1. No category

HELSINGIN YLIOPISTO
Elintarvike- ja ympäristötieteiden laitos
EKT-sarja 1681
SERPIINIEN ELIMINOINTI GLUTEENITTOMASTA
OLUESTA
Mari Riuttala
Helsinki 2015
Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion – Faculty
Laitos/Institution– Department
Maatalous-metsätieteellinen tiedekunta
Elintarvike- ja ympäristötieteiden laitos
Tekijä/Författare – Author
Mari Riuttala
Työn nimi / Arbetets titel – Title
Serpiinien eliminointi gluteenittomasta oluesta
Oppiaine /Läroämne – Subject
Viljateknologia
Työn laji/Arbetets art – Level
Aika/Datum – Month and year
Maisterintutkielma
Huhtikuu 2015
Sivumäärä/ Sidoantal – Number of pages
68
Tiivistelmä/Referat – Abstract
Ihmisillä erilaiset allergiat ja yliherkkyydet ovat viime vuosina lisääntyneet. Monet ihmiset kokevat saavansa erilaisia oireita syötyään viljatuotteita. Viljoista löytyvien peptidaasiinhibiittoreiden uskotaan yhtenä tekijää laukaisevan näitä oireita.
Tutkielman kokeellisen osuuden tavoitteena oli eristää seriinipeptidaasi-inihibiittoria serpiiniä
ohrasta ja tutkia erilaisten hydrolyysimenetelmien tehoa siihen. Serpiini on hyvin stabiili erilaisille hydrolyysimenetelmille. Tutkielman kirjallisuuskatsauksessa perehdyttiin viljojen seriinipeptidaasi-inhibiittoreihin kuuluvien serpiinien ominaisuuksiin. Lisäksi perehdyttiin keliaakikoille haitallisiin proteiineihin ja näiden pilkkomiseen, sekä keliakiaan, gluteeniyliherkkyyteen ja viljan aiheuttamiin allergioihin.
Viljojen proteiinit voivat laukaista ihmisillä erilaisia yliherkkyysoireita tai immunologisia reaktioita. Monet viljojen inhibiittoriproteiineista ovat allergeeneja ja varastoproteiinit prolamiinit
laukaisevat keliaakikoiden suolistossa immunologisen tulehduksen. Viljojen serpiinit ovat hyvin
vahvasti sitoutuvia inhibiittoreita, jotka käyttäytyvät substraattien tavoin ja niiden reaktiivinen
keskus pilkkoutuu inhibitioprosessin aikana. Serpiinien reaktiivisen keskuksen pilkkouduttua,
niistä tulee erittäin stabiileja lämmölle ja myöhemmälle pilkkoutumiselle. Serpiini on lähes ainoa proteiini, jota on oluessa. Se säilyy hydrolysoimattomana ja denaturoitumattomana läpi
mallastus ja oluenpanoprosessin. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli eristää serpiinejä ohrasta ja
eliminoida ne gluteenittomasta oluesta käyttäen Aspergillus niger- homesienen tuottamaa prolyyliendopeptidaasia AN-PEP:a, Tritirachium album-homesienen tuottamaa seriiniendopeptidaasia Proteaasi K:ta ja vetyperoksidihapetusta. Serpiinien pilkkoutumista seurattiin SDSgeelielektroforeesilla ja kokoekskluusiokromatografialla (SEC).
Tässä tutkimuksessa osoitettiin, että AN-PEP:n ja Proteaasi K:n avulla voitiin pilkkoa gluteenittoman oluen serpiinejä. Hapettamalla oluen serpiinejä ei saatu pilkkoutumaan. AN-PEP:n avulla
on mahdollista eliminoida pääosa oluen sisältämistä serpiineistä. AN-PEP:n avulla voisi olla
mahdollista tehdä allergikoille soveltuvaa olutta tulevaisuudessa.
Avainsanat – Nyckelord – Keywords
Serpiinit, prolyyliendopeptidaasi, gluteeniton olut, allergeeni, keliakia
Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where deposited
Helsingin yliopiston digitaalinen arkisto, Helda
Muita tietoja – Övriga uppgifter – Additional information
Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion – Faculty
Laitos/Institution– Department
Faculty of Agriculture and Forestry
Department of food and environmental sciences
Tekijä/Författare – Author
Mari Riuttala
Työn nimi / Arbetets titel – Title
Eliminate serpins from gluten-free beer
Oppiaine /Läroämne – Subject
Cereal technology
Työn laji/Arbetets art – Level
Aika/Datum – Month and year
Master’s dissertation
April 2015
Sivumäärä/ Sidoantal – Number of pages
68
Tiivistelmä/Referat – Abstract
In humans, various allergies and intolerances have increased in recent years. Many people think
that they have a variety of symptoms from eating grain products. Cereal protease inhibitors are
believed to be possibly one of the factors that can cause these reactions.
