1. No category

14/01/2014
EPO og annen bloddoping
- fysiologisk effekt og analytiske
utfordringer
Forum for klinisk fysiologi, NIH 9.januar 2014
Yvette Dehnes
Norges laboratorium for dopinganalyse
Norges laboratorium for dopinganalyse – Norges
WADA-akkrediterte laboratorium
1
14/01/2014
Disposisjon:
•
•
•
•
EPO og rekombinante analoger
Påvisning av bloddoping
Blodprofiler
Påvisning av mikrodoser EPO
Norges laboratorium for dopinganalyse
Rekombinant EPO (rEPO):
 Stor farmasøytisk industri (anemi; nyresykdom, kreft)
 Nye generasjoner EPO – forbedret behandling
 Misbrukes pga stor prestasjonsfremmende effekt
 Bivirkninger: blodpropp, hjerneslag, lungeemboli
Generasjon EPO-analog
Injeksjons hyppighet På markedet
1
Epoetin alfa, -beta,
(Eprex, NeoRecormon),
Biosimilar EPO (Retacrit)
3x /uke
1987
2
Darbepoetin alfa
(NESP)
1x /uke
3
CERA
(Continues erythropoietin receptor
activator)
2008
2001
2008
1x /måned
Norges laboratorium for dopinganalyse
2
14/01/2014
EPO og rEPO:
 165 aminosyrer,
molekylvekt: 30-34 kDa
Glykoprotein – sukker utgjør
40% av totalmasse, viktig for:
 affinitet til EPO-reseptor,
 øke stabilitet i blod,
 begrense hepatisk clearance
 Sukkergruppene brukes til å
påvise doping med rEPO.
Figur fra ‘Chemical and Engineering News’
Norges laboratorium for dopinganalyse
CERA – pegylert rEPO (epoetin beta)
 Struktur
 Halveringstid
Lavere affinitet for
EPO-reseptoren
Fra websiden til Roche, Norway
Lengre halveringstid
Norges laboratorium for dopinganalyse
3
14/01/2014
EPO-Fc fusion protein
•
EPO (dimer eller monomer)
fusjonert til Fc-delen på IgG
•
Kan tas opp i blodet via Fcreseptor ved inhalering
•
Mye lengre halveringstid
Norges laboratorium for dopinganalyse
EPO gendoping I
EPO genterapi:

Adenoassossierte virus (AAV), kunstige humane kromosomer,
transplantasjon av celler manipulert ex vivo

EPIDURE Biopumps - microdermis transfektert med EPO-genet

Kontinuerlig produksjon av EPO (3-36 mnd; fase I og II-studier )
(EPODURE Biopums, Medgenics Inc.)
Norges laboratorium for dopinganalyse
4
14/01/2014
EPO gendoping II
Oppregulering av EPO genet:
 HIF-stabilisatorer (prolyl hydroksylase hemmer)
(Fibrogen: FG-2216, FG-4592), HIF= Hypoxy Inducible Factor
 Hemmere av transkripsjonsfaktorene GATA-2 og NF-ΚB
Norges laboratorium for dopinganalyse
Påvisning av bloddoping
Analytiske utfordringer ved påvisning av doping med
rEPO og analoger:
1. EPO er et endogent molekyl
Norges laboratorium for dopinganalyse
5
14/01/2014
Hvordan skille rEPO fra endogent EPO?
Det humane EPO-genet uttrykt i
human nyre
hamsterceller
Ulike enzymer:
ulike sukkergrupper,
ulik ladning
6
IEF
HuEPO
(pI 3.8-4.7)
IEF
rEPO
(pI 4.4-5.1)
pH
2
Isoelektrisk fokusering (IEF)
Norges laboratorium for dopinganalyse
Elektroforetisk deteksjon av EPO
Isoelektrisk fokusering – IEF
SDS-PAGE
CERA
(MirceraTM)
NESP
(AranespTM)
Epoetin delta
(DynepoTM)
NorgesNorges
laboratorium
laboratorium
for dopinganalyse
for dopinganalyse
6
14/01/2014
Påvisning av CERA
 CERA kunne påvises
i serum hos 7 av 8
personer
IEF-profiler etter én injeksjon CERA:
CERA: (rEPO+PEG)
PEG
rEPO
 CERA kunne påvises
i urin hos 6 av 8
personer
 Påvist i både
morgenurin og urin
samlet etter trening
Sukker
 Deteksjonsvinduet
var minst 2x lengre i
serum enn i urin
Dehnes and Hemmersbach (2011), Drug Testing and Analysis. 3:291
NorgesNorges
laboratorium
laboratorium
for dopinganalyse
for dopinganalyse
Påvisning - annen bloddoping I
 Blodtransfusjon:
 Autolog transfusjon – bruker eget blod

