‫שיעור ‪ :01‬מבוא לביולוגיה מולקולרית‬ ‫‪1‬‬ ‫שיעור ‪ :01‬מבוא לביולוגיה מולקולרית‬ ‫ציוני דרך בגנטיקה מולקולרית‬ ‫לפני ‪ 150‬שנה שלטה ההשקפה המכונה "הדוֹגמה המרכזית" – ‪ RNA ,DNA‬וחלבונים‪ ,‬שהתבססה על‬ ‫מבנה הדו‪-‬סליל של ה‪ ,DNA-‬הצופן הגנטי ותפקיד ה‪ RNA-‬בתרגום החלבונים‪ .‬הדוֹגמה המרכזית‬ ‫הובילה לתפיסה שה‪ DNA-‬נושא את המטען התורשתי‪ ,‬משתכפל במדוייק ומדי פעם יש טעויות הגורמות‬ ‫לאבולוציה‪ .‬ל‪ RNA-‬נחשב תפקיד צנוע שהוא שיעתוק מה‪ ,DNA-‬תרגום לחלבונים וסיוע לחלבונים‬ ‫בתור גדילים המהווים "פיגומים"‪ ,‬כמו ה‪ .rRNA-‬החלבונים נחשבו לבעלי התפקיד המרכזי‪ ,‬בזירוז‬ ‫תהליכים שונים בתא‪ ,‬בין היתר השכפול‪ ,‬השיעתוק והתרגום‪.‬‬ ‫במרוצת השנים חלו שינויים בתפיסה זו‪:‬‬ ‫•‬ ‫בשנות ה‪ 70-‬התגלה שיש אנזימים שמסנטזים ‪ DNA‬על תבנית ‪ ,RT) RNA‬תומך בטענה ש‪RNA-‬‬ ‫היתה המולקולה הקדומה שקדמה ל‪ DNA-‬ולחלבונים יחד(‪.‬‬ ‫•‬ ‫בשנות ה‪ 80-‬התגלו הריבוזימים )‪ – (Ribozyme‬מולקולות ‪ RNA‬שמזרזות ריאקצות אנזימטיות‬ ‫כמו חלבונים‪.‬‬ ‫•‬ ‫בשנות ה‪ 90-‬מתגלה שניתן להסיר כמעט את כל חלבוני הריבוזום ולהותיר את ה‪ rRNA-‬שיכול לזרז‬ ‫יצירת קשרים פפטידים בחלבונים‪ .‬בהמשך מתגלה שהאתר הקטליטי היוצר קשר פפטידי הוא אתר‬ ‫החף מחלבונים לחלוטין‪.‬‬ ‫ה‪ RNA-‬היה ככל הנראה המולקולה הגנטית הראשונה; במשך כמה מיליוני שנים התקיים "עולם ה‪-‬‬ ‫‪ – "RNA‬בו ה‪ RNA-‬מילא הן תפקיד המטען הגנטי והן את תפקיד הזרז )למרות שכנראה נעזר‬ ‫בפפטידים קטנים(‪ .‬לא ברור מה הסביבה התאית בה עבדו המולקולות או איך נטלו ממנו תפקידים אלו ה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬והחלבונים‪.‬‬ ‫בסיס חומצות הגרעין‬ ‫חומצות הגרעין בנויות מארבעה בסיסים שכיחים הנגזרים משתי תרכובות‪ :‬פירימידין ופורין‪ ,‬תרכובות‬ ‫שטוחות וקשיחות בהן האטומים זזים מעט מאוד אחד ביחס לשני )תודות לקשרים הכפולים המקיימים‬ ‫רזוננס(‪ .‬הפורין יוצר את האדנין והגואנין‪,‬‬ ‫הפירימידין את הציטוזין והטימין‪ .‬חנקנים ‪9‬‬ ‫בפורין ו‪ 1-‬בפירימידין הם נקודות הקישור לסוכר‬ ‫בקשר נוקליאוזידי‪ .‬ב‪ RNA-‬יש בסיס אוראציל‬ ‫במקום טימין‪ .‬אורציל הוא בסיס קדום יותר‬ ‫אבולוציונית וחסר קבוצה מתילית בפחמן ‪.5‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪2‬‬ ‫לכל בסיס יש מספר מצבים טאוטומרים )למטה(‪,‬‬ ‫כאשר המצב הנפוץ הוא מצב הקטו והמצבים‬ ‫הנדירים משפיעים על היכולת ליצור קשרים וזיווגי‬ ‫בסיסים‪ .‬עובדה זו מעלה את הסיכוי לטעויות‬ ‫בשיכפול על ידי "התחפשות" של נוקליאוטיד אחד‬ ‫לאחר‪.‬‬ ‫הבסיסים בעלי שתי תכונות חשובות‪:‬‬ ‫•‬ ‫התקשרות בקשרי מימן דרך צלעותיהם‪ .‬בעלת חשיבות לקביעת הגיאומטריה של חומצת הגרעין –‬ ‫בין שיהיה ‪ DNA‬דו‪-‬גדילי או מולקולת ‪ RNA‬גלובולרית‪ .‬קשרי המימן מתאפשרים בסביבה‬ ‫ההידרופובית‪-‬פנימית של חומצת הגרעין ולא בחיצונית‪ ,‬שם יש תחרות עם מולקולות מים‪.‬‬ ‫•‬ ‫קישור בין המישורים של שני נוקליאוטידים באינטראקציית מערום )‪ ,(stacking‬אינטראקציות‬ ‫דיפול‪-‬דיפול בין עננות אלקטרוני ‪ π‬של כל מישור )מרחק של כ‪ 3-‬אנגסטרום(‪ .‬התקשרות זו יוצרת‬ ‫סביבה הידרופובית פנימית‪.‬‬ ‫לבד מארבעת הבסיסים השכיחים קיימים בסיסים מותמרים הנוצרים על ידי וריאציות ושינויים בבסיסים‬ ‫השכיחים‪ .‬השינויים חלים לרוב לאחר פילמור השרשרת – ‪ DNA‬או ‪ .RNA‬במקרים נדירים ההתמרה‬ ‫נעשית כבר ברמת הנוקליאוטיד‪ .‬ההתמרות נדירות ב‪ DNA-‬אך שכיחות ב‪ ,RNA-‬במיוחד ב‪.tRNA-‬‬ ‫מוכרות מעל ‪ 100‬התמרות‪ ,‬גם אם משמעות כולן אינה מוכרת‪.‬‬ ‫התפקידים המוכרים של ההתמרות‪:‬‬ ‫•‬ ‫ב‪ DNA-‬התמרות משפיעות על בקרת הגנים‪ ,‬אבחנה בין גדיל חדש לישן בעת השכפול‪ ,‬יכולת‬ ‫התגוננות מפני נגיפים התוקפים את התאים באנזימי נוקליאז התוקפים חומצות גרעין שלא עברו‬ ‫מודיפיקציית מתילציה )הוספת קבוצת ‪.(methyl‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :01‬מבוא לביולוגיה מולקולרית‬ ‫•‬ ‫‪3‬‬ ‫ב‪ RNA-‬המודיפיקציות מכווננות ומשנות את משמעות וכיוון הקידוד‪ ,‬מייצבות מבנים ומקנות‬ ‫עמידות לאנטיביוטיקה‪.‬‬ ‫האיורים הבאים מציגים דוגמאות למתילציות‬ ‫בציטידין ואדנוזין‪ .‬המתילציות מאפשרות להבדיל‬ ‫בין ‪ DNA‬חיידקי לנגיפי‪ .‬באאוקריוטים‪ ,‬מתילציות‬ ‫בציטידין קריטיות להכרה ובקרה של גנים‪.‬‬ ‫באיור התחתון מופיעה מתילציה של נוקליאוטיד‬ ‫המותמר כבר ברמת הנוקליאוטיד; זהו נוקליאוטיד‬ ‫של נגיף ונועד לזיהוי כדי שישמש בבניית חומצות‬ ‫הגרעין שלו בגוף החיידק‪.‬‬ ‫דוגמאות נוספות הן פסודו‪-‬אורידין )ראו בעמוד הקודם(‪ ,‬בו הפחמן ‪C5‬‬ ‫נקשר לסוכר )במקום החנקן בעמדה ‪ (1‬וכעת החנקן מתפנה לפעילויות‬ ‫אחרות‪ .‬מודיפיקציה אחרת היא הפיכה של אדנוזין לאינוזין )‪ ,(I‬המזוהה‬ ‫על ידי מערכת התרגום כגואנין )‪ .(G‬כאשר הוא מופיע ב‪mRNA-‬‬ ‫האינוזין גורם לשינוי החלבון הנוצר‪ .‬במבנה דו‪-‬גדילי‪ ,‬אינוזין לא יכול ליצור אותם קשרי מימן עם‬ ‫אורציל‪/‬טימין כמו אדנין‪ ,‬ולכן מערער את יציבות הדו‪-‬גדיל‪ .‬כמו כן‪ ,‬אינוזין יכול ליצור קשרים עם ‪C‬‬ ‫ועם ‪ ,U‬דבר שמקנה את תכונת ה‪ wobble-‬של העמדה השלישית באנטיקודון של ה‪.tRNA-‬‬ ‫רכיבי הנוקליאוטיד‬ ‫•‬ ‫בסיס‬ ‫חנקני‬ ‫–‬ ‫חובר‬ ‫לסוכר‬ ‫בקשר‬ ‫‪ .N-glucosidic‬הבסיס נוטה להתרחק מהסוכר‬ ‫ולכן יהיה בקונפורמציית ‪ .anti‬במקרים נדירים‬ ‫תתקיים קונפורמציית ‪.syn‬‬ ‫•‬ ‫סוכר פנטוז )‪ 5‬פחמנים( המאורגן כטבעת‬ ‫המכונה ‪ .Furanose‬פחמן ‪ 5‬חורג מהטבעת‪.‬‬ ‫חיבור ‪-N‬גליקוזידי דרך פחמן ‪ 1‬וחיבור‬ ‫לפוספט דרך חמצן ‪ '5‬וחמצן ‪ .1'3‬הצורה‬ ‫הטבעית של הסוכר היא קונפיגורציית‪ .‬בניגוד‬ ‫לבסיסים הקשיחים‪ ,‬הסוכר גמיש יותר ויכול‬ ‫להתקפל בכמה אופנים‪ ,‬דבר המשפיע על‬ ‫הקונפורמציה המרחבית של הנוקליאוטיד‪ .‬לשם‬ ‫כך מוגדר מישור בין האטומים '‪ C1', O4', C4‬והקונפורמציה נקבעת לפי מיקום '‪:C2', C3‬‬ ‫‪ 1‬מספרי הפחמנים בסוכר מסומנים ב‪ '-‬כדי להבדילם מפחמני הבסיס החנקני‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪4‬‬ ‫•‬ ‫‪ – C-3' endo‬פחמן ‪ 3‬עולה למעלה ופחמן ‪ 2‬יורד‬ ‫למטה‪ .‬מאפיין דו‪-‬גדיל ‪ DNA‬ו‪ RNA-‬בקונפורמציה ‪.A‬‬ ‫מאפיין בממסים אורגניים‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ – C-2' endo‬פחמן ‪ 2‬הוא העליון והוא מאפיין ‪ DNA‬בקונפורמציה ‪ ,B‬נפוץ בסביבה מימית‪.‬‬ ‫•‬ ‫את חמצן '‪ O2‬ניתן לחבר לפחמן '‪ C4‬ולקבל תרכובת קשיחה החוברת לרצף הקומפלמנטרי‬ ‫בצורה הרבה יותר חזקה מאשר במולקולה גמישה‪ .‬תרכובות אלו חשובות בדיאגנוזה ודיאליזה‬ ‫לזיהוי והשתקה של גנים‪.‬‬ ‫•‬ ‫שייר פוספט – נוקליאוטיד הינו נוקליאוזיד‬ ‫מזורחן‪ .‬הפוספט נקשר בחמצן ‪ '5‬על פי רוב אך‬ ‫ניתן למצוא גם קישור בעמדה '‪ .3‬קיימות גם‬ ‫מולקולות בהן הפוספט נמצא בקשר ציקלי בין‬ ‫עמדות '‪ 3‬ל‪.(cAMP) 5'-‬‬ ‫הפולינוקליאוטיד‬ ‫שרשרת הפולינוקליאוטיד נוצרת על ידי קשר פוספואסטרי בין זרחן מנוקליאוטיד אחד לחמצן של‬ ‫נוקליאוטיד אחר‪ .‬הקשר מתקיים בין פחמן ‪ '3‬לפחמן ‪ .'5‬השרשרת מאופיינת בקצוותיה‪ :‬קצה ‪ '5‬נושא‬ ‫פוספט או פוליפוספט חופשי; קצה ‪ '3‬נושא הידרוקסיל חופשי‪ .‬בצורה זו ניתנים לשרשרת כווניות‬ ‫וקוטביות‪ .‬לעובדה זו יש משמעות ביולוגית – הפילמור והתרגום נעשים מקצה ‪ '5‬ל‪.'3-‬‬ ‫בכל יחידת נוקליאוטיד יש שישה קשרים בודדים שלכאורה מקנים‬ ‫חופש סיבוב‪ ,‬אך בפועל החופש ניתן רק בקשרים שאופפים את‬ ‫הזרחן – רק קשרים אלפא וזטא מגמישים את הסליל‪ .‬המבנים של‬ ‫ה‪ RNA-‬וה‪ DNA-‬מוגבלים בשל אינטראקציות רבות כמו מערום‬ ‫וזיווגי בסיסים‪ ,‬המעצבות את מבנה המולקולה תוך שהן מתירות‬ ‫את הגמישות המתבקשת לפעולות שעוברים ‪ DNA‬ו‪.RNA-‬‬ ‫מישורים סמוכים מתקרבים למרחק של כ‪ 3-‬אנגסטרום‬ ‫באינטראקציות דיפול‪-‬דיפול‪ ,‬ון דר‪-‬ולס ואלקטרוסטטיות‪ ,‬הגורמות‬ ‫לתנודות קלות במבנה ותלויות באופי הרצף‪ .‬המערום יוצר סביבה‬ ‫פנימית‪-‬הידרופובית המייצבת את המבנה ומקלה על זיווג בסיסים‬ ‫בקשרי מימן; פורינים מקיימים אינטראקציות מערום חזקות‬ ‫יותר מאשר פירימידינים‪.‬‬ ‫זיקות בין בסיסים‬ ‫זיווגי בסיסים נובעים מפיזור לא שיוויוני של מטענים‪ ,‬עקב קיומן של קבוצות קטו שמחפשות לקלוט‬ ‫פרוטון ושל קבוצות תורמות פרוטונים‪ .‬קשר מימן נוצר בין קטו קולט ובין מולקולה אחרת תורמת‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :01‬מבוא לביולוגיה מולקולרית‬ ‫‪5‬‬ ‫ברגע שקשר אחד נוצר הבא אחריו קל יותר ליצירה‪ .‬הקשרים יוצרים מבנים חופפים של זוגות קבועים –‬ ‫‪ AU/AT‬ו‪ ,GC-‬המכונים זיווגי ווטסון‪-‬קריק‪ .‬הם נמצאים ב‪ DNA-‬ובאיזורים דו‪-‬גדיליים ב‪.RNA-‬‬ ‫הם נבדלים בכך שבקשרי ‪ AT‬יש שני קשרי מימן בעוד שב‪ GC-‬יש שלושה )ולכן הם קשים יותר‬ ‫לפירוק(‪ .‬מבנה שני הזוגות חופף בשל חפיפה היוצרת מרחק דומה בין קשרי הגליקוזידים שנוצרים‪.‬‬ ‫קריק טבע את מונח ה‪ wobble-‬כשקבע שבזכות זיווגים מתירנים של ‪ ,G‬פעם עם ‪ C‬ופעם עם ‪ ,U‬אותו‬ ‫‪ G‬יכול ליצור מספר זיווגים ולכן מספר קודונים‪ .‬זיווג בסיסים מסוג זה‪ ,‬כמו גם אחרים שאינם מטיפוס‬ ‫ווטסון‪-‬קריק‪ ,‬שכיחים בעיקר ב‪ .2RNA-‬דוגמה אחת לזיווג שאינו ווטסון‪-‬קריק היא ‪ ,wobble‬וכל בסיס‬ ‫יכול ליצור ‪ 3‬קשרי מימן עם צלעות בסיסים אחרים והאינטראקציות יכולות אפילו להסתובב ב‪ 180°-‬כדי‬ ‫ליצור זיווג בסיסים ‪ – trans‬בו הסוכרים היו נמצאים בוקנפורמציית ‪ trans‬ולא ‪ .cis‬הם נמצאים בעיקר‬ ‫ב‪ RNA-‬שמתקפל על עצמו‪.‬‬ ‫מבנה הדו‪-‬סליל של ה‪DNA-‬‬ ‫מבנה זה הוצע ב‪ 1953-‬על ידי ווטסון וקריק‪ ,‬שהציעו שה‪DNA-‬‬ ‫עשוי שני גדילים המקיפים זה את זה בפיתול ימני‪ .‬ישנם ‪10‬‬ ‫זוגות בסיסים במחזור כאשר הבסיסים נמצאים בתווך‬ ‫ההידרופובי והשדרה הפוספו‪-‬סוכרית פונה לממס‪ .‬הבסיסים‬ ‫חושפים צלעות בשתי תעלות‪ :‬האחת רחבה ועמוקה שמקיפה את‬ ‫ה‪ ,DNA-‬והשנייה צרה שמייצגת את הצלע התחתונה של זוג‬ ‫הבסיסים )‪ ,major & minor grooves‬בהתאמה(‪.‬‬ ‫לגדילים יש קוטביות מנוגדת‪ :‬אם האחד עולה מ‪ 5'-‬ל‪ ,3'-‬השני‬ ‫עולה מ‪ 3'-‬ל‪ .5'-‬הקוטביות ההפוכה מוכתבת ממבנה זוג הבסיסים‬ ‫עצמו‪ .‬התעלות הן איזורים בהן ה‪ DNA-‬חושף‬ ‫את עצמו ויכול להסגיר את רצף הנוקליאוטידים;‬ ‫חלבונים יכולים לקרא את רצף ה‪ DNA-‬מצד‬ ‫התעלה הגדולה ולכן דרך התעלה הקטנה ייקשרו‬ ‫חלבונים שנקשרים ל‪ DNA-‬ללא קשר לרצף‪.‬‬ ‫מימדי המולקולה הם כ‪ 2-‬ננומטר בין שני פוספטים‬ ‫של בני זוג ומידת ההגבהה בין זוג בסיסים למשנהו‬ ‫היא כשליש ננומטר‪.‬‬ ‫‪ 2‬למרות שמסתבר שגם ‪ DNA‬יכול לשנות את מתכונת זיווגי הבסיסים שלו כתוצאה מאינטראקציה עם חלבונים‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪6‬‬ ‫נתונים ושיקולים שהובילו למודל‬ ‫•‬ ‫ארווין שארגף‪ ,‬אשר ביודעו שה‪ DNA-‬הוא החומר הגנטי‪ ,‬הניח ש‪ DNA-‬של אורגניזמים שונים‬ ‫יהיה בעל מבנה כימי שונה‪ .‬הוא קבע את תכולת הבסיסים של ‪ DNA‬מאורגניזמים שונים בהתאם‬ ‫לקוטביות האור‪ ,‬וראה שלמרות שיחסי ‪ A‬ל‪ G-‬היו שונים‪ ,‬יחסי ‪ A‬ל‪ T-‬או ‪ C‬ל‪ G-‬היו ‪ .1:1‬זהו חוק‬ ‫שארגף‪ .‬בטבלה )שקף ‪ ,46‬מצגת ‪ (1‬ניתן לראות הבדלים בתכולת הבסיסים שגילה שארגף ויחסי‬ ‫‪) 1:1‬בערך( של הבסיסים המזווגים‪.‬‬ ‫•‬ ‫ווטסון וקריק לקחו את הצורות הטאוטומריות של ‪ A‬ו‪ T-‬או ‪ G‬ו‪ ,C-‬גזרו אותן מקרטון וניסו לזווג‬ ‫אותן‪ .‬הם התקשו בכך כי לא הכירו את הצורה הטאוטומרית השכיחה‪ ,‬עד שנתון זה נחשף להם מפיו‬ ‫של כימאי אחר‪ .‬אם יש צורה טאוטומרית נדירה יכולה להיגרם מוטציה עקב שידוך לא מתאים בין‬ ‫זוגות‪.‬‬ ‫•‬ ‫ווטסון וקריק הניחו שמדובר בשני גדילים אשר ישלימו אחד את השני‪ ,‬כאשר המודל‬ ‫הקומפלמנטרי מתאים יותר לתהליך אוטו‪-‬קטליטי‪ .‬בהיעדר הוכחות פיזיות למספר הגדילים‪ ,‬הם‬ ‫הסתמכו על נתונים מרוזלין פרנקלין )שלא בידיעתה( אשר על סמך קריסטלוגרפיה ניתן היה‬ ‫להסיק שיש שני גדילים עם יחידה חוזרת בגודל ‪ 3‬אנרגסטרות ואורך מחזור הוא ‪ 10‬יחידות‪.‬‬ ‫החפיפה בין הזוגות יוצרת מארז אחיד לכאורה )למרות שבהמשך מסתבר שיש דקויות ושינויים קלים‬ ‫תלויי רצף הנותנים לכל גדיל אישיות משלו(‪.‬‬ ‫תכונות ועדויות נוספות‬ ‫•‬ ‫קומפלמנטציה – מהזיווגים מתבקש יחס משלים‪ ,‬ולכן‬ ‫מתקיימת קומפלמנטציה בין שני גדילי ה‪ .DNA-‬יש לשים לב‬ ‫שגדילי ‪ sense‬ו‪ antisense-‬מנוגדים בכיוונם‪.‬‬ ‫•‬ ‫מחזוריות – בדו‪-‬סליל‪ ,‬כל בסיס מוסט מהקודם לו ב‪ 36-‬מעלות ו‪ 0.34-‬ננומטר‪ .‬מדי עשרה בסיסים‬ ‫משלימים מחזור‪.‬‬ ‫•‬ ‫נתוני דיפרקציה – רוזלין פרנקלין הפיקה נתוני דיפרקציה )פיזור אור( גסים על בסיס סיבי ‪,DNA‬‬ ‫שלמרות גסותם סיפקו את המדע הדרוש להשלמת התמונה של ווטסון וקריק‪ .‬הכתמים השחורים הם‬ ‫מבנה חוזרני שחוזר כל ‪ 3‬אנגסטרום; הכתמים הקטנים שחוזרים שורות‪-‬שורות מאפשרים את קווי‬ ‫השכבות‪ ,‬סה"כ ‪ 10‬קווים המרמזים על כמות הבסיסים במחזור‪ .‬מבנה הצלב במרכז מרמז על מבנה‬ ‫סלילי‪ .