Sisällysluettelo (alustava) - Yhdyskunta
AALTO-YLIOPISTO Insinööritieteiden korkeakoulu Yhdyskunta- ja ympäristötekniikan laitos Anna Lehtonen BIOLOGISEN KANTOAINEREAKTORIN MIKROBIDIVERSITEETIN MUUTOKSET ORGAANISTEN HAITTA-AINEIDEN POISTOSSA Diplomityö, joka on jätetty opinnäytteenä tarkastettavaksi diplomi-insinöörin tutkintoa varten Espoossa 9.6.2011 Työn valvoja: Professori Riku Vahala Työn ohjaajat: MMM Anu Kapanen, DI Pirjo Rantanen, TkL Minna Vikman AALTO-YLIOPISTO Insinööritieteiden korkeakoulu Anna Lehtonen Tekijä: DIPLOMITYÖN TIIVISTELMÄ Diplomityön nimi: Biologisen kantoainereaktorin mikrobidiversiteetin muutokset orgaanisten haitta-aineiden poistossa Päivämäärä: 9.6.2011 Sivumäärä: 85 Professuuri: Vesitekniikka Koodi: Yhd-73 Valvoja: TkT Riku Vahala Ohjaajat: MMM Anu Kapanen, DI Pirjo Rantanen, TkL Minna Vikman Avainsanat: Biofilmi, bisfenoli A, HHCB, kantoaineet, jätevedet Diplomityössä rakennettiin kaksi eri kantoaineilla (muovi ja puu) pakattua laboratoriomittakaavan bioreaktoria, joihin syötettiin esiselkeytettyä yhdyskuntajätevettä ja ilmaa. Kumpikin reaktori muodostui kahdesta lasikolonnista, joiden tilavuudet olivat tyhjänä 250 ml. Biofilmin annettiin muodostua kantoaineiden pinnalle noin seitsemän viikon ajan, jonka jälkeen reaktoreihin syötettiin jäteveden mukana kahta orgaanista haitta-ainetta, bisfenoli A:ta (BPA) ja HHCB:tä (myskiyhdiste). Molemmat kemikaalit ovat jätevesien mukana vesistöihin useista eri lähteistä päätyviä hormonihäiritsijöitä. Oletettiin, että reaktoreiden ensimmäisissä kolonneissa hajoavat helposti biohajoavat yhdisteet ja toisten kolonnien biofilmeihin rikastuu bakteereita, jotka ovat mahdollisia BPA:n ja HHCB:n hajottajia. Työssä tarkasteltiin bakteeripopulaatioiden monimuotoisuutta eri kantoaineiden pinnalla polymeraasiketjureaktio- (PCR) ja denaturoiva gradienttigeelielektroforeesi (DGGE) -menetelmillä. Haitta-aineiden poistumista tutkittiin kiinteäfaasiuuton ja nesteuuton jälkeisellä kaasukromatografia/massaspektrofotometrialla (GC/MS). Kokeessa verrattiin myös kantoaineiden eroja suhteessa mikrobipopulaation muutoksiin ja haitta-aineiden poistumiseen. Reaktoreiden toimivuutta jäteveden-puhdistuksessa arvioitiin mittaamalla kokeen aikana joitakin jätevedenpuhdistuksessa käytettyjä parametreja (BOD7ATU, CODCr, ammoniumtyppi, kokonaistyppi ja kokonaisfosfori) syötettävästä jätevedestä ja ulostulevista vesistä. Suurin osa bakteereista, joiden DNA saatiin sekvensoitua valitulta alueelta, kuuluivat -, - tai -proteobakteereihin. Nämä ovat myös kirjallisuuden perusteella yleisesti jätevesissä esiintyviä bakteereita. Ero ensimmäisten ja toisten kolonnien välillä, etenkin muovisten kantoaineiden kohdalla, oli selvä. Ensimmäisissä reaktoreissa bakteerilajeja oli useita, mutta jälkimmäisissä reaktorissa selvästi vähemmän. Saatujen DNAsekvenssien perusteella jäteveden bakteeripopulaatio erosi biofilmin populaatiosta. Myös eri kantoaineiden pinnalla kasvavat bakteeripopulaatiot erosivat toisistaan. Eri bakteeriryhmien suhteellisia osuuksia ja aktiivisuutta kantoaineiden biofilmissä on syytä tutkia tarkemmin, jotta voitaisiin päätellä enemmän niiden roolista jätevedenpuhdistuksessa. Haitta-aine-analyysien perusteella ei voida tehdä kuin varovaisia päätelmiä syötettävien kemikaalien hajoamisesta, sillä niistä saatiin vain murto-osa jäljitettyä. Syytä alhaisiin BPA ja HHCB saantoihin ei tässä tutkimuksessa pystytty selvittämään. Tämä on yksi jatkotutkimuksissa selvitettävistä ongelmista. 2 ABSTRACT OF THE MASTER’S THESIS AALTO UNIVERSITY School of Engineering Anna Lehtonen Author: Thesis: Date: Changes in microbial diversity of biological carrier reactor removing organic detrimental elements 9.6.2011 85 Number of pages: Professorship: Water and wastewater Engineering Code: Yhd-73 Supervisor: Instructors: Professor Riku Vahala M. Sc. Anu Kapanen, M. Sc. (Techn.) Pirjo Rantanen, Lic. Sc. Minna Vikman (VTT) Key Words: Biofilm, bisphenol A, HHCB, carrier, wastewater In this thesis two laboratory scale bioreactors packed with wood chips and plastic carrier objects were built. The reactors were supplied with preliminary clarified municipal wastewater and air. Both reactors were composed of two glass columns with a capacity of 250 ml each. Biofilm was allowed to form on the surface of the carrier material for approximately seven weeks after which two organic detrimental elements, bisphenol A and HHCB (a musk compound), were supplied to the system with the wastewater. Both chemicals are hormone disrupters which end up to water systems via numerous sources. It was assumed that easily biodegradable compounds would be degraded in the first columns and potentially BPA or HHCB degrading bacteria would be accumulated in the second columns. In this study, the diversity of bacterial population on the carrier material was investigated by polymerase chain reaction (PCR) and by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Reduction of BPA and HHCB were studied by solid phase extraction (SPE) and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). Also, differences between carrier materials in relation to changes in microbial diversity and decrease of detrimental elements were studied. The function of the reactors in nutrient removal was estimated by measuring some parameters (BOD7ATU, CODCr, ammonium nitrogen, total nitrogen and total phosphorus) used in wastewater treatment from influent and effluent. Most of the bacteria whose DNA sequence was received belonged to -, - or proteobbacteria. Also, according to the literature, these bacteria are commonly found in wastewater. The difference between the first and the second column, especially columns packed with the plastic carriers, was obvious. There were several bacterial species in the first columns, but evidently less in the second ones. Based on the received DNAsequences, the bacterial population of wastewater and the biofilm differed from each other. Also, the bacteria growing on the different carrier material differed from each other. In order to conclude more from the role of bacteria in wastewater, the relative amounts and the activity of different bacterial groups should be futher investigated. Only conservative conclusions of the analysis of bisphenol A and HHCB could be made based on the results of their biodegradation because only a fractional part of supplied amounts could be traced. The reason for the low yield could not been detected in this study. That is one of the problems to be solved in the further studies. 3 Alkusanat Tämän diplomityön kokeellinen osa tehtiin VTT:n materiaalimikrobiologian tutkimusryhmässä toukokuun ja marraskuun välisenä aikana vuonna 2010. Työ on osa Vesiturva-hanketta, jonka tavoitteena on tehostaa jätevesien puhdistusta siten, että vesistöihin päätyisi nykyistä vähemmän haitallisia aineita ilman kemikaalien turhaa käyttöä jätevedenpuhdistusprosessissa. Haluan kiittä lämpimästi Anu Kapasta ja Minna Vikmania, joilta sain apua työn edetessä, mutta jotka antoivat myös riittävästi tilaa itsenäiselle työskentelylle ja oppimiselle. Pirjo Rantaselle haluan esittää myös erityiset kiitokset rakentavista ja hyödyllisistä kommenteista. Suurkiitos Riku Vahalalle puolieni pitämisestä ja työn tarkastamisesta. Laboratorion väki ansaitsee ehdottomasti kiitokset kannustavasta ilmapiiristä ja hyvästä seurasta. Haluan kiittää hyvästä yhteistyöstä myös Vesiturva-hankkeen Lahden osapuolia. Lisäksi haluan kiittää vanhempiani kannustamisesta ja tukemisesta sekä ystäviäni tarpeellisten hengähdystaukojen tarjoamisesta. Erityiskiitos Markukselle tuesta, uskomisesta ja oikolukemisesta. 4 Lyhenteet ja termien selitykset A AOB BOD BPA BPA-d16 C CAS-numero COD DAPI DGGE dNTP DOC EC50 G GC/MC-Tof GTA HHCB JV Kow LC50 N NOB NOEC NTP PCR PE Phe-d10 PNEC R1 R2 R37 R41 R43 R50/53 R62 SPE T Xn adenosiini ammoniumia hapettavat bakteerit (engl. ammonia oxidising bacteria) biologinen hapenkulutus (engl., biological oxygen demand) 4,4'-dihydroksi-2,2-difenyylipropaani, bisfenoli A (engl. Bisphenol A) bisfenoli A-d10; sisäinen standardi BPA:n määrityksessä sytosiini kemikaalien tunnistenumero (chemical abstract service) kemiallinen hapenkulutus (engl. chemical oxygen demand) 4’6-diamino-2-fenoli-indole denaturoiva gradienttigeelielektroforeesi deoksinukleotiditrifosfaatti liuennut orgaaninen hiili (engl. dissolved organic carbon) vaikuttava pitoisuus (engl. effective concentration) guaniini kaasukromatografi/ massaspektrofotometri-time-of-flight glutaraldehydi 1,3,4,6,7,8-heksahydro-4,6,6,7,8,8-heksametyylisyklopenta-2-bentsopyreeni jätevesi oktanoli-vesi jakaantumiskerroin pitoisuus, joka tappaa 50 % koe-eläimistä (engl. lethal concentration) erittäin myrkyllistä vesieliöille nitriittiä hapettavat bakteerit (engl. nitrite oxidising bacteria) pitoisuus, jossa koe-eliöissä ei ole havaittu muutosta tutkitussa suureessa (engl. no observed effect concentration) normaali lämpötilta ja paine, 1 bar, 20 ºC (293,15 K) (engl. normal temperature and pressure) polymeraasiketjureaktio (engl. polymerase chainreaction) polyeteeni fenantreeni-d10; sisäinen standardi HHCB:n määrityksessä ympäristössä haitattomaksi arvioitu pitoisuus (engl. predicted no effect concentration) reaktori 1 (puulastukantoainereaktori) reaktori 2 (muovikantoainereaktori) R-lauseke: ärsyttää hengityselimiä R-lauseke: vakavan silmävaurion vaara R-lauseke: ihokosketus voi aiheuttaa herkistymistä R-lauseke: erittäin myrkyllistä vesieliöille, voi aiheuttaa pitkäaikaisia haittavaikutuksia vesiympäristössä R-lauseke: voi mahdollisesti heikentää hedelmällisyyttä kiinteäfaasiuutto (engl. solid phase extraction) tymiini, haitallinen 5 Sisällysluettelo KIRJALLISUUSOSA .......................................................................................... 8 1 JOHDANTO ................................................................................................. 8 2 JÄTEVEDEN PUHDISTUS ....................................................................... 10 2.1 Historiaa lyhyesti..................................................................................................................... 10 2.2 Tärkeimmät parametrit jäteveden puhdistuksessa .............................................................. 10 2.3 Biologinen jäteveden käsittely ................................................................................................ 11 2.3.1 Aktiivilieteprosessit.............................................................................................................. 12 2.3.2 Kantoaineprosessit ............................................................................................................... 13 2.4 Mikrobit jäteveden puhdistuksessa ....................................................................................... 16 2.4.1 Nitrifikaatio- ja denitrifikaatiobakteerit ............................................................................... 17 2.4.2 Muita jäteveden bakteereita ................................................................................................. 18 2.4.3 Bakteerien luokittelu ............................................................................................................ 18 3 3.1 BIOFILMI ................................................................................................... 20 Biofilmin muodostuminen ja rakenne ................................................................................... 20 3.2 Biofilmin monitorointi ja tutkimukset................................................................................... 22 3.2.1 Mikrobitiheyden määrittäminen ........................................................................................... 23 3.2.2 FISH ..................................................................................................................................... 23 3.2.3 Polymeraasiketjureaktio (PCR) ............................................................................................ 24 3.2.4 DGGE .................................................................................................................................. 26 4 YHDYSKUNTAJÄTEVESIEN ORGAANISET HAITTA-AINEET ............ 28 4.1 Bisfenoli A ................................................................................................................................ 29 4.1.1 BPA:n haitalliset ominaisuudet ............................................................................................ 30 4.1.2 Päästöt ja pitoisuudet vesistöissä.......................................................................................... 31 4.1.3 Biohajoavuus ........................................................................................................................ 32 4.2 HHCB ....................................................................................................................................... 33 4.2.1 Valmistus ja käyttö ............................................................................................................... 33 4.2.2 Päästöt ja esiintyminen vesistöissä ....................................................................................... 34 4.2.3 Haittavaikutukset vesieliöille ............................................................................................... 35 4.2.4 Biohajoaminen ..................................................................................................................... 35 4.3 Jäteveden haitta-aineiden määrittäminen ............................................................................. 35 4.3.1 Kiinteäfaasiuutto .................................................................................................................. 36 4.3.2 Kaasukromatografia-TOF-massaspektrometri ..................................................................... 36 KOKEELLINEN OSA ........................................................................................ 37 5 MATERIAALIT JA MENETELMÄT .......................................................... 37 5.1 Bioreaktorin pystyttäminen ja ylläpito ................................................................................. 37 5.1.1 Ilmastus ................................................................................................................................ 39 5.1.2 Lämpötilan, pH:n ja liuenneen hapen mittaus ...................................................................... 39 5.1.3 Kemialliset analyysit ............................................................................................................ 39 5.1.4 Haitta-aineiden syöttäminen ................................................................................................. 40 6 5.2 Näytteenotto ja -säilytys.......................................................................................................... 41 5.2.1 Vesinäytteet .......................................................................................................................... 41 5.2.2 Kantoainenäytteet ................................................................................................................. 42 5.3 Vertailureaktorit Lahdessa .................................................................................................... 42 5.4 Laboratorioanalyysit............................................................................................................... 44 5.4.1 DAPI-värjäys ....................................................................................................................... 44 5.4.2 DNA:n eristys ...................................................................................................................... 45 5.4.3 PCR-DGGE.......................................................................................................................... 45 5.4.4 PCR-tuotteen puhdistus ja sekvensointi ............................................................................... 47 5.4.5 Kiinteäfaasiuutto (SPE) ........................................................................................................ 48 5.4.6 Nesteuutto ............................................................................................................................ 50 5.4.7 GC/MS-TOF ........................................................................................................................ 51 6 TULOKSET JA TULOSTEN TARKASTELU ........................................... 52 6.1 Reaktorien toiminta ................................................................................................................ 52 6.1.1 Kemialliset analyysit ............................................................................................................ 52 6.1.2 Lämpötila, pH ja liuennut happi........................................................................................... 55 6.2 Haitta-aineanalyysit ................................................................................................................ 57 6.3 Mikrobien määrä .................................................................................................................... 59 6.4 Mikrobidiversiteetti ................................................................................................................ 61 7 JOHTOPÄÄTÖKSET JA JATKOTUTKIMUSEHDOTUKSET................. 70 LÄHDELUETTELO ........................................................................................... 