1. No category

‫שיעור ‪ :12‬מסלולי השיעתוק‬
‫‪95‬‬
‫שיעור ‪ :12‬מסלולי השיעתוק‬
‫המרצה‪ :‬פרופסור לילי ורדימון‬
‫תהליך השיעתוק – הקדמה‬
‫תהליך זה מעביר מידע מה‪ DNA-‬אל מולקולות ‪ ,RNA‬ויש להתמקד בשלושה מסלולים‪:‬‬
‫•‬
‫שיעתוק ממולקולות ‪ DNA‬למולקלות ‪.RNA‬‬
‫•‬
‫זיהוי גנים המיועדים לשיעתוק – שיעתוק לא מתרחש לכל אורך מולקולות ה‪ ,DNA-‬בניגוד‬
‫לשכפול‪ ,‬וכולל זיהוי ספציפי של גנים כאשר המערכת יודעת היכן בתוך מולקולת ה‪ DNA-‬הארוכה‬
‫מתחילים הגנים והיכן הם מסתיימים‪.‬‬
‫•‬
‫בקרת תהליך השיעתוק – סוגיה המתייחסת לעובדה שלא כל הגנים באורגניזם רב תאי מבוטאים –‬
‫בצורת ‪ RNA‬וחלבון – בכל התאים‪ .‬הביטוי הסלקטיבי ובקרת השיעתוק מקנים את השונות שבין‬
‫התאים‪ .‬באורגניזם שמתחיל מתא מופרה אחד מתקיים תהליך התפתחות עוברית והתמיינות ליצירת‬
‫תאים שונים באופן ברור ומובהק – ביוכימית כמו גם מורפולוגית ופונקציונאלית – המתאפשרת על‬
‫ידי ביטוי סלקטיבי של גנים ודגמי ביטוי שונים של גנים‪.‬‬
‫מתוך אלו עולות השאלות כיצד מערכת השיעתוק מזהה גנים ואיך נקבעת בקרת השיעתוק והתרגום‬
‫בכל סוג תא? במשך שנים סברו שהמנגנון‪ ,‬במהלך ההתמיינות בהתפתחות העוברית‪ ,‬מלווה בשינוי ב‪-‬‬
‫‪ – DNA‬דהיינו איבוד של ‪ .DNA‬לימפוציטים יאבדו את כל הגנים שמקודדים לנוירוטרסמיטורים ותאי‬
‫נוירוון יאבדו את הגנים האחראים לסינטזת נוגדנים במהלך התמיינותם; פעולה זו תבטיח ביטוי סלקטיבי‬
‫של גנים‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬השערה זו הוכחה כטעות‪.‬‬
‫תאים ממויינים מכילים את האינפורמציה הגנטית ליצירת אורגניזם שלם‬
‫בניסוי הבא‪ ,‬אספו ביצים בלתי‪-‬מופרות של צפרדע )הפלואידיות שלא מתפתחות לאורגניזם שלם(‬
‫והקרינו אותן ב‪ UV-‬להריסת הגנום‪ .‬מגדלים תרבית תאי‪-‬עור ממויינים של צפרדע בוגרת ובצורה פיזית‪,‬‬
‫במחט‪ ,‬הוציאו מתוכם את הגרעין והשתילו אותו בביצית חסרת הגרעין‪ .‬תהליך זה מאפשר לביצית –‬
‫שללא השתלת גרעין מתה בתוך זמן קצר – להתחיל להתחלק‪ ,‬להתמיין וליצור אורגניזם שלם – ראשן‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪96‬‬
‫ניסויים אלו נעשו בשנות ה‪ 50-‬והראו שיש לתא ממויין – תא עור – כל הפוטנציאל והאינפורמציה‬
‫הגנטית כדי ליצור אורגניזם שלם )תאי מוח‪ ,‬כבד ושאר הרקמות בגוף(‪ .‬מכאן שאין דגרדציה של‬
‫החומר הגנטי עם ההתמיינות‪ .‬תוצאות דומות התקבלו מאוחר יותר גם בתאי צמחים בהם הושתלו תאי‬
‫שורש מגזר וגידולם בתנאים מתאימים המשרים התחלקות עוברית על תאי השורש שיוצרת את כל‬
‫הרקמות החיוניות של הצמח‪.‬‬
‫בשנים האחרונות ניסויים שתומכים בתיאוריה זו נעשו גם ביונקים – מה שמוכיח שהטענות אינן מוגבלות‬
‫ליצורים נחותים או מוגבלים יותר‪ .‬הניסויים – ניסויי שיבוט – נעשים באופן הבא‪:‬‬
‫•‬
‫אוספים ביציות שאינן מופרות )במצב הפלואידי‪ ,‬בשלב המיוטי בו קל להוציא את החומר הגנטי(‬
‫מיונק )למשל פרה(‪ .‬מקרינים אותן ויוצרים במבחנה ביציות חסרות גרעין‪.‬‬
‫•‬
‫לוקחים תאים אפיתליאלים מאותו סוג אורגניזם )אך פרט אחר‪ ,‬עדיף בעל פנוטיפ שונה( ומניחים‬
‫אותו בסמיכות לביצית‪.‬‬
‫•‬
‫בעזרת זרם חשמלי מעודדים איחוי בין שני התאים – הביצית חסרת הגרעין והאפיתל – המאפשר‬
‫החדרת הגרעין הדיפלואידי של האפיתל אל הביצית‪ .‬ההחדרה של הגרעין מאפשר לביצית לעבור‬
‫תהליך התפתחות עוברית ליצירת אורגניזם שלם‪.‬‬
‫•‬
‫הביצית מושתלת בפרה פונדקאית )עדיף מזן שלישי( הממליטה בסופו של דבר עגל שתכונותיו‬
‫דומות לתכונות הגרעין הנתרם – תאי הפרה שתרמה את האפיתל ולא תכונות הפרה שתרמה את‬
‫הביצית‪.‬‬
‫ה‪ DNA-‬השלם בתא הממויין אינו זהה לחלוטין לזה של תא עוברי מבחינות שונות – הטלומרים שלו קצרים‬
‫יותר‪ ,‬יש לו מודיפיקציות שונות שמבקרות את הביטוי וכדומה‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬לצורך הפשטה ניתן להתייחס‬
‫אליהם כזהים‪ .‬בנוסף לא כל תא יכול להיות תורם גרעין – תאי המערכת החיסונית באמת עוברים איזושהי‬
‫דגרדציה של גנים מסויימים נוסף על קיצור הטלומרים‪.‬‬
‫בדיקת מולקולות החלבון בג'ל דו‪-‬מימדי‬
‫טביעת חלבונים שונה היא הביטוי הראשון במעלה לשונות בין תאים‪ .‬ניסויים המשתמשים בג'ל דו‪-‬מימדי‬
‫מאפשרים להראות את השונות שבין התאים‪.‬‬
‫הג'ל הדו‪-‬מימדי הוא הרצה כפולה של חלבונים – ההרצה הראשונה היא במימד המפריד בין חלבונים‬
‫בעלי נקודות איזואלקטרויות שונות )גרדיינט ‪ (pH‬וההרצה השנייה היא במימד המפריד בין חלבונים‬
‫בעלי משקלים שונים )‪.(SDS-PAGE‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :12‬מסלולי השיעתוק‬
‫‪97‬‬
‫בצורה זו מתקבלת "טביעת אצבעות" של חלבוני הרקמה – הממיינת את החלבונים לפי מטען אינטרינזי‬
‫ולפי מסה‪ .‬הנקודות על פני הג'ל הן החלבונים‪ ,‬כאשר ההפרדה היא ברזולוציה מספיק גבוהה להבדיל בין‬
‫חלבונים שנבדלים אפילו בחומצת אמינו בודדת‪.‬‬
‫הנקודות המתקבלות בטביעת האצבעות משתנות‬
‫בנפחן כתלות כרמות הביטוי של כל חלבון – ככל‬
‫שהנקודה גדולה יותר‪ ,‬הביטוי רב יותר‪.‬‬
‫בצורה זו ניתן להריץ חלבונים שהופקו משתי רקמות‬
‫שונות ולהשוות בין הג'לים הדו‪-‬מימדיים המתקבלים‬
‫מכל רקמה‪ .‬את ההבדלים בטביעות האצבעות של‬
‫החלבונים ניתן לנתח כהבדלים בביטוי החלבונים בין‬
‫הרקמות‪ .‬את הנקודות ניתן פיזית להוציא מהג'לים‪,‬‬
‫להפיק ולרצף את החלבון ולזהות מהם החלבונים‬
‫המהווים את ההבדלים‪.‬‬
‫באנליזות כאלו נראה שיש חלבונים רבים משותפים בין‬
‫הרקמות אך גם חלבונים ייחודיים לכל רקמה‪ .‬ההבדל‬
‫בדגם החלבונים יכול לנבוע מהבדלים בשיעתוק של‬
‫הגנים ויכול להיות גם שה‪ mRNA-‬מצוי בשתי הרקמות‬
‫אך מבוקר ברמת התרגום‪.‬‬
‫בקרה ברמת השיעתוק‬
‫אחת הדרכים לבדוק האם מדובר בבקרת שיעתוק או‬
‫תרגום היא בעזרת מיקרואראי –‬
‫לוקחים ‪ RNA‬משתי רקמות ממויינות‬
‫שונות‪ ,‬ממצים אותו מהרקמה ויוצרים‬
‫ממנו ‪ cDNA‬בעזרת ‪.RT‬‬
‫ה‪ cDNA-‬של כל רקמה מסומן בתג‬
‫פלורסנטי‬
‫מסויים‪,‬‬
‫לאחר‬
‫הסימון‬
‫מערבבים את שני התוצרים יחד‬
‫במבחנה ועושים להם היברידיזציה על‬
‫גבי צ'יפ עשוי זכוכית עליה מודבקות‬
‫פיסות ‪ DNA‬המייצגות את כל ‪30,000‬‬
‫הגנים ההומנים‪ ,‬כאשר מיקום כל גן‬
‫ידוע‪.‬‬
‫את התערובת של ה‪ DNA-‬האדום‬
‫והירוק מדגירים בצ'יפ ופיסות ה‪ cDNA-‬עוברות היברידיזציה עם ה‪ DNA-‬של הצ'יפ‪ .‬לאחר השטיפה‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪98‬‬
‫מפיסות שלא נקשרו‪ ,‬ניתן לנתח את הצ'יפ במכשיר המקרין קרני לייזר באורכים מתאימים ולראות היכן‬
‫יש גנים המתבטאים רק ברקמה שסומנה באדום‪ ,‬רק ברקמה שסומנה בירוק או בשתיהן יחד )צהוב(‪.‬‬
‫•‬
‫•‬
‫בניסויים אלו ניתן לראות שהשוני בין החלבונים מקורו לרוב בהבדל בביטוי של ‪ – RNA‬כלומר‬
‫גנים שהשיעתוק שלהם ברקמה האחת נמוך מאוד או מושתק כליל לעומת ברקמה האחרת‪.‬‬
‫כמו כן רמות השיעתוק מבקרות את הכמות – ככל שיש יותר ‪ mRNA‬יש יותר חלבון או יכולים‬
‫להיות קצבי תרגום שונים‪.‬‬
‫בקרת השיעתוק באאוקריוטים‬
‫בחיידקים‪ ,‬מולקולות ‪ mRNA‬הן בעלות זמן מחצית חיים קצר – מתפרקות בתוך דקות ספורות על ידי‬
‫מנגנון דגרדציה מהירה‪ .‬עובדה זו מאפשרת לבקר בקלות את דגם הביטוי של הגנים‪ ,‬תכונה המתאימה‬
‫לסביבה הדינמית של תאים פרוקריוטים‪ .‬בקרה ברמת השיעתוק יעילה אם ה‪ mRNA-‬הינו קצר חיים‪.‬‬
‫סיבה נוספת לכך שרוב הבקרה הפרוקריוטית היא בשיעתוק היא העובדה שקיים צימוד בין שיעתוק‬
‫לתרגום – מיד עם יצירת ה‪ RNA-‬הריבוזומים נצמדים אליהן ועוד לפני שהסינטזה השיעתוקית מסתיימת‬
‫כבר מתחיל התרגום‪ .‬כמעט ואין מנגנונים לבקרה ברמת התרגום‪.‬‬
‫בניגוד לכך‪ ,‬בתאים אאוקריוטים יש הפרדה פיזית בין תרגום לשיעתוק מבחינת מדורי התרחשות‬
‫התהליכים‪ .‬מולקולות ‪ mRNA‬אאוקריוטיות עוברות תהליכי עיבוד – שיחבור‪ ,‬פוליאדנילציה וקאפינג‬
‫– כמו גם העברה מהגרעין לציטופלזמה‪ .‬רק לאחר המעבר לציטופלזמה יכול להתחיל התרגום‪.‬‬
‫העובדה שיש בתהליך כל כך הרבה שלבים מאפשרת רמות שונות של בקרה‪ .‬עם זאת‪ ,‬הדרך היעילה‬
‫ביותר לבקר את הביטוי היא עדיין ברמת השיעתוק‪ ,‬שכן זוהי הבקרה החסכונית ביותר – כל תהליך‬
‫עיבוד ה‪ mRNA-‬והשמירה עליו דורש אנרגיה ברמה כזו שמשתלם יותר לבקר את התהליך עוד באיבו‪.‬‬
‫הבקרה האאוקריוטית היעילה ביותר היא בשיעתוק אך לא רק‪ ,‬להבדיל מרוב הגנים הפרוקריוטים‪.‬‬
‫תהליך השיעתוק‬
‫באיור הבא ניתן לראות את תהליך השיעתוק‪ :‬מולקולת ‪ DNA‬נפרשת באיזור גן מסויים‪ ,‬חלבון ‪RNA-‬‬
‫‪ Polymerase‬מזהה את אתר השיעתוק ומתחיל בפרימה של האיזור‪ .‬ב‪ E.coli-‬הפרימה היא בגודל ‪17‬‬
‫זוגות בסיסים‪ .‬היא יוצרת פיתולי על חיוביים ושלילייים בהמשך‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :12‬מסלולי השיעתוק‬
‫‪99‬‬
‫מולקולת הפולימראז בוחרת את הגדיל שיעבור‬
‫שיעתוק ותמיד באותה בועת שיעתוק פרומה נמצא‬
‫גדיל יחיד בלבד – לעולם אין שיעתוק מקביל של‬
‫שני הגדילים‪ .‬השיעתוק הוא פולרי‪ ,‬בעל כיווניות‬
‫מוגדרת מקצה '‪ 5‬אל '‪ – 3‬בדומה לתהליך‬
‫הרפליקציה של ‪ .DNA‬גם כאן התהליך דומה‬
‫בכלליו לתהליך הרפליקציה‪.‬‬
‫אבני הבניין‬
‫הדמיון מתחיל בעובדה שאבני הבניין של ‪ RNA‬דומות לאלו של ‪ – DNA‬הנוקליאוטידים של ה‪RNA-‬‬
‫זהים למעט שני שינויים מהותיים‪:‬‬
‫•‬
‫הסוכר הוא ריבוז המכיל ‪) '2-OH‬ב‪ DNA-‬יש דיאוקסיריבוז עם ‪.('2-H‬‬
‫•‬
‫במקום הפירמידין טימין נעשה שימוש בפירמידין אורציל‪.‬‬
‫סינטזה של ‪RNA‬‬
‫בדומה לסינטזת ‪ RNA ,DNA‬נוצר בהעתקת תבנית קיימת שהיא לרוב ‪ DNA‬לפי חוקי ווטסון‪-‬קריק‬
‫תוך יצירת גוף קומפלמנטרי‪ .‬הצמיחה של הגדיל פולרית מכיוון '‪ 5‬ל‪.3'-‬‬
‫באיור נראה גדיל ‪ DNA‬המשמש תבנית ליצירת ה‪-‬‬
‫‪ RNA‬ומולו גדיל ה‪ RNA-‬הגדל באופן כיווני‪.‬‬
‫הנוקליאוטיד המוסף מצטרף לפי חוקי ווטסון‪-‬קריק‪,‬‬
‫כאשר אורציל מחליף את הטימין בזיווג לאדנין‪.‬‬
‫ההידרוקסיל בקצה '‪ 3‬מוחלף תוך יצירת קשר‬
‫לפוספט בקצה '‪ 5‬של הנוקליאוטיד הבא‪.‬‬
‫‪-RNA‬פולימראז‬
‫אנזים הפילמור של ‪ RNA‬מזהה את נקודת תחילת הגן שאותו יש לשעתק; התבנית המתאימה נבחרת‬
‫ומבוססת על הכיווניות של הגדילים – הפולאריות של הפולימראז‪ ,‬הקובעת את כיוון התקדמות האנזים‪,‬‬
‫קובעת שהסינטזה תהיה מ‪ 5'-‬ל‪ 3'-‬ולכן הגדיל המשועתק יהיה אנטי‪-‬מקביל – הולך מ‪ 3'-‬ל‪.5'-‬‬
‫תהליך הסינטזה אינו צורך אנרגיה וקשור בשינוי קונפורמציה וזיהוי אתר התחלת השיעתוק של הגן‪.‬‬
‫הנוקליאוטיד הראשון המצורף הוא היחיד ששומר את שלושת הפוספטים שבקצהו‪ .‬כל השאר‬
‫מאבדים פירופוספט‪ ,‬אשר מתפרק בהמשך לשני פוספטים אנאורגניים – תהליך המשחרר אנרגיה שהיא‬
‫הכוח המניע )בהסטת שיווי משקל( לסינטזת מולקולת ה‪.RNA-‬‬