Per i dag ingen påvisningsmetode
 Homolog transfusjon – bruker fremmedblod

Analysemetode: flow-cytometri
Norges laboratorium for dopinganalyse
7
14/01/2014
Påvisning - annen bloddoping II
 Syntetisk erytropoesestimulerende peptid – Peginesatide:

SDS-PAGE, ELISA
 Syntetiske oksygenbærere (HBOC; Hemopure, PolyHeme):

Kolorimetrisk direkte visuell metode, HPLC
 EPO gendoping:



Deteksjon av transgent EPO
Deteksjon av transgent DNA (kan påvises i mnd – år)
Deteksjon av ektopisk EPO mRNA ekspresjon
Norges laboratorium for dopinganalyse
Analytiske utfordringer ved påvisning av doping med
rEPO og analoger:
2. Påvisningstid ≠ virkningstid
 Deteksjonsvindu:
–
rEPO: 1-3 dager
–
NESP: 3-5 dager
–
CERA: 1-2 uker
 Virkningstid: 1-2 mnd!
Norges laboratorium for dopinganalyse
8
14/01/2014
Tolkning av blodprøver – indirekte effekt av
bloddoping
EPO og andre ESAs
Navn
Fork.
Antall
parametre
Hemoglobin
Hgb
1
Hematokrit
Hct
1
Retikulocytter
Ret%
1
OFF-score*
Abnormal
Blood Profile
Score
Startfase
Vedlikeholds
fase
Blodtransfusjon
Tapping
Infusjon
2
ABPS
2-12
* OFF-score= Hgb (g/L) – 60*√(Ret%)
Norges laboratorium for dopinganalyse
Individuelle blodprofiler
– matematisk sannsynlighetsmodell basert på bayesiansk statistisk teori.
Norges laboratorium for dopinganalyse
9
14/01/2014
Ricco – italiensk syklist
Norges laboratorium for dopinganalyse
Analytiske utfordringer ved påvisning av doping:
3. Mikrodoser
Norges laboratorium for dopinganalyse
10
14/01/2014
Påvisning av mikrodoser EPO
Studieprotokoll:
 9 friske, frivillige personer fikk intravenøse mikrodoser EPO (7.5 U/kg bw)
2x/uke i 3 uker.
 Urin og blod ble samlet på ulike tidspunkt etter injeksjonene
 Prøvene ble analysert med EPO WGA MAIIA, SAR-PAGE og IEF
Prosjektet var godkjent av REK
Norges laboratorium for dopinganalyse
EPO WGA MAIIA: Nytt screening assay for EPO?
 Kombinert WGA affinitetskromotografi og lateral flow immunoassay
 EPO isoformer
separeres i en sone
med WGA i en tynn
mikrokolonne
(dipstick)
 Bindingsaffinitet til
WGA:
rEPO >> endogent
EPO
PMI = % migrerte isoformer
Lectin = WGA (Wheat Germ Agglutinin)
| Norwegian Doping Control Laboratory
11
14/01/2014
Påvisning av mikrodoser EPO
Dehnes et al. Drug Test Anal. 2013 Nov 4. doi: 10.1002/dta.1579
Norges laboratorium for dopinganalyse
Elektroforetisk påvisning av mikrodoser med
MAIIA-assay
SAR-PAGE av urin samlet ca 10 timer etter 1. iv mikrodose (7.5 U/kg):
BRP= referansepreparat for rEPO (1:1 epoetin alfa og epoetin beta)
Norges laboratorium for dopinganalyse
12
14/01/2014
Elektroforetisk påvisning av mikrodoser (7.5 U/kg bw) EPO:
Urinprøver:
Plasmaprøver:
Dehnes et al. Drug Test Anal. 2013 Nov 4. doi: 10.1002/dta.1579
NorgesNorges
laboratorium
laboratorium
for dopinganalyse
for dopinganalyse
Takk til
•
Alexandra Shalina, mastergradsstudent Farmasi, UiO/Norges
laboratorium for dopinganalyse, OUS
•
Prosjektdeltakere fra Norges idrettshøyskole (NIH)
•
Linda Myrvold, Mette Borgen, Mette Istad og andre kollegaer ved
Norges laboratorium for dopinganalyse, OUS
•
Jostein Hallén, Seksjon for fysisk prestasjonsevne, NIH
•
Sykepleiere og leger ved Endokrinologisk poliklinikk, OUS Aker
Prosjektet ble støttet av Kulturdepartementet
Takk for oppmerksomheten!
NorgesNorges
laboratorium
laboratorium
for dopinganalyse
for dopinganalyse
13