1. No category

Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Univerzitetni študijski program Kemija
Izbirni sklop analizna in anorganska kemija
Avtomatizirana analiza
Seminar 2012
Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar
Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza
(30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in
inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu
napake ali druge nepravilnosti.
Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.
1
Univerza v Ljubljani
Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
AVTOMATIZIRANA ANALIZA
Seminar
NANO-OPTIČNOTEKOČINSKA DETEKCIJA VIRUSOV IN NANODELCEV
Avtor:
Špela Smrkolj
4.letnik kemija
Mentor: prof. dr. Boris Pihlar
Ljubljana, julij 2012
2
UVOD
Nanotehnologija se pojavlja na vseh področjih industrije, od kemijske in tekstilne industrije,
računalništva, informatike, energetike, do transporta in avtomobilske industrije, še posebej na
področju farmacevtske in obrambne dejavnosti. Omogoča izdelavo naprav ali materialov, ki so lažji,
hitrejši, močnejši, ki imajo popolnoma nove ali dodatne specifične značilnosti. Nanoznanost
pojasnjuje nove pojave in značilnosti (fizikalne, kemijske in biološke)
na nanometrskem razsežnostnem nivoju.
Nanomaterial je snov, ki vsebuje nanostrukture razsežnosti med 1 nm in 100 nm, ali bolj točno
velikost vsaj ene izmed razsežnosti nanostrukture mora biti manjša od 100 nm. To je razsežnostna
meja (100 nm), pri katerih se značilnosti nanomateriala bistveno razlikujejo od značilnosti masivnega
materiala. Zaradi svojih izredno majhnih razsežnosti imajo namreč nanomateriali drugačne značilnosti
od običajnih materialov. Nanostrukture so lahko plastovitih oblik, v obliki nanocevk in nanovlaken ter
kot trirazsežni nanodelci [1].
3
ZGRADBA OPTIČNEGA VLAKNA
Sredica optičnega vlakna ima tipični premer od nekaj mikrometrov do nekaj 100 mikrometrov in je
skoraj izključno narejena iz kvarčnega stekla z lomnim količnikom okoli 1,5. Kvarčno steklo dobro
prevaja svetlobo na širokem območju valovnih dolžin. Ker večino izgub prispevajo nečistoče, je zelo
pomembna čistost kvarčnega stekla, ki mora biti v sredici čim višja. Absorbcija v kvarčnem steklu je
še posebej nizka okoli valovnih dolžine 1,5 mikrometra, kjer znašajo izgube okoli 0.2 dB/km. Kvarčno
steklo ima tudi dobro mehansko odpornost na nateg in zvijanje, ob tem pa je tudi kemijsko inertno in
ni higroskopno.
Plašč ima tipično debelino med 125 in 600 mikrometri. Narejen je ravno tako iz kvračnega stekla, ki
mu je dodana majhna količina nečistoč, ki spremeni lomni količnik, tako da je le-ta manjši od lomnega
količnika jedra. Kot dodatek se pogosto uporabljata bor in fluor. Meja med obema plastema je lahko
ostra, lahko pa se lomni količnik postopoma spreminja. Optičnemu vlaknu je dodan še ovoj (debelina
250-1400 mikrometrov), ki ščiti sredico in plašč pred poškodbami[2].
Slika 1: Ilustracija zgradbe optičnega kanala. V sredini se nahaja sredica,okoli nje plašč in ovoj.
DELOVANJE OPTIČNEGA VLAKNA
Prenos svetlobe po optičnem vlaknu temelji na totalnem odboju na meji med sredico in plaščem, ki
ima nižji lomni količnik kot sredica. Do totalnega odboja pride, kadar svetloba vpada na mejo pod
kotom, ki je večji od mejnega kota , določenega z zvezo
. Pri tem je
lomni
količnik sredice,
pa lomni količnik plašča. Zaradi tega pogoja se bo po vlaknu širila le svetloba, ki
vanj vstopi pod primernim kotom. Ta kot mora biti večji od kota totalnega odboja.