72 7 KIRJALLISUUSOSA 1. Johdanto Jätevedenpuhdistamoilta pääsee purkuvesien mukana ympäristöön pieniä määriä orgaanisia haitta-aineita. Puhdistamot toimivat yleensä tehokkaasti orgaanisen kiintoaineen, typen ja fosforin poistajina, mutta useiden haitallisten orgaanisten yhdisteiden poistumiseen ei ole kiinnitetty huomiota. Osa haitta-aineista hajoaa puhdistusprosessin aikana, osa jää jätevesilietteeseen, mutta haitallisia määriä mm. hormonihäiritsijöitä, lääkejäämiä ja pestisidejä saattaa päätyä puhdistetun jäteveden mukana vesistöihin. Monet haitta-aineet ovat rasvaliukoisia ja ne rikastuvat ravintoketjussa päätyen lopulta myös ihmisiin. EU:n laatimalla vesistöille haitallisten aineiden prioriteettilistalla on mukana aineita, joiden on todettu aiheuttavan haittaa muun muassa vesistöissä. Bisfenoli A (BPA) ja 1,3,4,6,7,8-heksahydro-4,6,6,7,8,8-heksametyylisyklopenta- -2- bentsopyraani (HHCB) ovat yhdisteitä, joiden haitallisuudesta on käyty laajaa keskustelua. Prioriteettilista tarkistetaan ja päivitetään vähintään neljän vuoden välein. Bisfenoli A on ehdotettu lisättäväksi tälle listalle ja myös HHCB:tä on tutkittu vesiympäristössä ja sen on todettu häiritsevän mm. kalojen hormonitoimintaa. Jotta näiden aineiden poistamista jätevesistä voitaisiin tehostaa, olisi tärkeää ymmärtää niiden hajoamismekanismit. Tämä diplomityö tehtiin osana Tekesin rahoittamaa Vesiturva (Biologisen jätevedenpuhdistuksen tehon parantaminen) -hanketta, jonka tavoitteena on tehostaa jätevesien haitta-aineiden hajotukseen soveltuvia biologisia prosesseja siten, että kemikaaleja kuluu mahdollisimman vähän ja vesistöihin laskettava vesi on ekologisesti turvallista. Diplomityön tavoitteena oli rakentaa pakattu bioreaktori ja tutkia sen avulla kehittyykö biofilmiin bisfenoli A:ta ja HHCB:tä substraattinaan käyttävä mikrobikanta ja onko kantoaineen materiaalilla merkitystä hajoamistehokkuuteen tai mikrobidiversiteettiin. Tässä työssä tutkittiin kahden erityyppisen kantoaineen pinnalla kasvavien biofilmien bakteeripopulaatioita ja niissä tapahtuvia muutoksia kun puhdistettavaan jäteveteen lisättiin BPA:ta ja HHCB:tä. Työssä verrattiin PCR-DGGE:n avulla reaktoreista otettujen näytteiden mikrobikantoja ennen haitta-aineiden syöttämistä 8 ja haitta-aineiden syöttämisen jälkeen. Tavoitteena oli tutkia, kuinka biofilmin mikrobidiversiteetti eroaa kahden eri kantoaineen (puulastu ja muovikappale) välillä ja toisaalta saman reaktorin ensimmäisen ja jälkimmäisen kolonnin biofilmien välillä. Myös haitta-aineiden poistumista prosessin aikana seurattiin. Kumpikin kantoaine pakattiin kahteen rinnakkaiseen lasikolonniin, joiden läpi syötettiin esiselkeytettyä yhdyskuntajätevettä. Reaktoreihin syötettiin myös ilmaa, eli kyseessä oli hapellinen prosessi. Haitta-aineiden syöttö aloitettiin, kun biofilmi oli muodostunut kantoaineiden pinnalle. Hypoteesina oli, että sarjassa olevien reaktoreiden ensimmäisissä kolonneissa tapahtuisi helposti biohajoavien orgaanisten aineiden hajoamista ja bisfenoli A:ta tai HHCB:tä substraattinaan käyttävien mikrobien osuus toisissa kolonneissa kasvaisi. Bioreaktoreiden toimintaa seurattiin myös tärkeimpien jätevedenpuhdistuksessa käytettyjen parametrien (mm. orgaaninen aine ja ravinteet) avulla, jotta saatiin selville kuinka hyvin olosuhteet vastasivat todellista jätevedenpuhdistamoa. Tavoitteena ei kuitenkaan ollut rakentaa toimivaa jätevedenpuhdistusyksikköä, vaan luoda olosuhteet biofilmin bakteeripopulaation muutosten tutkimiselle. 9 2. Jäteveden puhdistus 2.1. Historiaa lyhyesti 1800-luvun puolivälissä alettiin ymmärtää likaisen veden ja suurissa kaupungeissa jylläävien epidemioiden yhteys ja jätevedenpuhdistamoita ryhdyttiin rakentamaan (Bitton 2005). Kuitenkin vasta 1960-luvulta lähtien Suomessa on laadittu jätevesien päästömääräyksiä (Vesilaki 264/1961), joita on myöhemmin määrätietoisesti tiukennettu (mm. EU-direktiivi yhdyskuntajätevesien käsittelystä, 91/271/ETY). Jätevedenpuhdistamoiden pääasiallinen tehtävä on ollut vähentää jätevedestä kiintoainesta, biologista hapenkulutusta, hajuhaittoja ja ravinteita. Tosin ravinteiden, etenkin typen, tehokkaampaan poistoon herättiin vasta 1990luvulla, jolloin esimerkiksi Itämeren ravinnepitoisuuden kasvu alkoi saada osakseen huomiota suurten leväesiintymien yleistyttyä. Viime aikoina huolenaiheiksi ovat nousseet myös jätevesien mukana vesistöihin kulkeutuvat kemikaalit (esim. hormonihäiritsijät ja antibiootit) ja resistentit bakteerikannat (Henze ym. 2008, Bitton 2005). 2.2. Tärkeimmät parametrit jäteveden puhdistuksessa Jäteveden puhdistusprosessin toimivuuden ja tehokkuuden varmistamiseksi prosessin eri vaiheita seurataan joko ottamalla säännöllisesti näytteitä tutkittavaksi, tai jatkuvatoimisilla mittalaitteilla. Seurannan avulla saadaan tärkeää tietoa mm. prosessin olosuhteista ja bakteerien toiminnasta ja normaalista poikkeaviin arvoihin voidaan reagoida ajoissa. Hapen riittävyys biologisissa prosesseissa taataan jäteveden ilmastuksella. Liuenneen hapen määrää mitataan yleensä jatkuvatoimisella mittauksella, samoin kuin lämpötilaa ja pH:ta. Biologinen hapenkulutus (BOD7) on tärkein jäteveden puhdistuksesta kertova parametri. BOD7 mittaa sitä hapen määrää, jonka mikrobit kuluttavat seitsemässä vuorokaudessa hajottaessaan orgaanista ainesta. Jos BOD7 on suuri, on jätevedessä paljon orgaanista hajoavaa materiaalia ja mikrobit kuluttavat paljon liuennutta happea. Orgaanisen aineen määrää mitataan myös kemiallisella hapenkulutuksella (CODCr), jossa voimakkaasti hapettava jäteveteen lisätty aine (di-kromaatti) hapettaa kaiken orgaanisen aineen. Hapettavan aineen kulutus mitataan ja stoikiometrian avulla voidaan laskea COD Cr-arvo. Jäteveden 10 puhdistusprosessin aikana seurataan myös kiintoaineen, ravinteiden (typpi ja fosfori) ja koliformisten bakteerien määrää, joka viittaa myös muiden ulosteperäisten taudinaiheuttajamikrobien läsnäoloon (Vesilind 2003). Typpi ja fosfori ovat ravinteita, jotka vaikuttavat vesistöissä levien lisääntymiseen. Taulukkoon 1 on koottu joitakin Suomenojan jätevedenpuhdistamon tulevan ja puhdistetun jäteveden seurantaparametrien keskiarvoja vuodelta 2009, Yhdysvaltojen keskimääräisiä jäteveden pitoisuuksia sekä EU:n asettamat suurimmat sallitut pitoisuudet lähtevälle vedelle, sekä niitä vastaavat poistumaprosentit. Taulukko 1: Suomenojan jätevedenpuhdistamon vuoden 2009 seurantaparametrien keskiarvoja (mg/l) tulevassa ja lähtevässä jätevedessä, USA:n keskisuuren puhdistamon vastaavia arvoja sekä lähtevän jäteveden EU:n asettamat suurimmat sallitut pitoisuudet ja minimi puhdistusprosentti (Jätevedenpuhdistamon omassa ympäristöluvassa rajat ovat tiukemmat). Parametri Keskiarvoja Keskiarvoja EU:n yhdyskuntajäte- puhdistetussa puhdistusvaativedessä yhdyskuntajäte- mukset (maksimi vedessä mg/l/ minimi puhdistus- %) 3 SO1 USA2 SO1 BOD7ATU (O2 mg/l) 230 350 4,6 25/ 70–90 % CODCr (O2 mg/l) 530 750 44 125/ 75 % NH4-N (mg/l) 49 45 1,8 Kok.-N (mg/l) 64 60 14 10 15/ 70 80 % Kok.-P (mg/l) 8,5 15 0,31 2/ 80 % Kiintoaine (mg/l) 290 400 5,5 35–60/ 70–90 % 1 Suomenojan jätevedenpuhdistamo 2009 2 Henze ja Comeau 2008 3 EU:n direktiivi 91/271/ETY 2.3. Biologinen jäteveden käsittely Biologinen jätevedenpuhdistus perustuu luonnon omiin hajotusprosesseihin. Jätevedessä olevia mikrobeja käytetään hajottamaan jäteveden orgaaninen aines, jota ne muuttavat uusien solujen rakennusaineeksi tai haitattomiksi yhdisteiksi. Esimerkiksi glukoosi hajoaa hapellisissa olosuhteissa biokemiallisesti hiilidioksidiksi ja vedeksi kaavan 1 osoittaman yhtälön mukaisesti. C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O (1) Joillekin mikrobeille myös haitalliset orgaaniset aineet kelpaavat ravinnoksi. Mikrobien hajotustehokkuutta pyritään tehostamaan pitämällä olosuhteet niille suotuisina mm. pH:ta ja hapen määrää säätämällä. Koska eri bakteerit osallistuvat 11 eri hajotusreaktioihin, on reaktioille eri optimiolosuhteet. Esimerkiksi typen kierrossa nitrifikaatioon osallistuvat hapellisissa oloissa elävät ammoniumtyppeä hapettavat bakteerit (AOB), jotka muuttavat ammoniumtypen nitraatiksi ja nitriitiksi. Denitrifikaatio, eli nitraatin ja nitriitin muuttuminen typpikaasuksi tai typen oksideiksi, tapahtuu hapettomissa olosuhteissa. Denitrifikaatioon osallistuvat nitriittiä hapettavat bakteerit (NOB). Nitrifikaation perusreaktiot on esitetty kaavoissa 2 ja 3 (Ekama ym. 2008). NO2 +H2O + 2H+ NH4+ + 1½ O2 (AOB) NO2 + ½ O2 (NOB) NO3 (2) (3) Usein biologisen käsittelyn lisäksi vaaditaan myös kemiallinen käsittely, jotta päästään vaadittuihin pitoisuuksiin ei-toivottujen aineiden poistossa. Esimerkiksi fosforinpoisto tapahtuu Suomessa yleensä ferrosulfaattisaostuksella. Biologinen jäteveden käsittely voidaan jakaa karkeasti aktiiviliete- ja kantoaineprosesseihin sekä näiden yhdistelmiin. 2.3.1. Aktiivilieteprosessit Aktiivilieteprosessissa jätevedenpuhdistukseen osallistuvat mikrobit kasvavat jätevesisuspensiossa, jossa ne muodostavat 50 200 µm suuruisia flokkeja. Puhdistettu jätevesi ja mikrobimassa erotetaan toisistaan laskeuttamalla ja osa mikrobimassasta eli aktiivilietteestä kierrätetään palautuslietteenä prosessin alkuun. Tyypillisesti aktiivilieteprosessi on aerobinen, mutta myös osittain hapeton (anaerobinen tai anoksinen) aktiivilietekäsittely on mahdollinen. Tällaisessa prosessissa voidaan toteuttaa sekä nitrifikaatio, että denitrifikaatio (Metcalf ja Eddy 2003). Uusi, nopeasti alaa valtaava aktiivilietteeseen perustuva jälkiselkeytyksen korvaava puhdistusmenetelmä on kalvobioreaktori (membrane bioreactor, MBR). Siinä kalvomoduuli voi olla joko upotettuna aktiivilietteeseen, tai erillisenä yksikkönä. Kalvon läpi suodattuu permeaatti eli puhdistettu jätevesi ja kalvon toisele puolelle jää kiintoaine (Metcalf ja Eddy 2003). 12 2.3.2. Kantoaineprosessit Kantoaineella tarkoitetaan materiaalia tai kappaleita, joiden pinnalle jäteveden puhdistamiseen osallistuvat mikrobit muodostavat biofilmiä. Kantoaineiden käyttö jäteveden puhdistuksessa perustuu niiden suureen pinta-alaan, joka mahdollistaa hajotustyötä tekevien bakteerien suuren tiheyden ja sen myötä hyvän hajotustehon. Bakteerit kiinnittyvät kantoaineeseen jos suspendoituneen bakteerimassan huuhtoutumisnopeus on suurempi kuin kyseisen bakteeripopulaation kasvunopeus (Morgenroth 2008). Kantoainemateriaalina ovat perinteisesti olleet luonnon materiaalit kuten kivi ja sora, mutta nykyään materiaalien kirjo on hyvin laaja ja käsittää paljon erilaisia polymeerejä. Myös uusia luonnon materiaaleja, kuten sammalta ja tupasvillaa, on testattu ja otettu käyttöön joissakin pienpuhdistamoissa (mm. Biolan). Uudenlaisilla kantoaineprosesseilla on mm. tehostettu COD:n poistoa kemianteollisuuden jätevesistä (Wessman ym. 2004). Kantoaineiden biofilmeissä on todettu kasvavan runsaasti nitrifioivia bakteereita (Podedworna ym. 2009), joiden avulla voidaan parantaa jätevedenpuhdistus-prosessin tehoa. Kantoaineprosessin tilantarve on huomattavasti pienempi kuin esimerkiksi aktiivilieteprosessin ja se kestää myös paremmin kuormitusta (Ødegaard ym. 1994). Luvussa 3 käsitellään tarkemmin biofilmiä ja sen jätevedenpuhdistuksen kannalta tärkeitä ominaisuuksia. Kantoainereaktorityyppejä on olemassa runsaasti erilaisia, joista seuraavaksi esitellään tunnetuimmat. Biosuodin Vanhimmassa kantoaineeseen perustuvassa jäteveden puhdistusmenetelmässä, biosuotimessa (trickling filter) (kuva 2 a), puhdistettava jätevesi syötetään pisaroina kantoaineen (esim. sepeli) pinnalle, josta se suodattuu kantoaineen läpi joutuen samalla kosketuksiin kantoaineen pinnalla kasvavan biofilmin kanssa. Kantoainemateriaaleina voivat olla myös erilaiset muoviset kappaleet tai luonnon omat materiaalit, kuten puulastu tai sammal. Jotta biofilmin hajotustyötä tekevät mikrobit ja muut eliöt säilyisivät hengissä ja toimintakykyisinä, on veden virtauksen oltava jatkuvaa. Biosuotimella ei ole varsinaista suodatusvaikutusta, joten se tarvitsee jälkiselkeytyksen, jossa biomassa ja puhdistettu jätevesi erotetaan toisistaan. Biosuotimessa ei erillistä ilmastusta useinkaan käytetä. BOD7:n alenema on biosuotimissa keskimäärin 50 80 %. Matalakuormitteiselle suotimelle 13 poistoprosentti on suurempi kuin korkeakuormitteiselle. Myös kantoainemateriaali vaikuttaa tehokkuuteen (Morgenroth 2008, Bitton 2005, Metcalf ja Eddy 2003). Biosuotimissa esiintyy prokarioottien, levien ja sienten lisäksi myös korkeampia eliöitä, kuten rataseläimiä, sukkulamatoja, nivelmatoja sekä hyönteisten toukkia. Aktiivisia bakteerisukuja ovat ainakin Zooglea, Pseudomonas, Nitrosomonas, Nitrobacter, Flavobacterium, Achromobacter ja Alcaligenes. Sienistä mm. Aspergillus ja Penicillum saattavat esiintyä biofilmissä, joskin ne kasvavat vain alhaisessa pH:ssa. Biofilmin pinnalla kasvaa myös leviä, jotka sienten tavoin osallistuvat jäteveden käsittelyyn, toisin kuin esim. aktiivilieteprosessissa, jossa työtä tekevät lähinnä bakteerit. Biosuotimen etuina ovat sen halvat käyttökustannukset, luotettavuus ja kestävyys jäteveden haitallisten aineiden pitoisuuspiikkejä vastaan. Toisaalta se voi tukkeutua liiallisen bakteeri- ja leväkasvun seurauksena, tai jos orgaanista ainesta syötetään liikaa. Tästä voi olla seurauksena mm. hajuhaittoja. Patogeenien poistossa biosuodin ei myöskään pärjää esimerkiksi aktiivilieteprosessille (Bitton 2005, Metcalf ja Eddy 2003). Biologinen suodatin Biologisessa suodattimessa kantoaine on pakattu reaktorin sisään, jonne jätevesi syötetään joko ylä-, tai alakautta. Aerobisessa reaktorissa ilmaa syötetään joko jäteveden mukana, tai vastakkaisesta suunnasta pieninä kuplina (kuva 2 b ja c). Kantoaineet ovat tyypillisesti pieniä, 2–8 mm halkaisijaltaan olevia rakeita, joiden ominaispinta-ala on suuri (1000–3000 m2/m3). Biofilmin liiallinen kasvu ja tukkeutuminen estetään säännöllisellä takaisinpesulla, jossa ilmaa ja vettä syötetään vastakkaiseen suuntaan kuin normaalitoiminnassa. Tällöin irrallinen biofilmi ja muu kuona saadaan poistettua (Morgenroth 2008). Bioroottori Bioroottori (rotating biological contactor, RBC) on myös melko vanha keksintö; sen ensimmäiset versiot otettiin käyttöön 1960-luvulla Saksassa. Bioroottorissa yhdestä neljään millimetrin paksuinen biofilmi muodostuu osittain jäteveden alla ja osittain ilman kanssa kosketuksissa olevien pyörivien levyjen pinnalle (kuva 2 d). Levyt ovat tyypillisesti polystyreeniä tai polyvinyylikloridia. Ne pyörivät hitaasti ja hapetus hoituu suoraan ilmasta, eikä erillistä ilmastusta tarvita. Pyörimisnopeudella on vaikutusta biofilmin paksuuteen ja muihin ominaisuuksin. Bioroottorien biofilmeissä esiintyy eubakteereita, rihmabakteereita, alkueläimiä ja myös 14 monisoluisia eliöitä. Bakteereista on löydetty mm. Shaerotilus-suvun edustajia. Bioroottorit ovat melko halpoja ja niiden käyttökustannukset ovat alhaiset. Ne eivät myöskään tukkeudu samoin kuin esimerkiksi biosuodattimet (Bitton 2005, Harremoës 2003, Morgenroth 2008). Upotetut biofilmireaktorit: kiinteä- ja liikkuvapatjainen bioreaktori Kiinteäpatjaisessa bioreaktorissa ((submerged) fixed bed bioreactor) biofilmi muodostuu kiinteän kantoainemateriaalin pinnalle, jonka ohi jätevesi virtaa. Reaktorilla ei ole suodatusvaikutusta, minkä vuoksi se vaatii jälkiselkeytyksen. Reaktori myös tukkeutuu melko helposti. Liikkuvapatjaisissa bioreaktoreissa (moving bed bioreactor, MBBR) kantoainekappaleiden materiaali pyritään valitsemaan siten, että niiden tiheys on lähellä jäteveden tiheyttä. Tyypillisesti materiaalina käytetään polymeeriä, josta tehdään mahdollisimman suuren ominaispinta-alan omaavia 2 3 kappaleita 2 (kuva 1). 3 Ominaispinta-ala vaihtelee noin 100 m /m :sta 5000 m /m :iin. Toimintaan vaikuttaa kappaleiden pinta-alan ja muodon lisäksi mm. täyttöaste. MBBR:ssa sekoitus voidaan toteuttaa jäteveden virtauksen, ilman syötön, mekaanisen sekoittimen, tai näiden yhdistelmän avulla. MBBR:a käytetään monesti tehostamaan aktiivilietelaitoksen toimintaa. Myös monet pienpuhdistamot ovat hyödyntäneet tekniikkaa (Huhtamäki 2006, Morgenroth 2008). Kuva 1: erilaisia muovisia kantoainekappaleita (kuvat: A. Lehtonen 2010). Leijupetireaktorit Leijupetireaktorissa (fluidised bed reactor), (kuva 2 e ja f), kantoainekappaleet ”leijuvat” jätevesisuspensiossa veden virtauksen vaikutuksesta. Toiminnan kannalta tärkeä on alhaaltapäin tulevan jäteveden virtausnopeus; jos virtaus on liian hidas, kiintoaine kerääntyy reaktorin pohjalle, mutta toisaalta liian suuri virtausnopeus huuhtoo suodatinaineen reaktorista. Leijupetireaktoreita käytetään pääasiassa teollisuuden tasaisille jätevesivirroille, eikä yhdyskuntajätevesille (Morgenroth 2008). 15 Kalvobiofilmireaktorit Kalvolla kasvavan biofilmin toimintaan perustuvassa bioreaktorissa (membrane attached biofilm reactor, MABR) (kuva 2 h) puhdistettava jätevesi virtaa joko toisella puolella kalvoa ja kaasut toisella puolella, tai molemmin puolin kalvoa, jolloin toiselle puolelle syötetään elektronien vastaanottajat ja toiselle luovuttajat. Kalvo on ohut ja se läpäisee kaasuja (Harremoës 2003, Morgenroth 2008). Yhdistelmäbioreaktorit Yhdistelmäbioreaktoreissa käytetään hyväksi sekä aktiivilieteprosessia, että kantoaineen pinnalla kasvavaa biofilmiä. Osa aktiivilietteestä kierrätetään takaisin kantoainereaktoriin, jolloin käytännössä biofilmiin rikastuu hitaasti kasvavia bakteereita, kuten nitrifioivia bakteereita tai anaerobisessa prosessissa metanogeenejä. Yhdistelmäbioreaktorit kestävät hyvin kuormituksen vaihtelua ja ne tehostavat puhdistusprosessia (Morgenroth 2008, Metcalf ja Eddy 2003). a c b ilma e f ilma d ilma g h ilma Kuva 2: Yleisimmät biofilmireaktorityypit: biosuodatin (trickling filter) (a), biologinen suodatin (b, c), bioroottori (rotating biological contactor, RBC) (d), suspensiobioreaktori ilmahissillä (e), leijupetireaktori (f), liikkuvapatjainen bioreaktori (g) ja kalvobioreaktori (h) (Morgenroth 2008). 2.4. Mikrobit jäteveden puhdistuksessa Yhdyskuntajätevesissä esiintyy suuri joukko erilaisia mikrobeja, kuten bakteereita, alkueläimiä, rataseläimiä, sieniä, viruksia ja leviä. Jäteveden puhdistuksessa näistä kiistattomasti tärkein rooli on bakteereilla, jotka ovat pieniä (0,2–3,0 µm), yksisoluisia prokariootteja, eli niillä ei ole tumaa kuten eukariooteilla. Solun 16 sisällä, soluseinän suojaamina ovat mm. RNA (ribonukleiinihappo), jolla on keskeinen rooli proteiinisynteesissä, sekä DNA (deoksiribonukleiinihappo), joka sisältää bakteerin geneettisen informaation. DNA:n emäsjärjestys määrää mm. millaisia proteiineja ja entsyymejä solut tuottavat. DNA:n emäsjärjestyksen selvittäminen avaa uusia mahdollisuuksia tutkittaessa bakteerien roolia jätevedenpuhdistuksessa. Monet entsyymit toimivat katalyytteinä erilaisille jätevedenpuhdistuksessa tapahtuville reaktioille, joissa yhdisteitä muutetaan haitattomaan tai vähemmän haitalliseen muotoon. Mikrobipopulaation koostumukseen sekä bakteerien tuottamien entsyymien määrään vaikuttavat etenkin lämpötila ja pH, mutta myös saatavilla olevat ravinteet sekä liuenneen hapen määrä. Jäteveden puhdistuksessa aktiivilietteen vallitsevia mikrobeita ovat beta-, alfa- ja gammaproteobakteerit (Bitton 2005, Metcalf ja Eddy 2003). 2.4.1. Nitrifikaatio- ja denitrifikaatiobakteerit Yhdyskuntajäteveden puhdistuksessa kenties tärkein rooli on typen kiertoon osallistuvilla bakteereilla. Ne muuttavat hapellisissa oloissa ammoniumtypen nitriitiksi ja edelleen nitraatiksi (nitrifikaatio) ja hapettomissa oloissa nitraatin typpikaasuksi (denitrifikaatio). Bakteerit, jotka muuttavat ammoniumtypen nitriitiksi (AOB, engl. ammonia oxidising bacteria), kuuluvat - ja - proteobakteereihin. Tällaisia bakteereita ovat esimerkiksi Nitrosomonas (mm. N. europaea), Nitrospira, Nitrococcus, Nitrosolobus ja Nitrosovibrio, joista Nitrosomonas-suvun bakteerit ovat hallitsevia jätevedenpuhdistusprosessissa. Nitrifikaatiobakteerit ovat kemoautotrofeja eli ne saavat hiilen pelkistämiseen tarvittavan energian hapettamalla tässä tapauksessa typpiyhdisteitä. Nitriittiä hapettavat bakteerit (NOB, engl. nitrite oxidising bacteria) kuuluvat - proteobakteerien alajaksoon. Esimerkiksi Nitrobacter (mm. N. agilis) muuttaa nitriitin nitraatiksi. Denitrifioivat bakteerit ovat heterotrofeja ja fakultatiivisesti aerobeja tai anaerobeja. Niissä on usean suvun edustajia: Pseudomonas, Bacillus, Spirillum, Hyphomicrobium, Agrobacterium, Acinotobacter, Propionobacterium, Rhizobium, Corynebacterium, Cytophaga, Thiobacillus ja Alcaligenes. Näistä ainakin Pseudomonas (mm. P. fluorescens) ja Alcaligens ovat tyypillisiä jätevedestä löytyviä bakteereja (Bitton 2005). 