‫• ‪ –Metal ion catalysis‬יון המתכת באנזים יכול לפעול בכמה‬
‫אופנים‪:‬‬
‫– ייצוב מטען‪.‬‬
‫– יצירת נוקלאופיל חזק יותר‪.‬‬
‫– הידוק הקשר בין האנזים והסובסטרט‪.‬‬
‫– עיצוב הקשר בין האנזים והסובסטרט‪.‬‬
‫‪4‬‬
‫אסטרגיות של קטליזה‬
‫• ‪ –General acid/base‬האנזים מגלם‬
‫תפקיד של חומצה או בסיס‪.‬‬
‫•‬
‫בסיס‪/‬חומצה ספציפיים – תגובות בהם הבסיס‬
‫או החומצה בעצמם משתתפים בתגובה (מים)‪.‬‬
‫• בסיס‪/‬חומצה כלליים – הסרה או הוספה של‬
‫פרוטונים לזירוז התגובה‪ ,‬מסייע בבניית‬
‫נוקלאופיל חזק‪.‬‬
‫•‬
‫לעתים קרובות ‪ His‬ישחק את תפקיד הבסיס‬
‫או החומצה‪.‬‬
‫‪5‬‬
‫אסטרגיות של קטליזה‬
‫• ‪ –Catalysis by approximation‬האנזים מאפשר אוריינטציה‬
‫ספציפית אשר מגבירה את הסיכוי להתרחשות ריאקציה‪.‬‬
‫‪6‬‬
‫כימוטריפסין‬
‫פרוטאז = אנזים המקטלז ביקוע של קשרים פפטידים‪ ,‬בתגובת הידרוליזה‪.‬‬
‫שייך למשפחת ‪.serine proteases‬‬
‫למרות שהידרוליזה של קשר פפטידי היא תהליך מועדף תרמודינמית (‪ ,)0<G‬זוהי ריאקציה‬
‫מאוד איטית בהעדר קטליזטור (‪.(Ea>>0‬‬
‫אנזים מתגבר על מכשולים אלו על ידי כך שמספק סביבה ספציפית (האתר הפעיל) שבה‬
‫הריאקציה יכולה להתרחש מהר יותר‪.‬‬
‫‪7‬‬
‫התפקיד הביולוגי של כימוטריפסין‬
‫כימוטריפסין שייך לאנזימי מערכת העיכול‪ .‬מיוצר ומופרש מהלבלב אל המעי הדק‪.‬‬
‫אנזימי העיכול מיוצרים בלבלב כ ‪ zymogens‬שהם פרקורסורים לא‪-‬פעילים שהופכים‬
‫לאנזימים פעילים רק כאשר מגיעים לאתר הפעולה שלהם במעי הדק‪.‬‬
‫‪8‬‬
‫הביקוע הספציפי בשרשרת הפפטידית של כימוטריפסינוגן גורם‬
‫לשינוי קונפורמציה שחושף את האתר הפעיל של האנזים‪.‬‬
‫שלוש השרשראות הפפטידיות המרכיבות את האנזים הפעיל‬
‫מחוברות זו לזו באמצעות קשרים דיסולפידיים‪.‬‬
‫צהוב – קשרים דיסולפידיים‬
‫‪9‬‬
‫הסובסטרט‬
‫לכימוטריפסין יש העדפה‬
‫ברורה לביקוע קשר פפטידי‬
‫אחרי שייר נפחי והידרופובי‪.‬‬
‫כימוטריפסין מבקע באופן סלקטיבי את הקשר הפפטידי בקצה ’‪ C‬של חומצות האמינו‬
‫הארומטיות‪.‬‬
‫כיס הקישור ההידרופובי אחראי לספציפיות של האנזים לסובסטרט‪.‬‬
‫‪10‬‬
‫המבנה של כימוטריפסין‬
‫אתר הקישור‬
‫ירוק –כיס הקישור בו יושב השייר הצידי של‬
‫החומצה האמינית הארומטית‬