4
Količini
, ki določa največji kot divergence svetlobnega snopa, ki je še ujet v
vlaknu, pravimo numerična aparatura NA. Razlika lomnih količnikov je navadno majhna, le nekaj
stotink, numerična apertura pa ima vrednost okoli desetinke[2].
Slika 2: Totalni odboj v optičnem vlaknu in numerična aparatura NA.
LASTNA STANJA IN RODOVI V VLAKNU:
Optično vlakno kot valovni vodnik podpira le določene načine razširjanja svetlobe. Lastne
rešitve valovne enačbe popišemo z dvema številoma: azimutalnim številom l, ki pove stopnjo kotne
simetrije, in radialnim številom m, ki pove število lokalnih maksimumov na radialni osi. Za vsako
kombinacijo (l,m) sta možni dve polarizaciji.Taka lastna stanja imenujemo rodovi. Število rodov, ki se
lahko širijo po vlaknu, je odvisno od valovne dolžine, premera sredice in numerične aperture NA.
To odvisnost zapišemo s številom V
kjer je
valovna dolžina v vakuumu. Vedno je prisotna vsaj ena rešitev –
. Vlakna, po katerih
potuje le en rod, imenujemo enorodovna. Če je V večji od prve ničle Besslove funkcije
(približno
2,405), se po vlaknu lahko razširja več rodov. Taka vlakna imenujemo večrodovna[2].
5
Slika 3: Oblika prvih nekaj rodov pri razširjanju po optičnem vlaknu.
EKSPERIMENT
Za eksperiment so vzeli 100 nm polistirena kot testni delec. Najprej se delec nahaja na mestu
r=(x,y,z)=(0,0,0) stacionarnega vzbujevalnega žarka in nato je periodično skeniran v prečni smeri.
Zaradi prisotnosti ozadja Eb heterodinski signal izkazuje časovno-odvisno bazno linijo. Da
karakteriziramo vpliv faze na moč signala Sx ponovimo eksperiment pri različnih odmikih vzdolž
optične osi,(kjer je z=konstantna) kar bi predstavljalo tipično območje usmeritve delcev. Za vsako z
vrednost ocenimo maksimalno vrednost Sx(x). Rezultati so podani na grafu 1.
Graf 1
Graf predstavlja različice signalov v standardni homodinski detekciji. Različne usmeritve delcev
vplivajo na homodinski signal močneje,kar omejuje točnost merjenja in otežuje točno določitev
velikosti delca in polarizabilnost. Signal A=(Sx2 +Sy2)1/2 se spreminja po tipičnem območju usmeritve
delca. Eliminacija fazne razlike privede do večje točnosti meritev. Nastavitve meritev delcev bo dalo
karakteristično velikost porazdelitve,katere širina bo predstavljala dejansko velikost porazdelitve delca
kot tudi merilno negotovost. Širino ocenimo kot standardni odmik z enačbo:
σ= (σ2sistem + σ2usmeritev + σ2velikost)1/2
σsistema .........sistemski odziv,kar je porazdelitev pridobljena za delec,ki prečka fokus večkrat z isto
usmeritvijo
6
σusmeritev.....predstavlja signal,ki nastane zaradi različnih usmeritev istega delca
V članku so tudi ocenjevali občutljivost detekcije in razmerje signal-šum z imobiliziranim
nanodelcem,kateri je bil večkrat skeniran skozi laserski fokus. Ta nastavitev izločuje probleme
povezane z heterogenostjo delcev in različnimi usmeritvami delcev.
Polistiren nanodelce so odložili na čisto stekleno krovno steklo s spinsko oblogo,to je raztopina,ki
vsebuje delce. Po evaporaciji tekočine so delci čvrsto pritrjeni na površino krovnega steklca z Van der
Walsovimi silami. Delce nato pokrijejo z kapljico vode,da posnemajo detekcijo v topilu. Vzorec so
nato postavili na piezoelektrični oder in fokusirali na steklo-voda vmesnik. Za eliminacijo svetlobe v
ozadju zaradi notranjega odboja steklo-voda uporabijo zaslonke na poti žarka. Vsaka detekcija,ki se
odziva na delec,ki gre skozi laserski objektiv,nastaneta signala iz katerih izračunamo modul
A(t)=(Sx2 + Sy2)1/2 .