‬יש גם קו שכבה אחד חסר‪ ,‬הנובע‬ ‫מהתאבכות בגלל שגדיל אחד מסתיר את הגדיל‬ ‫השני – רמז לכך שמדובר במולקולה שיש בה‬ ‫יותר מגדיל אחד‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :01‬מבוא לביולוגיה מולקולרית‬ ‫‪7‬‬ ‫מבנה גבישי של ‪ DNA‬מוגדר‬ ‫בתקופת ווטסון וקריק לא ניתן היה לבודד מספיק ‪ DNA‬כדי לגבש אותו‪ ,‬ולכן הדקויות של המבנה –‬ ‫הגדלים‪ ,‬המרחקים‪ ,‬הזוויות – לא היו מדוייקות‪ .‬בשנות ה‪ 80-‬פותחו כבר שיטות לניקיון ‪ DNA‬ברמות די‬ ‫גבוהות‪.‬‬ ‫ריצ'רד דיקרסון סנטז גדיל שמשלים את עצמו‪ ,‬גיבש אותו‪ ,‬וראה שמידת ההגבהה בין זוגות הבסיסים‬ ‫אינה קבועה‪ ,‬זווית הפיתול אינה קבועה‪ ,‬הבסיסים לא תמיד מונחים זה כלפי אלא יכולים לסטות זה‬ ‫כלפי זה; בשלושת צירי המרחב הם יכולים לבצע תפניות זה כלפי זה ובין זוגות‪ ,‬הכל בתלות באופי‬ ‫הרצף‪ .‬הדבר נובע מחיפוש אחר "תנוחה נוחה"באינטראקציות המערום בין הבסיסים‪ .‬הדבר משפיע‬ ‫גם על יכולת האריזה הקומפקטית של המולקולה הענקית הזו‪.‬‬ ‫המבנה המקומי של ה‪ DNA-‬מושפע מרצף בסיסיו‪ ,‬וערכי הפיתול וההגבהה הממשיים חורגים‬ ‫מממוצעי ווטסון‪-‬קריק‪ .‬רצפים מסויימים מעוותים את מבנה הדו‪-‬גדיל בכיוון הסויים‪ ,‬המאפיינים‬ ‫‪ DNA‬ארוז במבנה כרומטין )אשר ה‪ DNA-‬מתכופף סביבו(‪ .‬רצפם מסויימים אף יכולים הקנות ל‪-‬‬ ‫‪ DNA‬נטייה לפיתול שמאלי‪.‬‬ ‫האיור הבא מציג שינויים אפשריים ווריאציות מבניות בתוך מבנה הדו‪-‬גדיל בין בסיסים‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪8‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬חומצות גרעין‪ ,‬ארגון הגנום – המשך‬ ‫לכל בסיס שש צלעות‪ ,‬אחת מהן משתתפת באינטראקציות ווטסון קריק‪ ,‬ועוד שתיים יוצרות את התעלה‬ ‫הגדולה והקטנה‪ .‬כל זוג בסיסים מציג דגם ייחודי של קבוצות פונקציונאליות התורמות או קולטות‬ ‫פרוטון‪ .‬חלבונים הניגשים ל‪ DNA-‬יכולים לזהות אותו מצד התעלה הגדולה ולהבחין בנוקליאוטידים‬ ‫מצד זה; מצד התעלה הקטנה קיים דגם יותר‬ ‫סימטרי‪ .‬התעלה הגדולה מאפשרת מאפשר גישה‬ ‫חלבוני בקרה הקוראים רצף ייחודי של ‪– DNA‬‬ ‫אתרי פרוטמוטור או תחילת שכפול; התעלה הקטנה‬ ‫מאפשרת גישה לחלבונים הפועלים על ה‪ DNA‬בלי‬ ‫קשר לרצף שלו – כמו חלבונים המקפלים את ה‪-‬‬ ‫‪ .DNA‬התעלה הגדולה מאפשרת לחומצות אמינו‬ ‫כמו גליצין או אספרגין לשלוח זרועות לתוך‬ ‫הנוקליאוטידים )דרך צלע ‪.(Hoogsteen‬‬ ‫גישה לחלבונים‬ ‫באיור ניתן לראות דוגמה לחלבון רגולטורי‪ .‬שתי תת היחידות זהות‬ ‫ונצמדות ל‪ DNA-‬בשני מחזורי פיתול – כ‪ 20-‬זוגות בסיסים‪ .‬כל‬ ‫תת יחידה מגיבה עם רצף זהה‪ ,‬ומחדירה סליל אלפא ל‪.DNA-‬‬ ‫המבנה הדימרי מאפשר ניצול טוב יותר של האינפורמציה הגנטית‪:‬‬ ‫באותה כמות חלבון ניתן להכיר ‪ 20‬זוגות בסיסים במקום ‪ ,10‬כך‬ ‫שמקטינים את ההסתברות שהרצף יופיע באופן אקראי‪.‬‬ ‫המבנה הדימרי מאפשר ליצור צירופים הטרודימרים‪ ,‬כך שתת‬ ‫היחידות יכולות להיות שונות ולגרום לפעילויות הפוכות כמו‬ ‫שיפעול הגן במקום דיכויו וכדומה‪.‬‬ ‫באיור הימני מופיע חלבון‬ ‫המזהה את ה‪ DNA-‬מצד‬ ‫התעלה הגדולה שאיזור ההיכרות שלו משתרע על איזור פיתול‬ ‫אחד בלבד‪ .‬את האלפא הליקס הוא מחדיר מצד התעלה הגדולה‪,‬‬ ‫ותת היחידה הקטנה מזהה את ה‪ DNA-‬מאחוריו באותו מחזור‬ ‫פיתול‪ .‬שתי תת היחידות קשורות ביניהן בחלק הנותר של‬ ‫החלבון‪ ,‬באונה הצהובה‪ .‬אונה זו מכילה לאוצינים שנקשרים‬ ‫ביניהם ומחזיקים את שתי היחידות‪ .‬מבנה זה מכונה ‪Leucin‬‬ ‫‪.zipper‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬חומצות גרעין‪ ,‬ארגון הגנום – המשך‬ ‫‪9‬‬ ‫האיור הבא מציג את הדינמיות של הדו‪-‬גדיל‪ :‬בסיס בודד‪ ,‬תודות‬ ‫לגמישות השידרה הפוספו‪-‬סוכרית‪ ,‬יכול להציץ החוצה מהדו‪-‬גדיל‪.‬‬ ‫תכונה זו מאפשרת לחלבונים לסרוק את ה‪ DNA-‬ולזהות בסיסים‬ ‫המיועדים להתמרה או בסיסים שגויים שיש לסלק‪ .‬היפוכים אלו‬ ‫מאפשרים לחלבון לזהות שגיאות גם מבלי לפרום את הדו‪-‬גדיל של‬ ‫ה‪ .DNA-‬יש לציין כי היפוך הבסיס אינו משנה את המתאר הכללי‬ ‫של הדו‪-‬גדיל‪ ,‬שנותר יציב‪.‬‬ ‫המודל מסביר פונקציות חשובות‬ ‫מבנה הדו‪-‬גדיל מסביר כיצד הדו‪-‬גדיל משתכפל‪ ,‬כאשר כל גדיל‬ ‫"הורה" נפרם מהשני ומהווה תבנית ליצירת גדיל משלים‪ .‬כך‬ ‫מתקבלים שני דופלקסים חדשים הזהים לדופלקס המקורי‪ .‬מודל‬ ‫הדו‪-‬גדיל של ווטסוון‪-‬קריק מאפשר להבין את מבנה הפרימה‬ ‫והשכפול‪.‬‬ ‫קריק חשב שהפרימה והבנייה נעשות ספונטנית; כיום ידוע שאין‬ ‫זה כך ושתי הפעולות דורשות פעילות אנזימטית‪ ,‬האחראית‬ ‫לפעולות רבות נוספות כמו פתיחת קשרים בגדילים‪ ,‬הגנה על גדילי‬ ‫התבנית הנחשפים בפרימה וחלבוני בקרה שיבטיחו שתהליך‬ ‫השכפול ייתרחש בצורה מלאה פעם אחת בלבד‪ ,‬בזמן ובמקום‬ ‫המתאימים לכך‪.‬‬ ‫מגוון קונפורמציות‬ ‫ה‪ DNA-‬יכול ללבוש ולפשוט צורה במבנים‬ ‫שונים‪ .‬מתיחת מבני ה‪ DNA-‬בתמיסות‬ ‫אתנול חושפת מבנים שונים המתבטאים‬ ‫במימדי התעלות )תעלה קטנה צרה יותר‬ ‫ופחות נגישה לחלבונים‪ ,‬זוגות בסיסים קצת‬ ‫נטויים ביחס לציר האורך(‪ ,‬דבר הנובע‬ ‫משינוי קטן בקונפורמציית הבסיס‪.‬‬ ‫קונפורמציה נוספת‪ ,‬נדירה יותר‪ ,‬קיימת ובה‬ ‫הפיתול‬ ‫של‬ ‫הדו‪-‬גדיל‬ ‫שמאלי‪.‬‬ ‫בעוד‬ ‫שבקונפורמציות ‪ A‬ו‪ B-‬היחידה החוזרת‪,‬‬ ‫הא‪-‬סימטרית‪ ,‬היא של זוג בסיסים אחד‪,‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪10‬‬ ‫בקונפורמציה ‪ Z‬היחידה החוזרת היא של שני זוגות בסיסים‪ ,‬ונובעת מכך שבקונפורמציה זו אחד‬ ‫הבסיסים בזוג מתקרב לסוכר שלו ונמצא בקונפורמציית ‪ ,syn‬הקונפורמציה הלא‪-‬שכיחה‪.‬‬ ‫האיור הבא מציג עוד יותר את ההבדלים בגדלי התעלות של ‪ RNA‬לעומת ‪ .DNA‬ההבדלים גורמים לכך‬ ‫שחלבונים שמזהים רצף ‪) RNA‬קונפורמציה ‪ (A‬מזהים אותו באיזורים חד גדיליים‪ ,‬כי גדלי התעלה אינם‬ ‫מאפשרים זיהוי הרצף מבחינת החלבונים‪.‬‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫קונפורמציה ‪ A‬היא קונפורמציית ‪ DNA‬בסביבה מימית‪ A ,‬של ‪ RNA‬או בסביבה אל‪-‬מימית‪.‬‬ ‫‪ RNA‬נמצא בקונפורמציה ‪ A‬בגלל נוכחות קבוצות ‪.2'-OH‬‬ ‫קונפורמציה ‪ :A‬גודל דו‪-‬גדיל גדול‪ ,‬מרחקים וזוויות פיתול קטנים יותר‪ ,‬יותר זוגות במחזור‪.‬‬ ‫תהעלה הגדולה צרה ועמוקה ואינה נגישה לחלבון – החלבונים קוראים רצפי ‪ RNA‬באיזורים‬ ‫חד‪-‬גדיליים בעיקר‪.‬‬ ‫קונפורמציה ‪ :Z‬יחידה חוזרת מורכב שני זוגות בסיסים )ולא אחד(‪ .‬מאופיין ברצפי ‪GC‬‬ ‫חוזרניים‪ .‬הפורינים נמצאים בקונפורמציית ‪ Syn‬הנדירה‪.‬‬ ‫שלשות בסיסים‬ ‫תכונה נוספת של הדו‪-‬גדיל היא תגובה עם בסיס נוסף‪ ,‬ליצירת תלת‬ ‫גדיל‪ .‬בתכונה זו מתבטאים זיווגי בסיסים יוצאי דופן‪:‬‬ ‫•‬ ‫בסיס נוסף מנצל צלע ‪ ,Hoogsteen‬הפונה לתעלה הגדולה‪ ,‬על‬ ‫מנת לחבור לזוג בסיסים קיים‪.‬‬ ‫•‬ ‫בצורה זו מתקבל איזור תלת גדילי‪ ,‬אשר יכול להוציא חד גדיל‬ ‫מתוך הדו‪-‬גדיל וליצור דו‪-‬גדיל חדש‪.‬‬ ‫•‬ ‫שלשת בסיסים יכולה לפגוע בביטוי גנים ברקמות מסויימות‪.‬‬ ‫בעוד שלתלת גדיל יש יישומים רבים תפקידו הביולוגי לא ידוע‪.‬‬ ‫רביעיית‪-‬גואנוזין‬ ‫ישנו גם ‪ DNA‬ארבע‪-‬גדילי‪ ,‬הנוצר משני בסיסים הנקשרים לגואנוזינים‬ ‫ויוצרים טבעת בו נכנס יון נתרן או אשלגן המייצב את המבנה‪ .‬מבנה זה‬ ‫מכונה רביעיית‪ G-‬והוא יכול‬ ‫להיווצר בפולימרים מלאכותיים על‬ ‫טהרת ה‪ G-‬או באיזורי בקרה המכילים עושר של שיירי ‪.G‬‬ ‫בשל פוטנציאל לתכונות חשמליות והיותם מבנים קשיחים שניתן‬ ‫ליצור באורכים מדוייקים‪ ,‬מבנים אלו מעניינים מבחינה‬ ‫ננוטכנולוגית‪ .‬בתחום השימושים הביולוגיים‪ ,‬ישנם חלבונים‬ ‫היודעים לפרום מבנים אלו על מנת לאפשר שיכפול או שיעתוק‬ ‫של הגנום‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬חומצות גרעין‪ ,‬ארגון הגנום – המשך‬ ‫‪11‬‬ ‫פלינדרום‬ ‫פלינדרום הוא רצף של השלמה עצמית‪ ,‬הנמצאים‬ ‫בגנום והינם מועדים ליצירת מבנה צלב באיזורי‬ ‫בקרה‪ ,‬אתרי ריקומבינציה ייחודיים וכדומה‪.‬‬ ‫פלינדרומים בחומצות גרעין חד‪-‬גדיליות )דוגמת‬ ‫‪ RNA‬על סוגיו השונים( מאפשרים יצירת‬ ‫קונפורמציות‬ ‫מרחביות‬ ‫במבנים‬ ‫שניוניים‬ ‫ושלישוניים‪ ,‬דוגמת מבנה ראש סיכה ) & ‪stem‬‬ ‫‪ (loop‬המאפשר יצירת איזורי בקרה )‪,(miRNA‬‬ ‫טרמינציה‬ ‫)‪termination‬‬ ‫‪rho-independent‬‬ ‫בפרוקריוטים( וכדומה‪.‬‬ ‫סיכום‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪12‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬הטופולוגיה של ה‪DNA-‬‬ ‫פרימה של ה‪ ,DNA-‬ניתוק קשרי המימן והחלשת זיקות המערום מגבירים את הבליעה של המולקולה‪.‬‬ ‫קרינת ‪ UV‬שגורמת לשינויים דוגמת אלו בגנום מובילה לשינויים בבליעה הנגרמים משינויים כימיים‪-‬‬ ‫מוטגנים המנוצלים במעבדה לקיבוע‬ ‫קשרים‪-‬לא קוולנטים בין חלבון לרצף‬ ‫‪ DNA‬מסויים‪.‬‬ ‫התכה והכלאה‬ ‫חימום או שינוי ‪ pH‬מאפשרים הפרדה מדורגת של בסיסי ה‪-‬‬ ‫‪ .DNA‬החימום מגדיל את תנועת המולקולות והעלאת ה‪pH-‬‬ ‫מיננת את הבסיסים ומבטלת את קשרי המימן‪ .‬התכת ה‪DNA-‬‬ ‫היא פעולה הפיכה‪ :‬צינון התמיסה יוביל את הגדילים למצוא זה‬ ‫את זה ולהתקשר חזרה‪ ,‬אולם עליו להיות הדרגתי על מנת לא‬ ‫ליצור קשרים בתוך הסליל‪.‬‬ ‫ביטול הזיקה בין הבסיסים משנה את הבליעה ומקלה על מעקב‬ ‫אחר שינויים במבנה ה‪ DNA-‬וה‪ .RNA-‬הגרף מציג את שינוי‬ ‫הבליעה של אור ‪ UV‬על ידי המולקולה‪ .‬נקודת ההתכה מצויינת‬ ‫כנקודת אמצע שינוי הבליעה‪ .‬נקודה זו שונה בין מולקולות‬ ‫שונות‪ ,‬שכן המולקולה המתוארת בכחול עשירה יותר בקשרי ‪AT‬‬ ‫מאשר ‪ .GC‬זוגות ‪ AT‬קלים יותר להפרדה מאשר זוגות ‪.GC‬‬ ‫בצורה זו ניתן היה לאמוד כבר לפני זמן רב את תכולת ה‪ GC-‬של‬ ‫הגדיל – ככל שיש יותר ‪ GC‬נקודת ההתכה עולה‪.‬‬ ‫ישנם גורמים נוספים שיכולים להשפיע‪ ,‬כמו חוזק יוני המייצב את‬ ‫הדו‪-‬גדיל‪ ,‬אורך המולקולה וההטרוגניות שלה – אם היא אחידה‬ ‫לכל אורכה המולקולה תעבור התכה בצורה אחידה יותר מאשר אם‬ ‫היו בה איזורים עשירים ב‪ AT-‬שלהם נטייה להיפרם יותר מאשר‬ ‫איזורים אחרים )מסומן בחיצים אדומים(‪.‬‬ ‫כשם שניתן להפריד את הגדילים הם יכולים‬ ‫להתאחד מחדש; תכונה זו חשובה במחקר כי ניתן‬ ‫להשתמש ב‪ DNA-‬זר בעל קומפלמנטציה טובה –‬ ‫לא מושלמת אפילו – ולהכליא בינו לבין ‪DNA‬‬ ‫מקורי‪ RNA ,‬ואפילו פולימרים סינטטיים דמויי‪-‬‬ ‫‪ RNA‬ו‪ .DNA-‬לעובדה זו יש שימושים רבים‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬הטופולוגיה של ה‪-DNA‬‬ ‫‪13‬‬ ‫בדימוי וייצוב גנים – סינטזת גנים‪ ,‬בידודם וכדומה‪ ,‬מבוססים על‬ ‫סינטזת ‪ DNA‬מוגדר קטן )פריימר(‪ ,‬קיבועו על ‪ DNA‬קיים‬ ‫והתחלת פולימריזציה באותה נקודה‪.‬‬ ‫מעקב אחר ביטו גנומי‬ ‫כדי לבחון את דגם הביטוי של כלל הגנים בתא‪ ,‬למשל בהשוואות‬ ‫בין תא רגיל לסרטני או תא שמר משתכפל לתא במצב ספורולציה‪,‬‬ ‫ניתן להפיק מכל סוג תא את כלל ה‪ RNA-‬שלו וליצור עותקי‬ ‫‪ DNA‬מה‪ RNA-‬בעזרת האנזים )‪.reverse transcriptase (RT‬‬ ‫תוך כדי הסינטזה משלבים נוקליאוטידים צבעוניים – אנאלוגים‬ ‫שמתפלמרים ומכילים סמן צבעוני‪ .‬בצורה זו מתקבלת ספריית ‪ cDNA‬צבועה ומעורבבת‪.‬‬ ‫על שבב המכיל תאים בבאריות שמים את הגדלים המסומנים‪ ,‬הגדילים נכנסים לתאים ונקשרים ל‪RNA-‬‬ ‫הקומפלמנטרים‪ .‬בצורה זו ניתן לראות מהי מידת הביטוי בתאים הנמצאים בשלבי התפתחות או מצבים‬ ‫שונים‪.‬‬ ‫סיכום‬ ‫• בליעת אור ‪ UV‬משמשת למעקב אחר שינויי מבנה ‪ DNA‬ו‪.RNA-‬‬ ‫• הפרדת הגדילים משולה להתכה‪ ,‬כאשר טמפרטורת ההפרדה עולה כפונקציה של תכולת ‪.GC‬‬ ‫• הכלאה )‪ (Annealing‬של חומצות גרעין היא בעלת יישומים רבים )דוגמת ‪.(microarray‬‬ ‫הכלאה אפשרית גם בין גדילים ממקורות שונים אם דרגת הקומפלמנטציה מספקת‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪14‬‬ ‫טופולוגיית ‪DNA‬‬ ‫מדע הטופולוגיה עוסק בחקר תכונות של גופים אשר כל עוד לא‬ ‫קורעים אותם שומרים על צורתם‪ .‬כאן מדובר על מספר‬ ‫הקשרים הלא‪-‬קוולנטים ולא‪-‬כימיים של המערכת‪ ,‬קשרים בלתי‬ ‫ניתנים לניתוק‪ .‬תכונה זו במולקולות ביולוגיות אופיינית רק ל‪-‬‬ ‫‪ ,DNA‬כי אלו שני סלילים שנמצאים זה ליד זה ובעוד שניתן‬ ‫להפרידם ברמות קטנות לא ניתן לעשות כן לכל הגדיל‪.‬‬ ‫לדוגנה‪ ,‬ב‪ DNA-‬מעגלי הסלילים כרוכים זה סביב זה וסגורים‬ ‫קוולנטית ולכן לא ניתן להפריד בין הגדילים‪ .‬בתא‪ ,‬לא רק‬ ‫מולקולות מעגליות כפופות לכך אלא גם ‪ DNA‬לינארי‪ ,‬שאינו‬ ‫חופשי לנוע עקב קישור חלבונים וגם עקב גודל החיכוך שהיה‬ ‫נדרש מסיבוב מוקולה כה גדולה סביב צירה‪.‬‬ ‫אילוצים טופולוגיים אלו משפיעים על כל פעולה בה מעורב ה‪-‬‬ ‫‪ :DNA‬שיכפול‪ ,‬שיעתוק‪ ,‬פרימת הדו‪-‬גדיל‪ ,‬יצירת פיתולי‪-‬העל‬ ‫של ה‪ DNA-‬סביב עצמו או סביב ליבות חלבוניות‪ .‬כשחוקרים‬ ‫את הטופולוגיה ניתן להבין את הקשר בין פיתולי העל לפיתול‬ ‫של ציר הדו‪-‬סליל‪ :‬יש קשר בין מצב ה‪ DNA-‬במצב הפיתולים‬ ‫הראשוני לבין פיתולי העל‪ ,‬היוצרים מתח שניתן לפרוק על ידי‬ ‫פרימה באתרים מועדים לפרימה )כמו ‪ .(OriR‬במהלך השוטף‬ ‫של שכפול ה‪ ,DNA-‬בו מפרידים ללא הרף את הגדילים‬ ‫ההוריים‪ ,‬טופואיזומראזות משנות את המצב הטופולוגי של ה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬ומשנות את המתח על מנת למנוע היווצרות קשרים עקב‬ ‫הגדלת או הקטנת מספר הקשרים ויצירת או הרפיית פיתולי על‪.