‫אדום – חומצות האמינו המרכיבות את האתר‬
‫הפעיל‪.‬‬
‫חלבון גלובולרי‪ ,‬מבנה שניוני שרובו בקונפורמצית ‪ .β‬שלוש שרשראות‬
‫מחוברות בקשרים דיסולפידים‪.‬‬
‫‪11‬‬
‫ניסוי של הרטלי וקילבי משנת ‪:1954‬‬
‫‪Burst phase‬‬
‫כימוטריפסין פועל ב‪ 2-‬שלבים‪ .‬קטליזה קוולנטית‪.‬‬
‫‪+ X +B‬‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫‪+‬‬
‫‪X‬‬
‫‪A‬‬
‫‪X‬‬
‫‪+‬‬
‫‪B‬‬
‫‪A‬‬
‫‪12‬‬
‫תוצאות ניסוי זה היוו חלק מההוכחות לקיומו של תוצר הביניים אציל‪-‬אנזים קוולנטי‪.‬‬
‫הריאקציה מתחילה בקצב מהיר שאחריה התמתנות של הקצב‪ .‬שלב הקצב המהיר ( ‪burst‬‬
‫‪ )phase‬משקף את האצילציה המהירה שעוברות כל מולקולות האנזים (משוחררת כמות‬
‫ניטרופנול כמעט מקבילה סטוכיומטרית לכמות האנזים) והקצב עבור ערך ה ‪ turnover‬של‬
‫האנזים מוגבל ע"י שלב הדה‪-‬אצילציה האיטי‪.‬‬
‫‪13‬‬
‫מנגנון הפעולה של כימוטריפסין‬
‫תוצר ביניים קוולנטי ‪-‬‬
‫שלב האצילציה (‪ - )acylation phase‬ביקוע הקשר הפפטידי ויצירת קשר אסטרי בין‬
‫הפחמן הקרבונילי של הפפטיד והאנזים (יצירת אציל‪-‬אנזים קוולנטי שהוא תוצר ביניים‬
‫זמני)‪.‬‬
‫שלב הדה‪-‬אצילציה (‪ – )deacylation phase‬הידרוליזה של הקשר האסטרי ורגנרציה‬
‫של האנזים‪.‬‬
‫‪14‬‬
‫מנגנון הפעולה של כימוטריפסין ‪ -‬מפורט‬
‫שלב האצילציה (‪)acylation phase‬‬
‫אתר הקישור ההידרופובי קובע את הספציפיות של כימוטריפסין‪.‬‬
‫‪15‬‬
‫הנוקליאופיל בשלב האצילציה הוא אטום החמצן של ‪ .Ser195‬ה ‪ pKa‬של ההידרוקסיל של‬
‫סרין בד"כ גבוה מכדי שהצורון המיונן יהיה נוכח ב ‪ pH‬פיזיולוגי‪ ,‬אולם הסביבה הכימית‬
‫של ‪ Ser195‬בכימוטריפסין גורמת להנמכת ה ‪ pKa‬שלו‪.‬‬
‫כיצד?‬
‫‪The catalytic triad‬‬
‫‪16‬‬
The catalytic triad
17
‫שלב ‪ – 1‬הסובסטרט נקשר לאנזים‪ Ser195 .‬מעביר פרוטון ל ‪ His57‬ומבצע התקפה‬
‫נוקליאופילית על הפחמן הקרבונילי של הסובסטרט‪.‬‬
‫מתקבל תוצר ביניים טטרהדרלי קצר‪-‬חיים שבו יש מטען שלילי על החמצן הקרבונילי של‬
‫הסובסטרט‪ .‬מטען זה מיוצב ע"י קשרי מימן ב “‪."oxyanion hole‬‬
‫‪18‬‬
‫שלב ‪ – 2‬חוסר יציבות של המטען השלילי על החמצן הקרבונילי מוביל לפירוק תוצר‬
