ביולוגיה של התא - שיעורים 12-14
שיעור :12שיכפולDNA 135 15.04.2010 שיעור :12שיכפול DNA עולה השאלה :האם הדו-גדיל החדש בנוי משני גדילים חדשים לגמרי ,או שמה יש שני דו-גדילים שבכל אחד מהם יש גדיל חדש וגדיל ישן? היום ידוע שהמצב הוא כמו המצב השני, המכונה "חצי שמרני" )semi- ,(conservativeואנחנו לא ניכנס לאופן ההוכחה )מי שהוכיחו היו & Meselson .(Stahl משמעות הדבר הוא שתמיד יש גדיל DNA שהיה באבות-אבותיו של התא. תזכורת על מבנה הDNA- הגדילים הם פולימרים העשויים מהמונומרים הנוקליאוטידיים .השלד הפוספו-דיאסטרי עשוי מחיבור בין הפוספט בעצדה מספר ' 5והOH- של הסוכר שבעמדה מספר ' .3כתוצאה מזה נוצרת כיווניות כאשר שני גדילים מתייחסים זה לזה באופן אנטי-פאראללי )anti- ,(parallelכלומר האחד הולך מ 3'-ל5'- והשני מ 5'-ל) 3'-את שניהם קוראים מ 5'-ל- ' .(!3חיבור של מונומר חדש נעשה לצד ה3'- של הגדיל. שימו לב :קודם כל מתבצע קשר המימן מול המונומר של הגדיל ההומולוגי )קשר מימן בין בסיסים חנקניים( ורק אז יש כניסה של המונומר לשרשרת ,על מנת למנוע כניסה של נוקליאוטידים לא מתאימים. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 136 DNA-Polymerase זהו אנזים שאחראי לתהליך הפילמור – יצירת הפולימר – של ה .DNA-השיכפול חייב להיות מדוייק מאוד – זהו אחד התהליכים הכי מדוייקים בטבע ,כי ה DNA-צריך לעבור מדור לדור בלי שגיאות. ארתור קורנברג הוא זוכה פרס נובל על גילוי ה DNA-פולימראז הראשון שהתגלה בחיידקי אשרישיה קולי. עד לפני 50שנה האנזים הזה לא היה מוכר; העבודה בביולוגיה מולקולרית אז נעשתה בעיקר בחיידקים אבל היום ידוע שהשכפול הוא מנגנון שמור ואוניברסלי ,ולכן מה שגילו בחיידקים לפני 50שנה נכון לכל היצורים החיים. סינטזת –DNAשיכפול קורנברג ביקש לבודד את האנזים שיודע לעשות שיכפול; הוא בודד אותו מחיידקים על ידי בידוד חלבונים לפי תכונות ומסה ,ואז הוא שם דוגמיות במבחנה עם נוקליאוטידים וקיווה לראות שאולי הוא יצליח למצוא את האנזים שייקשור ביניהם .בניסוי זה לא הייתה אף הצלחה. אז קורנברג חשב שאולי האנזים לא קושר סתם כך נוקליאוטידים; שהרי זה לא קיים בטבע .בטבע למעשה יש שכפול של DNAקיים ,כלומר צריכה להיות תבנית שמולה מסתדרים נוקליאוטידים .לכן הוא הוסיף למבחנה תבנית – DNAחד גדילי ,וקיווה שהאנזים יפלמר מול התבנית .גם זה לא הצליח. לאחר הכשלון הזה הוא הגיע למסקנה שהאנזים לא יכול סתם כך לפלמר מול תבנית; אולי הוא צריך נקודת התחלה כלשהי – שאותה קורנברג כינה פריימר – שחייבת להיות מחובר לחד-גדיל על מנת שהאנזים יתחיל להאריך אותה מול התבנית .הוא אכן עשה זאת, ולשם שינוי ,זה הצליח. קורנברג בודד את האנזים ,שכונה פולימראז ,ומצא את תכונותיו .האנזים הזה יודע אך ורק להאריך שרשרת קיימת למול תבנית .המבנה של פולימראז הוא כמו כף יד שמחזיקה מחד את הגדיל ויכולה לתפוס מונומרים נוקליאוטידים .לאחר שהיא תופסת את המונומר הנכון היד נסגרת ,המונומר מתפלמר, ואז היד נפתחת שוב ומחפשת אחר הנוקליאוטיד הבא. • • • DNA Polymeraseיודע להאריך שרשרת קיימת. הוא מאריך את השרשרת מול תבנית. הוא מאריך מכיוון ' 5ל 3'-בלבד – מוסיף נוקליאוטידים על קצה ' 3בלבד. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :12שיכפולDNA 137 פולימראז הוא חלבון כל כך "מפונק" כי הוא חייב להיות בעל יעילות מאוד גבוהה – הוא חייב להגיע למינימום של שגיאות .מכיוון שאי אפשר להגיע למחסור גמור בשגיאות ,צריך לוודא שהן יגיעו למינימום האפשרי. אנחנו רואים שהשכפול של הגנום, במיוחד לאחר ההגהה של הגנום ,מפיל בערך 6מוטציות בכל מחזור שיכפול בגנום האנושי; הסיכוי שזה ייפול בגן הוא נדיר ,כי רוב החומר הגנטי לא מקודד לגנים; והסיכוי שאם זה קרה בתוך הגן זה ייפול באקסון קלוש עוד יותר; וגם אם זה נפל באקסון ,הסיכוי שייפול דווקא באתר הפעיל של החלבון קטן אף יותר. מנגנון ההגהה של פולימראז נניח שלמרות הדייקנות של פולימראז, הוא עשה טעות והכניס נוקליאוטיד לא מתאים .