‬‬ ‫‪cccDNA‬‬ ‫למרות שפיתולי על רלוונטים לכל ‪ ,DNA‬חוקרים‬ ‫אותם בתרכובות מודל פשוטות‪ ,‬מולקולות ‪DNA‬‬ ‫מעגליות‬ ‫סגורות‬ ‫קוולנטיות‬ ‫–‬ ‫‪.cccDNA‬‬ ‫מולקולות אלו נמצאות בטבע ככרומוזומים של נגיפים‪ ,‬פלסמידים וכלורופלסטים וקל לבודד אותן‬ ‫מהכרומוזום המעגלי של חיידקים שלמרות מעגליותו קשה לבודדו בלי לשבור אותו‪.‬‬ ‫חלק מהמולקולות הן מעגלים רפויים ופרושים; אחרות מפותלות סביב עצמן בפיתולי העל‪ .‬תקלות בבידוד‬ ‫יכולות לגרום לניתוקים בין קשרים פוספו‪-‬דיאסטרים בגדילים‪ ,‬המקנים חופש תנועה של גדיל אחד כלפי‬ ‫השני ופיתול העל נרפה ספונטנית ומתקבל מבנה מעגל פרוש‪-‬בינונית‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬הטופולוגיה של ה‪-DNA‬‬ ‫‪15‬‬ ‫משתנים רלוונטים‬ ‫•‬ ‫)‪ – Linkage (Lk‬נתון טופולוגי המייצג את מספר הפעמים שגדיל אחד‬ ‫סובב סביב הגדיל השני‪ .‬הנתון הזה מיוצג במספרים שלמים בלבד‪.‬‬ ‫•‬ ‫)‪ – Twist (Tw‬נתון גיאומטרי המייצג את דרגת הפיתול של גדיל ‪DNA‬‬ ‫בקונפורמציה נתונה )קונפורמציה ‪ B‬לרוב‪ 10-10.5 ,‬זוגות בסיסים בכל‬ ‫מחזור פיתול(‪ .‬הנתון בעל ערכים רציפים כי ניתן לשנות את קונפורמצית ה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬ולקבל יותר זוגות בסיסים למחזור פיתול או לשלב מולקולות‬ ‫ארומטיות בין זוגות הבסיסים המשנות את ערכי הפיתול‪.‬‬ ‫•‬ ‫)‪ – Writhe (Wr‬נתון גיאומטרי בעל ערכים רציפים המייצג את ההפרש‬ ‫‪ .Tw-Lk‬מספר הקשרים ב‪ DNA-‬מתחייב מגודל המולקולה‪ ,‬אך עשוי‬ ‫להתקיים הבדל בין הצפוי )‪ (Tw‬למצוי )‪.(Lk‬‬ ‫•‬ ‫כאשר ההפרש הוא ‪ 0‬ה‪ DNA-‬יהיה רפוי;‬ ‫•‬ ‫כאשר יש גירעון יהיו פיתולי על שליליים – ציר הדו‪-‬גדיל יפותל בכיוון מסויים‪.‬‬ ‫•‬ ‫בעודף של קשרים מתקבלים פיתולי על חיוביים – בציר הפוך‪.‬‬ ‫במולקולת ‪ DNA‬רפויה‪ Lk=Tw, Wr=0 ,‬ואין פיתולי על‪ .‬ניתן לפרום שני מחזורי פיתול‪ ,‬להפוך אותם‬ ‫לחד גדיל‪ ,‬ואז ‪ Tw‬לא מתייחס אליהם ולא משתנה ‪ .Wr‬לעומת זאת‪ ,‬ללא פרימה‪ ,‬אם לא יהיו בפועל ‪25‬‬ ‫קשרים באותה המולקולה )כך ש‪ (Tw≠Lk-‬אנחנו מקבלים עיוות בכיוון ספציפי היוצר כיפוף של הדו‪-‬‬ ‫גדיל על עצמו ונוצרים שני פיתולי על‪ .‬על מנת לשמר את הגיאומטריה באופן סימטריה העיוות נעשה‬ ‫בצורה מונוטונית ואחידה לאורך המולקולה – בצורה זו מתקבל ששני הגדילים חולפים זה מעל זה ‪25‬‬ ‫פעמים למרות שמספר הקשרים הטופולוגים הוא רק ‪.23‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪16‬‬ ‫מולקולה כזו יכולה להימצא בשיווי משקל עם המצב הפרום‪ .‬ישנם איזורים בעלי נטייה להיפרם‪ ,‬ופיתולי‪-‬‬ ‫על שליליים יוצרים לחץ ונטייה ל‪ DNA-‬להיפרם‪ .‬במיקרוסקופ אלקטרוני נראה שכל המולקולות במצב‬ ‫מסויים‪ ,‬אך בתמיסה ניתן לראות כיצד וכמה מהן נמצאות במצב המקופל‪ .‬פיתול על חיובי מפתל את‬ ‫הדו‪-‬גדיל באותו כיוון של הפיתול הראשוני‪ ,‬כך שהוא מבטל עודפי‪-‬פיתולים‪.‬‬ ‫אילוץ טופולוגי‬ ‫במולקולה הלינארית באיור‪ ,‬גדילי ה‪ DNA-‬חופשיים לסוב זה‬ ‫סביב זה; הם יכולים להימצא בשיווי משקל שבו ‪.Tw=Lk‬‬ ‫במולקולה המעגלית לא ניתן לשנות את היחס של ‪ Tw‬ו‪ Lk-‬בלי‬ ‫לשבור את אחד הגדילים‪.‬‬ ‫למעשה‪ ,‬גם ‪ DNA‬לינארי בתא כפוף‬ ‫לאותם האילוצים אולם כאשר רוצים‬ ‫לעבוד במבחנה על ‪ DNA‬טהור קל יותר‬ ‫להמחיש‬ ‫את‬ ‫האינטראקציות‬ ‫והטופולוגיה בעזרת ‪ .cccDNA‬הכיפוף‬ ‫של ‪ DNA‬לינארי נובע מחלבונים‬ ‫שצמודים אליו ומונעים ממנו לנוע‬ ‫בחופשיות‪.‬‬ ‫גרעונות בהפרש ‪ Tw-Lk‬ייפתרו על ידי פיתול‪-‬על נגד הכיוון של הפיתול הראשוני‪ ,‬אשר יוצר הגדלה‬ ‫של מספר הפיתולים במולקולה על ידי פיתולי על; עודפים בהפרש ייפתרו על ידי פיתול‪-‬על עם כיוון‬ ‫הפיתול הראשוני ולכן יקזז את הפיתולים העודפים‪ .‬פיתולי על בגרעונות מכונים פיתולי על שליליים‬ ‫ופיתולי על בעודפים מכונים פיתולי על חיוביים‪.‬‬ ‫משמעות ביולוגית של פיתולי על‬ ‫ה‪ DNA-‬שבתא מכיל פיתולי על שליליים והמתח הנוצר בו מקל על פרימה של איזורים מועדים‪-‬לפרימה‬ ‫אשר‪ ,‬בנוכחות חלבונים מסויימים‪ ,‬יוצאת מהכוח אל הפועל‪ .‬מאידך‪ ,‬בהמשך פרימת ה‪) DNA-‬למשל‬ ‫בשיכפול‪ ,‬הדורש הפרדה מוחלטת של נשי הגדילים‬ ‫לתאי בת שונים( החלקים שעדיין לא נפרמים עולים‬ ‫בצפיפות הקשרים שלהם ולכן יכולים להיווצר‬ ‫פיתולי על חיוביים‪ .‬אם התהליך יימשך ללא הפרעה‬ ‫ייווצרו קשרים בגדילים‪ .‬פיתולי העל החיוביים‬ ‫נפתרים מייד עך ידי אנזימים המשנים את מספר‬ ‫הקשרים בין הגדילים‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬הטופולוגיה של ה‪-DNA‬‬ ‫‪17‬‬ ‫יש לציין כי ביצורים מסויימים‪ ,‬דוגמת ארכיאה תרמופילים‪ ,‬פיתולי על חיוביים ב‪ DNA-‬קיימים כדי‬ ‫למנוע את התכת ה‪ DNA-‬בטמפרטורת הסביבה הגבוהה‪.‬‬ ‫גם בזמן השיעתוק‪ RNA ,‬פולימראז מתקדם על‬ ‫הגדיל ויוצר גרעון בקשרים אחריו לעודף קשרים‬ ‫לפניו‪ .‬אנזימים מיוחדים מתקנים מצב זה סביב צידי‬ ‫פעילות הפולימראז‪.‬‬ ‫שנויים מכוונים במבחנה בעזרת מולקולת אתדיום‬ ‫ברומיד מכניסים את המולקולה בין זוגות בסיסים‪ .‬גיבוש מראה כי הוספת האתידיום משנה את זווית‬ ‫הקשר )קטן ב‪ (16°-‬ומקטינה את ‪ Tw‬עקב הגדלת מספר הבסיסים במחזור‪ .‬אם היו פיתולי על שליליים‬ ‫עקב גרעון בקשרים‪ ,‬אתדיום ברומיד הקטין את ‪ ,Tw‬שינה את היחס ‪ Lk:Tw‬והגרעון הצטמצם עד שה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬נרפה לחלוטין‪ .‬מעבר לנקודה זו‪ ,‬הוספת ‪ EtBr‬תגיע למצב של פיתולי על חיוביים‪.‬‬ ‫גרף משמאל‪ :‬מכיוון שה‪ DNA-‬בעל פיתולי על‪ ,‬הוא יותר קומפקטי ובשדה צנטריפוגלי הוא יישקע מהר‬ ‫יותר‪ .‬ככל שה‪ DNA-‬יטוטר ביותר באתידיום‪ ,‬פיתולי העל יירפו והמולקולות יהיו גדולות יותר‪ ,‬החיכוך‬ ‫שלהן יהיה גבוה יותר והתנועה איטית יותר‪ ,‬עד הגעה לערך מינימום בשקיעה‪ .‬אם הטיטור יימשך‪,‬‬ ‫יתקבלו פיתולי על חיוביים שיהפכו את המולקולה ליותר קומפקטית עד ששוב תגיע לתנועה מהירה‬ ‫במורד השדה‪.‬‬ ‫בגדיל ‪ DNA‬מעגלי סגור קוולנטית‪ ,‬הטיטור עם ‪ EtBr‬מוגבל עד לרמה שבה מספר פיתולי העל כה גבוה‬ ‫שהגידל אינו מסוגל להכיל עוד פיתולים‪ .‬ל‪ DNA-‬לינארי אין מגבלה זו כיוון שהתנועתם יותר חופשית‬ ‫והם אינם צוברים מתח מפיתולי על‪.‬‬ ‫הניסויים שלעיל נערכו על ידי ג'רום ווינוגרט‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪18‬‬ ‫שיעור ‪ :03‬הטופולוגיה של ה‪ – DNA-‬המשך‬ ‫הפרדת טופואיזומרים באלקטרופורזה‬ ‫הניסוי של ווינוגרט היה יקר מאוד; יותר זול ונוח להתבונן בשינויי הטופוגרפיה של ה‪ DNA-‬כאשר‬ ‫מריצים אותו בג'ל אגרוז‪ ,‬המאפשר גם להבחין בין טופואיזומרים שונים – מולקולות ‪ DNA‬זהות‬ ‫הנבדלות בקשרים‪.‬‬ ‫באיור ניתן לראות ‪ DNA‬שהורץ בג'ל‪ .‬בערוץ ‪,1‬‬ ‫במהלך הבידוד חלק מהמולקולות סבלו נתק ב‪DNA-‬‬ ‫ועברו הרפייה ספונטנית )ממצב ‪ cccDNA‬למצב‬ ‫‪ cDNA‬בלבד(‪ .‬אותן מולקולות נודדות לאט יותר‬ ‫מאשר מולקולות ‪ super-coiled‬רגילות‪ .‬בערוצים ‪2‬‬ ‫ו‪ 3-‬ניתן לראות מצבים שונים של טופואיזומרים‬ ‫שנוצרו על ידי הוספת אנזים הטופואיזומראז אשר‬ ‫מסוגל על ידי פתיחה וסגירה של ה‪ DNA-‬לשחרר‬ ‫מתחים או ליצור מתחים בגדילים‪ .‬ההבדלים בין‬ ‫הערוצים נובעים מכמות האנזים שהוספה‪ .‬ניתן‬ ‫לראות את מצבי הביניים שבין המצב ה‪super--‬‬ ‫‪ coiled‬לבין המצב ה‪ .coiled-‬מספר פיתולי העל‬ ‫משתנה בהדרגה בגלל שפעילות הטופואיזומראז‬ ‫מדורגת‪ ,‬והן משנות פיתול על אחד בכל מחזור‬ ‫פעילות‪.‬‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫טופואיזומרים נבדלים זה מזה במספר פיתולי העל‪.‬‬ ‫טופואיזומראזות מטיפוס ‪ I‬מבקעות בכל מחזור גדיל אחד‪.‬‬ ‫טופואיזומראזות מטיפוס ‪ II‬מבקעות בכל מחזור שני גדילים‪.‬‬ ‫טופואיזומראזות מתמחות בהרפייה של פיתולי על‪ .‬בחיידקים הן מרפות פיתולי על שליליים‪,‬‬ ‫באאוקריוטיים הם מרפות גם פיתולי על חיוביים‪.‬‬ ‫טופואיזומראזות בחיידקים יכולות גם לעיתים ליצור פיתולי על שליליים תוך פירוק ‪.ATP‬‬ ‫טופואיזומראזות תרמופיליות יכולות ליצור גם פיתולי על חיוביים‪ ,‬בתהליך שלרוב לא צורך‬ ‫‪.ATP‬‬ ‫טופואיזומראז ‪I‬‬ ‫טופואיזומראז זה מרפה רק פיתולי על שלילייים‪.‬‬ ‫הפעולה נעשית על ידי פתיחת אחד הגדילים )נתק‬ ‫בגדיל האדום( והעברת הגדיל השני )הכחול( דרכו‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :03‬הטופולוגיה של ה – ‪-DNA‬המשך‬ ‫‪19‬‬ ‫הדבר נעשה על ידי שייר טירוזין‬ ‫שמתחבר לפוספט בנקודת הניתוק‪.‬‬ ‫כעת מתקבל קצה ‪ OH‬בנוקליאוטיד‬ ‫הבא‪ .‬הגדיל השני יכול לעבור בנתק‬ ‫הזה‪,‬‬ ‫ולאחר‬ ‫מתהפכת‬ ‫המעבר‬ ‫הריאקציה‬ ‫ומחודש‬ ‫הקשר‬ ‫הפוספואסטרי )הכוח המניע הוא‬ ‫המתח שהיה בפיתול‪-‬העל(‪.‬‬ ‫טופואזומראז מסוג ‪DNA Gyrase – II‬‬ ‫מרטין גלרט גילה אנזים חיידקי החיוני‬ ‫כמו טופואיזומראז ‪ I‬אך פעולתו מעט‬ ‫שונה‪ :‬יש לו שתי יחידות קטליטיות‬ ‫המבקעות בו זמנית את שני הגדילים‪.‬‬ ‫דרך השבר הדו‪-‬גדילי מעבירים קטע‬ ‫דו‪-‬גדילי ואז סוגרים מחדש‪ .‬בצורה זו‬ ‫האנזים משנה פיתול על מסוג מסויים‬ ‫)למשל שלילי( לסוג השני )חיובי(‪.‬‬ ‫הפעולה משנה את ערך פיתולי העל‬ ‫ב‪ 2-‬יחידות‪.‬‬ ‫בחיידק יש את שני סוגי הטופואיזומראזות‪ ,‬ועל ידי כך שאחת יוצרת פיתולי על ואחת מרפה אותם הוא‬ ‫מסוגל לבקר בצורה הדוקה את מספר פיתולי העל בכרומוזום‪ .‬הבקרה על אנזימים אלו מבוססת על מנגנון‬ ‫משוב שלילי‪ :‬ככל שה‪ DNA-‬רפוי באיזור של ‪ ,DNA Gyrase‬כך החלבון משועתק ומתורגם ומגדיל את‬ ‫הפיתול; ככל שה‪ DNA-‬מפותל באיזור טופואיזומראז‪ I-‬כן הוא משועתק ומרפה את ה‪.DNA-‬‬ ‫מעכבי טופואיזומראזות כתרפיה לסרטן‬ ‫מעכבים של האנזימים גורמים לנתקים או‬ ‫שברים דו‪-‬גדיליים ובכך למות התא‪ .‬עובדה‬ ‫זו פוגעת במיוחד בתאי סרטן‪ ,‬בהם יש‬ ‫פעילות גבוהה של טופואיזומראזות‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪20‬‬ ‫סיכום‬ ‫תכולת הגנום ואריזתו‬ ‫הגנום אינו מצוי חופשי בתא; הוא קשור לחלבונים‪ ,‬ליגנדים ו‪ .RNA-‬המערך הארוז מאפשר דברים‬ ‫שונים‪:‬‬ ‫•‬ ‫כיווץ ה‪ DNA-‬למימדי התא‪.‬‬ ‫•‬ ‫הגנה על ה‪ DNA-‬מפני גורמי נזק אפשריים‪.‬‬ ‫•‬ ‫העברה מסודרת של כרומטידות בנות לתאי הבת‪.‬‬ ‫•‬ ‫מידור המידע – איזורים מסויימים בגנום מופרדים זה מזה כאתרים נפרדים; איזורים מסויימים‬ ‫מכווצים כל כך שאינם זמינים לשיעתוק על ידי פולימראז‪ ,‬בעוד שאחרים פרושים וזמינים יותר‪.‬‬ ‫השפעת גודל הגנום‬ ‫חיידקים‬ ‫וארכיאה‬ ‫מכילים‬ ‫לרוב‬ ‫כרומוזום מעגלי יחיד בכל תא‪.‬‬ ‫אאוקריה מכילים ‪ DNA‬לינארי‬ ‫המחולק לכרומוזומים מרובים‪ ,‬לרוב‬ ‫בשני עותקים )למעט כרומוזומי המין‬ ‫או פרוטיסטה בהם הצורה השלטת‬ ‫היא הפלואידית(‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :03‬הטופולוגיה של ה – ‪-DNA‬המשך‬ ‫‪21‬‬ ‫הגנום ממוקם באיזור תאי מוגדר‪ ,‬אולם רק האיזור האאוקריוטי מוקף ממברנה‪ .‬ככל שמורכבות היצור‬ ‫עולה‪ ,‬תכולת הגנום שלו עולה וצפיפות הגנים פוחתת‪ .‬עובדה זו מודגמת בטבלה הקודמת‪ :‬בעוד‬ ‫שבחיידק ה‪ E.coli-‬יש גן על כל מיליון בסיסים בערך‪ ,‬באדם או בעכבר יש צפיפות גנים נמוכה בשני‬ ‫סדרי גודל‪.‬‬ ‫הכרומוזום החיידקי צפוף מאוד מבחינת מרווחי הגנים‪ :‬מרווחים של זוגות בסיסים ספורים ואפילו לעיתים‬ ‫מסגרת קריאה אחת הנוגעת באחרת‪ .‬באדם‪ ,‬לעומת זאת‪ ,‬רק ‪ 1-1.5%‬מכלל ה‪ DNA-‬התאי הם רצפים‬ ‫המקודדים ישירות לחלבון‪ 98% .‬האחרים נחשבו כ‪ "Junk" DNA-‬שאינו בעל מטרה חשובה‪.‬‬ ‫ה‪ Junk DNA-‬מכיל אחוז ניכר של‬ ‫גנומים ויראליים שנתקבעו בגנום‬ ‫והפיצו את עצמם וכן אחוז ניכר של‬ ‫אינטרונים המשולבים בינות לאקסונים‬ ‫ומקודדים‬ ‫לחלבון‪.‬‬ ‫בעבר‬ ‫חשבו‬ ‫שאקסונים ואינטרונים הם היחידים‬ ‫שמשועתקים; היום ידוע ששאר ה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬משועתק גם הוא ל‪RNA-‬‬ ‫רגולטורי‪.‬‬ ‫כאשר בוחנים בין אורגניזמים שונים את הגן ל‪-RNA-‬פולימראז ניתן לראות שאחוז הרצפים הלא‬ ‫מקודדים בגן עולה וצפיפות הגנים קטנה – עובדה המדגימה מה קרה בכל הגנום‪ .‬עובדה זו מאפשרת גם‬ ‫וריאנטים גנטיים – שינוי סדר האקסונים והאינטרונים כך שניתן ליצור מגוון רפרטואר של תוצרים‬ ‫מאותו גן‪.‬‬ ‫באיור הבא ניתן לראות שתי כרומטידות אחיות‪ .‬לכרומוזום יש זרוע אחת המכילה גנים )הארוכה( וזרוע‬ ‫אחת שכלל לא מכילה גנים‪ .‬בזרוע המכילה גנים‪ ,‬הגדלת רזולוציית ההסתכלות מראה עד כמה צפיפות‬ ‫הגנים קטנה – בין שעקב אזורים רגולטוריים בהסתכלות רחבה יחסית או בשל כניסת אינטרונים עצומים‬ ‫)ביחס לאקסונים( בהסתכלות המצומצמת‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪22‬‬ ‫כרומוזומים‬ ‫אאוקריוטיים‬ ‫מכילים‬ ‫שלושה אלמנטים חשובים לתחזוקתם‪:‬‬ ‫•‬ ‫טלומר – רצף מיוחד שאינו מכיל‬ ‫גנים המבדיל את קצה הכרומוזום‬ ‫משבר‪-‬דו‪-‬גדילי‪ .‬קיימים מנגנונים‬ ‫מיוחדים‬ ‫האחראים‬ ‫לשכפול‬ ‫והארכת הטלומר‪ ,‬במידת הצורך‪.‬‬ ‫•‬ ‫מוצאי השכפול – נקודות פתיחה‬ ‫מרובות ודו‪-‬כיווניות לשיכפול ה‪-‬‬ ‫‪ .DNA‬השיכפול מתרחש בכל‬ ‫מקום למעט בקצוות‪ ,‬שם נמצאים‬ ‫רצפים הטלומרים המיוחדים‪.