The aim of the experimental part of the study was to isolate serine peptidase inhibitors serpins
from barley and study different hydrolysis to it. Serpins are very stable at hydrolyse. The literature review deals characteristics of serine protease inhibitors serpins and other allergens from
cereals. And examine the celiac harmful proteins and their cleavage, gluten sensitivity and celiac disease.
Cereals proteins can trigger variety hypersensitivity or immunological symptoms for humans.
Many of cereal inhibitor proteins are allergens and storage proteins prolamins cause immunological inflammation in the coeliac patient’s intestines. Cereal serpins are very strong binding
inhibitors that behave like substrates and reactive centre cleaved during inhibition. After serpins
reactive centre degraded, they become very stable to heat and subsequent degradation. Serpins
are almost the only protein in beer. It remains hydrolysed and undenatured through the malting
and brewing process. The aim of this study was to isolate serpins from barley and eliminate
them from gluten-free beer using the Aspergillus niger- fungus produced prolyl endopeptidase
AN-PEP, Tritirachium album- fungus produced serine endopeptidase Protease K and hydrogen
peroxide oxidation. Serpin cleavage was monitored by SDS-gel electrophoresis and size exclusion chromatography (SEC).
In this study, it was shown that AN-PEP and protease K made it possible to degrade serpins
from gluten-free beer. Serpins from gluten-free beer did not degrade with oxidation. AN-PEP
makes it possible to eliminate the majority of beer serpins. AN-PEP can be used to make beer
suitable for allergy sufferers in the future.
Avainsanat – Nyckelord – Keywords
Serpins, prolyl endopeptidase, gluten-free beer, allergen, celiac disease
Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where deposited
University of Helsinki digital registry, Helda
Muita tietoja – Övriga uppgifter – Additional information
ESIPUHE
Tämä tutkimus tehtiin Helsingin yliopiston elintarvike- ja ympäristötieteiden laitoksella viljateknologian oppiaineessa. Työn ohjaajana toimi yliopistonlehtori Tuula Sontag-Strohm, jolta myös tutkimuksen aihe saatiin. Työn valvojana toimi professori Hannu Salovaara ja lisäksi ohjausryhmään
kuului ETM Xin Huang.
Kiitän lämpimästi kaikkia, jotka auttoivat minua tämän työn aikana. Erityisesti, kiitos Xin Huangille kaikesta avusta tämän työn aikana. Kiitos myös laboratorioteknikolle Outi Brinkille avusta laboratorioanalyysien kanssa. Lisäksi haluan kiittää opiskelukavereitani ajatusten ja tuen jakamisesta
toinen toisillemme, sekä yhteisistä kahvihetkistä. Suuri kiitos puolisolleni, että olet jaksanut kannustaa tässä työssä eteenpäin.