Graf 2
Na grafu 2 ima signal strukturo dvojnega vrha. Ta informacija nam koristi za ločevanje dogodkov iz
sistema šum. Iz vsake detekcije ocenimo maksimum vrha amplitude A(t) in vrednost dodamo v
histogram. Z zadostnim številom meritev dobimo signal karakteristične porazdelitve. Slika 3a kaže
velikost histograma pridobljena kot imobiliziran 75 nm polistirenski delec. Velikostna porazdelitev
pomeni sistemsko odzivno funkcijo in širino porazdelitve. Homodinska detekcija donosi velikostno
porazdelitev,ki je občutno širša,kar se vidi z izrisom velikosti histograma pridobljenega iz signala
Sx(t) oziroma Sy(t). To povečanje širine je posledica tega,da na homodinski signal vpliva fazna
različica zaradi interferometričnih nestabilnosti in majhnimi odmiki v usmeritvi delcev.
USMERITVE DELCEV
Karakterizacija usmeritve delcev zahteva,da se velikost delcev ne spreminja med merjenjem. Da
odpravimo dvoumnost izvajamo elektroosmotsko reciklirano shemo,ki omogoča večkratno opazovanje
enega delca.
OPREMA
Nanofluidni kanali,ki so izdelani iz taljenih silicijevih rezin uporabne za UV litografijo. Nanokanali
so dolgi 15µm in imajo 500 nm×500 nm prereza in povezani na dva zbiralnika. Tok delcev je na
osnovi uporabljenega elektroosmotskega efekta.
Signal enega delca,ki prečka laserski objektiv se uporabi za obrnitev elektroosmotske napetosti,takoj
po prehodu,ki povzroča,da nanodelec obrne smer gibanja in zopet prečka laserski objektiv. Prehod
delca skozi laserski objektiv mora biti krajši kot časovna skala povezana z Brownianovim gibanjem,ki
je τ < ∆x2/(2D)
D....razširitveni koeficient
V
7
vodi je D≈10-11 m2/s in s tem je τ < 5ms. V tem izvršenem eksperimentu je τ ≈ 1 ms,ki nam dovoli
detektirati en nanodelec več kot 104-krat preden izgine zaradi Brownovega gibanja. Karakteristično
sledenje v odvisnosti od časa za nanodelec,ki je v elektroosmotskih pogojih predstavljen na grafu 3.
Graf 3
Graf 4
Vse krivulje so bile posnete istočasno in ustrezajo posnetku,ki ustreza časovnemu intervalu 30s. Rdeča
krivulja prikazuje periodično preklapljanje elektroosmotskega potenciala,modra krivulja prikazuje
homodinski signal Sx(t),črna krivulja pa heterodinski signal A(t). Fazne različice zaradi različnih
usmeritev delcev so vsebovane v Sx(t) toda eliminirane v A(t). To nam pokaže variacije med
posameznimi zaznavnimi dogodki,ki so precej večji v homodinskem signalu kot v heterodinskem
signalu. Nato so ocenili maksimalno vrednost A(t) za vsak delec,ki prečka in osnovali porazdelitvene
vrednosti. Rezultat je prikazan na histogramu 4.b. Ko detektiramo isti delec večkrat,dobimo faktorje,ki
prispevajo signalni variaciji,sistemskemu šumu in varijacijam usmeritve delcev. Slednja daje rast
razširjanju porazdelitve v primerjavi z imobiliziranem delcu,kar se vidi na grafu 4. Homodinska
detekcija donosi precej širšo porazdelitev zaradi faznih variacij in tudi zaradi različnih usmeritev
delcev.