‬‬ ‫•‬ ‫הצנטרומר היחיד – איזור ללא גנים עם אריזה מיוחדת על ידי חלבונים היסטוניים השונים‬ ‫מההיסטונים הרגילים‪ .‬אחראי לקשר בין הכרומטידות בזמן השכפול וליצירת הכישור המיטוטי‪.‬‬ ‫כלל הכרומוזומים המצויים הגנום ניתנים לאיבחון‬ ‫בעזרת אוליגונוקליאוטידים המתאימים לרצפים‬ ‫המופיעים בין זוגות הומולוגיים כמו גם צבעים‬ ‫מיוחדים לכרומוזומי המין השונים‪ .‬בצורה זו נוצרת‬ ‫תמונת קריוטיפ אנושי‪.‬‬ ‫למרות שסדר הגנים דומים בין אדם לעכבר‪ ,‬סידור‬ ‫הגנים עצמו בכרומוזומים יכול להיות שונה מאוד‪.‬‬ ‫יכולים‬ ‫לחול‬ ‫גם‬ ‫שינויים‬ ‫עצומים‬ ‫במתאר‬ ‫הכרומוזומלי בין שני מינים מאוד קרובים כמו שני‬ ‫מיני האיל בתמונה‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :03‬מארז הגנום בתא ומבנה ה‪-RNA‬‬ ‫‪23‬‬ ‫שיעור ‪ :03‬מארז הגנום בתא ומבנה ה‪RNA-‬‬ ‫האורך הלינארי של ה‪ DNA-‬גדול בסדרי גודל מגודל התא או נגיף‪.‬‬ ‫בחיידקים נשמר מאזן של פיתולי על שליליים על ידי ה‪ Gyrase-‬וה‪ .Topo-I-‬ישנם גם חלבוני‬ ‫ארכיטקטורה המכופפים את ה‪ DNA-‬וחלבוני‬ ‫‪ MSX‬אוניברסליים )בחיידקים ואאוקריה( המכילים‬ ‫שתי תת יחידות הנקשרת ל‪ DNA-‬ומקרבות שני‬ ‫איזורי ‪ DNA‬מרוחקים‪ ,‬עצמאיים‪ ,‬על ידי התקרבות‬ ‫תת היחידות היוצרת לולאה שמקרבת את איזור‬ ‫התווך‪.‬‬ ‫בחיידקים אין חיץ פיזי בין שכפול‪ ,‬שיעתוק ותרגום‪.‬‬ ‫באאוקריוטים ה‪ DNA-‬ממודר בגרעין ונארז סביב‬ ‫היסטונים בשני קיפולי על שליליים‪ ,‬היוצרים מבנה‬ ‫דמוי שרשרת חרוזים‪ ,‬המתכווץ למבנים ההולכים‬ ‫ומצטופפים עד לרמת הכרומוזום המיטוטי‪.‬‬ ‫ה‪ DNA-‬שמצוי בין ליבות הנוקליאוזום רגיש יותר‬ ‫לאיכול על ידי נוקליאז‪ .‬ניתן להפריד כך את היחידות‬ ‫הנוקלאוזומיות‪ ,‬להפריד מהן את החלבונים ולפרק‬ ‫את החלבונים לתת יחידותיהם‪ .‬החלבונים דומים‬ ‫יחסית ובעלי מבנה בסיסי‪ .‬היחידות החוזרות‬ ‫העוטפות את הנוקליאוזום הן כפולות של ‪200‬‬ ‫נוקליאוטידים‪.‬‬ ‫• איכול המחרוזת על ידי ‪ Nuclease‬פוגע תחילה במרווח בין ליבות הנוקליאוזום‪.‬‬ ‫• עיכול מלא פוגע במבנה הליבה של החלבונים‪.‬‬ ‫החלבונים‪ ,‬הם ההיסטונים‪ ,‬עשויים מבנה ליבה משותף – ‪ – Histon fold‬המורכב משלושה סלילי אלפא‬ ‫שביניהם שלוש לולאות קצרות‪ .‬מוטיב זה משותף לכל ארבעת ההיסטונים ומופיע פעמיים בהיסטון‬ ‫החמישי )‪ .(H1‬כמו כן יש זנבות בעלי תפקיד רגולטורי‪ .‬היסטון ‪ H1‬נבדל בהיותו בעל מסה כמעט כפולה‬ ‫בשל כפילות המוטיב‪ .‬הזנבות מכילים שיירי סרין וליזין העוברים מודיפיקציות שונות – אצטילציה‬ ‫ומתילציה או יוביקוויטינציה על ליזין וזירחון בסרין‪ .‬השינוי במודיפיקציה משפיעה על ביטוי הגן‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪24‬‬ ‫ההיסטונים ‪ H3‬ו‪ ,H4-‬הקדומים מבין ההיסטונים‪,‬‬ ‫מתלכדים לטטראמר שיכול לקשור ‪ ;DNA‬מלפנים‬ ‫ומאחור נקשרים אליו גם זוגות ‪ H2a+H2b‬היוצרים‬ ‫קומפלקס מורכב‪ .‬גם בארכיאה נוצר מבנה ‪H3+H4‬‬ ‫שמהווה מבנה כרומטין פרימיטיבי‪.‬‬ ‫ה‪ DNA-‬מקיף את ההיסטונים בכמעט שני פיתולים שלמים‪ .‬בחתך רוחב )ימין( ניתן לראות מחצית מכל‬ ‫אחד מארבעת ההיסטונים ומחצית ה‪ .DNA-‬החלבונים באים במגע עם ה‪ DNA-‬מצד התעלה הקטנה‬ ‫בלבד‪ .‬הדבר מתאים לתכונתם‪ ,‬שכן הם נקשרים ל‪ DNA-‬ללא תלות ברצף‪.‬‬ ‫בנוקליאוזום רואים סרוגיות ב‪ DNA-‬הנקשר לנוקליאוזום –‬ ‫איזורים עשירי ‪ AT‬או ‪ GC‬לסירוגין‪ .‬כתוצאה מכך במקומות‬ ‫עשירי ‪ AT‬התעלה הקטנה צרה יותר וכאשר יש יותר ‪GC‬‬ ‫התעלה רחבה יותר‪ .‬עובדה זו מקלה על יצירת פיתול העל השלילי‬ ‫בו ה‪ DNA-‬מקיף את הנוקליאוזום ומסייע להציב את הנוקליאוזום‬ ‫בצורה מסויימת כלפי רצף ה‪ .DNA-‬זה מאפשר גם להשאיר‬ ‫במרווח החשוף ‪ DNA‬שצריך לעבור שיעתוק‪ ,‬למשל‪ ,‬ולכן צריך‬ ‫להיות זמין לקריאה‪ ,‬במקום לכלוא אותו בנוקליאוזום‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :03‬מארז הגנום בתא ומבנה ה‪-RNA‬‬ ‫‪25‬‬ ‫זנבות ההיסטונים‬ ‫הזנבות מלאים שיירי ליזין‪ ,‬הטעונים חיובית‪ ,‬ולכן נוטים להידבק‬ ‫לגדילי ה‪ DNA-‬השליליים‪ .‬המטען החיובי תורם לדחיסה של‬ ‫הכרומטין‪ ,‬ופריסה של ה‪ DNA-‬יכולה להיעשות על ידי חסימת‬ ‫הליזין במודיפיקציות שמנטרלות את המטען‪.‬‬ ‫גורם נוסף שמכווץ את הכרומטין הוא ‪ ,H1‬אשר יכול לקשור את‬ ‫שני הסיבים שיוצאים מהנוקליאוזום ותורם לבניית סיב ה‪30-‬‬ ‫ננומטר‪.‬‬ ‫מבנה ה‪RNA-‬‬ ‫במשך שנים רבות נחש ה‪ RNA-‬כרצף נוקליאוטידים שנקרא על‬ ‫ידי הריבוזום ומתורגם לחלבונים ותו לא‪ .‬לאחר שגילו את‬ ‫הריבוזימים – גדילי ‪ RNA‬המזרזים ריאקציות אנזימטיות – הובן‬ ‫שיש לו תפקידים נוספים ויש להכיר את המבנה שלו‪.‬‬ ‫המבדיל ‪ RNA‬מ‪ DNA-‬הוא בראש ובראשונה האורציל המופיע‬ ‫במקום טימין‪ .‬האורציל מכיל סוכר ריבוז עם חמצן נוסף בעמדה ‪.'2‬‬ ‫ה‪ RNA-‬גם נוצר כחד גדיל ולא דו‪-‬גדיל‪ ,‬אולם הוא יודע להתקפל‬ ‫בצורה מורכבת ואישית המייצרת מבנה אינדיבידואלי המזכיר את‬ ‫מבנה החלבונים באופיו‪.‬‬ ‫מדוע ל‪ DNA-‬יש ‪?T‬‬ ‫•‬ ‫דה‪-‬אמנציה היא ריאקציה ספונטנית בה שיירי ‪ C‬הופכים לשיירי ‪ .U‬אם ‪ U‬לא היה שונה‬ ‫מהבסיס התקני של ה‪ DNA-‬מערכת התיקון לא הייתה יכולה לזהות אותו כטעות ולתקן את ה‪-‬‬ ‫‪.DNA‬‬ ‫•‬ ‫יכולה להיות החלפה של ‪ T‬ב‪ U-‬וגם טעות זו מזוהה‪.‬‬ ‫•‬ ‫המתיל הנוסף של טימין מאפשר היותו תו היכר לפקטורי שיעתוק הניגשים ל‪ DNA-‬מצד התעלה‬ ‫הגדולה – קבוצה הידרופובית המתאימה לאינטרקאציה עם חומצות אמינו הידרופוביות‪ .‬ההבדל הזה‬ ‫לא מצוי באורציל והוא גם מבחין בין סידור של ‪ AT‬או ‪.TA‬‬ ‫תכונות ההידרוקסיל בעמדה ‪'2‬‬ ‫•‬ ‫תורם לאי‪-‬יציבות של ה‪ .RNA-‬בתנאים בסיסיים מתונים‪ ,‬ניתן לתקוף את הפוספט של נוקליאוטיד‬ ‫אחד בעזרת החמצן‪ ,‬כך שהשרשרת נשברת‪ .‬חוסר היציבות הוא כנראה הסיבה שלא ניתן היה לבסס‬ ‫גנומים ארוכים ועמידים על בסיס ‪.RNA‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪26‬‬ ‫•‬ ‫הקבוצה תרמה ליכולת קישור תוך ובין מולקולארי ולפעילויות קטליטיות לאתר פפטידיל‬ ‫טראנספראז ולריבוזים ראש‪-‬פטיש‪ .‬הראקציה של הריבוזום נעשית על טהרת קטליזה של ‪,RNA‬‬ ‫על ידי ‪ rRNA‬ו‪ .tRNA-‬ריבוזים ראש הפטיש מצוי בנגיפי צמחים מסויימים והינו בעל מבנה שניוני‬ ‫המזכיר ראש פטיש‪ .‬הריבוזים הזה מכיל קבוצה הידרוקסילית בעלת פונקציה קטליטית‪.‬‬ ‫היררכית מבני ה‪RNA-‬‬ ‫ל‪ RNA-‬יש היררכיה ארגונית כמו‬ ‫לחלבונים – מבנים ראשוני‪ ,‬שניוני‪,‬‬ ‫שלישוני ואפילו רבעוני בו מחברים‬ ‫‪ RNA‬אחד לשני‪.‬‬ ‫•‬ ‫מבנה ראשוני – רצף הנוקליאוטידים‪.‬‬ ‫•‬ ‫מבנה שניוני – נוצר מאינטראקציה במרחק קרוב‪ ,‬קיפול ה‪ RNA-‬על עצמו ליצירת איזורים דו‪-‬‬ ‫גדיליים‪ .‬אחד הזוגות השכיחים מבמבנה זה הוא זוג ה‪ wobble-‬של ‪ .UG‬איזור דו‪-‬גדילי נחשב כזה‬ ‫שמכיל רצף של לפחות שני זוגות בסיסים‪.‬‬ ‫•‬ ‫מבנה שלישוני – צירוף של שני דו‪-‬גדילים שיוצרים תווך של שתי לולאות המתכנסות ליצירת זיקות‬ ‫בין מבנים שניוניים‪ .‬באינטראקציות אלו משתתפים גם יוני מתכת המנטרלים את מטעני הפוספטים‪,‬‬ ‫בעיקר באינטראקציות ארוכות טווח כי הם יכולים ליצרו קשרי קואורדינציה‪ – 3‬יון מגנזיום יכול‬ ‫קשור לשש מולקולות מים או חמצנים‪/‬חנקנים של ה‪ RNA-‬עצמו‪.‬‬ ‫‪ 3‬קשרי קואורדנציה – דומים לקשרים קוולנטים אולם כאן אטום אחד תורם שני אלקטרונים לקליפה ריקה ולא אטום אחד‬ ‫תורם אלקטרון אחד לקשר‪ ,‬כמו בקשר קוולנטי‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :03‬מארז הגנום בתא ומבנה ה‪-RNA‬‬ ‫‪27‬‬ ‫במבנה המרחבי של ‪ RNA‬יש מגוון זוגות בסיסים‬ ‫לא שכיחים‪ :‬לא רק צלעות ווטסון קריק משתתפות‬ ‫אלא גם צלעות הוקסטיין והסוכר שמהוות את‬ ‫קרקעיות התעלה הגדולה והקטנה‪ ,‬בהתאמה‪ .‬הללו‬ ‫יכולות ליצור תלת גדיל )שידוך בסיס נוסף לצלע‬ ‫הוקסטיין(‪ ,‬אוריינטציית ציס וטרנס בין סוכרים‬ ‫והגדילים וכדומה‪.‬‬ ‫בריבוזום‪ ,‬שהוא קומפלקס עצום‪ ,‬מוצאים במיוחד אינטראקציות לא שגרתיות‪.‬‬ ‫הטבלה הבאה מציגה משפחות של זוגות ווטסון קריק וזוגות לא שכיחים נוספים‪.‬‬ ‫משמאל‪ :‬אלמנטי מבנה שניוני‪ :‬איזורים חד גדיליים‪ ,‬דו גדליים‪ ,‬בליטה הנוצרת מבסיס אחד לא מזווג‬ ‫)יכול להכיל בסיס אחד או מספר בסיסים( ולואה פנימית )היכולה להיות סימטרית או לא‪-‬סימטרית‬ ‫בתלות במקבילות מספר הבסיסים משני צידיה(‪.‬‬ ‫סיכת ראש היא מעצם מבנה של ‪ stem & loop‬וכן‬ ‫מבנה צומת – איזור שממנו יוצאים לפחות שלושה‬ ‫דו‪-‬גדילים‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪28‬‬ ‫שיעור ‪ :04‬מארז הגנום ומבנה ה‪ – RNA-‬המשך‬ ‫בדוגמה הבאה שני דו‪-‬גדילים חוברים זה לזה‪ .‬הם יכולים לחלוק‬ ‫ביניהם גדיל )או לא(‪ ,‬ולחבור על ידי תופעת מערום קו‪-‬אקסיאלי‪.‬‬ ‫אחת הדוגמאות לכך היא במבנה ה‪ tRNA-‬בעל מראה התלתן‪.‬‬ ‫מבחינה מרחבית‪ ,‬כל שני גבעולים מתלכדים יחד באינטראקציית‬ ‫מערום קו‪-‬אקסיאלי ויוצרים רצף דו‪-‬גדילי משותף‪ .‬כתוצאה‬ ‫מתקבלים שני מתחמים של ה‪ tRNA-‬ומניחים שיש להם מקורות‬ ‫אבולוציוניים שונים שהתאחדו בשלב מסויים‪.‬‬ ‫במבנה ה‪ tRNA-‬מודגמים מבני זוגות הבסיסים הלא‪-‬שגרתיים‬ ‫הקיימים במספר עצום – ‪ 50%‬מהבסיסים בגבעולי ה‪tRNA-‬‬ ‫נמצאים בזיווג‪ ,‬אך עם האינטראקציות הנוספות הלא‪-‬שגרתיות‬ ‫כמעט ‪ 90%‬נמצאים בזיווג ואינטראקציות מערומים‪.‬‬ ‫ניתן לראות קשרים בין ‪ U‬ל‪ G-‬עקב מודיפיקציה של היורידין וכן‬ ‫זווג לפסודו‪-‬יורידין במקומות רחוקים במולקולה היוצר קשר מימן‬ ‫בודד; אינטראקציות ווטסון‪-‬קריק קלאסיות שלא בתוך גבעול אלא‬ ‫באיזורים מרוחקים במולקולה; אינטראקציות ווטסון‪-‬קריק בקונפורמציית טראנס במקום ציס;‬ ‫אינטראקציה בין צלע הוקסטן וצלע ווטסון קריק בין שלושה בסיסים )שניים קשורים בווטסון‪-‬קריק‬ ‫קלאסי(‪.‬‬ ‫קשרים חריגים‬ ‫•‬ ‫קשר מדומה –קשר של זיווג‬ ‫בסיסים בין איזורים מרוחקים‪.‬‬ ‫•‬ ‫לולאות נושקות‬ ‫•‬ ‫בליטה לראש סיכה – מצב‬ ‫אסימטרי‪ ,‬ארבע בסיסים בלולאה יוצרים קשר עם הבליטה‪.‬‬ ‫•‬ ‫רוכסן ריבוז – התגלה לראשונה באינטרון של ריבוזים‪.‬‬ ‫האינטראקציה מבוססת על כך ש‪-2-‬הידרוקסיל במולקולת‬ ‫‪ RNA‬אחת מגיב בתגובה ארוכת‪-‬טווח של קשר מימני כפול‬ ‫עם החמצן של ההידרוקסיל – האחד לצלע הבסיס של הסוכר‬ ‫והשני לחמצן‪ 2-‬של הריבוז בנוקליאוטיד הסמוך לו‪ .‬הקשרים‬ ‫יכולים להיות סמוכים ורצופים אך הקשר נוצר בין‬ ‫נוקליאוטידים רחוקים ברצף של מולקולות ‪ RNA‬שונות‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :04‬מארז הגנום ומבנה ה – ‪-RNA‬המשך‬ ‫‪29‬‬ ‫תפקיד יוני מתכת דו‪-‬ערכית‬ ‫תרומה חשובה לאינטראקציות ארוכות טווח תורמים יוני מתכת דו ערכית – במיוחד יוני מגנזיום‪ .‬הם‬ ‫יכולים לגשר על פני שני מטענים שליליים של פוספטים וגם ליצור קשרי קואורדינציה המקבילים‬ ‫לקשרי קוולנטים‪ .‬האינטראקציות יכולות להיות‪:‬‬ ‫•‬ ‫ישירות ברצף ה‪ RNA-‬עם חמצנים של הפוספטים של ה‪;RNA-‬‬ ‫•‬ ‫מתווכות על ידי מולקולת מים;‬ ‫•‬ ‫משולבות )מתווכות וישירות(‪.‬‬ ‫אינטראקציות אלו מאוד מדוייקות – בניגוד לאינטראקציות של עננות יונים חד‪-‬ערכיים‪ ,‬המגנזיום מוצב‬ ‫במיקום מסויים מאוד ב‪ RNA-‬ויוצר אינטראקציות ארוכות טווח המצופפות את המטענים השליליים של‬ ‫ה‪ ,RNA-‬תורם למבנה המרחבי של ה‪ RNA-‬ולעיתים גם מקנה יכולת קטליטית למולקולות ה‪.RNA-‬‬ ‫ניבוי המבנה‬ ‫משיקולים תרמודינמיים‬ ‫מולקולת ה‪ RNA-‬הינה דינמית‪ .‬ניבוי המבנה שלה והיתכנות הקיפולים הקיימים בה מבוססים על‬ ‫שיקולים תרמודינמיים ויציבות מבני זוגות סמוכים ושכנים‪ .‬ב‪ ,RNA-‬בניגוד ל‪ ,DNA-‬לאלמנטי הרצף‬ ‫יש יציבות משלהם מעצם היותם מולקולות קטנות – אלמנטים קצרים של ‪ DNA‬אינם יציבים ללא כל‬ ‫המבנה הדו‪-‬הליקלי‪ .‬ניתן לסנטז אלמנטים קטנים ולבדוק את יציבותם לקבלת נתונים עבור זוגות בסיסים‬ ‫שכנים‪ ,‬יציבות לולאות‪ ,‬תרומתם האנטרופית של זוג הבסיסים הראשון ועוד‪.‬‬ ‫גם כאשר מתקבלות תחזיות שונות לגבי אפשרויות קיפול ה‪ RNA-‬יש לבחון אותן בשיטות ניסוייות‪ ,‬גנטיות‬ ‫ואנזימטיות על מנת לבדוק מהן ההשלכות של איזורים מקופלים או חשופים יותר‪ .‬אם ניתן לגבש את ה‪-‬‬ ‫‪ RNA‬מה טוב‪ ,‬אך אלו שיטות יקרות שאורכות זמן רב‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪30‬‬ ‫מהשוואות פילוגנטיות‬ ‫כאשר משווים הרבה רצפים של ‪ RNA‬מקבילים מאורגניזמים שונים‪ ,‬ניתן להבחין בשינויים קלים בין‬ ‫הרצפים האורתולוגיים החלים במהלך האבולוציה‪ .‬ההשוואה מאפשרת להתרשם משינויים מתואמים –‬ ‫כלומר שינוי מסויים ברצף שינה ‪ G‬ל‪ C-‬אך שינוי אחר שינה ‪ C‬ל‪ .G-‬מכאן אנו מסיקים שכנראה לא‬ ‫הרצף הוא המשנה אלא הזיווג – אם מקפלים את הרצף ניתן לראות שהבסיסים שהתחלפו יוצרים למעשה‬ ‫זיווג בסיסים כלשהו )לאו דווקא ווטסון קריק‪ ,‬יש לציין(‪.‬‬ ‫על מנת לבחון היפותזה זו מבצעים מוטגנזה בשני שלבים‪:‬‬ ‫•‬ ‫אם הבסיס חשוב לשימור מבנה ה‪ ,RNA-‬החלפה של זוג הבסיסים תגרום להתמוטטות המבנה‬ ‫וכתוצאה מכך לאובדן הפונקציה של ה‪.RNA-‬‬ ‫•‬ ‫אם מבצעים מוטציה שנייה מקבילה כך שזיווג הבסיסים משוחזר מהצד השני וכתוצאה מכך‬ ‫משוחזרת הפונקציה שאבדה לאחר המוטציה הראשונה‪ ,‬מכאן שבאמת זיווג זה קיים‪ ,‬הינו חיוני‬ ‫לפונקציה ומשום כך נשמר‪.