Helsingissä huhtikuun 5. päivänä 2015
Mari Riuttala
SISÄLLYSLUETTELO
TIIVISTELMÄ
ABSTRACT
ESIPUHE
1 JOHDANTO
7
2 KIRJALLISUUSKATSAUS
9
2.1 Seriinipeptidaasi-inhibiittorit
2.1.1 Serpiinit
9
9
Serpiinien rakenne ja inhibitiomekanismi
Viljojen serpiinit
Vehnän serpiinit
Ohran serpiinit
Rukiin serpiinit
2.1.2 Inhibiittorit allergioissa ja yliherkkyyksissä
13
2.2 Proteiinit keliakiassa ja gluteeniyliherkkyydessä
15
2.2.1 Triticeae- suvun viljojen prolamiinit
15
Ohran hordeiinit
Rukiin sekaliinit
Vehnän gliadiinit ja gluteenialayksiköt
2.2.2 Keliakia ja prolamiinit
19
Keliakian patogeneesi
Keliaakikolle haitalliset proteiinit ja peptidit
2.2.3 Gluteeniyliherkkyys
2.3 Proteiinien hydrolyysi
23
24
2.3.1 Proteiineista peptidejä
24
2.3.2 Prolamiinien hydrolyysi perinteisillä menetelmillä
25
Idätys
Hapantaikinafermentaatio
2.3.3 Prolyyliendopeptidaasit
28
Aspergillus niger
Muiden mikrobien tuottamat prolyyliendopeptidaasit
2.3.4 Prolamiinien hydrolyysi hapettamalla
30
3 KOKEELLINEN TUTKIMUS
32
3.1 Koeasetelma ja tavoite
32
3.2 Materiaalit ja menetelmät
32
3.2.1 Ohra-ruismallasutteen ominaisuudet
32
3.2.2 Oluen ominaisuudet
34
3.2.3 AN-PEP:n inkubaation- ja lämmönkesto
35
3.2.4 Ohra-ruismallasuutteen käsittely prolyyliendopeptidaasilla (AN-PEP)
36
3.2.5 Oluen käsittelyt
36
3.2.6 Proteiinien kokojakauman tarkastelu elektroforeesi- ja
kokoekskluusioerotuksella
3.3 Tulokset
38
41
3.3.1 Ohra-ruismallasuutteen ominaisuuksien tarkastelu elektroforeesierotuksella
41
3.3.2 Oluen ominaisuuksien tarkastelu elektroforeesi- ja
kokoekskluusioerotuksella
42
3.3.3 AN-PEP:n inkubaatio- ja lämmönkeston tarkastelu elektroforeesi- ja
kokoekskluusioerotuksella
45
3.3.4 Ohra-ruismallasuutteen proteiinijakauman tarkastelu elektroforeesi
erotuksella AN-PEP -käsittelyn jälkeen
47
3.3.5 Oluen proteiinijakauman tarkastelu elektroforeesi- ja
kokoekskluusioerotuksella käsittelyjen jälkeen
48
3.4 Pohdinta
53
4 PÄÄTELMÄT
56
LÄHDELUETTELO
57
LIITTEET
Liite 1. Aminohapot ja niiden lyhenteet
Liite 2. Tutkimuksessa käytetyt reagenssit ja laitteet
64
65
7
1 JOHDANTO
Viljojen proteiinit voivat laukaista ihmisillä erilaisia immunologisia oireita tai yliherkkyysreaktioita. Viljan jyvän seriinipeptidaasi- ja amylaasi/trypsiini-inhibiittoriproteiinit ovat
allergeeneja ja varastoproteiiniet laukaisevat keliaakikoiden ohutsuolessa immunologisen
tulehduksen (García-Casado ym. 1996; Shan ym. 2002; Vader ym. 2003; Sapone ym.
2012).
Kasvien seriinipeptidaasi-inhibiittorit (PI:t) voidaan jakaa kahdeksaan ryhmään: serpiineihin, Kunitz-inhibiittoreihin, Bowman-Birk-inhibiittoreihin, squash-inihibiittoreihin, PI 1ja
2
-inhibiittoreihin,
viljan
amylaasi/trypsiini-inhibiittoreihin
ja
sinapinsiemen-
inhibiittoreihin (Laing ja McManus 2002). Serpiinejä löytyy kaikista eliöistä, myös viruksista. Suurin osa serpiineistä inhiboi irreversiibelisti seriinipeptidaaseja kymotrypsiiniryhmästä, mutta myös trypsiini- ja elastaasiryhmistä (Laing ja McManus 2002; Roberts ja
Hejgaard 2008). Serpiinit ovat hyvin vahvasti sitoutuvia inhibiittoreita, jotka käyttäytyvät
substraattien tavoin ja niiden reaktiivinen keskus pilkkoutuu inhibition aikana (Roberts ja
Hejgaard 2008). Serpiinien reaktiivisen keskuksen pilkkouduttua, niistä tulee erittäin stabiileja lämmölle ja myöhemmälle pilkkoutumiselle.
Viljojen serpiinit ovat molekyylimassaltaan 40–44 kDa:n välillä ja niitä on mm. vehnässä,
riisissä, ohrassa ja rukiissa (Laing ja McManus 2002). Ilmeisesti evoluution aikana serpiinit ovat mukautuneet inhiboimaan endogeenisia tai tuholaisista peräisin olevia peptidaaseja, jotka osallistuvat jyvän varastoproteiinien pilkkomiseen. Vehnän serpiineistä useilla on
sama toistuva Q–Q sekvenssi reaktiivisessa keskuksessa, kuin vehnän prolamiineilla
(Østergaard ym. 2000). Lisäksi monella vehnän serpiineistä on P–P sekvenssi reaktiivisessa keskuksessa. Rukiin serpiineillä on reaktiivisissa keskuksissa samankaltaisia aminohapposekvenssejä kuin sekaliineilla (Hejgaard 2001).