‫הביניים‪ .‬יצירה מחדש של הקשר הכפול עם הפחמן מחליפה את הקשר בין הפחמן וקבוצת‬
‫האמינו של הקשר הפפטידי וכך נשבר הקשר הפפטידי‪.‬‬
‫נוצר אציל‪-‬אנזים‪.‬‬
‫קבוצת האמינו עוברת פרוטונציה ע"י ‪.His57‬‬
‫‪19‬‬
‫שלב ‪– 3‬‬
‫אמין השתחרר מהאנזים‪.‬‬
‫‪20‬‬
‫שלב הדה‪-‬אצילציה (‪)deacylation phase‬‬
‫שלב ‪ – 4‬מולקולת מים נכנסת דרך‬
‫קשר מימן עם ‪ .His57‬מולקולת המים‬
‫עוברת דה‪-‬פרוטונציה (‪ His57‬מקבל‬
‫פרוטון)‪ .‬יון ההידרוקסיד תוקף את‬
‫הקשר האסטרי של האציל‪-‬אנזים‪.‬‬
‫תוצר ביניים טטרהדרלי נוצר‪ .‬מטען‬
‫שלילי על חמצן קרבונילי מיוצב על‬
‫ידי קשרי מימן ב “‪."oxyanion hole‬‬
‫‪21‬‬
‫שלב ‪ – 5‬חוסר יציבות מוביל לפירוק תוצר הביניים‪ Ser195 .‬משתחרר‪ His57 .‬עובר דה‪-‬פרוטונציה‬
‫ומעביר פרוטון ל ‪.Ser195‬‬
‫‪22‬‬
‫שלב ‪ – 6‬קומפלקס אנזים‪-‬תוצר (‪.)EP‬‬
‫‪23‬‬
‫בשלב ‪ 7‬התוצר משתחרר מהאתר הפעיל‬
‫כך שהאנזים מוכן שוב לפעולה‪.‬‬
‫‪24‬‬
‫מנגנון הפעולה של כימוטריפסין מדגים עקרונות קטליטיים המצויים בשימוש ע"י‬
‫אנזימים רבים‪:‬‬
‫‪ – Covalent catalysis‬האתר הפעיל מכיל קבוצה ריאקטיבית‪ ,‬בד"כ נוקלאופיל‬
‫חזק‪ ,‬שבמהלך הקטליזה עובר מודיפיקציה קוולנטית זמנית‪.‬‬
‫בכימוטריפסין – יצירת אציל‪-‬אנזים‪.‬‬
‫‪ – General acid-base catalysis‬מולקולה אחרת מ ‪ H2O‬משמשת בתפקיד‬
‫‪.proton donor/acceptor‬‬
‫בכימוטריפסין ‪ His57 -‬תיפקד כבסיס בשלבים מסוימים וכחומצה בשלבים אחרים במהלך‬
‫הריאקציה‪.‬‬
‫‪25‬‬
‫שאלה ‪:1‬‬
‫להלן פרוטאזות הדומות לכימוטריפסין‪ .‬נתונים אתרי הקישור של שתיים מהן‪ ,‬נסו לנחש מה‬
‫יהיה אופי הסובסטרטים של כל אחת מהן‪:‬‬
‫כימוטריפסין קושר בעיקר חומצות אמינו הידרפוביות גדולות (ארומטיות)‪ ,‬כפי שרואים יש לו‬
‫כיס קישור גדול‪ .‬טריפסין חותך אחרי שיירים טעונים חיובית (ליזין וארגינין) בעוד אלסטאז‬
‫חותך אחרי שיירים קטנים‪.‬‬
‫‪26‬‬
‫שאלה ‪2‬‬
‫במחקר נעשתה מוטציה ב ‪ Asp102‬בכימוטריפסין‬
‫ל ‪ Asn‬והוחלט לבדוק את הפעילות של האנזים המוטנט‪.‬‬
‫מה יהיה ההבדל בערכי ‪ Km‬ו‪ kcat -‬בין האנזים המוטנט ל‪?WT-‬‬
‫תשובה‬
‫היות ש ‪ Asp102‬משתתף ב‪ catalytic triad-‬היכולת של האנזים ליצור נוקלאופיל חזק‬
