1. No category

Produksjon av steril yngel og ”all
female” fisk – status og perspektiver
Geir Lasse Taranger, Trine Haugen, Håkon Otterå, Anders Thorsen, Ingegjerd Opstad
Ørjan Karlsen,Per Gunnar Fjelldal, Craig Morton, Birgitta Norberg, Anders MangorJensen, Geir Dahle, Anna Wargelius, Rolf Edvardsen og Tom Hansen
Sats marin møte, Bergen 09.02.2012
Modnings- og kjønnsrelaterte
utfordringer – torsk og kveite
• Genetisk påvirkning etter gyting i merd
eller rømning
• Mulig smittespredning med egg?
• Velferdsproblem i torsk (gytespreng)
• Veksttap hver gyting (ca 30% i torsk);
dårlig fôrfaktor og økonomi
• Bedre vekst i hokveite (hanner modner
tidlig)
Mulige løsninger
• Lysstyring; utsetter modning hos både torsk og
kveite, men gir ikke fullgode resultat i merd; kan
kombineres med avl
• ”All female” – forhindrer befruktede egg i merdene
og ofte bedre vekst ho hofisk; metode etablert på HI
Austevoll for torsk og kveite
• Triploid steril fisk – produsert med trykksjokk på egg
– helst i kombinasjon med ”all female”
• Alternativ sterilitet – kjønnscellefri fisk; forsøk på HI
og NOFIMA pågår
Maskulinisering med androgener i kjønnsdifferensieringsperioden
Utvikling av gonader og differensieringen til ovarie eller en testis
kjønnscellevandring
Foto: A. Thorsen
embryo
Foto: A. Thorsen
Gonadeanlegg
plommesekklarve
kjønnsceller
Kjønnsdifferensiering
- Deling kjønnsceller
Befruktet egg
yngel
fig; T Haugen
Nye sterilitesmodell torsk?
Kjønnscellene migrerer feil i torsk behandlet med morfolino
mot Nos1 (gen som er viktig for tidlige kjønnceller)
Ø Drivenes, A Wargelius, R Edvardsen, in prep;
kjønnsceller visualisert med GFP
Trenger finansiering for videre arbeid
”All-female” torsk
• Teknologien er nå klar!
• Unngår utslipp av befruktede egg
• Vanlig å kombinere triploid (steril fisk) med ”all-female”;
triploide hanner utvikler store gonader og modningsrelaterte
problemer, mens hunnene vanligvis forblir helt umodne
(Taranger et al 2010)
• HI har gjennomført et NFR prosjekt med Universitetene i
Utrecht, Bergen og Nordland på torsk;
– Kartlagt når kjønnsdifferensiering skjer (ca 12-25 mm kroppslengde)
og molekylære mekanismer (Haugen et al. in revision)
– Produsert hermafroditter; melke fra disse ga 100% hofiskavkom
(Haugen et al. 2011)
Kjønnsdifferensiering hos torsk,
histologiske studier tyder på morfologisk forskjell før 20mm
12mm lang yngel (480dg)
Kjønnscelle
14mm lang yngel
Foto: T.H.M. Wijgerde
20mm lang yngel
T Haugen et al.
Foto: T.H.M. Wijgerde
All female produksjon – trinn 1: lage hermaforditter eller ”neohanner”
Maskuliniserer under kjønnsdifferensieringen
12mm-25mm yngel
Aromatase hemmer
P450 aromatase
testosteron
Østrogen
Methyltestosteron (MT)
Dihydromethyltestosteron (DHMT)
Fadrozol
T Haugen et al.
Forsøk 2007
og 2008
n=500
Høy (15mg/kg) og lav (5mg/kg) dose MT
50L
Høy (15mg/kg) og lav (5mg/kg) dose DHMT
Høy (250mg/kg) og lav (10mg/kg) dose fadrozol
Høy og lav dose MT
(2007)
Høy og lav dose
DHMT eller fadrozol
(2008)
12mm
Kroppstørrelse
16mm
20mm
25mm
T Haugen et al. 2011
All-female produksjon; melke fra hermafroditter
11-KT: 0,40 ng/ml
E2: 0,52 ng/ml
11-KT: 0,33 ng/ml
E2: 0,26 ng/ml
2,1 cm
T. Haugen et al.
2,1 cm
11-KT: 1,13 ng/ml
E2: 0,46 ng/ml
2,1 cm
All-female produksjon – trinn 2
Befruktet egg fra
normale hunner
med sperm fra
kjønnsreverserte hunner
(hermafroditter) ga
100% hunner!