Vehnän amylaasi/trypsiini-inihibiittorit (ATI) ovat ryhmä proteiineja, joiden molekyylimassat ovat 11,5–14 kDa:n välillä (Laing ja McManus 2002). ATI:t inhiboivat peptidaaseja ja α-amylaaseja, pääasiassa jompaakumpaa entsyymiä (Laing ja McManus 2002). Viljan
jyvän ATI:t pystyvät inhiboimaan nisäkkäiden ja hyönteisten entsyymejä, mutta eivät viljan endogeenista α-amylaasia (Tatham ja Shewry 2008).
Viljan jyvän inhibiittoreista allergeeneja ovat amylaasi/trypsiini-inihibiittorit ja serpiinit.
Lisäksi amylaasi/trypsiini-inihibiittorit saattavat vaikuttaa keliakian puhkeamiseen ja aihe-
8
uttaa gluteeniyliherkille ihmisille oireita. Viljojen amylaasi/trypsiini-inhibiittorit aiheuttavat hengitettynä allergisia oireita (Tatham ja Shewry 2008). Leipurin astma ja nuha ovat
erittäin tunnettuja allergisia reaktioita, jotka johtuvat viljapölyn hengittämisestä. Amylaasi/trypsiini-inhibiittoreilla ei näytä olevan roolia ruoka-allergioissa. Ruoka-allergioita aiheuttavat pääasiassa ohran, rukiin ja vehnän prolamiinit, erityisesti ω-hordeiinit, -sekaliinit ja
-gliadiinit. Ohran serpiini BSZ4 on tunnistettu toiseksi oluen allergeeneista (Garcia-Casado
ym. 2001). Oluen proteiinien on todettu aiheuttavan IgE-välitteisiä allergisia reaktioita ja
iho-oireita oluelle allergisilla henkilöillä (Figueredo ym. 1999; Fernandez-Anaya ym.
1999).
Keliaakikoille haitallisia varastoproteiineja prolamiineja on Triticeae- suvun viljoissa, eli
ohrassa, rukiissa ja vehnässä. Prolamiineja voidaan pilkkoa idättämällä viljan jyvää, hapantaikinafermentaatiolla, hapettamalla tai prolyyliendopeptidaaseilla (Cunningham ja
O’Connor. 1997). Muun muassa Aspergillus niger- homesienestä peräisin olevan prolyyliendopeptidaasin on tutkittu pilkkovan tehokkaasti prolamiineja (Stepniak ym. 2006).
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli eristää ja eliminoida serpiinit gluteenittomasta oluesta
käyttäen Aspergillus niger- homesienen tuottamaa prolyyliendopeptidaasia AN-PEP:a,
Tritirachium album- homesienen tuottamaa seriiniendopeptidaasia Proteaasi K:ta ja vetyperoksidihapetusta. AN-PEP:n ja hapetuksen ajateltiin tehoavan serpiineihin, koska niillä
on samoja toistuvia aminohapposekvenssejä reaktiivisessa keskuksessa kuin prolamiineilla.
9
2 KIRJALLISUUSKATSAUS
2.1 Seriinipeptidaasi-inhibiittorit
Peptidaasi-inhibiittorit inhiboivat proteolyyttisten entsyymien aktiivisuutta (Laing ja McManus 2002). Peptidaasi-inhibiittoreita (PI) on kaikkialla luonnossa ja elävissä organismeissa, myös viruksissa. Kasvien peptidaasi-inhbiittoreilla on ainakin kaksi roolia, suojella
ja toimia varastoproteiineina. Kasvien ja nisäkkäiden PI:t suojelevat soluja niiden omilta
peptidaaseilta ja kontrolloivat biokemiallisia reaktioita elimistössä. Lisäksi kasvien PI:t
suojelevat soluja tuholaisilta ja patogeeneilta. PI:t luokitellaan inhiboitavan peptidaasin
mukaan. Seriini PI:t inhiboivat seriinipeptidaaseja, kysteiini PI:t kysteiinipeptidaaseja, aspartyyli PI:t aspartyylipeptidaaseja ja metallo PI:t metallopeptidaaseja.