‬‬ ‫קשרי ‪-RNA‬חלבון‬ ‫ה‪ ,RNA-‬מרגע היווצרו‪ ,‬קשור לחלבון‪ .‬החלבונים נקשרים ל‪ RNA-‬כבר מרגע היווצרותו‪ ,‬לצורך עיצוב‬ ‫הקצוות שלו )פעמים רבות ‪ RNA‬נוצר כפריקורסור שנחתכים ממנו מקטעים או מתווספות לו‬ ‫מודיפיקציות(‪.‬‬ ‫החלבונים מסייעים לשיחבור ה‪ ,RNA-‬להתמרת בסיסיו‪ ,‬היקשרות לצורך הגנה מנוקליאזות וכימיקלים‬ ‫מזיקים שונים; הם מסיעים את ה‪ RNA-‬ליעדו בתא – בתאים אאוקריוטיים מוציאים אותו מהגרעין‬ ‫ואפילו מסיעים אותו למקום בו החלבון שיתורגם ממנו צריך לפעול את פעולתו )למשל הסעת ה‪RNA-‬‬ ‫ממרכז תא עצב לקצה התא‪ ,‬בסינפסה(‪.‬‬ ‫מולקולות ‪ RNA‬פועלות בנוכחות חלבונים המבקרים את פעולתן ומייצבים את מבניהן‪ ,‬והחלבונים‬ ‫גם מסיימים את פעולתו ואורך חייו‪ .‬מסיבות אלו חשוב להבין את הקישור של החלבונים ל‪.RNA-‬‬ ‫שימוש מודולרי במוטיבי קישור‬ ‫מולקולות ‪ RNA‬ממלאות מגוון גדול של תפקידים‪ ,‬המשתקף במגוון גדול של מבנים מרחביים; החלבונים‬ ‫צריכים לזהות מבנים אלו הנחלקים למספר מצומצם של מוטיבים המשמשים להכרה – ‪RNA binding‬‬ ‫‪.domain‬‬ ‫ההכרה הספציפית של מולקולות ‪ RNA‬שונות נעשית בהכרה מודולארית – במולקולה אחת יש כמה‬ ‫מוטיבי קישור מאותו הסוג או מסוגים שונים המאפשרים הכרת מספר גדול של מבני ‪ RNA‬שונים‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :04‬מארז הגנום ומבנה ה – ‪-RNA‬המשך‬ ‫אינטראקציה‬ ‫קבוצת חלבונים‬ ‫אלקטרוסטטיות‬ ‫שיירי חומצות אמינו‬ ‫‪31‬‬ ‫קבוצות ‪DNA‬‬ ‫קבוצות ‪RNA‬‬ ‫הפוספטים של שדרת הגדיל‪.‬‬ ‫חיוביות )ליזין‪ ,‬ארגינין(‬ ‫ודיפול בין קצה ‪ N‬לאלפא‬ ‫הליקס‪.‬‬ ‫קשרי מימן‬ ‫חומצות אמינו‬ ‫מאפשרות לזהות זוגות‬ ‫חמצני פוספטים וקבוצות‬ ‫הידרופיליות‬ ‫בסיסים ספציפיים בתעלה‬ ‫‪.OH-2‬‬ ‫הגדולה‪.‬‬ ‫הידרופוביות‬ ‫חומצות אמינו לא‪-‬פולריות‬ ‫קבוצות התעלה הגדולה‬ ‫קבוצות התעלה הקטנה‬ ‫דרך ‪-5‬מתיל של טימידין‪,‬‬ ‫פחמני הבסיסים‪.‬‬ ‫מערומים‬ ‫‪4‬‬ ‫שיירי ארומטיים‬ ‫בסיסי ‪ DNA‬חד גדילי‬ ‫בסיסי ‪ RNA‬חד גדילי‬ ‫‪) RRM – RNA Recognition Motif‬מוטיב זיהוי ‪(RNA‬‬ ‫זהו מוטיב נפוץ המזהה את ה‪.RNA-‬‬ ‫המוטיבים נמצאים על החלבון ומאפשרים‬ ‫ליצור אינטראקציות ולקשור מולקולות‬ ‫‪ RNA‬ספציפיות‪ :‬ודגמת קשירת זנב ה‪-‬‬ ‫‪ poly-A‬של ‪ mRNA‬באמצעות שני‬ ‫דומיינים ספציפיים; שני דומיינים נוספים‬ ‫קושרים חלבונים אחרים המביאים את ה‪-‬‬ ‫‪ mRNA‬למקומו הייעודי בתא‪.‬‬ ‫אינטראקציות מערום בין השיירים של האדנוזין לשיירים ארומטיים‬ ‫מבטיחים לקשור חומצת גרעין; ההבטחה שזו תהיה מולקולת ‪RNA‬‬ ‫מתקיימת תודות לקשרים ספציפיים עם הריבוז‪.‬‬ ‫הגן הראשון שנמצא מקודד לחלבונים מסוג זה הוא ‪ – Pumilio‬חלבוני‬ ‫בקרה שנקשרים ל‪ mRNA-‬במורד הרצף המקודד )‪ .(53'-UTR‬איזור‬ ‫‪ 3'-UTR‬מכיל ‪ 10‬חזרות של מוטיב מסויים‪ ,‬כאשר אינטראקציות‬ ‫מערום בקצות המוטיב מייצבות את הקשר ו‪ 8-‬החזרות בתוך המוטיב‬ ‫מעניקות ספציפיות‪ .‬כל מוטיב שולח שייר ארומטי בין שני בסיסי ‪RNA‬‬ ‫וחומצות אמיניות אחרות יוצרות קשרי מימן‪.‬‬ ‫‪ 4‬אינטראקציות ‪ stacking‬הן ספציפיות לחומצות גרעין חד‪-‬גדיליות‪.‬‬ ‫‪ 5‬איזורי ‪ UTR‬הם איזורי בקרה חשובים לוויסות התרגום שנמצאים משני קצוות הגדיל‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪32‬‬ ‫חלבונים שמחפשים ‪ RNA‬דו גדילי מכילים מוטיב היוצר‬ ‫אינטראקציות ספציפיות עם התעלות הקטנות וגם נוגע‪-‬לא‬ ‫נוגע עם מרכז המוטיב בצד התעלה הגדולה הפונה אליו‪,‬‬ ‫עקב פתיחת התעלה הגדולה על ידי בסיס אחד לא מזווג‪ .‬יחד‬ ‫עם זאת אין אינטראקציה ספציפית כמו ב‪ – DNA-‬הוא‬ ‫לא יכול לשלוח אלמנטים המזהים את הרצף כי מימדי‬ ‫התעלה הגדולה לא מאפשרים זאת‪.‬‬ ‫ריבוזימים‬ ‫ריבוזים הוא אנזים עשוי ‪ .RNA‬ריבוזימים טבעיים מתפקדים בביוסינטזה של ‪ RNA‬וחלבונים ובשכפול‬ ‫גנומי של ‪ RNA‬נגיפי‪ .‬חקירתם תרמה להבנת יחסי מבנה‪-‬תפקוד של ‪.RNA‬‬ ‫גילוי הריבוזים חיזק את תאוריית עולם ה‪ .RNA-‬חיזוק הרעיון בייתי מכיוון שכמעט בלתי אפשרי לאתר‬ ‫מאובנים מולקולארים‪ ,‬והדבר שסיקרן את החוקרים היה האופן בו מולקולות ‪ RNA‬מסוגלות לזרז‬ ‫ריאקציות אנזימטיות‪ ,‬שכן הגיוון הכימי של ‪ RNA‬מוגבל מאוד לעומת החלבון‪.‬‬ ‫מכיוון שאלו מולקולות קטנות שניתן לסנטז מלאכותית‪ ,‬הן שימשו לא רק להבנת פעילות הריבוזימים‬ ‫עצמן אלא גם להשגת תובנות בנוגע למבנה ה‪ ,RNA-‬נושא שהיה זניח עד אז‪ .‬בנוסף לאותן פרדיגמות‬ ‫ניסוייות חשובות‪ ,‬מחקר הריבוזימים – במיוחד יצירת ריבוזימים מלאכותיים שיזרזו ריאקציות או ייקשרו‬ ‫ליגנדים לפי הזמנה – תרם ליישומים שימושיים‪.‬‬ ‫תומס צ'ך וסידני אלטמן גילו את הריבוזימים ושינו את התפיסה בנוגע לייחודיות היכולת הקטליטית של‬ ‫החלבונים‪ .‬הם גילו אינטרון שיכול לחלץ את עצמו מגדיל ה‪ RNA-‬בו הוא נמצא בלי סיוע של חלבונים;‬ ‫אולם הטענה היית שאין זה אנזים קלאסי כי הפעולה משנה את תפקודו כך שאינו יכול לחזור לפעילות‬ ‫כמו אנזים קלאסי‪ .‬לאחר שנה נמצא ריבוזים באנזים קלאסי האחראי להבשלה‪ 6‬של קצה '‪ 5‬של ה‪RNA-‬‬ ‫ונמצא שהריבוזים מסוגל לבצע את הפעולה במבחנה ללא סיוע החלבון אליו הוא מחובר‪ .‬זוהי באמת‬ ‫פעילות אנזימטית כי הגדיל לא משתנה ויכול לחזור על הריאקציה מספר רב של פעמים‪.‬‬ ‫בריסנית ‪ Tetrahymena‬יש פעילות חזקה של אנזים לתחזוקת‬ ‫טלומרים ותופעה ייחודית בה בפריקורסור ה‪ RNA-‬הריבוזומלי‬ ‫מקנן אינטרון הנחלץ במהלך הבשלת ה‪ ,rRNA-‬דבר חריג ב‪-‬‬ ‫‪.rRNA‬‬ ‫כאשר ניסו לבצע את השיחבור במבחנה‪ ,‬הדגירו את ה‪ rRNA-‬עם‬ ‫חלבונים וכביקורת ללא חלבונים‪ .‬למרבה ההפתעה‪ ,‬האינטרון‬ ‫נחלץ בשני המקרים‪.‬‬ ‫‪ RNA 6‬משועתק כפריקורסור גדול שבמהלך ההבשלה מאבד חלק בקצויו במעלה ובמורד האיזור המתורגם‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :04‬מארז הגנום ומבנה ה – ‪-RNA‬המשך‬ ‫‪33‬‬ ‫פעילות ריבוזים מעורבת בשחבור עצמוני של אינטרון ‪I‬‬ ‫מתברר שנוקליאוטיד מסויים‪ ,‬למשל‬ ‫גואנין‪,‬‬ ‫נקשר‬ ‫ל‪RNA-‬‬ ‫המיועד‬ ‫לחיתוך )באיור הקווים המרוסקים הם‬ ‫אקסונים והקו המלא הוא אינטרון(‪.‬‬ ‫במבנה ה‪ RNA-‬נוצר כיס אליו נקשר‬ ‫הליגנד‬ ‫החופשי‪.‬‬ ‫עם‬ ‫הקשירה‪,‬‬ ‫‪-3‬הידוקסיל חופשי של הגואנין תוקף‬ ‫את הקשר אינטרון‪-‬אקסון ליצירת‬ ‫קשר פוספואסטרי בין הנוקליאוטיד‬ ‫החופשי לנוקליאוטיד הראשון של‬ ‫האקסון‪ ,‬המשחרר את האקסון מה‪ .RNA-‬כתוצאה מהריאקציה ה‪ RNA-‬משנה קונפורמציה‪ ,‬זורק‬ ‫החוצה את הנוקליאוטיד ומכניס במקומו שייר ‪ ,G‬דהיינו הנוקליאוטיד האחרון של האינטרון‪.‬‬ ‫כעת האקסון הראשון‪ ,‬עם ההידרוקסיל החופשי‪ ,‬יכול לתקוף את הקשר הפוספו‪-‬דיאסטרי שמחבר את‬ ‫קצה ‪ '5‬של האינטרון לקצה האקסון השני‪ ,‬ואז מתקיימת ריאקציה דיאסטריפיקציה נוספת שקושרת בין‬ ‫שני האקסונים בריאקציית השיחבור‪.‬‬ ‫הריבוזים הזה לא יכול לפעול בלי שיהיו קשורים‬ ‫אליו יוני מגנזים‪ ,‬שחלקם אחראים לקיפול מרחבי‬ ‫והם קשורים לאתר הקטליטי של הריבוזים – זהו‬ ‫למעשה מטאלואנזים שמבצע פעילותו בעזרת יוני‬ ‫מתכת המשמשים כבסיס‪ ,‬חומצה וייצוב מצב המעבר‬ ‫של האסטריפיקציה‪.‬‬ ‫שני יוני מתכת דו‪-‬ערכית הנמצאים במרחק מאוד‬ ‫מסויים זה מזה המתארגנים סביב מרכז הפוספט של‬ ‫הסובטסטרט היא תופעה שכיחה באנזימים הפועלים‬ ‫למדו את‬ ‫על פוספט‪ .‬ישנה סברה שהחלבונים האלה" "‬ ‫התרגיל הזה מריבוזים שקדמו להם והוחלפו על ידיהם‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪34‬‬ ‫ריבוזים מביא להבשלת ‪tRNA‬‬ ‫הריבוזים השני ממסלק קצה מיותר מתוך מולקולת ‪ RNA‬ומזרז ריאקציית שחרור של החלק העודף‪.‬‬ ‫הקבוצה התוקפת היא מולקולת מים המופעלת על ידי הריבוזים‪ .‬תתת יחידת ה‪ RNA-‬של הריבוזים‬ ‫צמודה לפוליפפטיד יחיד בחיידק‪ ,‬ארבע יחידות בארכיאה ועשר באאוקריה‪ .‬תת היחידות מייצבות את‬ ‫המבנה הפעיל של מולקולת ה‪RNA-‬‬ ‫כדי שתזרז את הפעילות בעצמה‪.‬‬ ‫לצורך הפעילות נדרש ריכוז לא‪-‬‬ ‫פיזיולוגי‪ ,‬גבוה מאוד‪ ,‬של מגנזיום‪.‬‬ ‫לאחר מספר שנים ונסיונות לגלות‬ ‫ריבוזימים נוספים הסתבר שבהרבה‬ ‫נגיפי‬ ‫‪RNA‬‬ ‫מקננים‬ ‫ריבוזימים‬ ‫שמזרזים ריאקציות ביקוע‪-‬עצמי של ה‪ .RNA-‬מולקולות ‪ RNA‬נגיפי חד‪-‬גדיליות מעגליות‪ ,‬למשל‪,‬‬ ‫נדרשות להיות משועתקות על ידי ‪ RNA replicase‬המייצרים ‪ RNA‬קומפלמנטרי לגדיל המעגלי‪ .‬ה‪-‬‬ ‫‪ RNA‬הנוצר משתלשל מהתבנית ויכול להיות ארוך מאוד ולהכיל חזרות רבות של הרצף המעגלי‪ ,‬כיוון‬ ‫שהוא מכיל מספר רב של יחידות גנומיות‪ .‬יש לקצוץ מתוכו את היחידות הגנומיות‪ ,‬דבר שייעשה על ידי‬ ‫ריבוזימים שיבקעו אותן‪.‬‬ ‫שימו לב שהמעגל הגנומי משועתק ליצירת מעגל אנטי‪-‬גנומי‪ ,‬אשר יכול להיות מתורגם לחלבוני הויריון או‬ ‫משועתק שוב ליצירת יחידות גנומיות שייכנסו לויריון השלם‪.‬‬ ‫ריבוזים ראש‪-‬פטיש‬ ‫הריבוזים פועל בריאקציה של ביקוע וליגציה בודדת של ‪.RNA‬‬ ‫בניסוי גרמו לו לפעול כמה פעמים על ידי ניתוק החלק האנזימטי‬ ‫מהחלק הסובסטרטי‪ .‬כעת המולקולה יכולה להיבקע על ידי החלק‬ ‫האנזימטי )אדום(‪ .‬ביקוע האוליגונוקליאוטיד והרפיית הקשרים‬ ‫המאפשרים לאוליגונוקליאוטיד )כחול( להיפרד מאפשרים לקשור‬ ‫עוד אוליגונוקליאוטיד‪.‬‬ ‫בצורה כזו הפך ריבוזים חד‪-‬פעמי לריבוזים רב‪-‬מחזורי‪ .‬מכיוון‬ ‫שהרצפים הם סתמיים ורק צריך ליצור זוגות בסיסים כלשהם‪ ,‬ניתן לסנטז את הריבוזים ולהשתמש בו‬ ‫בכל רצף ‪ RNA‬שמבקשים לתקוף – ליצור רצפי ‪ RNA‬ראש פטיש שיכולים לתקוף ‪ RNA‬לפי‬ ‫הזמנה‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :04‬מארז הגנום ומבנה ה – ‪-RNA‬המשך‬ ‫‪35‬‬ ‫ריבוזימים הגורמים לביקוע‪-‬עצמי‬ ‫ריבוזימים המבצעים ביקוע עצמי עוברים הפעלה של הנוקליאופיל‪ ,‬החמצן תוקף את הפוספט ובהמשך‬ ‫נתרם פרוטון ליצירת קבוצה עוזבת‪ .‬כעת שרשרת ה‪ RNA-‬נשברת כי הקשר הפוספואסטרי הבין‪-‬‬ ‫נוקליאוטידי מוחלף בקשר תוך נוקליאוטידי וכך ה‪ RNA-‬נשבר‪.‬‬ ‫האתר הפעיל‬ ‫מה ב‪ RNA-‬הופך את הנוקליאופיל לנוטל פרוטון ואיזו קבוצה חומצית תורמת פרוטון?מה מייצב את מצב‬ ‫המעבר? מסתבר שבעוד שחלבון יכול לשנות את קיפול הסובסטרט כדי לייצב את מצב המעבר‪ ,‬הריבוזים‬ ‫משתמש באחד הגואנינים בתור קבוצה קטליטית למשיכת פרוטון מהידרוקסיל‪ 2-‬של התוקף‪ ,‬להפכו‬ ‫לנוקליאופיל; קבוצה שנייה היא חמצן‪ 2-‬של ‪ .C‬יצוב מצב המעבר נעשה כך שהקבוצות שאופפות אותו‬ ‫יוצרות יותר קשרי מימן מאשר בסובסטרט או בתוצר – כלומר המצב מיוצב על ידי קשרי מימן עודפים‪.‬‬ ‫בעקבות החוליות החסרות – ‪Selex‬‬ ‫במבחנות ניתן לסנטז מולקולות ‪ DNA‬מסויימות או בעלות רצף אקראי )נוקליאוטיד ‪ N‬כלשהו(‪ .‬הדבר‬ ‫יוצר כמות אדירה של רצפים שונים‪ ,‬גם ברצפים בני ‪ 100‬בסיסים; ניתן לשער שיהיו באוסף המצומצם‬ ‫הזה רצפים שיכולים לעשות משהו מיוחד – לקשור חומצה אמינית‪ ,‬חלבון‪ ,‬קו‪-‬אנזים‪ ,‬נוקליאוטיד‪ ,‬אטום‬ ‫זהב – ואולי כאלה שגם יכולים לזרז ריאקציה אנזימטית ספציפית‪.‬‬ ‫בסלקציה ניתן למצוא אחוז קטן של מולקולות שמזרזות את התהליך המבוקש ביעילות נמוכה‪ ,‬לא כמו‬ ‫אנזימים טבעיים‪ .‬אם נחפש מולקולת ‪ RNA‬שיודעת ליצור קשר ‪-N‬גליקוזידי‪ ,‬ניתן לסנטז ‪ DNA‬אקראי‪,‬‬ ‫לשעתק אותו ל‪ ,RNA-‬בקצה ‪ '3‬לחבר כימית שייר פוספט עם ריבוז ולהסיף לריבוז שייר פירופוספט או‬ ‫פוספט שמפעיל את עמדה ‪ 3‬שלו‪ .‬לתערובת מוסיפים בסיס חנקני כלשהו שכולל אטום שמקל את בידוד‬ ‫המולקולות שקושרות אותו – למשל שמכיל גופרית במקום אחד החמצנים‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪36‬‬ ‫כעת מדגירים את כל גדילי ה‪ RNA-‬עם הבסיס‪ ,‬ממתינים ומזרימים את אוסף החומרים על קולונה אליה‬ ‫מקובעים אטומי כספית או תרכובת כספיתית הקושרת גופרית באופן ספציפי‪ .‬רק מולקולות ‪RNA‬‬ ‫שקשרו קוולנטית את הבסיס יישארו בקולונה‪ .‬ניתן להפיק אותן מתוך הקולונה ולהפוך אותן מחדש ל‪-‬‬ ‫‪ DNA‬בעזרת ‪ .RT‬את ה‪ DNA-‬מגבירים ב‪ PCR-‬ומשעתקים חזרה ל‪.RNA-‬‬ ‫בתהליכים האלה יוצרים מגוון במולקולות שהתקבלו – מכניסים מוטציות שיוצרות וריאנטים חדשים של‬ ‫המולקולות הלא יעילות שהתקבלו ומקווים שחלק מהמוטנטים יהיו מוצלחים יותר‪ .‬חוזרים על התהליך‬ ‫בתנאים מחמירים יותר – פחות זמן – ורק מולקולות שיצרו את הקשר באופן יעיל יותר‪ ,‬מהיר יותר‪,‬‬ ‫יישארו בקולונה‪ .‬ממשיכים וחוזרים על התהליך מספר פעמים עד שמוצאים מולקולות שמשלימות את‬ ‫התהליך בשניות ספורות‪.‬‬ ‫בשיטה זו בודדו אנזימים מלאכותיים שמזרזים ריאקציות אזימטיות ספציפיות‪.‬‬ ‫‪ RNA‬מזרז סינטזת חלבון‬ ‫באיור ניתן לראות ריבוזום שכלול‬ ‫בתוכו‬ ‫‪RNA‬‬ ‫)כתום=חלבונים‪,‬‬ ‫אפור=‪ .(RNA‬הנקודה הירוקה מייצגת‬ ‫את הקצה בו נפגשים הפפטידיל‪-‬‬ ‫‪ tRNA‬והאתר הפעיל‪ .‬ניתן לראות‬ ‫שהחלבונים רחוקים בלפחות ‪15-20‬‬ ‫אנגסטרום מהאתר הפעיל – כלומר‬ ‫הקטליזה נעשית על ידי ה‪RNA-‬‬ ‫לבדו‪ .‬העברת הפרוטון‪ ,‬המערבת בסיס‬ ‫וחומצה קטליטיים‪ ,‬לא נעשית על ידי‬ ‫בסיסים של ה‪ rRNA-‬אשר רק מציב‬ ‫אותם בעמדות הנכונות‪ .