1. No category

 TEE-SE-ITSE-ELEKTROFOREESI
Justus Mutanen (Opinkirjon työn pohjalta)
BioPop-resurssikeskus, Helsingin yliopiston LUMA-keskus
Työn tavoite Työn tavoitteena on tutustua elektroforeesin periaatteeseen ja ymmärtää sen sovellusmahdollisuudet biologisessa tutkimuksessa. Työssä rakennetaan elektroforeesilaitteisto itse, valetaan
agaroosigeeli ja testataan näytteiden ajautumista agaroosigeelissä. Työ on suunniteltu siten,
että se voidaan toteuttaa tavallisessa koulussa ilman erityisiä laboratoriotiloja tai –tarvikkeita.
Tee-se-itse-elektroforeesi sopii hyvin biologiaa, kemiaa ja fysiikkaa eheyttävään kokonaisuuteen. Työ on suunniteltu lukioikäisille opiskelijoille ja sitä voidaan soveltaa esimerkiksi lukion biologian viidennellä tai lukion kemian neljännellä tai viidennellä kurssilla.
Työ on suunniteltu Opinkirjon tiedekerhojen materiaalin pohjalta:
http://www.opinkirjo.fi/fi/opettajat_ja_ohjaajat/tiedekasvatus/tiedekerho/teemakokonaisuuksia_ti
edekerhoon/genetiikkaa Taustaa DNA eli deoksiribonukleiinihappo toimii kaikkien eliöiden perimäaineksena. Se koostuu
kahdesta juosteesta, jotka pariutuvat toisiensa kanssa vetysidoksin. DNA-juoste koostuu kolmesta toistuvasta osasta: emäs-, sokeri- ja fosfaattiosasta. Juosteen runkona on fosfaatista ja
deoksiriboosista (sokeri) koostuva ketju. Emäksiä on neljä erilaista (A, C, G ja T) ja ne kiinnittyvät sokeriosaan. DNA:n fosfaattiosa neutraalissa pH:ssa negatiivisesti varautunut ja se
antaa DNA-molekyylille negatiivisen varauksen.
DNA:n kemialliseen rakenteeseen on merkitty yksi nukleotidi, joka koostuu sokeri-, fosfaattija emäsosasta. Fosfaattiosa on negatiivisesti varautunut. DNA:n kokoa, laatua ja määrää
tutkitaan yleisimmin elektroforeesin avulla.
Työn periaate Elektroforeesissa sähköisesti varautuneita aineita erotellaan sähkökentän avulla. Sähköisesti
varautuneet aineet kulkeutuvat sähkökentässä kohti vastakkaismerkkistä varausta. Esimerkiksi negatiivisesti varautunut DNA-molekyyli kulkeutuu kohti laitteiston positiivista elektrodia.
Elektroforeesilaitteisto muistuttaa rakenteeltaan elektrolyysikennoa. Laitteistoon kuuluu virtalähde, elektrodit, ajoastia sekä tutkittavat näytteet. Yleensä näytteitä ajetaan geelimäisessä
väliaineessa, jotta ne erottautuisivat paremmin. Tässä työssä hyödynnetään agaroosigeeliä,
joten kyseessä on agaroosigeelielektroforeesi (AGE).
Geelielektroforeesissa näytteiden ajautumisnopeuteen vaikuttavat sekä aineen molekyylien
koko että sähkövaraus. Isommat molekyylit ajautuvat hitaammin kuin pienemmät, sillä geeli
vastustaa enemmän suurempien molekyylien kulkua. Tämän vuoksi geelielektroforeesissa
suuret DNA-pätkät ajautuvat hitaimmin ja pienimmät nopeimmin. Näin erikokoisia DNApätkiä voidaan erotella toisistaan.