17 2.4.2. Muita jäteveden bakteereita Typen kiertoon osallistuvien bakteerien lisäksi jätevedessä esiintyy lukemattomia muita bakteereita, joista monenkaan roolia ei vielä tunneta. Fosforin poistoon osallistuvia bakteereita ovat mm. Acinetobacter, Nocardia, Arthrobacter, Pseudomonas ja Rhodococcus. Rikkiä hapettavat mm. Thiobacillus, Arthrobacter ja Micrococcus. Aina bakteereilla ei ole toivottua vaikutusta. Jätevesissä esiintyy jonkin verran bakteereita, jotka ovat patogeenejä eli taudinaiheuttajia. Tutuimpia jäteveden patogeenisia bakteereita ovat esimerkiksi maha- ja suolistotulehdusta aiheuttava Campylobacter jejuni, lavantautia aiheuttava Salmonella typhi, sekä Escherichia coli O157:H7. Taudinaiheuttajat ovat useimmiten peräisin ihmisten tai eläinten ulosteista. Jätevedenpuhdistuksen yksi päämäärä on päästä eroon taudinaiheuttajista. Usein mm. E. colia käytetään veden puhtauden mittarina; se toimii jätevesikontaminaation indikaattorina. Jotkin bakteerit voivat myös haitata jätevedenpuhdistusprosessia esimerkiksi muodostamalla ei-toivottua vaahtoa. Tällaisia bakteereja ovat esimerkiksi Gordonia amarae, Nocardia asteroides, N. caviae ja Rhodococcus (Bitton 2005). 2.4.3. Bakteerien luokittelu Bakteerien luokittelemiseksi on perinteisesti käytetty menetelmiä, jotka perustuvat esimerkiksi bakteerisolujen muotoon ja kokoon, soluseinän rakenteeseen (gramvärjäys) tai bakteerin käyttämään ravinnon lähteeseen. Muodon mukaan bakteerit jaetaan pyöreisiin kokkeihin, sauvamaisiin basilleihin sekä kierteisiin spirilleihin. Usein bakteerit kasvavat tiiviinä ryhminä vuorovaikutuksessa toistensa kanssa ja muodostavat lajityypillisiä rakenteita, kuten pitkiä rihmoja. Kasvuun käyttämänsä hiililähteen mukaan bakteerit jaetaan heterotrofeihin (orgaaninen aines) ja autotrofeihin (hiilidioksidi). Lämpötilaoptimin mukaan bakteerit voidaan jakaa psykrofiilisiin (optimilämpötila 12–18 °C), mesofiilisiin (25–40 °C) ja termofiilisiin (55–65 °C). Bakteerien tyypillinen optimi-pH on 6,5–7,5. Optimiympäristönsä suhteen löytyy poikkeavia bakteereita, jotka viihtyvät äärialoissa (Bitton 2005, Metcalf ja Eddy 2003, Salkinoja-Salonen 2002). 1970-luvun lopulla alettiin tutkia bakteereita molekyylitasolla. Mahdollisuus selvittää bakteerien DNA:n emäsjärjestys eli sekvenssi on mahdollistanut niiden entistä tarkemman luokittelun ja auttanut ymmärtämään paremmin niiden 18 toimintaa. Emäsjärjestyksen tunteminen mahdollistaa myös bakteerien entistä tarkemman sukulaisuussuhteiden selvittämisen ja läheisten sukulaisten erottamisen toisistaan. Bakteerien tunnistaminen emäsjärjestyksen perusteella tapahtuu yleensä ribosomaalisen 16S RNA:n geenin emäsjärjestystä vertaamalla. Kyseessä on geeni, joka esiintyy kaikilla bakteereilla, mutta vaihtelee tietyiltä osiltaan lajikohtaisesti. Jos kahden bakteerin 16S rRNA geenin alueelta eristetyn DNA:n emäsjärjestys on yli 97 %:sesti yhtenevä, voidaan bakteereita pitää saman lajin edustajina (Salkinoja-Salonen 2002). 19 3. Biofilmi Biofilmi on monimutkainen kokonaisuus, joka pitää sisällään erilaisia mikroympäristöjä. Biofilmin muodostuminen alkaa heti nesteen ja pinnan kohdatessa, jos kyseessä ei ole täysin steriili alue. Riippuen biofilmin esiintymispaikasta, se on joko haluttu tai ei-toivottu ilmiö. Esimerkiksi sairaaloiden, lämmönvaihtimien ja elintarviketeollisuuden biofilmit ovat yleensä ei-toivottuja, mutta suolistossa ja jätevedenpuhdistamolla biofilmin mikrobit tekevät korvaamatonta työtä. Maailman kaikista bakteereista todennäköisesti suurin osa elää biofilmeissä (Sutherland 2001b). 3.1. Biofilmin muodostuminen ja rakenne Koska biofilmin muodostaminen on mahdollista lukemattomille bakteerikannoille ja kyseiset bakteerit tuottavat lukemattomia erilaisia yhdisteitä, biofilmin koostumus, rakenne ja paksuus voivat vaihdella suuresti. Biofilmit koostuvat tyypillisesti vedestä (<97 %), mikrobisoluista (2–5 %), polysakkarideista (1–2 %), proteiineista (<1–2 %), sekä solun ulkoisesta DNA:sta ja RNA:sta (<1–2 %) (Sutherland 2001b). Solun ulkopuolisten polymeeristen aineiden (EPS, engl. extracellular polymeric substances) eli polysakkaridien, proteiinien ja aminohappojen tehtävänä on mm. kiinnittää bakteerisolut alustaan ja toisiinsa sekä toimia bakteerien suojana (Sutherland 2001a). Bakteerien lisäksi biofilmeissä elää jonkin verran myös alkueläimiä ja joitakin monisoluisia eliöitä, mutta niiden merkitys jätevedenpuhdistuksessa ei yllä bakteerien tasolle (Wobus ym. 2003). Biofilmin muodostuminen saa alkunsa bakteerien kiinnittyessä alustaan (kuva 3). Vähitellen bakteerien metaboliatuotteista ja kuolevien bakteerien jäänteistä (EPS) muodostuu bakteereita suojaava alue. Tämä alue suojaa bakteereita kuivumiselta ja myrkyiltä sekä mahdollistaa ioninvaihdon esimerkiksi biofilmin pinnan negatiivisten ryhmien ja raskasmetallien välillä. (Bishop 2003) Biofilmin ominaisuuksiin vaikuttavat ainakin mikrobipopulaatio, saatavilla olevien ravinteiden ja hapen määrä, alustan pintamateriaali ja veden virtausnopeus. Biofilmi on hyvin heterogeeninen kokonaisuus. Mikrobipopulaatio on erilainen biofilmikerroksen pinnalla, jossa hajotus tapahtuu tehokkaammin, kuin alimmissa kerroksissa. Toisaalta jäteveden kanssa kosketuksissa olevat pintakerroksen 20 mikrobit ovat alttiita kulutukselle ja irtoavat biofilmistä herkemmin kuin alimmissa kerroksissa olevat mikrobit. Karkeasti jaoteltuna sisäosissa esiintyy hitaasti kasvavia anaerobisia tai anoksisia bakteereita ja pinnalla nopeakasvuisia aerobisia bakteereita (Bishop 2003, Morgenroth 2008). Bakteerisoluja Solun ulkopuolista polymeeristä ainetta (ESP) 1 2 3 Kuva 3: Biofilmin muodostuminen: kiinnittyminen pinnalle (1), kasvu (2) ja irtautuminen (3) (Davies 2003). Cole ym. (2002) mallinsivat happea läpäisevän membraanibioreaktorin biofilmin bakteeri- ja konsentraatioprofiileita suhteessa biofilmin paksuuteen. Tutkimusryhmän saamien tulosten mukaan aerobisten heterotrofien määrä laskee rajusti yli 300 µm etäisyydellä membraanista samalla kun hapen määrä laskee ja denitrifioivien bakteerien osuus kasvaa. Vasta noin yhden millimetrin päässä membraanin pinnasta alkaa biofilmissä esiintyä etikkahappoa energian lähteenään käyttäviä metaania tuottavia bakteereita. Cole ym. tutkivat MABR-biofilmin ja aktiivilietteen bakteeripopulaatioita PCR–DGGE-menetelmän avulla. Aktiivilietteen bakteeripopulaatio osoittautui suppeammaksi kuin biofilmin populaatio. Biofilmin mikrobit ottavat jätevedestä ravinteita käyttöönsä. Lähellä pintaa biofilmin tiheys kasvaa, permeabiliteetti pienenee ja aineiden diffuusiota tapahtuu vain vähän. Biofilmin pinnan muoto vaikuttaa jäteveden virtausprofiiliin, joka taas vaikuttaa ravinteiden kulkeutumiseen biofilmin sisälle. Biofilmin eri kerroksissa myös hapen ja ravinteiden määrä voi vaihdella suuresti. Biofilmin pinnassa ravinteita ja happea on eniten saatavilla, kun taas aivan kantoaineen rajapinnassa saattaa olla lähes hapettomat olosuhteet ja niukasti ravintoa. Aineet kulkeutuvat biofilmissä sekä advektion, eli aineiden vapaan kulkeutumisen, ja diffuusion avulla. Suurin osa aineiden kulkeutumisesta tapahtuu solun EPS-aineessa olevien huokosten ja tunnelimuodostumien kautta (Bishop 2003). 21 3.2. Biofilmin monitorointi ja tutkimukset Biofilmiä on perinteisesti tarkasteltu erilaisilla mikroskooppisilla menetelmillä. Muita käytettyjä menetelmiä ovat lukuisat mikrobiologiset, molekyylibiologiset, kemialliset ja fysikaaliset menetelmät. Käytetty tutkimismenetelmä riippuu mm. siitä, mitä biofilmin ominaisuutta halutaan tutkia. Taulukossa 2 on esitetty erilaisia tutkimuskohteita ja -menetelmiä biofilmin tutkimiseksi. Taulukko 2: käytettyjä menetelmiä biofilmin tutkimiseksi eri kohteista (Denkhaus 2007). Tutkimuskenttä Limoittuminen biofilmin rakenne ja toiminta Biokorroosio Biohajoaminen mikrobiyhdyskunnan muodostuminen aineenvaihdunnan aktiivisuus ja säätelyjärjestelmä Ekologia sairauden synty ja kehitys hygienian merkitys BIOFILMI Analyyttinen menetelmä Molekyylibiologian menetelmät Erotusmenetelmät Pinnan ja rajapinnan karakterisointi tekniikat DGGE CE AFM FISH uuttoerotus CLSM GFP FFF IR-spektroskopia immunoanalyysi GC NMR oligonukleotidi koettimet LC valoakustinen spektroskopia SEC PFGE PCR heijastuskyky spektroskopia SEM STXM röntgensäde Spektrometria Mikrosensorit AAS elektrokemialliset mikrosensorit (fluoresenssi) spektrometria Selitykset: AAS atomiabsorptio spektrometria, AMF atomivoimamikroskopia, CE kapillaarielektroforeesi, CLSM konfokaali laserpyyhkäisymikroskopia, DGGE denaturoiva gradientti geelielektroforeesi, FFF kenttävirtaerotus, FISH fluoresenssi in situ hybridisaatio, GC kaasukromatografia, GE geelielektroforeesi, GFP vihreää fluoresoiva proteiini, LC nestekromatografia, NMR ydinmagneettinen resonanssi, PFGE pulssikenttäelektroforeesi, SEC kokoerotteleva kromatografia, SEM pyyhkäisyelektonimikroskopia, STXM pyyhkäisyläpäisy röntgensäde mikroskopia valokuitumikrosensorit 22 3.2.1. Mikrobitiheyden määrittäminen Biofilmin mikrobitiheyttä voidaan arvioida esimerkiksi värjäämällä näyte fluoresoivalla väriaineella ja tarkastelemalla näytettä fluoresenssimikroskoopilla. Yleisesti käytetty väriaine on 4’6-diamino-2-fenoli-indoli (DAPI), joka sitoutuu mikrobien DNA:han ja fluoresoi sitoutuessaan sinistä tai sinivalkoista valoa. Muuhun kuin DNA:han sitoutunut väriaine saattaa fluoresoida kellertävää valoa. Nestemäinen näyte laimennetaan tarvittaessa, värjätään ja suodatetaan käsitellyn polykarbonaatti-membraanisuodattimen epifluoresenssimikroskoopilla. läpi. DAPI-värjäyksellä Suodatinta on tarkastellaan mahdollista tunnistaa mikrobisolujen kokoeroja ja muotoja, mutta eläviä ja kuolleita soluja ei tällä menetelmällä voida erottaa toisistaan (Kepner ja Pratt 1994). Elävät ja kuolleet solut voidaan erottaa toisistaan live/dead-kiteillä. Ne perustuvat yleensä kahteen fluoresoivaan väriin, joista toinen tarttuu vahingoittumattoman solun kalvoon ja toinen kuolleisiin soluihin. Tuloksia voidaan tarkastella fluoresenssi-mikroskoopilla. Kokonais-ATP:n (adenosiinitrifosfaatti) mittaamisella voidaan myös arvioida aktiivisten solujen määrää. Solut käyttävät ATP:tä energian siirtoon ja lyhytaikaiseen varastoimiseen. Bakteerit tuottavat luontaisesti ATP:n ja lusiferaasientsyyminsä avulla valoa, joka voidaan mitata luminometrillä (SalkinojaSalonen 2002). 3.2.2. FISH Fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) on suosittu tapa erilaisten ryhmien paikallistamiseksi biofilmistä. FISH perustuu lyhyeen nukleiinihapposekvenssiin eli koettimeen, jonka toiseen päähän on kiinnitetty fluoresoiva markkeri. Koetin on suunniteltu siten, että se tunnistaa mikrobi-RNA:n komplementaarisen kohdan ja kiinnittyy siihen. Kun ylimääräiset koettimet pestään pois ja näytettä tarkastellaan fluoresenssimikroskoopilla, voidaan havaita haluttuihin bakteereihin kiinnittyneet tiettyä väriä säteilevät markkerit (Comeau 2008). Bakteeripopulaatioiden koostumusta on tutkittu fluoresenssi in situ hybridisaation avulla erilaisten kantaja-aineiden biofilmistä (mm. Xia 2010, Andersson ym. 2008, Fernández ym. 2008, Bertin 2007) ja aktiivilietteestä (mm. Wagner ym. 1993, Wilén ym. 2008). Biofilmistä voidaan saada FISH:in avulla selville myös 23 bakteerien sijainti ja niiden määräsuhteet. Bertin ym. (2007) tutkivat nonyylifenolien hajoamista pakatussa bioreaktorissa ja tarkistivat biofilmin kehittymisen kantoaineiden pinnalle FISH:in avulla. Fluoresenssimikroskooppia herkempi on pyyhkäisyelektronimikroskooppi, jonka avulla FISH-värjäyksistä voidaan saada kolmiulotteisia, jopa 4000-kertaisia suurennoksia (mm. Fernández ym. 2008). 3.2.3. Polymeraasiketjureaktio (PCR) PCR:n tarkoituksena on monistaa haluttua DNA-pätkää niin, että DNA:ta saadaan tarpeeksi sen visualisoimiseksi. PCR:n avulla voidaan DNA-juosteesta monistaa jopa satoja miljoonia kopioita halutusta alueesta. DNA:n eristämiseksi on nykyään saatavilla lukuisia kaupallisia kittejä, minkä ansiosta DNA:n eristämisessä käytettyjen myrkyllisten kemikaalien (esim. fenoli) käyttö on vähentynyt. PCR perustuu alukkeisiin, jotka suunnitellaan komplementaarisiksi monistettavan alueen emäsjärjestyksen kanssa. DNA:n ja alukkeiden A (adenosiini) ja T (tymiini) pariutuvat keskenään ja C (sytosiini) ja G (guaniini) keskenään (kuva 4). Alukkeiden välinen DNA-sekvenssi monistuu PCR-reaktioon lisättävien nukleotidien ja Taq-entsyymin läsnä ollessa. Kuva 4: DNA:n rakenne. Tekijänoikeus: CSC 2002). Tilastollinen laskenta Oy (Heikkinen ym. PCR:n vaiheet on esitetty kuvassa 5. PCR-laite lämmittää ja jäähdyttää putkia, jotka sisältävät monistettavalle kohdealueelle suunnitellut alukkeet, 24 deoksinukleotiditrifosfaatteja (dNTP), korkeita lämpötiloja kestävää Taq-entsyymiä ja entsyymille optimiolosuhteet takaavaa puskuria sekä puhdistetun näyte-DNA:n eli templaatin. Lämpötilan nopean vaihtelun ansiosta DNA:n kaksoiskierre ensin hajoaa, jonka jälkeen alukkeet tarttuvat yksijuosteisen DNA:n vastinpariensa kohdalle. Tarttumislämpötila on alukkeille ominainen, noin viisi astetta alukkeiden sulamislämpöä alhaisempi. Alukkeiden sulamislämpötila riippuu niiden emäskoostumuksesta: suuri G ja C pitoisuus nostaa sulamislämpöä. Uusi kaksijuosteinen DNA monistuu Taq-entsyymin ja dNPT:ien avulla 72 ºC:ssa ja denaturoituu taas lämpötilan noustessa noin 94 ºC:een. Lämpötilasyklejä toistetaan yhteensä 25–35 kertaa, joista jokaisen syklin aikana DNA-juosteiden määrä kaksinkertaistuu (Brown 2006). 3’ 5’ 5’ 3’ Monistettava DNA 3’ 5’ Denaturaatio (94 ºC): 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ Alukkeiden sitoutuminen (50–60 ºC) ja uuden DNAjuosteen synteesi (72 ºC) 5’ 3’ Lämpösyklejä toistetaan 25– 35 kertaa DNA-kaksoisjuosteet ensimmäisen PCR-syklin jälkeen Kuva 5: PCR:n yksi sykli, jossa yhdestä DNA-juosteesta monistuu kaksi juostetta (Brown 2006). PCR:n onnistuminen tarkistetaan yleensä suorittamalla geelielektroforeesi, jossa PCR-tuotetta lisätään agaroosigeeliin valettuihin kaivoihin yhdessä DNA:n etenemistä havainnoivan väriliuoksen kanssa. Sähkövirran avulla DNA saadaan liikkumaan geelillä ja erikokoiset DNA:t erotettua toisistaan. Kun geeliin lisätään kokomarkkeri, joka on sekoitus tunnetun kokoisia DNA-pätkiä, voidaan tunnistaa oikean kokoiset PCR-tuotteet. Geeli värjätään DNA:han sitoutuvalla väriaineella ja 25 tarkastellaan UV-valolla tai muulla valittua väriainetta fluoresoivalla valolla. Jos DNA ei ole monistunut, ei geelillä näy mitään. Sen vuoksi PCR:oon on syytä ottaa mukaan aina positiivinen kontrolli, jonka tiedetään monistuvan ja olevan halutun kokoinen. Myös negatiivinen kontrolli on tarpeellinen, jotta nähdään aiheuttavatko alukkeet vääriä PCR-tuotteita esimerkiksi pariutumalla keskenään. 3.2.4. DGGE Monistetusta DNA:sta eli PCR-tuotteesta voidaan ajaa denaturoiva gradientti geelielektroforeesi (DGGE), jonka avulla on mahdollista erottaa toisistaan samankokoisia, mutta emäsjärjestykseltään eroavia DNA-juosteita. Menetelmää käytetään yleisesti selvittämään erilaisten mikrobipopulaatioiden koostumusta, sillä yhdestä näytteestä voidaan erottaa halutulla tarkkuudella useita eri mikrobeita. Bakteeripopulaatioita PCR-DGGE:llä karakterisoitaessa käytetään DNA:n monistamiseksi yleensä alukkeita (kohde-DNA:han sitoutuvia oligonukleotideja), jotka tunnistavat ribosomaalisen 16S RNA-geenin, tai osan siitä. Tämä geeni on kaikilla bakteereilla, mutta sen koodi, eli emäsjärjestys vaihtelee eri bakteerilajien välillä. Denaturoiva gradienttigeeli valetaan kahden lasin väliin ohueksi (tavallisesti 1-1,5 mm) levyksi. Geelin valuvaiheessa sen yläpäähän tehdään ns. geelikamman avulla kaivot, joihin monistettu DNA pipetoidaan yhdessä latausväriliuoksen kanssa. Monistettu DNA (PCR-tuote) ajetaan sähkövirran avulla 60 ºC:isessa puskurissa geelin poikki ylhäältä alas. DNA:n kulkeutuessa geeliä pitkin, geelin denaturoivien komponenttien (urea ja formamidi) osuus kasvaa ja DNA:n kaksoisjuoste purkautuu. Hajonnut DNA kulkeutuu geelissä hitaammin kuin ehjä ja pysähtyy lopulta käytännössä kokonaan. DNA:n kaksoisjuoste purkautuu sitä nopeammin, mitä suurempi A- ja T-emästen pitoisuus DNA:ssa on. Jos DNA sisältää runsaasti G- ja C-emäksiä, DNA hajoaa hitaammin ja kulkeutuu pidemmälle geelissä. Toiseen PCR alukkeeseen lisätään 5’-päähän (5’ viittaa sokeriryhmän hiiliatomien numerointiin, kuva 4, s. 25) C ja G emäksistä koostuva häntä, jolloin suuren ATpitoisuuden juosteet saadaan erotettua paremmin. Geeli värjätään DNA:han sitoutuvalla väriaineella. Valmis geeli kuvataan UV-valopöydällä ja DNA havaitaan geelissä näkyvinä juosteina. (Fisher ja Lerman 1983, Muyzer ym. 1993). PCR-DGGE-menetelmää on käytetty useissa jätevesitutkimuksissa (mm. Xia ym. 26 2010, Baba ym. 2009, Liu ym. 2007, Boon ym. 2002) bakteeripopulaatioiden esiintymisen selvittämiseksi erilaisista jätevesiympäristöistä (esim. aktiiviliete ja biofilmireaktori). Xia ym. (2010) tutkivat PCR-DGGE:n avulla hiili-typpi-suhteen vaikutusta nitrifikaatio- ja denitrifikaatiobakteereiden esiintymiseen laboratoriomittakaavan upotetussa bioreaktorissa. 27 4. Yhdyskuntajätevesien orgaaniset haitta-aineet Orgaanisia haitta-aineita kulkeutuu jäteveden käsittelylaitoksille teollisuudesta, kunnallisten palveluiden (sairaalat, hoitolaitokset yms.) jätevesien, kaupunkien ja taajamien hulevesien, kaatopaikan suotovesien ja kotitalousvesien mukana. Myös uusia synteettisiä aineita tulee markkinoille useita joka vuosi, eikä niiden yhteisvaikutuksista ja haittavaikutuksista pitkällä aikavälillä ole aina riittävästi tietoa. Haitta-aineista vaihteleva osa poistuu jäteveden puhdistusprosessissa; osa hajoaa biologisesti ja osa jää lietteeseen. Kemikaaleja päätyy kuitenkin puhdistetun jäteveden mukana myös vesistöihin (Bitton 2005, Metcalf ja Eddy 2003). Melko huonosti tunnetuilla hormonihäiritsijöillä saattaa olla pitkäkestoisia vaikutuksia vesistöjen populaatioihin. Pienetkin pitoisuudet voivat olla haitallisia, sillä useat hormonihäiritsijät ovat rasvaliukoisia, eli ne rikastuvat ravintoketjussa. Kaksi vesistöihin mm. jätevesien mukana kulkeutuvaa hormonihäiritsijää ovat bisfenoli A (BPA) ja HHCB. Euroopan komissio on laatinut listan prioriteettiaineista, joiden on todettu aiheuttavan kroonista tai akuuttia haittaa vesieliöille. Lista on osa Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiiviä, jonka tarkoitus on koota yhteen tärkeysjärjestyksessä aineet, joiden päästöjä vesistöihin on tarkkailtava ja joiden päästöjen vähentämiseksi on ryhdyttävä toimiin mahdollisuuksien mukaan. Ensimmäinen 33 ainetta sisältävä vesipolitiikan alan prioriteettilista julkaistiin vuonna 2001 (liite 1). Neuvoston päätöksen ohjeen mukaan prioriteettilistaa on päivitettävä neljän vuoden välein (EU:n päätös 2455/2001/EY). Prioriteettilista tarkistettiin viimeksi 13.1.2011. Ehdotettujen uusien prioriteettiaineiden listalla (liite 2) oli mm. bisfenoli A (EU:n direktiivi 2008/105/EY). Kumpikaan tässä työssä tutkituista haitta-aineista ei päätynyt kyseiselle listalle. 