Seriini PI:t ovat ryhmä proteiineja, joita löytyy eläimistä ja kasveista, sekä joistakin viruksista (Laing ja McManus 2002). Kasvien seriinipeptidaasi-inhibiittorit (PI:t) jaetaan yleensä
kahdeksaan
ryhmään:
serpiineihin,
Kunitz-inhibiittoreihin,
Bowman-Birk-
inhibiittoreihin, squash-inihibiittoreihin, PI 1- ja 2 -inhibiittoreihin, viljan amylaasi/trypsiini-inhibiittoreihin ja sinapinsiemen-inhibiittoreihin (Laing ja McManus 2002).
2.1.1 Serpiinit
Serpiinien rakenne ja inhibitiomekanismi
Kasvien kasvun ja muodostumisen, stressin hallinnan sekä tuholaisia vastaan taistelun
kannalta proteolyysin kontrolloiminen on tärkeää (Roberts ja Hejgaard 2008). Serpiineihin
kuuluvat proteiinit ovat merkittävässä roolissa kontrolloitaessa proteolyysia. Ne inhiboivat
irreversiibelisti endo- ja eksogeenisia peptidaaseja. Serpiinit ovat toinen peptidaaseja inhiboivista ryhmistä, joita löytyy kaikista eliöistä ja ainoa, jota löytyy myös viruksista. Kasvien ja eläinten serpiinit rakentuvat tyypillisesti 350–500 aminohaposta ja niiden molekyylimassat ovat 40–60 kDa:n välillä (Silverman ym. 2001; Gettins ja Olson 2009). Serpiinien
rakenteessa on 8–9 α-heliksiä, kolme β-levyä ja reaktiivinen keskus, jossa on spesifinen
”syötti” sekvenssi kohteena olevalle peptidaasille (Roberts ja Hejgaard 2008).
10
Suurin osa serpiineistä inhiboi irreversiibelisti seriinipeptidaaseja kymotrypsiiniryhmästä,
mutta myös trypsiini- ja elastaasiryhmistä (Laing ja McManus 2002; Roberts ja Hejgaard
2008). Serpiinit ovat hyvin vahvasti sitoutuvia inhibiittoreita, jotka käyttäytyvät substraattien tavoin ja niiden reaktiivinen keskus pilkkoutuu inhibitioprosessin aikana (Roberts ja
Hejgaard 2008). (kuva 1)
Kuva 1. Serpiinien rakenne ja inhibitiomekanismi. a) Natiivin serpiinin rakenne. Esimerkkinä on käytetty
SERPINA1- serpiiniä (Protein Data Bank (PDB) koodi 1QLP). Reaktiivinen keskus (silmukka) on molekyylin yläosassa. Reaktiivisen keskuksen muuttuva asema inhibition jälkeen on merkitty katkoviivalla. b) Serpiinin (SERPINA1) reaktiivisen keskuksen ja peptidaasin inaktiivisen trypsiinin (PDB koodi 1OPH) muodostama kompleksi. Kun aktiivisen peptidaasin kiinnittyminen on tapahtunut (b), mahdollisia jatkoreittejä on
kaksi: c) lopullinen serpiini-peptidaasikompleksi (PDB koodi 1EZX). Serpiini on siirtynyt tilasta S tilaan R ja
peptidaasi riippuu molekyylin alapuolella vääristäen serpiinin rakenteen. d) pilkkoutuneen serpiinin
(SERPINA1) rakenne (PDB koodi 7API), jossa reaktiivinen keskus muodostaa ylimääräisen levyrakenteen.
Serpiinin substraattimaista käyttäytymistä voidaan nähdä, jos peptidaasi pystyy irtautumaan kompleksista.
Tällöin jäljelle jää aktiivinen peptidaasi ja inaktiivinen pilkkoutunut serpiini. (Law ym. 2006).