Tässä työssä DNA:n sijaan käytetään erilasia (elintarvike)värejä, jotka ovat joko varauksettomia tai negatiivisesti varautuneita. Värien avulla elektroforeesin toimintaa voidaan tarkkailla helpommin. Tehtävänä on selvittää, montaa eri väriainetta elintarvikevärit sisältävät ja onko väriaineilla sähköistä varausta.
Elektroforeesilaitteisto rakennetaan käyttäen tavallisesta kaupasta saatavia välineitä. Lisäksi
työssä valmistetaan agaroosigeeli, pipetoidaan näytteet geelin sisään ja seurataan niiden kulkeutumista geelielektroforeesin aikana.
Kaupallinen agaroosigeelielektroforeesilaitteisto.
Työturvallisuus Työssä on käytettävä suojatakkia koko työn ajan. Agaroosigeelin valmistamisen aikana on
suositeltavaa käyttää myös suojalaseja ja –käsineitä.
Työssä käytettävät kemikaalit ovat ns. keittiökemikaaleja, eikä niistä ole oikein käsiteltynä
vaaraa. Suurimmat vaarat liittyvät elektroforeesilaitteen käyttämiseen:
o Älä koskaan oikosulje virtapiiriä elektroforeesissa!
o Tarkkaile elektroforeesin aikana paristojen lämpötilaa. Mikäli ne kuumenevat liikaa,
lopeta ajo, anna paristojen jäähtyä ja vähennä paristojen määrää.
o Varo koskettamasta elektroforeesilaitteistoa ajon aikana. Älä myöskään koske molempia elektrodeja yhtä aikaa, jotta välttyisit sähköiskulta. 45 V jännitteestä saa jo
melkoisen tärskyn!
Lisäksi agaroosigeelin (tai agargeelin) valmistuksen aikana on huomattava seuraavat asiat:
o Käytä suojakäsineitä tai patakinnasta, kun käsittelet kuumaa geeliä.
o Työskentele varovaisesti kuumennetun agaroosigeelin kanssa, sillä se polttaa hyvin
helposti!
o Älä kuumenna geeliä liikaa mikrossa, jotta se ei kiehu astiasta pois. Älä anna geelin
kiehua mikrossa, vaan sekoita sitä välillä.
o Ole varovainen ottaessasi kuumaa agaroosigeeliä mikroaaltouunista. Liikutettaessa
kuuma geeli saattaa kuohahtaa yllättävästi, vaikka ei näytä kiehuvalta.
Pipetin käytöstä:
o Käytä pipetissä AINA kärkeä!!!
o Älä koskaan käännä pipettiä vaakatasoon tai ylösalaisin, jos sen kärjettä on nestettä!!!
o Poista kärki aina heti käytön jälkeen.
Arvioitu aika o 1 h, kun rakennetaan pelkkä laitteisto.
o 2 h, kun elektroforeesilaitteiston osat valmistetaan pienryhmissä ja ajetaan geeli
o 3 h, kun kaikki valmistavat itse osat elektroforeesilaitteistoon ja jokainen ajaa oman
geelinsä
Ennen työtä pohdittavaksi tai selvitettäväksi o Mihin elektroforeesia käytetään biotekniikassa?
o Mitä agaroosi (tai agar) on ja mistä sitä saadaan?
o Miksi DNA-pätkiä halutaan erotella koon mukaan? Tarvikkeet o Muovisia pakasterasioita ja niiden kansia
o Alumiinifoliota
o Hauenleuoilla varustettuja johtimia (voit myös valmistaa itse johtimesta ja hauenleuo
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
oista)
Piirtoheitinkalvoa
Sakset
Teippiä
Ilmastointiteippiä
9 V paristoja (3–5 / laitteisto)
Vettä (vesijohtovesi riittää)
Ruokasuolaa (natriumkloridia)
Ruokasoodaa (natriumvetykarbonaattia)
Lasi- tai muovipullo
Mittalasi (1 l)
Ruoka- ja teelusikka
Erlenmeyer (250 ml), keittopullo tai muu mikron kestävä lasiastia (väh. 250 ml)
Mikroaaltouuni
Vaaka
Agaroosia tai agarhiutaleita
Tutkittavia näytteitä (esim. elintarvikevärejä)
Pipetti ja pipetinkärkiä
Työn suoritus VAIHE 1: Laitteiston rakentaminen ja reagenssien valmistaminen
Vaihe 1 voidaan tehdä neljässä pienryhmässä, jolloin ryhmät tekevät seuraavat asiat:
o
o
o
o
Kelkat
Ajoastiat ja kammat
Geelin valmistaminen
Puskuriliuoksen valmistaminen
HUOM! Jos vaihe 1 tehdään pienryhmissä: Huomaa, että geeliä valmistettaessa tarvitaan
puskuriliuosta ja kelkat. Ne kannattaa säästää edelliseltä kerralta tai valmistaa etukäteen.