28 4.1. Bisfenoli A 4,4'-dihydroksi-2,2-difenyylipropaani eli bisfenoli A (BPA) on monomeeri, joka muodostuu kahden fenolin ja asetonin reagoidessa (kuva 6). Yleisiä BPA:n ominaisuuksia on luetteloitu taulukossa 3. Kuva 6: Bisfenoli A:n muodostuminen. Taulukko 3: BPA:n yleisiä- ja fysikaalisia ominaisuuksia. Parametri Suure Lähde CAS-numero 80-05-7 Molekyylikaava C15H16O2 Molekyylipaino 228,29 g/mol Olomuoto (NTP) Valkoinen jauhe tai hiutaleet EURAR, 2003 Liukoisuus veteen 120–300 mg/l EURAR, 2003 Kiehumispiste 250–252 ºC Leimahduspiste n. 207 ºC EURAR, 2003 log Kow 3,32–3,82 Staples ym. 1998 Vaarallisuusluokittelu Xn (R37, R41, R43, R62) BPA:ta käytetään pääasiassa muoviteollisuudessa lisäaineena valmistettaessa epoksihartsia ja polykarbonaattimuoveja (taulukko 4). Polykarbonaattimuoveja käytetään mm. elintarviketeollisuudessa tölkkien pinnoittamiseen ja tuttipullojen valmistamiseen sekä iskun ja kulutuksen kestävyyttä vaativissa muovituotteissa. BPA:ta hyödynnetään myös lämpöpaperin valmistuksessa. (Staples ym. 1998, EURAR 2003). 29 Taulukko 4: BPA:n käyttö Länsi-Euroopassa vuosina 2005/2006 (EURAR 2003) Käyttötarkoitus polykarbonaatin valmistus epoksihartsin valmistus – tölkkien pinnoitus – etoksyloity BPA fenoplastin valuprosessit tyydyttymättömien polyestereiden valmistus Lämpöpaperin valmistus PVC - polymerisaatio Muut Nettovienti Tonnia/vuosi 865 000 191 520 2 755 2 260 8 800 3 600 1 890 1 800 7 245 65 000 Yhteensä 1 149 870 Osuus 75,23 % 16,66 % 0,24 % 0,20 % 0,77 % 0,31 % 0,16 % 0,16 % 0,63 % 5,65 % 4.1.1. BPA:n haitalliset ominaisuudet Bisfenoli A on hormonihäiritsijä, joka muistuttaa estrogeeniä (17 -estradiol, naishormoni) ja sitoutuu soluissa samoihin reseptoreihin estäen estrogeenin toiminnan (Goodman ym. 2006). Vesistöissä BPA voi häiritä kalojen ja muiden vesieliöiden lisääntymistä (Lahnsteiner ym. 2005). BPA:lla on todettu olevan myös muita haittavaikutuksia kuten karsinogeenisuus. Taulukossa 5 ja 6 on esitetty tuloksia BPA:n myrkyllisyydestä vesieliöille (Alexander ym. 1988). Taulukko 5: BPA:n myrkyllisyys vesieliöille (makea vesi) (Alexander ym. 1998). 96 h EC50 48 h EC50 96 h LC50 Testikohde Myrkyllisyys levälle Latinankielinen nimi Selenastrum capricornutum Pitoisuus 2,7–3,1 mg/l Myrkyllisyys selkärangattomille Myrkyllisyys kaloille (mutu) Daphnia magna 9,2–11 mg/l Pimephales promelas 4,0–5,5 mg/l (seisova vesi) 3,6–5,4 mg/l (virtaava vesi) Taulukko 6: BPA:n myrkyllisyys vesieliöille (merivesi) (Alexander ym. 1998). 96 h EC50 96 h LC50 96 h LC50 Testikohde Myrkyllisyys levälle Latinankielinen nimi Skeletonema costatum Pitoisuus 1,0–1,8 mg/l Myrkyllisyys selkärangattomille Myrkyllisyys kaloille (atlantinhopeakylki) Mysidopsis bahia 0,92 – 1,2 mg/l Menidia menidia 8,3 – 11 mg/l Lahnsteiner ym. (2005) tutkivat BPA:n vaikutusta purotaimenen (Salmo trutta f. fario) mädin ja maidin tuotantoon ja niiden laatuun. Käytetyt BPA-pitoisuudet olivat pieniä: 0,00175 mg/l, 0,00240 mg/l ja 0,00500 mg/l. Mukana oli kontrolliryhmä, jonka veteen ei lisätty BPA:ta. Tutkimuksessa havaittiin veteen lisätyn BPA:n vaikuttavan uroskaloilla maidin massaan (BPA-lisäys 0,005 mg/l) 30 sekä siittiöiden määrään (BPA-lisäys 0,005mg/l) ja liikkuvuuteen (kaikilla BPA:n pitoisuuksilla). Naarailla BPA vaikutti tuotettujen munien määrään (0,0024 mg/l BPA:ta) ja tilavuuteen (0,005 mg/l BPA:ta). Lisäksi kaikilla BPA-pitoisuuksilla naaraiden ovulaatio myöhästyi ja 0,005 mg/l BPA-pitoisuudella munat eivät hedelmöittyneet lainkaan. 4.1.2. Päästöt ja pitoisuudet vesistöissä BPA:ta on löydetty myös jätevesistä (Fürhacker ym. 2000, Staples ym. 1998). Jätevesiin päätyvät määrät riippuvat mm. ympäröivästä teollisuudesta ja asukastiheydestä. BPA:n riskinarviointia varten tehdyssä kartoituksessa arvioitiin Euroopassa jätevedenpuhdistamoille päätyvän BPA:ta yhteensä noin 369 tonnia vuodessa. Puhdistamoilta vesistöihin päätyvän BPA:n määrän on arvioitu Euroopassa olevan noin 44 tonnia/vuosi (121 kg/vrk). Näiden arvioiden perusteella hieman alle 90 % BPA:sta poistuisi jätevedenpuhdistuksessa (EURAR 2003). Eniten BPA:ta päätyy jätevesiin lämpöpaperin kierrätyksestä (n. 85 %) ja PVC:n valmistusprosesseista (n. 14 %). Myös kotitalouksien jätevesistä on mitattu 0,0058 mg/l BPA-pitoisuuksia (Fürhacker ym. 2000). Jätevesien puhdistuksen jälkeenkin BPA:ta päätyy vesistöihin mainittujen prosessien lisäksi mm. epoksihartsin ja BPA:n valmistusprosesseista. BPA:ta valmistavien tehtaiden puhdistetuista jätevesistä on mitattu 0,00313–0,045 mg/l pitoisuuksia vuonna 2006. Vuositasolla samojen tehtaiden päästöt olivat 6,8–113 kg (EURAR 2003). Kirjallisuusselvityksen (Kang ym. 2007) mukaan luonnon vesistä lähellä jäteveden purkupaikkaa on mitattu <0,00005–0,008 mg/l BPA-pitoisuuksia (Hollannissa yhdessä näytteessä 0,021 mg/l). Kyseisen selvityksen kohteena olivat Espanja, Hollanti, Japani, Kiina, Saksa ja Yhdysvallat. Suurimmat pitoisuudet (0,001 0,008 mg/l) mitattiin Yhdysvalloissa. Muiden maiden suurimmatkin mitatut pitoisuudet olivat alle 0,002 mg/l. Pidemmällä purkupaikasta pitoisuudet putosivat alle määritysrajan, mikä johtuu todennäköisesti sekä laimenemisesta, että biohajoamisesta. Puhton (2009) opinnäytetyössä Viikinmäen jätevedenpuhdistamolle tulevasta jätevedestä mitattiin BPA:ta noin 0,0001 mg/l ja lähtevästä vedestä noin 0,0002 mg/l. Tämän mukaan 80 % BPA:sta joko hajoaa, tai päätyy lietteeseen. 31 4.1.3. Biohajoavuus Tutkimusten (Lobos ym. 1992, Kang ja Kondo 2002a, Oshiman ym. 2007) mukaan jotkin bakteerit pystyvät hajottamaan bisfenoli A:n nopeasti kokonaan tai lähes kokonaan hapellisissa olosuhteissa. Taulukkoon 7 on koottu joitakin BPA:ta hajottavia bakteereita. Lobos ym. (1992) eristivät muovitehtaan jäteveden lietteestä bakteerin (MV1), joka pystyi hajottamaan BPA:ta kyllästyneestä jätevedestä 80–90 % kolmessa tunnissa. Pääasiallisina hajoamistuotteina hydroksibentsoehappo ja 4-hydroksiasetofenoni, tunnistettiin 4- jotka mineralisoituivat tai liittyivät solujen hiileen. Noin 20 % BPA:sta hydroksyloitui 2,2-bis(4hydroksifenyyli)-1-propanoliksi ja 2,3-bis(4-hydroksifenyyli)-1,2-propaanidioliksi. Kangin ja Kondon (2002a) tekemässä kokeessa viisi jokivedestä eristettyä bakteeria hajottivat BPA:ta, mutta hajotustehokkuus vaihteli: bakteerit hajottivat 28–91 % lisätystä BPA:sta (1 mg/l). Tehokkaimmat hajottajat olivat Pseudomonas sp. ja Pseudomonas putida. Molempien BPA:n hajotustehokkuus oli noin 90 %. Hapettomissa olosuhteissa BPA:n hajoamista ei havaittu. Oshiman ym. (2007) eristivät 500 maanäytteestä bakteereita, joista yksi pystyi hajottamaan 100 mg/l BPA:ta määritysrajan alapuolelle 6–48 tunnissa kasvatusliuoksesta riippuen. Kyseessä oli ennestään tuntematon Sphingomonassuvun laji, joka nimettiin S. bisphenolicumiksi (AB191723). Lämpötilalla, veden laadulla (merivesi tai jokivesi) ja bakteerien määrällä on todettu olevan vaikutusta BPA:n biohajoavuuteen (Kang ja Kondo 2002b, Danzl ym. 2009). Kangin ja Kondon (2002b) tutkimuksissa BPA hajosi jokivesistä otetuista näytteistä 15 päivän aikana alle määritysrajan (0,005 mg/l) 20 ja 30 ºC:een lämpötilassa, mutta 4 ºC:ssa BPA:sta hajosi vain 20 %. Taulukko 7: BPA:ta hajottavia bakteereita. Bisfenoli A:n hajottaja Eristyslähde Lähde Sphingomonas sp., kanta BP-7 merivesi Sakai ym. 2006 tuntematon bakteeri, kanta MV1 jätevesiliete Lobos ym. 1992 Sphingomonas bisphenolicum (kanta maaperä Oshiman ym. 2006 Pseudomonas sp. jokivesi Kang ja Kondo 2002a Pseudomonas putida jokivesi Kang ja Kondo 2002a AO1) 32 4.2. HHCB Polysyklisiä myskejä, joihin HHCB (1,3,4,6,7,8-heksahydro-4,6,6,7,8,8- heksametyylisyklopenta- -2-bentsopyraani, kuva 7) kuuluu, käytetään pääasiassa hajusteena kosmetiikassa, pesuaineissa ja raikastimissa. HHCB on myskiyhdisteistä eniten käytetty. Sen kauppanimiä ovat ainakin Abbalide, Chromanolide, Galaxolide ja Pearlide. Taulukossa 8 on esitetty HHCB:n ominaisuuksia (Balk ja Ford 1999a, EU Risk Assesment Report – HHCB 2008). CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Kuva 7: HHCB:n rakennekaava Taulukko 8: HHCB:n ominaisuuksia Ominaisuus Arvo ja suure Lähde CAS 1222-05-5 Molekyylikaava C18H26O Molekyylipaino 258,41 g/mol Olomuoto (NTP) viskoosi neste EU RAR – HHCB 2008 Liukoisuus veteen (NTP) 1,75 mg/l Balk ja Ford 1999a Sulamispiste -10–0 ºC EU RAR – HHCB 2008 Kiehumispiste 160 ºC (4 mm Hg), 330 ºC (760 mm Hg) EU RAR – HHCB 2008 Leimahduspiste > 100 ºC EU RAR – HHCB 2008 Log KOW 5,9 Balk ja Frod 1999a Log KOC 4,86 Balk ja Frod 1999a Vaarallisuusluokittelu N (R50/53) EU RAR – HHCB 2008 4.2.1. Valmistus ja käyttö Vuonna 2000 HHCB:tä valmistava tehdas tuotti Euroopassa 1000–5000 tonnia, josta noin 63 % meni vientiin EU:n ulkopuolelle. Suurin osa HHCB:stä laimennetaan orgaaniseen liuottimeen (esim. dietyyliftalaatti) heti valmistuksen jälkeen. Vuonna 2004 HHCB:tä käytettiin Euroopan 17 maassa 1307 tonnia ja aiempina vuosina (1992–2003) jonkin verran enemmän. Tärkein HHCB:n käyttökohde on pesuaineet, joihin käytetään noin 25 % valmistetusta HHCB:stä. Henkeä kohden HHCB:tä käytettiin Pohjois-Euroopassa vuonna 2000 arviolta 6,0 mg/päivä ja Etelä-Euroopassa 19,8 mg/päivä. Vuodesta 1995 lähtien on 33 polysyklisten myskien käyttöä hajusteaineena pyritty systemaattisesti vähentämään niiden ympäristöriskien takia. Kysynnän hiipuminen on vaikuttanut myös HHCB:n valmistukseen (EU RAR – HHCB 2008). 4.2.2. Päästöt ja esiintyminen vesistöissä Jätevesissä HHCB-pitoisuudet vaihtelevat paljon riippuen mm. asukastiheydestä ja ympäröivästä teollisuudesta. Tärkein lähde on kuitenkin talouksien päästöt ja teollisuudella on todettu olevan vain vähäisesti merkitystä (Clara ym. 2011). Euroopassa on mitattu sisäänmenevästä ja ulostulevasta jätevedestä taulukon 9 mukaisia HHCB-pitoisuuksia. Taulukko 9: jätevedessä. Maa Raportoituja HHCB-pitoisuuksia sisäänmenevässä HHCB mg/l ja ulostulevassa Lähde Sisäänmenevä jätevesi Ulostuleva jätevesi Itävalta <0,0014 0,0068 <0,0008 0,0011 Clara ym. 2011 Saksa 0,0019 0,0007 Bester 2004 Sveitsi 0,0044 0,0008 Kupper ym. 2006 Vain pieni osa HHCB:stä hajoaa jäteveden käsittelyssä, suurin osa jää lietteeseen ja loput päätyvät puhdistetun jäteveden mukana vesistöihin (Bester 2004, Clara ym. 2010). Erään tutkimuksen (Bester 2004) mukaan noin puolet HHCB:stä jää lietteeseen, noin 7 % hajoaa mm. HHCB-laktoniksi ja noin 37 % päätyy muuttumattomana vesistöihin. Kyseinen tutkimus tehtiin keräämällä näytteitä aktiivilietelaitoksen (n. 50 % yhdyskuntajätevettä ja n. 50 % panimoteollisuuden jätevettä) vedestä esiselkeytyksen jälkeen ja ennen laskemista jokeen, sekä mädättämön lietteestä (lieteikä 20 päivää). Vuonna 2002 kartoitettiin pohjoismaisessa yhteistyöhankkeessa myskiyhdisteiden esiintymistä. HHCB:tä löytyi mm. jätevesilietteistä Tanskan Roskildesta 26,6 mg/kg ja Viikin jätevedenpuhdistamolta 6,1 mg/kg (SYKE 2004). Pintavesistä on myös pystytty määrittämään vaihtelevia määriä HHCB:tä, jotka usein ovat suuruudeltaan alle 0,0001 mg/l (Balk ja Ford 1999a), mutta myös suurempia (mm. 0,00159 mg/l) pitoisuuksia on mitattu (Fromme ym. 2001). 34 4.2.3. Haittavaikutukset vesieliöille HHCB on rasvaliukoinen yhdiste, jonka on todettu kertyvän mm. kalojen kudoksiin. Sillä on todettu olevan antiestrogeenisiä vaikutuksia ainakin seeprakaloilla tehdyssä in vivo kokeessa (Schreurs ym. 2004). Taulukkoon 10 on koottu arvoja HHCB:n myrkyllisyydestä vesieliöille. Pienin pitoisuus, joka ei aiheuta haittaa (PNEC) vesieliöille, on HHCB:lle 0,0068 mg/l (Balk ja Ford 1999b). Taulukko 10: HHCB:n myrkyllisyys vesieliöille (Balk ja Ford 1999b). Myrkyllisyysvaikutus Testikohde Latinankielinen nimi Pitoisuus NOEC (72 h) Levä Pseudokirchneriella subcapitata 0,201 mg/l NOEC (21 h) NOEC (21 h) NOEC (36 d) PNEC Selkärangattomat (vesikirppu) Kalat (aurinkoahven) Kalat (mutu, toukkavaihe) vesieliöt Daphnia magna 0,111 mg/l Lepomis macrochirus 0,093 mg/l Pimephales promelas 0,068 mg/l 0,0068 mg/l 4.2.4. Biohajoaminen Mikään bakteeri ei nykytietämyksen mukaan hajota HHCB:tä. Sen sijaan joillakin sienillä on todettu olevan kyky hajottaa HHCB:tä mm. HHCB-laktoniksi. Balkin ja Fordin (1999a) tekemän tutkimuksen mukaan parhaiten hajotustyötä teki Cladosporium cladosporiodes; viikossa 81 % ja neljässä viikossa 95 %. Kyseessä on yleisesti ympäristössä esiintyvä sieni. Kyseisen tutkimuksen huonoiten HHCB:tä pilkkova sieni hajotti sekin 43 % HHCB:stä 12 viikossa. Sienten on todettu kykenevän hajottamaan HHCB:tä myös muissa tutkimuksissa (mm. Martin ym. 2007). Tutkimukset on tehty lähinnä puhdasviljelmillä ja hyvin hallituissa olosuhteissa. 4.3. Jäteveden haitta-aineiden määrittäminen Usein tutkittavia haitta-aineita on vesissä hyvin pieniä määriä, jopa suuruusluokkaa ng/l. Näin pienten määrien analysoimiseksi on näytteestä poistettava analysointia inhiboivat tekijät, joita jätevedessä on runsaasti, sekä konsentroitava näyte. Jätevesille on käytetty mm. bisfenoli A:n määrittämiseksi esikäsittelynä kiinteäfaasiuuttoa (SPE) ja sen jälkeistä kaasukromatogafi-massaspektrometriaa (CG-MS) (Ballesteros ym. 2006, Gatidou ym. 2006). 35 4.3.1. Kiinteäfaasiuutto Kiinteäfaasiuutto perustuu SPE-patruunoiden täytemateriaalin (stationäärifaasin) kykyyn pidättää itseensä analysoitavat aineet fysikaalis-kemiallisten voimien (mm. van der Waals) avulla. Täytemateriaali on pakattu usein ruiskua muistuttavaan patruunaan ja sen koostumus valitaan analysoitavan aineen mukaan. Täytemateriaali voi olla esimerkiksi kvartsi- tai polymeerijohdannainen. SPE:ssä on tavallisesti seuraavat vaiheet: 1. patruuna alustetaan sopivalla liuottimella, 2. näyte suodatetaan patruunan läpi ja patruuna huuhdotaan (analysoitava aine jää patruunaan), 3. patruuna kuivataan vetämällä ilmaa sen läpi, 4. aine(et) eluoidaan sopivalla reagenssilla, 5. saatu näyte konsentroidaan haihduttamalla typpivirrassa (Berrueta ym. 1995, Ballesteros ym. 2007). 4.3.2. Kaasukromatografia Kaasukromatografian (GC) avulla voidaan erottaa toisistaan orgaanisia, haihtuvia yhdisteitä (VOC). Tekniikka perustuu kromatografialaitteen kapillaarissa olevaan inerttiin liikkuvaan faasiin ja stationäärifaasiin, joka reagoi tutkittavan yhdisteen eri komponenttien kanssa muuttaen niiden kulkeutumisnopeutta kapillaarin sisällä. Eri yhdisteet tulevat kapillaarista ulos eri aikaan ja ne voidaan siten erottaa toisistaan. Massaspektrofotometria (MS) erottaa aineet toisistaan niiden molekyylipainon perusteella. Time-of-flight (TOF) -MS perustuu molekyylin varauksen ja painon suhteeseen, joka vaikuttaa molekyylien kulkeutumisnopeuteen sähkökentässä. Nämä kaksi menetelmää yhdistettynä parantavat erotusherkkyyttä huomattavasti ja vain vähän toisistaan eroavat aineet saadaan erilleen. Menetelmän avulla voidaan tunnistaa esimerkiksi haitta-aineiden hajoamistuotteita, joiden avulla voidaan tutkia hajoamisreittejä (EPA 2011). 36 KOKEELLINEN OSA 5. Materiaalit ja menetelmät 5.1. Bioreaktorin pystyttäminen ja ylläpito Diplomityössä koottiin kaksi eri kantoainetta sisältävää bioreaktoria, jotka molemmat koostuivat kahdesta sarjaan kytketystä kantoaineilla pakatusta kolonnista (kuvat 8 ja 9). Ensimmäisiin kolonneihin syötettiin alakautta jätevettä lasipullosta peristalttisen pumpun (Watson Marlow, 205S) avulla nopeudella 0,35 rpm (n. 0,5 ml/min). Pumpun kautta kulkeva letku (Marprene Manifold Tubing, ID 2,54 mm; OD 4,14 mm) liitettiin Tygon®-letkuun (Saint-Gobain Performance Plastics, ID 3,2 mm; OD 6,4 mm). Reaktoreista toinen pakattiin Konva-Centerin tuottamilla puulastuilla (männyn ja kuusen seos, kuva 10 a) ja toinen Clewer Oy:n muovisilla (HDPE) kantoainekappaleilla (kuva 10 b ja c), jotka halkaistiin terävällä veitsellä kahteen osaan. Kantoainekappaleet halkaistiin jotta kappaleiden tehollinen pinta-ala saatiin suuremmaksi ja vastaavasti reaktorin sisäseinämien pinta-ala kantoaineeseen nähden pienemmäksi. Kokonaisten kantoainekappaleiden tehollinen pinta-ala oli 650 m2/m3. Puolikkaita kantoainekappaleita lisättiin reaktoreihin kumpaankin kolonniin 120 kpl. Kantoainepuulastuja lisättiin reaktoreihin siten, että koko reaktorin tila täyttyi, mutta lastuja ei tiivistetty painamalla. Puulastujen tehollista pinta-alaa ei ollut määritetty. Kunkin kolonnin tilavuus tyhjänä oli 250 ml ja täytettynä noin 70 % tästä. ulostuleva jätevesi Arvoja yhdelle kolonnille: Tilavuus: 250 ml verkko Täyttöaste: n. 70 % (puulastuille) Virtaama: n. 0,5 ml/ min (720 ml/d) BOD-kuorma (1. reaktorit): n. 68 mg/d kantoainepatja Sisäänmenevä jätevesi ilma Kuva 8: Reaktorin prosessikaavio (samanlainen molemmilla reaktoreilla). 37 Reaktorit toimivat huoneen lämmössä noin kolme kuukautta aikavälillä 28.6. 30.9.2010. Jätevettä säilytettiin kylmässä (+4 ºC), josta se päivittäin (ei viikonloppuna) siirrettiin lämpiämään vähintään neljäksi tunniksi ennen reaktoreihin syöttämistä. Syötettävä jätevesi haettiin noin viikon välein (ks. taulukko 11) Suomenojan jätevedenpuhdistamolta esiselkeytysaltaiden loppupäästä. Reaktorit ja jäteveden syöttöastia peitettiin foliolla levän kasvun ja haitta-aineiden mahdollisen fotolyyttisen hajoamisen estämiseksi. Taulukko 11: Jäteveden hakupäivät ja haitta-aineen syötön aloitus. Vrk Vko JV haettu Vrk edellisestä alusta alusta (pvm.) -15 n. - 2 14.6. Reaktorin käynnistys 29.6. 6 5.7. 9 n.1 15 14.7. 9 n. 2 23 8 n. 3 22.7. 34 11 n. 5 2.8. 42 8 6 10.8. Haitta-aineiden syötön aloitus 17.8. (49 vrk/ 7 vko alusta) 51 9 n. 7 19.8. 59 8 n. 8 27.8. 70 10 10 6.9. 79 10 n. 11 16.9. 90 11 n. 13 27.9. Näytteenotto pvm. 12. 13.8. 1.9. 14.9. a R1 R2 Kuva 9: Puulastulla täytetty reaktori (R1) sekä muovisilla kantoainekappaleilla täytetty reaktori (R2). 38 a c b Kuva 10: puulastukantoainetta (a); muovikantoainekappaleita kantoainekappaleessa kasvaa pinnalla biofilmiä (c). (b); alemmassa 5.1.1. Ilmastus Reaktoreiden riittävä hapen saanti taattiin ilmastamalla akvaariopumpuilla (Rena Air 100 ja Rena Air 300, Mars Fishcare Inc.) syötettävää jätevettä, jossa oli myös magneettisekoitus, sekä syöttämällä ilmaa ensimmäisiin kolonneihin. Reaktoreiden sisään syötettävä ilma hajotettiin akvaarioon tarkoitetulla ilmakivellä ja ilmavirtausten nopeudet säädettiin rotametrien (Kyrtölä Instruments) avulla arvoon 120 l/h. Rotametrien avulla voitiin myös seurata ilman virtausta. Jos ilmavirtaus laski alle 80 l/h, imettiin poistoletkusta ilmaa tasaisesti 50 ml ruiskulla kunnes tukokset aukesivat ja ilmavirtaus palautui asetettuun arvoon. 5.1.2. Lämpötilan, pH:n ja liuenneen hapen mittaus Lämpötila mitattiin päivittäin (ei viikonloppuisin) sekä ilmasta, että syötettävästä jätevedestä. pH ja liuenneen hapen määrä mitattiin (Orion, 720A; InnoLab, Oxi730) yhdestä kolmeen kertaa viikossa syötettävästä jätevedestä ja molempien reaktoreiden ulostulevasta vedestä. Ulostulevaa jätevettä kerättiin noin viisi millilitraa 50 ml:n putkeen, josta liuennut happi ja pH mitattiin välittömästi magneettisekoitusta käyttäen. 