‬יחד עם זאת‬ ‫העברת הפרוטון ל‪ 3-‬הידרוקסיל של‬ ‫ה‪ tRNA-‬שעוזב מזורזת על ידי ה‪ 2-‬הידרוקסיל של ה‪ tRNA-‬עצמו בעמדת ‪.P‬‬ ‫התוצאה הזו‪ ,‬ש‪ RNA-‬טהור – ‪ – tRNA & rRNA‬מזרז את סינטזת החלבון מחזקת את הטענה ש‪-‬‬ ‫‪ RNA‬קדם לחלבונים המתורגמים )למרות שייתכן שנוצרו גם פפטידים על ידי דחיסה ספונטנים של‬ ‫חומצות אמינו שלא בתהליך תרגום(‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :05‬שיכפול‪DNA‬‬ ‫‪37‬‬ ‫שיעור ‪ :05‬שיכפול ‪DNA‬‬ ‫ממודל הסליל הכפול של ווטסון‪-‬קריק ניתן היה‬ ‫לחזות את אופן השכפול של ה‪ :DNA-‬דו‪-‬הגדיל‬ ‫ההורי נפרד וכל גדיל מהווה תבנית לבניית גדיל‬ ‫קומפלמנטרי ולקבלת שתי מולקולות ‪ DNA‬שרצפן‬ ‫זהה למולקולה ההורית‪.‬‬ ‫מודל זה נדרש לבדיקה ניסויית שנעשה על ידי‬ ‫מסלסון וסטאל‪ .‬הם ניצלו את העובדה שניתן היה‬ ‫להשתמש באיזוטופים וסימנו את ה‪ DNA-‬בחנקן‬ ‫‪ :15N‬גידלו חיידקים עם החנקן הזה כך שה‪DNA-‬‬ ‫שלהם יכיל את החנקן המסומן‪ ,‬ההופך את ה‪DNA-‬‬ ‫למעט צפוף יותר‪ .7‬לאחר מכן‪ ,‬הוציאו את החיידקים‬ ‫וגידלו אותם במצע גידול עם חנקן ‪ ,14N‬חיכו דור‬ ‫אחד ובודדו ‪ .DNA‬ה‪ DNA-‬שהתקבל היה בעל צפיפות ביניים בין ‪ DNA‬קל לכבד‪ .‬ככל שחיכו יותר‬ ‫דורות הלכה וקטנה צפיפות ה‪ .DNA-‬מכך ניתן להסיק שלאחר הדור הראשון כל ה‪ DNA-‬היה מורכב‬ ‫מגדיל ישן וגדיל חדש ולכן הייתה צפיפות ביניים‪ .‬לא היה מצב של ‪ DNA‬חדש טהור כי אז היה‬ ‫מתקבל ‪ DNA‬קל ולא צפיפות ביניים‪.‬‬ ‫מידע זה מעלה שאלות רבות‪ :‬מי פורם את הגדילים? מי מייצר ‪ DNA‬על התבניות החשופות? כיצד נשמרת‬ ‫הקוטביות המנוגדת של הגדילים בדו‪-‬סליל כאשר הסינטזה מתרחשת תמיד בכיוון יחיד‪ ,‬מ‪ 5'-‬ל‪ ?3'-‬כיצד‬ ‫מבטיחים שיכפול מלא של הכרומוזום פעם אחת בלבד‪ ,‬לא יותר ולא פחות? האם המסקנות המתקבלות‬ ‫מאורגניזם מודל זהה לכלל האורגניזמים? האם המנגנון בפרוקריוטים זהה לזה של אאוקריוטים?‬ ‫עקרונות השכפול‬ ‫עקרונות השכפול אוניברסליים‬ ‫אם בוחנים את כל היצורים התאיים במערכות השכפול‪ ,‬מתגלים כמה עקרונות משותפים‪ .‬עקרונות אלו‪,‬‬ ‫במידת מה‪ ,‬יפים גם למערכות מודל מסויימות – נגיפי ‪ DNA‬של חיידקים או אאוקריוטים מסויימים‪.‬‬ ‫הללו שימשו מערכות מודל חשובות לפיענוח מנגנון השכפול של התא המאחסן‪ ,‬כי יש להם כרומוזומים‬ ‫קטנים יותר משל המאחסן‪.‬‬ ‫לצד הדמיון והעקרונות האוניברסליים קיימים הבדלים מהותיים המפלגים את הממלכות לחיידקים‬ ‫ולארכיאה‪+‬אאוקריה‪ ,‬שכנראה היה להם אב משותף )כפי שעלה מהשוואת רצפים בין שלושת הממלכות(‪.‬‬ ‫‪ 7‬הצפיפות נמדדת בצנטריפוגציה לשיווי משקל‪ .‬בתמיסה של צזיום כלוריד ניתן להגיע לתמיסות רוויות בצפיפויות גבוהות‪,‬‬ ‫ואם מסרכזים את המבחנות בשדה צנטריפוגלי חזק המלח מתפזר ויוצר מפל ריכוזים של צפיפויות – הצפיפות הגבוהה ביותר‬ ‫בתחתית והנמוכה ביותר בראש המבחנה‪ .‬מולקולות ‪ ,DNA‬שהן גדולות ובעלות הדיפוזיה קטנה‪ ,‬ייסתדרו במבחנה במקום‬ ‫המתאים לצפיפותן‪ DNA .‬עם ‪ 15N‬נמצא בתחתית המבנה‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪38‬‬ ‫כללים משותפים‬ ‫•‬ ‫מוצאי‬ ‫השכפול‬ ‫–‬ ‫השכפול‬ ‫מתחיל מנקודה מסויימת בה ה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬עובר פרימה התחלתית‬ ‫בעקבות אינטראקציה עם חלבון‬ ‫בקרה‪ .‬הפרימה והשיכפול ממשיכים מנקודה זו בצורה דו‪-‬כיוונית )משני צידי הבועה לאורך הדו‪-‬‬ ‫גדיל(‪ .‬בחיידקים לעיתים מוצאים שיכפול חד כיווני‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ DNA‬פולימראז זקוק לתחל – התחלת הסינטזה חייבת להיות על בסיס חומצת גרעין קצרה‪,‬‬ ‫‪ ,Primer‬העשויה נוקליאוטידים של ‪ .RNA‬הקיום של התחל ב‪ DNA-‬זמני והוא יוחלף בהמשך ב‪-‬‬ ‫‪ .DNA‬סינטזת ה‪ DNA-‬מאותחלת על ידי ‪.RNA‬‬ ‫•‬ ‫רק אחד מהגדילים צומח ברציפות – הגדיל השני מסונטז במקטעים קצרים שבמהלך השיכפול‬ ‫מתחברים זה לזה )מקטעי אוקזאקי(‪ .‬התהליך מכונה ‪ .semi-discontinuous synthesis‬יש להבחין‬ ‫בין גדיל צומח וגדיל תבנית‪.‬‬ ‫מהתחלה ועד סיום‬ ‫מוצא השכפול יכול להיות רצף או מבנה ‪DNA‬‬ ‫מוגדר )בדוגמה מובא רצף ‪ 250‬זוגות בסיסים‬ ‫בככרומוזום החיידק ‪ .(E.coli‬רק אחוז קטן‬ ‫מהנוקליאוטידים בכרומוזום מהווה מוצא שכפול‬ ‫ומסוגל להשרות תחילת השיכפול‪ .‬בחיידק יש מוצא‬ ‫שכפול יחיד בעוד שבאאוקריה יש מוצאי שיכפול‬ ‫מרובים‪.‬‬ ‫חלבון‪/‬חלבוני בקרה נקשרים לרצף מוצא השכפול‬ ‫ומעודדים פרימה התחלתית‪ .‬פרימה זו מאפשרת גיוס‬ ‫חלבונים נוספים‪ ,‬כאשר הראשון בהם הוא הליקאז‬ ‫שתפקידו להמשיך ולפרום את ה‪ DNA-‬ההורי על‬ ‫מנת לספק תבניות שיכפול ל‪ DNA-‬החדש‪.‬‬ ‫כאשר הליקאז פורם את ה‪ DNA-‬ההורי וגדילי‬ ‫התבנית משמשים לסינטזת ‪ DNA‬משלים‪ ,‬נוצרים‬ ‫שני מבנים דינאמיים וסימטריים המכונים מזלגות‬ ‫שיכפול‪ :‬הם מכילים גבעול הורי שטרם נפרם וזרועות בת שהן הכרומטידות החדשות המסונטזות‪.‬‬ ‫השמות ‪ DnaB‬ו‪ DnaC-‬הם שמות הליקאז ושאפרון )בהתאמה( ונגזרים מהשמות שניתנו לגנים לפי‬ ‫מוטנטים לפני שזיהו מיהם הגנים עצמם או החלבונים המקודדים על ידיהם )מה שזוהה היה רק הפנוטיפ(‪.‬‬ ‫השאפרון ייחודי למוצא השיכפול וייצוב טבעת השיכפול הוא תפקידו העיקרי בתא‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :05‬שיכפול‪DNA‬‬ ‫‪39‬‬ ‫הליקאז משתמש באנרגיית פירוק נוקליאוטיד )לרוב ‪ (ATP‬כד למשוך את‬ ‫הגדיל ולשחרר את הגדיל השני במרכז מעגל תת היחידות שלו‪ ,‬תוך שהוא‬ ‫נע על גבי ה‪ .8DNA-‬כאשר פורמים את ה‪ ,DNA-‬אם לא יישתנו מספר‬ ‫הקשרים בחלק שעדיין לא נפרם הקשרים יצטופפו ואז יקרה אחד משני‬ ‫דברים‪:‬‬ ‫•‬ ‫עודף פיתולי על חיוביים באיזור שטרם נפרם‪.‬‬ ‫•‬ ‫פיתולי העל יינדדו אחורה וייגרמו לשתי כרומטידות‪-‬הבת להסתבך‬ ‫אחת בשנייה‪.‬‬ ‫בשני המקרים נדרשת פעילות טופואיזומראז שתפיג את המתח – בין אם‬ ‫על ידי יצירת פיתולי על שליליים או הרפיית המתח‪ .‬במקרה הזה‬ ‫משתמשים בטופואיזומראזות שיפרידו את הגדילים כי בסופו של דבר הם‬ ‫ייצטרכו להישלח לשני תאי הבת‪.‬‬ ‫בגלל שקיימת קוטביות מנוגדת בין גדילי ה‪DNA-‬‬ ‫ובגלל שהסינטזה מתקיימת רק מכיון ‪ '5‬ל‪ ,'3-‬אחד‬ ‫הגדילים‬ ‫מסונטז‬ ‫מקטעים‪-‬מקטעים‬ ‫על‬ ‫מנת‬ ‫שהסינטזה תישמר סימטרית‪ .‬משום כך אחד הגדילים‬ ‫מכונה הגדיל המוביל שהוא המסונטז באופן רציף‬ ‫והגדיל השני הוא הגדיל הנסוג‪ ,‬הבלתי המשכי‪.‬‬ ‫המקטעים מכונים מקטעי אוקזקי‪.9‬‬ ‫מגבלת הפעילות של הפולימראז מצריכה אנזים‬ ‫נוסף‪ ,‬פרימאז‪ ,‬המסוגל לסנטז ‪ RNA‬קצר כתחל‪,‬‬ ‫המיוצר ללא תלות בנקודה עצמה‪ .‬לאחר שהפרימאז‬ ‫ייצר את התחל‪ DNA ,‬פולימראז יכול להתחיל‬ ‫בסינטזה‪.‬‬ ‫‪ 8‬בחיידקים הוא כנראה נע על גבי ה‪ DNA-‬שנשאר קבוע במקומו בתא ובמערכות אחרות מניחים שהאנזים הוא שקבוע‬ ‫למקומו וה‪ DNA-‬נע על פניו‬ ‫‪ 9‬את מקטעי אוקזקי ניתן לבודד בעזרת הרצה בגל וסימון ב‪ dGTP-‬ו‪ .dCTP-‬זה קורה במערכת מודל שבה יש דו‪-‬גדיל‬ ‫שבאחד הגדילים יש הרבה ‪ G‬ובשני הרבה ‪ .C‬הבנייה תהיה כך שאחד הגדילים‪ ,‬למשל ‪ C‬קומפלמנטרי‪ ,‬יהיה רציף והשני‪,G ,‬‬ ‫יהיה עשוי מקטעי אוקזקי קצרים‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪40‬‬ ‫כאשר חושפים את תבנית ה‪ ,DNA-‬בייחוד על‬ ‫הזרוע הבלתי‪-‬המשכית‪ ,‬נוצרים מרווחים של‬ ‫נוקליאוטידים בלתי מזווגים )בחיידקים מגיע‬ ‫לאלפים‪ ,‬באאוקריה כמה עשרות או מאות(‪.‬‬ ‫לאיזורים אלו נקשר החלבון ‪ SSB‬המגן על החד‪-‬‬ ‫גדיל הן מפני נזקים שונים והם מפני קיפול‪-‬עצמי של‬ ‫ה‪ DNA-‬על עצמו‪ .‬כמו כן הוא מהווה עוגן לקשירת‬ ‫חלבוני שיכפול נוספים‪.‬‬ ‫כאשר מגיע פולימראז פעיל אל התחל הבא‪ ,‬יש לסלק את התחל ולאפשר לפולימראז לסנטז ‪DNA‬‬ ‫במקום תחל ה‪ .RNA-‬קישור שני המקטעים לאחר סילוק כל ה‪ RNA-‬נעשה על ידי ‪-DNA‬ליגאז שיוצר‬ ‫קשר דיאסטרי בין הקצוות של הנתק שנותר‪ .‬השכפול מסתיים עם מפגש בין המזלגות‪.‬‬ ‫בעיית הקצוות‪ :‬בכרומוזום מעגלי לא קיימת בעיה כי אין קצוות; בכרומוזום לינארי לעומת זאת אין דרך‬ ‫להשלים קצוות במנגנון השיכפול הרגיל‪ ,‬דבר שעשוי להוביל להתקצרות של הכרומוזום‪ .‬משום כך‬ ‫בשיכפול כרומוזום לינארי יש פתרונות שונים ומגוונים לבעית הקצה‪:‬‬ ‫•‬ ‫מנגנון מעגל סובב – קיים לרוב בחיידקים‪.‬‬ ‫•‬ ‫טלומרים – קצוות הכרומוזומים מכילים רצפים‬ ‫חוזרניים בני אלפי נוקליאוטידים המיוצר על ידי‬ ‫אנזים שלא זקוק לתבנית‪ ,‬טלומראז‪ .10‬פעילות‬ ‫הטלומראז אינה קיימת בכל התאים‪ ,‬אלא בעיקר‬ ‫בתאי גזע ותאים עובריים‪ ,‬כמו גם תאי סרטן בהם פעילות הטלומראז מתחדשת ומאפשרת לתאים‬ ‫התחלקויות לא מבוקרות מבלי לגרור נזק ל‪.DNA-‬‬ ‫בזמן השיכפול‪ ,‬ה‪ DNA-‬חשוף ביותר לנזקים ולכן יש לאפשר לתא שהות להפעיל מערכות בקרה‬ ‫)‪ (Checkpoints‬על מנת שיאתרו טעויות ויתקנו אותן‪ .‬אחת המערכות מזהה נזק בשיכפול ה‪DNA-‬‬ ‫ומשדרת‪ ,‬באמצעות זירחון חלבונים‪ ,‬שיש להפנות חלבונים לתיקון ‪ ,DNA‬לסנטז חלבונים הדרושים‬ ‫לייצור נוקליאוטידים ולעצור את מחזור התא‪.‬‬ ‫סיכום‬ ‫•‬ ‫הפרימאז חולש על ה‪ DNA-‬עד סיום המקטע שלו‪ .‬הפרימה נעשית בשני כיוונים מנוגדים ונוצרים‬ ‫שני מזלגות שיכפול‪ ,‬מבנים דינמיים המכילים גבעול הורי וזרועות בנות בהן מתקיימת סינטזת ה‪-‬‬ ‫‪.DNA‬‬ ‫•‬ ‫בגלל הקוטביות המנוגדת של ה‪ DNA-‬מחד והכיוון הכימי בו מסונטזות השרשרות מאידך אין ברירה‬ ‫אלא לסנטז רק גדיל אחד באופן רציף ואת הגדיל השני במקטעים‪.‬‬ ‫‪ 10‬האנזים לא זקוק לתבנית כי בתוך החלבון מקננת תבנית עשויה מולקולת ‪ RNA‬לרצף החוזרני‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :05‬שיכפול‪DNA‬‬ ‫•‬ ‫‪41‬‬ ‫הסינטזה זקוקה לתחל ‪ RNA‬על מנת שתתאפשר תחילת הפעילות של ה‪ DNA-‬פולימראז‪ .‬התחל‬ ‫מסופק על ידי חלבון הפרימאז‪ .‬התחל מסולק בהמשך ומוחלף ב‪.DNA-‬‬ ‫•‬ ‫הנתקים בין קטעי ‪ DNA‬סמוכים מחוברים על ידי אנזים ‪-DNA‬ליגאז‪ SSB .‬שומר בינתיים על חד‪-‬‬ ‫גדילים חשופים מפני נזקים‪.‬‬ ‫•‬ ‫טופואיזומראזות מונעות הצטברות של פיתולי על חיוביים‪ ,‬והמזלגות בסופו של דבר מתמזגים אלו‬ ‫לאלו באופן פסיבי או מבוקר‪.‬‬ ‫•‬ ‫בעיית הקצוות דורשת פתרונות יחודיים‪ .‬הפתרון הנפוץ באאוקריה הוא הטלומרים המשוחזרים‬ ‫בתאים ייחודיים על ידי אנזים טלומראז‪ ,‬המסנטז ‪ DNA‬על תבנית ‪ RNA‬חוזרנית‪-‬אינהרנטית‪.‬‬ ‫הרפליקון‬ ‫פרנסואה ז'קו טבע מונח זה‪ ,‬המתאר יחידת שכפול עצמאית שיש לה גם אלמנט ציס היכול לפעול רק‬ ‫על הכרומוזום בו הוא נמצא ואלמנט טראנס שיכול לפעול לוויסות הפעילות של אלמנט הציס‪ .‬דוגמה‬ ‫לכך קיימת בחיידק ‪ ,E.coli‬בו יש חלבון שיודע לזהות את הרצף של מוצא השכפול‪ :‬מוצא השכפול הוא‬ ‫אלמנט הציס‪ ,‬הרפליקטור‪ ,‬והחלבון הוא אלמנט הטראנס‪ ,‬האיניציאטור‪.‬‬ ‫בחיידקים מוצא השכפול מכונה ‪ .OriC‬המודל הזה מתאים לחיידקים‪ ,‬ארכיאה‪ ,‬נגיפים ופלסמידים שיש להם‬ ‫מוצא יחיד‪ .‬ב‪ DNA-‬אאוקריוטי יש מוצאי שכפול מרובים בכל כרומוזום ולכן לא כל אחד מקטעי הכרומוזום‬ ‫עליהם חולש כל מוצא שכפול יכולים לקודד לאיניציאטור‪ .‬כמו כן ידוע שמוצאי שכפול רבים נדלקים בצורה‬ ‫מתואמת ולכן לא ניתן לדבר עליהם כיחידות שכפול אוטונומיות‪.‬יחד עם זאת משתמשים במושג הרפליקון גם‬ ‫לתיאור קטעי ה‪ DNA-‬של הכרומוזום האאוקריוטי‪.‬‬ ‫בהפעלת מוצא השכפול האאוקריוטי משתתף חלבון ‪Origin‬‬ ‫)‪ .recognition complex (Orc‬באיור מופיע קטע קטן מ‪DNA-‬‬ ‫אאוקריוטי משתכפל‪ .‬ניתן לראות בצד האיזורים הקווייים בועות‬ ‫של מזלגות שיכפול‪ .‬ב‪ DNA-‬אאוקריוטי רואים מספר גדול של‬ ‫בועות כאלו‪ ,‬עדות לריבוי מוצאי השכפול‪.‬‬ ‫בתמונה הבאה רואים ניסוי ישן הממחיש את הריבוי והדו‪-‬כיווניות‬ ‫של מוצאי השכפול האאוקריוטים‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪42‬‬ ‫הניסוי נערך על ידי הוברמן והיקס ב‪ ,1966-‬אשר לקחו תאי אוגר סיני )יונק( שניתן לגדל בתרבית‬ ‫וסימנו אותם לפרק זמן קצר בטימידין מסומן בטריטיום )‪ .(3H‬הטריטיום מכיל קרינה חלשה שלא‬ ‫מתפזרת למרחק רב‪ ,‬ולכן אם מצלמים את ה‪ DNA-‬ניתן לראות את מתאר הכרומוזום )הקרינה לא‬ ‫מתפשטת ומקנה רזולוציה טובה(‪ .‬לאחר הסימון סילקו את מצע הגידול והוסיפו מצע עם טימידין לא‬ ‫מסומן‪ .‬כתוצאה מידת הסימון הולכת ונמהלת‪ .‬זהו ניסוי מסוג פעימה‪-‬דחיקה המאפשר לזהות גלגול של‬ ‫חומרים בתוך התא‪ .‬לבסוף בודדו את ה‪ ,DNA-‬מתחו על לוח זכוכית וקיבלו את התמונות המופיעות‪.‬‬ ‫בתמונה הימנית מופיעים גדילים מסומנים‪ .‬הקטע באדום מוגדל משמאל‪ .‬בקטע זה מופיעים סימנים‬ ‫שחורים‪ ,‬המראים את התקדמות שכפול ה‪ :DNA-‬הדינמיקה מותווית בהיחלשות הסימון‪ ,‬המעידה על‬ ‫כיוון צמיחת ה‪ .DNA-‬ניתן לראות שהוא צומח בשני הכיוונים‪ .11‬התווך הוא כנראה מוצא השכפול הדו‪-‬‬ ‫כיווני‪ .‬לא רחוק ניתן לראות עוד מוצא שכפול דו‪-‬כיווני והאמצע בין שניהם הוא המקום בו ייפגשו מזלגות‬ ‫השיכפול‪.‬‬ ‫על קטע ‪ DNA‬כה קטן רואים כבר שני מוצאי שכפול סמוכים‪ ,‬שכנראה נדלקו באותו זמן בצורה מתואמת‪.‬‬ ‫מנגנוני הפעלת והשתקת מוצא השכפול החיידקי ‪OriC‬‬ ‫אין זה דבר טריוויאלי לזהות ‪ 250‬זוגות בסיסים‪ ,‬מוצא השיכפול‪ ,‬בקטע של ‪ 5‬מיליון; מכיוון שהשכפול‬ ‫מתקדם בשני הכיוונים‪ ,‬כאשר מסתכלים על אוכלוסיה אקראית של חיידקים בניסוי פעימה‪-‬דחיקה‪ ,‬קטעי‬ ‫הכרומוזום הקרובים יותר למוצא השכפול מיוצגים יותר מאשר קטעי כרומוזום שקרובים לסוף השכפול‪.