Valmistetut kelkat ja puskuriliuokset voi säästää seuraavalle kerralle.
a. Kelkat
Tarvikkeet:
o Piirtoheitinkalvoa
o Sakset
o Kelkan sapluuna
Miten tehdään:
o Leikkaa piirtoheitinkalvosta sapluunan kokoisia kappaleita (Vaihtoehtoisesti: suunnittele itse kelkka, joka mahtuu ajoastiaan. Kelkan sivujen korkeus kannatta olla ainakin
1,5 cm korkuisia.)
o Taita kelkan reunat sisäänpäin ja teippaa ne yhteen ilmastointiteipillä. Tarkista kelkan
tiiviys veden avulla.
Kelkan sapluuna ja valmiit kelkat.
b. Kammat
Tarvikkeet:
o Pakasterasioiden kansia
o Sakset
Miten tehdään:
o Leikkaa pakasterasioiden kansista koholla olevat reunat pois. Leikkaa kansi keskeltä
kahteen osaan.
o Taita saamasi osat kahtia.
o Aseta taitettu sivu alaspäin ja leikkaa kannesta ”kampa”, jossa on useita piikkejä. Piikit eivät saa yltää ajokelkan pohjaan saakka (ks. kuva). Käytä apunasi vanhoja kelkkoja tehdessäsi kampaa.
Kampa kelkassa ja sen ulkopuolella
c. Ajoastia
Tarvikkeet:
o Pakasterasioita
o Alumiinifoliota
o Hauenleuoilla varustettuja johtimia
Miten tehdään:
o Taittele alumiinifolio nelinkerroin ja vuoraa sillä pakasterasian päädyt.
o Kiinnitä johtimet hauenleuoilla folioon, mutta älä yhdistä niitä virtalähteeseen vielä
tässä vaiheessa.
Ajoastia
d. Puskuriliuos
Tarvikkeet:
o Vettä (vesijohtovesi käy)
o Ruokasuolaa (natriumkloridia)
o Ruokasoodaa (natriumvetykarbonaattia eli natriumbikarbonaattia)
o Lasi- tai muovipullo
o Ruoka- ja teelusikka
o Mittalasi
Miten tehdään:
Lisää pulloon 1/16 teelusikallinen ruokasuolaa (0,05 g)
Lisää pulloon kukkurainen ruokalusikallinen leivontasoodaa (2,0 g)
Lisää pulloon 1,0 l vettä
Sekoita kääntämällä pulloa ylösalaisin, mutta älä ravista. Anna ruokasuolan ja ruokasoodan liueta kokonaan.
o Valmiin liuokset pH:n tulisi olla noin 8,5, minkä voi halutessaan testata pH-mittarilla
tai pH-paperilla.
o
o
o
o
Puskuriliuoksen valmistamisessa tarvittavat tarvikkeet.
e. Agaroosi- tai agargeeli
Tarvikkeet:
o Agaroosia tai agarhiutaleita
o Puskuriliuosta (kohta d)
o Erlenmeyer (250 ml), keittopullo tai muu mikron kestävä lasiastia (väh. 250 ml)
o Vaaka
o Mikroaaltouuni
Miten tehdään (määrät yhdelle geelille):
o Mittaa erlenmeyeriin 0,50 g agaroosia tai agarhiutaleita
o Lisää 50 ml puskuriliuosta ja sekoita huolellisesti
o Kuumenna geeliä varovaisesti mikrossa, kunnes se pulpahtaa ensimmäisen kerran.