5.1.3. Kemialliset analyysit Jotta voitiin arvioida reaktoreiden toimivuutta jätevedenpuhdistuksessa, otettiin kokeen aikana näytteitä kemiallisia analyysejä varten. Näytteet toimitettiin Metropolilabiin analysoitavaksi. Myös syötettävä jätevesi analysoitiin samanaikaisesti. Taulukossa 12 on esitetty teetettyjen analyysien menetelmät. 39 Taulukko 12: Kemialliset analyysimenetelmät (Metropolilab). Analyysi Menetelmä Sameus SFS-EN ISO 7027:2000 Biologinen hapenkulutus, BOD7ATU SFS-EN 1899-1:1998 Kemiallinen hapenkulutus, CODCr ISO 15705:2002 Ammonium-typpi (NH4-N) ISO 7150: 1984 Nitraatin ja nitriitin summa, (NO2+NO3) Metropolilab (Sisäinen menetelmä, Aquakem) Kokonaistyppi (N) 11905-1 (C2) SFS-EN ISO Kokonaisfosfori (P) Metropolilab (Sisäinen menetelmä, Aquakem) Orgaanisen hiilen kokonaismäärä, TOC SFS-EN 1484:1997 Liuenneen orgaanisen hiilen määrä, SFS-EN 1484:1997 DOC Vesinäytteistä analysoitiin kiintoaine tai sameus (näytemäärät eivät aina riittäneet kiintoaineen mittaamiseen), biologinen hapenkulutus (BOD7ATU), kemiallinen hapenkulutus (CODCr), ammoniumtyppi (NH4-N), kokonaistyppi (N) ja kokonaisfosfori (P). Viimeisimmästä näytteenotosta määritettiin myös nitraatin ja nitriitin summa (NO2 + NO3), orgaanisen hiilen kokonaismäärä (TOC) sekä liuenneen orgaanisen hiilen määrä (DOC). Näytteitä otettiin neljä kertaa, joista ensimmäinen näytteenotto sisälsi vain sisään syötettävän jäteveden. Viimeisessä näytteenotossa (30.9.) kerättiin vettä myös ensimmäisten kolonnien ulostulevasta vedestä. Ensimmäinen jätevesinäyte analysoitiin 1,5 viikkoa ennen reaktorien käynnistämistä. Seuraavat näytteenottokerrat viikkoina reaktorin käynnistämisestä/ haitta-aineen syöttämisestä olivat seuraavat: 1/- vrk (5.7.), 9/ 2 (31.8.) sekä 13/ 6,5 (30.9.). 5.1.4. Haitta-aineiden syöttäminen Haitta-aineiden syöttö aloitettiin, kun reaktori oli ollut käynnissä 7 viikkoa. Bisfenoli A:ta (Aldrich, 239658-50G) ja HHCB:tä (SAFT, W52.060-8) lisättiin 2 mg/l ja 0,050 mg/l, tässä järjestyksessä. Molemmista tehtiin ensin kantaliuokset asetoniin (ks. liite 3), koska yhdisteet liukenevat veteen huonosti. Kantaliuoksia (BPA: 20 g/l ja HHCB: 2,5 g/l) pipetoitiin ensin lasiputkeen 100 µl (BPA) ja 20 µl (HHCB) litraa jätevettä kohden. Lasiputken neste siirrettiin lasisella pipetillä jäteveden syöttöpulloon. Sekä pipetti, että lasiputki huuhdottiin vielä 40 syöttöastiasta otetulla jätevedellä, joka palautettiin syöttöastiaan. Ajan ja tilan rajallisuuden vuoksi haitta-aineet syötettiin samanaikaisesti. 5.2. Reaktoreista Näytteenotto ja -säilytys kerättiin kokeen aikana näytteitä, jotka säilytettiin jatkotutkimusmenetelmästä riippuen joko 4 °C:ssa, -20 °C:ssa, tai -80 °C:ssa myöhempää käsittelyä varten. Näytteenottotaulukossa (liite 4) on luetteloitu kaikki DNA:n eristystä ja DAPI-värjäystä varten otetut näytteet. VTT:lle pystytetyistä reaktoreista otettiin näytteet ennen haitta-aineiden syöttämistä sekä noin kahden ja neljän viikon kuluttua haitta-aineiden syötön aloittamisesta. 5.2.1. Vesinäytteet Vesinäytteet otettiin DAPI:a ja DNA:n eristystä varten sisäänmenevästä jätevedestä sekä kummankin reaktorin (R1; puulastu ja R2; muovikantoaine) molempien kolonnien ulostulevasta vedestä. DNA:n eristystä varten näytettä suodatettiin 30– 40 ml Sterivex™-suodattimen (Millipore, SVGP01050) läpi. Suodattimet jäädytettiin nopeasti joko nestetypessä (-196 ºC) (AGA) tai kuivajäillä (-79 ºC) (AGA) ennen siirtämistä säilytykseen -80 ºC:een. DAPI-värjäystä varten otettiin 4,5 tai 9 ml näytteitä, joihin lisättiin kestävöintiainetta (10 % fosfaattipuskuroitu glutaraldehydi, ks. liite 3) 1:10. Näytteitä säilytettiin 4 ºC:ssa värjäykseen asti. Värjäys tehtiin alle kahden vuorokauden sisällä näytteenotosta. Lisäksi otettiin kustakin näytteenottopisteestä ylimääräinen näyte mahdollisia jatkotutkimuksia varten. Nämä pakastettiin ja säilytettiin -20 ºC:ssa. Haitta-aineanalyysejä varten otettiin 200 ml:n näyte sisään syötettävästä jätevedestä sekä 300 ml:n näytteet ulostulevista vesistä (R1.2 ja R2.2). Näytteet säilytettiin puolen litran lasipulloissa -20 ºC:ssa kyljellään, jotta vältyttiin pullojen rikkoutumiselta. Ennen kiinteäfaasiuuttoa näytteet otettiin sulamaan jääkaappiin (4 ºC) uuttoa edeltävänä päivänä. Kemiallisia analyysejä varten näytteitä kerättiin 500–1000 ml muovipulloihin. Näytteet otettiin pääasiassa 2. reaktoreiden ulostulevista vesistä, mutta viimeiseen analyysipakettiin näytteet kerättiin myös ensimmäisten kolonnien (R1.1 ja R2.1) jälkeen. Näytteet toimitettiin mahdollisimman nopeasti (viimeistään seuraavana päivänä) Metropolilabiin analysoitaviksi. 41 5.2.2. Kantoainenäytteet Kantoainenäytteitä otettiin ensimmäisessä näytteenotossa jokaisesta kolonnista noin viiden senttimetrin syvyydeltä. Päältä siirrettiin syrjään kantoainetta, joka palautettiin reaktoriin näytteenoton jälkeen. Kantoaineita lisättiin näytteenoton jälkeen otettuja näytteitä vastaavat määrät. Lastuja otettiin DNA:n eristystä varten 15 ml:n muoviputkiin (Corning, 430052) kantoainekappaleita samanlaisiin putkiin noin 5 ml ja muovisia noin kuusi kappaletta. Näytteet jäädytettiin nopeasti nestetypessä tai kuivajäillä ja säilytettiin 15 ml muoviputkissa -80 °C:ssa. Seuraavalla näytteenottokerralla vältettiin ottamasta lisättyä kantoainetta. Lisätyn lastukantoaineen erotti vanhemmasta kantoaineesta värin perusteella (uusi oli selkeästi vaaleampaa). Lisättyjä muovisia kantoaineita ei halkaistu, jolloin uudet pystyi erottamaan alkuperäisistä. Lisäksi otettiin -20 ºC:seen ylimääräisiä näytteitä mahdollisia jatkotutkimuksia varten. 5.3. Lahdessa Vertailureaktorit Lahdessa Helsingin yliopiston ylläpitämät Clewer Oy:n muovisilla kantoainekappaleilla täytetty pyörivä laboratoriomittakaavan bioreaktori (kuva 11 a) sekä Konva-Centerin Eko-Matic Willa harmaavesipuhdistin (kuvat 11 b ja c) toimivat vertailureaktoreina. Näistä haettiin vesi- ja kantoainenäytteitä kolmesti tutkimuksen aikana: kerran ennen haitta-aineiden syöttämistä ja kahdesti haittaaineiden syöttämisen jälkeen. 42 a b c Kuva 11: Lahden vertailureaktorit: Clewer Oy:n kantoaineilla täytetty pyörivä bioreaktori (a); Konva-Centerin pilottimittakaavan biosuodatin (b) ja biosuodattimen yläosasta otettu lähikuva (c). Konva-Centerin Eko-Matic Willa pilottimittakaavan jätevedenpuhdistusreaktoreita oli sarjassa kaksi, joista ensimmäiseen syötettiin kahdesti päivässä 10 minuutin ajan yläkautta keinotekoista harmaavettä (resepti, ks. liite 3) nopeudella noin 5 l/min. Veden oli tarkoitus simuloida todellista harmaavesipäästöä esimerkiksi kesämökeillä. Vesi valui kantoainepatjan läpi ensimmäisen reaktorin alaosaan, josta se pumpattiin toisen reaktorin yläosaan. Molempien reaktorien tilavuus oli noin 350 litraa. Erillistä ilmastusta ei ollut. Kolme sarjassa olevaa pyörivää bioreaktoria (kuva 11 a) oli täytetty Clewer Oy:ltä saaduilla kantoainekappaleilla (kuva 10 b). Kunkin reaktorin tilavuus oli noin 4,5 litraa ja täyttöaste 75 %. Syötettävän jäteveden (esiselkeytetty jätevesi: Lahti Aqua) virtaus oli 1,1 1,3 ml/min (n. 1,6 1,9 l/d). Haitta-aineet (BPA ja HHCB) syötettiin 43 jatkuvalla pumppauksella siten, että pitoisuudet jätevedessä olivat 1 mg/l (BPA ja 50 µg/l (HHCB). Kantoainekappaleet pyörivät reaktoreiden sivusta syötettävän ilman vaikutuksesta. Lahden reaktoreista otettiin näytteet kerran ennen BPA:n ja HHCB:n syöttämistä, ja kahdesti haitta-aineiden syöttämisen aloituksen jälkeen (kolmen- ja kymmenen viikon kuluttua). Vesinäytteet harmaavesireaktorista otettiin sisäänmenevästä ja molempien reaktoreiden ulostulevasta vedestä. Kantoainenäytteet otettiin molemmista reaktoreista sekä 10 cm, että 30 cm syvyydeltä. Pyörivästä bioreaktorista otettiin sekä vesi- että kantoainenäytteet kunkin reaktorin päällä olevista putkista. Näytteet säilytettiin kuten VTT:n reaktoreista otetut näytteet. 5.4. Laboratorioanalyysit DAPI-värjäyksen avulla voitiin visuaalisesti tarkastella jätevedessä esiintyvien mikrobien määrää ja monimuotoisuutta. Sen avulla voitiin myös laskea jäteveden solumäärät sekä verrata sisäänmenevän jäteveden ja ulostulevan veden solumääriä. Sterivex™-suodattimista sekä kantoaineista eristettiin kokonais-DNA:t PCRDGGE-analyysiä varten. DGGE-geelistä eristettiin useita juosteita, joista yhteensä 33 saatiin puhdistettua sekvensointia varten. 5.4.1. DAPI-värjäys DAPI-värjäys tehtiin jätevesinäytteille Kepneriä ja Prattia (1994) mukaillen. Määrityksessä käytetyt reagenssit on esitetty liitteessä 3. Kaikki reagenssit ja ionivaihdettu (Millipore, Milli-Q®) vesi suodatettiin ennen käyttöä 22 µm ruiskusuodattimella (Whatman, FP30/0,2 CA-S). Värjäystä ennen 0,45 ml:aan näytettä lisättiin 0,05 ml dispergointiainetta (0,1M tetranatriumpyrofosfaatti), sekoitettiin (Vortex-Genie 2) ja annettiin inkuboitua pimeässä, huoneen lämmössä kymmenen minuutin ajan. Koottiin suodatuslaitteisto (Millipore) ja membraanisuodattimet (Millipore, Isopore™ membrane filters, 0,2 µm GTTP) kostutettiin suodattamalla niistä läpi millilitra steriiliä ionivaihdettua vettä ilmasuodattimen (Piab, Classic) avulla. Suodatinlaitteen suppilossa sekoitettiin 5 ml steriiliä vettä, 0,5 ml näytettä ja 50 ml DAPI-käyttöliuosta (liite 3). Suodatinlaitteisto peitettiin foliolla ja annettiin DAPI:n vaikuttaa noin 20 minuuttia huoneenlämmössä, jonka jälkeen suoritettiin alipainesuodatus. Suodattimet 44 huuhdottiin lopuksi kaksi kertaa 1 ml:lla steriiliä vettä. DAPI-värjätty suodatin siirrettiin aluslasille pienen immersioöljytipan (Leica, 11513861) päälle. Suodattimen päälle laitettiin peitinlasi, jonka ylä- ja alapuolelle laitettiin myös tippa immersioöljyä. Suodattimia tarkasteltiin mahdollisimman pian (alle 2 vrk) värjäyksen jälkeen epifluoresessimikroskoopilla (Olympus, BX60) satakertaisella suurennoksella DAPI-värille tarkoitetun suodattimen (360 nm) läpi. Jokaisesta suodattimesta kuvattiin CellP-ohjelman avulla useita (10–20) näkökenttiä. Solut laskettiin Analysis-ohjelmalla niistä näytteistä, joissa oli arviolta alle 300 solua näkökentässä (esim. kuva 12). Kuva 12: DAPI-värjäyskuva mikrobisolujen laskemista varten. 5.4.2. DNA:n eristys PCR:ää varten eristettiin -80 °C:ssa säilytetyistä näytteistä genomi-DNA:ta. Kantoainelastuista DNA eristettiin PowerSoil™ -kitillä (MoBio). Clewerin kantoainekappaleille ja Sterivexeille™ (Millipore), joiden läpi vesinäytteet oli suodatettu, käytettiin PowerBiofilm™ -kittiä (MoBio). Näytemäärä DNA:n eristyksessä oli 0,2–0,4 g lastuja, yksi noin kymmeneen osaan skalpellilla pilkottu kantoainekappale tai Sterivex™-suodattimen noin 50 osaan skalpellilla leikattu suodatinpaperi. 5.4.3. PCR-DGGE PCR-reaktioon käytettiin F968GC (5’-cgc ccg ggg cgc gcc ccg ggc ggg gcg ggg gca cgg ggg gaa cgc gaa gaa cct tac-3’) ja R1401 (5’-cgg tgt gta caa gac cc-3’) alukkeita (Nübel ym. 1996), jotka on suunniteltu monistamaan eubakteerien 16S rRNA geenin 433 emäksen mittainen sekvenssi emäsparista 968 emäspariin 1401. 45 PCR:n kokonaistilavuus oli 50 µl, joka sisälsi 3 yksikköä Dynazyme II polymeraasientsyymiä ja 150 µmol/l entsyymille tarkoitettua valmista 10x puskuria (Finnzymes), 200 µmol/l dNTP:tä (Finnzymes), kumpaakin aluketta 0,2 µmol/l (Sigma), steriiliä vettä (Sigma) sekä templaattina 1 µl eristettyä DNA:ta per näyte. Positiivisena PCR-kontrollina ja DGGE kontrollina käytettiin pro gradu työssä (Wallenius 2000) valmistettua DGGE-markkeria. DNA-pitoisuudet mitattiin ennen PCR:ää Nanodrop-laitteella (Thermo Scientific). Tulokset vaihtelivat 2-40 µg/ml välillä. PCR-ohjelma oli seuraavanlainen: (1) 5 min 94 ºC; (2) 30 s 94 ºC; (3) 20 s 50 ºC; (4) 40 s 72 ºC; (5) 35 kertaa kohdat (2)-(4); (6) 7 min 72 ºC. PCR suoritettiin Eppendorfin Mastercycler gradient -laitteella. PCR-tuotteen koko tarkistettiin 1,2 %:lla agaroosigeelillä (SeaKem), joka värjättiin SybrSafe (Invitrogen) väriaineella ja kuvattiin Bio-Radin kuvantamislaitteella (Gel Doc™ XR+). Mukaan otettiin kokomarkkerit (Fermentas, SM0243), joihin vertaamalla PCR-tuotteen oikea koko varmistettiin. DGGE-analyysissä käytettiin 8 % polyakryyliamidigeeliä, jossa oli 38–60 % denaturoiva urea-formamidi-gradientti (ks. luku 3.2.4). Gradienttigeeli (liite 3) valmistettiin vetokaapissa Bio-Radin gradienttilaitteella ja pumpun (Bio-Rad, Econo pump) kierrosnopeudella 4,5 rpm. Gradienttigeelin päälle valettiin lisäksi matala kerros denaturoimatonta polyakryyliamidigeeliä. Geelin annettiin polymerisoitua noin kaksi tuntia ennen näytteiden lataamista. Geelin kaivoihin pipetoitiin ohuilla geelipipetinkärjillä (Alpha Laboratories Ltd, LW1100) 10 µl PCR-tuotetta ja 1 µl kuusikertaista latausväriliuosta (liite 3). DGGE suoritettiin DCode™ Universal Mutation Detection System -laitteella (Bio-Rad) (kuva 13) 60 °C:isessa 0,5xTAE-puskurissa (1:100 50xTAE, Bio-Rad). Jännite säädettiin aluksi 200 V:iin kymmeneksi minuutiksi, jonka jälkeen se laskettiin 85 V:iin 20 tunniksi. Sähkövirta säädettiin 400 mA:ksi. Laitteessa oleva puskuri lämmitettiin 60 °C:seen ennen näytteiden lataamista ja sähkövirran käynnistämistä. 46 Kuva 13: DGGE-ajolaite ja virtalähde (Bio-Rad). Valmis geeli värjättiin DNA:han kiinnittyvällä Sybr® Green I -värillä (Lonza, 50513). 10 ml:aan Milli-Q®-vettä lisättiin 1,2 µl väriä. Seos pipetoitiin tasaisesti geelin päälle ja annettiin vaikuttaa huoneenlämmössä, pimeässä noin 20 minuuttia. Ylimääräinen väriaine poistettiin ja geeli huuhdottiin Milli-Q® -vedellä. Geeli kuvattiin Bio-Radin Gel Doc XR+ kuvantamislaitteella käyttäen Quantity One® ohjelmaa. Geelin juosteet leikattiin talteen 0,5 ml:n mikrosentrifugiputkiin, joihin lisättiin 36 µl steriiliä vettä (Sigma). DNA:n annettiin liueta veteen +4 ºC:ssa yön yli. Liuennutta DNA:ta käytettiin templaattina (6 µl) uuteen PCR-ajoon, jonka lopputuote analysoitiin DGGE:llä kuten edellä. Jos geelillä näkyi vain yksi juoste, oli näytteestä onnistuttu eristämään haluttu DNA, joka voitiin lähettää sekvensoitavaksi, eli kopioidun DNA:n emäsjärjestys voitiin selvittää. Sekvensointiin saatiin yhteensä 33 näytettä, joista kolme oli Lahdessa toimivasta Clewerin kantoaineilla täytetystä bioreaktorista ja loput VTT:llä pystytetyistä reaktoreista. 5.4.4. PCR-tuotteen puhdistus ja sekvensointi PCR-tuote, josta DGGE:llä näkyi vain yksi juoste, puhdistettiin (Omega bio-tek, E.Z.N.A.™ Cycle-Pure Kit) ja toimitettiin sekvensoitavaksi VTT:n sisäiseen sekvensointipalveluun, jossa sekvensointi suoritettiin ABI Prism® 3100/3100Avant Genetic Analyzer -laitteella (Applied Biosystems). Vastauksena saatiin sähköisessä muodossa eristetyn DNA-jakson emäsjärjestys, joita voitiin verrata ja 47 käsitellä Genius Pro 5.1.6 -ohjelmalla. Sekvenssejä verrattiin Muscle-algoritmiin perustuvalla menetelmällä. Genius Pro 5.1.6 -ohjelmalla tehtiin saaduista sekvensseistä myös fylogeneettinen puu. Puuhun otettiin mukaan sekvensoitujen bakteereiden lisäksi bakteereita, joilla ohjelman suorittaman Blastn-haun perusteella oli samankaltainen sekvenssialue sekä joitakin kirjallisuuden perusteella BPA:ta hajottavien bakteerien sekvenssejä. 5.4.5. Kiinteäfaasiuutto (SPE) BPA:n ja HHCB:n määrittämiseksi kerätyistä jätevesinäytteistä tehtiin kiinteäfaasiuutto (SPE), jonka menetelmäohje oli koottu Helsingin yliopiston ympäristöekologian laitoksella Lahdessa Ballesterosta (2006), Moorsia (2007) ja Gatidouta (2007) mukaillen. Uutetut näytteet lähetettiin analysoitaviksi Helsingin yliopistolle Lahteen. Uuttoa ennen näytteiden pH säädettiin neutraaliksi (pH 6-8) jonka jälkeen ne suodatettiin (ei kontrollinäytteitä) lasikuitusuodattimien läpi; ensin GF/A:n (Whatman) ja sitten GF/C:n (Whatman) läpi. Osa suodattimista säilytettiin lasiputkissa -20 °C:ssa lisätutkimuksia (haittaaineiden määritys suodattimiin jääneistä kiintoaineista) varten. Näytteisiin lisättiin natriumkloridia (Merck, 1.06404.1000) 3 g/100 ml, metanolia (Merck, 1.06011.2500) 1 ml/100 ml sekä sisäisiä standardeja, BPA-d16 (Aldrich, 451835) ja Fenantreeni-d10 (Aldrich, 364622), taulukossa 13 olevien määrien mukaisesti. Sisäisiä standardeja lisättiin sen verran kuin näytteissä arvioitiin olevan tutkittavia aineita. Kontrollinäytteisiin lisättiin myös BPA:ta 6200 ng/20 ml ja HHCB:tä 800 ng/20 ml. 48 Taulukko 13: Sisäisten standardien lisätyt määrät ja vastaavat konsentraatiot. Ajon Näyte Tilavuus BPA-d16 Phe-d10 Konsentraatiot (µg/l) (ng) nro (ml) (ng) BPA-d16 Phe-d10 1 JV 12.8. 76 235 155 3 2 2 R1 12.8. 65 3234 325 50 5 2 R2 12.8. 100 4998 500 50 5 1 JV 13.9. (1) 20 4998 500 250 25 1 JV 13.9. (2) 20 4998 500 250 25 1 R1 13.9. 100 4998 500 50 5 1 R2 13.9. 100 4998 500 50 5 2 JV 28.9. 20 8232 * 825 * 412 41 2 R1 28.9. 100 4998 500 50 5 2 R2 28.9. 100 4998 500 50 5 1 Nolla 1 100 309 200 3 2 2 Nolla 2 100 309 200 3 2 1 Kontrolli 1 20 1470 100 74 5 2 Kontrolli 2 20 1470 100 74 5 *Näytteessä JV 28.9. sisäisiä standardeja lisättiin liikaa. Määrät on huomioitu tietokoneohjelman pitoisuuslaskuissa. Näytteitä suodatettiin seuraavasti: 100 ml kaikkia muita näytteitä, paitsi 20 ml kontrollia sekä sisäänmenevää jätevettä, johon oli tehty haitta-ainelisäys. Kahteen näytteeseen (JV 12.8. ja R1 12.8.) ei riittänyt oikeaa (100 ml) näytemäärää, mikä on huomioitu laskuissa. Uutossa käytettiin kuvan 14 mukaista vakuumikammiota, johon kytkettiin vesiimu, sekä Strata™-X polymeeripatruunoita (200 mg, 6 ml) (Phenomenex). SPEuutto suoritettiin vetokaapissa. Patruunat alustettiin 6 ml:lla metanolia (Merck, 1.06011.2500) yön yli. Alustuksen tarkoituksena oli kosteuttaa ja tasapainottaa patruunoissa oleva stationäärifaasi, jotta molekyylit pääsisivät mahdollisimman tasaisesti kosketuksiin faasin kanssa. Esisuodatetut näytteet suodatettiin pienellä imulla (alipaine 0,2 0,3 bar) SPE-patruunoiden läpi, jonka jälkeen näyteastiat huuhdottiin pienellä määrällä ionivaihdettua vettä, joka kaadettiin patruunaan. Patruunoita kuivattiin ensimmäisellä uuttokerralla noin 15 minuuttia ja toisella kerralla yli 30 minuuttia, koska havaittiin, että vettä jäi patruunoihin ensimmäisen uuton jälkeen melko paljon. Vesi häiritsee GC/MS-TOF-laitteella tehtävää haittaainemääritystä. Näytteet eluoitiin 20 ml lasiputkiin (Kimax) lisäämällä 10 ml dikloorimetaania (Merck, 1.06044.2500) ja 10 ml etyyliasetaattia (Merck, 49 83621.320), tässä järjestyksessä. Kuva 14: SPE-patruunat ja vakuumikammio. Nestettä haihdutettiin typpivirrassa lämpimässä (noin 50 ºC:ista hanavettä) vesihauteessa, kunnes tilavuus oli noin 1,5 ml. Ylimääräinen vesi poistettiin lisäämällä putkiin kidevedetöntä natriumsulfaattia (Merck, 1.06639.0500) niin paljon, että irtonaisia kiteitä saattoi havaita putken pohjalla. Veden saattoi myös havaita liuottimen joukosta ja suurimmat määrät poistettiin ennen suolan lisäämistä lasisella pasteurpipetillä. Näytteet siirrettiin mahdollisimman tarkasti kromatografiaputkiin (Agilent, 5182-0716) varoen kuitenkin ottamasta mukaan suolaa. Uutetut näytteet lähetettiin Lahteen analysoitavaksi GC/MS-TOFmenetelmällä. 