‫בבועת השיעתוק יש רק גדיל אחד שהוא התבנית; בחירת התבנית היא פועל יוצא של כיוון ההתקדמות‬
‫של הפולימראז‪ .‬הגדיל שאינו משמש כתבנית הוא ‪ coding strand‬או ‪ .non-template strand‬גדיל‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪100‬‬
‫התבנית הוא ה‪ non-coding strand-‬או ‪.sense‬‬
‫יחד עם זאת‪ ,‬הגדיל הלא‪-‬תבניתי הינו בעל רצף‬
‫זהה לזה של ה‪ – RNA-‬כי שניהם גדילים‬
‫קומפלמנטרים לרצף ה‪ .sense-‬מסיבה זו‪ ,‬רצף זה‬
‫משמש לניתוח של רצף ה‪.RNA-‬‬
‫האיזור ב‪ DNA-‬שהולך מ‪ 3'-‬ל‪ 5'-‬יהיה גדיל‬
‫התבנית‪ .‬הגדיל הקומפלמנטרי הוא גדיל הקוד‪,‬‬
‫מכיוון שהוא זהה ל‪.RNA-‬‬
‫גדיל הקידוד יכול להיות גדיל הקידוד של הגן‬
‫שהתבנית שלו נמצאת מולו בלבד‪ .‬גדיל קידוד של גן‬
‫אחד יכול להיות גדיל לא‪-‬מקודד של גן אחר – אם‬
‫הקריאה של הגן האחר היא בכיוון ההפוך‪ ,‬אזי היא‬
‫תהיה על הגדיל הנגדי‪ ,‬כלומר הגדיל שהיה עד כה‬
‫גדיל הקידוד‪ .‬באיור ניתן לראות היפוך זה בתפקידים‬
‫בין גנים ‪ a‬ו‪ – b-‬הגנים מקודדים בכיוונים שונים ולכן גם התבניות שלהם נמצאות על גדילים הפוכים‪.‬‬
‫בתמונה הבאה ניתן לראות שני גנים בתהליך שיעתוק כפי שצולמו במיקרוסקופ אלקטרוני‪ .‬הגנים הם‬
‫גנים ל‪ ,rRNA-‬אשר אינו מתורגם לחלבון אלא משמש אבן בניין לריבוזומים‪ .‬הנקודות השחורות לאורך‬
‫הגנים הם הפולימראז מהם יוצאים גדילי ה‪ RNA-‬המתורגמים‪ .‬הנקודה הדגושה בקצה כל מולקולה היא‬
‫כנראה מבנה שניוני של ‪ RNA‬מקופל‪.‬‬
‫ניתן לראות שהגן מתחיל מצד שמאל והכיוון של שני הגנים זהה – לפי אורך הגדילים המסונטזים‪,‬‬
‫הקצרים יותר מצד שמאל מכיוון ששם הפולימראזים רק מתחילים בסינטזה‪ .‬כל "שערה" שיוצאת מה‪-‬‬
‫‪ DNA‬היא מולקולת ‪ RNA‬אחת המסונטזת מפולימראז אחד; אבל ניתן לראות שהפרישה הולכת‬
‫ומתרחבת כשמתרחקים ימינה‪ ,‬כלומר הסינטזה התבצעה יותר זמן ככל שמתקדמים ימינה‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :12‬מסלולי השיעתוק‬
‫‪101‬‬
‫סינטזה של ‪RNA‬‬
‫סינטזת ‪ RNA‬מופקדת בידי פולימראזות‪ .‬ה‪ RNA-‬פולימראז‪ ,‬בניגוד ל‪ DNA-‬פולימראז‪ ,‬יכול ליזום‬
‫גדיל חומצת גרעין חדש ללא תחל‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬השיכפול של שני סוגי הפולימראזות נעשה במנגנונים‬
‫כימיים דומים – התקפה נוקליאופילית ויצירת קשר פוספודיאסטרי המונעת על ידי פירוק פירופוספט‪.‬‬
‫שניהם בונים על תבנית ‪ DNA‬ושניהם יוצרים רצףקומפלמנטרי לפי זיווגי ווטסון‪-‬קריק‪.‬‬
‫ההבדל המרכזי‪ ,‬מעבר לחוסר הצורך בתחל‪ ,‬הוא שבעוד שב‪ DNA-‬פולימראז משכפל את כל הגנום‪,‬‬
‫‪ RNA‬פולימראז מזהה את הגנים הנדרשים לשיעתוק‪ ,‬בכמות ובתזמון הדרושים‪ .‬כמו כן ‪ RNA‬פולימראז‬
‫אינו בעל פעילות נוקליאז המאפשרת הגהה של התוצר – וכתוצאה מכך הוא מבצע יותר שגיאות‪.‬‬
‫תופעה זו לא תוקנה באבולוציה ככל הנראה משום שמולקולות אלו קצרות חיים ואינן מועברות בתורשה‬
‫לתאי הבת עם החלוקה‪.‬‬
‫למרות ש‪ RNA-‬פולימראז לא עסוק בהגהה ותיקונים‪ ,‬הקצב שלו איטי יותר מסינטזת ‪30-50 – DNA‬‬
‫נוקליאוטידים בשנייה לעומת ‪ 800‬נולקיאוטידים בשנייה על ידי ‪ DNA‬פולימראז – קשור ככל הנראה‬
‫בתהליכי עיבוד ‪ RNA‬הממושכים יותר‪.‬‬
‫בבועת שיעתוק משועתק גדיל אחד בלבד‪ ,‬למרות שבוירוסים יכולים להיות שני גנים על גבי אותו מקטע‬
‫‪ – DNA‬כל אחד פונה לצד שני או נמצא במסגרת קריאה שונה‪ .‬הם לא משועתקים בו זמנית אך תכונה‬
‫זו חיונית לאורגניזמים קטנים שאינם יכולים להכיל גנומים ארוכים מאוד כדי למחזר את הגדיל הקיים‬
‫כך שיכיל יותר גנים‪.‬‬
‫דוגמאות כאלו קיימות בעיקר באורגניזמים צפופים כמו וירוסים ואינן שכיחות באורגניזמים מתקדמים יותר‪.‬‬
‫מבנים מרחביים של ‪RNA‬‬
‫מולקולת ה‪ RNA-‬מסוגלת ליצור מבנים שניוניים‬
‫ושלישוניים – החשובים במיוחד לתפקודן של‬
‫מולקולות כמו ‪ tRNA‬או ‪ .rRNA‬האיור הבא מציג‬
‫מבנים שניוניים שונים של ‪ RNA‬האופייניים‬
‫למולקולות אלו – בניגוד למולקולת ‪ DNA‬היוצרת‬
‫תמיד מבנה דו‪-‬סליל‪.‬‬
‫משמאל‪ :‬מבנה שלישוני של ‪ .RNA‬המבנה מבוסס‬
‫על קומפלמנטריות של איזורי בועה חד‪-‬גדיליים‬
‫בקצה אחד ואיזורי בועה אחרת בגדיל כך שנוצר‬
‫מבנה מרחבי המתקפל בצורה תלת מימדית‪.‬‬
‫דוגמה לכך היא מבנה דמוי‪ L-‬הפוכה של מולקולת ה‪-‬‬
‫‪ ,tRNA‬הנגרם עקב הקומפלמנטציות במבנה השניוני‬
‫דמוי התלתן שלה‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪102‬‬
‫סוגי ‪RNA‬‬
‫•‬
‫‪ – mRNA‬הסוג הנדיר ביותר‪ ,‬בעל אורך משתנה ומהווה תבנית ליצירת חלבון‪.‬‬
‫•‬
‫‪ –tRNA‬נושא חומצות אמינו לריבוזומים‪.‬‬
‫•‬
‫‪ – rRNA‬אבני הבניין של הריבוזומים ובעלי תפקיד קטליטי בריבוזום‪.‬‬
‫הטבלה מציגה את תכונות המולקולות ב‪.E.coli-‬‬
‫‪ mRNA‬ניחן בוריאביליות בגודל ושכיחות נמוכה‬
‫בתא; מולקולות ‪ tRNA‬יותר הומוגניות בגודלן‬
‫ומהוות ‪ 16‬אחוזים מה‪ RNA-‬בתא‪ .‬רוב החומר הוא‬
‫‪ ,82% – rRNA‬וגם כאן יש שלושה סוגים של‬
‫גדילים שכל אחד מהם אחיד יחסית בגודלו למרות‬
‫שכל קבוצה נבדלת באורכה מהשנייה‪.‬‬
‫לעומת זאת‪ ,‬בטבלת האאוקריוטים נראה שחלוקת ה‪-‬‬
‫‪ RNA‬מופרדת ל‪ RNA-‬גרעיני לעומת ‪RNA‬‬
‫ציטופלזמטי‪ .‬ה‪ rRNA-‬הגרעיני הוא ‪ RNA‬שזה‬
‫עתה נוצר‪ ,‬ומהווה אחוז מאוד נמוך בגרעין – לעומת‬
‫‪ 71%‬מכלל ה‪ RNA-‬הציטופלזמטי‪ .‬לעומת זאת‬
‫‪ mRNA‬גרעיני )‪ (hnRNA‬נמצא יותר בגרעין‬
‫מאשר בציטופלזמה – הוא ‪-mRNA‬פריקורסור‬
‫שעדיין עובר תהליכי עיבוד שונים ולכן כמותו‬
‫בגרעין גדולה יותר‪ .‬מולקולות ‪ RNA‬קטנות‪ ,‬בעיקר ‪ ,tRNA‬מהוות ‪ .15%‬גם כאן ה‪ mRNA-‬הוא‬
‫בכמות הקטנה ביותר בתאים‪ ,‬דבר המעלה קושי לעיתים בזיהוי מולקולות ‪.mRNA‬‬
‫בסימון של ‪ RNA‬על ידי יורידין רדיואקטיבי‪ ,‬נראה שבפרקי זמן קצרים ה‪ RNA-‬המסומן יהיה בגרעין –‬
‫‪ 39%‬מהם יהיה ‪ 58% ,rRNA‬יהיה ‪ mRNA‬ורק ‪ 3%‬יהיו ‪ .tRNA‬קיים הבדל דרמטי בין כמות ה‪-‬‬
‫‪ mRNA‬המסונטזת לעומת זו הנמצאת בפועל‪ .‬עובדה זו מוסברת על ידי הדגרדציה המהירה מאוד של‬
‫‪ – mRNA‬מולקולות ‪ RNA‬אחרות בעלות אורך חיים ארוך יותר ומולקולות ‪ mRNA‬בעלות אורך‬
‫מחצית חיים קצר על מנת לאפשר בקרה צמודה על הביטוי‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :13‬מסלולי השיעתוק‬
‫‪103‬‬
‫שיעור ‪ :13‬מסלולי השיעתוק‬
‫רצף הקונצנזוס‬
‫קצה החוט להבנת מנגנון זיהוי הגנים של ‪-RNA‬פולימראז התקבל ככל שנאספו יותר רצפים של גנים‬
‫במערכות פרוקריוטיות‪ .‬בהשוואה בין הרצפים נראה שלמרות השוני הגדול ביניהם‪ ,‬אם מעמדים אותם כך‬
‫שנקודת תחילת השיעתוק )המסומנת בתור ‪ (+1‬תהיה בקו אחד‪ ,‬אזי הרצף שנמצא ‪ upstream‬לשיעתוק‬
‫מכיל רצפים בעלי מידה מסויימת של הומולוגיה )מסומנים בצהוב(‪ .‬אחד הרצפים ממורכז בנקודה ‪-10‬‬
‫ומכונה ‪) Pribnow Box‬ע"ש החוקר שמצא אותו( והרצף השני ממורכז בנקודה ‪ .-35‬אם משווים מספר‬
‫גדול מספיק של גנים ניתן להגיע לרצף קונצנזוס של חלק גדול מהגנים המצויים ב‪ .E.coli-‬הרצפים‬
‫מכונים 'רצפי הקונצנזוס של סיגמה‪ '70‬על שם פקטור השיעתוק המזהה אותם‪.‬‬
‫מוטציות ברצפים אלו משפיעות על רמת השיעתוק – בין השאר – של הגן‪ .‬השינוי יכול להיות בשני‬
‫כיוונים‪ :‬ככל שהשינוי הופך את הרצף לדומה יותר לרצף הקונצנזוס השיעתוק ייתגבר וככל שהשינוי‬
‫יפחית בדמיון תיגרר ירידה בשיעתוק‪ .‬מידת הדמיון לרצף הקונצנזוס מכתיבה את עוצמת השיעתוק‬
‫שכן היא מכתיבה את חוזק האפיניות של פקטור השיעתוק לרצף‪.‬‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫באיזור ‪ upstream‬לתחילת השיעתוק ישנם רצפים שמורים‪.‬‬
‫שינויים ברצפים לרוב גורמים לירידה בשיעתוק אבל שינויים מסויימים יכולים לגרום לעלייה‪.‬‬
‫הקביעה האם השינוי ייגרום לירידה או עלייה ניתנת על פי מידת התרחקות הרצף מהקונצנזוס‪.‬‬
‫השימוש של רצפי ההכרה‬
‫ההנחה הראשונה היא שאולי הרצפים האלה קשורים באפיניות של הפולימראז לאיזור תחילת הגן ומשמש‬
‫כאיזור הכרה לפולימראז‪ .‬אולם כיצד ניתן לבדוק זאת?‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪104‬‬
‫אנליזה ביוכימית ל‪ RNA-‬פולימראז הבקטריאלי‬
‫‪ RNA‬פולימראז הוא קומפלקס חלבוני המורכב משתי תת יחידות‪.‬‬
‫ניתן לבדוק האם הוא יודע לקשור מקטע ‪ DNA‬בו ממוקם הרצף‬
‫החשודעל ידי ‪EMSA = Electrophoretic Mobility Shift‬‬
‫)”‪ .Assay (“Gel Shift‬בניסוי זה‬
‫לוקחים את מקטע ה‪ DNA-‬הנבדק‬
‫ומסמנים אותו רדיואקטיבית בקצה‪.‬‬
‫אם‬
‫מריצים‬
‫את‬
‫המקטע‬
‫בג'ל‬
‫פוליאקריל‪-‬אמיד‪ ,‬הוא ירוץ לנקודה‬
‫ספציפית הנקבעת על פי אורכו‪.‬‬
‫אם נדגיר את הגדיל המסומן עם חלבון המסוגל להיקשר אליו ייתקבל ‪ shift‬בריצה – שכן החלבון יכביד‬
‫על הריצה של ה‪ DNA-‬ולכן הקומפלקס ירוץ למרחק קצר יותר מה‪ DNA-‬העירום‪ .18‬אם אכן החלבון‬
‫נקשר‪ ,‬יופיע בנד נוסף‪.‬‬
‫כדי לוודא את ספציפיות הקישור יש לערוך תחרות‪ :‬פעם אחת עורכים את הניסוי בהדגרה של ה‪DNA-‬‬
‫עם חלבון; בנוסף‪ ,‬במבחנות מקבילות‪ ,‬מוסיפים ריכוזים עולים של ‪ DNA‬לא מסומן בעל אותו הרצף של‬
‫איזור הפרומוטור‪ .‬תחרות מסוג זה היא תחרות עם ‪ DNA‬ספציפי‪ .‬כמו כן מריצים עם ‪ DNA‬לא ספציפי‪,‬‬
‫מאיזור אחר בגנום‪.‬‬
‫אם הקישור נעשה עקב זיהוי רצף‪ ,‬רק ה‪ DNA-‬הספציפי יוכל להתחרות והשיפט ייעלם עם העלייה‬
‫בריכוז; ה‪ DNA-‬הלא ספציפי לא יוכל להתחרות‪ .‬אם הקישור יינבע מרצף ‪ DNA‬כלשהו – ללא קשר‬
‫לרצף‪ ,‬עקב תכונת קשירת ‪ DNA‬כללית – במקרה זה שני סוגי התחרויות ייגרמו לדעיכה של הבנד‪.‬‬
‫ניתן לראות באיור שהתחרות הלא‪-‬ספציפית אינה גורמת להיעלמות של הבנד‪ ,‬מכאן שהקישור אכן ספציפי‪.‬‬
‫‪DNase I Footprinting‬‬
‫בשיטה זו לוקחים את פיסת ה‪ DNA-‬עם הרצף שרוצים לברר אם החלבון נקשר אליו‪ .‬מכינים שתי‬
‫מבחנות המכילות ‪ DNA‬מסומן‪ ,‬כאשר רק באחת מוסיפים את החלבון הנבדק‪ .‬השיטה מבוססת על‬
‫פעילות ‪ DNase I‬המסוגל לחתוך ‪ DNA‬באופן בלתי תלוי ברצף‪ .‬כאשר מוסיפים הרבה מהאנזים הוא‬
‫יחתוך את ה‪ DNA-‬לנוקליאוטידים בודדים; ככל שהריכוז ירד‪ ,‬מספר החיתוכים יילך וייקטן‪.‬‬
‫יש לעבוד בריכוז ‪ DNase‬נמוך כך שסטטיסטית יהיה חיתוך אחד בכל מולקולת ‪ .DNA‬בהוספת האנזים‬
‫למבחנה הראשונה והדגרה לזמן מתאים‪ ,‬תתקבל אוכלוסיה מגוונת של גדילים – בתלות במקום האקראי‬
‫בו חתך ה‪ DNase-‬את הגדיל‪ .‬כאשר הגדילים יורצו בג'ל ניתן יהיה לראות סולם פרגמנטים שהמרחק‬
‫ביניהם הוא נוקליאוטיד אחד‪.‬‬
‫‪ 18‬הג'לים צריכים להיות נאטיבים )ג'ל שאינו מכיל דטרגנטים כמו ‪ (SDS‬משום שאלמלא כן הקשר בין החלבון ל‪DNA-‬‬
‫ייפרם‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :13‬מסלולי השיעתוק‬
‫‪105‬‬
‫יחד עם זאת‪ ,‬בהוספת האנזים למבחנה השנייה‬
‫ייתקבל הסולם באופן קטוע – האיזור המוחזק על ידי‬