כתוצאה מהשינוי נוצר שינוי במרחב .השינוי הזה גורם לפולימראז להפסיק לסנטז ,דבר ראשוןן; ודבר שני הוא מתחיל ללכת אחורה ,מ 3'-ל,5'- כאשר ההפיכה הזו אחורה גורמת לו להתחיל לפרק במקום לבנות. לאחר שהוא פירק כמה נוקליאוטידים, ההפרעה שמונעת ממנו להמשיך נעלמת והוא משנה את כיוונו שוב מ 5'-ל ,3'-ומתחיל לסנטז מחדש. מבנה הפולימראז כל עוד המבנה של הדו-גדיל תקין ,הוא פונה כל הזמן לאתר Pשל הפולימראז ,שהוא האתר המפלמר ) ;(polymerizationברגע שיש עיוות כלשהו ,הגדיל החדש פונה כעת לאתר ,(editing) Eמה שייגרום לתחילת תהליך הפירוק ).(exonucleolytic החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 138 נמאס לי לכתוב על אנמיה חרמשית! תבינו לבד שאם יש מוטציה נקודתית זה יכול להרוס את החלבון ולפגוע בתפקוד שלו לחלוטין. דוגמאות להמחשה: גנום הוא כמו ספר מתכונים; זהו ספר מתכונים בפורמט שמתאים לכל סוגי המסעדות ,ומכיל את כל המתכונים הקיימים .התא לעומת זאת ,הוא מתמחה בתפקוד מסויים ולכן צריך גנים מסויימים – כמו מסעדה איטלקית שצריכה רק מתכונים לפסטות .הגן הוא מתכון בספר המתכונים. הדוגמאות הבאות הן דוגמאות למוטציות שונות במתכון ,או בגן: מנגנון השכפול השכפול מתחיל מ ,ORF-קיצור של origin of ) replicationנקודת תחילת השכפול( .ישנם ORF רבים על גבי הכרומוזום ,כי השכפול מתחיל מנקודות רבות בו זמנית .ה ORF-מזוהה על ידי חלבונים המאפשרים תחילת השכפול. דבר ראשון שיש לעשות הוא לפתוח את הדו-גדיל, במיקום שנקרא .replication bubbleהפתיחה שיוצרת את הבועית נעשית על ידי האנזים הליקאז ) .(helicaseהבועות האלה מופיעות בזמנים לא- מסונכרנים על גבי הכרומוזום במקומות רבים. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :12שיכפולDNA 139 הבועות הולכות וצומחות בשני הכיוונים בבת אחת .בתמונות הבאות סימנו נוקליאוטידים בפלורסנט וכך יכלו לעקוב אחר כיוון פתיחה הבועית. החשיבות של הכיוון נובעת מהידיעה שפולימראז יכול לפתוח רק מ 5'-ל.3'- כאשר הבועות גדלו מאוד הן מתאחות ואז תם השכפול. מזלג רפליקציה אם מסתכלים על חצי-בועה ,אנחנו רואים שבחלק שעדיין סגור יש מזלג .המזלג הזה מכונה מזלג השכפול ),(replication fork והוא מקום התרחבות הבועית. בגדיל התחתון במזלג שבתמונה אין בעיה לסינטזה :הפולימראז הולך מ' 5ל ,3'-שזה הכיוון מהחלק הפתוח למזלג שהולך ונפתח .אולם בגדיל העליון כל פעם נפתח איזור חדש מקצה ' .5אז איך אפשר לשכפל את הקטע הזה? לשם הסבר הפעילות של מה שפולימראז עושה בגדיל ההעליון ,נסתכל על ה .ORF-אם נסתכל על בועית במרכזה ,אנחנו יכולים לטעון שהמרכז הוא נקודת הפתיחה של הבועית .אנחנו יכולים לחלק את זה למעשה לשני מזלגות ,כאשר בכל מזלג יש גדיל "ישר" וגדיל "הפוך" .בצורה זו נוצרות לנו שתי תבניות ישרות :למעלה משמאל ולמטה מימין .זהו הגדיל המוביל :יכול לסנטז מייד ולפתוח את המזלג. הגדיל המוביל הולך מ—' 5ל 3'-והוא זה שפותח את המזלג .הוא מוביל את הקצב וגם מוביל מבחינת הספק הפילמור. בשני החלקים האחרים של המזלגות יש השהייה עד שנפתח מספיק מהמזלג ונחשף; לאחר ההשהייה הזו יכול הפולימראז להיכנס ולהתחיל לסנטז )בכיווני החץ הוורוד .הגידל הזה ,מכיוון שהוא מתחיל באיחור ביחס לגדיל המקביל לו ,מכונה .lagging strand החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 140 הגדיל המעוכב מתחיל מאוחר יותר ומסנטז מקטעים-מקטעים. כעת הבועית נפתחת וגדלה; המוביל הגדיל ממשיך בכיוון שלו ,הוא זה שפתח את הבועית ממשיך ולכן איתה; הוא בגדיל המעוכב ממתין מעט עד שייפתח מעט יותר מהגדיל המעוכב ,ורק אז מתחיל בסינטזה. ניתן לראות שמעבר לכך שהגדיל המעוכב הוא מוביל מבחינת לוח הזמנים הוא גם רציף; הגדיל המעוכב מאחר בלוח הזמנים וגם נוצר במקטעים-מקטעים .