‬‬ ‫הדבר נבדק עם סמנים לאיזורים שונים בגנום‪ ,‬אשר הפיקו גרדיינט ממנו נעשתה הוקשה נקודת התחלה‪.‬‬ ‫בהמשך ניסו לשבט איזורים מהכרומוזום שיקנו יכולת שכפול לקטעי ‪ DNA‬סתמיים עד שהגיעו לקטע‬ ‫שמקנה את יכולת השכפול‪ ,‬והבינו שזהו ה‪ .Ori-‬אולם כיצד ‪ Ori‬מופעל וכיצד מבוקרת השתקה שלו?‬ ‫איזור ה‪ Ori-‬מכיל מספר אתרי קישור לחלבון‪ .‬כאשר החלבון נקשר הוא גורם לפרימה באיזור סמוך‬ ‫העשיר בזוגות ‪ .AT‬החלבון נקשר רק כשהאתר קשור ל‪ .ATP-‬עם תחילת השכפול ה‪ ATP-‬מתפרק‬ ‫ל‪ ADP-‬וכעת לא ניתן להיקשר שוב לאותו אתר; כך נמנע שיכפול חוזר בטרם עת מאותו אתר‪.‬‬ ‫חלבוני ארכיטקטורה שמעצבים את ה‪ DNA-‬ומכופפים אותו מאפשרים התאמה לקישור ‪.DnaA‬‬ ‫חלבונים אחרים הינם בעלי פעולה הפוכה‪ .‬הם מופיעים בעיתוי מתאים באיזור השיכפול‪ IHF :‬יופיע‬ ‫בהפעלה ו‪ FIS-‬יופיע בשיתוק‪.‬‬ ‫‪ 11‬האיזור שאינו מסומן באמצע הוא כנראה איזור ששוכפל עוד לפני שהוסף הסימון‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :05‬שיכפול‪DNA‬‬ ‫‪43‬‬ ‫אמצעי נוסף הם רצפים של ‪ .GATC‬השכיחות שלהם באיזור המוצע גבוהה מאשר הסתברותם האקראית‬ ‫בשאר הגנום‪ .‬הרצף מזוהה על ידי מתילאז בשם ‪ Dam‬שמסמן את הגדיל במתיל‪ .12‬מכיוון שהם שכיחים‬ ‫מאוד במוצא השכפול‪ ,‬נדרש יותר זמן עד שניתן למתל מחדש את הגדיל ולכן מעוכבת הסינטזה הבאה‪.‬‬ ‫תיבות קונצנזוס‪ ,‬רצפם דומים אחד לשני המכילים נוקליאוטידים המזוהים על ידי ‪ DnaA‬הנקשר מצד‬ ‫התעלה הגדולה‪ .‬הם אינם זהים אבל ה‪ DnaA-‬מזהה מוטיב שמאפיין אותם‪ .‬יש גם רצפי ‪ GATC‬רבים‬ ‫מאוד המעכבים את המתילציה‪ .‬כמו כן יש איזור עשיר ב‪ AT-‬והוא האיזור המועד לפרימה‪.‬‬ ‫‪ DnaA‬אחראי לפרימה‬ ‫ה‪ DNA-‬נכרך סביב הפיתול של‬ ‫‪ DnaA‬בפיתול על חיובי )לעומת‬ ‫פיתול העל השלילי שקורה סביב‬ ‫ההיסטונים(‪ .‬באופן אוטומטי האיזור‬ ‫הסמוך מתפתל בפיתול‪-‬על שלילי‪,‬‬ ‫המגביר את הנטייה לפרימה באיזור‬ ‫שגם כך עשיר ב‪ AT-‬ונוצרת הבועה‬ ‫ההתחלתית ממנה מתחיל השיכפול‪.‬‬ ‫בהמשך ‪ DnaC‬מגייס את החלבונים‬ ‫שיתאימו עליו גם את הליקאז‪.‬‬ ‫למרות שהחלבונים התרחקו במהלך האבולוציה יש להם מוצא משותף גם באורגניזמים שונים‪ .‬בחיידק כל‬ ‫הליקאז מחובר למזלג משלו בעוד שבאורגניזמים אחרים הם יכולים להיות צמודים אחד לשני )המחקר‬ ‫עדיין לא ברור בנוגע לזה(‪.‬‬ ‫דמיון בין חלבוני בקרת מוצא השכפול – חיידקי ואאוקריוטי‬ ‫‪ DnaA‬הוא קרוב‪-‬רחוק של תת היחידות השונות של ‪ .Orc‬ביונקים יש ל‪ Orc-‬שש תת יחידות שונות‬ ‫שכולן נגזרו מאותו מוצא קדום‪ .13‬המשותף הוא המנוע שקושר ומפרק ‪.ATP‬‬ ‫שיבוט מוצא השכפול ידוע; כעת ניתן לשתול אותו בקטע ‪ DNA‬אינרטי‪ ,‬שאין לו יכולת שיכפול‪ ,‬כך‬ ‫שנוצר פלסמיד זעיר בו יוכנס ‪ DNA‬ויועבר לתא החיידק‪ .‬מוצא השכפול ספציפי מאוד לתא ממנו הוא‬ ‫נלקח‪ :‬פלסמיד עם מוצא שכפול של קולי ניתן לשכפל רק בקולי‪.‬‬ ‫על מנת שפלסמיד יוכל להשתכפל בשני אורגניזמים שונים ניתן‬ ‫יהיה לצייד אותו בשני מוצאי שיכפול שונים‪.‬‬ ‫‪ 12‬המתילציה דרושה לזיהוי גדיל ישן ולהתחלת השיכפול‬ ‫‪ 13‬הנחה הנובעת מכך שבארכיאה יש תת יחידה שחוזרת על עצמה שש פעמים‪ .‬ככל הנראה הגן הסתעף‪ ,‬עבר רה‪-‬לוקליזציה‬ ‫ויוצר כעת שש נגזרות שונות שעדיין יוצרים יחד את ה‪ Orc-‬הנקשרים משני צידי ה‪.DNA-‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪44‬‬ ‫זיהוי מוצא שיכפול בסביבתו הטבעית‬ ‫כאשר מבודדים ‪ DNA‬מכרומוזום השמר המאפשר ליצור פלסמידים משתכפלים בשמר‪ ,‬מסתבר‬ ‫שהתפקוד של המוצאי השכפול בכרומוזום עצמו הוא חלקי בלבד‪ ,‬בצורה המותנית לרוב בתלות במצב‬ ‫ובמיקום בכרומוזום‪ .‬אם יעתיקו מוצא שיכפול פעיל לטלומר‪ ,‬מוצא השכפול לא יהיה פעיל וה‪DNA-‬‬ ‫ישוכפל על ידי מוצא שיכפול אחר‪ ,‬מרוחק‪.‬‬ ‫פסרו ושות' )‪ (2002‬התמקדו בקטע מהגנום של שמר‪ .‬בכל הגנומים יש גנים המיוצגים במספר רב של‬ ‫עותקים‪ ,‬דוגמת הגנים ל‪ :rRNA-‬בחיידקים יש שבעה‪ ,‬באדם יש מאות ולשמר יש רצף מורכב שמקודד‬ ‫לכל תת היחידות של ‪ rRNA‬עם איזורים בין גנים המכילים רצף ‪ARS (autonomous replication‬‬ ‫)‪ sequence‬משלהם‪ .‬הרצפים חוזרניים וסמוכים‪.‬‬ ‫לצורך בידוד הרצף מכלל כרומוזומי השמר‪ ,‬הריצו את הגנום של השמר‪ ,‬הפרידו את הגדילים ואז הגיבו‬ ‫עם אנזים הגבלה שמכיר רצף בן ‪ 6-8‬נוקליאוטידים‪ .‬איזור ה‪ rRNA-‬אינו מכיל את אתר החיתוך ולכן‬ ‫הוא היחיד שנותר בשלמותו‪ ,‬גדול ולא מרוסק‪.‬‬ ‫בהמשך מתחו את ה‪ DNA-‬על שבב שבו אפשר לסדר את ה‪ DNA-‬לכל האורך‪ .‬ה‪ DNA-‬התחיל‬ ‫להשתכפל וברגע תחילת השיכפול נתנו לתאים נוקליאוזיד מותמר שצובע את ה‪ DNA-‬בירוק‪ .‬בנוסף‬ ‫סימנו את ה‪ DNA-‬באמצעות אוליגונוקליאוטיד קומפלקמנטרי לרצף החוזרני של ‪ rRNA‬וכך סימנו את‬ ‫כל החזרות ברצף )נקודות אדומות(‪ ,‬כאשר כל נקודה אדומה מייצגת חזרה‪ .‬הנקודות הירוקות הן תחילת‬ ‫הסיטזה והצהוב הוא מיזוג של שני הקטעים‪.‬‬ ‫ניתן לראות שבעוד שיש עשרות ‪ ARS‬רק שניים מהם היו פעילים‪ .‬זהו עקרון כללי‪ :‬מוצאי שיכפול‬ ‫אינם דברים קבועים‪ ,‬למעט בחיידקים או נגיפים עם מוצא שיכפול אחד‪ .‬ביצורים יותר מתקדמים יש‬ ‫שימוש מותנה במוצאי שיכפול בתלות במצב ובשלב ההתפתחות‪ :‬בשלבים המוקדמים יש ב‪ DNA-‬הרבה‬ ‫מוצאים פעילים המאפשרים חלוקות מהירות מאוד; בהמשך זה מתמתן‪ .‬גנים המבוטאים בצורה פעילה‬ ‫ברקמה כזו או אחרת‪ ,‬משתכפלים ממוצא שיכפול תאי‪ .‬אם הגן מושתק ברקמה אחת ולא באחרת‪ ,‬הגן‬ ‫משתכפל מוקדם בתאים שבהם הוא מופעל ומאוחר בכרומוזומים בהם הוא מושתק‪.‬‬ ‫סיכום ביניים – מוצאי שיכפול ורפליקונים‬ ‫•‬ ‫ברפליקון חיידקי מוצא שכפול יחיד הפועל בציס וגן בקרה הפועל בטרנס‪.‬‬ ‫•‬ ‫רפליקון אאוקריוטי הוא קטע שנשלט על ידי מוצא שכפול משלו‪.‬‬ ‫•‬ ‫קטעי ‪ DNA‬המקנים יכולת שיכפול אוטונומית בודדו מחיידקים‪ ,‬פלסמידים‪ ,‬נגיפים ושמרים‪.‬‬ ‫•‬ ‫שיטות שונות משמשות לזיהוי מוצאי שכפול פעילים בסביבתם הטבעית‪.‬‬ ‫•‬ ‫הפעלת מוצא השכפול ביצורים אאוקריוטיים מותנית בשלב ההתפתחות או במצב ההתמיינות‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :05‬שיכפול‪DNA‬‬ ‫‪45‬‬ ‫רכיבי הרפליזום‬ ‫מכלול חלבוני מזלג השכפול מכונים רפליזום )למרות שקשה לבודד אותו‪ ,‬אבל מניחים שהוא קיים כי‬ ‫לחלבונים זיקה רופפת אחד לשני וניתן לראות אותם באותו מקום בתא‪ ,‬במוקדי שיכפול‪ ,‬על ידי צביעה‬ ‫אימונולוגית(‪.‬‬ ‫הליקאזות‬ ‫הליקאזות לא קשורות רק לשכפול ‪ ,DNA‬אלא גם לשיעתוק‪ ,‬לשיחבור והן פעילות גם על ‪;RNA‬‬ ‫הליקאזות יכולות לפרום דו סליל של חומצת גרעין כלשהי‪ .‬יש הליקאזות שלא רק פורמות ‪ DNA‬אלא‬ ‫יכולות לשאוב דו‪-‬גדיל לתוכן ולהזיז אותו ממקום למקום‪ ,‬עובדה בעלת חשיבות לריקומבינציה‬ ‫הומולוגית או דחיסת ‪ DNA‬למעטפת החבונית של נגיף‪ .‬ההליקאזות מניעות את ה‪ DNA-‬על ידי‬ ‫משיכת גדיל אחד והפרדתו מהשני – לצמיתות כמו ב‪ DNA-‬או באופן זמני כמו בריקומבינציה‬ ‫הומולוגית או בשאיבת ‪ DNA‬לנגיף‪.‬‬ ‫האנרגיה מסופקת על ידי הידרוליזת ‪ ATP‬או נוקליאוטיד אחר )נדיר(‪ .‬התהליך מאופיין בהפרדת הגדילים‬ ‫והופעת איזור חד גדילי‪ .‬התאים מכילים עשרות הליקאזות שונות האחראיות לתחזוקה ופגמים מולדים‬ ‫יכולים לנבוע מנזק להליקאז כזו או אחרת‪.‬‬ ‫במבחנה ניתן לבחון את פעילות ההליקאז ולזהות את הפעילות האנזימטית וגם את סוגה‪ .‬הליקאזות‬ ‫מסויימות מושכות ‪ DNA‬מ‪ 3'-‬ל‪ 5'-‬ואחרות מ‪ 5'-‬ל‪.3'-‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫‪46‬‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫לשם הזיהוי לוקחים ‪ DNA‬חד גדילי גדול ומוסיפים לו אוליגונוקליאוטיד מסומן רדיואקטיבית באחד‬ ‫הקצוות שהוא משלים‪ .‬אם ההליקאז תפריד את החד גדיל הוא ינדוד מהר בג'ל ואז הסימון יופע במקום‬ ‫נמוך יותר מהבנד של ה‪ DNA-‬הגדול‪.‬‬ ‫כעת זוהתה הפעילות אך לא את סוגה; לשם כך מחברים שני אוליגונוקליאוטידים באורכים שונים‬ ‫המאפשרים להבחין בין פעילות ההליקאזות על ידי הבחנת האוליגונוקליאוטיד ששוחרר – הקצר או‬ ‫הארוך‪) .‬הם נמצאים משני צדדים של אותו מוצא השכפול היחיד‪ .‬רוב ההליקאזות זקוקות לחד גדיל כדי‬ ‫להתחיל(‪.‬‬ ‫לכיוון הפעילות יש השלכות – הליקאז חיידקי מניע ‪ DNA‬בכיוון אחד ואאוקריוטי בכיוון שני‪.‬‬ ‫הראשון מושך את גדיל התבנית הבלתי‪-‬המשכית והשני את גדיל התבנית ההמשכית‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :06‬שיכפול – ‪ DNA‬המשך‬ ‫‪47‬‬ ‫שיעור ‪ :06‬שיכפול ‪ – DNA‬המשך‬ ‫הליקאזות – המשך‬ ‫הליקאזות שכפוליות‬ ‫ההליקאזות השכפוליות בנויות משש תת יחידות היוצרות קומפלקס מעגלי‬ ‫עם חור במרכזו; הקומפלקס אופף את החד גדיל‪ ,‬מושך אותו באופן‬ ‫פאסיבי ומשחרר את הגדיל השני‪ .‬בחיידק יש שתי טבעות שכאלו‪ ,‬כל אחת‬ ‫על גדיל משלה המסתעף ממוצא השכפול‪ .‬באאוקריוטים‪ ,‬ארכיאה ובנגיף‬ ‫האנימלי ‪) SV40‬המשמש כמודל( מסתבר שיש שתי טבעות משושות המתחברות יחד ליצירת משאבת‬ ‫‪ DNA‬דו‪-‬כיוונית‪ .‬ההבדל באאוקריוטים הוא שתת היחידות שונות למרות שלכולן מוצא אבולוציוני‬ ‫משותף‪ .‬שתי הטבעות המצומדות מקיפות את הדו‪-‬גדיל העובר בחלל הצינור הנוצר סביבו‪.‬‬ ‫משאבת ה‪ DNA-‬שואבת אותו משני עבריו ופועלת על שני מזלגות‪ .‬ההליקאז של ‪ SV40‬משמש‬ ‫כמערכת מודל אולם ההבדל בינו למערכת החיידקית הוא שלחלבון יש שני דומיינים )שכל אחד מופיעה‬ ‫שש פעמים היות ויש שש תת יחידות(‪ ,‬בהם יש פעילות של הליקאז ופעילות צמודה של פרימאז – כלומר‬ ‫שברגע שחושפים את החד‪-‬גדיל ניתן להניח עליו תחל ‪ .RNA‬גם במערכות אחרות הליקאז ופרימאז‬ ‫קרובים מאוד אולם הם כבר שני חלבונים נפרדים שיש ביניהם אינטראקציות חלבון‪-‬חלבון‪.‬‬ ‫בחיידקים לכל גדיל יש טבעת נפרדת‪ ,‬באאוקריוטים הקומפלקס של שתי הטבעות מושך את שני‬ ‫הגדילים יחד‪.‬‬ ‫הליקאז נגיפי כמודל אאוקריוטי‬ ‫ההליקאז של ‪ SV40‬דומה להליקאז האאוקריוטי ולכן משמש‬ ‫כמערכת מודל; בגיבוש החלבון הסתבר שהוא יוצר טבעת כפולה‬ ‫בעלת שלושה חלקים המסומנים באיור באדום‪ ,‬סגול וכחול‪ .‬שלושת‬ ‫הטבעות יוצרות צינור אחד‪ ,‬יחד עם עוד תת יחידה המורכבת גם‬ ‫היא משלוש טבעות‪ .‬החלל שנוצר בתוך הטבעות מאפשר מעבר של‬ ‫דו‪-‬גדיל‪ .‬החלק הכחול מזהה את רצף ה‪ DNA-‬של מוצא השכפול‬ ‫והוא מקביל ל‪ .DnaA-‬החלקים האחרים הם ההליקאז עצמו‪.‬‬ ‫חלבון ה‪ T-antigen-‬הוא חלבון עם פונקציות רבות שמקיים הרבה מהפוקנציות הנדרשות על ידי‬ ‫החיידק‪ ,‬מכיוון שנגיפים על פי רוב חסכניים מבחינה גנטית ותרגומית‪ .‬לחלבון יש תכונות מסרטנות‬ ‫מכיוון שהוא קושר שני חלבונים תאיים‪ ,‬שתפקידם למנוע כניסת התא לחלוקה ומנטרל אותם; עיכוב‬ ‫נעשה כיוון שהנגיף זקוק לאנזימי השכפול של ה‪ DNA-‬על מנת להתקיים‪ ,‬אך כתוצאה מכך הוא מונע‬ ‫בקרה תקינה על השכפול‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪48‬‬ ‫החלבון מזהה את מוצא השכפול של ה‪Origing binding -‬‬ ‫)‪ domain (OBD‬ומתפקד כהליקאז הפורם בו זמנית את שני‬ ‫מוצאי השכפול‪ :‬ה‪ DNA-‬הסלילי נשאב לתוך החלבון משני‬ ‫כיווניו ויוצא החוצה מבעד לחלבון‪ .‬האנרגיה להליקאז מתקבלת‬ ‫מפירוק ‪ ATP‬כדי למשוך את אחד הגדילים )תבנית המשכית( מ‪-‬‬ ‫'‪ 3‬ל‪ 5'-‬ואז להשחיל את התבנית דרך חרכים בין תת היחידות‬ ‫המרכיבות את הטבעת; באופן קומפלנטרי ‪,‬התבנית הלתי המשכית‬ ‫יוצאת מהצד השני‪.‬‬ ‫ההליקאז הארכאי הוכח כדומה למודל של ‪ ,S40‬ומכיוון שההליקאז‬ ‫האאוקריוטי הוא קרובו האבולוציוני מניחים כי הוא פועל בצורה‬ ‫דומה‪.‬‬ ‫‪ DNA‬פרימאז‬ ‫הפרימאז החיידקי )‪ (DnaG‬אינו צמוד לפולימראז ועשוי תת יחידה אחת‪ .‬יש לו טופולוגיה שונה משל‬ ‫פרימאז הארכיאה‪/‬אאוראיה‪ ,‬שכן הם בעלי מקור אבולוציוני שונה‪ ,‬ומורכבים משתי תת יחידות‪.‬‬ ‫באאוקריוטים פועלם יחד כמה ‪-DNA‬פולימראז‪ ,‬כאשר ‪ Polα‬פועלת בצמידות עם הליקאז והפרימאז‪.‬‬ ‫הפרימאז יוצר קטע ‪ RNA‬של ‪ 10‬נוקליאוטידים ו‪ Polα-‬ממשיך ומאריך אותו בעוד ‪10-20‬‬ ‫נוקליאוטידים‪ .‬לאחר מכן מצטרף פולימראז שני )‪ δ‬או ‪ ,ε‬למקטעי אוקזקי או גדיל המשכי בהתאמה(‪.‬‬ ‫בסופו של דבר מגיע ליגאז שמחבר בין שתי חתיכות )לאחר הסרת הפריימר והחלפתו ב‪ DNA-‬במקום‬ ‫‪ .(RNA‬בתמונה הבאה משווים בין התהליכים החיידקי והאאוקריוטי‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :06‬שיכפול – ‪ DNA‬המשך‬ ‫‪49‬‬ ‫מנגנוני ייזום אחרים‬ ‫בכל המערכות התאיות נדרש ‪-RNA‬פריימר שייצר תחל אשר יוארך על ידי פולימראז‪ .‬יחד עם זאת‬ ‫קיימים גם מנגנוני ייזום אחרים‪ ,‬לרוב בנגיפים‪.‬‬ ‫•‬ ‫מנגנון המעגל הסובב – בנגיפים מסויימים ‪ dsDNA‬מעגלי יוצר נתק באחד הגדילים ואז פולימראז‬ ‫מתחיל להאריך את הגדיל המנותק )המשמש כתחל( לאורך המעגל‪ ,‬והגדיל המתארך משתחרר‬ ‫ביחידות חוזרות מרובות של ‪ DNA‬הנגיף; בסופו של דבר יש‬ ‫לחתוך את היחידות‪.‬‬ ‫•‬ ‫שימוש ב‪ RNA-‬פולימראז‪.‬‬ ‫•‬ ‫מודיפיקציות לחלבון – נוקליאוטיד נקשר קוולנטית לחלבון פולימראז‪ ,‬אשר נקשר לקצה‬ ‫הכרומוזום הנגיפי‪ .‬בזכות קישור זה ניתן להתחיל לסנטז את הכרומוזום הנגיפי‪.