‫החלבון שלכאורה קושר את ה‪ DNA-‬לא יוכל‬
‫להיחתך על ידי ה‪ .DNase-‬החלבון הקשור ל‪-‬‬
‫‪ DNA‬ממסך אותו מפני האנזים ולא מאפשר‬
‫נגישות לחיתוך‪ .‬איזור החיתוך יהיה מוגבל רק סביב‬
‫החלבון‪ ,‬וההרצה בג'ל תראה את "טביעת הרגל" של‬
‫האנזים – אורכי הנוקליאוטידים שבהם לא ניתן היה‬
‫לחתוך עקב החסימה של החלבון‪.‬‬
‫כאשר עושים את הניסוי עם חלבון ‪ RNA‬פולימראז‬
‫ניתן לראות שתי נקודות מיסוך – האחת סביב ‪-10‬‬
‫והשנייה סביב ‪ ,-35‬המציינות את העקבה של‬
‫הפולימראז ומגיעות במעלה נקודת השיעתוק של גנים‬
‫רבים‪.‬‬
‫מבנה הפרומוטור הבקטריאלי‬
‫הגנים מצויינים על ידי רצפים הממוקמים במעלה‬
‫נקודת השיעתוק בגנום של תאים פרוקריוטים‪.19‬‬
‫האיזור ‪ -10‬עשיר ב‪ A-‬ו‪ .T-‬איזור ‪ -35‬מכילה רצף ספציפי נוסף‪ .‬הם מהווים את איזור הפרומוטור של‬
‫הגן שהוא אתר קישור והכרה של ‪ RNA‬פולימראז‪ .‬המיקום שלו קובע דברים חשובים לגבי השיעתוק‬
‫של הגנים‪ .‬יש לציין כי לא רק הרצף חשוב אלא גם המרחק – שינוי המרחק פוגע בקישור עקב‬
‫בעייתיות בקישור של החלבון על המבנה המרחבי שלו‪ .‬בחלק מהגנים זוהה אלמנט נוסף המשמש לעיתים‬
‫בגנים שהשיעתוק שלהם חזק מאוד‪.‬‬
‫פרומוטור‬
‫הפרומוטור מהווה מקום לקישור של ‪ RNA‬פולימראז‪ .‬מיקום הרצף קובע את נקודת תחילת השיעתוק‬
‫– הזזה של הפרומוטור כולו תזיז את נקודת ‪ +1‬בהתאם‪ .‬מכאן שהפולימראז פותח בשיעתוק במרחק קבוע‬
‫מנקודת העיגון שלו את הכרומוזום‪.‬‬
‫עוצמת הקישור )הנגזרת מהרצף( קובעת מה תהיה יעילות השיעתוק – ככל שהפרומוטור בעל רצפים‬
‫הדומים יותר לרצפי הקונצנזוס‪ ,‬הרצף האופטימלי לקישור הפולימראז‪ ,‬יעילות השיעתוק והקצב יהיו‬
‫גבוהים יותר‪.‬‬
‫‪ 19‬באאוקריוטים העקרונות דומים אך התהליך שונה‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪106‬‬
‫רצף הפרומוטור קובע איזה גדיל ישועתק – שכן הרצף מופיע בצורתו רק על גדיל מסויים ולכן קובע‬
‫את הפולאריות של התיישבות הפולימראז והיא תקבע את הכיווניות של השיעתוק – אופן ההתיישבות של‬
‫הפולימראז מאפשר התקדמות בכיוון מסויים והפולימראז ישעתק את הגדיל אשר הולך מ‪ 3'-‬ל‪ 5'-‬בכיוון‬
‫המתאים לאוריינטציה של הפולימראז שהתיישב‪ .‬מי שמשמש תבנית בפועל הוא הגדיל הנגדי לזה‬
‫שמכיל את הפרומוטור‪ ,‬מכיוון שהגדיל שמכיל את הפרומוטור הוא הגדיל הזהה לגדיל ה‪ ,RNA-‬שהוא‬
‫גדיל ה‪.anti sense-‬‬
‫‪ RNA‬פולימראז‬
‫הפולימראז הוא קומפלקס חלבוני עם מספר תת יחידות‪ .‬בתאים פרוקריוטים הוא משמש לשיעתוק כל‬
‫סוגי ה‪ – RNA-‬להבדיל מהפולימראזות השונים באאוקריוטים המשעתקים סוגי ‪ RNA‬שונים‪ .‬יש לו‬
‫מבנה דמוי אוכף‪ ,‬ה"רוכב" על ה‪.DNA-‬‬
‫לפולימראז יש תת יחידה חשובה בשם סיגמה‪ ,‬החיונית לזיהוי פרומוטורים‪ .‬אילוציה בג'ל תפריד בין‬
‫סיגמה ובין הליבה של הפולימראז‪ .‬הפולימראז המלא‪ ,‬עם הסיגמה מכונה ‪ holoenzyme‬וזה ללא סיגמה‬
‫הוא ‪.core enzyme‬‬
‫כאשר התקבלו המרכיבים השונים ערכו ניסויים שקבעו את קבוע הקישור של ה‪ core-‬או ‪holoenzyme‬‬
‫לשני סוגי ‪:DNA‬‬
‫•‬
‫‪ DNA‬עם רצף כלשהו;‬
‫•‬
‫‪ DNA‬עם רצף של פרומוטור‪.‬‬
‫כשעשו את ניסויי הקישור נמצאו הדברים הבאים‪:‬‬
‫•‬
‫כאשר משתמשים ב‪ ,core enzyme-‬אין הבדל בקישור בין שני סוגי ה‪ – DNA-‬הוא לא מבחין‬
‫ברצפים ונוכחות הפרומוטור לא משנה את האפיניות‪ .‬האפיניות הכללית של הליבה ל‪ DNA-‬חזקה‬
‫מאוד אבל אינה ספציפית‪.‬‬
‫•‬
‫מנגד‪ holoenzyme ,‬הינו בעל קבועי קישור שונים לחלוטין בין הפרומוטור לרצף רנדומלי‪ :‬הקישור‬
‫לפרומוטור חזק בסדר גודל אחד מאשר קישור ה‪ ,core enzyme-‬בעוד שהקישור לרצף אקראי של‬
‫‪ DNA‬חלש כמעט בארבעה סדרי גודל‪ .‬ההולואנזיים נקשר חזק מאוד לפרומוטור וחלש מאוד‬
‫לרצף אקראי‪.‬‬
‫על סמך קישורים אלו הוצע המודל להכרה‪ ,‬אשר מאוחר יותר הוכח באמצעים מולקולריים שונים‪:‬‬
‫•‬
‫‪ RNA‬פולימראז על כל תת יחידותיו נקשר באופן אקראי בנקודה כלשהי ל‪.DNA-‬‬
‫•‬
‫הקישור שלו לרצף שאינו פרומוטור חלש ולכן הוא מסוגל לנוע לאורך ה‪ DNA-‬ולסרוק אותו‪.‬‬
‫•‬
‫ברגע שהוא מגיע לאיזור של פרומוטור‪ ,‬בגלל האפיניות החזקה המוקנית על ידי הסיגמה פקטור‪ ,‬יש‬
‫שינוי בקישור ובקונפורמציה הגורם לפתיחה ספונטנית של בועת השיעתוק – פרימה של ה‪DNA-‬‬
‫שאינה דורשת אנרגיה ונובעת משינוי הקונפורמציה של הפולימראז‪.‬‬
‫•‬
‫פתיחת הבועה מעוררת תחילת זיהוי גדיל התבנית ותהליך הוספת נוקליאוטידים ליצירת ‪.RNA‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :13‬מסלולי השיעתוק‬
‫•‬
‫‪107‬‬
‫לאחר יצירת כ‪ 8-‬נוקליאוטידים במולקולת ה‪ ,RNA-‬משתחרר פקטור סיגמה‪ .‬השחרור מוריד את‬
‫האפיניות של הקישור‪ .‬כעת פקטור סיגמה חופשי להיקשר לאנזים ליבה חופשי ואנזים הליבה‬
‫הקשור‪ ,‬ללא הפקטור‪ ,‬ממשיך בהארכה של שרשרת ה‪.RNA-‬‬
‫מבנה ותפקוד של תת היחידות‬
‫תת היחידות השונות בעלות תפקידים שונים באיניציאציה‪ ,‬אלונגציה וכדומה של של תהליך השיעתוק‪.‬‬
‫פקטור סיגמה היא תת היחידה שמזהה ונמצאת במגע ישיר עם רצפי הפרומוטור; ל‪ RNA-‬פולימראז יש‬
‫כיווניות קישור הנובעת מהמיקום היחסי של ‪ -10‬ל‪ ,-35-‬הקובעת את כיוון השיעתוק והגדיל שישמש‬
‫בתור תבנית‪.‬‬
‫בקרת האיניציאציה‬
‫הבקרה הבסיסית ביותר נעשית על ידי פקטור סיגמה; קיימים סוגים שונים של סיגמה פקטור הנבדלים‬
‫במסה שלהם )המספר מסמן את המסה(‪ .‬פקטורי סיגמה שונים מזהים רצפי פרומוטור שונים‪ .‬סיגמה ‪70‬‬
‫מזהה את רוב הפרומוטורים בתא‪ ,‬כאשר פקטורי סיגמה אחרים מופעלים תחת בקרה ומזהים פרומוטורים‬
‫ייחודיים לסיטואציות מסויימות‪ ,‬בעיקר עקות‪.‬‬
‫סיגמה ‪ 32‬למשל משעתק גנים המאפשרים לחיידק‬
‫להתמודד עם עקות של חום; בעקות חום יש פרימה‬
‫של איזור הפרומוטור המזוהה על ידי הסיגמה‪,‬‬
‫המאפשרת לו לקשר בין פולימראז לפרומוטורים‪.‬‬
‫שיחלוף פקטורי סיגמה שימש לבקרה של ביטוי גנים‬
‫פאג' ‪ SPO1‬מכיל שלושה סוגי גנים – גנים מוקדמים‪ ,‬המבוטאים מיד לאחר ההדבקה; גנים המבוטאים‬
‫בשלב השני; וגנים מאוחרים המקודדים לחלבוני הקאפסיד הנדרשים רק בתום התהליך‪ .‬על מנת לגייס‬
‫באופן יעיל את מערכת החיידק בסדר המסויים הזה‪ ,‬המערכת מתבססת על הספציפיות של פקטור סיגמה‪.‬‬
‫מיד אחרי ההדבקה‪ ,‬הפולימראז היחיד הזמין בתא הוא פולימראז עם סיגמה ‪ .70‬בהתאמה‪ ,‬הגנים‬
‫המוקדמים מכילים פרומוטור המזוהה על ידי סיגמה ‪ .70‬אחד מהגנים המוקדמים מקודד לסיגמה ‪ ,28‬בעל‬
‫אפיניות גבוהה לליבה‪ .‬עם המשך השיעתוק והתרגום‪ ,‬ריכוז סיגמה ‪ 28‬עולה בתא עד שרוב הפולימראזות‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪108‬‬
‫של החיידק משחלפים את סיגמה ‪ 70‬בסיגמה ‪ ,28‬המזהה פרומוטורים של הגנים האמצעיים‪ .‬כעת מופסק‬
‫השיעתוק של הגנים המוקדמים ונעשה מעבר לשיעתוק הגנים האמצעיים‪.‬‬
‫בין הגנים האמצעיים יש גן לסיגמה פקטור אחר‪ ,‬סיגמה ‪ ,34‬אשר מזהה את הפרומוטורים של הגנים‬
‫המאוחרים‪ .‬עם העלייה בריכוז עולה כמות הפולימראזות הקשורים ל‪ 34-‬ומתחיל שיעתוק גנים מאוחרים‪.‬‬
‫לוירוס יש מערכת המאפשרת בקרה ותיזמון נכון של שיעתוק גנים המבוססת על הספציפיות של‬
‫פקטורי סיגמה שונים‪.‬‬
‫זיהוי אתר סיום השיעתוק )טרמינטור(‬
‫נקודת הסיום מכונה טרמינטור‪ .‬הרצף‬
‫של הגן מכיל רצף ‪ DNA‬היוצר מבנה‬
‫שניוני ב‪ RNA-‬המסונטז‪ .‬ישנם שני‬
‫סוגי אותות של טרמינציה‪ :‬טרמינטור‬
‫תלוי‪-‬רו וטרמינטור בלתי‪-‬תלוי ברו‬
‫)‪.(ρ-dependent/independent‬‬
‫המשותף לשניהם הוא שאיזור סיום‬
‫השיעתוק מכיל רצף פלינדרומי‬
‫הפוך‪ .‬כתוצאה מכך‪ ,‬ה‪ RNA-‬מכיל‬
‫יוצר מבנה שניוני ‪.stem and loop‬‬
‫בטרמינטור בלתי‪-‬תלוי ברו‪ ,‬רצף ה‪UUUU-‬‬
‫שמגיע בהמשך יוצר קשר חלש ל‪ DNA-‬ומקל‬
‫בניתוק‪.‬‬
‫סינטזת התיבה השנייה ברצף הפלינדרומי גורמת‬
‫לכך שהרצף מתנתק מה‪ DNA-‬ומתעדף קישור‬
‫לתיבה הראשונה‪ ,‬ויוצר את מבנה ה‪stem and -‬‬
‫‪ .loop‬נטישת בועת השיעתוק על ידי הגדיל גורמת‬
‫לכך שכל ה‪ RNA-‬תלוי על רצף הרבה יותר קצר‬
‫המורכב כולו מקשרי ‪ ,A-U‬קשרים חלשים שלא‬
‫מאפשרים להחזיק את מולקולת ה‪ RNA-‬בבועה‪.‬‬
‫כתוצאה יש ניתוק של ה‪ ,RNA-‬ויחד איתו נפילה‬
‫של הפולימראז מה‪.DNA-‬‬
‫•‬
‫•‬
‫טרמינטור בלתי‪-‬תלוי‪-‬רו הוא מבנה של ‪stem‬‬
‫‪ and loop‬שבעקבותיו של רצף פולי‪.U-‬‬
‫הרצף לא מאפשר הישארות של הגדיל‬
‫בבועת השיעתוק ומעודד נפילת ה‪RNA-‬‬
‫והפולימראז‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :13‬מסלולי השיעתוק‬
‫‪109‬‬
‫הטרמינטור שתלוי ברו אינו מכיל בהכרח רצף‬
‫‪ PolyU‬ולכן היכולת לניתוק ה‪ RNA-‬תלויה‬
‫במעורבות ‪.ρ‬‬
‫תחילת הסיגנל תלויה בהיווצרות ראש הסיכה אבל‬
‫אחרי הסיגנל נקשר חלבון רו‪ .‬חלבון רו נקשר‬
‫במקום כלשהו ברצף ה‪ RNA-‬לפני ראש הסיכה;‬
‫הוא מתקדם על גבי הגדיל בעקבות הפולימראז‬
‫במנגנון תלוי‪.ATP-‬‬
‫כאשר נוצר סיגנל ראש הסיכה של הטרמינציה‪,‬‬
‫הנוכחות של רו בסמיכות גורמת‪ ,‬במנגנון שפרטיו‬
‫המולקולריים לא ידועים לחלוטין‪ ,‬לניתוק של ה‪-‬‬
‫‪ RNA‬מבועת השיעתוק‪ ,‬שחרור של הפולימראז‬
‫והפסקת השיעתוק‪.‬‬
‫מוטציות באתר הקישור של רו יכולות להפסיק את‬
‫הטרמינציה של חלבונים תלויי רו‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪110‬‬
‫שיעור ‪ :14‬בקרת ביטוי גנים בחיידקים‬
‫בחיידקים )ובאאוקריוטים( מבחינים בין שני סוגי גנים‪:‬‬
‫•‬
‫‪ – House Keeping Genes‬מבוטאים קונסטיטוטיבית ומקודדים לחלבונים מבניים הקשורים‬
‫לממברנה או לריבוזומים – מבנים שקיומם נשמר בתא בלי קשר לשינויים נוספים חיצוניים‪ .‬הגנים‬
‫האלה מבוטאים תמיד אך בקצבים משתנים בהתאם לנסיבות‪.‬‬
‫•‬
‫גנים אינדוסוביליים – גנים שהביטוי שלהם משתנה בהתאם לתנאי הסביבה‪ ,‬הקשורים לרוב‬
‫לקטבוליזם של נוטריינטים שונים כמו מקורות פחמן‪ ,‬פוספט וכדומה‪ .‬המנגנון חוסך ביטוי של קסטות‬
‫גנים שאינם נדרשים באופן קבוע‪ .‬השינויים יכולים להיות גם בסביבה התוך תאית – למשל במצבי‬
‫עודף‪/‬חוסר של חומצות אמינו מסויימות‪ .‬מבוקרים בעיקר ברמת השיעתוק באופן היוצר זיקה בין‬
‫שינויים חיצוניים או פנימיים לבין מערכת הבקרה ויכולת החיידק לשעתק‪.‬‬
‫בקרה חיובית או שלילית של השיעתוק‬
‫•‬
‫מערכת בקרה שלילית – מערכת המבוססת על‬
‫נוכחות של רפרסור‪ ,‬חלבון שנקשר ל‪DNA-‬‬
‫באיזור בקרת הגן המכונה "אופרטור" )נמצא‬
‫לרוב ‪ downstream‬לפרומוטור‪ ,‬אך יכול‬
‫להיות גם ‪ .(upstream‬מערכת הבקרה צריכה‬
‫להסיר את הרפרסור כאשר יש צורך בשיעתוק‬
‫הגן‪ .‬מצב ברירת המחדל הוא שיעתוק אולם‬
‫ברוב המצבים קשור רפרסור‪.‬‬
‫•‬
‫מערכת בקרה חיובית – השיעתוק אפשרי רק‬
‫על ידי קישור אקטיבטור לאופרטור‪ .‬ההפעלה‬
‫של האקטיבטור תלויה בשינוי סביבתי היוצר‬