המקטעים האלו מכונים Okazaki .Fragments מי זה הפריימר? מהו הפריימר ,ומי מסנטז אותו? שהרי אם הוא עשוי DNAהוא אמור להיות מיוצר על ידי DNAפולימראז ,אבל הרי פולימראז לא יכול לסנטז פריימר ללא פריימר .בצורה כזו הגיעו למסקנה שהפריימר עשוי דווקא מ.RNA- RNAמסונטז על ידי חלבון אחר ,המכונה .RNA Polymerase הפולימראז הזה הוא פולימראז "חאפר" :הוא עושה הרבה מאוד שגיאות 1 ,ל .10-אבל מכיוון שיש wobbleהרבה יותר חזק בנוקליאוטידים של ,RNAוגם מכיוון שיש הרבה מאוד מולקולות RNAלכל חלבון ,זה לא כל כך מפריע לתפקוד של מולקולות ,RNAשאינן עוברות בתורשה.34 הפולימראז הזה הוא פולימראז מיוחד המכונה Primaseשתפקידו לפלמר פריימר עשוי .RNAהוא הולך בצמוד למערכת השכפול .הפרימאז נכנס במקומות שהוא יכול להיכנס בהם ,בכל נקודה פנויה ,ומתחיל לייצר גדילון פריימר עשוי .RNAכעת DNAפולימראז יכול להתחיל סינטזה על גבי הפריימר הזה; במקטעי אוקאזאקי ,כאשר הוא מתקרב לפריימר של המקטע הבא ,כבר אין צורך בפריימר )כבר בנינו את המקטע שנשען על הפריימר הבא על השרשרת ,כי הוא היה למעשה מקטע אוקזאקי הקודם( ולכן הפריימר מתפרק במקביל לבנייה מחדש על ידי פולימראז .35בסופו של דבר ליגאז מגיע ומחבר בין כל שני גדילי DNAמופרדים. 34בוירוסים ,שבהם ה RNA-לעיתים משמש בחומר הגנטי ,יש מסיבה זו הרבה מוטציות – כך למשל וירוס האיידס משתנה כל הזמן ,סובל מהרבה מוטציות ויש לו הרבה מאוד ווריאנטים וקשה למצוא חיסון כנגדו. 35זאת מכיוון שאי אפשר להשאיר את הגדיל מעורבב עם .RNA חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :12שיכפולDNA 141 מה עם הקצה? DNAחד גדילי אינו יכול להתקיים; בקצה ,הגדיל שהולך מ 5'-ל 3'-מסונטז עד הסוף אבל הגדיל השני אינו יכול ליצור פריימר עבור הפריימר הקיצוני ביותר ,ולכן יש קטע באורך פריימר שלא ניתן ליצור מקביל לו .אורך של פריימר הוא בערך 10נוקליאוטידים .המקטע של ' 5ל ,3'-שכן סונטז ,מפורק בהיעדר המקטע המקביל לו. האיזור הזה מכונה טלומר; זהו איזור שאינו מכיל גנים והוא מיועד לפירוק עם כל שכפול .אולם ,עם ההזדקנות של התא ,ככל שהוא מתחלק יותר ויותר ,הפריימר מתקצר ובסופו של דבר הנגיסות מתחילות לאכול מהגנום וזה פוגע בתא עד שהוא מת. טלומראז בתאי גזע וסרטנים אולם יש תאים אחרים בגוף הבוגר שמתחלקים הרבה מאוד ,וצריכים להיות מסוגלים לעשות זאת ללא הזדקנות; למשל תאי גזע או תאים עובריים שמתחלקים הרבה מזיגוטה ועד האורגניזם השלם; תאים כאלו מכילים חלבון מיוחד שעוזר לה לפתור בעיה כזו .תאים סרטניים מאמצים את הפתרון של תאי הגזע ותאים עובריים על מנת שהוא לא ימות. הפתרון לבעיה היא אנזים בשם טלומראז :טלומראז הוא אנזים שמוסיף כל הזמן עוד מקטעים לטלומר .כל כמה זמן הוא מאריך מאוד את הטלומר ואז "נח" ,עד שהטלומר מתקצר לאורך מסויים שוב ואז הוא חוזר לעבוד. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 142 הפעילות של טלומראז טלומראז הוא חלבון מיוחד שמורכב מחלבון ו .RNA-הטלומר הוא מקטע DNAחוזרני ,למשל .TTGGGG הטלומראז מכיל למעשה RNAעם תבנית של ה DNA-החוזרני ,והוא למעשה משתמש בעצמו בתור פריימר לבנייה ומדביק לכרומוזום שוב ושוב את אותה התבנית שהוא נושא. שימו לב :הבעיה הזו קיימת רק בכרומוזום לינארי ,לא בכרומוזום מעגלי של חיידקים! הטלומראז למעשה עושה הארכה של ' 5ל 3'-ויוצר DNAעל תבנית של .RNAלאחר מכאן מגיע פרימאז ומתחיל ליצור מקטעי אוקאזאקי בגדיל הנגדי .