‬‬ ‫•‬ ‫נגיפי רטרו – הגנום הוא ‪ ssRNA‬והכניסה לתא מתחילה שיעתוק הופכי עם ‪ RT‬היוצר גדיל ‪DNA‬‬ ‫קומפלמנטרי ל‪ .RNA-‬בסיום‪ ,‬ה‪ DNA-‬מופרד ומסונטז לו ‪DNA‬קומפלמנטרי ליצירת ‪dsDNA‬‬ ‫העובר אינקורפורציה לגנום המאחסן‪ .‬מכאן ניתן להמשיך בשיעתוק ‪.RNA‬‬ ‫גם ה‪ RT-‬זקוק לפריימר‪ ,‬אולם הוא לא נוצר על ידי פרימאז אלא מולקולת ‪ tRNA‬המגוייסת על ידי‬ ‫הנגיף‪ 18 :‬בסיסים מקצה ‪ '3‬של המולקולה‪ ,‬שהם קומפלמנטרים לאתר הקישור של ‪ ,RT‬נפרמים‪.‬‬ ‫כעת קצה ‪ '3‬יכול לשמש כתחל ליצירת ‪ DNA‬נגיפי‪ .‬בזמן היווצרות חלקיק הנגיף הוא קושר ‪amino‬‬ ‫‪ acyl synthetase‬יחד עם ‪ tRNA‬קשור וכולא את האנזים בתוך הקפסיד‪ .‬כאשר יש הדבקה מופעל‬ ‫‪.RT‬‬ ‫יצירת ‪ DNA‬נגיפי חד גדילי‬ ‫יש נגיפים שה‪ DNA-‬בתוכם הוא חד גדילי ולכן הם יכולים ליצור‬ ‫‪ DNA‬סביב החד‪-‬גדיל המעגלי‪ .‬בצורה כזו נוצר ‪ dsDNA‬ויכול‬ ‫להתחיל מנגנון מעגל סובב על ידי נתק באחד הגדילים‪.‬‬ ‫זוהי סינטזה אסימטרית )איור עליון(‪ ,‬שמזורזת לקראת אריזת ה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬ומייצרת ממחד מעגלי דו‪-‬גדיליים לצורך סינטזה ומרידך‬ ‫מעגלים חד‪-‬גדיליים שייכלאו בקפסידים; לעומתה קיימת סינטזה‬ ‫סימטרית )תחתון( בה הגדיל המודח )אדום( ממשיך להיות מסונטז‬ ‫במספר רב של חזרות‪ ,‬ותוך כדי הסינטזה מיוצר על גביו גדיל‬ ‫בלתי‪-‬המשכי‪ .‬התוצר הלינארי נחתך ליחידות הגנומיות שמוכנסות לקאפסיד בצורה לינארית‪ .‬בהדבקה‬ ‫הבאה היחידות ייתעגלו תוך כדי הכניסה למאחסן ויתחילו שוב במעגל הסובב הסימטרי‪.‬‬ ‫ההבדל בין מעגל אסימטרי הוא שיוצרים רק חד‪-‬גדיל בעוד שבמעגל סמטרי יוצרים דו‪-‬גדיל –‬ ‫לאורך הגדיל הנוצר מתחילים ביצירת גדיל קומפלמנטרי על ידי מקטעי אוקזקי‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪50‬‬ ‫‪DNA polymerase‬‬ ‫‪ DNA‬פולימראז הראשון התגלה לפני ‪ 50‬שנה‪ .‬גילויו היה מהפכה תפישתית‪ ,‬כי הוא חשף אנזים הזקוק‬ ‫לתבנית כדי לסנטז ‪ – DNA‬שלא כמו אנזימים אחרים שנחקרו קודם‪ .‬לא זו בלבד‪ ,‬הוא זקוק לארבעה‬ ‫פריקורסורים – ארבעת הנוקליאוטידים במצב טרי‪-‬פוספט למרות שרק הפוספט הקרוב ביותר לסוכר‬ ‫נשאר ב‪.DNA-‬‬ ‫אם משאירים את הפולימראז עם תבנית ללא פריימר הוא לא יוכל לסנטז; הוא זקוק לפריימר המשלים‪.‬‬ ‫בעזרת הפריימר הוא מסוגל לחבר את הנוקליאוטיד הבא על גבי הגדיל המשלים המסונטז‪ .‬הפריקורסור‬ ‫הוא תלת‪-‬פוספט‪ ,‬כלומר האנרגיה לקשר מתקבלת מפירוק קשר האנהידריד בין הפוספטים הראשון‬ ‫והשני‪ .‬התבנית תקבע את הפריקורסור שייבחר וקצה ‪ '3‬של התחל הוא הקצה הצומח‪.‬‬ ‫כאשר נוקליאוטיד נכנס משתחרר פירופוספט‪ .‬הפירופוספורילציה היא ריאקציה הפיכה ולכן‪ ,‬על מנת‬ ‫להסיט את שיווי המשקל לכיוון הביוסינטטי‪ ,‬הפירופוספט מתפרק מידי על ידי פירופוספטאז‪ .‬כמו כן‬ ‫עזיבת הפירופוספט מסיטה את האנזים לעמדה ‪) n+2‬כאשר הנוקליאוטיד שהוסף נמצא בעמדה ‪.(n+1‬‬ ‫ישנן מספר פולימראזות בתאים; ה‪ DNA-‬פולימראז‬ ‫הראשון שהתגלה היה קל לגיבוש יחסית‪ .‬המבנה‬ ‫הבסיסי – במיוחד האתר הקטליטי – דומה‬ ‫לפולימראזות אחרות ולכן מהווה מערכת מודל‪.‬‬ ‫האיזור הפעיל מתואר ככף יד ימין עם שלושה‬ ‫אלמנטים חשובים‪:‬‬ ‫•‬ ‫אגודל – מהדק את הקצה של הגדיל הצומח‬ ‫והקטע התבניתי המתאים אל החלבון‪.‬‬ ‫•‬ ‫אצבעות – מזמנות את הנוקליאוטיד המתאים לגדיל הראשון‪ ,‬החופשי בתבנית‪ .‬הן יוצרות כיס‬ ‫המתאים לזוג ווטסון קירק בלבד‪ ,‬המורכב מדיאוקסיריבונוקליאוטידים בלבד )לכן הפולימראז לא‬ ‫מפלמר ריבונוקליאוטידים‪ ,‬אין מקום ל‪ .(2'-OH-‬ההפרעה נגרמת תודות לחומצת אמינו אחת‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :06‬שיכפול – ‪ DNA‬המשך‬ ‫•‬ ‫‪51‬‬ ‫כף יד – האתר הקטליטי האחראי ליצירת הקשר הפוספואסטרי החדש‪ .‬באתר זה יש שני יוני מתכת‬ ‫דו‪-‬ערכית‪ .‬המטאלואנזים המשתמש ביוני המתכת לקשירת מולקולות מים כבסיס נוקליאופילי‬ ‫התוקף את הפוספט וכחומצה המוסרת פרוטון לפירופוסט לסיום התהליך‪ .‬הוא גם מייצב את מצב‬ ‫המעבר בעל עודף מטען שלילי‪.‬‬ ‫כמו כן התבנית מכופפת כך שהפולימראז ידע להשתמש‬ ‫בנוקליאוטיד המתאים בלבד‪ .‬כאשר נכלל ב‪ DNA-‬נוקליאוטיד‬ ‫שגוי‪ ,‬הגדיל הצומח מוסט לאתר אקסוגנאז אשר מבצע הידרוליזה‬ ‫לקשר האסטרי‪ .‬הנוקליאוטיד השגוי מוּסר והזווית חוזרת למצב‬ ‫הקודם כדי לאפשר הכנסת הנוקליאוטיד התקין‪ .‬זוהי מערכת ההגהה‬ ‫של הפולימראז‪.‬‬ ‫מוטציה בפולימראז יכולה לפגוע ביכולת ההגהה; יש פולימראזות המאבדים בכוונה את יכולת ההגהה‪.‬‬ ‫כתוצאה שיעור המוטציות הספונטניות ייגדל בכמה סדרי גודל‪ .14‬תופעה זו אותרה לראשונה בפולימראז‬ ‫של פאג' ‪.T4‬‬ ‫לקולי יש חמישה סוגי פולימראזות )טבלה(; לאדם‬ ‫יש לפחות ‪ .12‬חלקם אחראי לתיקון ושכפול ואחרים‬ ‫אחראים להכנסת מוטציות או אי‪-‬דיוקים מכוונים‪,‬‬ ‫בעיקר באירועי הדבקה ויראלית )המוטגנזה מגבירה‬ ‫את יכולת הזיהוי של התא המודבק על ידי המערכת‬ ‫החיסונית למניעת תפשטות הוירוס(‪.‬‬ ‫תכונות ‪PolI‬‬ ‫לפולימראז זה יש שתי פעולות אקסונוקליאז‪ :‬האחת‬ ‫משמשת להגהה והשנייה מאפשרת ביקוע בעזרת‬ ‫פרוטאז בנקודה ספציפית לשני חלקים; החלק‬ ‫הראשון מכיל את אתר הפולימראז וההגהה בעוד‬ ‫שהחלק השני מכיל את האקסונוקליאז '‪.5‬‬ ‫לחלבון קצב איטי )‪ 20‬נוקליאוטידים‪/‬שנייה‪ ,‬לשם השוואה פולימראז מזלג השכפול מפלמר ‪1000‬‬ ‫נוקליאוטידים‪/‬שנייה(‪ .‬כמו כן לחלבון יש פרוססיביות‪ 15‬נמוכה‪ .‬תהליך הנשירה וההצמדות מחדש מאריך‬ ‫את זמן חלוקת התא‪.‬‬ ‫‪ 14‬כל פנוטיפ מוטנטי במנגנוני שכפול‪ ,‬הגהה‪ ,‬נקודות בידוק הוא פנוטיפ קריטי לתהליך הסרטני – כי הן יוצרות תא סרטני‪ ,‬לא‬ ‫יציב גנטי‪ ,‬הצובר עוד ועוד מוטציות וכך הופך אלים יותר ועמיד יותר לתרופות‪.‬‬ ‫‪ 15‬פרוססיביות היא הנטייה ליפול מהתבנית‪ .‬ככל שהפרוססיביות גדולה יותר הפולימראז נשאר יותר זמן על הגדיל ולכן מסנטז‬ ‫גדילים ארוכים יותר‪ .‬פולימראז עם פרוססיביות נמוכה אינו מתאים לפילמור של כרומוזום ‪ ,DNA‬שהוא מולקולה גדולה‬ ‫מאוד‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪52‬‬ ‫מה הפולימראז כן עושה?‬ ‫•‬ ‫יכולת הגהה בעזרת אקסונוקליאז '‪.3'3‬‬ ‫•‬ ‫הסרת תחל ה‪ RNA-‬בעזרת אקסו '‪ 3' 5‬ומילוי החלל ב‪;DNA-‬‬ ‫•‬ ‫החלפת קטע ‪ DNA‬פגום בקטע תקין‪.‬‬ ‫פולימראז‪ I-‬אינו יעיל לשכפול אך משמש ביעילות לפעולות הטלאה – החלפת מקטעים קצרים‬ ‫פגומים או פריימרים‪.‬‬ ‫‪ DNA‬פולימראז ‪III‬‬ ‫בעל שתי ליבות זהות שכל אחת מכילה אתר‬ ‫פולימראז ותת יחידה שמשמשת כאקסונוקליאז הגהה‬ ‫)לא באותה שרשרת של פוליפפטיד אבל באתרים‬ ‫סמוכים דיים(‪ .‬כמו כן מכיל תת יחידה שלישית‬ ‫תפקודה אינו ידוע‪.‬‬ ‫המבנה כולו יכול לפלמר ‪ DNA‬בקצב איטי‬ ‫ופרוססיביות נמוכה; אולם יש עוד חלק‪ :‬טבעת קטנה‬ ‫בשם טבעת המצמד‪ ,‬המתיישבת על תבנית ה‪DNA-‬‬ ‫ועל ידי ריתוק הליבה לטבעת‪ ,‬הליבה הופכת פרוססיבית – נקשרת ל‪ DNA-‬בחוזקה ומחליקה מהר יותר‬ ‫לאורך ה‪ .DNA-‬בתוספת הטבעת הפולימראז הופכת יעילה ופרוססיבית יותר‪ .‬החלק השלישי )מטען‬ ‫המצמד( הוא שאפרון בעל תפקיד כפול‪ :‬הטענת הטבעת על ‪) DNA‬והסרתה לפי הצורך( וחיבור הליבה‬ ‫לטבעת‪.‬‬ ‫מכיוון שיש שתי ליבות ככל הנראה הפולימראז הזו נועדה לפלמר בו זמנית את שני הגדילים – ההמשכי‬ ‫והבלתי המשכי‪.‬‬ ‫טבעת המצמד משפרת יכולות‬ ‫הטבעת מתחברת במפגש הגדיל הצומח עם החד גדיל‪.‬‬ ‫בקישור היא מרתקת את הפולימראז ל‪ ,DNA-‬הופכת‬ ‫אותו למהיר ופרוססיבי יותר‪,‬ומוליכה אותו לאורך‬ ‫התבנית‪.‬‬ ‫הטבעת לא מרתקת רק פולימראז אלא גם ליגאז‪,‬‬ ‫חלבוני‬ ‫תיקון‬ ‫באאוקריוטים‬ ‫המתפקדות‬ ‫‪DNA‬‬ ‫יש‬ ‫כמה‬ ‫ופולימראזות‬ ‫טבעות‬ ‫אחרות;‬ ‫אלטרנטיביות‬ ‫בתיקוני ‪ .DNA‬העקרון‬ ‫זהה‬ ‫–‬ ‫פלטפורמה שמקשרת את החלבון ל‪ DNA-‬ומוליכה‬ ‫אותו לאורך התבנית במידת הצורך‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :06‬שיכפול – ‪ DNA‬המשך‬ ‫‪53‬‬ ‫מטען המצמד‬ ‫זהו שאפרון שעוזר להצמיד את הטבעת‪ .‬לכל אחד מחלבוני הטבעת )שני חלקים( יש שלוש אונות‪.‬‬ ‫באאוקריוטים אלו שלוש תת יחידות עם שתי אונות אבל המבנה עדיין זהה‪ .‬המבנה יוצר מעג פתוח אשר‬ ‫על מנת שיוטען על ה‪ DNA-‬צריך מנגנון שייסגור אותו לטבעת‪ .‬מטען המצמד מסוגל להיצמד למעגל‬ ‫הפתוח ובעזרת אנרגיית פירוק ‪ ATPADP‬לסגור אותו לטבעת‪ .‬גם באדם צריך שאפרון שיניח ויוריד‬ ‫את הטבעת ביצירת כל פיסת אוקזקי‪.‬‬ ‫פילמור בו זמנית בשתי הזרועות‬ ‫פולימראז המשכי ופולימראז בלתי המשכי נעיםבכיוונים מנוגדים לאורך החיידק; פיסות אוקזקי חיידקיות‬ ‫הן גדולות – ‪ 1000-2000‬נוקליאוטידים‪ .‬כיצד המבנה הדו‪-‬ראשי יכול למשוך בכיוונים שונים?‬ ‫שאלה זו העסיקה חוקרים זמן ניכר‪ ,‬עד לפתרון‬ ‫שהוצע‬ ‫על‬ ‫ידי‬ ‫ברוס‬ ‫אלברט‪.‬‬ ‫הוא‬ ‫הציע‬ ‫שהפולימראזות נותרות צמודות וה‪ DNA‬של‬ ‫התבנית הבלתי המשכית יוצר לולאה המתרחבת‬ ‫ומתכווצת במסלול פיסת אוקזקי‪.‬‬ ‫הסליל ההורי מופרד על ידי ההליקאז ויוצר תבנית‬ ‫לזרוע ההמשכית והבלתי המשכית‪ .‬הזרוע ההמשכית‬ ‫גדלה באין מפריע; הזרוע הבלתי המשכית מתכופפת‪ ,‬מתכווצת ומתרחבת – כאשר מחד ההליקאז שואב‬ ‫את הדו גדיל ומנפח את הטבעת ומאידך הפולימראז שואב את הטבעת‪ ,‬מסנטז את הרצף הקומפלמנטרי‬ ‫ומכווץ את הטבעת הנוצרת‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪54‬‬ ‫סידור קצוות – ‪ DNA‬ליגאז‬ ‫בסוף פיסת האוקזקי צריך להסיר את תחל ה‪.RNA-‬‬ ‫הדבר נעשה על ידי פולימראז‪ ,I-‬המסיט את הנתק‬ ‫מנקודת סוף האוקזקי אל נקודת סוף התחל )שהוחלף‬ ‫ב‪ .(DNA-‬שימו לב שגם לאחר פעולה זו קיים נתק –‬ ‫הוא פשוט הוזז‪ ,‬אך לא נעלם‪.‬‬ ‫על מנת לסגור את הנתק משתמשים בליגאז‪.DNA-‬‬ ‫מקור האנרגיה פעילותו בחיידקים הוא ניקוטין‪-‬אדנין‬ ‫)‪ (NAD+‬ובאאוקריה וארכיאה האנזים משתמש ב‪-‬‬ ‫‪) ATP‬גם בפאג' ‪ .(T4‬בשני המקרים מתקבל ‪AMP‬‬ ‫ופירופוספט או ‪) NMN‬חיידקים(‪.‬‬ ‫התהליך האנזימטי של פעילות הליגאז מתואר באיור‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :06‬שיכפול – ‪ DNA‬המשך‬ ‫‪55‬‬ ‫סיום שכפול כרומטידות סבוכות‬ ‫בתום השיכפול שתי הכרומטידות האחיות סבוכות אחת‬ ‫סביב השנייה‪ ,‬באותו מבנה שיוצרים שני הגדילים בדו‪-‬‬ ‫סליל‪ .‬כעת נדרש טופואיזומראז שיפריד את הסבך‪.‬‬ ‫הטופואיזומראז הוא ‪ II‬או ‪) IV‬שהוא טופואיזומראז ‪II‬‬ ‫מתמחה(‪.‬‬ ‫בעית הקצוות‬ ‫בכרומוזומים לינארים בעיה זו נפתרת על ידי רצפים‬ ‫חוזרניים בקצה הכרומוזום המוספים על ידי פולימראז‬ ‫מיוחד שלא משתמש בתבנית הגנומית כתחל אלא בתבנית‬ ‫פנימית‪ .‬הרצפים לא רק פותרים את בעית הקצוות אלא‬ ‫מבדילים בין קצה כרומוזום לבין שבר דו גדילי היכול‬ ‫ליצור בעיות רבות‪ ,‬דוגמת איחוי כרומוזומים שגוי‪.‬‬ ‫כאשר יש להאריך קצה נתון‪ ,‬הטלומראז נדבק לקצה החופשי‪ .‬אחת מהמולקולות הפנימיות של הטלומראז‬ ‫היא ‪ RNA‬שחושף את הרצף התבניתי של התחל הפנימי של הטלומראז‪ .‬כעת חלבון הטלומראז‪ ,‬שפועל‬ ‫כמו ‪ RT‬היוצר ‪ DNA‬על גבי ‪ ,RNA‬יוצר את הרצף הטלומרי המוסף למקום חדש – מול קטע קטן שהוא‬ ‫בנה ושהינו קומפלמנטרי לתחל הפנימי‪ ,‬וכך הוא מדלג הלאה‪ .‬הרצף הזה מושך חלבונים שמקפלים אותו‬ ‫בצורה ייחודית ועוצרים בזמן נתון את הטלומראז‪.‬‬ ‫אאוקריוטים מסויימים אינם מכילים טלומראז אך כן מכילים חזרות ופותרים את בעיית הקצוות על ידי‬ ‫"הלוואת" קצוות מכרומוזום אחד לאחר באופן זמני‪.‬מסיבה זו גם תאים סרטניים שבהם עוכב הטלומראז או‬ ‫שאיבדו את החלבון לא בהכרח ימותו עקב איבוד טלומרים‪.‬‬ ‫מכיוון שבתאים הסומטיים הטלומראז אינו פעיל טוענים כי הוא הקובע את מספר החלוקות האפשריות‬ ‫וכתוצאה מכך גם את אורך החיים‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‬ ‫‪56‬‬ ‫שיעור ‪ :06‬יציבות הגנום‬ ‫יציבות הגנום חיונית אולם שינויים גם יכולים ליצור יתרונות שרידה ויצור חדש‪ ,‬מותאם יותר‪ .‬הגנום‬ ‫נפגע ללא הרף מנזקים חיצוניים ופנימיים כאחד‪ ,‬אולם הגוף עמיד למדי ומכיל מנגנוני תיקון איתנים‬ ‫לעומת הנזקים האלו‪ .‬נזקים שחומקים מהתיקון הופכים למוטציות‪ ,‬היכולות להזיק‪ ,‬להקנות יתרון או‬ ‫להיות מוטציות שקטות שאינן משפיעות‪ .‬מוטציות יכולות להיות גם מכוונות באתרים ספציפיים על מנת‬ ‫ליצור פרטים כשירים יותר להתמודדות במצבי עקה‪.‬‬ ‫מה פוגע ב‪DNA-‬‬ ‫•‬ ‫טעויות בשכפול שלא תוקנו כמו הכללות שגויות‪ ,‬כפילויות או דילוגים‪.‬‬ ‫•‬ ‫חלק מהטעויות מתוקנות בהגהה ויש גם מערכת תיקון ספציפית לזוגות בזיווג לא נכון‪ .‬כאשר‬ ‫המערכת הזו פגועה באדם יש נטיית יתר לסרטן המעי הגס‪ ,‬למשל‪.‬‬ ‫•‬ ‫גורמי סביבה אחראים לנשירת בסיסים‪ ,‬התמרתם‪ ,‬ואפילו הצמדות בין בסיסים‪.‬‬ ‫•‬ ‫גורמי נזק אחרים הם אלמנטים ניידים כמו נגיפים שיכולים להשתבץ בתוך ה‪ DNA-‬הגנומי אך לא‬ ‫נדון בהם בקורס זה‪.‬‬ ‫תוצאות נזקי ה‪DNA-‬‬ ‫•‬ ‫מוטציות על ידי נזקים שלא עוברים תיקון‪ .‬מוטציות בגן חיוני משפיעות על תוצרי התא‪.‬‬ ‫•‬ ‫פנוטיפ המוטנט‪ ,‬פגיעה בגן החשוב ליציבות הגנום ומערערים את יציבותו‪ ,‬גורמת לתוצאות קיצוניות‬ ‫– מוות תאי‪ ,‬הזדקנות מואצת ושינויים מסרטנים‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