Genteknologi for gymnasiet INSTRUKTION TIL PLASMIDOPRENSNING OG SKÆRING MED RESTRIKTIONSENZYMER PLASMIDOPRENSNING: Skift altid pipettespids før en ny afpipettering!! Denne forskrift beskriver oprensning af pUC19-DNA fra 5 mL 16 timers-kultur af Eschericia coli DH5alpha i LBmedium. Alle reagenser findes i Eppendorfrør i et gråt stativ på arbejdsstationen. P1 Du får udleveret et plastikcentrifugerøret med et bakteriebundfald (5 mL bakteriekultur centrifugeret i 10 minutter i Heraus centrifugen 5000 rpm (3634 xg) har givet dette bundfald). P2 Til bundfaldet i plastikrøret sættes 250 µL Buffer 1, hvorefter det opslemmes omhyggeligt på Whirly Mixer. (Buffer 1 indeholder RNase). P3 Overfør de 250 µL bakteriesuspension til et 2 mL Eppendorfrør (rundbundet). P4 Ovennævnte Eppendorfrør tilsættes først 250 µL Buffer 2 (Lysis buffer, pH = 12). Vend røret forsigtigt 4 – 6 gange (1/2 min.). Opløsningen bliver nu klarere og tyktflydende. Efter det halve minut tilsættes 350 µL Buffer 3 så bliver pH = 7. Vend øjeblikkeligt røret forsigtigt 4 – 6 gange. Opløsningen bliver nu grumset og uklar. Hele processen P4 må højst vare 5 minutter. (Buffer 3 er neutralisationsbuffer med høj koncentration af et chaotropt salt, der sikrer at DNA’et bindes til spinkolonnens matrix se P7). P5 Centrifuger røret i 10 minutter ved 13400 rpm (12100 xg) i Eppendorfcentrifugen. Lad hængslet på røret vende opad. Efter centrifugeringen ser du et hvidt bundfald, som består af cellerester og kromosomalt DNA samt en supernatant ( klar væske over bundfaldet), der indeholder plasmid DNA. P6 Sæt spin-kolonnen i opsamlingsrøret og overfør 500 µL supernatant fra P5 til midten af spin-kolonnen. Vent 1 minut og centrifuger opsamlingsrøret med kolonnen i 1 minut (Eppendorfcentrifugen, 13400 rpm, 12100 xg). Væske fra opsamlingsrøret hældes i autoklaveposen efter centrifugeringen. P7 Sæt spin-kolonnen i opsamlingsrøret igen og overfør resten af supernatanten fra P5 til spin-kolonnen. Vent 1 minut og centrifuger opsamlingsrøret med kolonnen i 1 minut (Eppendorfcentrifugen, 13400 rpm, 12100 xg). Væske fra opsamlingsrøret hældes i autoklaveposen efter centrifugeringen. Plasmid-DNA’et er bundet til spin-kolonnens matrix. P8 Sæt igen spin-kolonnen i opsamlingsrøret, tilsæt 400 µL Buffer 4 til spin-kolonnen og centrifuger opsamlingsrøret med kolonnen i 1 minut (Eppendorfcentrifugen, 13400 rpm, 12100 xg). (Buffer 4 er en vaskebuffer med ethanol, der sikrer at DNA stadig er bundet til matrix). Kasser opsamlingsrøret med væske efter centrifugeringen. P9 Placer spin-kolonnen i et sterilt, spidsbundet 1.5 mL Eppendorfrør (mærket pDNA), hvor låget er vredet af (gem låget). Tilsæt 50 µL Buffer 5 i centrum af spin-kolonnen og lad den stå i 1 minut så plasmidDNA’et kan løsnes fra kolonnematrix. (Buffer 5 er en elueringsbuffer; 10 mM TRIS-HCl; pH 8.0; 1mM EDTA). P10 Centrifuger 1 minut i Eppendorfcentrifuge. Plasmid-DNA’et er nu i røret pDNA; for at undgå fordampning sættes låget på til du skal bruge plasmid DNA’et. SKÆRING MED RESTRIKTIONSENZYMER: Dråben skal afsættes i bunden af røret. R1 Tag 2 små 0.2 mL Eppendorfrør mærket E (EcoR I) fra isboksen. I rørene findes restriktionsenzym, 2 µL (5 units /µL) svarende til 10 units EcoR I i røret. Mærk rørene henholdsvis E1 og E2 samt holdets initialer så I kan genkende dem senere. R2 Overfør 10 µL λ – DNA