למרות שסופו של דבר עדיין יש אותה בעיה שאורך של פריימר נופל ,עכשיו זה פחות בעיתי כי הפריימר הוארך אז אין סכנה שזה ייפגע בקטע הגנומי של הכרומוזום. אילוסטרציה :הדגמה של מנגנון השיכפול במזלג הרפליקציה ראו שיש חלבונים – – single strand DNA-binding proteinsאשר נקשרים ל DNA-חד גדילי ומונעים פירוק שלו ,כי אמרנו ש DNA-חד גדילי מתפרק. המזלג לא נמצא בטבע פתוח ומאושר; יש מבנה שלישוני שדואג לקשור ביחד את החלבונים הפעילים על מנת לייעל את התהליך )מודגם באיור הבא ובסרט( .אנחנו רואים שכל החלבונים הפיעילים –פרימאז, חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :12שיכפולDNA 143 הליקאז ופולימראז קשורים ביחד ועובדים יחד ,והחלבונים ששומרים על החד-גדיל מתקפלים ושומרים על החד גדיל של מקטע אוקאזאקי. אולם ,יש בעיה :בקצוות הבועה ,נוצר מתח עקב זה שהסלילים מסתלסלים סביב עצמם ונדחסים; עכשיו מגיע אנזים חדש – טופואיזומראז שעושה חיתוך של גידל אחד בלבד .הגדיל הזה משחרר את המתח, המתח המשתחרר הוא אנרגיה שנאצרת בטופואיזומראז ,ואז הוא משתמש באנרגיה הזו על מנת לקשור מחדש את הסליל. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 144 22.04.2010 שיעור :13חזרה עקב אנשים שביקשו ממני לכבות את המחשב בשיעור זה ,כי המאוורר שלו כנראה רם מכדי לשמוע את קולה של אורנה עם המיקרופון ,מתוך טענה שזה לא מתחשב מצידי לא לסגור אותו ,ההרצאה הזו לא מופיעה בסיכומים. 26.04.2010 שיעור :14שיעתוק האינפורמציה בתא מאוחסנת ב ;DNA-בתא אאוקריוטי ה DNA-נמצא בגרעין ובפרוקריוטי הוא נמצא בפורמט מעגלי בציטופלזמה )באיזור ייעודי( .מולקולת ה DNA-עוברת שיכפול ,כפי שכבר למדנו .ה- DNAהזה מתבטא במידה ויש בו רצפים שמקודדים לפונקציה .מה שמתבטא הם גנים וההתבטאות הולכת דרך שיעתוק ) (transcriptionשל סינטזת .RNAה RNA-הזה יכול להיות בשימוש בתור ) RNAדוגמת rRNSאו (tRNAויכול לעבור תרגום לחלבון )כפי שנלמד בשיעור הבא(. יעילות הביטוי אינפורמציה גנטית ניתן לאחסן ברצף אחד ולא יותר )שני עותקים ביצור דיפלואידי אבל לא יותר( וניתן ליצור הרבה מאוד מולקולות של RNAמאותו הגן אם רוצים ביטוי גבוה ומעט RNAאם רוצים ביטוי ברמת נמוכה .ניתן לגרום לאמפליפיקציה )הגברה( ברמת השיעתוק )שיעתוק של מעט/הרבה (RNAוגם ברמת התרגום )אותו mRNAמתורגם להרבה/מעט חלבונים(. סינטזת – RNAשיעתוק באיור הבא אנו רואים סכמה של .RNA Polymeraseהאיזור המודגש הוא אתר קטליטי שאליו נכנס הדו-גדיל של DNAוהפתיחה שלו מאפשרת שיעתוק של RNAמריבונוקליאוטידים .ריבונוקליאוטידים נכנסים דרך תעלה בחלבון ,הם מסתדרים מול התבנית והריבונוקליאוטידים מפולמרים על ידי הפולימראז בקשר פוספו-דיאסטרי. RNAפולימראז הוא פחות "מפונק" מ DNA-פולימראז ,ולכן הוא פשוט מפלמר את הנוקליאוטידים כפי שהם מסתדרים .כתוצאה מכך יש לו הרבה יותר טעויות :אחת מ .104-אבל הטעויות האלו אינן עוברות תורשתית לתאים הבאים ,כי mRNAהוא לא חומר תורשתי. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :14שיעתוק 145 התבנית של השיעתוק שיעתוק נעשה מכיוון ' 5ל 3'-של הגדיל הנבנה ,כלומר הגדיל המשועתק צריך להיקרא מכיוון ' 3ל.5'- בין שני גדילים ,כיצד אנו יכולים לדעת מהו הגדיל של התבנית? התשובה היא שאנחנו לא יכולים ,לפחות לא ללא נתונים נוספים. עקרונית שני הגדילים יכולים להוות תבנית; מעשית זה נקבע לפי נקודת ההתחלה של הגן ומיקומה על גדיל מסויים. קיימים רצפים ב DNA-שמסמנים התחלה של גנים .רצף זה מכונה פרומוטור .הרצף הזה הוא דו-גדילי כי הוא מסמן גם את הכיוון של השיעתוק ,כי RNAפולימראז מתיישב על הרצף באוריינטציה שתכתיב את כיוון השיעתוק. פרומוטור הוא רצף רגולטרי שמכתיב איפה הגן וגם כמה חזק ייקשרו פולימראז ופקטורי השיעתוק שלו לאותו הפרומוטור. האפיניות של פולימראז ופקטורי השיעתוק לפרומוטור תכתיב את הרגולציה של השיעתוק – ככל שהאפיניות גבוהה יותר יהיה שיעתוק של יותר גדילי RNAשל הגן .