‫קביעת חלבון כמותית‬ ‫חשיבות‪:‬‬ ‫‪ ‬כמות חלבון‪/‬אנזים‬ ‫פעילות‬ ‫‪ ‬מעקב אחר תהליך בידוד וניקוי של חלבון‬ ‫‪ ‬איפיון חלבון מסויים‬ ‫התכונות הנדרשות משיטת הכימות‪:‬‬ ‫‪ ‬סלקטיביות )‪ - (selectivity‬חלבון ‪ X‬חומצת גרעין‪/‬סוכר‬ ‫‪ ‬רגישות )‪mg, mg – (sensitivity‬‬ ‫שיטות הכימות העיקריות מבוססות על תכונות הבליעה‪:‬‬ ‫‪photometric‬‬ ‫*‬ ‫‪colorimetric‬‬ ‫העיקרון של כל שיטות המדידה הפוטומטריות‬ ‫חוק ‪ :Beer‬הבליעה‬ ‫‪a‬‬ ‫לריכוז‬ THE ELECTROMAGNETIC SPECTRUM Radio Wavelength (meter) Energy > 1x10-1 Low Microwave 1x10-1 - 1x10-3 Infrared 1x10-3 - 7x10-7 Optical 7x10-7 - 4x10-7 Ultraviolet - UV 4x10-7 - 1x10-8 X- ray 1x10-8 - 1x10-11 Gamma-ray < 1x10-11 High ‫שיטות כימות‪:‬‬ ‫‪ .1‬ע"פי בליעה בתחום ה‪:uv -‬‬ ‫לדוגמה‪ :‬בליעת חלבון ב ‪280 nm = l‬‬ ‫הבליעה נובעת משיירי ‪ tyrosine‬ו‪tryptophan -‬‬ ‫יתרון‪ :‬שיטה פשוטה ומהירה – אין צורך בריאגנטים‪/‬טיפול‬ ‫החלבון נשמר במצבו המקורי לשימושים נוספים‬ ‫חסרון‪ :‬בליעת חומצות גרעין ב ‪280 nm = l‬‬ ‫פי ‪ 10‬יותר‬ ‫שיטות כימות‪:‬‬ ‫‪ .2‬ע"פי תגובת צבע )‪:(colorimetric assays‬‬ ‫‪BIURET‬‬ ‫‪LOWRY‬‬ ‫מדידה בתחום‬ ‫הנראה )‪(optical‬‬ ‫‪BRADFORD‬‬ ‫העיקרון המשותף‪:‬‬ ‫תמיסה הנמדדת ‪ +‬ריאגנט‬ ‫צבע ‪a‬‬ ‫כמות‪/‬ריכוז החלבון‬ ‫יתרון‪ :‬אין בליעת חומצות גרעין ב ‪ l‬בתחום הנראה‬ ‫חסרון‪ :‬החלבון אינו מתאים לשימושים נוספים‬ ‫שיטת ‪BIURET‬‬ ‫עיקרון‪:‬‬ ‫יצירת קומפלקס בין‬ ‫יוני נחושת דו‪-‬ערכיים )‪(Cu2+‬‬ ‫ואטומי חנקן בקשרים פפטידיים בח"א‬ ‫‪tyrosine‬‬ ‫‪tryptophan‬‬ ‫‪cysteine‬‬ ‫יתרון‪ :‬מינימום הפרעות ע"י ריאגנטים הנמצאים בתמיסה‬ ‫חסרונות‪ :‬רגישות לא גבוהה )‪(mg‬‬ ‫נפח הריאקציה = ‪5 ml‬‬ ‫הפרעה ע"י מלחי אמוניום‬ ‫שיטת ‪LOWRY‬‬ ‫הנפוצה ביותר‬ ‫עיקרון‪ :‬תגובה של יוני נחושת דו‪-‬ערכיים בסביבה אלקלית (‪)biuret‬‬ ‫‪tyrosine‬‬ ‫יוני נחושת חד‪-‬ערכיים ‪ +‬שיירים על ח"א‬ ‫‪tryptophan‬‬ ‫‪cysteine‬‬ ‫אמפליפיקציה של הצבע ע"י תגובה עם ‪folin‬‬ ‫‪l = 500 -750 nm‬‬ ‫שיטת ‪LOWRY‬‬ ‫יתרונות‪ - UV :‬רגישות פי ‪20- 10‬‬ ‫‪ - Biuret‬הגברת הרגישות ע"י תגובה עם ‪:folin‬‬ ‫‪ ‬טווח‪10 – 100 mg :‬‬ ‫‪ ‬נפח הריאקציה = ‪1ml‬‬ ‫חסרונות‪ :‬תהליך דו‪-‬שלבי‬ ‫משך‪ 60 – 40 ~ :‬דקות (‪ – UV‬מיידי‪ 30 ~ BIURET ,‬דקות)‬ ‫רגישות ל ‪)10 – 10.5( pH‬‬ ‫חלק מהמרכיבים לא יציבים‬ ‫הפרעה ע"י דטרגנטים‪ ,Tris ,‬סוכרים‪ ,‬כו'‬ ‫הטווח הליניארי צר יחסית‬ ‫שיטת ‪BRADFORD‬‬ ‫עיקרון‪ :‬מולקולת צבע ‪ l coomassie blue G250‬מכס' = ‪465 nm‬‬ ‫קשירה לחלבון‬ ‫‪ l‬מכס' = ‪595 nm‬‬ ‫קשירה לאיזורים הידרופוביים של החלבון‬ ‫בעיקר ח"א ‪arginine & lysine‬‬ ‫שינוי בצבע‪ :‬חום‬ ‫כחול‬ ‫‪l = 595 nm‬‬ ‫שיטת ‪BRADFORD‬‬ ‫יתרונות‪ :‬מהירה‬ ‫‪ 5‬דקות‬ ‫נפח הריאקציה = ‪1- 5.5 ml‬‬ ‫רגישות יותר גבוהה‬ ‫פי ‪ 4‬מ‪:Lowry -‬‬ ‫מיקרו = ‪1 – 20 mg‬‬ ‫מקרו = ‪20 – 200 mg‬‬ ‫מיעוט של הפרעות – בעיקר דטרגנטים‬ ‫חסרונות‪ :‬לא מתאים לחלבונים עם מיעוט ח"א ‪arginine‬‬ ‫ליניאריות פחות עקבית‬ ‫רקע גבוה (תמיסת ‪ Bradford‬חומה)‬ ‫טווח הרגישות‬ ‫שיטה‬ 20 mg – 3 mg UV 1 – 10 mg Biuret 10 – 100 mg Lowry 1 – 200 mg Bradford ‫מה באמת‬ ‫מודדות שיטות‬ ‫הכימות‪...‬‬ ‫‪BRADFORD‬‬ ‫‪UV‬‬ ‫‪tryptophan‬‬ ‫‪tyrosine‬‬ ‫‪arginine‬‬ ‫‪lysine‬‬ ‫‪BIURET‬‬ ‫אטומי חנקן‬ ‫‪LOWRY‬‬ ‫‪tryptophan‬‬ ‫‪tyrosine‬‬ ‫‪cysteine‬‬ ‫תכולה חריגה של השיירים הנמדדים תגרום‬ ‫להטעיה בקביעת ריכוז חלבון‬ ‫מכשור‬ ‫‪spectrophotometer‬‬ ‫‪Photometer‬‬ ‫מודד את‬ ‫עוצמת האור‬ ‫שעוברת‬ ‫דרך התמיסה‬ ‫‪+‬‬ ‫‪Spectroscope‬‬ ‫מייצר אור‬ ‫מונוכרומטי‪:‬‬ ‫‪ l‬נתון‬ ‫עוצמת הבליעה של‬ ‫החומר הנבדק‬ ‫‪ - microplate (ELISA) reader‬אותו העיקרון‬ ‫מיכשור למדידות קולורימטריות‬ ‫‪ .1‬ספקטרופוטומטר – מדידה ידנית יחידנית במבחנה ‪ /‬קיווטה‬ ‫)‪(cuvette‬‬ ‫רוחב הקיווטה‬ ‫= ‪1 cm‬‬ ‫‪ - microplate reader .2‬מדידה מרוכזת ב"‪ "plate‬רב‪-‬בארית‬ ‫השפעה לנפח הדגימה‬ ‫שיטות קולורימטריות ‪ -‬עקומת כיול‬ ‫‪Standard curve‬‬ ‫בד"כ‪ BSA :‬ייצוג אקראי של ח"א‬ ‫כמויות ידועות של החלבון‬ ‫‪+‬‬ ‫כמות קבועה של ריאגנט הצבע הנבחר‬ ‫?‬ ‫מהו הפתרון כאשר ריכוז החלבון>‬ ‫מהרגישות של שיטת הכימות?‬ ‫מיהול‬ ‫מיהול‬ ‫מיהול‬ ‫מיהול‬ ‫מהו ה ”‪? “blank‬‬ ‫ריאגנט הצבע ‪ +‬תמיסה‬ ‫ריכוז החלבון‬ ‫הנמדד = ‪0‬‬ ‫= מינימום הבליעה‬ ‫מוגדר כ‪ 0 -‬בליעה‬ ‫מה חסרון השימוש במים כ ”‪?“blank‬‬ ‫מתבצע בטמפ' החדר‬ xenon-flash lamps produce light over a broad spectrum, allowing measurements from 200 nm to 1000 nm. Electromagnetic Spectrum - electromagnetic radiation can be described in terms of a stream of photons, each traveling in a wave-like pattern, moving at the speed of light and carrying some amount of energy. It was pointed out that the only difference between radio waves, visible light, and gamma-rays is the energy of the photons. “Electromagnetic” is another term for “light". Light waves are fluctuations of electric and magnetic fields in space. Photon – the smallest quantum (unit) of energy of light: it is defined to have zero mass & no electric charge For example: hemoglobin appears red because the hemoglobin absorbs blue and green light rays much more effectively than red. The degree of absorbance of blue or green light is proportional to the concentration of hemoglobin . (Beer’s Law)