til E1; afsættes lige over væsken i bunden af røret. Skift pipettespids !! R3 Tilsæt 6 µL sterilt vand til E1; afsættes lige over væsken i bunden af røret. Skift pipettespids. R4 Tilsæt 4 µL 10x OFA til E1; afsættes lige over væsken i bunden af røret. Skift pipettespids. R5 Overfør 16 µL plasmid DNA fra pDNA til E2; afsættes lige over væsken i bunden af røret.. Skift pipettespids. R6 Tilsæt 4 µL 10x OFA til E2; afsættes lige over væsken i bunden af røret. Skift pipettespids. R7 Placer rørerne i en mikrotiterplade (Brug én mikrotiterplade som stativ til alle). Rørene sættes i varmeskab ved 37° C i ca. 1 time. Vask hænder inden du går til pause. Vi mødes igen efter ½ til ¾ time. Laborantafdelingen, Selandia-ceu 2010-01-20 Side 1 af 2 KLARGØRING AF PRØVER TIL GELELEKTROFORESE: Der udleveres en øvegel, hvor I indøver påsætning 12 µL loading buffer inden I går videre til GE1. Øvegelen ligger i en petriskål. Hæld vand i petriskålen så gelen dækkes af ca. 1 mm vand inden I indøver påsætningen. GE1 Overfør 15 µL uskåret plasmid-DNA fra pDNA-røret til et nyt 1.5 mL Eppendorfrør med 3 µL loading buffer. Denne blanding er nu klar til elektroforese. Mærk røret upDNA. GE2 Hent E1 og E2 fra mikrotiterpladen og tilsæt 3 µL loading buffer til hvert rør. Bland ved at suge væsken op og ned med pipetten NB husk ny spids til hvert rør! Er nu klar til elektroforese. GE3 Markør: I et 1.5 mL Eppendorfrør mærket "M" får du udleveret 10 µL DNA markør. Tilsæt 3 µL loading buffer til dette rør og bland. Er nu klar til elektroforese. ELEKTROFORESE: Hent læreren før du gør noget. Prøverne afpipetteres til brøndene i gelen efter skema som ligger ved elektroforesekarret. Skift spids for hver prøve. To hold per gel gør elektroforesen klar: Elektroforesebuffer er hældt i karret så gelen netop er dækket med 2 mm buffer. Indstil en pipette til 20 µL og husk at skifte pipettespids for hver prøve. Første hold: Brønd 1: Påsæt 18 µL (hele mængden) uskåret plasmid DNA fra røret mærket upDNA. Brønd 2: Påsæt 20 µL plasmid DNA skåret med EcoR I fra røret mærket E2. Brønd 3: Påsæt 20 µL λ-DNA skåret med EcoR I fra røret mærket E1. Brønd 4: Påsæt 13 µL (hele mængden) DNA markør, røret mærket ”M”. Andet hold: Påsæt jeres prøver i samme rækkefølge i brønd 5 – 8. Se Figur 1. GE4 GE5 Tænd for strømmen der skal være indstillet til 100 V, 250 mA og 1 time. Oprydning: Brugt plastudstyr og elektroforesegeler, der indeholder bakterier og plasmider placeres i autoklaveposen. Kitlerne lægges i den sorte affaldssæk i stativet ved udgangen. Vask hænder inden du forlader laboratoriet! Vi fotograferer gelerne og sender billedfiler til jer. Såfremt I ønsker at overvære fotograferingen af elektroforesegelerne og tolkning af resultaterne er I meget velkomne til at blive til det er gjort. I skal dog regne med at bruge yderligere 2 timer. Figur 1: Billede af 0.9 % agarosegel Figur 2: pUC19’s tilstandsformer Markøren HyperLadder I med 14 bånd ved, 10000bp, 8000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2500bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp, 800bp, 600bp, 400bp og 200bp λ-DNA skåret med restriktionsenzymet EcoR I giver lineære stykker dsDNA med følgende antal basepar 3530, 4878, 5643, 5604, 7421 og 21226. Laborantafdelingen, Selandia-ceu 2010-11-11 Side 2 af 2 Tak for i dag og på gensyn Laborantafdelingens lærere