Eksperiment so izvajali za polistirenske delce različnih velikosti in za nanodelce zlata. V vseh
primerih je eliminacija faze izboljšala točnost detekcije. Preostale spremembe v heterodinski detekciji
so bile zaradi velikosti laserskega objektiva,ki je manjši kot prečna velikost nanokanala. Usmeritev
delcev vpliva na amplitudo signala v heterodinskem primeru,ki je precej šibkejša kot fazna variacija.
Če uporabimo večji objektiv potem bi bila porazdelitev ožja. Boljša preciznost v tem primeru bi bila
na račun nižje občutljivosti ker je razmerje signal-šum za detekcijo zmanjšan.
Porazdelitev delcev je še širša,če uporabimo različne nanodelce. Osredotočili se bomo na velikost
porazdelitev delcev v topilu. Da zaznamo različne delce v topilu smo uporabili povratno zanko,ki
nadzoruje elektroosmotsko past. Pod temi pogoji konstantni elektroosmotski potencial poganja
nanodelce skozi nanokanal. Graf 4.c kaže zabeleženo velikostno porazdelitev za 5000 različnih 75 nm
8
polistirenskih sfer. Porazdelitev je nekoliko asimetrična s standardno deviacijo σskupno= 8.1nm iz katere
določimo negotovost velikosti delca.
σsistem=0.7nm....prispevek sistemskega odziva na širino
σusmeritve=(4.22 – 0.72)1/2 nm = 4.1 nm ......širina povezana z varijacijami usmeritve delcev
σnegotovost= 6.9 nm
V primerjavi z homodinsko detekcijo ima slednja veliko večje signalne variacije in preprečuje točno
določitev velikosti delca. Večina metod opredeljevanja velikosti delcev uporabi površinsko
imobilizacijo,katera je splošno manj učinkovita za majhne delca v primerjavi z večjimi. Variacija v
vezavni moči vpliva na merjeno porazdelitveno velikost delcev in s tem na specifično standardno
deviacijo. Naša shema detekcije se ne zanaša na imobilizacijo,ki naredi merjeno porazdelitev bolj
zanesljivo. Asimetrija merjene porazdelitve na sliki 4.c je rezultat procesa proizvodnega filtriranja,ki
je učinkovit za odstranjevanje večjih delcev toda manj učinkovito za manjše delce. Točnost ene
meritve se pokaže z širino veliosti porazdelitve za monodispergiran vzorec. Čeprav ni mogoče
pridobiti resnično monodispergiranega vzorca izvajamo večkratne meritve nihanja enega delca v
tekočini. Širino te porazdelitve definira interval zaupanja za meritev velikosti. Interval zaupanja se
lahko spremeni odvisno od materialne sestave delca. Slednja predstavlja pomembno omejitev naše
metode ,saj z uporabo različnih delcev z različno materialno sestavo zahteva ponovno, pravilno
umerjenje sistema.
KARAKTERIZACIJA MEŠANICE NANODELCEV
V tem eksperimentu so pokazali,da je možno ločevati med nanodelci različnih velikosti in sestave v
istem topilu.
Graf 5.a
Graf 5.b
Za eksperiment so uporabili mešanico polistirenskih in zlatih delcev,različnih velikosti. Graf 5.a
prikazuje velikost razporeditve delcev v mešanici polistirenskih delcev z radiji 50nm in 75nm.
Koncentracija 50 nm delcev je dvakrat večja od koncentracije 75 nm delcev. Z uporabo heterodinske
detekcije jasno razrešimo dva delca različnih velikosti. Detekcija,ki kaže večje signale so opredeljeni
kot 75 nm delci,medtem ko so nižje amplitude opredeljene kot signali za 50 nm delce. Enak
eksperiment so ponovili z nanodelci zlata. Graf 5.b kaže velikostno porazdelitev zabeleženo za
mešanico zlatih nanodelcev z glavnimi radiji 30,40 in 50 nm. Heterodinska shema detekcije razreši
delce,čeprav se posamezne razporeditve zelo prekrivajo. Pri homodinski shemi detekcije je skupna
razporeditev delcev preširoka,da bi prepoznali posamezne vrhove delcev.