‫דרישה לשיעתוק‪ .‬מצב ברירת המחדל הוא אי‪-‬‬
‫שיעתוק ותחת תנאים מתאימים נקשר‬
‫אקטיבטור‪ .‬המערכת מאופיינת בפרומוטור‬
‫חלש שזיקתו לפולימראז מתחזקת עקב הקישור‬
‫לאקטיבטור‪ .‬אופרטור‪-‬אקטיבטור ממוקם לרוב‬
‫‪ upstream‬לפרומוטור‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :14‬בקרת ביטוי גנים בחיידקים‬
‫‪111‬‬
‫ארגון גנים בקטריאלים‬
‫חלק גדול מהגנים החיידקיים יושבים על אופרונים‪ ,‬גדילי ‪ mRNA‬פוליציסטרונים‪ .‬אופרון הלקטוז מהווה‬
‫דוגמה לרפרסיה ואקטיבציה באותו האופרון‪.‬‬
‫רפרסיה של אופרון הלקטוז‬
‫בהיעדר לקטוז‪ ,‬האופרון אינו משועתק מכיוון שרפרסור הלקטוז )‪ (lacI‬מונע את השיעתוק‪.‬‬
‫האופרון‬
‫מכיל‬
‫שלושה‬
‫אתרי‬
‫רפרסיה‪:‬‬
‫הראשון‬
‫יושב‬
‫אחרי‬
‫הפרומוטור‪,‬השני אחרי הגן של ‪ lacZ‬והשלישי בתוך הגן של הרפרסור‬
‫)מסומנים ב‪.(O-‬‬
‫כאשר מבצעים ‪) DNase I footprinting‬משמאל( לאופרון הלקטוז עם‬
‫פולימראז לעומת עם הרפרסור‪ ,‬ניתו לראות שטביעת הרגל של‬
‫הפולימראז והרפרסור חופפות – כלומר הרפרסור מתיישב פיזית במקום‬
‫הקישור של הפולימראז‪ .‬זוהי עדות ראשונה לעיכוב פיזי של יכולת‬
‫הקישור של פולימראז לפרומוטור של האופרון‪.‬‬
‫לאחר שגיבשו את הרפרסור הסתבר שהוא עובד כטטראמר – ארבע תת‬
‫יחידות זהות הבנויות משני דימרים‪ .‬כל צבע באיור מייצג מונומר ושני‬
‫הדימרים מחוברים במבנה אלפא‪-‬הליקלי ליצירת טטראמר‪ .‬כל תת יחידה‬
‫מכילה מבנים של אלפא‪-‬הליקס היוצרים קשר ישיר עם נוקליאוטידים‬
‫ב‪ .DNA-‬דימר אחד תמיד נקשר לאיזור ‪ O1‬הסמוך לאתר הקישור של‬
‫הפולימראז והדימר השני נקשר ל‪ O2-‬או ל‪) O3-‬לא ידוע אם קיימת‬
‫העדפה לאחד או לשני(‪ .‬רצף ההכרה של הרפרסור בנוי בתור ‪Inverted‬‬
‫‪ Repeat‬כאשר כל אחד מהקטעים ההופכיים נקשר על ידי אחת מתת‬
‫היחידות הבונות את הדימר‪ .‬הקישור של הטטראמר ל‪ DNA-‬גורם כנראה‬
‫ליצירת לולאה ב‪ DNA-‬המונעת קישור הפולימראז ושיעתוק האופרון‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪112‬‬
‫בהוספת לקטוז יש עלייה מהירה בביטוי ה‪mRNA-‬‬
‫של האופרון ובעקבותיה עלייה בביטוי הגן )‪.(LacZ‬‬
‫הסרת הלקטוז גוררת דגרדציה מהירה של ‪.mRNA‬‬
‫יחד עם זאת‪ ,‬הביטוי של החלבונים מתקבע – דבר‬
‫המלמד כי זמן מחצית החיים של החלבונים ארוך‬
‫מזה של ה‪.mRNA-‬‬
‫העובדה שפרמיאז ברמה נמוכה מבטא‪-‬גלקטוזידאז‬
‫יכולה לנבוע מכך שפרמיאז בעל זמן מחצית חיים קצר‬
‫יותר או שהסינטזה שלו איטית יותר‪.‬‬
‫מתוך מבנה המערכת ניתן להבין שהיא אינה סגורה‬
‫הרמטית – תמיד יש קצת שיעתוק‪ ,‬המאפשר תרגום‬
‫של פרמיאז שמכניס את הלקטוז על מנת שניתן יהיה לחוש‬
‫בנוכחותו‪ .‬כאשר לקטוז מתפרק‪ ,‬אלולקטוז הוא המשרן אשר‬
‫נקשר אל הרפרסור ומוריד אותו מהגן‪.‬‬
‫קריסטלוגרפיה של טטראמר הרפרסור עם ובלי ‪ IPTG‬בדקה כיצד‬
‫‪ IPTG‬משפיע על המבנה‪.‬‬
‫באיור‬
‫ניתן‬
‫לראות‬
‫את‬
‫המבנה בנוכחות )צבע כהה(‬
‫ובהיעדר )שקוף( ‪.IPTG‬‬
‫ההבדל הבולט במבנה הוא‬
‫הבלטה החוצה של מבנים‬
‫אלפא‪-‬הליקלים של הטטראמר – אשר מקופלים לתוך המבנה בעת הקישור ל‪ .IPTG-‬מכאן‬
‫שהאלמנטים המבניים שאחראים לקישור ל‪ DNA-‬מתקפלים לתוך החלבון בתגובה למשרן‪ .‬מסיבה זו‪,‬‬
‫בריכוז גבוה של המשרן הרפרסור ניתק מה‪.DNA-‬‬
‫הבקרה החיובית על ידי אקטיבטור‬
‫בנוכחות גלוקוז ולקטוז‪ ,‬ניתן לראות שלמרות שהרפרסור יורד מהגן עדיין אין שיעתוק של האופרון‪.‬‬
‫הסיבה היא שגלוקוז פשוט יותר לניצול ולכן כל המערכות שמשעתקות לפירוק דו‪-‬סוכרים אחרים‬
‫מעוכבות בנוכחותו‪ .‬המערכת הזו מבוססת על אופרציה הקשורה לעובדה שגם בהיעדר רפרסור‪ ,‬ה‪RNA-‬‬
‫פולימראז אינו יכול לשעתק את האופרון‪ .‬הסיבה לכך היא שהרצף באתר ‪ -35‬של פרומוטור אופרון‬
‫הלקטוז שונה מרצף הקונצנזוס‪ ,‬הפרומוטור חלש והשיעתוק תלוי בנוכחות אופרטור‪.‬‬
‫האקטיבטור הוא דימר שנקשר לאתר ‪ upstream‬לפרומוטור האופרון‪ .‬החלבון )המכונה גם ‪ (CAP‬חייב‬
‫להיות קשור ל‪ cAMP-‬על מנת לעבור שינוי קונפורמציה המאפשר קישור ל‪ .DNA-‬הגלוקוז מעכב את‬
‫האנזים אדנילין‪-‬ציקלאז‪ ,‬היוצר ‪ .cAMP‬מכאן שנוכחות גלוקוז מעכבת את ייצור ה‪ cAMP-‬ומונעת‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :14‬בקרת ביטוי גנים בחיידקים‬
‫‪113‬‬
‫קישור ‪ DNA‬מצד האקטיבטור‪ .‬הקישור של‬
‫האקטיבטור אל ה‪ ,DNA-‬בהיעדר גלוקוז ובנכוחות‬
‫לקטוז‪ ,‬מאפשר ייצור של הפולימראז הנקשר‬
‫לפרומוטור‪.‬‬
‫•‬
‫כאשר גלוקוז נמצא לבדו‪ ,‬הרפרסור מונע‬
‫שיעתוק והאקטיבטור לא נקשר לאתר ההכרה‪.‬‬
‫•‬
‫כאשר גלוקוז ולקטוז נמצאים יחד‪ ,‬הרפרסור‬
‫יורד אך יעילות השיעתוק נמוכה כי האקטיבטור‬
‫אינו נקשר לאתר ההכרה ולכן פולימראז אינו‬
‫נקשר באופן אופטימלי‪.‬‬
‫•‬
‫כאשר יש לקטוז בלבד‪ ,‬הרפרסור יורד‬
‫והאקטיבטור מסוגל להיקשר – יש שיעתוק‬
‫יעיל של המערכת‪.‬‬
‫•‬
‫כאשר אין גלוקוז ואין לקטוז הרפרסור עדיין‬
‫קשור אך תיאורטית גם האקטיבטור קשור‪ .‬אין‬
‫שיעתוק‪.‬‬
‫אופרון הטריפטופן‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪114‬‬
‫זוהי דוגמה למערכת בקרה שמגיבה לשינויים בריכוז הטריפטופן בתוך התא‪ .‬ירידה בריכוז מולידה צורך‬
‫לשעתק את הגנים שעל האופרון על מנת להתחיל בסינטזה של הטריפטופן בתא‪ .‬מערכת הבקרה מתנהלת‬
‫בשתי רמות‪ :‬האחת מבוססת על רפרסור והשנייה מבוססת על איזור ההחלשה )‪ (Attenuator‬הנמצא בין‬
‫הפרומוטור לגן הראשון באופרון‪.‬‬
‫המערכת הזו מייצגת מערכות בקרה נוספות של סינטזת חומצות אמינו אחרות‪ ,‬אשר גם בהן מערכת הבקרה‬
‫עובדת על אותו העקרון‪.‬‬
‫מערכת הרפרסור‬
‫המערכת הזו מגיבה לריכוזי טריפטופן גבוהים בתא‪ .‬במצבים אלו אין צורך בשיעתוק האופרון‪ .‬הרפרסור‬
‫משועתק במקום אחר בגנום על ידי פרומוטור משלו‪ .‬הקישור לאתר ההכרה ב‪ DNA-‬תלוי בנוכחות‬
‫הטריפטופן‪.‬‬
‫כאשר רמת הטריפטופן מספיק גבוהה כדי שיחידות טריפטופן ייקשרו לרפרסור‪ ,‬יהיו מספיק רפרסורים‬
‫מאוקטבים שיעברו שינוי קונפורמציה המאפשר קישור של הרפרסור לאתר ההכרה ב‪ .DNA-‬במצב זה‬
‫הפולימראז אינו יכול להיקשר ולשעתק את האופרון‪.‬‬
‫הרפרסור גובש ומבנהו נקבע – המבנה‬
‫הוא הומודימר עם איזור אלפא‪-‬הליקלי‬
‫שאינו יכול להיקשר לאתר ההכרה‬
‫ללא הטריפטופן‪ .‬קישור הטריפטופן‬
‫גורם‬
‫לשינוי‬
‫קונפורמציה‬
‫באתר‬
‫האלפא‪-‬הליקלי ומאפשר קישור לאתר‬
‫ההכרה ב‪ DNA-‬וחסימת היכולת של‬
‫ה‪ RNA-‬פולימראז להכיר ולשעתק‬
‫את האופרון‪.‬‬
‫מערכת האטנואציה‬
‫מערכת הרפרסור פעילה במצבי עודף‬
‫כבדים; מערכת האטנואציה פעילה‬
‫במצבי עודף קלים‪ ,‬בהם אין אקטיבציה‬
‫מספקת של רפרסורים אך עדיין אין‬
‫צורך בשיעתוק האופרון‪ .‬הבקרה‬
‫נמצאת באיזור ה‪ Leader-‬בו מצוי גם‬
‫אתר האטנואציה‪.‬‬
‫איזור האטנואציה מאפשר עיכוב ביטוי האופרון במצב של עודף קל ומכיל ארבעה רצפי עניין‪:‬‬
‫•‬
‫הרצף הראשון הוא מסגרת קריאה פתוחה המקודדת לפפטיד קצר; הוא מאופיין ב‪ AUG-‬ורצף ‪.stop‬‬
‫הפפטיד הקצר מכיל שני קודונים סמוכים המקודדים לחומצת האמינו טריפטופן‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :14‬בקרת ביטוי גנים בחיידקים‬
‫•‬
‫‪115‬‬
‫שלושת האיזורים הנוספים יכולים ליצור מבנים שניוניים של ‪stem and‬‬
‫‪ loop‬שנוצרים בין רצפים ‪ 2-3‬או בין ‪ .3-4‬המבנה שנוצר בין הרצפים ‪3-4‬‬
‫נראה כמו רצף טרמינטור‪.‬‬
‫כאשר השיעתוק מתחיל ומולקולת ‪ mRNA‬צצה מבועת השיעתוק‪ ,‬ריבוזומים‬
‫מתיישבים עליה ומתחילים בתרגום של מסגרת הקריאה הפתוחה של ה‪.Leader-‬‬
‫במצב של חוסר חמור בטריפטופן‪ ,‬הריבוזומים מתחילים בתרגום ומגיעים לאתר‬
‫הפפטיד שדורש שני טריפטופנים רצופים‪ .‬מכיוון שריכוז מולקולות ‪tRNATrp‬‬
‫מאוד נמוך‪ ,‬הריבוזום משתהה‪ .‬ההשתהות הזו מאפשרת ל‪ RNA-‬פולימראז‬
‫להתקדם בשיעתוק ונוצר מבנה שניוני של ‪ RNA‬בין רצפים ‪ .2-3‬לרצף ‪ 4‬אין אפשרות ליצור מבנה‬
‫שניוני של טרמינציה‪ .‬בתנאים אלו – רמות טריפטופן נמוכות – יש המשך תקין של שיעתוק מולקולת ה‪-‬‬
‫‪ mRNA‬של אופרון הגנים לסינטזת טריפטופן‪.‬‬
‫כאשר יש עודף קל של טריפטופן‪ ,‬הריבוזום אינו משתהה וממשיך מהר מאוד אחרי הפולימראז‪ .‬בצורה זו‬
‫הוא מגיע לסיום השיעתוק מייד עם היווצרות רצף ‪ .2‬ההתקדמות המהירה גורמת למיסוך של רצף ‪ 2‬כך‬
‫שאינו זמין ליצירת מבנה שניוני עם רצף ‪ 3‬כאשר זה נוצר ולכן רצף ‪ 3‬פנוי ליצירת מבנה שניוני של‬
‫טרמינציה עם רצף ‪ ,4‬הגורם לטרמינציה של השיעתוק ונפילת ה‪ RNA-‬פולימראז ומולקולת ה‪mRNA-‬‬
‫מבועת השיעתוק‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪116‬‬
‫בצורה זו מערכת האטנואציה – ההחלשה – מאפשרת עצירת השיעתוק של ה‪ mRNA-‬בשלב‬
‫מוקדם ומניעת יצירת האופרון‪.‬‬
‫מערכת ‪ PhoR/PhoB‬לבקרת ביטוי גנים על ידי פוספט‬
‫סוג נוסף של בקרה היא בקרה דו‪-‬רכיבית‪ .‬הדוגמה‬
‫הבאה היא מערכת בקרה של אופרונים שמגיבים‬
‫לשינויים בריכוז הזרחן בתא‪ .‬זרחן הוא יסוד חשוב‬
‫מאוד החיוני ליצירת ‪ DNA‬וזירחון מולקולות‪,‬‬
‫ושינויים בריכוז הזרחן בבסביבות התאית והחוץ‬
‫תאית צריכים לעורר תגובה מהירה ומתאימה‪.‬‬
‫בשינויי ריכוז מופעלת מערכת גנים על ידי שמונה‬
‫אופרונים שונים )שם כולל‪ :‬רגולון‪ ,‬כי הם מבוקרים‬
‫באופן דומה(‪ .‬הבקרה חיובית על ידי אקטיבטור –‬
‫אין שיעתוק בריכוז חיצוני גבוה של זרחן‪.‬‬
‫האופרונים מקודדים לטרנספורטרים רבים יותר ואפקטיבים יותר של פוספט‪ ,‬לחלבונים המאפשרים‬
‫ניצולת טובה יותר של מאגרי הפוספט התוך תאי כמו פוספטאזות וכדומה‪.‬‬
‫שינויים ברמת הפוספט יכולים להתרחש במהלך נדידתו של חיידק מסויים במערכת העיכול‪ ,‬למשל –‬
‫במעי הדק יש סביבה בסיסית המאפשרת פעילות של אלקאלין פוספאטאז‪ ,‬המסיר קבוצות פוספט מאבות‬
‫מזון‪ .‬במעי הגס הסביבה חומצית יותר‪ ,‬האנזים אינו פעיל ולכן מתחולל שינוי דרמטי בריכוז הפוספט‬
‫בסביבה החוץ תאית של החיידק‪.‬‬
‫המערכת המאפשרת את התגובה מורכבת משני רכיבים‪ PhoR :‬ו‪.PhoB-‬‬
‫•‬
‫‪ PhoB‬הינו אקטיבטור שנקשר לאיזור הפרומוטור של האופרונים המעורבים ברגולון ומאפשר‬
‫קישור יציב של ‪ RNA‬פולימראז‪ .‬יכולת הקישור של האקטיבטור לפרומוטורים תלויה בזירחון שלו‪.‬‬
‫•‬
‫הזירחון של האקטיבטור נעשה על ידי הקינאז ‪ ,PhoR‬חלבון טרנס‪-‬ממברנלי שיושב על הממברנה‬
‫הציטופלזמטית של החיידק‪ .‬האלמנט החוץ תאי של ‪ PhoR‬הוא אתר קישור למולקולת פוספט;‬
‫האלמנט התוך תאי הוא קינאז‪.‬‬
‫כאשר ריכוזי הפוספט החוץ תאיים גבוהים‪ ,‬הרצפטור קשור לפוספט ומשרה שינוי קונפורמציה של החלק‬
‫התוך תאי של החלבון‪ .‬הקונפורמציה מעכבת את פעילות הקינאז‪ .‬כאשר ריכוז הפוספט יורד‪ ,‬החלק‬
‫החוץ תאי משחרר את הפוספט ושינוי קונפורמציה נעשה בחלק התוך תאי של המולקולה כך שהקינאז‬
‫הופך פעיל‪.‬‬