Serpiinin rakenteen muuttumisen jälkeen se ei ole enää metastabiili (stressaantunut, S)
vaan hyperstabiili (rentoutunut, R), eikä se pysty enää inhiboimaan peptidaaseja. Sanotaan,
että serpiini siirtyy tilasta S tilaan R. Serpiinien reaktiivisen keskuksen pilkkouduttua, niistä tulee erittäin stabiileja lämmölle ja myöhemmälle pilkkoutumiselle. Natiivi serpiini kestää n. 58 °C:n lämmön, kun muuttunut serpiini kestää yli 100 °C:n lämmön. Kasvien serpiinit eivät kykene inhiboimaan eläinten ruoansulatuksen peptidaaseja, koska ne inaktivoituvat matalassa pH:ssa (Roberts ym. 2003).
11
Viljojen serpiinit
Viljojen serpiinit ovat molekyylimassaltaan n. 40–44 kDa:a ja niitä on mm. vehnässä, riisissä, ohrassa ja rukiissa (Laing ja McManus 2002). Viljojen jyvissä on paljon inhibiittoreita, mutta niiden fysiologinen rooli on epäselvä. Ilmeisesti evoluution aikana serpiinit ovat
mukautuneet inhiboimaan endogeenisia tai tuholaisista peräisin olevia peptidaaseja, jotka
osallistuvat varastoproteiinien pilkkomiseen. Viljojen serpiinien on osoitettu inhiboivan
useita peptidaaseja trypsiini-, kymotrypsiini- ja katepsiini G -ryhmistä. Jopa sama inhibiittori voi inhiboida useampaa peptidaasia. Ensimmäisenä kasviserpiininä tunnistettiin ohrasta proteiini Z, joten monien kasvista peräisin olevien serpiinien nimessä on Z-kirjain (Roberts ja Hejgaard 2008). Z-kirjain kuvastaa sekvenssien samankaltaisuutta ohran proteiini
Z kanssa.
Vehnän serpiinit
Vehnän jyvästä on tunnistettu viisi erilaista serpiiniä puhdistamalla ja sekvensoimalla aminohappoja. (Østergaard ym. 2000). Ne muodostavat suurimman albumiiniryhmän vehnässä. Vehnän jyvässä on 3–4 mg:a serpiinejä / jyvä g:a kohti. Noin 40 %:a vehnän jyvän serpiineistä on vapaassa muodossa ja voidaan uuttaa jauhoista pelkän puskurin tai suolaliuoksen avulla. Loput vehnän serpiineistä on ns. latentissa muodossa ja ne voidaan uuttaa jauhoista jonkun pelkistimen tai pelkistämisen jälkeen veden avulla. Natiivissa jyvässä osa
serpiineistä on kiinni kiinni β-amylaasissa. Vehnän serpiinit on jaettu kahteen ryhmään
WSZ1- (WSZ1a, WSZ1b, WSZ1c) ja WSZ2 (WSZ2a ja WSZ2b) -serpiineihin. Kaikki
viisi serpiiniä inhiboivat seriinipeptidaaseja kymotrypsiini- ja katepsiini G -ryhmistä, tehokkaimmin kymotrypsiini -ryhmästä.
Vehnän serpiineistä useilla on sama toistuva Q–Q sekvenssi reaktiivisessa keskuksessa
kuin vehnän prolamiineilla. Vehnän serpiini WSZ1b:n reaktiivisessa keskuksessa P2–P1´
on peptidi PQQ, joka toistuu kahdesti γ-gliadiinin oktapeptidissä PQQPFPQQ. WSZ1a:n
reaktiivisessa
keskuksessa
P2–P1´
on
peptidi
LQQ,
joka
löytyy
myös
HMW-gluteenialayksiköiden toistuvasta sekvenssistä GYYPTSLQQ. Vehnästä on eristetty
lisäksi WSZ3, joka näyttäisi kuuluvan serpiinien ryhmään (Hejgaard 2005). WSZ3:n sekvenssiä ei täysin tunneta, mutta sitä voidaan pitää yhtenä vehnän serpiineistä. Sen reaktiivisessa keskuksessa P2–P5´ on sekvenssi QQQMPIV ja LMW-gluteenialayksiköissä on sek-
12
venssi QQQIPIV (Østergaard ym. 2000). Monessa vehnän serpiinissä on lisäksi P4´–P5´
kohdassa P–P sekvenssi, joka on yleinen prolamiineissa.
Vehnän ja ohran serpiinien aminohappokoostumus on 75 %:sesti samanlainen. Suurin ero
ohran ja vehnän serpiinien aminohapposekvensseistä löytyy reaktiivisesta keskuksesta.