Melke opereres ut fra
hermafroditter
Behandlers med
spermfortynner før
befruktning
T Haugen et al.
Kjønnsreversering i kveite
Ph.D.-prosjekt Joanna Babiak, U i Nordland
Veiledere Birgitta Norberg, Ian Mayer
Deltakere Torstein Harboe, Trine Haugen, Sara Olausson,
Inger Semb Johansen
Bakgrunn kveite
•
•
•
•
•
Kveitehanner blir kjønnsmodne flere år før
hunnene, og ved en vesentlig mindre
størrelse
Hunnene når vanligvis slaktevekt før
modning
Kjønnsdifferensiering beskrevet (T Benfey
og medarbeidere)
Kjønnsreversering ved behandling med
metyltestosterone (MT) ved ca 30-36mm
størrelse (rett etter tørrfôrtilvenning)
Teste aromataseinhibitor i stedet for
steroider
Kjønnsavhengig vekst hos kveite
– Hanner modne ved 2-3 år/ ca 2kg
– Hoer modne ca 6 år/ ca 8kg
♀
20000
18000
16000
14000
Weight
12000
10000
8000
♂
6000
4000
2000
0
01.94 07.94 01.95 07.95 01.96 07.96 01.97 07.97 01.98 07.98 01.99 07.99 01.00 07.00 01.01
date
B Nordberg et al.; Svart strek indikerer han-modning og rød ho-modning
Pilotforsøk (Austevoll 2006)
• Fire forsøksgrupper fikk tilsats av
hormon eller fadrozole i fôret
som følger:
•
•
•
•
Etanol (negativ kontroll)
MT (positiv kontroll)
100 mg fadrozole/kg
700 mg fadrozole/kg
• Forsøksfôr ble gitt i seks uker
J. Babiak et al.
Resultat 2006
– Histologisk kjønnsbestemmelse
– Analyse av moden fisk
– Befruktningsforsøk
J. Babiak et al.
Hunn
Hann
250
days vs length (mm) C
days vs length (mm) Fad
200
Length (mm)
• Visuell kjønnsbestemmelse
indikerer 99-100% hanner i alle
de behandlede gruppene
• Normal kjønnsfordeling i negativ
kontroll
• Lavere vekst i gruppene under
fôring med høy dose fadrozol
• Gjenstående arbeid:
150
Fad
100
50
0
0
50
100
150
Days
200
250
Triploid (3N) torsk
Et dyr er vanligvis
diploid. Det har ett
sett kromosomer fra
mor og ett sett fra far
Et triploid dyr har to
sett kromosomer fra
mor og ett sett fra far
Pilotprosjekt intensiv prod 3N torsk Austevoll
• Trykksjokk ga 100% 3N
(Canadisk protokoll); god
befruktning og klekking
• Lavere vekst og mer
deformiteter ved intensiv
startfôring; hva med
”Gullstandard?”
• 3N hannfisken modnet ved 2 års
alder
• Mesteparten av 3N hofisken
umodne
• Fisken er i praksis steril
Opstad et al in rev
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
triploid
diploid
snitt
Vekt (g) dag 87 (pr kar)
Nakkeknekk og lordose i 3N torsk
Andel fisk med nakkeknekk eller lordose i diploid og triploid
torsk på uttaket i november 2008 målt på røntgenbilder.
Gruppe
Nakkeknekk (%)
Lordose (%)
Diploid
40
2
Triploid
56
42
Opstad et al. In revision
Foto: PG Fjelldal HI
•
•
•
•
Storskala produksjon 3N torsk i Parisvannet, 2010 og
2011
Produsert ca 150 000 torskeyngel i poll 2010 og 2011 basert på trykksjokkmetoden
(manuell stryking)
Startfôring basert på naturlig dyreplankton i pollen
God vekst, og ingen synlige deformiteter på yngel – men ikke 100% 3N!
Overført 122 000 fisk til Gulen Marin Farm AS i 7. juli 2010 (2-3g) for oppfølging i
Innovasjon Norge prosjekt, og > 100 000 fisk i 2011
H Otterå, A Thorsen, J Pedersen, GL Taranger
Vekst mix diploid og triploid torsk fra HI Parisvannet
2010å og 2011å ved Gulen Marin Farm
Måling 20 sep 2011
N
Snittvekt (Gram)
SD
Min
Max
2010 utsett
100
726
237
322
1327
2011 utsett
101
75
24
32
155
Foto:Terje van der Meeren, HI
Gulen; 2010 og 2011 årsklasse fra
Parisvannet
20.sep 2010
100
0
50
500
Vekt
Vekt
1000
150
1500
200
20.sep 2010
30
35
40
45
50
12
14
16
18
20
22
24
Lengde
Lengde
2010 utsettet: Raude punkt er fisk som
vart karakterisert som synleg deformerte.