כמו כן יש רצף שמסמן את סוף הגן – שהוא הטרמינטור )בהמשך(. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב 146 ביולוגיה של התא -הרצאות1 אם אנחנו יודעים על איזה גדיל נמצא הפרומוטור ולאיזה כיוון הוא שולח את הפולימראז ,אנחנו יכולים לדעת מהי התבנית ומהו ה RNA-שיסונטז. שימו לב שיש ב RNA-יורידין במקום טימידין וכן שמדובר בריבונוקליאוטידים ולא דיאוקסיריבו- נוקליאוטידים. גדילי SenseוAnti-sense- מכיוון שהרצף של RNAזהה לרצף הקומפלימנטרי של התבנית למעט החלפה של Tו ,U-אנחנו יכולים להשתמש בגדיל הקומפלימנטרי של התבנית כדי להבין איך יראו הרצפים על ה RNA-ולהבין אילו חומצות אמינו מתורגמות ממנו .שני הגדילים עבור כל גן מחולקים לשני תפקידים sense :הוא התבנית ו- anti senseהוא הקומפלימטרי לתבנית. אם אנחנו יודעים מיהו הפרומוטור ומהי האוריינטציה ,אנחנו יודעים מהי התבנית )גדיל ה(sense- ואנו יודעים מהו הרצף של גדיל ה anti-sense-שהוא זהה לגדיל ה RNA-למעט החלפת Tב,U- דבר המאפשר לנו לנתח את חומצות האמינו המתורגמות מהגדיל. מבנה שניוני של RNA אמרנו ש RNA-הוא חד גדיל; אולם הוא לא מופיע כחד גדיל פרוש בתא .בראש ובראשונה הוא עטוף חלבון; שנית הוא יוצר קשרי מימן בין הריבונוקליאוטידים היוצרים מבנים שניוניים ואפילו שלישוניים .קשרי המימן שבין ריבונוקליאוטידים יכולים להיות בין A ו C ,U-ו G-ו G-ו.U- הפרומוטור באיור אנחנו רואים את המספור של רצפים על הגן .הנוקליאוטיד שממוספר ב (+1)-הוא הנוקליאוטיד הראשון ב) RNA-שימו לב :לאו דווקא הראשון שיתורגם( .מה שנמצא בכיוון upstream 36 )כלומר מכיוון ' 5לנוקליאוטיד (+1מסומן במספר שלילי וזה למעשה הפרומוטור של הגן .באופן כזה מגדירים 36זרם של מה? הזרם של הסינטזה :סינטזה נעשית מ 5'-ל 3'-ולכן Upstreamלנקודה מסויימת זה לכיוון ' 5ו- Downstreamלאותה נקודה הוא בכיוון '.3 חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :14שיעתוק 147 את האתרים ) (-10ו ,(-35)-שהם אתרים חשובים בפרומוטורים של פרוקריוטים )לא חשובים ללימוד שלנו( .המיספור הזה של המספרים השליליים נמשך עד שנגמר הרצף הרגולטורי ויכול להכיל בין עשרות ועד אלפים של נוקליאוטידים – תלוי בחוזק של הפרומוטור. הערות: • הפרומוטור הוא לא מקום תחילת השיעתוק אלא הרצף הרגולטורי שקובע את קצב ורמת השיעתוק של הגן. • הפרומוטור עצמו נמצא תמיד לכיוון ' 5מאתר התחלת השיעתוק ) .(+1שימו לב שהדבר בהתייחסות לגדיל של ה!sense- • הפרומוטור הוא איזור רגולציה של גן ,הוא איזור לא סימטרי שמחייב קשירה של פקטורי שיעתוק ו RNA-פולימראז ,המתיישבים בצורה מאוד מסויימת שמכתיבה את כיוון השיעתוק – הוא קובע איזה גדיל ישמש תבנית. • אתר תחילת השיעתוק נמצא downstreamלפרומוטור. הטרמינטור לאחר שה RNA-משועתק ,מגיע רצף הטרמינציה .בעוד שהפרומוטור אינו משועתק ל ,RNA-הטרמינטור כן משועתק על מנת שיצליח לאותת את סיום השיעתוק .אתר הסיום של שהיעתוק נמצא downstream לטרמינטור ולכן הוא מופיע בגדיל .RNA • הטרמינטור הוא רצף ב DNA-וב.RNA- • הפרומוטור מופיע ב DNA-בלבד. הטרמינטור מורכב משני רצפים קומפלימנטרים )אבל על אותו הגדיל( בעלי אוריינטציה הפוכה במרחק קצר אחד מהשני .כאשר הפולימראז מסנטז את שני המקטעים אלה ,הם יוצרים מבנה שניוני של RNA בצורה .stem & loopמבנה שניוני זה מפריע להמשך הסינטזה על ידי פולימראז וגורם לו ליפול מתבנית ה.DNA- כיוון השיעתוק נקבע על ידי הפרומוטור מכיוון שיש פרומוטורים בשני הגדילים ,יכול להיות מצב שבו senseשל גן מסויים הוא anti- senseשל גן אחר ,או לפחות החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 148 חלק ממנו .