Ohran serpiinien reaktiivisten keskusten inhibitiokohta muistuttaa eläinten serpiinejä, P1
kohdassa on aminohapot R, L tai M ja P1´ kohdassa S. Vehnän serpiineistä kahdella on
inhibitiokohdassa P1–P1´ Q–Q sekvenssi ja kahdella muulla P1´ kohdassa on aminohappo
Q. Yhdelläkään yli 200 eläimestä tai viruksesta tunnistetulla serpiinillä ei ole Q kohdassa
P1 ja vain yhdellä hyönteisestä löydetyllä serpiinillä on Q kohdassa P1´. Kirjallisuuskatsauksessa käytetyt aminohappojen lyhenteet löytyvät liitteestä 1.
Ohran serpiinit
Serpiinit ovat suurin albumiiniryhmä ohran endospermissä (Hejgaard ym. 1985). Pääsääntöisesti ohra sisältää 1,5–2,5 mg:a serpiinejä / jyvä g:a kohti, mutta määrä vaihtelee jonkin
verran lajikkeittain. Natiivissa jyvässä serpiineistä 20–30 %:a on vapaassa muodossa ja
loput (70–80 %:a) ovat ns. latentissa muodossa. Natiivissa jyvässä osa serpiineistä on liittynyt yhteen β-amylaasin kanssa. Serpiinien ja β-amylaasin latentit muodot vapautuvat
itämisen aikana, disulfidisidosten pelkistymisen tai proteolyyttisen prosessin aikana. Niiden vapaat muodot liukenevat veteen. Latentit muodot liukenevat tioliin tai pelkistyksen
jälkeen veteen. Ohran jyvästä on löydetty kolme geneettisesti samanlaista alaryhmää serpiinejä: BSZx, BSZ4 ja BSZ7 (Hejgaard 1982; Roberts ym. 2003), joiden molekyylimassat
n. 40 kDa:a. Ne ovat aminohapposekvensseiltään homologisia ihmisen α1-antitrypsiinin
kanssa, mutta eivät pysty assosioimaan tämän proteiinin kanssa.
Ohran serpiineistä BSZ4:ä ja BSZ7:ä esiintyy eniten täysin kehittyneessä jyvässä (Roberts
ym. 2003). Ne sijaitsevat tärkkelysendospermin keskellä ja reunoilla, subaleuroni ja
aleuroni kerroksissa. Itämisen aikana BSZ4:n määrän on todettu lisääntyvän 149–300 %:a
ja BSZ7:n 49–141 %:a (Evans ja Hejgaard 1999). Itämisen aikana suurin osa BSZ4:n ja
30–70 %:a BSZ7:n reaktiivisista keskuksista pilkkoutuu. BSZ4 ja BSZ7 serpiineillä on
reaktiivisessa keskuksessa inhibitiokohdassa P1–P1´ M–S tai R–S, kuten eläinten serpiineillä. BSZ4 inhiboi tehokkaimmin peptidaaseja katepsiini G- ja BSZ7 trypsiini -ryhmästä
(Dahl ym. 1996; Hejgaard 2005). BSZx inhiboi erilaisia peptidaaseja trypsiini-, kymotrysiini- ja katepsiini G -ryhmistä päällekkäisellä reaktiivisella keskuksella in vitro (Dahl ym.
13
1996; Roberts ym. 2003). BSZx:n reaktiivisella keskuksella on uniikki kyky adaptoitua
spesifisesti eri seriinipeptidaaseille (Dahl ym. 1996).
Ohrasta on lisäksi eristetty BSZ3, joka näyttäisi olevan serpiini (Hejgaard 2005). BSZ3:n
sekvenssiä ei täysin tunneta, mutta sitä voidaan pitää yhtenä ohran serpiineistä. BSZ3:lla
on reaktiivisen keskuksen inhibitiokohdissa P3–P1 tai P2–P1´ sekvenssi QQQ. BSZ3 inhiboi peptidaaseja kymotrypsiiniryhmästä irreversiibelisti.