Linja tilsvarar kondisjonsfaktor=1.
2011 utsettet. Ingen deformerte
observert – men det ser ut som vi
har veldig få 3N fisk!
H Otterå, A Thorsen et al
Resultat Gulen 3N yngel 2010 årsklasse
Blodcellediameter plotta mot vekt av fisken i september 2011. Fisk som har
blodceller mindre enn 12 µm vert rekna som diploide, mendan resten vert
rekna som triploide, dvs 82% 3N og 18% 2N.
H. Otterå, A. Thorsen m.fl.
Ulike trykk
torsk Austevoll
– blodcellediameter og
Master oppgave:
Susanne
Håvardsstuen
mikrosatelittanalyse (Håvardstuen, Haugen, Mangor-Jensen, Dahle et al)
a)
13
13
kontroll
Diameter (microm)
11
11
10
10
Mean
Mean±SE
Mean±1,96*SE
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
011
Mean
Mean±SE
Mean±1,96*SE
9
001
004
007
010
013
016
019
022
025
028
031
034
037
040
043
046
049
052
055
058
061
064
067
070
073
077
080
083
086
089
092
095
9
012
Individual
Individual
c)
13
13
12
d)
Diameter (microm)
12
11
10
500 bar
080
077
073
064
061
058
055
052
049
046
043
040
037
034
031
028
025
022
019
016
013
010
007
004
001
Individual
070
Mean
Mean±SE
Mean±1,96*SE
9
11
600 bar
Mean
Mean±SE
Mean±1,96*SE
9
001
005
010
014
018
022
026
030
034
038
042
046
050
054
058
062
066
070
074
079
083
087
091
095
098
102
106
110
114
118
122
10
067
Diamet er (microm)
400 bar
12
12
Diameter (microm)
b)
Individual
MSc, UiB 2011: Susanne Håvardsstuen, (3N testet med mikrosat. Geir Dahle)
Trykkforsøk torsk Austevoll vår 2011
%3N målt med flow cytometri på larver (måler DNA mengde pr blodcelle).
1) 20 min etter befruktning på 8500 psi i 5 min (etter oppnådd fullt
trykk)
2) 25 min
3) 30 min
4) 35 min
5) 40 min
6) 6 min (etter oppnådd fullt trykk):8500 psi i 6 min
7) 9000 psi i 5 min
8) 9000 psi i 6 min
9) Kontroll (diploid)
120
100
80
trip
60
dip
40
20
0
ctr
20 min pf 30 min pf 35 min pf 40 min pf
Trine Haugen, Craig
Morton mfl
TRIPCOD - NFR Havbruk 3N torsk fra 2011
• Samarbeid Nofima Marin, NVH og DFO Canada;
TRIPCOD planer
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Internasjonal work-shop steril fisk/torsk (mars 2012, Bergen)
Poseprod av 3N og all-female i Parisvannet (HI 2011, 2012)
[Oppfølging 3N fra poll i kommersielle anlegg HI 2012; Innovasjon Norge]
Intensiv startfôringsprotokoll for 3N torsk (Nofima)
Respirasjonsfysiologi (Nofima og NVH)
Hypoxi og temptoleranse (HI Matre 2012)
Deformiteter (HI og Nofima)
Nye 3N protokoller (HI Austevoll 2011, 2012)
Implementering i avlsprogrammet (Nofima)
Parisvannet, Øygarden
Takk for oppmerksomheten!
Foto: J.E. Fosseidengen
Havforskningsinstituttet
Dose-respons-forsøk (Austevoll 2007)
•
•
•
•
•
•
3 ulike doser av fadrozole ble testet:
10, 50 og 100 mg/kg
Behandlingen ble gitt i 2, 4 respektive
6 uker
MT positiv kontroll
EtOH negativ kontroll
Prøver tatt for analyse av aromataseaktivitet og ekspresjon
Kjønnsbestemmelse (visuell og
histologisk) når fisken var et år.
J. Babiak et al.
Resultat 2007 forsøk
•
•
•
•
Visuell kjønnsbestemmelse tyder på
at 6 ukers behandling ga min. 87100% hanner ved de høyere dosene
av fadrozol
To ukers behandling var ikke effektiv,
mens fire uker ga en overvekt av
hanner, men litt lavere andel en etter
seks uker i de fleste gruppene.
Ikke signifikante effekter på vekst.
Kjønn må bekreftes histologisk