הדבר תלוי בפרומוטורים :אם יש על גדיל ה anti-sense-פרומוטור עם כיווניות הפוכה לפרומוטור של הגן הראשון ,יווצר פה שיעתוק בכיוון הנגדי שיהפוך את גדיל ה anti-sense-של הגן הראשון לגדיל senseשל הגן השני. שימו לב :מצב חפיפה בין גנים על שני גדילים הוא נדיר אבל קיים. שיעתוק – הבדלים בין אאוקריוטיים לפרוקריוטיים בתאים אאוקריוטיים יש גרעין בו נמצא החומר הגנטי; הגנים ב DNA-מורכבים מאינטרונים ואקסונים, שהם איזורים לא-מקודדים ומקודדים )בהתאמה( .השיעתוק הראשוני של גדיל ה RNA-נעשה לכל הגן – על אקסוניו ואינטרוניו .זהו ה) primary RNA transcript-באיור :אינטרונים בצהוב ואקסונים בכחול(. את ה RNA-הראשוני יש לעבד בתהליך המכונה שיחבור ) :(splicingבתהליך זה נחתכים האינטרונים מגדיל ה RNA-ונשארים רק האקסונים. במקביל לתהליך השיחבור מתרחשים שני תהליכים נוספים :קאפינג ) (5' cappingוהכנסת רצף פוליA- ).(3' polyadenylation לאחר שהגדיל עבר את שלושת תהליכי העיבוד האלו, הוא mRNAמוכן ויכול לצאת מהגרעין לציטופלזמה. לאחר היציאה מתרחש תהליך התרגום על ידי ריבוזומים. שימו לב RNA :שלא מיועד לצאת לציטופלזמה לרוב יעבור ספלייסינג אך לא קאפינג ולא פוליאדנילציה. בתאים פרוקריוטיים יש לזכור ,בראש ובראשונה, שה DNA-הוא מעגלי והוא נמצא בנוקליאוזום ,איזור ייעודי בציטופלזמה אך ללא מידור ממברנלי כמו בגרעין .הגנים שלו חסרי אינטרונים ,כך שאין שום צורך בעיבוד לאחר השיעתוק ,ולכן כבר במהלך שיעתוק הRNA- מתיישבים עליו הריבוזומים ומתרגמים אותו. ההבדלים ב mRNA-בין אאוקריוטים לפרוקריוטיים אם נסתכל על mRNAסופי של אאוקריוט ,אנחנו רואים שבקצה ' 5שלו יש מתיל-גואנוזין )גואנין שיש לו קבוצה מתילית( וטרי-פוספט שקשורים לקצה ' .5הקשר הזה הוא מיוחד ,כי זה קשר של ' 5ל 5'-ולא ' 5ל 3'-כפי שהיה עד כה. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :14שיעתוק 149 בקצה ' 3יש רצף ארוך של כמה מאות נוקליאוטידי אדנין ) .(Aהרצף הזה אינו חלק מה ,DNA-הפולי A-מתווסף ל RNA-לאחר השיעתוק .התוספת משפיעה גם על יעילות התרגום של הגדיל וגם על היציבות שלו. כמו כן בתוך ה mRNA-יש איזור מקדד )לאחר הספלייסינג( ומשני צידי האיזור המקודד יש איזור לא מקודד .האיזור המקודד נפתח ב AUG-ונסגר בקודון .STOPה RNA-מתחיל upstreamלאיזור המקודד. ב mRNA -הפרוקריוטי אין תהליכי עיבוד ולכן קצה ' 5מכיל שלושה פוספטים ,שלא הורדו ממנו בחיבור פוספו-דיאסטרי, וקצה '3 ריק מתוספות. ה RNA-יוצא מוכן לתרגום כאשר יש עליו ,לרוב ,מספר איזורים מקודדים ,המקודדים לכמה גנים שונים: RNAשל פרוקריוט יכול לקודד לגן אחד אבל יכול לקודד גם עשרה גנים על אותו הרצף ועם אותו פרומוטור )אופרון( .הגנים לרוב מקודדים לאנזימים ופקטורים מאותו מסלול ביוכימי ,וזהו למעשה .37Poly-cistronic mRNA הקבוצה הכימית 5' capping מתילגואנוזין )קבוצה מתיל מחוברת לחנקן של גואנוזין( יוצרת קשר בין פחמן 5של סוכר הנוקליאוטיד מתיל-גואנוזין לבין פחמן 5של תחילת ה .mRNA-הקישור הזה מחייב את מתילגואנוזין להתחבר הפוך לגדיל ,וזה מייצב את המולקולה: המתילגואנוזין מונע למעשה מאנזימי RNAseשמפרקים RNAחסרי קאפ מלתקוף את הגדיל ,וכן נקשר לקאפ חלבון נוסף שעוזר בייצוב. הקשר הזה מכונה אם כן 5'-to-5' triphosphate bridge )גשר טרי-פוספט(. 37באופן דומה ה mRNA-של אאוקריוטיים מכונה ,Mono-cistronic mRNAכי הוא מכיל רק גן אחד תמיד. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 150 יצירה של זנב פולי-אדנילין בסוף הגן לא מופיע רצף הפולי A-מבחינת הקידוד ב DNA-אבל כן מופיע רצף הטרמינטור ,המתקפל למבנה שניוני של .stem & loopכאשר פולימראז רץ על ה ,DNA-פקטורי שיעתוק שקשורים לזנב של הפולימראז )לא ניכנס לשמות( מזהים את המבנה השניוני של הטרמינטור ששועתק ובעקבות הזיהוי פקטורי השיעתוק חותכים את ה RNA-באיזור של רצף מאוד ספציפי ) (AAUAAAולאחר החיתוך אחד מחלבוני פקטורי השיעתוק מתחיל להוסיף פולי) A-פולי A-פולימראז( .