5.4.6. Nesteuutto SPE-uuttoa edeltäneessä esisuodatuksessa suodatinpapereille jääneistä kiintoaineista uutettiin tutkittavat haitta-aineet nesteuutolla. Pakastimessa (-20 ºC) lasipulloissa säilytetyt suodatinpaperit sulatettiin huoneenlämmössä. Suodatinpapereille lisättiin sisäisiä standardeja (BPA-d16 ja Fenantreeni-d10) ja pulloihin etyyliasetaattia siten, että paperit peittyivät (n. 15 ml). Putkia pidettiin 50 ultraäänihauteessa 10 minuutin ajan, jonka jälkeen niitä ravisteltiin (250 rpm) noin tunnin ajan. Etyyliasetaatit siirrettiin uusiin lasipulloihin ja edellä kuvattu käsittely toistettiin dikloorimetaanilla. Lopuksi liuottimet yhdistettiin ja haihdutettiin typpivirran avulla noin viiden millilitran tilavuuteen. Näytteistä poistettiin vesi suodattamalla näytteet natriumsulfaatilla täytettyjen lasisten pasteurpipettien läpi. Kuivauksen jälkeen näytetilavuudet säädettiin haihduttamalla noin millilitraksi. Näytteet toimitettiin kromatografiaputkissa Helsingin yliopistolle Lahteen analysoitavaksi. 5.4.7. GC/MS-TOF Helsingin yliopiston Ympäristöekologian laitoksella oli Lahdessa pystytettynä menetelmä BPA:n ja HHCB:n analysoimiseksi kaasukromatokrafilla (GC) (Agilent) ja TOF (time-of-flight) -massaspektrofotometrilla (TOF-MS) (Waters, GCT Premier™). Käytetty kolonni (Zebron, ZB-5MS) oli pituudeltaan 30 m ja halkaisijaltaan 0,25 mm. Tulokset oli laskettu (Hy, Tiina Mononen) annettujen sisäisten standardien määrien perusteella MassLynx-ohjelman avulla. Kontrolleista saatiin lisätyistä haitta-aineista ulos BPA:n osalta noin 100 % ja HHCB:n osalta noin 60 %. 51 6. Tulokset ja tulosten tarkastelu 6.1. Reaktorien toiminta Noin puolentoista kuukauden ajan reaktorit toimivat hyvin, eikä niiden ylläpitämiseksi tarvinnut tehdä muuta kuin lisätä syötettävää jätevettä. Puulastuilla pakattuun reaktoriin (R1) muodostui silmillä havaittavia oikovirtauksia, mikä oli odotettavissa ajatellen veden taipumusta valita helpoin reitti. Muovisilla kantoainekappaleilla täytetyn reaktorin (R2) ilmastus oli silmämääräisesti tasaista. Noin 50 vuorokautta kokeen aloituksesta reaktorit alkoivat ajoittain tukkeutua, mikä johtui todennäköisesti jäteveden kiintoaineen kertymisestä ja bakteerimassan kasvamisesta. Puulastuilla täytetty reaktori tukkeutui herkemmin kuin muovikappaleilla täytetty. Tukkeumat aukaistiin työntämällä 50 ml:n ruiskulla ilmaa ilmastusletkun kautta. Pienikin paine riitti aukaisemaan tukokset. Ilman virtausta seurattiin rotametrien avulla. Tukkeumia avattiin seitsemän viikon jälkeen noin kolme kertaa viikossa ja viimeisen kuukauden aikana lähes päivittäin. Anaerobisia muodostuvien olosuhteita esiintyi ilmakanavien todennäköisesti takia (paikallisia) sekä puulastukantoaineeseen tukkeutumien takia (hetkellisiä). 6.1.1. Kemialliset analyysit Reaktorien tehokkuutta jäteveden puhdistajina mitattiin erilaisilla kemiallisilla analyyseillä (liite 5, kuvat 15 ja 16). Saatujen tulosten mukaan reaktorit vähensivät tehokkaasti biologista ja kemiallista hapenkulutusta sekä poistivat ravinteita. Poistotehokkuudet eri näytteenottokerroilla on esitetty taulukossa 14. Taulukko 14: Reaktoreiden poistotehokkuudet eri näytteenottokerroilla tärkeimpien parametrien osalta. Poistoprosentit R1 (puulastukantoaine) R2 (muovikappalekantoaine) Viikkoa aloituksesta 1 9 12 1 9 12 BOD7ATU 94 96 80 95 94 76 CODCr 74 81 42 77 82 74 NH4-N 12 80 57 12 87 75 kokonais-N 22 22 47 20 40 43 kokonais-P 94 94 81 88 92 83 52 Ammoniumtypen määrä putosi havaittavasti vasta kolmannella näytteenottokerralla, jolloin reaktorit olivat olleet toiminnassa 9 viikkoa ja haittaainetta syötetty 2 viikkoa. Ammoniumtypen väheneminen viittaa nitrifikaatioon. Nitrifikaatiosta kertoo myös kuva 16, josta voidaan havaita että sisäänmenevässä jätevedessä ei ole nitraatti- ja nitriittityppeä, toisin kuin ulostulevissa vesissä. Reaktorien välillä ei esiintynyt merkittäviä eroja toiminnan suhteen. Kemiallisten analyysien perusteella puulastulla täytetty reaktori (R1) toimi hieman paremmin kuin muovikappaleilla täytetty reaktori (R2). Haitta-aineilla ei oleteta olleen merkittävää vaikutusta reaktorien ravinteiden tai BOD:n poistotehokkuuteen. a BOD-7ATU 140 300 120 250 100 mg/l mg/l b CODCr 350 200 150 80 60 100 40 50 20 0 0 vko 1 c vko 9 vko 13 vko 0 d Kokonaisfosfori 5 vko 9 vko 13 vko 9 vko 13 Ammoniumtyppi 70 60 4 50 3 mg/l mg/l vko 1 2 40 30 20 1 10 0 0 vko 0 e vko 1 vko 9 vko 13 vko 0 vko 1 Kokonaistyppi 100 JV sisään mg/l 80 60 JV ulos, muovi 40 JV ulos, puu 20 0 vko 0 vko 1 vko 9 vko 13 Kuvat 15: Kemialliset analyysit (Metropolilab) kokeen aikana. Biologinen hapenkulutus (a), kemiallinen hapenkulutus (b), kokonaisfosfori (c), ammoniumtyppi (d) ja kokonaistyppi (e). X-akselilla näytteenottokerrat viikkoina jäteveden syötön aloittamisesta. 53 300 80 250 200 60 150 40 100 20 COD-Cr (mg/l) mg/l 30.9.2010 näytteenotto (vko 13) 100 50 0 0 JV sisään NH4-typpi R1.1 NO2+NO3 R1.2 R2.1 Kok-N TOC R2.2 DOC CODCr Kuva 16: Viimeinen näytteenottokerta, jossa ovat mukana näytteet kummankin reaktorin ensimmäisistä (R1.1 ja R2.1) ja toisista (R1.2 ja R2.2) kolonneista. Kuvasta 17 voidaan myös havaita, että reaktorit toimivat hyvin. Kokonaistypen poisto ei ollut jätevedenpuhdistamon veroista, koska reaktoreissa ei ollut erillistä anaerobivaihetta. Myöskään biofilmiin ei muodostunut riittävästi hapettomia olosuhteita, jotta denitrifikaatiota olisi voinut tapahtua. Työn tavoitteiden kannalta ravinteiden poistotehokkuudella ei kuitenkaan ole vaikutusta. Tehokas fosforinpoistuminen saattaa osittain johtua saostumisesta kiintoaineeseen ja osittain bakteereihin sitoutumisesta. Fosforia sitovat bakteerit tarvitsevat vuorotellen hapettomat ja hapelliset olosuhteet. Tällaiset olosuhteet ovat voineet syntyä varsinkin kokeen loppuvaiheessa, kun tukkeutuneita reaktoreita jouduttiin avaamaan. Puhdistustehoja (30.9.2010, vko 13) 100 % 90 % 80 % 70 % 60 % 50 % 40 % 30 % 20 % 10 % 0% Kok-N Kok-P BOD Puhdistusteho R1.1 Puhdistusteho R1.2 Puhdistusteho R2.1 Puhdistusteho R2.2 Puhdistusteho SO (2008, ka) EU:n vaatimus Kuva 17: Reaktorien puhdistustehoja (kokonaistyppi, kokonaisfosfori ja BOD) viimeisimpään näytteenottoon perustuen sekä vertailukohteena Suomenojan jätevedenpuhdistamo ja EU:n asettamat määräykset (EU:n direktiivi 91/271/ETY). 54 6.1.2. Lämpötila, pH ja liuennut happi Koe tehtiin huoneen lämmössä loppukesällä (heinä–lokakuu). Noin viikon ajan kokeen puolivälissä lämpötila kohosi helteistä johtuen lähelle 25 ºC:ta, mutta pysyi muuten noin kahdessakymmenessä asteessa (ks. taulukko 15). Sisään menevän jäteveden pH vaihteli arvojen 5,2 ja 8,4 välillä. Molemmissa reaktoreissa tapahtui pH:n alenemista, mikä viittaa mm. nitrifikaatioon. Keskimäärin molemmat reaktorit alensivat pH:ta yhtä paljon, mutta R1:ssä, aleneman vaihtelut olivat huomattavasti suuremmat kuin R2:ssa. Tämän perusteella R2:n toiminta oli tasaisempaa kuin R1:n, mikä taas johtui todennäköisesti R1:n kokeen aikana ilmenneistä ilmastusongelmista ja sitä kautta nitrifioivien bakteerien ajoittain liian vähäisestä hapen saannista. Taulukossa 15 on esitetty lämpötilan, pH:n ja liuenneen hapen tilastoidut arvot kokeen aikana. Kuvissa 18 a c ovat mitatut arvot lämpötilalle, pH:lle ja liuenneelle hapelle kokeen aikana. Taulukko 15: Tilastoidut lämpötilan, pH:n ja liuenneen hapen (O2) arvot. Lämpötila (ºC) pH O2 (mg/l) Ilma JV sisään JV sisään R1 ulos R2 ulos JV sisään R1 ulos R2 ulos Minimi 18,6 13,7 5,2 4,1 4,2 4,8 5,9 6,2 Maksimi 24,5 24,7 8,4 7,3 7,3 10,1 11,7 11,8 20,9 20,1 - - - 7,6 8,5 8,3 1,2 2,2 - - - 1,3 1,1 1,2 Keskiarvo Keskihajonta 55 a 30 Lämpötila (°C) 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Aika (viikkoa alusta) T (ilma) pH b T (jätevesi) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 10 12 14 Aika (viikkoa alusta) JV sisään c R1.2 ulos R2.2 ulos 14 12 O2 (mg/l) 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 Aika alusta (vrk) JV sisään R1.2 ulos R2.2 ulos Kuvat 18 a c: Lämpötilan, pH:n ja liuenneen hapen mittaustulokset kokeen aikana. 56 6.2. Haitta-aineanalyysit Syöttöveteen lisätystä bisfenoli A:sta ja HHCB:stä saatiin määritettyä vain joitakin prosentteja lisätyistä määristä (taulukko 16). Bisfenoli A:ta lisättiin 2 mg/l eli 2 000 000 ng/l ja enimmillään tästä saatiin määritettyä sisäänmenevästä jätevedestä (JV 28.9.) 91500 ng/l eli noin 4,6 % lisätystä määrästä. Kyseisestä näytteestä ei tutkittu kiintoaineeseen jäänyttä BPA:n osuutta. HHCB:tä lisättiin 50 µg/l eli 50 000 ng/l, josta saatiin määritettyä enimmillään 1,8 %. Kontrolleista saatiin määritettyä BPA:n osalta noin 100 % lisätystä määrästä ja HHCB:nkin osalta yli puolet. Kuvissa 19 a ja b on esitetty määritetyt pitoisuudet suhteutettuna kontrollien saantoihin. Osasta näytteistä tutkittiin nesteuutolla oliko BPA:ta ja HHCB:tä tarttunut esisuodattimiin jääneeseen kiintoaineeseen. Varsinkin HHCB:n osalta havaittiin, että sisäänmenevässä jätevedessä, jossa on enemmän kiintoainetta kuin ulostulevissa vesissä, on kiintoaineeseen jäävän aineen osuus huomattava (ks. kuva 19 b). Myös aiemmat tutkimukset (mm. Bester, 2004; Clara, 2010) tukevat tätä käsitystä. Taulukko 16: SPE- ja nesteuuton jälkeisellä GC/MS-TOF-määrityksellä saadut haittaainetulokset. Ajon nro Näyte 1 JV 12.8.1 (vko 6) 1 Tilavuus (ml) BPA (ng/l) HHCB (ng/l) 76 3840 380 65 1120 <5 2 R1 12.8. 2 R2 12.8.1 100 1110 <5 1 JV 13.9.(1)1 (vko 11) 20 4150 + 3900 2 60 + 850 2 1 JV 13.9.(2)1 20 6700 90 1 R1 13.9. 1 100 850 230 1 R2 13.9. 1 100 1590 100 2 JV 28.9. (vko 13) 20 91500 700 2 R1 28.9. 100 1130 + 1220 2 70 + 90 2 2 R2 28.9. 100 1230 + 1790 1 Nolla 1 100 900 <5 2 Nolla 2 100 650 <5 1 Kontrolli 1 20 334750 22180 2 2 290 + 410 Kontrolli 2 20 1354400 26940 Näyte sulatettu kahteen kertaan 2 SPE-uuton tulokset + nesteuuton tulokset (muissa vain SPE-uutto) Saanto-% BPA/ HHCB 0,4/ 1,8 0,3/ 0,2 4,6/ 1,4 - 2 104/ 56 100/ 67 1 57 a Bisfenoli A 1,E+05 ng/L 8,E+04 6,E+04 4,E+04 2,E+04 0,E+00 JV 12.8. R1 12.8. R2 12.8. BPA (SPE) (ng/l) JV 13.9. (1) JV 13.9. (2) R1 13.9. R2 13.9. JV 28.9. BPA (nesteuutto) (ng/l) b R1 28.9. R2 28.9. BPA yhteensä ng/l HHCB 1200 1000 ng/l 800 600 400 200 0 JV 12.8. R1 12.8. R2 12.8. HHCB nesteuutto (ng/l) JV 13.9. (1) JV 13.9. (2) R1 13.9. HHCB (SPE) (ng/l) R2 13.9. JV 28.9. R1 28.9. R2 28.9. HHCB yhteensä ng/l Kuva 19: Bisfenoli A:n (a) ja HHCB:n (b) pitoisuudet kolmessa eri näytteenotossa. Näytteistä JV 13.9. (1), R1 28.9. ja R2 28.9. analysoitiin haitta-ainepitoisuudet myös jäteveden kiintoaineesta. Ensimmäinen näytteenotto (12.8.) tehtiin ennen haitta-aineiden syötön aloittamista. HHCB:n osalta voidaan viimeisessä näytteenotossa (28.9.) havaita, että puulastuilla pakattu reaktori poistaa kemikaalia tehokkaammin kuin muovikappaleilla pakattu reaktori. Kuten aiemmin on todettu, kiintoainetta kertyi kokeen loppupuolella niin runsaasti, että tukkeumia jouduttiin avaamaan paineilman avulla. Puulastuilla täytetty reaktori tukkeutui herkemmin kuin muovikantoaineilla täytetty. Haittaaineiden sitoutuminen reaktorissa olevaan kiintoaineeseen on mahdollinen selitys pitoisuuksien laskulle. Osasta näytteistä (12.8. ja 13.9. näytteenotot) jouduttiin uutto tekemään kahteen kertaan, koska näytepullot olivat vuotaneet matkalla analysoitaviksi Lahteen. Tästä johtuen kyseiset näytteet myös jouduttiin sulattamaan ja jäädyttämään kahteen kertaan, millä saattaa olla vähäistä vaikutusta tuloksiin. 58 Koska kontrolleista saatiin BPA:n osalta 100 % ja HHCB:n osalta noin 60 % analysoitua, on lisäysvaiheessa, haitta-aineiden hävikki esisuodatuksessa tai tapahtunut nesteuutossa. todennäköisesti Kontrolleista ei joko tehty esisuodatusta, koska ne eivät sisältäneet kiintoainetta. Jatkossa esisuodatus olisi syytä tehdä myös kontrolleille, jotta pystyttäisiin sulkemaan pois mahdollisuus haitta-aineiden tarttumisesta suodattimiin. Lisätyt haitta-aineiden määrät olivat 200 µl BPA:ta (20 mg/ml) ja 40 µl HHCB:tä (2,5 mg/ml) kahteen litraan jätevettä. Lisätyt määrät olivat niin pieniä, että pienikin pipetointivirhe on voinut aikaansaada suuren virheen analysoiduissa tuloksissa. Kantaliuoksista on mahdollista jatkossa tehdä laimennos suoraan esimerkiksi dikloorimetaaniin, ja tämän pitoisuus voidaan selvittää Lahdessa GC/MS-TOF:llä. Haitta-ainemäärityksiä varten näytteet kerättiin vuorokauden aikana ja sisäänmenevästä vedestä otettiin näyte myös noin vuorokauden kuluttua haittaaineiden lisäämisestä. Ainakin BPA:n hajoamista saattoi tapahtua ennen näytteenottoa, jolloin tutkittavan näytteen pitoisuus on alkuperäistä pitoisuutta pienempi. 13.9. näytteenotossa näytteet kerättiin viikonlopun aikana, joten hajoamista on ehtinyt tapahtua lähes kolmen vuorokauden ajan. HHCB:n pieniä saantopitoisuuksia ei voida selittää hajoamisella, sillä se hajoaa tutkimusten (mm. Bester, 2004) mukaan huonosti. 6.3. Mikrobien määrä Jäteveden bakteerit esiintyvät usein rykelminä, joita on vaikea hajottaa. DAPI värjäysten perusteella varsinkin sisäänmenevästä jätevedestä oli vaikea laskea soluja, koska ne esiintyivät suurina epähomogeenisina ryppäinä (kuva 20 a). Ulostulevasta jätevedestä solut olivat helpommin laskettavissa (kuva 20 b). 59 b b a Kuva 20: DAPI-värjäys sisään menevästä jätevedestä (a) ja ulostulevasta (R2.2) vedestä (b). Solumääriä laskettiin vesinäytteistä seuraavan kaavan avulla: B= N · Af d · V · G · Ag , missä B = solujen lukumäärä kpl/ml, N = laskettujen solujen summa, Af = suodattimen tehollinen ala = 283,53mm2, d = laimennoskerroin = 0,81 (9/10 · 9/10), V = suodatetun näytteen tilavuus = 0,5 ml, G = laskettujen näkökenttien lukumäärä, Ag = näkökentän pinta-ala = 0,01673 mm2 tai 0,00568168 mm2. Kuvassa 21 on esitetty lasketut solut kahdesta näytteenotosta. Lukuja voidaan pitää suuntaa-antavina ja niiden perusteella voidaan todeta, että mikrobimäärä vähenee jätevedessä sen kulkeutuessa reaktoreiden läpi. Ero saattaa todellisuudessa olla laskettuja solumääriä suurempi, koska solujen ollessa ryppäinä useassa kerroksessa niiden määrä helposti aliarvioidaan. Mikrobimäärän lasku johtuu mikrobien rikastumisesta reaktoreiden biofilmiin, sitoutumisesta muuhun kiintoaineeseen ja joutumisesta reaktorissa olevien muiden mikrobien hajottamiksi. 60 x 10^6 solua/ml Solujen määrät jätevesissä 35 30 25 20 15 10 5 0 JV sisään R1.1 R1.2 vko 6 (12.8.) R2.1 R2.2 vko 9 (1.9.) Kuva 21: Laskettuja solumääriä. 6.4. Ennen Mikrobidiversiteetti denaturoivaa gradienttigeelielektroforeesia (DGGE) agaroosigeeli- elektroforeesilla tarkistettiin, että PCR-tuotetta oli monistunut tarpeeksi, ja että tuote oli oikean kokoista (433 emäsparia). Koko tarkistettiin vertaamalla näytteitä markkeriin (Fermentas), joka sisälsi tunnetun kokoisia DNA-pätkiä. DGGEgeeleistä leikatuista juovista lähes kaikista (60:sta) tehtiin uusi PCR ja DGGE, jonka avulla tarkistettiin, että oli saatu eristettyä yhtä bakteerikantaa edustava juova. Yhteensä 33 juovaa saatiin puhdistettua ja sekvensoitua - tosin kaksi sekvenssiä jouduttiin hylkäämään niiden huonon laadun vuoksi. Suurin osa sekvensoiduista näytteistä oli VTT:llä pystytetyistä reaktoreista ja vain kolme Lahden vertailureaktoreista, koska ajan rajallisuuden vuoksi haluttiin keskittyä varsinaisen tutkimuskohteena olevien reaktoreiden bakteeridiversiteetin tutkimiseen. Jatkossa on mahdollista puhdistaa ja sekvensoida loput DGGE:stä saadut DNA-palat. Kuvissa 22 ja 23 on esitetty punaisilla nuolilla kaikki juovat, joista saatiin sekvenssitiedot. Kuvissa näkyvät juovat edustavat eri bakteerilajeja. Juovan tummuus saattaa kuvastaa bakteerilajin dominoivuutta, mutta se voi johtua myös kyseisen DNA-juosteen tehokkaammasta monistumisesta PCR:ssä. DGGE:tä ei voida pitää kvantitatiivisena menetelmänä. 61 - 1 2 4 7 10 11 12 3 5 8 6 9 3. näytteenotto, vko 11 M R1.2 R2.1 R 2.2 Vesi 3 R1.1 R1.2 R2.1 R 2.2 M 2. näytteenotto, vko 9 Vesi 2 R1.1 M Vesi 1 R1.1 R1.2 R2.1 R 2.2 1. näytteenotto, vko 6 - 13 15 14 16 17 - 18 19 20 - 21 22 23 24 sekvensoidut juosteet Kuva 22: Sekvensoidut juosteet (punaiset nuolet) kolmesta eri näytteenotosta reaktoreista R1.1, R1.2 (puulastut kantoaineena), R2.1 ja R2.2 (muovikappaleet kantoaineena). Ensimmäisen näytteenoton R2.1 (muovikantoaine) näytteessä (kuva 22) dominoivaa bakteeria edustaa juova numero 7. Sama bakteeri esiintyi R2.1:ssä toisessa (juova 16) ja todennäköisesti myös kolmannessa näytteenotossa sekä myös puulastuissa (R1.2 juova 22). Emäsjärjestyksen perusteella kyseinen bakteeri on läheinen (samankaltaisuus 99,7 %) Asidobakteereihin kuuluvan Solibacter-suvun bakteerin kanssa. Puulastuilla täytetyn reaktorin toisessa kolonnissa (R1.2) erottuu muita selvemmin edellä mainitun bakteerin (juova 22) lisäksi juovat 13 ja 21, jotka ovat keskenään samoja. Ne ovat tutkitun sekvenssialueen perusteella lähimpänä (samankaltaisuus 95,7 %) Asidobakteereihin kuuluvaa Acidobacterium-suvun edustajaa. Asidobakteerit ovat tyypillisesti maaperässä esiintyviä bakteereita. Niiden eri lajit eroavat toisistaan sekä geneettisesti, että metabolialtaan (Quaiser ym. 2003, Jones ym. 2009). Asidobakteereita on löydetty myös teollisuuden jätevesistä (Layton ym. 2000, La Prada ym. 2000). Ajan suhteen VTT:n reaktorien muovikantoaineiden (R2) pinnalle rikastuva mikrobipopulaatio pysyy melko samana. Joitakin muutoksia voidaan havaita, mutta dominoivat juovat pysyvät samoina eri ajankohtina. Esimerkiksi R2.2:ssa rikastuva bakteeri (juovat 10 ja 24, kuva 22 ja taulukko 18, s. 69–70) rikastuu samalla tavalla 62 kaikissa näytteenotoissa myös ennen haitta-aineiden lisäystä. Kyseessä on - proteobakteereihin kuuluva Rhizobium-suvun bakteeri, jonka voidaan olettaa tulevan muita paremmin toimeen niukkaravinteisessa ympäristössä. Samankaltainen tutkimustulos on saatu Baban (2009) tutkimuksessa, jossa eristettiin jätevedenpuhdistuksen loppupään vesinäytteestä Rhizobium-sukuun kuuluva bakteeri, näytteenottoa jota jätevedelle ei havaittu oli tehty sisäänmenevässä mm. jätevedessä. suodatus, Ennen UV-käsittely ja käänteisosmoosikäsittely. Puukantoaineiden (R1) mikrobipopulaation sen sijaan voidaan todeta muuttuvan hieman eri näytteenottokertojen välillä. Esimerkiksi juova nro 13 (sama kuin nro 21) ei esiinny ensimmäisessä näytteenotossa ennen haitta-aineiden lisäämistä. Reaktoreihin syötettävä vesi on eri erää jokaisella näytteenottokerralla, mikä voi vaikuttaa näytteiden eroihin ajan suhteen. Esimerkiksi viimeisen näytteenoton R1.1:n juova, joka on samassa kohtaa vedestä eristetyn bakteerin (juova 18) kanssa, on todennäköisesti peräisin kyseisestä vesierästä. Pääosin kantoaineista löydetyt bakteerit eivät kuitenkaan ole samoja kuin vesistä löydetyt, vaan säilyvät samoina läpi koejakson veden bakteereista riippumatta. Eri kantoaineiden (puulastu ja muovi) välillä dominoivat bakteerit edustavat pääosin eri lajeja. Voidaan siis olettaa, että kantoainemateriaalilla on vaikutusta bakteeripopulaation muodostumiseen. Myös reaktorien eri kolonnien välillä esiintyy eroja. Tämä käy ilmi etenkin muovisilla kantoaineilla pakatun reaktorin osalta (kuva 22). Ensimmäisessä kolonnissa (R2.1) esiintyy useampia dominoivia bakteerilajeja kuin toisessa (R2.2), jossa vain yksi juova erottuu selvästi. Tämän perusteella voidaan olettaa ensimmäisissä kolonneissa hajotustoiminnan olevan monipuolisempaa kuin jälkimmäisissä kolonneissa, mikä tukee aiemmin tehtyä oletusta siitä, että helposti hajoavat aineet hajoavat ensimmäisissä kolonneissa. Myös Lahden vertailunäytteet antavat samansuuntaisia tuloksia. Kuvasta 23 nähdään, että muovisten kantoaineiden kohdalla ero ensimmäisen ja viimeisen reaktorin välillä on huomattava: ensimmäisessä reaktorissa on runsaasti biofilmiin rikastuneita bakteerilajeja ja viimeisessä selvästi muovikantoaineiden pinnalta saatiin eristettyä yksi vähemmän. - ja yksi Lahden -bakteereihin kuuluva bakteeri (juovat 25 ja 26). 