‫בתהליך דו שלבי של זירחון‪-‬עצמי ולאחר מכן זיהוי וזירחון של אקטיבטור המערכת ‪ ,PhoB‬נגרם‬
‫שינוי קונפורמציה של ‪ PhoB‬המאפשר לו קישור לפרומוטורים של הרגולון והגנים של הרגולון‬
‫מתחילים לעבור שיעתוק‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :14‬בקרת ביטוי גנים בחיידקים‬
‫‪117‬‬
‫מערכת ‪ NtrC/NtrB‬לבקרת ביטוי גנים על ידי חנקן‬
‫מערכת בקרה זו דו‪-‬רכיבית ומגיבה לשינויים ברמת‬
‫החנקן‪ .‬היכולת של הרכיבים לחוש את רמת החנקן‬
‫התוך‪-‬תאית לא ברורה לחלוטין‪ ,‬אך ידוע שהמערכת‬
‫מגיבה בירידה של רמת הגלוטמין בתא )חומצת אמינו‬
‫הנוצרת על ידי אמידציה של גלוטמאט ואמוניה(‪.‬‬
‫במערכת זו יש אקטיבציה של גנים דוגמת‬
‫‪ .Glutamine-Synthetase‬הפרומוטורים של הגנים‬
‫קושרים פולימראז אשר הליבה שלו קשורה לפקטור‬
‫סיגמה ‪ .54‬פקטור סיגמה ‪ ,54‬בניגוד לסיגמה ‪70‬‬
‫ואחרים‪ ,‬הוא מעט אימפוטנטי‪ :‬כאשר פולימראז‬
‫קשור אליו הוא יודע לזהות את אתרי ההכרה שלו‬
‫אבל‪ ,‬בניגוד לסיגמה ‪ 70‬או אחרים‪ ,‬הקישור לא‬
‫מאפשר פתיחה של בועת שיעתוק‪.‬‬
‫עובדה זו מנוצלת לצורך בקרה על ידי שני רכיבים‪:‬‬
‫הרכיב הראשון‪ NtrC ,‬הוא אקטיבטור של שיעתוק‬
‫ו‪ NtrB-‬הוא קינאז‪ .‬בירידת רמת הגלוטמין‪ ,‬במנגנון‬
‫שאינו ידוע מולקולרית‪ ,‬יש אקטיבציה של קינאז היודע לזרחן את ‪ NtrC‬בכל אחד מהמונומרים‬
‫בטטראמר‪ .‬המבנה מתיישב )רק במצב מזורחן!( על אתרים באיזור ‪ -108‬ו‪ ,-140-‬המכונים ‪Enhancers‬‬
‫כי הם קושרים חלבונים שיכולים לפעול במרחק‪ .‬לאחר הקשירה המבנה גורם לקיפול של מולקולת‬
‫‪ DNA‬בשל אפיניות למולקולת הפולימראז‪ .‬הקישור של האקטיבטור לפולימראז עם סיגמה ‪ 54‬בתהליך‬
‫דורש ‪ ATP‬הגורם לפתיחה של בועת שיעתוק ותחילת השיעתוק‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪118‬‬
‫שיעור ‪ :15‬בקרת ביטוי גנים באאוקריוטים‬
‫באאוקריוטים בקרת הביטוי מורכבת יותר בשל כמה גורמים‪:‬‬
‫•‬
‫ריבוי פולימראזות‪ ,‬מעורבות של פקטורי שיעתוק כלליים‪ ,‬אקטיבטורים וקו‪-‬אקטיבטורים;‬
‫•‬
‫ריבוי אתרי בקרה‪ ,‬קרובים ורחוקים כאחד;‬
‫•‬
‫קיפול ודחיסות הכרומטין‪.‬‬
‫ארגון גנים באאוקריוטים ובפרוקריוטים‬
‫בתאים אאוקריוטים יש יותר ‪ DNA‬המגוייס לתהליכי שיעתוק ובקרה של שיעתוק‪ .‬במערכת הטריפטופן‬
‫הפרוקריוטית למשל‪ ,‬חמשת הגנים המעורבים מסודרים באופרונים וחולקים איזור בקרה משותף המכיל‬
‫‪ ,leader‬איזור קישור לרפרסור ואיזור קישור לאקטיבטור‪ .‬לעומת זאת בשמרים‪ ,‬יצורים אאוקריוטים‪,‬‬
‫הגנים האלה מפוזרים בין הכרומוזומים של השמר‪ .‬לכל גן בקרה משלו ומנגנון שמאפשר תזמון ביטוי של‬
‫כל חמשת הגנים יחד‪ .‬מכאן שיש גיוס מוגבר של חומר גנטי למערכת הבקרה‪.‬‬
‫בנוסף לעובדה שהגנים אינם מסודרים באופרונים‪ ,‬בתאים אאוקריוטים יש פרישה של אינפורמציה‬
‫דומה על יותר ‪ DNA‬משום שאיזור הפרומוטור והבקרה יכול להיות ממוקם באיזורים שונים – לאו‬
‫דווקא מייד בתחילת הגן ובצמוד לו‪ .‬רצפים החשובים לבקרת התזמון והמיקום )מבחינת רקמה( של‬
‫הביטוי יכולים להיות במרחק של עד ‪ 50,000‬בסיסים מתחילת הגן‪.‬‬
‫כמו כן בתאים אאוקריוטים ה‪ RNA-‬עובר שיחבור‪ ,‬כך שיש איזורים בגן שאינם משמשים לתרגום‪.‬‬
‫ההיבטים שצויינו לעיל יוצרים מערכת מורכבת המשרתת תפקידי בקרה ברמות שונות‪.‬‬
‫שלושה סוגי ‪ RNA-Polymerase‬בגרעין התא האאוקריוטי‬
‫באאוקריוטים יש שלושה סוגי פולימראזות‪ ,‬כמו גם פולימראז מיטוכונדריאלי או כלורופלסטי בצמחים‪.‬‬
‫הטבלה הבאה מפרטת את סוגי הפולימראזות‪ ,‬סוגי גדילי ה‪ RNA-‬שהן משעתקות והרגישות לרעלן‬
‫אלפא‪-‬אמניטין‪.‬‬
‫למרות שמבחינה קטליטית הפולימראזות עושות אותה פעולה הם נבדלים בכך שהם מזהים גנים שונים –‬
‫עובדה המתבטאת בסוגי הגדילים שהם משעתקים‪ .‬ההבדלים ביניהם מתבטאים גם ברגישות לרעלן אלפא‪-‬‬
‫אמניטין‪ .‬הרגישות לרעלן מאפשר לקבוע איזו פולימראז משעתק גדיל ‪ RNA‬חדש שמתגלה‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :15‬בקרת ביטוי גנים באאוקריוטים‬
‫‪119‬‬
‫הפרדה וזיהוי של שלושת ה‪ RNA-Polymerase-‬האאוקריוטיות בקולונה‬
‫אפשר להשתמש ברעלן על מנת להפריד בין הפולימראזות ולחקור כיצד הם מזהים גנים שונים‪ .‬ההפרדה‬
‫בין הפולימראזות נעשית על ידי הפרדה בקולונה המכילה בידים המצופים בריאגנט שיש לו אפיניות‬
‫לחלבונים על בסיס חוזק יוני‪ .‬לאחר מכן שוטפים את הקולונה בגרדיינט של מים או תמיסת מלחים;‬
‫השטיפה מוציאה את החומרים שלא נספחו לקולונה‪ .‬כעת בודקים אילו חלבונים משתחררים באיזה ריכוז‪.‬‬
‫ניתן לראות שרוב החלבונים יוצאים‬
‫בריכוז הנמוך של המלח אולם‬
‫ריכוזים גבוהים יותר של מלח‬
‫משחררים חלבונים ספציפיים‪.‬‬
‫לאחר‬
‫מכן‬
‫בודקים‬
‫פעילות‬
‫פולימראזות בכל מבחנה שהופקה‬
‫מהקולונה‬
‫)הגרף‬
‫האדום(‪.‬‬
‫ניתן‬
‫לראות שלושת פיקים של פעילויות‬
‫פולימראזות שונות‪ .‬על מנת לוודא‬
‫שאלו באמת חלבונים שונים‪ ,‬ניתן‬
‫לבדוק את הפעילות בנוכחות ריכוזים‬
‫שונים של אלפא‪-‬אמניטין‪.‬‬
‫הרכב תת היחידות של ה‪ RNA Polynerase-‬בשמר‬
‫בפולימראזות אאוקריוטיות יש גם כן תת יחידות‪ ,‬כשם שיש בפרוקריוטים‪ ,‬אולם באאוקריוטים יש הרבה‬
‫יותר תת יחידות והם הרבה יותר מורכבים‪ .‬ישנן מספר תת יחידות שזהות בכל שלושת הפולימראזות‬
‫ומספר תת יחידות המשתנות בין הפולימראזות – עובדה הצפויה מתוך הידע שהפולימראזות שונות בזיהוי‬
‫הגנים‪ ,‬השיעתוק ורגישותן לרעלנים‪.‬‬
‫תת היחידה ‪) 1‬ההומולוגית לתת היחידה ’‪ (β‬בפולימראז ‪ II‬מכילה‬
‫בקצה ה‪ C-terminus-‬רצף חוזרני המופיע בשמר ‪ 26‬פעמים‬
‫ובאדם ‪ 52‬פעמים; הרצף הוא ‪ .YSPTSPS‬כל שלושת חומצות‬
‫האמינו האלה יכולות לעבור זירחון ויש להן תפקיד מכריע‬
‫בשיעתוק על ידי פולימראז‪.II-‬‬
‫שני מבני הפולימראז‪ ,‬של הפרוקריוטים ואאוקריוטים‪ ,‬יוצרים‬
‫מבנה מרחבי של אוכף‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪120‬‬
‫שיטות משלימות למיפוי נקודת תחילת השיעתוק‬
‫תחילה יש לקבוע את נקודת תחילת הרצף‪ ,‬הנקודה‬
‫בה מתחיל ה‪ .mRNA-‬לשם כך ישנן שתי שיטות‪,‬‬
‫שעל פי רוב משתמשים בשתיהן‪:‬‬
‫•‬
‫‪ – Nuclease Protection‬השיטה משתמשת‬
‫ב‪ S1-Endonuclease-‬היודע לאכל ‪ DNA‬או‬
‫‪ RNA‬חד גדיליים )‪.(ssDNA/ ssRNA‬‬
‫בתהליך‬
‫זה‬
‫מסנטזים‬
‫‪probe‬‬
‫)גלאי(‬
‫קומפלמנטרי לאיזור רחב בו צפוי שיהיה ה‪-‬‬
‫‪ RNA‬המשועתק יחד עם איזור שנמצא במעלה‬
‫נקודת תחילת השיעתוק‪ .‬פיסת ה‪DNA-‬‬
‫מסומנת רדיואקטיבית בקצה ‪ .'5‬כעת מדגירים‬
‫את הגלאי עם ה‪ ,mRNA-‬העוברים היברידיזציה באיזור החפיפה‪ .‬בשלב הבא מדגירים את הגדילים‬
‫החופפים‪-‬למחצה עם הנוקליאזה‪ ,‬אשר מאכלת את השיירים החד‪-‬גדיליים‪ .‬מבצעים דה‪-‬נטורציה‪,‬‬
‫מבודדים את הגלאי המסומן‪ ,‬ולפי המקום שבו האנדונוקליאזה הפסיקה לאכל אותו ניתן להבין מהי‬
‫נקודת תחילת השיעתוק – מהי הנקודה בה התחילה הקומפלמנטציה שלו עם ה‪ .mRNA-‬שימו לב‪:‬‬
‫שיחבור יכול להפריע לאנליזה של שיטה זו‪ ,‬שכן הגלאי נבנה על בסיס הגן אך אמור לעבור‬
‫קומפלמנטציה עם ה‪ mRNA-‬המשוחבר‪.‬‬
‫•‬
‫‪ – Primer Extension‬בשיטה זו בוחרים‬
‫פריימר קצר מאוד מאיזור שצפוי להיות האיזור‬
‫המקודד של הגן – לא במעלה נקודת תחילת‬
‫השיעתוק‪ .‬הפריימר מסומן בקצה ‪ .'5‬לוקחים‬
‫תמצית ‪ RNA‬תאי ומאפשרים היברידיזציה בין‬
‫הפריימר ל‪ .RNA-‬בעזרת האנזים ‪,RT‬‬
‫המסוגל לסנטז ‪ DNA‬על בסיס ה‪,RNA-‬‬
‫הפריימר יוארך אחורה – כלפי תחילת גדיל ה‪-‬‬
‫‪ – mRNA‬עד לנקודת תחילת השיעתוק‪ .‬לאחר‬
‫סיום התגובה מבצעים דה‪-‬נטורציה וקובעים את גודלו של הגלאי‪ .‬לפי אורכו ניתן לקבוע מה הייתה‬
‫נקודת תחילת השיעתוק‪ .‬הערה‪ :‬מכיוון שגם כאן עשויים "ליפול" על אינטרונים משתמשים בכמה‬
‫פרומוטורים שנמצאים באיזור תחילת הגן המזוהה‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :15‬בקרת ביטוי גנים באאוקריוטים‬
‫‪121‬‬
‫השוואת רצפי הבסיסים במעלה נקודת תחילת השיעתוק‬
‫לאחר שמתקבלות כמה נקודות תחילת שיעתוק של גנים‪ ,‬ניתן לבצע עימוד של הגנים ולבדוק האם קיים‪,‬‬
‫כמו בפרוקריוטים‪ ,‬רצף קונצנזוס – רצף קבוע ששכיחותו גבוהה בין גנים‪ .‬האיור מציג את האיזור‬
‫המכונה "‪ "TATA BOX‬ואת השכיחות של כל נוקליאוטיד בכל עמדה באיזור בין ‪ 50‬גנים‪ .‬ניתן לראות‬
‫שהרצף ‪ TATAAA‬מופיע בשכיחות מאוד גבוהה ונמצא באיזור ‪ -30‬מנקודת תחילת השיעתוק‪ .‬ב‪50%-‬‬
‫מהמקרים‪ ,‬הנוקליאוטיד הראשון לשיעתוק הוא ‪.A‬‬
‫שימו לב‪ :‬זהו אינו ‪ AUG‬של איניציאציית התרגום אלא נוקליאוטיד בנקודת איניציאציית השיעתוק‪.‬‬
‫גנים המושפעים מ‪ TATA BOX-‬מתנהגים כמו רצפי קונצנזוס של פרוקריוטים‪ :‬שינוי התיבה לטובה או‬
‫לרעה משפיע בהתאם על השיעתוק והביטוי של הגן‪ .‬אולם ככל שהמחקר התקדם ונוספו עוד גנים התגלו‬
‫עוד רצפים‪ ,‬בין אם רצפי איניציאצייה מסויימים‪ ,‬שילוב בין רצפי ‪ TATA‬ואיניציאציה ורצפי בקרה‬
‫הנמצאים אפילו במורד נקודת השיעתוק‪.‬‬
‫אלמנטי ליבה של הפרומוטור‬
‫כאשר בוחנים גן עם ‪ ,TATA BOX‬ומוסיפים אותו למבחנה עם פולימראז ‪ II‬על תת יחידותיו השונות‪,‬‬
‫ניתן לבדוק האם מתקבל שיעתוק המתחיל בנקודת השיעתוק‪ .‬התשובה היא שלא‪ :‬מתברר שהרצפים‬
‫האלה חשובים אך לא מספיקים כאשר משתמשים רק בפולימראז ותת יחידותיו‪.‬‬
‫מהי הסיבה לכך? מדוע הדברים שמתקבלים ‪ in vivo‬לא מתקבלים גם ‪ ?in vitro‬מתברר שכאשר‬
‫מוסיפים למבחנה תמצית תאית מתקבל שיעתוק בנקודה הנכונה; מכאן שיש עוד משהו בתאים הדרוש‬
‫כדי לבצע שיעתוק מהנקודה הנכונה‪.‬‬
‫הפרדת פקטורי השיעתוק הכלליים של פולימראז‪II-‬‬
‫בעזרת קולונות המפרידות למשקלים מולקולרים‪ ,‬מטענים חשמליים ופרמטרים שונים ביקשו להפריד את‬
‫התמצית התאית ולהוסיף רכיבים שונים מתוכה לפולימראז ‪ II‬על מנת לבדוק מי מהם ייגרום לשיעתוק‬
‫מהנקודה הנכונה‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪122‬‬
‫מתברר שקיימים קומפלקסים רבים שנוכחות כולם נדרשת על מנת ליצור שיעתוק נכון‪ .‬הקומפלקסים‬
‫מכונים )‪ TFII (transcription factor for RNA-Polymerase II‬וממוספרים ‪ .A-H‬חלקם‬
‫קומפלקסים המכילים מספר חלבונים שונים )דוגמת ‪ (TFIIH‬ואחרים חלבונים בודדים )דוגמת ‪.(TFIIA‬‬
‫בטבלה )שקופית ‪ ,12‬מצגת ‪ (17‬מופיעים הקומפלקסים ופירוט מאפייניהם‪ .‬כל הקומפלקסים דרושים על‬
‫מנת להתחיל שיעתוק בנקודת האיניציאציה הנכונה‪.‬‬
‫חלבוני ה‪) TBP-‬קושרי‪ (TATA-‬יוצרים קשר עם קומפלקס ה‪ .TFIID-‬ה‪ TFIID-‬הוא קומפלקס העשוי‬
‫מחלבונים הנמצאים באסוציאציה עם ‪ .TATA BOX‬לא כל תת היחידות שלו נדרשות לשיעתוק‪ .‬בטבלה‬
‫מפורטים מספר החלבונים המרכיבים את הקומפלקסים‪.‬‬
‫ה‪ TBP-‬זוהה כחלבון קושר‪ .TATA BOX-‬זהו פפטיד אחד היוצר מבנה מרחבי סימטרי דמוי‪-‬דימר‪.‬‬