עקב החיתוך ה RNA-פולימראז יורד מהתבנית. גנים הם רצפי DNA בעלי משמעות פונקציונאלית שמשועתקים ל .RNA-ישנם מספר סוגים שונים של :RNA • – mRNAגדיל RNAשמטרתו לצאת לציטופלזמה ולהיות מתורגם לחלבון. • – rRNAגדיל שתפקידו להיות חלק מהריבוזום ,מכונת התרגום. • – tRNAגדיל שתפקידו בשיעתוק ,לזהות בין קודונים לחומצות אמינו. ישנם עוד גדילים עם תפקידים שונים ,וכולם הם תוצר של שיעתוק על פני גן :לכולם היו פרומוטור, טרמינטור ,שיעתוק ופונקציה .גדילים אלו הם RNAקטנטנים ,ועל מיקרו RNA-אנחנו צריכים לקרא בקריאת החובה. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :14שיעתוק 151 לא כל הגדילים האלה מסונטזים על ידי אותו פולימראז; ישנם שלושה סוגים של RNAפולימראז ,כאשר הסוגים השונים משעתקים גדילים שונים. פולימראז 1מזהה ומשעתק גדילים של rRNAוזה מבוצע בגרעינון; פולימראז 2מכיר גנים רבים המתורגמים לחלבונים ,אולם לאחרונה התגלה כי הוא מקודד לא רק ל mRNA-אלא גם ל RNAקטנים ושונים .פולימראז 3משעתק גנים ל ,tRNA-חלק מה rRNA-וחלק מהגדילים הקצרים. פקטורי שיעתוק RNAפולימראז לא מתיישב לבד על הפרומוטור; הוא צריך עזרה .בפרוקריוטים העזרה הזו היא מינימלית :הפרומוטור מזוהה על ידי תת-יחידה מסויימת )סיגמה-פקטור( המסוגלת גם לבצע את הפתיחה, ובמקרים של פרומוטורים חלשים יש גם אקטיבטורים שעוזרים לסיגמה-פקטור להיקשר לפרומוטור. לעומת זאת ,בתאים אאוקריוטיים יש המוני פקטורי שיעתוק .הרצפים של הפרומוטור הם מורכבים ושונים מגן לגן ,כל רצף קושר פקטורי שיעתוק אחרים ,השיעתוק תלוי בחלבונים הנוכחים בסביבה ,ולכן יש דרישות של המון סוגי פקטורי שיעתוק ,דבר הנותן בקרה נוספת ,עדינה מאוד ,שהיא לא רק לרמת האם הגן משועתק או לא אלא נוגעת גם לרמה ולקצב. חלק מהפקטורים נקשרים לפרומוטור וחלק נקשרים לפולימראז ומשנים אפיניות שלו לפרומוטור .ישנו חלבון נוסף )הכחול( שנקשר לאיזור רחוק מאוד ב ;DNA-האילוסטרציה הזו באה להראות שישנם רצפים רגולטוריים ב DNA-שיכולים להשפיע על השיעתוק של גנים מרוחקים מאוד ,על ידי קישור של פקטורי שיעתוק שגורמים לקיפול של הכרומוזום )למרותש שהמודל הזה חדש יחסית ועדיין נחקר(. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 152 פקטורי שיעתוק פרוקריוטיים בפרוקריוטיים יש יעילות גדולה של השיעתוק; פקטור השיעתוק סיגמה נקשר ל RNA-פולימראז הפרוקריוטי ,שקיים מסוג אחד בלבד בתא הפרוקריוטי; הפקטור שיעתוק נקשר יחד עם פולימראז אל הפרומוטור .ללא סיגמה הפולימראז לא יגיע לפרומוטור .סיגמה פותח את שני הגדילים ,ולאחר שנפתחה בועה מספיק גדולה יכולה להתחיל סינטזה; לאחר שהסינטזה עוברת כ 12-נוקליאוטידים הסיגמה יורד ופולימראז יכול לרוץ על התבנית עד הטרמינטור .לאחר שיעתוק הטרמינטור ויצירת ה stem & loop-הפולימראז יורד. פקטורי שיעתוק אאוקריוטיים בתאים אאוקריוטיים ,ה DNA-ארוז על ידי נוקליאוזומים והיסטונים .כאן לא די לפתוח את ה DNA-צריך גם להסיט את הנוקליאוזומים .ההסטה אורכת שברירי שניות עד שהשיעתוק ייגמר באותו איזור. איזור מסויים בשם TATA boxקושר אליו פקטורי שיעתוק; לאחר שכל פקטורי השיעתוק נמצאים באיזור ,וגם פקטורים אקטיבטורים מאקטבים את הפולימראז ,יכול הפולימראז להיקשר לפקטורי השיעתוק שעל הפרומוטור ולהתחיל בסינטזה. אלמנטים רגולטוריים שהם רצפים המרוחקים מאוד לרוב מהגן שאותו הם מבקרים יכולים חלבון לקשור אקטיבציה מסויים .החלבון הזה נדרש לקומפלקס של פקטורי השיעתוק והפולימראז שעל ה ,DNA-במרחק רב מהם .