63 M Vesi R1 R2 R3 M Vesi R1 R2 R3 M 26 27 25 KKA2 30cm KKA2 10 cm KKA1 30 cm KKA1 10 cm HV R2 HV R1 HV M CKA3 CKA2 CKA1 JV R3 JV R2 JV R1 JV M Kuva 23: DGGE-kuva Lahden muovikantoainereaktorista otetuista näytteistä kahdelta ensimmäiseltä näytteenottokerralta (25.5. ja 3.8.). Sekvensoidut juosteet on merkitty nuolilla. Kuva 24: Viimeinen Lahden näytteenotto (21.9.): jätevedet (JV), muovikantoaineet (CKA) kolmesta reaktorista, harmaavedet (HV) ja puulastukantoaineet (KKA) eri syvyyksiltä molemmista reaktoreista. Kuva 24 on viimeisimmän näytteenoton DGGE-kuva Lahden vertailureaktoreista ja niihin syötettävistä jätevesistä. Kuvan näytteistä ei teetetty sekvenssejä. Siitä pystytään kuitenkin havaitsemaan, että kuten VTT:lläkin pystytetyissä reaktoreissa, muovisten kantoaineiden pinnalle rikastuu ensimmäisessä reaktorissa (CKA1) huomattavasti enemmän dominoivia lajeja kuin kahdessa jälkimmäisessä (CKA2 ja CKA3). Puulastujen kohdalla ei suurta eroa ole havaittavissa syvyyden tai eri reaktoreiden suhteen. 64 Taulukkoon 17 on koottu kaikki sekvensoidut juosteet ja mistä sekvensoitu näyte on otettu. Viimeisen sarakkeen sekvenssinumerot vastaavat kuvien 22 ja 23 sekvenssinumeroita 1-27. Taulukko 17: Sekvensoidut näytteet (vrt. kuvat 22 ja 23) Näytteenottokohde Näytteenotto pvm. Sekvensoidut juosteet Sisäänmenevä jätevesi 12.–13.8. (vko 6) 1 Kantoaine (lastu) R1.1 12.–13.8. (vko 6) 3 Kantoaine (lastu) R1.2 12.–13.8. (vko 6) 6 Kantoaine (muovi) R2.1 12.–13.8. (vko 6) 9 Kantoaine (muovi) R2.2 12.–13.8. (vko 6) 10 Sisäänmenevä jätevesi 1.9. (vko 9) 11 12 Kantoaine (lastu) R1.1 1.9. (vko 9) 13 Kantoaine (lastu) R1.2 1.9. (vko 9) 14 15 Kantoaine (muovi) R2.1 1.9. (vko 9) 16 18 Kantoaine (muovi) R2.2 1.9. (vko 9) - Sisäänmenevä jätevesi 14.9. (vko 11) 19 21 Kantoaine (lastu) R1.1 14.9. (vko 11) - Kantoaine (lastu) R1.2 14.9. (vko 11) 22 23 Kantoaine (muovi) R2.1 14.9. (vko 11) - Kantoaine (muovi) R2.2 14.9. (vko 11) 24 Lahti Cw (sisäänmenevä jv.) 25.5. - Lahti Cka1 (reaktori 1) 25.5. - Lahti Cka2 (reaktori 2) 25.5. 25 Lahti Cka3 (reaktori 3) 25.5. - Lahti Cw (sisäänmenevä jv.) 3.8. - Lahti Cka1 (reaktori 1) 3.8. 26 Lahti Cka2 (reaktori 2) 3.8. - Lahti Cka3 (reaktori 3) 3.8. 27 Lahden näytteiden sekvensseistä ei saatu tunnistettua bakteerilajeja. Saatiin kuitenkin selville, että kaksi muovikantoaineissa elävää bakteeria kuuluvat - ja proteobakteereihin, jotka ovat jätevesien tyypillisiä bakteereja. Taulukko 18: Sekvensoituja näytteitä lähinnä olevat geenipankin (GeneBank®) bakteerit (Geneious Pro 5.1.6/ blastn). Juosteen nro 1 2 Eristyslähde Näyte W_1 (1) R1.1_1 (1) Lähin osuma FN421339 Aeromonas sp. DB1, strain DB1 AB101445 Xanthomonas axonopodis, strain: S11 raakaöljyä käsittelevän tehtaan aktiiviliete jäteveden aktiiviliete Samankaltaisuus Luokittelu 99,7 % -proteobakteeri 99,4 % -proteobakteeri 65 Juosteen nro 3 4 5 6 7 (=16= 22) 8 9 10 11 12 13 (=21) 14 15 16 (=7 =22) 17 18 19 20 21 (=13) 22 (=7 =16) Eristyslähde Näyte R1.1_2 (1) R1.2_1 (1) R1.2_2 (1) R1.2_3 (1) R2.1_1 (1) R2.1_2 (1) R2.1_3 (1) R2.2_1 (1) W_2 (2) R1.1_1 (2) R1.2_1 (2) R1.2_2 (2) R2.1_1 (2) R2.1_2 (2) R2.1_3 (2) W_1 (3) W_2 (3) W_3 (3) R1.2_1 (3) R1.2_2 (3) Lähin osuma AB245366 Rhodanobacter lindaniclasticus, strain: Gsoil 3028 AB288571 Uncultured deltaproteobacterium, clone: RPS-IG4 AY500141 Asticcacaulis taihuensis strain T3-B7 gingsengjuuripellon maaperä DQ789034 Uncultured Solibacter sp. clone PC1 Paulinella chromatophora viljelmä jäteveden käsittelylaitos jäteveden käsittelylaitoksen aktiiviliete Sesbania exasperata (kasvi) GQ266405 Aeromonas salmonicida strain PA-283 isäntä: lohi AY689676 Uncultured Verrucomicrobia bacterium clone BPM2_E06 FN689719 Acidobacterium sp. ORAC partial 16S rRNA gene, strain ORAC AJ532705 Uncultured alphaproteobacterium, clone JG34-KF-258 EF516716 Uncultured bacterium clone FCPT546 hapan kaivoksen poistovesisakka (pH 4,16) ritsosfääri DQ789034 Uncultured Solibacter sp. clone PC1 DQ684297 Uncultured bacterium clone OTU303 EU283395 Uncultured gamma-proteobacterium clone AS98 EF219707 Uncultured proteobacterium clone AI1M_F10 AB512203 Uncultured Ralstonia sp., clone: UAB19 FN689719 Acidobacterium sp. ORAC partial 16S rRNA gene, strain ORAC DQ789034 Uncultured Solibacter sp. clone PC1 99,7 % -proteobakteeri 97,9 % -proteobakteeri 98,6 % -proteobakteeri 99,7 % -proteobakteeri 99,7 % asidobakteeri 98,9 % -proteobakteeri 99,5 % ei tunnistettu 99,7 % -proteobakteeri 99,7 % -proteobakteeri 98,8 % verrukomikrobi 95,7 % asidobakteeri 96,7 % -proteobakteeri 99,1 % ei tunnistettu 99,7 % asidobakte eri 93,9 % ei tunnistettu 97,6 % -proteobakteeri 98,9 % proteobakteeri 97,0 % -proteobakteeri 95,7 % asidobakteeri 99,7 % asidobakteeri/ Taihu-järvi, Kiina maaperä DQ422964 Rhizobium sp. Lv6.1Se Luokittelu riisipellon maaperä FN794207 Asticcacaulis sp. strain VA7 FJ263061 Candidatus Nitrotoga sp. enrichment culture clone HAM-1 GQ480074 Uncultured bacterium clone BXHB25 Samankaltaisuus uraanikaivoksen jätekasa ruohomaaperä Paulinella chromatophora viljelmä maaperä membraanibioreak torin aktiiviliete sammalen alainen maaperä (UusiSeelanti) anodin biofilmi ritsosfääri Paulinella chromatophora viljelmä 66 Juosteen nro 23 24 25 26 27 Eristyslähde Näyte R2.2_1 (3) R2.2_2 (3) CKA2 (1) CKA1 (2) CKA3 (2) Lähin osuma Samankaltaisuus Luokittelu 99,2 % -proteobakteeri EF141871 Uncultured gamma-proteobacterium clone NC035 EF203423 Rhizobium sp. Lv1.1Se maaperä isäntä: Sesbania exasperate (kasvi) 99,2 % -proteobakteeri AB252934 Uncultured alpha-proteobacterium Rautaa hapettava biofilmi 98,2 % -proteobakteeri EU283395 Uncultured gamma-proteobacterium clone AS98 EU244149 Uncultured bacterium clone sl3274 membraanibioreak torin aktiiviliete 97,0 % -proteobakteeri Leine-joen sedimentti 95,6 % ei tunnistettu Kuvassa 25 on havainnollistettu sekvensoitujen bakteerien jakaantumista eri pääjaksoihin. Vertailuun ei ole otettu mukaan kolmea Lahden reaktoreista sekvensoitua bakteeria. On myös huomioitava, että kuvaajat on tehty saatujen sekvenssien perusteella, eivätkä siten vastaa todellisia bakteerijakaumia. Niitä voidaan kuitenkin pitää suuntaa-antavina. Kahdesta ensimmäisestä kuvaajasta voidaan havaita, että suurin osa vesinäytteistä saaduista sekvensseistä (yhteensä 5) edusti -proteobakteerien pääjaksoa ja toinen vesinäytteistä löytynyt bakteeriryhmä oli -proteobakteerit. Kumpaakin löytyi myös kantoaineista, mutta vain noin neljäsosa vesinäytteiden määristä. Kantoaineiden yleisin bakteerien pääjakso oli proteobakteerit ja toisiksi yleisin asidobakteerit. Kumpaakaan ei löytynyt vesinäytteiden sekvensseistä. Noin viidesosa sekvensoiduista bakteereista jäi tunnistamatta. Kahdessa seuraavassa kuvaajassa on esitetty puu- ja muovikantoaineiden bakteerit erikseen ja kahdessa viimeisessä on jakauma ensimmäisten kolonnien ja toisten kolonnien bakteereista. Kuvista voidaan havaita, että asidobakteerit ovat jakaantuneet tasaisesti kantoaineesta tai kolonnin järjestysnumerosta riippumatta. Merkittävänä havaintona voidaan pitää -proteobakteerien suurta määrää reaktorien jälkimmäisten kolonnien kantoaineiden pinnalla. Kyseisiä bakteereita ei löydetty lainkaan ensimmäisistä kolonneista tai vesinäytteistä. Puulastuissa esiintyy verrukomikrobeita ja -proteobakteereita, joita ei muovikantoaineen pinnalta saatu sekvensoitua. Vastaavasti -proteobakteeri esiintyy muovikantoaineissa, mutta ei puulastuissa. Puun ja muovin välillä ei kuitenkaan ole merkittävää eroa sekvensoitujen bakteerien osalta. 67 ei tunnistettu 20 % verruko mikro bi 0% asidobakteeri 0% -proteo b. 0% -proteo b. 20 % Vesinäytteistä sekvensoidut bakteerit ei tunnistettu 34 % -proteob. 11% -proteob. 11% -proteo b. 30 % verruko mikro bi 10 % asido bakteeri 20 % -pro teob. 0% -pro teo b. 20 % -pro teo b. 10 % Muovikantoaineiden sekvensoidut bakteerit bakteerit -proteob. 11% ei tunnistettu 34 % -proteob. 22 % -proteob. 0% asidobakteeri 22 % 1. kolonneista sekvensoidut bakteerit -proteob. 16 % ei tunnistettu 10 % -proteob. 0% -proteob. 0% -proteob. 5% Kantoaineista sekvensoidut bakteerit -proteob. 22 % asidobakteeri 22 % -proteob. 5% asidobakteeri 17 % -proteo b. 60 % verrukomikrobi 11% -proteob. 27 % verrukomikrobi 4% -pro teob. 0% verrukomikrobi 0% ei tunnistettu 21% Puuvikantoaineista sekvensoidut ei verruko - tunnistettu 10 % mikro bi 0% asido bakteeri 20 % -pro teo b. 50 % -pro teo b. 10 % -proteo b. 10 % -proteo b. 0% 2. kolonneista sekvensoidut bakteerit Kuva 25: Sekvensoitujen bakteerien jakaumia veden ja kantoaineiden kesken, eri kantoaineiden kesken sekä reaktoreiden ensimmäisten ja toisten kolonnien kesken. Sekvenssitietoja geenipankissa olevien tietojen kanssa vertaamalla koottiin Geneious Pro 5.1.6 -ohjelman avulla fylogeneettinen puu (kuva 26). Puun avulla tunnistamattomia bakteereita voidaan samankaltaisuuden perusteella ryhmitellä 68 pääryhmiin. Gammaproteobakteerit ovat tällä tavoin tarkasteltuna suurin ryhmä sekvensoiduista bakteereista. -proteobakteerit -proteobakteerit -proteobakteerit Kuva 26: Fylogeneettinen puu. Sinisellä fontilla muovikantoaineesta eristetyt bakteerisekvenssit, ruskealla puulastujen bakteerit, vihreällä Lahden vertailureaktorin muovikantoaineen bakteerit ja lihavoidulla mustalla vesinäytteistä eristetyt bakteerisekvenssit. Kursivoidut bakteerit ovat kirjallisuuden mukaan BPA:ta hajottavia bakteereita. 69 7. Johtopäätökset ja jatkotutkimusehdotukset Laboratoriomittakaavan kantoainereaktorien tarkoitus oli toimia diplomityön tutkimusvälineinä. Pääasiallinen tarkoitus oli mikrobidiversiteetin tutkiminen puuja muovikantoaineiden pinnalla kasvavasta biofilmistä. Laitteistoon melko nopeasti muodostuvan kiintoainesakan ja siitä johtuvan osittaisen tukkeutumisen vuoksi vastaavaa laitteistoa ei ole mielekästä pystyttää pidempikestoiselle tutkimukselle. On huomioitava, että pystytetty laitteisto ei vastannut täydenmittakaavan bioreaktoria, eikä koejärjestelyissä ollut tarkoituksena mallintaa kunnallisen jäteveden puhdistusprosessia. Voidaan kuitenkin todeta, että jäteveden BOD7- ja CODCr-arvot alenivat ja reaktoreissa tapahtui nitrifikaatiota. Jätevedestä poistui reaktoreissa myös huomattavan paljon fosforia. Tämän diplomityön tavoitteiden saavuttamiseksi reaktorit toimivat riittävän hyvin. Lämpötilan vaihtelulla ei todennäköisesti ollut oleellista merkitystä mikrobidiversiteettiin. Jatkossa kuitenkin vastaavanlainen koejärjestely kannattaa tehdä vakioidussa lämpötilassa, jotta voidaan sulkea pois lämpötilan vaikutus mikrobien esiintymiseen. Tutkimuksessa voitiin osoittaa, että kantoainereaktorien ensimmäinen ja toinen reaktori, sekä eri kantoaineet eroavat toisistaan mikrobidiversiteetin suhteen. Koska haitta-aine-analyysin avulla ei saatu jäljitettyä kuin murto-osa lisätyistä kemikaaleista, ei voida päätellä onko kantoaineilla eroa haitta-aineiden poistoprosessissa. Oleellinen osa tutkimuksen onnistuneelle loppuunsaattamiselle on haitta-ainemäärityksen ongelmien selvittäminen. Tutkimuksen perusteella ei voida myöskään kertoa, hajottaako jokin reaktoreihin rikastuvista bakteereista lisättyjä haitta-aineita, tai miten HHCB:tä ja BPA:ta mahdollisesti hajottavat mikrobit eroavat toisistaan. Jotta vertailua haitta-aineita pilkkovien mikrobien välillä voitaisiin tehdä, tulisi haitta-aineet syöttää erikseen. Tarkempaa bakteerien luokittelua varten mielenkiintoisimmat DNA-näytteet voitaisiin monistaa käyttäen yksilöidympiä alukkeita DGGE:tä edeltävässä PCR:ssä. Saatujen sekvenssitietojen perusteella jälkimmäisissä reaktoreissa rikastui kantoaineiden pinnalle -proteobakteereita, joiden osuus kasvoi nollasta 50 %:iin. Tämä viittaa siihen, että kyseisessä bakteeriryhmässä on bakteereita, jotka pystyvät hajottamaan huonommin hajoavia yhdisteitä. Löydettyjen -proteobakteereiden 70 lähempi tarkastelu voisi johtaa haitta-aineiden hajottajien jäljille. Myös fluoresenssi in situ -hybridisaatio (FISH) on menetelmänä yleinen mikrobidiversiteetin tutkimisessa ja sen avulla saataisiin paremmin selville eri bakteeriryhmien osuuksia ja jakaantumista biofilmissä. Metagenomiikan avulla voidaan tutkia mikrobiyhteisön koko geenikantaa. Uudet sekvensointitekniikat ja vauhdilla kehittyneet nopeat tietokoneohjelmat mahdollistavat suurten sekvenssitietojen käsittelyn. Koko genomin sekvenssitietojen avulla voidaan tutkia metaboliareittejä ja saada parempaa ymmärrystä aineiden kulkeutumisesta ja hajoamisesta (Martín ym. 2006). Kirjallisuuden mukaan HHCB:tä hajottavat jotkin sienet, joten kyseisten sienten esiintymistä voitaisiin myös tutkia esimerkiksi PCRDGGE-menetelmän avulla. Siihen, kuinka suuri osa haitta-aineista hajoaa bakteerien vaikutuksesta ja kuinka suuri osa tarttuu kiintoaineeseen, ei tässä tutkimuksessa pystytä aukottomasti vastaamaan. Jatkoa ajatellen kannattaisi pyrkiä kehittämään menetelmiä haittaaineiden määrittämiseksi myös kiintoaineesta, johon sisältyvät biofilmi, jäteveden orgaaninen kiintoaine ja kantoaineet. Tässäkin työssä käytetty nesteuuttomenetelmä voisi kehitettynä toimia haitta-aineiden uuttamiseksi kantoaineiden pinnalta kasvavasta biofilmistä. Jotta kantoainemateriaalin osuus haitta-aineita adsorboivana tekijänä voitaisiin selvittää, voitaisiin tehdä vastaavanlainen koejärjestely kantoaineilla, joiden pinnalla ei kasva biofilmiä. 71 LÄHDELUETTELO Alexander, H., Dill, D., Smith, L., Guiney, P ja Dorn, P. 1988. Bisphenol A: acute aquatic toxicity. Environmental Toxicology and Chemistry. Vol 7:1. S. 19 26. Andersson, S., Nilsson, M., Dalhammar, G. ja Rajarao, G.K. 2008. Assessment of carrier materials for biofilm formation and denitrification. Vatten. Vol. 64. S. 201 207. Baba, T., Matsumoto, R., Yamaguchi, N. ja Nasu, M. Bacterial population dynamics in a reverse-osmosis water purification system determined by fluorescent staining and PCR-Denaturing gradient gel electrophoresis. Microbes and environments. Vol. 24:2. S. 163 167. DOI: 10.1264/jsme2.ME09120. Balk, F. ja Ford, R. 1999a. Environmental risk assessment for the polycyclic musks ATHN and HHCB in the EU. I. Fate and exposure assessment. Toxicology Letters. Vol. 111:1–2. S. 57–79 Balk, F. ja Ford, R. 1999b. Environmental risk assessment for the polycyclic musks, AHTN and HHCB. II. Effect assessment and risk characterisation. Toxicology Letters. Vol. 111:1–2. S. 81–94. Ballesteros, O., Alberto Z., Alberto N. ja Jose L.V. 2006. Sensitive gas chromatographic-mass spectrometric method for the determination of phthalate esters, alkylphenols, bisphenol A and their chlorinated derivatives in wastewater samples. Journal of Chromatography A. Vol. 1121:2. S. 154 62. Berrueta, L.A., Gallo, B. ja Vicente, F. 1995. A review of solid phase extraction: Basic principles and new developments. Chromatographia. Vol. 40:7–8. S. 474–483. Bertin, L., Di Giaia, D. Barberio, C., Salvadori, L., Marchetti, L. ja Fava, F. 2007. Biodegradation of polyethoxylated nonylphenols in packed-bed biofilm reactors. Industrial & Engineering Chemistry Research. Vol. 46:21. S. 6681 6687. Bester, K. 2004. Retention characteristics and balance assessment for two polycyclic musk fragrances (HHCB and AHTN) in a typical German sewage treatment plant. Chemosphere. Vol. 57:8. S. 863–870. Bishop P. L., 2003. The effect of biofilm heterogeneity on the metabolic processes. Teoksessa: Wuertz, S., Bishop, P. ja Wilderer, P. (toim.) Biofilms in wastewater treatment. An Interdisciplinary approach. Lontoo, Iso-Britannia: IWA Publishing. S. 125–146. ISBN 1-84339-007-8. Bitton, G. 2005. Wastewater microbiology. 3rd ed. New Jersey, USA: John Wiley & Sons, Inc. 746 s. (Wiley series in ecological and applied microbiology). ISBN 0471-65071-4. Boon, N., De Windt, W., Verstraete, W. ja Top, E.M. 2002. Evaluation of nestedPCR DGGE (denaturation gradient gel electrophoresis) with group-specefic 16S rRNA primers for the analysis of bacterial communities from different wastewater treatment plants. FEMS (Federation of European microbiological Societies) Microbiology ecology. Vol. 39:2. S. 101 112. Brown, T. A. 2006. Gene cloning & DNA analysis An Introduction. 5th ed. Blackwell Publishing. 386 s. ISBN: 1-4051-1121-6. Clara, M., Gans, O., Windhofer, G., Krenn, U., Hartl, W., Braun K., Scharf, S. ja Scheffknecht, C. 2011. Occurrence of polycyclic musks in wastewater and receiving water bodies and fate during wastewater treatment. Chemosphere. Vol. 82:8. S. 1116–1123. 72 Cole, A., Shanehan, J., Semmens M. ja LaPara, T. 2002. Preliminary studies on the microbial community structure of membrane-aerated biofilms treating municipal wastewater. Desalination. Vol. 146:1–3. S. 421 426. Comeau, Y. 2008. Microbial metabolism. Teoksessa: Henze, M., van Loosdrecht, M.C.M, Ekama, G.A., Brdjanovic, D. (toim.) Biological wastewater treatment. Principles, modelling and design. Lontoo, Iso-Britannia: IWA Publishing. S. 32. ISBN: 9781843391883. Davies, D. 2003. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nature Reviews Drug Discovery. [Verkkolehti] Vol. 2, S. 114–122 [Viitattu 19.2.2011]. Saatavissa: http://www.nature.com/nrd/journal/v2/n2/full/ nrd1008.html. Danzl, E., Sei, K., Soda, S., Ike, M. ja Fujita, M. 2009. Biodegradation of Bisphenol A, Bisphenol F and Bisphenol S in Seawater. International journal of environmental research and public health. Vol. 6:4. S. 1472 1484. Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U. ja Wingender, J. 2007. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchimica Acta. Vol. 158:1–2. S. 27. Ekama, G. A. ja Wentzel, C. M. 2008. Nitrogen removal. Teoksessa: Henze, M., van Loosdrecht, M.C.M, Ekama, G.A., Brdjanovic, D. (toim.) Biological wastewater treatment. Principles, modelling and design. Lontoo, Iso-Britannia: IWA Publishing. S. 85 138. ISBN: 9781843391883. EPA United States environmental protection agency. 2011. Gas chromatography. Verkkodokumentti. [Viitattu 31.2.2011]. Saatavissa: http://clu-in.org/ characterization/technologies/gc.cfm. Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivi 2008/105/EY. 2008. Euroopan unionin virallinen lehti. [Verkkolehti]. L 348/84 FI. [Viitattu 12.11.2010]. Saatavissa: http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2008:348:0084: 0097:FI:PDF. Euroopan parlamentin ja neuvoston päätös 2455/2001/EY. 2001. Euroopan yhteisöjen virallinen lehti. [Verkkolehti]. L 331/1 FI. [Viitattu 12.11.2010]. Saatavissa: http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2001:331:0001: 0005:FI:PDF. European Union Risk Assessment Report (EURAR). 4,4'-isopropylidenediphenol (Bisphenol-A). 