‫יותר תקטן‪ ,‬ולכן גם שלב האצילציה וגם שלב הדה‪-‬אצילציה יהיו איטיים יותר‬
‫כך ש ‪ kcat‬יהיה נמוך בהרבה‪.‬‬
‫עם זאת‪ ,‬לא ניתן לקבוע לגבי ‪ Km‬בצורה ודאית היות שאנו לא יודעים איזה מהשלבים‬
‫יואט בצורה משמעותית יותר‪.‬‬
‫‪27‬‬
‫שאלה ‪: 3‬‬
‫הריאגנט )‪ Tosyl-l-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK‬מעכב באופן ספציפי כימוטריפסין‬
‫על ידי קישור קוולנטי ל ‪His57‬‬
‫א‪ .‬ציינו מדוע המעכב ספציפי עבור כימוטריפסין‪.‬‬
‫ב‪ .‬הציעו ריאגנט‪ ,‬בהתבסס על מבנה ‪ TPCK‬שעשוי להיות מעכב יעיל של טריפסין‪.‬‬
‫‪TPCK‬‬
‫פתרון‪:‬‬
‫א‪ TPCK .‬ספציפי לכימוטריפסין היות והטבעת הפנילית של ‪ Phe‬עוברת אינטראקציה יעילה עם כיס‬
‫הקישור של האתר הפעיל של כימוטריפסין‪ .‬כך קבוצת הכלורומתיל מוצבת במיקום המאפשר הגבה עם‬
‫‪His57‬‬
‫טריפסין‪.‬‬
‫ב‪ .‬החלפה של שייר ה ‪ Phe‬ב ‪ TPCK‬בארגינין או ליזין תיצור ריאגנטים שיהיו ספציפיים לעיכוב‬
‫‪28‬‬
‫שאלה ‪4‬‬
‫כאשר כימוטריפסין מפרק סובסטרט מסוים ‪ ,X‬לא נמדד שלב ‪ burst‬והריאקציה מתנהגת‬
‫בצורה לינארית לכל אורכה‪ .‬מה ההסבר הסביר ביותר?‬
‫א‪ .‬כימוטריפסין מפרק את התוצר באסטרטגיה של חומצה ובסיס כלליים ואין תוצרי‬
‫ביניים בתגובה‪.‬‬
‫ב‪ .‬הסובסטרט המדובר מתפרק בצורה דומה כמו בניסוי של הרטלי וקילבי אך התוצר‬
‫אשר אותו "רואים" בניסוי הוא התוצר השני שמשתחרר‪.‬‬
‫ג‪ .‬שלב יצירת האציל‪ -‬אנזים הוא שלב קובע המהירות ושלב פירוק האציל‪-‬אנזים הוא‬
‫השלב המהיר‪.‬‬
‫ד‪ .‬כימוטריפסין אינו מסוגל לפרק את קומפלקס האציל‪-‬אנזים במקרה של פירוק‬
‫סובסטרט ‪.X‬‬
‫תשובה ב נכונה מבחינה עקרונית‪ ,‬אך היא מתארת טעות של הנסיין‪.‬‬
‫תשובה ג נותנת הסבר ביולוגי‬
‫‪29‬‬
‫שאלה ‪5‬‬
‫איזה משפט הוא הנכון ביותר לגבי השלשה הקטליטית של כימוטריפסין?‬
‫א‪ .‬שלושת השיירים משמשים בתגובה כחומצות או בסיסים כלליים‪.‬‬
‫ב‪ .‬סרין ‪ 195‬משתתף בתגובה וקושר קוולנטית את השייר של היסטידין ‪ 57‬ולכן התגובה‬
‫נחשבת כקטליזה קוולנטית‪.‬‬
‫ג‪ .‬סרין ‪ 195‬אשר בדר" כ מהווה נוקלאופיל חלש משמש כנוקלאופיל חזק בריאקציה‬
‫בכימוטריפסין‪.‬‬
‫ד‪ .‬אספרטאט ‪ 102‬משמש גם נוקלאופיל וגם אלקטרופיל בריאקציה‪.‬‬
‫ג‬
‫‪30‬‬