‫החלבון נקשר לתעלה הקטנה והקישור גורם לקיפול ב‪.DNA-‬‬
‫כיצד מתארגן קומפלקס הפרה‪-‬איניציאציה?‬
‫ה‪ RNA Polymerase-‬לא מסוגל להיקשר ספציפית לפרומוטור ולזהות אותו; ככל הנראה ‪ TBP‬הוא זה‬
‫שמזהה את הפרומוטור לפי ה‪ .TATA BOX-‬השאלה היא האם הקישור שלו מעורר קישור של חברי‬
‫הקומפלקס האחרים‪ ,‬או שהם נקשרים אליו כבר כקומפלקס שלם‪.‬‬
‫שורה של ניסויים שנערכו מציעה שיש קישור‬
‫הדרגתי‬
‫של‬
‫החלבונים‬
‫ליצירת‬
‫קומפלקס‬
‫איניציאציית השיעתוק‪ .‬הניסוי נערך בשיטת ‪Gel-‬‬
‫‪ .Shift‬בניסוי זה הגלאי הוא איזור שנמצא במעלה‬
‫נקודת תחילת השיעתקו של הגן‪ .‬לאחר מכן מדגירים‬
‫את הגן והגלאי עם מרכיבים שונים של פקטורי‬
‫השיעתוק הכלליים‪ .‬כאשר מדגירים עם פקטור אחד‬
‫כל פעם עולה שרק ‪) TFIID‬הכולל ‪ (TBP‬הוא‬
‫היחיד שיודע לקשור את ה‪ DNA-‬כי הוא היחיד‬
‫שגורם ל‪ shift-‬בג'ל‪.‬‬
‫כאשר מוסיפים את כל הפקטורים או צירופים שונים של כמה פקטורים מתקבלת סדרה של בנדים‬
‫המייצגים מצבים שונים של קישור‪ ,‬כאשר הבנד הנמוך מייצג אוכלוסייה הקשורה רק ל‪ ;TFIID-‬בנד שני‬
‫מייצג קישור ל‪ TFIID-‬ו‪) TFIIA-‬קומפלקס ‪ .(2‬מתוך טביעות הרגל המתקבלות ניתן לגזור את סדר‬
‫ההצטרפות של החלבונים לפרומוטור‪.‬‬
‫שימו לב‪ :‬הדגרה של כל הפקטורים יחד הוציאה הרבה בנדים; הדגרה של כל הפקטורים למעט ‪TFIID‬‬
‫הובילה לכך שלא יהיה אף בנד‪ .‬מכאן שללא ‪ TBP‬אין קישור כלל‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :15‬בקרת ביטוי גנים באאוקריוטים‬
‫‪123‬‬
‫האיור הבא מציג את תהליך הבנייה‬
‫והקישור של הקומפלקסים‪ .‬בשלב‬
‫השלישי ניתן לראות קשירה של‬
‫הפולימראז‪ ,‬קשור ל‪ ,TFIIF-‬כאשר‬
‫הוא במצב לא מזורחן על תת היחידה‬
‫‪ .1‬הקומפלקס שנוצר לפני הקישור‬
‫של ‪ TFIIH‬מכונה קומפלקס פרה‪-‬‬
‫איניציאציה‪ ,‬קומפלקס מוכן לשיעתוק‬
‫שאין לו את הכוח המניע לשיעתוק –‬
‫הניתן על ידי ‪ .TFIIH‬הקישור של‬
‫‪ TFIIH‬מתאפשר רק בסוף כי רק אז‬
‫יש התאמת קונפורמציה לקישור‪.‬‬
‫הקשירה שלו מפעילה פעילות קינאז‬
‫הגורמת להפעלת הפולימראז‪ ,‬פתיחת‬
‫בועת שיעתוק‪ ,‬שחרור של הפולימראז‬
‫מהקומפלקס ותחילת השיעתוק של‬
‫הגן בבועת האיניציאציה‪.‬‬
‫מעורבות חלבוני ‪ GTF‬בתהליך השיעתוק – איניציאציה או אלונגציה?‬
‫לאחר שקומפלקס האיניציאציה של השיעתוק מתפרק ומשחרר ממנו את הפולימראז‪ ,‬נשאלת השאלה‬
‫האם באמת כל החלבונים משתחררים ואינם ממשיכים עם הפולימראז בתהליך האלונגציה של ה‪.RNA-‬‬
‫על מנת לבדוק זאת ניתן לבצע בדיקה בשם ‪.ChIP Assay‬‬
‫‪Chromatin Immmunupercipitation Assay‬‬
‫ניתן לומר בביטחון שהפולימראז מעורב בתהליך האלונגציה; אך יש לבדוק האם פקטורים נוספים נותרים‬
‫קשורים אליו‪ .‬לשם כך מבצעים את הניסוי הבא‪:‬‬
‫בשלב הראשון מדגירים תאים שלמים עם‬
‫פורמלדהיד המקבע קשרים בין חלבון ל‪-‬‬
‫‪ DNA‬והוא חדיר לתאים חיים‪ .‬כעת בודקים‬
‫האם חלבון מסויים‪ ,‬למשל החלבון הסגול‪,‬‬
‫נקשר למקטע ‪ DNA‬מסויים – המקטע האדום‬
‫– או למקטעים אחרים‪.‬‬
‫לאחר מכן חותכים את ה‪ DNA-‬למקטעים‬
‫קטנים בעזרת סוניקציה ומפרידים את ה‪-‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪124‬‬
‫‪ DNA‬על החלבונים המצולבים אליו בתהליכי אקסטרקציה‪ ,‬כך שנותרים עם מקטעי ‪ DNA‬וחלבונים‬
‫המחוברים אליהם‪ .‬בשלב הבא מוסיפים למבחנה נוגדנים המכירים ספציפית את חלבון המטרה – החלבון‬
‫הסגול‪.‬‬
‫אם הנוגדן מחובר לחרוז )ביד( כבד‪ ,‬ניתן לסרכז את הנוגדנים ולהשקיע אותם כך שהם יירדו בצנטריפוגה‬
‫לתחתית המבחנה יחד עם החלבון הקשור אליהם‪ .‬בצורה זו ניתן לבודד את החלבונים הסגולים‪ .‬כעת ניתן‬
‫להפוך את הפיקסציה בתנאים בסיסיים‪ ,‬להפריד בין החלבונים ל‪ DNA-‬ולבדוק מהי מולקולת ה‪DNA-‬‬
‫שהתקבלה‪ :‬הגדיל האדום או כל מקטע חשוד אחר‪.‬‬
‫לשם כך מבצעים ‪ PCR‬עם פריימרים לאיזורים קצרים שונים של ה‪ .DNA-‬מדגירים עם גדיל ה‪DNA-‬‬
‫המתקבל ומחפשים תוצאה חיובית לקומפלמנטציה בין הגדיל לסוג מסויים של גדילים קצרים שהופקו ב‪-‬‬
‫‪ .PCR‬בצורה זו מוצאים את הגדיל שנמצא בקשר עם החלבון הסגול‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :16‬בקרת ביטוי גנים באאוקריוטים – המשך‬
‫‪125‬‬
‫שיעור ‪ :16‬בקרת ביטוי גנים באאוקריוטים – המשך‬
‫הבחנה בין חלבונים בעזרת ‪ChIP Assay‬‬
‫לאחר שמבודדים ‪ DNA‬בניסוי ‪ ,ChIP‬ניתן לבחון איזה הם‬
‫הגדילים של הפרומוטור ואילו חלבונים מעורבים באלונגציה‪.‬‬
‫הניסוי הבא בוחן האם נעשה שינוי בנוכחות הגדיל ‪ GAL1‬לאורך‬
‫זמן‪ .‬הנוגדן שבשימוש הוא נגד תת היחידות וניתן לראות שנוגדן‬
‫כנגד פולימראז‪ II-‬המשמש ב‪ ChIP-‬מראה עוצמת בנד הולכת‬
‫וגדלה עם הזמן לגן הניסוי לעומת גן הביקורת‪.‬‬
‫כאשר עושים את הניסוי כנגד איזור אחר שנמצא ב‪ ,ORF-‬ניתן לראות שבתחילה יש מעט קישור בהיעדר‬
‫גלקטוז וככל שמוסיפים גלקטוז הבנד הולך וגדל עקב האינדוקציה‪ .‬מכאן מבינים שבכל זמן נתון חלק‬
‫מהמולקולות של הפולימראז נמצאות על גבי‬
‫הפרומוטור וחלקן נמצאות במסגרת הקריאה‪ ,‬תוך‬
‫כדי שיעתוק‪.‬‬
‫כעת משתמשים בנוגדן ל‪ TBP-‬לצורך ההשקעה‬
‫ומבצעים‬
‫‪PCR‬‬
‫לאיזור‬
‫הפרומוטור‬
‫התמונה‬
‫המתקבלת דומה ל זו המתקבלת עם הפולימראז‪ .‬עם זאת‪ ,‬כאשר עושים ‪ PCR‬לאיזור שנמצא ב‪,ORF-‬‬
‫לא מתקבל שינוי בעוצמת הבנד‪ .‬מכאן שה‪ TBP-‬אינו משתתף באלונגציה‪.‬‬
‫זיהוי חלבונים המעורבים באלונגציה‬
‫על אותו העקרון ביצעו ניסויים נוספים עם נוגדני השקעה כנגד כל אחד מפקטורי השיעתוק )‪.(TAF‬‬
‫בפנל העליון מוצג ‪ PCR‬כנגד הפרומוטור ובפנל התחתון פריימרים כנגד ה‪.ORF-‬‬
‫ניתן לראות בכל הפקטורים עלייה בפרומוטור ללא שינוי ב‪ ORF-‬למעט ‪ ,TFIID‬המכיל – כזכור – ‪12‬‬
‫‪ TAF‬שלא כולם מעורבים בשיעתוק של כל פרומוטור; בניסוי זה השתמשו בנוגדן כנגד ‪ TAF‬שאינו‬
‫מעורב בשיעתוק הפרומוטור של ‪ GAL1‬ולכן לא ניתן להבחין בעלייה בפרומוטור‪ .‬תוצאות אלו מראות‬
‫שככל הנראה אף אחד מהפקטורים לא מגיע עם הפולימראז לאותו איזור ב‪ ORF-‬שהוגבר ב‪.PCR-‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪126‬‬
‫מעגל השיעתוק האאוקריוטי‬
‫מניסויים כאלו ואחרים ניתן להבחין בתפקיד ובתהליך הקישור של כל הפקטורים ליצירת קומפלקס‬
‫השיעתוק של התא האאוקריוטי‪ .‬הגיוס של הפקטורים הוא הדרגתי ובכל מקרה הפולימראז אינו‬
‫הראשון – הספציפיות של הכרת הגן מוקנית על ידי הקומפלקס החלבוני של ‪ TBP‬עם ‪TFIID‬‬
‫והקומפוננטות המזהות את אותו פרומוטור‪.‬‬
‫הקומפלקס האחרון הוא ‪ ,TFIIH‬בעל פעילות הליקאז שמאפשרת את פתיחת בועת השיעתוק‪ .‬עם פתיחת‬
‫הבועה הפולימראז עוזב לזמן קצר יחד עם ‪ TFIIE‬ו‪ ,TFIIH-‬המתנתקות בשלב מאוחר יותר‪ .‬לאחר סיום‬
‫האלונגציה הפולימראז משתחרר‪ ,‬הפוספטים‬
‫מהזנב משתחררים והוא זמין להתחיל מעגל‬
‫שיעתוק חדש‪.‬‬
‫הזירחון של זנב הפולימראז מדורג ויש לו‬
‫תפקיד‬
‫חשוב‬
‫בבקרת‬
‫שלבים‬
‫שונים‬
‫בשיעתוק‪ .‬הזירחון הראשון נעשה על ‪Ser5‬‬
‫ברצף ה‪ .CTD-‬זירחון זה מאפשר ניתוק‬
‫ויציאה לדרך לצד השהיית השיעתוק בנקודה‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :16‬בקרת ביטוי גנים באאוקריוטים – המשך‬
‫‪127‬‬
‫מסויימת עד להוספת מבנה ‪ PEP‬למולקולת ה‪ .mRNA-‬רק בשלב זה יזורחן ‪ Ser2‬וסיום תהליכי הזירחון‬
‫יאפשר את היציאה מההשהייה ויצירת אלונגציה באופן יעיל‪.‬‬
‫השיעתוק דורש סיגנלים ליצירת קומפלקס מורכב על ה‪ DNA-‬הנבנה בשלבים‪.‬‬
‫כאשר מוסיפים את כל המרכיבים האלה לתרכיב עם גן בעל ‪ ,TATA BOX‬ניתן יהיה לקבל שיעתוק‬
‫מנקודת האיניציאציה הנכונה‪ .‬אולם האם באמת די ב‪ TATA BOX-‬בלבד כדי לקבל שיעתוק בתוך‬
‫התא? האם החדרה של גן אקראי לתאים תפיק שיעתוק נכון בתוך התא?‬
‫דבר זה נבדק על ידי החדרת ‪ .DNA‬קיימות מספר שיטות החדרת ‪ DNA‬לתאים בלי לפגוע בהם‪:‬‬
‫•‬
‫בעזרת קלציום‪-‬פוספט שיוצר אגרגטים של ה‪ DNA-‬העוברים אנדוציטוזה לתאים ומטופלים על ידי‬
‫המערכת כמו ‪ DNA‬אנדוגני‪ .‬השיטה המקובלת ביותר היא בעזרת ליפוזומים – ממברנות מלאכותיות‬
‫הכולאות את ה‪ DNA-‬מהתמיסה הנספחים אל הממברנה הציטופלזמטית‪.‬‬
‫•‬
‫אלקטרופורציה‪ ,‬המחוררת את הממברנה לרגע קל בעזרת זרם חשמלי קצר העובר בממברנה וגורם‬
‫לכניסת מולקולות ה‪ DNA-‬הטעונות לתוך התא‪.‬‬
‫שימוש בגן מדווח לזיהוי רצפי ‪DNA‬‬
‫בניסוי הבא מבקשים לבדוק איזה מקטע ראשוני של‬
‫גן מסויים‪ ,‬אשר ידוע שמועתק במבחנה בתנאים‬
‫הנכונים‪ ,‬יאפשר גם שיעתוק של גן מדווח המצוי על‬
‫גבי פלסמיד‪ .‬הגן המדווח הוא חלבון בעל פעילות‬
‫אנזימטית ייחודית שלא קיימת בתא – לרוב‬
‫בקטריאלי – שקל לזהות את הפעילות האנזימטית‬
‫שלו‪ .‬דוגמאות לכך הן‬
‫‪beta-galactosidase,‬‬
‫‪.CAT & Luciferase‬‬
‫לפלסמיד המכיל את אחד מהגנים המדווחים וללא‬
‫שום איזור בקרה לשיעתוק מוצמדים איזורים‬
‫שונים מגן אאוקריוטי ובודקים האם ניתן לקבל‬
‫ביטוי הדומה לביטוי הגן האנדוגני בתוך התא‪.‬‬
‫המקטעים שהוכנסו )צהוב( הוכנסו במעלה ה‪ORF-‬‬
‫של הגן המדווח )אפור( ובדקו כמה תוצר התקבל‬
‫בצאצאים‪.‬‬
‫לאחר טרנספקציה ה‪ DNA-‬מגיע לגרעין‪ ,‬עובר‬
‫שיעתוק ל‪ mRNA-‬ונמדדת פעילות הגן המדווח‪.‬‬
‫ניתן לראות בתוצאות שכאשר המקטע המוחדר מאיזור הגן האנדוגני קטן מאוד לא מתקבל ביטוי; כלומר‬
‫איזור תחילת השיעתוק לא מספיק לקבלת ביטוי‪ .‬במקטע יותר גדול שכולל ‪ TATA BOX‬או‬
‫איניציאטור ו‪ TATA BOX-‬מתקבל שיעור ביטוי בינוני אולם ככל שעולים באורך המחדר מתקבלת‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪128‬‬
‫קפיצה דרמטית בביטוי‪ .‬מכאן שבין‬
‫מקטעים ‪ 3‬ל‪ 2-‬יש רצף המאפשר‬
‫ביטוי יותר גבוה‪ ,‬הגברה של רמת‬
‫הביטוי‪.‬‬
‫‪Linker Scanning Mutations‬‬
‫באיור מופיעים חלקים מפלסמידים‬
‫ואיזור בקרה נחקר‪ .‬בתור ביקורת‬
‫לוקחים את איזור הביקורת השלם‬
‫ובניסוי מבקשים למצוא קופסאות‬
‫רצפים החשובות לרמת הביטוי‪.‬‬
‫לצורך כך מחליפים כל פעם קופסה‬
‫אחרת בגודל ‪ 10-12‬נוקליאוטידים‬
‫ברצף סינטטי באופן חופף‪ .‬לאחר מכן‬
‫בודקים איך השינויים השפיעו על‬
‫הביטוי‪.‬‬
‫ניתן לראות בעזרת התוצאות אילו איזורים מהווים ‪ ,control elements‬איזורים חופפים בין מקטעים‬
‫שבהחלפתם התקבל ביטוי נמוך או ללא ביטוי כלל‪ .‬שימו לב שהדבר תקף לאיזורי החפיפה – איזורים‬
‫שהופיעו בגדיל אחר בעל ביטוי גבוה לבטח אינם אלו שגורמים לירידה בביטוי אלא רק איזורים החופפים‬
‫בין מקטעים שבהם עוכב הביטוי‪.‬‬
‫מכאן עלה שישנם שלושה איזורי בקרה; כעת נשאלת השאלה מהם אותם איזורים ולמה הם משמשים‪.‬‬
‫דגם כללי לארגון האתרים המבקרים ביטוי גנים‬
‫בשיטות אלו זיהו רצפים שניתן לחלק לשניים‪:‬‬
‫•‬
‫איזורים החשובים לארגון קומפלקס האיניציאציה של השיעתוק‪.‬‬
‫•‬