Sekoita seosta välillä, mutta käytä patakinnasta tai muuta suojavarustetta.
o Kun agar tai agaroosi on liuennut puskuriin kokonaan, se on läpikuultavaa. Jäähdytä
pöydällä tai vesihanan alla hetki.
o Kaada jäähtynyt seos kelkkaan (kohta a). Varo, ettei kelkkaan jää ilmakuplia.
o Aseta kampa (kohta b) kelkan toiseen reunaan pystyyn. Kamman piikit eivät saa osua
kelkan pohjaan.
o Anna geelin jähmettyä vähintään puoli tuntia.
Agaroosin (agarin) punnitseminen ja geelin valmistus mikroaaltouunissa.
Valmis geeli kelkassa kamman kanssa.
VAIHE 2: Geelielektroforeesi
Seuraavassa vaiheessa tehdään itse geelielektroforeesiajo. Tätä varten sinun tulee rakentaa
virtalähde 9 V paristoista. Kytke 3–5 paristoa sarjaan (kokonaisjännite 27–45 V). Älä kytke
enempää paristoja sarjaan, sillä muuten ne voivat ylikuumentua!
Tarvikkeet:
o
o
o
o
o
9 V paristoja (tai tasavirtalähde)
Ajoastia (kohta 1 c)
Geeli (kohta 1 e)
Tutkittavat näytteet (Voit lisätä näytteisiin glyserolia pipetoinnin helpottamiseksi)
Pipetti ja pipetinkärkiä
Miten tehdään:
o Leikkaa kelkka irti geelistä ja aseta geeli ajoastiaan.
o Irrota kampa varovasti geelistä.
o Pipetoi tutkittavia näytteitä (esim. elintarvikevärejä tai DNA:ta) geelin kuoppiin pipetillä. Jos käytät automaattipipettiä, käytä pipetissä AINA kärkeä. Älä käännä pipettiä
koskaan kyljelleen tai ylösalaisin, jos kärjessä on nestettä! Sopiva määrä on esim. 10
µl.
o Kaada puskuria ajoastiaan varovasti niin, että geeli juuri ja juuri peittyy puskuriliuokseen.
o Kytke ajoastia virtalähteeseen. Kytke näytteiden puoleinen pää miinusnapaan ja näytteistä katsottuna kauempi pää plusnapaan.
o Jos sähkökenttä muodostuu, puskurissa alkaa muodostua kuplia.
o Jos paristot kuumentuvat niin kuumiksi, että niitä ei voi koskettaa, lopeta ajo. Anna
paristojen jäähtyä ja käytä pienempää jännitettä.
o (9 V paristoja käyttäen) 45 V jännitteellä näytteet ovat erottuneet riittävästi noin puolessa tunnissa.
Geelin ajaminen 27 V jännitteellä ja ajon lopputulos puolen tunnin jälkeen. Pohdittavaa työn jälkeen o Miksi eri molekyylit kulkevat geelielektroforeesissa eri nopeudella?
o Miten RNA käyttäytyisi samanlaisessa geelielektroforeesissa?
o Miksi puskuri alkaa kuplia, kun se kytketään virtalähteeseen? Mitä elektrodeilla muodostuu?
o Mitä alumiinifoliolle tapahtuu ajon aikana ja minkä vuoksi?
o Miksi kaikki väriaineet eivät kulkeudu geelillä?
o Miksi paristot kuumenevat ajon aikana?
o Tutki kaupallista geelielektroforeesilaitteistoa. Löydätkö siitä samat osat kuin valmistamastasi laitteistosta?