על ידי קיפול ה DNA-יכולה להיות אקטיבציה ,כמודגם באיור. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :14שיעתוק 153 שימו לב :הפקטורים שציינו שעושים חיתוך של ה RNA-לאחר הטרמינטור ,אינם פקטורי שיעתוק כי אם חלבונים הקשורים למערכת העיבוד של ה ,RNA-זאת משום שהם לא משפיעים על היכולת של הפולימראז לסנטז יותר או פחות מה.RNA- גנים של פרוקריוטים ואאוקריוטים גנים של פרוקריוטים מורכבים מאיזור מקודד ,ללא תחכום רב; באאוקריוטים הגן מורכב מהרבה מאוד אקסונים ויותר מכך אינטרונים – שהם איזורים לא מקודדים .ה RNA-משעתק במדויק את כל הגן ,כך שמתקבלת בתחילת מולקולה ראשונית ארוכה מאוד הנמצאת בגרעין .אז היא תתחיל לעבור תהליך שיחבור, של בו האינטרונים יוצאים והאקסונים נותרים. ההוצאה של אינטרונים אינה סימולטנית ואפילו אינה בעלת סדר קבוע. אם נסתכל בגרעין על רצף RNAשמקודד לגן ספציפי ,ונתהה אודות האורך של ה RNA-המקודד מאותו הגן ,נקבל אורכים שונים :בין האורך המקסימלי של כל האקסונים +כל האינטרונים לבין האורך הסופי המינימלי של אקסונים בלבד ישנם כל האורכים האפשרייים בזמני הוצאת אינטרונים שונים. לפיכך בגרעין יכולים להימצא אורכים שונים של אותו הגן. שיחבור Splicing - תהליך זה הוא מורכב מאוד ואנו לא ניכנס לפרטיו; בתהליך זה מוציאים את האינטרונים מה .RNA-באיור אנחנו רואים אקסונים בתכלת ואינטרונים בצהוב .בגרעין ישנם חלבוני שיחבור רבים שיודעים להיקשר לאינטרונים .כמו כן חלבונים אחרים יודעים לסמן את הצמתים בין אינטרונים ואקסונים ,מקומות בהם יש לחתוך הצהוב )החלבונים והכתום U1 ,ו.(U2- התהליך נעשה על ידי ,spliceosomeמכונה מיוחדת שעורכת הספליסוזום את בנוי ה.RNA- מRNA- וחלבונים. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב 154 ביולוגיה של התא -הרצאות1 שיחבור חלופי בתאים אאוקריוטים יש הרבה פחות גנים לעומת כמות החלבונים שיש בהם; בעוד שיש כ 90,000-חלבונים שונים בגוף האדם ,מספר הגנים הוא כ- 26,000בלבד )לאחר פיענוח הגנום האנושי( .ההסבר לתופעה זו הוא שקיים שיחבור חלופי ) alternative :(splicingיצירה של מולקולות mRNAשונות שיוצאות לתרגום בציטופלזמה ומקורן מגן אחד ,זאת על ידי חיבור בסדרים חלופיים בין אקסונים ואינטרונים שיוצרים את גדיל ה .mRNA-בצורה זו ניתן ליצור חלבונים שונים מאותו הגן. הגן אלפא-טרפומיוזין )משמאל( הוא אחד הגנים הראשונים שגילו לגביהם שיחבור חילופי .כאשר ניסו לעשות שיבוט של הגן ראו שברקמות שונות החלבונים שונים ,כאשר כל ריקמה פיתחה חלבון המתאים יותר לתפקוד שלה. סיכום בסופו של תהליך ,בתאים אאוקריוטיים ,ה mRNA-צריך לצאת אל הציטופלזמה .לאחר תום השיחבור, ה mRNA-הינו בעל הקאפ באיזור ' 5וזנב פולי A-באיזור ' .3חלבונים מתוך הגרעין נקשרים ל:RNA- הראשון שנקשר הוא חלבון שכבר ציינו 5' cap binding protein ,וכן נקשר poly-A-binding proteinועוד רצפטור טרנספורט גרעיני ,חלבון "סבל" שסוחב את הגדיל אל הממברנה של הגרעין. בממברנה קיים קומפלקס חריר הממברנה ) ;(nuclear pore complexהחריר צריך להתרחב על מנת שהגדיל ייצא ,ולכן הקומפלקס יכול לזהות את החלבונים שיושבים על mRNAגמור ותוך כדי השקעת אנרגיה מוציאים את ה .mRNA-עם היציאה ,החלבונים שעטפו את ה RNA-בגרעין מוחלפים על ידי חלבונים מהציטופלזמה כי אם RNAיהיה עירום בציטופלזמה הוא ייתפרק מיד. חלבון הטרנספורט משתחרר וחוזר לגרעין; חלבון קשירת ה 5'-קאפ מוחלף בחלבון ציטופלזמטי שמונע פירוק וגם משמש במערכת התרגום – הוא מזוהה על ידי הריבוזומים על מנת שיתחילו בתרגום הגדיל .גם החלבון שנקשר לפולי A-מוחלף במקביל שלו מהציטופלזמה שאחראי על ייצוב ושמירה על הגדיל. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 ,
© Copyright 2024