‫איזורים שאותרו בסריקות לינקרים שהם איזורי בקרה הנחלקים בעצמם לשניים‪:‬‬
‫•‬
‫איזורים פרוקסימלים הנדרשים לסביבת הפרומוטור כדי לאפשר שיעתוק ברמה גבוהה;‬
‫•‬
‫איזורים מגבירים )‪ (enhancers‬היכולים להופיע במעלה נקודת תחילת השיעתוק ולפעמים‬
‫אפילו בתוך אינטרונים במורד נקודת תחילת השיעתוק‪.‬‬
‫ברצפים אלו ניתן לשנות את המיקום או האוריינטציה והם עדיין ייפעלו היטב – הרצפים של איזור‬
‫ההגברה גמישים מאוד ויכולים לעבוד ממרחק‪ .‬זאת לעומת האיזורים הפרוקסימלים‪ ,‬שאינם ניחנים‬
‫בגמישות ומחייבים מרחק ואוריינטציה ספציפיים מנקודת תחילת השיעתוק‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :16‬בקרת ביטוי גנים באאוקריוטים – המשך‬
‫‪129‬‬
‫ניסויים רבים שעסקו בבדיקת הרצפים של גנים מסויימים הראו שלכל גן יש חותמת ספציפית ייחודית של‬
‫אלמנטי בקרה‪ .‬רק כאשר כל האלמנטים הספציפיים נמצאים ניתן יהיה לקיים שיעתוק תקין‪ .‬פגיעה‬
‫ברצפי התיבות תפגע בשיעתוק בעוד שפגיעה באיזורי התווך בין תיבות לא תפגע בשיעתוק‪.‬‬
‫גנים שונים יכולים לחלוק ‪ ,TATA BOX‬שהיא אלמנט כללי לגיוס הפולימראז‪ ,‬אך הם מאופיינים‬
‫בדגם מאוד ספציפי של איזורי בקרה‪ ,‬רצפים מסויימים בשכיחות ובוריאציות שונות‪.‬‬
‫כרומטוגרפיה על קולונת זיקה ל‪DNA-‬‬
‫ניכר שאלמנטי הבקרה גורמים לבקרה חיובית‪ ,‬כי מוטציה גורמת לירידה בביטוי; ניתן לבדוק אם קיים‬
‫בתא חלבון שמכיר את הרצף הספציפי של התיבה‪ .‬לצורך בדיקה וזיהוי אלו משתמשים בכרומטוגרפיה –‬
‫הפעם על קולונת זיקה ל‪.DNA-‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪130‬‬
‫בונים שתי קולונות המכילות בידים‪ .‬לבידים קשורים גדילי ‪ .DNA‬בקולונה הראשונה הרצפים אקראיים;‬
‫בקולונה השנייה הבידים מצופים ברצף הניסוי‪ .‬כעת לוקחים תמצית של חלבוני התא ומעבירים דרך‬
‫הקולונה הראשונה בריכוז מלחים נמוך‪ .‬המלח גורם להוצאה של החלבונים שלא קשורים ל‪ ,DNA-‬כך‬
‫שבקולונה נותרים רק חלבונים עם אפיניות כלשהי ל‪ .DNA-‬החלבונים הקשורים נשטפים החוצה‬
‫בריכוזי מלח בינוניים‪.‬‬
‫את החלבונים קושרי ה‪ DNA-‬מטעינים בקולונה השנייה‪ ,‬בה הבידים מצופים ברצף הניסוי‪ .‬מעבירים את‬
‫החלבונים בקולונה ושוטפים בריכוז מלח בינוני; כל החלבונים בעלי הזיקה ל‪ DNA-‬שאינה חזקה‬
‫נשטפים החוצה‪ .‬החלבונים הקשורים יהיו חלבונים בעלי זיקה חזקה לרצף הספציפי‪ ,‬הנשטפים החוצה‬
‫בריכוזי מלח גבוהים‪.‬‬
‫ניסוי זה מאפשר לבדוק אם התא מכיל חלבון שמכיר ספציפית את רצף הבקרה שזוהה עוד קודם‪.‬‬
‫ניקוי חלבון ה‪ Sp1-‬על קולונת זיקה ל‪DNA-‬‬
‫כאשר חוזרים ושוטפים בשיטה זו את החלבון ניתן להפיק‬
‫בנד ברור של החלבון שנקשר חזק מאוד לרצף הבקרה‬
‫הנבדק‪ ,‬למשל ‪ .GC‬כעת ניתן לבצע אנליזת טביעת רגל‬
‫לחלבון ולאשש את העובדה שהוא נקשר לתיבת ‪.GC‬‬
‫החלבון המזהה בתוך רצף גדול ב‪ DNA-‬את תיבת ה‪GC-‬‬
‫מכונה פקטור שיעתוק והוא משנה את בקרת השיעתוק‬
‫בתא‪ .‬הפונקציה של פקטורי שיעתוק הינה היכולת לזהות‬
‫רצפים ספציפיים ולעורר אקטיבציה של שיעתוק‪.‬‬
‫בדיקת ‪ In vivo‬לאישור פעילותו המאקטבת של פקטור שיעתוק‬
‫נתונים שני פלסמידים‪ ,‬כאשר פלסמיד ‪ 2‬נושא גן מדווח‬
‫ואתר קישור של פקטור שיעתוק ופלסמיד ‪ 1‬מכיל את הגן‬
‫לפקטור השיעתוק הנבחן‪ .‬שני הפלסמידים מוכנסים לתאים‬
‫שלא מבטאים אנדוגנית את פקטור השיעתוק – עובדה‬
‫שמוודאים בביקורת בה מכניסים את פלסמיד ‪ 2‬לבדו‪.‬‬
‫בטרנספקציה כפולה של שני הפלסמידים ניתן לראות ביטוי‬
‫של הגן המדווח ועל ידי כך להוכיח שיש פונקציית‬
‫אקטיבציה של פקטור השיעתוק‪.‬‬
‫תוצאות הניסוי מודגמות באיור הבא‪ .‬המטרה היא לבדוק את‬
‫פונקציות הקישור ל‪ DNA-‬ושיפעול השיעתוק‪ ,‬והאם שתי הפונקציות‬
‫קשורות זו בזו‪ .‬במקרה זה מסתכלים על פקטור השיעתוק השמרי ‪GAL4‬‬
‫היודע להיקשר לרצף ה‪ UAS .UAS-‬מחובר לגן המדווח ‪ .LacZ‬כעת‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :16‬בקרת ביטוי גנים באאוקריוטים – המשך‬
‫‪131‬‬
‫בודקים האם החלבון יכול לקשור את‬
‫ה‪ UAS-‬ואת היכולת לאקטב שיעתוק‬
‫ויצירה מוגברת של ‪.LacZ‬‬
‫האיור מציג את יכולת הקשירה‬
‫והשפעול של פקטור השיעתוק השלם‬
‫ושל פקטור שיעתוק המכיל מחיקות‬
‫)‪ (deletions‬במקומות שונים‪ .‬כאשר‬
‫מורידים את ‪ 50‬חומצות האמינו‬
‫הראשונות בקצה ‪ N‬של החלבון‪,‬‬
‫החלבון מאבד את יכולת הקישור ואת‬
‫יכולת שיפעול השיעתוק‪ .‬כאשר מורידים מספר דומה של חומצות‬
‫אמינו מקצה ‪ C‬לא קורה דבר; רק בנקודה ‪ 792‬ככל שמסירים‬
‫יותר מהחלבון פוגעים שוב באופן דרמטי ביכולת השיפעול של‬
‫הגן‪ .‬כאשר יוצרים חלבון בעל החלקים הפעילים בלבד‪ ,‬שהסרתם‬
‫פגעה בפעילות‪ ,‬הם יכולים לגרום לקשירה ולשיפעול‪.‬‬
‫מכאן שאיזור הקישור ואיזור השיפעול אינם אותו איזור; איזור‬
‫הקישור הוא בקצה ה‪ N-‬טרמינלי )‪ 74‬חומצות אמינו ראשונות(‬
‫והרצפים ‪ 738-881‬בקצה ‪ C‬הם אחראים לשפעול השיעתוק‪.‬‬
‫המבנה המודולרי של פקטורי שיעתוק אאוקריוטים‬
‫מיקום האתרים המשפעלים והקושרים משתנים בין פקטורי שיעתוק שונים באאוקריוטים אך על פי רוב‬
‫אלו אתרים נפרדים בחלבון‪ .‬לרוב יש אתר קישור אחד בלבד ואתר שיפעול אחד או יותר‪.‬‬
‫אתר קישור ‪DNA‬‬
‫יש כ‪ 10-20-‬נקודות מגע בין אתר הקישור של החלבון לרצף המזוהה על ידיו‪ .‬המגע הזה מיוצג בקשרי‬
‫מימן‪ ,‬קשרים יוניים וקשרים הידרופוביים – קשרים חלשים אך רבים המחזקים במספריהם את הקישור‪.‬‬
‫ישנם אלמנטים מאוד אופייניים לאתרי הקישור ל‪-‬‬
‫‪ DNA‬של פקטורי שיעתוק‪ .‬אחד מהם הוא‬
‫"אצבעות אבץ" המצוי בפקטור ‪ Sp1‬ולרוב חוזר‬
‫בפקטורי שיעתוק מספר פעמים‪ .‬האצבע מכילה‬
‫מבנה אחד של אלפא‪-‬הליקס ומבנה של בטא‪-‬שיט‪.‬‬
‫השניים מתקרבים בעזרת האבץ‪ .‬האיזור הנקשר ל‪-‬‬
‫‪ DNA‬הוא האלפא‪-‬הליקס שנקשר לתעלה הרחבה של ה‪ .DNA-‬אם רצף הנוקליאוטידים מתאים‬
‫לפקטור השיעתוק‪ ,‬יש קישור יציב המאפשר גיוס של הפקטור למבנה יציב עם ה‪.DNA-‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪132‬‬
‫מבנה אופייני נוסף הוא המוטיב הליקס‪-‬לופ‪-‬הליקס‪.‬‬
‫באיור מופיעים שני פקטורי שיעתוק העובדים כדימר‬
‫– אפור עם אדום‪ .‬אלפא הליקסים של איזור אחד‬
‫יוצרים את הדימר והשניים יוצרים את הקישור ל‪-‬‬
‫‪ .DNA‬במבנה הטרודימרי‪ ,‬ככל הנראה כל אלפא‬
‫הליקס מזהה רצף אחר בגן‪.‬‬
‫אפשרויות קומבינטוריקה‬
‫רוב פקטורי השיעתוק עובדים כדימרים למעט בעלי אצבעות האבץ‪ .‬חלבונים שנקשרים כדימרים יכולים‬
‫להסביר את הקומבינטוריקה המורכבת של פקטורי הישעתוק – מודע יש מעט פקטורי שיעתוק יחסית והם‬
‫עדיין יכולים לנהל בקרה מורכבת של הרבה מאוד גנים‪.‬‬
‫אם שני פקטורי שיעתוק משתייכים לאותה משפחה שמסוגלת ליצור דימרים והטרודימרים‪ ,‬כל אחד מהם‬
‫מכיר רצף אחד ומעט שונה; שלושה פקטורי שיעתוק שיודעים לעשות ביניהם דימריזציה מאפשרים‬
‫לשלוט על שישה אתרי זיהוי ‪ DNA‬שונים‪.‬‬
‫העובדה שפקטורי שיעתוק נקשרים כדימרים מאפשרת קומבינטוריקה של מעט פקטורים לבקרת‬
‫מגוון רחב ושונה של אתרי בקרה‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :17‬בקרת ביטוי גנים אאוקריוטים – המשך‬
‫‪133‬‬
‫שיעור ‪ :17‬בקרת ביטוי גנים אאוקריוטים – המשך‬
‫אתרי הפעלת השיעתוק‬
‫אתרים אלו בעלי מאפיינים מגוונים‪:‬‬
‫•‬
‫‪Acidic Domains‬‬
‫•‬
‫‪Glutamine-Rich Domains‬‬
‫•‬
‫‪Proline-Rich Domains‬‬
‫יש מאפיינים שחוזרים על עצמם‪ ,‬אבל‬
‫מתוך לא ניתן להקיש הכרתם כיצד הם‬
‫פועלים‪ .‬פריצת דרך התקבלה כאשר‬
‫התחילו לחפש את החלבונים שבאים‬
‫באינטראקציה עם המוטיבים‪.‬‬
‫ממחקר זה עלה שאתר ההפעלה של‬
‫פקטורי‬
‫השיעתוק‬
‫יכול‬
‫לעבור‬
‫אינטראקציה עם קומפוננטות שונות‬
‫של פקטורי השיעתוק הכלליים‪ ,‬הכוללים את הפולימראז ו‪ TAF-‬שונים‪ .‬מתברר שיכולת אינטראקציה זו‬
‫היא חלק מרכזי ביכולת האקטיבציה כיוון שפגיעה ביכולת לאינטראקציה פוגעת ביכולת אקטיבציית‬
‫השיעתוק‪ .‬כמו כן נמצא שהאינטראקציה של חלק מהחלבונים היא ישירה וחלקה עקיפה דרך חלבונים‬
‫מתווכים )‪.(mediators‬‬
‫באיור ניתן לראות את קומפלקס איניציאציית‬
‫השיעתוק קשור ל‪ ,DNA-‬חלבוני ‪ TAF‬שהם חלק‬
‫מה‪ TFIID-‬וכן פקטורי שיעתוק שונים בעלי אתרי‬
‫אקטיבציה ואתרי קשירת ‪ .DNA‬בעזרת אתרי‬
‫האקטיבציה נוצר קשר ישיר עם קומפוננטות של‬
‫קומפלקס האיניציאציה‪ ,‬כמו ‪ ,TAF‬או באמצעות‬
‫מתווכים שהם חלבונים היכולים ליצור קשר עם‬
‫מרכיבי אקטיבציה של פקטורי שיעתוק וקשר עם‬
‫מרכיבים בקומפלקס האיניציאציה‪.‬‬
‫בתמונה מופיע גן המבוטא ספציפית בתאי כבד‪ .‬הוא‬
‫קושר פקטורי שיעתוק נפוצים – המבוטאים בחלק‬
‫גדול מהתאים – וגם פקטורי שיעתוק המבוטאים‬
‫באופן סלקטיבי בהפטוציטים‪ ,‬תאי כבד‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪134‬‬
‫בתמונה משמאל ניתן לראות איך‬
‫הקומפקלס הזה נראה – לגן יש אתרי‬
‫קישור‬
‫פרוקסימליים‬
‫סמוכים‬
‫ל‪-‬‬
‫‪ TATA BOX‬שהמיקום שלהם קריטי‬
‫ואתרים רחוקים מגבירים שהמיקום‬
‫שלהם פחות רלוונטי לתפקודם‪ .‬האיור‬
‫מדגים את הקישור של קומפלקס‬
‫איניציאציית השיעתוק ושל פקטורי‬
‫השיעתוק הפרוקסימליים והדיסטליים‬
‫השונים הנקשרים אליו ומשפעלים‬
‫אותו‪.‬‬
‫על סמך ממצאים שכאלו התגלה אחד המנגנונים באמצעותו פקטורי שיעתוק מפעילים שיעתוק‪:‬‬
‫ייצוב הקישור בין קומפלקס האיניציאציה של השיעתוק ל‪ DNA-‬מעודד את השיעתוק‪ ,‬כאשר‬
‫ייצוב זה נעשה על ידי פקטורי שיעתוק באופן ישיר או עקיף דרך מתווכים‪.‬‬
‫הגנום האאוקריוטי ארוז בחלבוני כרומטין‬
‫מנגנון בקרה חשוב נוסף הוא מבנה הכרומטין המיוחד של הגנום האאוקריוטי‪ .‬שנים רבות נחשבו חלבוני‬
‫הכרומטין כקשורים לדחיסת ה‪ DNA-‬הנדרשת להכלתו במבנה הגרעין הקטן או דחיסה מוגברת בחלוקה‬
‫תאית‪ .‬מתברר‪ ,‬עם זאת‪ ,‬שיש לו גם תפקיד חשוב בבקרה‪.‬‬
‫נוקליאוזומים‪ ,‬העשויים קומפלקס היסטון העטוף כמעט פעמיים על‬
‫ידי ‪ ,DNA‬יוצרים מארזים ברמות מורכבוּת ההולכות ומתפתלות‬
‫עד שנוצר מבנהו הדחוס של הכרומוזום‪ .‬במיקרוסקופ אלקטרוני‬
‫ניתן לראות את הנוקליאוזומים הנראים כמו חרוזים על חוט‪.‬‬
‫נוקליאזות המפרקות את ה‪ DNA-‬שאינו מלופף מאפשרות לראות‬
‫כמה ‪ DNA‬קשור בכל נוקליאוזום‪ .‬אלמנט חשוב בנוקליאוזום הוא‬
‫ההיסטונים – ארבעה סוגי היסטונים יוצרים את מבנה הנקליאוזום‪,‬‬
‫בעזרת הצטרפות של שני הטרו‪-‬דימרים שונים )דימר של ‪H3+H4‬‬
‫ושל ‪ .(H1+H2‬מכל דימר יש שני זוגות‪ ,‬כך שסה"כ יש שמונה‬
‫חלבונים וארבעה דימרים משני סוגים שונים במבנה‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :17‬בקרת ביטוי גנים אאוקריוטים – המשך‬
‫‪135‬‬
‫להיסטונים יש זנבות פפטידים הנותרים חשופים‬
‫במבנה האוקטמר ומהווים‪ ,‬ככל הנראה‪ ,‬מורה דרך‬
‫לגנום כשהוא יוצר את הקיפול שלו‪ .‬בנוסף‬