2003. Publications office. [Verkkodokumentti]. Series: 3rd Priority List. Vol. 37. 290 s. [Viitattu 15.11.2011]. Saatavissa: http://oehha.ca.gov/prop65/crnr_notices/state_listing/data_callin/pdf/EU_bisphen olareport325.pdf. European Union Risk Assessment Report (EURAR). 1,3,4,6,7,8-hexahydro4,6,6,7,8,8-hexamethylcyclopenta- -2-benzopyran. (1,3,4,6,7,8-hexahydro4,6,6,7,8,8-hexamethylin-deno[5,6-C]pyran - HHCB). 2008. Chemical Substances Bureau. [Verkkodokumentti]. 37 s. [Viitattu 15.11.2011]. Saatavissa: http://esis.jrc.ec.europa.eu/doc/existing-chemicals/risk_assessment/SUMMARY/ hhcbsum414.pdf. EU-direktiivi yhdyskuntajätevesien käsittelystä, 91/271/ETY. [Viitattu 12.11.2010]. Saatavissa: http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX: 31991L0271:FI:NOT. Fernández, N., Diaz, E.E., Amils, R. ja Sanz, J.L. 2008. Analysis of microbial community during biofilm development in an anaerobic wastewater treatment 73 reactor. Microbial ecology. Vol. 56:1. S. 121 132. Fisher, S. ja Lerman, L. 1983. DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: Correspondence with melting theory. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 80:6. S. 1579–1583. Fromme, H., Otto, T. ja Pilz, K. 2001. Polycyclic musk fragrances in different environmental compartments in Berlin (Germany). Water research. Vol. 35:1. S. 121–128. Fürhacker, M., Scharf S. ja Weber, H., 2000. Bisphenol A: emission from point sources. Chemosphere. Vol. 41:5. S. 751–756. Gatidou, G., Thomaidis, N.S., Stasinakis, A.S. ja Lekkas, T.D. 2007. Simultaneous determination of the endocrine disrupting compounds nonylphenol, nonylphenol ethoxylates, triclosan and bisphenol A in wastewater and sewage sludge by gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A. Vol. 1138:1 2. S. 32–41. Goodman J.E., McConnell E.E., Sipes I.G., Witorsch R.J., Slayton T.M., Yu C.J., Lewis A.S. ja Rhomberg L.R. 2006. An Updated Weight of the Evidence Evaluation of Reproductive and Developmental Effects of Low Doses of Bisphenol A. Critical Reviews in Toxicology. Vol. 36:5. S. 387 457. Harremoës, P. 2003. Deduction and induction in design and operation of biofilm reactors. Teoksessa: Wuertz, S., Bishop, P. ja Wilderer, P. (toim.) Biofilms in wastewater treatment. An Interdisciplinary approach. Lontoo, Iso-Britannia: IWA Publishing. S. 299–324. ISBN 1-84339-007-8. Heikkinen, E., Korpi, M., Mattila, K., Porali, I., Vihinen, M., 2002. Bioinformatiikan sanasto. [Verkkodokumentti]. CSC Tieteellinen laskenta Oy. [Viitattu 17.1.2011]. Saatavissa: https://extras.csc.fi/biosciences/sanasto/latex/sanasto. pdf. Henze, M. van Loosdrecht, M.C.M., Ekama, G.A. ja Brdjanovic, D. 2008. Wastewater treatment development. Teoksessa: Henze, M., van Loosdrecht, M.C.M, Ekama, G.A., Brdjanovic, D. (toim.) Biological wastewater treatment. Principles, modelling and design. Lontoo, Iso-Britannia: IWA Publishing. S. 1 7. ISBN: 9781843391883. Henze, M. ja Comeau, 2008. Wastewater characrerization. Teoksessa: Henze, M., van Loosdrecht, M.C.M, Ekama, G.A., Brdjanovic, D. (toim.) Biological wastewater treatment. Principles, modelling and design. Lontoo, Iso-Britannia: IWA Publishing. S. 33 52. ISBN: 9781843391883. Huhtamäki, Markku. Juurocon Oy. 2006. Kantoaineet tehostavat puhdistamon toimintaa. Tekniikka ja kunta. [Verkkodokumentti]. Vol. 7. S. 32 35. [Viitattu 14.1.2011]. Saatavissa: http://lehti.kuntatekniikka.fi/sites/default/files/0706.pdf. Jones, R., Robeson, M.m Lauber, C., Hamaday, M., Knight, R. ja Fierer, N. 2009. A comprehensive survey of soil acidobacterial diversity using pyrosequencing and clone library analyses. The ISME Journal. Vol. 3:4. S. 442–453. Kang, J.H., Aasi, D. ja Katayama, Y. 2007. Bisphenol A in the aquatic environment and its endocrine -disturptive effects on aquatic organisms. Critical reviews in toxicology. Vol. 37:7. S. 607 625. Kang, J.H. ja Kondo, F. 2002a. Bisphenol A degradation by bacteria isolated from river water. Archieves of environmental contamination and toxicology. Vol. 43:3. S. 265 269. Kang, J.H. ja Kondo, F. 2002b. Effects of bacterial counts and temperature on the 74 biodegradation of bisphenol A in river water. Chemosphere. Vol. 49:5. S. 493 498. Kepner, R. ja Pratt, J. 1994. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiological Reviews. Vol. 58:4. S. 603–615. Kupper, T., Plagellat, C., Brändli R.C., de Alencastro L.F., Grandjean, D. ja Tarradellas, J. 2006. Fate and removal of polycyclic musks, UV filters and biocides during wastewater treatment. Water research. Vol. 40:14. S. 2603–2612. Lahnsteiner, F., Berger, B., Kletzl, M., Weismann, T. 2005. Effect of bisphenol A on maturation and quality of semen and eggs in the brown trout, Salmo trutta f. fario. Aquatic Toxicology. Vol. 75:3. S. 213–224. La Prada, T., Nakatsu, C., Pantea, L. ja Alleman, J. 2000. Phylogenetic analysis of bacterial communities in mesophilic and thermophilic bioreactors treating pharmaceutical wastewater. Applied and environmental microbiology. Vol. 66:9. S. 3951 3959. Layton, A., Karanth, P., Lajoie, C., Meyers, A., Gregory, I., Stapleton, R., Taylor, D. ja Sayler, G. 2000. Quantification of hyphomicrobium populations in activated sludge from an industrial wastewater treatment system as determined by 16S RNA analysis. Applied and environmental microbiology. Vol. 66:3. S. 1167 1174. Liu, C., Yang, J., Wu, G., Zhang, S., Li, Z. ja Guo, J. 2007. Estimation of dominant microbial population sizes in the anaerobic granular sludge of a full-scale UASB treating streptomycin wastewater by PCR-DGGE. World Journal of Microbiology and Biotechnology. Vol. 26:2. S. 375 379. Lobos, J., Leib, T. ja Su, T.-H. 1992. Biodegradation of bisphenol A and other bisphenols by a gram-negative aerobic bacterium. Applied and environmental microbiology. Vol. 58:6. S. 1823–1831. Martin, C., Moeder, M., Daniel, X., Krauss, G. ja Schlosser, D. 2007. Biotransformation of the polycyclic musks HHCB and ATHN and metabolite formation by fungi occuring in freshwater environments. Environmental science & technology. Vol. 41:15. S. 5395–5402. Martín, H., Ivanova, N., Kunin, V., Warnecke, F., Barry, K., McHardy, A., Yeates, C., He, S., Salamov, A., Szeto, E., Dalin, E., Putnam, N., Shapiro, H., Pangilinan, J., Rigoutsos, I., Kyrpides, N., Blackall, L., McMahon, K. ja Hugenholtz, P. 2006. Metagenomic analysis of two enhanced biological phosphorus removal (EBPR) sludge communities. Nature biotechnology. Vol 24:10. S. 1263–1269. Metcalf ja Eddy. 2003. Wastewater engineering treatment and reuse. 4th ed. New York, USA. McGraw-Hill. 1819 s. ISBN: 0-07-041878-0. Moors, S., Blaszkewicz, M., Bolt, H.M. ja Degen G.H. 2007. Simultaneous determination of daidzein, equol, genistein and bisphenol A in human urine by a fast and simple method using SPE and GC-MS. Molecular Nutrition & Food Research. Vol. 51:7. S. 787–98. Morgenroth, E, 2008. Biofilm reactors. Teoksessa: Henze, M., van Loosdrecht, M.C.M, Ekama, G.A., Brdjanovic, D. (toim.) Biological wastewater treatment. Principles, modelling and design. Lontoo, Iso-Britannia: IWA Publishing. S. 493–508. ISBN: 9781843391883. Muyzer, G. de Waal, E.C. ja Uitterlinden. A.G. 1993. Profiling of complex microbial 75 populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Applied and environmental microbiology. Vol. 59:3. S. 695–700. Nübel, U., Engelen, B., Felske, A., Snaidr, J., Wieshuber, A., Amann, R.I., Ludwig, W. ja Backhaus, H. 1996. Sequence heterogeneities of genes encoding 16S rRNAs in Paenibacillus polymyxa detected by temperature gradient gel electrophoresis. Journal of bacteriology. Vol. 178:19. S. 5636–5643. Ødegaard, H., Rusten, B. ja Westrum, T. 1994. A new moving bed biofilm reactor applications and results. Water science & technology. Vol. 29:10 11. S. 157 165. Oshiman, K.-I., Tsutsumi, Y., Nishida, T. ja Matsumura, Y. 2007. Isolation and characterization of a novel bacterium, Sphingomonas bisphenolicum strain AO1, that degrades bisphenol A. Biodegradation. Vol. 18:2. S. 247–255 Podedworna, J., Zubrowska-Sudol, M. ja Grabinska-Loniewska, A. 2009. Assessment of the propensity of biofilm growth on newfloat carrier media through process and biological experiments. Water science & technology. Vol. 60:11. S. 2781 2789. Puhto, E. 2009. Kalvosuodatustekniikan soveltuminen yhdyskuntajätevesien käsittelyn tehostamiseen. [Verkkodokumentti]. Diplomityö. Teknillinen korkeakoulu, rakennus- ja ympäristötekniikan osasto. Espoo. [Viitattu 3.2.2011]. 99 s. Saatavissa: civil.tkk.fi/fi/tutkimus/vesi/opinnaytteet/puhto2009.pdf Quaiser, A., Ochsenreiter, T., Lanz, C., Schuster, S., Treusch, A., Eck, J. ja Schleper, C. 2003. Acidobacteria form a coherent but highly diverse group within the bacterial domail: evidence from environmental genomics. Molecular Microbiology. Vol. 50:2. S. 563 575. Sakai, K., Yamanaka, H., Moriyoshi, K., Ohmoto, T. ja Ohe, T. 2007. Biodegradation of bisphenol A and related compounds by Shingomonas sp. strain BP-7 isolated from seawater. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. Vol. 27:1 S. 51 57. Salkinoja-Salonen, M., 2002. Fylogenia ja taksonomia. Teoksessa: Salkinoja-Salonen, M., Aalto, J.-M. Mikrobiologien perusteita. Suomi. Helsingin yliopisto. S. 358 384. ISBN: 9514595025 Schreuers, R., Legler, J., Artola-Garicano, E., Sinnige, T., Lanser, P., Seinen, W. ja Van der Burg, B. 2004. In vitro and in vivo antiestrogenic effects of polycyclic musks in zebrafish. Environmental science of technology. Vol. 38:4. S. 997 1002. Staples, C., Dorn, P., Klecka, G., O´Block, S ja Harris, L. 1998. A review of the environmental fate, effect, and exposures of bisphenol A. Chemosphere. Vol. 36:10. S. 1249–2173. Suomen ympäristökeskuksen (SYKE) julkaisu. 2004. Haitallisten aineiden ympäristöseurantojen tehostaminen - HAASTE-hankkeen loppuraportti. Helsinki. Edita publishing Oy. 143 s. Saatavissa: http://www.ymparisto.fi/ download.asp?contentid=30884. ISBN 952-11-1820-2 (sähköinen). ISBN 95211-1819-9 (painettu). Sutherland, I. 2001a. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework. Microbiology. Vol. 147:1. S. 3 9. Sutherland, I. 2001b. The biofilm matrix – an immobilized but dynamic microbial 76 environment. Trends in microbiology. Vol. 9:5. S. 222–227. Vesilaki 264/1961. Finlex® ajantasainen lainsäädäntö. Saatavissa: http://www.finlex. fi/fi/laki/ ajantasa/1961/19610264 Vesilind, A. (toim.) 2003. Wastewater treatment plant design. Alexandria, USA: Water environment federation. 516 s. ISBN 1572782528. Wagner, M., Amann, R., Lemmer, H. ja Schleifer, K.-H. 1993. Probing activated sludge with oligonucleotides specific for proteobacteria: inadequacy of culturedependent methods for describing microbial community structure. Applied and environmental microbiology. Vol. 59:5. S. 1520 1525. Wallenius, K. 2000. DNA:n eristäminen kompostista ja PCR-DGGE:n soveltaminen kontrolloidun kompostitestin mikrobiyhteisön monitorointiin. Pro gradu tutkielma. Helsingin yliopisto. Maatalous-metsätieteellinen tiedekunta. Helsinki. 92 s. Wilén, B.-M., Onuki, M., Hermanson, M., Lumley, D. ja Mino, T. 2008. Microbial community structure in activated sludge floc analysed by fluorescence in situ hybridisation and its relation to floc stability. Water research. Vol. 42:8–9. S. 2300 2308. Wobus, A., Kloep, F., Röske, K. ja Röske, I. 2003. Influence of population structure on the performance of biofilm reactors. Teoksessa: Wuertz, s., Bishop, P. ja Wilderer, P. (toim.) Biofilms in wastewater treatment. An Interdisciplinary approach. Lontoo, Iso-Britannia: IWA Publishing. S. 232–263. ISBN 1-84339007-8. Wessman, F., Yuegen, E., Zheng, Q., He, G., Welander, T. ja Rusten, B. 2004. Increasing the capacity for treatment of chemical plant wastewater by replacing existing suspended carrier media with Kaldnes Moving Bed media at a plant in Singapore. Vol. 49:11 12. S. 199 205. Xia, S., Li, Jixiang, Wang, R., Li, Junying ja Zhang, Z. 2010. Tracking composition and dynamics of nitrification and denitrification microbial community in a biofilm reactor by PCR-DGGE and combining FISH with flow cytometry. Biochemical engineering journal. Vol. 49:3. S. 370 378. 77 LIITE 1 (1/2) EU:n komission lista prioriteettiaineista (EU:n direktiivi 2008/105/EY, Liite II) 78 LIITE 1 (2/2) 79 LIITE 2 Euroopan neuvostolle esitetty lista tarkistettavista prioriteettiaineista (EU:n direktiivi 2008/105/EY, Liite III) 80 LIITE 3 (1/2) Kokeissa käytettävien liuosten teko-ohjeet A: DAPI-värjäyksen liuokset Kestävöintiaine (10 % fosfaattipuskuroitu glutaraldehydi (GTA)) 0,46 g NaH2PO4 x H2O (Merck) 3,10 g Na2HPO4 x 12H2O (Riedel-de-Haën) 60 ml Milli-Q® -H2O (Millipore) 40 ml 25 % GTA (Merck, 820603) Suodatus 22 µm, säilytys +4 ºC Dispergointiaine (0,1M tetranatriumpyrofosfaatti) 44,61 g Na4P2O7 x 10H2O (Riedel-de-Haën) 1000 ml Milli-Q® -H2O (Millipore) Suodatus 22 µm, säilytys +4 ºC DAPI-kantaliuos 4,6-diamino-2-fenolindole (Sigma, 9542) 2,5 mg/ml steriiliin veteen (Sigma) Jaetaan 50 µl:n eriin, säilytys pimeässä -20 ºC:ssa DAPI-käyttöliuos: 50 µl kantaliuosta 200 µl 2,5 % GTA:a B: Haitta-ainelaskut BPA-kantaliuos Punnittiin 0,2071 g BPA:ta (Aldrich, 239658-50G) 0,2071 g/ x ml = 0,2 g/10 ml (= 2 mg/ 100 µl) x = 10,36 ml (liuotus asetoniin) HHCB-kantaliuos Punnittiin 0,0312 g 50 % HHCB:tä (SAFC, W52,060-8) 0,0312 g/ x ml = 0,05 g/ 10 ml (=50 µg/ 10 µl), x = 6,24 ml (liuotus asetoniin), huom.: 50 % 81 LIITE 3 (2/2) C:DGGE 8 % akryyliamidi geeli, denaturoiva gradientti 38 60 % Kokonaistilavuuus 10 ml 20 ml 20 ml 0% 38 % 60 % 0 % denaturoiva liuos 10 ml 12,4 ml 8 ml 100 % denaturoiva liuos 0 ml 7,6 ml 12 ml Temed 16 µl 30 µl 30 µl 10 % APS 32 µl 60 ml 60 ml puskuri geeli Harmaaveden resepti: 28 g astianpesuainetta (Fairy) 28 g shampoota (TRESemme) 28 g pyykinpesujauhetta 263 g sosekeittoa 66 ml piimää ~330 l vettä (Helsingin yliopisto) 82 LIITE 4 (1/2) PCR-DGGE:tä ja DAPI-värjäystä varten otetut näytteet Molekyylibiologiset näytteet (VTT, Otaniemi ja Hy, Lahti) Nro Pvm. Näyte 1 25.5.2010 CW1, vesi sisään Lahti, sisään menevä jätevesi 2 25.5.2010 CW2, vesi Lahti, reaktori 1 (Clewerin kantoaine) 3 25.5.2010 CW3, vesi Lahti, reaktori 2 (Clewerin kantoaine) 4 25.5.2010 CW4, vesi Lahti, reaktori 3 (Clewerin kantoaine) 5 25.5.2010 CKA1, kantoaine Lahti, reaktori 1 (Clewerin kantoaine) 6 25.5.2010 CKA2, kantoaine Lahti, reaktori 2 (Clewerin kantoaine) 7 25.5.2010 CKA3, kantoaine Lahti, reaktori 3 (Clewerin kantoaine) 8 25.5.2010 KW1, vesi sisään Lahti, sisään menevä harmaavesi 9 25.5.2010 KW2, vesi ulos Lahti, reaktori 1 (Konva-Center, Eko Willa) 10 25.5.2010 KW3, vesi ulos Lahti, reaktori 2 (Konva-Center, Eko Willa) 11 25.5.2010 KKA1, kantoaine Lahti, reaktori 1 (Konva-Center, Eko Willa) 10 cm syvyydestä 12 25.5.2010 KKA2, kantoaine Lahti, reaktori 1 (Konva-Center, Eko Willa) 30 cm syvyydestä 13 25.5.2010 KKA3, kantoaine Lahti, reaktori 2 (Konva-Center, Eko Willa) 10 cm syvyydestä 14 25.5.2010 KKA4, kantoaine Lahti, reaktori 2 (Konva-Center, Eko Willa) 30 cm syvyydestä 15 3.8.2010 CW1, vesi sisään Lahti, sisään menevä jätevesi 16 3.8.2010 CW2, vesi Lahti, reaktori 1 (Clewerin kantoaine) 17 3.8.2010 CW3, vesi Lahti, reaktori 2 (Clewerin kantoaine) 18 3.8.2010 CW4, vesi Lahti, reaktori 3 (Clewerin kantoaine) 19 3.8.2010 CKA1, kantoaine Lahti, reaktori 1 (Clewerin kantoaine) 20 3.8.2010 CKA2, kantoaine Lahti, reaktori 2 (Clewerin kantoaine) 21 3.8.2010 CKA3, kantoaine Lahti, reaktori 3 (Clewerin kantoaine) 22 3.8.2010 KW1, vesi sisään Lahti, sisään menevä harmaavesi 23 3.8.2010 KW2, vesi ulos Lahti, reaktori 1 (Konva-Center, Eko Willa) 24 3.8.2010 KW3, vesi ulos Lahti, reaktori 2 (Konva-Center, Eko Willa) 25 3.8.2010 KKA1, kantoaine Lahti, reaktori 1 (Konva-Center, Eko Willa) 10 cm syvyydestä 26 3.8.2010 KKA2, kantoaine Lahti, reaktori 1 (Konva-Center, Eko Willa) 30 cm syvyydestä 27 3.8.2010 KKA3, kantoaine Lahti, reaktori 2 (Konva-Center, Eko Willa) 10 cm syvyydestä 28 3.8.2010 KKA4, kantoaine Lahti, reaktori 2 (Konva-Center, Eko Willa) 30 cm syvyydestä 29 13.8.2010 VW1, vesi sisään VTT, sisään menevä jätevesi 30 13.8.2010 VW2, vesi ulos VTT, reaktori 1.1 (Konva-Centerin kantoaine) 31 13.8.2010 VW3, vesi ulos VTT, reaktori 1.2 (Konva-Centerin kantoaine) 32 13.8.2010 VW4, vesi ulos VTT, reaktori 2.1 (Clewerin kantoaine) 33 13.8.2010 VW5, vesi ulos VTT, reaktori 2.2 (Clewerin kantoaine) 34 13.8.2010 VKA1, kantoaine VTT, reaktori 1.1 (Konva-Centerin kantoaine) 35 13.8.2010 VKA2, kantoaine VTT, reaktori 1.2 (Konva-Centerin kantoaine) 36 13.8.2010 VKA3, kantoaine VTT, reaktori 2.1 (Clewerin kantoaine) 37 13.8.2010 VKA4, kantoaine VTT, reaktori 2.2 (Clewerin kantoaine) 38 1.9.2010 VW1, vesi sisään VTT, sisään menevä jätevesi 39 1.9.2010 VW2, vesi ulos VTT, reaktori 1.1 (Konva-Centerin kantoaine) 40 1.9.2010 VW3, vesi ulos VTT, reaktori 1.2 (Konva-Centerin kantoaine) 41 1.9.2010 VW4, vesi ulos VTT, reaktori 2.1 (Clewerin kantoaine) 83 LIITE 4 (2/2) Molekyylibiologiset näytteet (VTT, Otaniemi ja Hy, Lahti) 42 1.9.2010 VW5, vesi ulos VTT, reaktori 2.2 (Clewerin kantoaine) 43 1.9.2010 VKA1, kantoaine VTT, reaktori 1.1 (Konva-Centerin kantoaine) 44 1.9.2010 VKA2, kantoaine VTT, reaktori 1.2 (Konva-Centerin kantoaine) 45 1.9.2010 VKA3, kantoaine VTT, reaktori 2.1 (Clewerin kantoaine) 46 1.9.2010 VKA4, kantoaine VTT, reaktori 2.2 (Clewerin kantoaine) 47 15.9.2010 VW1, vesi sisään VTT, sisään menevä jätevesi 48 15.9.2010 VW2, vesi ulos VTT, reaktori 1.1 (Konva-Centerin kantoaine) 49 15.9.2010 VW3, vesi ulos VTT, reaktori 1.2 (Konva-Centerin kantoaine) 50 15.9.2010 VW4, vesi ulos VTT, reaktori 2.1 (Clewerin kantoaine) 51 15.9.2010 VW5, vesi ulos VTT, reaktori 2.2 (Clewerin kantoaine) 52 15.9.2010 VKA1, kantoaine VTT, reaktori 1.1 (Konva-Centerin kantoaine) 53 15.9.2010 VKA2, kantoaine VTT, reaktori 1.2 (Konva-Centerin kantoaine) 54 15.9.2010 VKA3, kantoaine VTT, reaktori 2.1 (Clewerin kantoaine) 55 15.9.2010 VKA4, kantoaine VTT, reaktori 2.2 (Clewerin kantoaine) 56 21.9.2010 CW1, vesi sisään Lahti, sisään menevä jätevesi 57 21.9.2010 CW2, vesi Lahti, reaktori 1 (Clewerin kantoaine) 58 21.9.2010 CW3, vesi Lahti, reaktori 2 (Clewerin kantoaine) 59 21.9.2010 CW4, vesi Lahti, reaktori 3 (Clewerin kantoaine) 60 21.9.2010 CKA1, kantoaine Lahti, reaktori 1 (Clewerin kantoaine) 61 21.9.2010 CKA2, kantoaine Lahti, reaktori 2 (Clewerin kantoaine) 62 21.9.2010 CKA3, kantoaine Lahti, reaktori 3 (Clewerin kantoaine) 63 21.9.2010 KW1, vesi sisään Lahti, sisään menevä harmaavesi 64 21.9.2010 KW2, vesi ulos Lahti, reaktori 1 (Konva-Center, Eko Willa) 65 21.9.2010 KW3, vesi ulos Lahti, reaktori 2 (Konva-Center, Eko Willa) 66 21.9.2010 KKA1, kantoaine Lahti, reaktori 1 (Konva-Center, Eko Willa) 10 cm syvyydestä 67 21.9.2010 KKA2, kantoaine Lahti, reaktori 1 (Konva-Center, Eko Willa) 30 cm syvyydestä 68 21.9.2010 KKA3, kantoaine Lahti, reaktori 2 (Konva-Center, Eko Willa) 10 cm syvyydestä 69 21.9.2010 KKA4, kantoaine Lahti, reaktori 2 (Konva-Center, Eko Willa) 30 cm syvyydestä 84 LIITE 5 85
© Copyright 2024