9
DETEKCIJA IN KLASIFIKACIJA VIRUSOV
Velikost povprečnih človeških virusov je v območju od 20-200 nm,kar je primerno za zmogljivost
sheme heterodinske detekcije. Uspešno so zaznali HIV,gripo,Sindbis in vakcinijo v ločenih vzorcih.
Za detekcijo virusov so uporabili aparaturo,kateri tok poganja pritisk namesto že uporabljenega
elektroosmotskega toka. Hitrostni profil in hitrost toka sta podobna pri obeh metodah,toda
elektroosmotski tok teži k gretju pufrske raztopine virusa,kar lahko povzroči tvorbo parnih mehurčkov
in razkroj vzorca,to privede do zamašitve kanalov in motenj procesa merjenja. Pressure-driven flow ne
segreje raztopine pufra. Graf 6.a kaže velikost razporeditve zabeležena za vzorec HIV virusa.
Graf 6
EKSPERIMENT Z VIRUSOM HIV
Virus se prekine v TNE pufru(0,01 M Tris,pH 7.2, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA) in ga naredi pozitivno
nabitega. Da se izognemu leplenju na negativno nabito površino stekla nanokanala razredčimo virus z
2% raztopino polivinilpirolidona v TNE pufru,kar tvori protein-odbijajočo plast v nanotekočinskem
kanalu. Za kalibracijo velikosti HIV porazdelitve so vzeli polmer 50nm.
Na grafu 6.b je prikazana velikost porazdelitve za vzorec Sindbis virusa. Virus prekinejo v pufrski
raztopini,ki vsebuje MEM (pH 7.2) in 5% seruma (FBS). Za kalibracijo so vzeli radije velikosti 35
nm.
Da so dokazali sposobnost,da lahko zaznajo in razlikujejo med HIV in Sindbis virusom so posneli
velikostno porazdelitev mešanice obeh virusov skupaj. Graf 6.c kaže,da sta lahko prepoznamo dva
različna tipa virusa. V skladu z kalibracijo je glavna velikost Sindbis virusa 35 nm in kaže,da so
optične lastnosti teh dveh virusov podobne. Rezultati kažejo,da je možno razlikovati posamezne viruse
v mešanici različnih vrst virusov,pod pogojem,da vemo glavno velikost vsaj ene vrste virusa.
10
ZAKLJUČEK
Rezultati raziskav v članku so nas seznanili,da lahko izboljšamo točnost karakterizacije delcev in
indentifikacije z eliminacijo fazne občutljivosti v interferometrični detekciji delcev. Heterodinska
shema detekcije omogoča karakterizacijo in razvrščanje nanodelcev na podlagi njihovih
polarizabilnosti α. Dokazali so,da sistem lahko zazna en sam virus v vzorcu in razlikuje med
različnimi vrstami virusov v mešanici virusov. Sposobnost zaznavanja virusov z eno občutljivostjo
delca je uporabna za točno merjenje koncentracije virusov. Predvidevajo,da bodo takšne zmožnosti
našle uporabo tako v biodetekciji,kontaminaciji,pri preverjanju kvalitete,v farmaciji in biomedicinskih
raziskavah. Valovne dolžine v heterodinski detekciji lahko pridobijo neodvisne »fingerprints« za
velikost in sestavo ciljnega delca. Občutljivost in točnost sheme detekcije lahko izboljšamo z
zmanjšanjem naprave,ki eliminira nestabilnost laserskega kazalnika[3].
11
VIRI
[1] http://sl.wikipedia.org/wiki/Nanotehnologija
[2] http://sl.wikipedia.org/wiki/Opti%C4%8Dno_vlakno
[3] Nano-optofluidic Detection of Single Viruses and Nanoparticles: Anirban Mitra,†Bradley
Deutsch,‡Filipp Ignatovich,‡Carrie Dykes,§and Lukas Novotny†,‡,*†Department of Physics and
Astronomy,‡Institute of Optics, and§Department of Medicine, University of Rochester, Rochester,
New York 14627