‫להיסטונים שבליבה יש היסטון נוסף‪ H1 ,‬אשר‬
‫נקשר לאיזור ה‪ .DNA linker-‬הקישור מאפשר‬
‫קירוב נוקליאוזומים בעת יצירת סיבי ה‪.DNA-‬‬
‫במשך שנים היה ידוע שמבנה הכרומטין לאורך מולקולת ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬אינו אחיד‪ :‬ישנם איזורים דחוסים מאוד לעומת‬
‫איזורים רפויים יותר‪ .‬ההבדלים במבנה הינם בתאימות‬
‫ישירה‬
‫לשיעתוק‬
‫הגנים‪:‬‬
‫איזור‬
‫בו‬
‫נמצאים‬
‫גנים‬
‫העוברים‪/‬עומדים לעבור שיעתוק בזמן נתון יהיה רפוי‪ ,‬בעוד‬
‫שאיזורי גנים שאינם משועתקים באותו סוג תא יהיו במבנה‬
‫כרומטין דחוס‪.‬‬
‫עובדה זו ניתן להדגים בעזרת ‪ DNaseI‬המסוגל לחתוך‬
‫איזורי ‪ DNA‬חשופים‪ .‬הוא יחתוך איזורים של גנים‬
‫המקודדים לאלמנטים משועתקים בעוד שהמבנים הדחוסים‬
‫לא יהיו חשופים ולכן לא ייחתכו‪.‬‬
‫כאשר בודקים תא שבו גן מסויים לא פעיל – למשל הגלובין המבוטא רק בכדוריות דם אדומות ממויינות‬
‫– איזור הגן יהיה דחוס מאוד בתאים אחרים אך בכדוריות הוא יהיה רפוי יותר‪ .‬כעת מגיבים עם ה‪-‬‬
‫‪ DNase‬גרעינים מתאים בהם הגן איננו משועתק וגרעינים מתאים בהם הגן משועתק‪ ,‬האיזור החשוף‬
‫יאוכל – איכול שניתן להבחין בו על ידי מיצוי ה‪ DNA-‬ושימוש באנזימי הגבלה החותכים באיזור הגן‪.‬‬
‫אם הגן פורק על ידי ה‪ DNase-‬הרי שלא תהיה אותה דוגמת חיתוך כמו בתאים בהם הגן היה פעיל‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪136‬‬
‫בעבר הניחו שבשל תהליכי השיעתוק‪ ,‬פתיחת בועת השיעתוק וכדומה נגרמים שינויים מהותיים למבנה‬
‫הכרומטין; שינוי בגישה זו התקבל לפני ‪ 15‬שנה כשהתגלו חלבונים המסוגלים לבצע שינוי ספציפי –‬
‫על‬
‫מודיפיקציה‬
‫גבי‬
‫היסטונים‪.‬‬
‫האנזימים האלה‪ ,‬או הקומפלקסים‬
‫המכילים‬
‫אותם‪,‬‬
‫לעבור‬
‫יודעים‬
‫אינטראקציה עם אתרי האקטיבציה‬
‫של פקטורי שיעתוק‪.‬‬
‫ממצא זה פתח תחום חדש לחלוטין;‬
‫עם‬
‫וזיהוי‬
‫השנים‬
‫הקומפוננטות‬
‫הסתבר שיש שתי מערכות פעילות‬
‫נפרדות‬
‫האחראיות‬
‫לשינויים‬
‫בכרומטין‪ .‬הפעילויות מגוייסות על‬
‫ידי אתר האקטיבציה של פקטורי‬
‫שיעתוק‪.‬‬
‫הפעילות הראשונה שזוהתה היא אצטילציה של היסטון )‪ .(HAT=histone acetylase‬הפעילות השניה‬
‫הינה עיצוב‪-‬מחדש )‪ (re-modeling‬של ההיסטונים – להזיז אותם פיזית על מנת לחשוף אותם יותר‪.‬‬
‫קומפלקס ‪ SAGA‬בשמר‬
‫הקומפלקס מכיל את היחידה ‪ Gcn5‬בעלת פעילות‬
‫‪ .HAT‬החלבונים בקומפלקס יודעים לעבור‬
‫אינטראקציה עם ‪ – TAF‬מרכיבים של ‪TFIID‬‬
‫שעוברים אינטראקציה עם ‪ .TBP‬הקומפלקס יודע‬
‫לתווך קישור ל‪ TBP-‬ולקומפלקס האיניציאציה‪ ,‬וכן‬
‫הוא מכיל פעילות של ‪.HAT‬‬
‫אנזים ‪ HAT‬יודע להוסיף קבוצת אצטיל ממולקולת ‪ Acetyl-CoA‬לחומצת האמינו ליזין‪ .‬הוספה זו‬
‫מנטרלת את המטען החשמלי החיובי של ליזין‪ ,‬הנמצאים בקצוות ‪ N‬של ההיסטון‪ ,‬העשירים בליזין‪ .‬מטענו‬
‫החיובי של הליזין עוזר ליצור קשר הדוק עם מולקולת ה‪ DNA-‬הטעונה שלילית ויוצר מבנה חזק של‬
‫היסטון‪ ;DNA-‬פעילות ה‪ HAT-‬פורקת את המטען החיובי של הזנבות והמבנה החזק הזה של ההיסטון‪-‬‬
‫‪ DNA‬נפרם‪.‬‬
‫ההיסטונים קשורים באופן רפוי בלבד למולקולת ה‪ DNA-‬המלופפת סביבם‪ .‬האצטילציה מאפשרת‬
‫זמינות של איזורי בקרה כמו ‪ TATA BOX‬לצורך קישור קומפלקס האיניציאציה ופקטורי שיעתוק‬
‫נוספים‪ .‬פקטור השיעתוק המגייס את הקומפלקס עם ה‪ HAT-‬נקשר לאיזור ה‪.DNA linker-‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :17‬בקרת ביטוי גנים אאוקריוטים – המשך‬
‫‪137‬‬
‫בתאים אאוקריוטים יש גם פעילות של רפרסורים‪,‬‬
‫הנקשרים‬
‫לאתר‬
‫רפרסיה‬
‫מסויים‬
‫ב‪.DNA-‬‬
‫הרפרסור היודע לגייס קומפלקס חלבוני אחר‬
‫באמצעות אפיניות לתת יחידה מסויימת בקומפלקס‪.‬‬
‫הקומפלקס המתווך את פעילות הרפרסור הינו בעל‬
‫פעילות קטליטית לדה‪-‬אצטילציה‪ ,‬הסרת קבוצות‬
‫אצטיל מזנבות ההיסטון‪ .‬פעולה זו‪ ,‬כמובן‪ ,‬מחזקת‬
‫את קשר ה‪.DNA-Histone-‬‬
‫מעבר לפעילות האצטילציה‪ ,‬יש קומפלקס אחרים‬
‫עם פעילויות אנזימטיות אחרות להיסטון – כמו‬
‫זירחון‪ ,‬יוביקוויטינציה ומתילציה‪ .‬עם השנים‬
‫מתגלות חותמות שינויים ומודיפיקציות שמאפיינות‬
‫שיפעול לעומת כאלו המאפיינות עיכוב‪.‬‬
‫המודיפיקציות מתאפשרות על ידי גיוס קומפלקסים‬
‫לזירחון או מתילציה‪ .‬הגיוס נעשה על ידי פקטורי‬
‫שיעתוק‪ .‬כיום מוכרות יחידות קטליטיות בעלות‬
‫חתימות מיוחדות – ‪ HAT‬שיודעים לאצטל עמדת‬
‫ליזין מוסיימת‪ ,‬קינאזות שמזרחנות מגוון אתרים ספציפיים וכדומה‪ .‬מניחים שפקטורי שיעתוק יכולים‬
‫לגייס באתר האקטיבציה קומפלקסים מסויימים וספציפיים‪ ,‬שלהם בתורם יש ספציפיות למודיפיקציות‬
‫בנקודות מסויימות על זנב ההיסטון‪ .‬נוכחות של הרבה פקטורי שיעתוק מבטיחה מודיפיקציות בעמדות‬
‫שונות על ידי מגוון קומפלקסים מגוייסים‪.‬‬
‫הזירחון והמתילציות ושאר המודיפיקציות הן פלטפורמה למודיפיקציות של מתילציית ‪ ,DNA‬כפי‬
‫שמבינים היום‪ .‬זוהי רמה נוספת של בקרה – מעבר לרמה הגנטית – על ידי חותם על גבי ההיסטונים‬
‫שמוקנה על ידי פקטורי השיעתוק והקומפלקסים שהם יודעים לגייס‪.‬‬
‫קומפלקס עיצוב‪-‬מחדש )‪ (remodeling‬של הכרומטין‬
‫זוהי המערכת השנייה המגוייסת על ידי פקטורי השיעתוק‪ .‬מערכת‬
‫זו גם היא מערכת חלבונית‪ ,‬שבה אחת היחידות בעלת פונקציה של‬
‫עיצוב‪-‬מחדש והאחרות מאפשרות גיוס בעזרת מגוון פקטורי‬
‫שיעתוק של התא‪.‬‬
‫אופן ביצוע העיצוב‪-‬מחדש אינו ברור‪ ,‬אך מניחים שאלו היחידות‬
‫שמזיזות את ההיסטון לאורך ה‪ DNA-‬או אפילו מסלקות אותו‬
‫במקומות בהם נערכה אצטילציה‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪138‬‬
‫פעילויות ביוכימיות של קומפלקס ‪SWI/SNF‬‬
‫ניתן להפיק במבחנה נוקליאוזומים בודדים שונים )‪ .(1‬בנוקליאוזום יש נקודות מגע הדוקות ברמות‬
‫שונות‪ .‬בהפעלת ‪ DNase‬מתקבלת טביעת רגל של איזורים רגישים יותר ופחות לחיתוך‪ .‬אם הניסוי נעשה‬
‫לאחר הגדרת הנוקליאוזום עם קומפלקס ‪ ,SWI/SNF‬ניתן לראות שינוי בטביעת הרגל של ה‪.DNA-‬‬
‫שינוי נוסף שניתן לראות מתקבל כאשר בוחנים את היכולת של נוקליאוזומים לדימריזציה )‪ .(2‬במקרה זה‬
‫אין שימוש ב‪ DNase-‬אלא בנוקליאוזומים עצמם‪ :‬מריצים אותם בג'ל ובודקים לאן הם רצים‪ .‬כאשר‬
‫מריצים אותם לאחר הדגרה עם הקומפלקס‪ ,‬מתקבלת ריצה עד נקודת אחרת – מה שמעיד על מבנה אחר‬
‫הרץ לאט יותר‪.‬‬
‫בניסוי שלישי )‪ (3‬ניתן להוסיף ‪ DNA‬לא ארוז בנוקליאוזום שזהה ל‪ DNA-‬הארוז‪ .‬פיסת ה‪DNA-‬‬
‫המוספת היא רדיואקטיבית‪ ,‬והפיסה על הנוקליאוזום אינה רדיואקטיבית‪ .‬כאשר מריצים את הנוקליאוזום‬
‫עם הגדיל בלבד‪ ,‬מתקבלת טביעה של הגדיל לבדו‪ .‬אם מדגירים אותם קודם עם הקומפלקס‪ ,‬מתקבלים‬
‫שני בנדים ב‪ – Gel-Shift-‬של הנוקליאוזום ושל הגדיל הבודד‪ .‬הדבר מעיד על החלפה בין הגדיל האחוז‬
‫להיסטון והגדיל החופשי‪.‬‬
‫בניסוי‬
‫האחרון‬
‫)‪(4‬‬
‫לוקחים‬
‫שרשרת‬
‫של‬
‫נוקליאוזומים מחוברים ושני אנזימי הגבלה‪ ,‬שהאתר‬
‫של האחד )‪ (A‬נמצא באיזור דחוס יותר מהשני )‪.(B‬‬
‫עקב כך‪ ,‬מידת החיתוך בעזרת ‪ A‬תהיה נמוכה יותר‬
‫מאשר בעזרת ‪ .B‬הדגרה עם ‪ SWI‬יכולה להוביל‬
‫להזזה של הנוקליאוזום כך שייחשף האתר של ‪A‬‬
‫וייחסם האתר של ‪ B‬והתוצאות ייתהפכו‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :17‬בקרת ביטוי גנים אאוקריוטים – המשך‬
‫‪139‬‬
‫מודל היפותטי לתיאור פעילות קומפלקס ‪SWI/SNF‬‬
‫קומפלקס ‪ SWI‬מסוגל להזיז את הנוקליאוזומים‪ ,‬ככל הנראה‪ ,‬באופן יעיל לאורך ה‪ ,DNA-‬על ידי הורדת‬
‫אנרגיית השיפעול הנדרשת במצבי הביניים; הוא משנה את הדינמיות של מבנה ה‪ DNA-‬המאפשר קישור‬
‫של פקטורי שיעתוק נוספים והמשך קישור של קומפלקס האיניציאציה של השיעתוק המאפשר שיעתוק‪.‬‬
‫מעורבות ה‪ SWI/SNF-‬בשיעתוק‬
‫במערכת הניסוי ‪ in vitro‬לוקחים ‪ DNA‬המאורגן ככרומטין ומכיל אתרי קישור לפקטורי השיעתוק‬
‫המפורטים באיור‪ .‬כעת בודקים מה קורה במבנה הכרומטין‪.‬‬
‫ללא מבנה כרומטין‪ ,‬הוספת אלמנטי שיעתוק מספיקה לשיעתוק; אולם במבנה הכרומטין הוספת פקטורי‬
‫השיעתוק לבדם אינה מספיקה על מנת ליצור שיעתוק‪ .‬ללא ‪ ,SWI‬הוספה או היעדר פקטור השיעתוק‬
‫מסתיימים באותה המידה בחוסר שיעתוק של גן הבחן‪.‬‬
‫הוספה של קומפלקס ‪ SWI‬למערכת גורמת להגברה ניכרת בשיעתוק הגן )כאשר הוספו גם פקטורי‬
‫השיעתוק(‪ .‬בהוספה של פקטור ‪ GATA‬יש ביטוי של הגן‪ ,‬העולה ביחס ישר לריכוז ‪ .GATA‬יחד עם‬
‫זאת כאשר מוסיפים לפקטור השיעתוק גם את ‪ ,SWI‬יש עדיין עלייה מהותית בשיעתוק – ככל הנראה‬
‫תודות להזזת הנוקליאוזום כך שתהיה גישה נוחה יותר לפקטור השיעתוק וליצירת קומפלקס‬
‫האיניציאציה‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪140‬‬
‫אצטילציה של היסטונים היא דו כיוונית‬
‫בין שני גנים סמוכים‪ ,‬כאשר צריך אקטיבציה רק של גן אחד ומכיוון שהאצטילציה היא לשני הכיוונים‪,‬‬
‫שני הגנים יעברו פרישה של הנוקליאוזום ולכן שניהם יוכלו להיות משועתקים‪ .‬כיצד ניתן למנוע שיעתוק‬
‫של גן אחד ולא את השיעתוק של הגן הסמוך לו?‬
‫מתברר שקיימים אתרי בידוד או גבול הנמצאים במקומות שונים בין גנים סמוכים‪ .‬הרצפים יודעים לגייס‬
‫חלבונים המבטיחים שסוף איזור האצטילציה יהיה בנקודה בה הם נמצאים‪ .‬הם ממסכים את יכולת ה‪-‬‬
‫‪ HAT‬לעבור מעבר לגבולות עליהם הם שומרים‪.‬‬
‫סיכום – האבולוציה של הבנת השיעתוק האאוקריוטי‬
‫עם השנים הבינו שיש איזורים המהווים את פרומוטור הליבה‪ ,‬הצמודים לאיזורי רצף הגן‪ .‬הם בעלי‬
‫רצפים שונים בקומבינציות שונות ומכתיבים את נקודת תחילת השיעתוק‪ .‬כמו כן נמצאו רצפים נוספים‬
‫שמשמשים אתרי קישור לפקטורי שיעתוק – אתרים פרוקסימליים הסמוכים לנקודת תחילת השיעתוק‬
‫ואתרים מרוחקים לאקטיבטורים‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :17‬בקרת ביטוי גנים אאוקריוטים – המשך‬
‫‪141‬‬
‫הפרומוטור מכיל רכיבים לחלבוני קומפלקס האיניציאציה‪ ,‬כאשר פולימראז הוא בפירוש לא הראשון‬
‫שנקשר; הרצפים הפרוקסימליים מהווים אתרי קישור לפקטורי שיעתוק המורכבים מאלמנט קושר‪DNA-‬‬
‫ואלמנט אקטיבטורי‪.‬‬
‫חלק מהרכיבים האלה יכולים ליצור אסוציאציות עם קומפלקס האיניציאציה דרך קשר ישיר או מתווכים‪.‬‬
‫בנוסף‪ ,‬אקטיבטורים על אתרים דיסטאליים יודעים לקשור קומפלקסים משני סוגים‪ :‬קומפלקס העיצוב‪-‬‬
‫מחדש המזיז היסטונים על גבי ה‪ DNA-‬או קומפלקסים דוגמת ‪ HAT‬המבצעים מודיפיקציות בגנום‪.‬‬
‫כיצד תאים נבדלים אלו מאלו?‬
‫•‬
‫ביטוי של פקטורי שיעתוק שונים בתאים שונים‬
‫•‬
‫שונות ברמות הפעילות של חלבונים – פקטור השיעתוק קיים בשתי רקמות שונות‪ ,‬אך ברקמה אחת‬
‫הוא מקבל סיגנלים לכניסה לגרעין בהרקמה שנייה לא ולכן אינו יכול לשפעל את הגנים בה‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