Rukiin serpiinit
Rukiista on tunnistettu ja karakterisoitu kuusi serpiiniä (Hejgaard 2001). Rukiin serpiinejä
ovat RSZb, RSZc1, RSZc2, RSZd, RSZe ja RSZf. Jokaisen serpiinin reaktiivinen keskus
muodostaa palautumattoman kompleksin kymotrypsiiniä sisältävän peptidaasin kanssa
inhiboiden sitä. Rukiin serpiineillä on reaktiivisissa keskuksissa samankaltaisia aminohapposekvenssejä kuin sekaliineilla. Neljällä näistä serpiineistä (RSZb, c2, d ja e) on reaktiivisessa keskuksessa inhibitiokohdassa P2–P1´ tripeptidi SQQ tai QQS, joka on samankaltainen kuin rukiin γ-sekaliinien toistuva sekvenssi PQQP. Rukiin ω-sekaliinien rakenteessa
toistuu usein oktapeptidi PQQPFPQQ, jossa F on usein korvattu jollain muulla hydrofobisella aminohappotähteellä, kuten valiinilla tai tyrosiinilla. Rukiin serpiineistä RSZf:llä on
inhibitiokohdassa P2–P1 P–Y ja RSZc1:llä inhibitiokohdassa P3–P1 VPQ sekvenssi. Ilmeisesti paljon Q:a sisältävä reaktiivinen keskus toimii syöttinä prolamiineja pilkkoville peptidaaseille.
2.1.2 Inhibiittorit allergioissa ja yliherkkyyksissä
Vehnän amylaasi/trypsiini-inihibiittorit (ATI:t) kuuluvat seriinipeptidaasi-inhibiittoreihin
(Laing ja McManus 2002). Ne ovat ryhmä pieniä homologisia proteiineja, jotka ovat erittäin resistenttejä ruoansulatuskanavan proteolyyttisille entsyymeille (Sapone ym. 2012).
Amylaasi/trypsiini-inhibiittoreita on viljoissa, ne sijaitsevat endospermissä sekä niiden
molekyylimassat ovat n. 11,5–14 kDa:a (Laing ja McManus 2002). Yli 20 erilaista ATI:a
on tunnistettu (Carbonero ja Garcia-Olmedo 1999). ATI:t inhiboivat peptidaaseja ja
α-amylaaseja, pääasiassa toista näistä entsyymeistä (Laing ja McManus 2002). Viljan jyvän ATI:t pystyvät inhiboimaan nisäkkäiden ja hyönteisten entsyymejä, mutta eivät viljan
14
endogeenista α-amylaasia (Tatham ja Shewry 2008). Osa näistä inhibiittoreista on allergeeneja.
Hengitettynä allergisia oireita aiheuttavat vehnän α-amylaasi- ja rukiin amylaasi/trypsiini-inhibiittorit (Tatham ja Shewry 2008). Leipurin astma ja nuha ovat erittäin tunnettuja allergisia reaktioita, jotka johtuvat viljapölyn hengittämisestä. Leipurin astma on
nykyään yksi yleisimmistä työperäisistä astmoista. Diagnoosi perustuu yleensä ihon
prick-testiin
ja
verestä
löytyvään
spesifiseen
IgE:hen
eli
immunoglobuliini
E -vasta-aineeseen. α-amylaasi- ja amylaasi/trypsiini-inhibiittorit ovat suurin leipurin astmaa aiheuttava proteiiniryhmä, mutta niillä ei näytä olevan roolia ruoka-aineallergioissa.
Ruoka-aineallergioita aiheuttavat pääasiassa ohran, rukiin ja vehnän prolamiinit, erityisesti
ω-hordeiinit, -sekaliinit ja -gliadiinit. Vehnäallergikoilla ω5-gliadiini saattaa aiheuttaa jopa
hengenvaarallisen allergisen reaktion, anafylaktisen shokin.
Viljoissa esiintyvät ATI:t voivat vaikuttaa keliakian puhkeamiseen ja aiheuttaa gluteeniyliherkille ihmisille oireita. Vehnän ATI:en on todettu aktivoivan monosyyttien, makrofaagien ja dendriittisolujen luontaisen immuniteetin vasteen (Junker ym. 2012). ATI:t sitoutuvat
TLR4-MD2-CD14 -kompleksiin, jolloin solusta alkaa vapautua tulehduksellisia sytokiineja, sekä keliakiaa sairastavien että sairastamattomien potilaiden biopseissa. Lisäksi ATI:en
on esitetty olevan yksi tekijä tulehdus- ja immuunireaktioissa muissa suolistoperäisissä ja
ei-suolistoperäisissä immuunisairauksissa.
Ohran serpiini BSZ4 on tunnistettu toiseksi oluen allergeeneista (Garcia-Casado ym.
2001). Oluelle allergisilla henkilöillä ohran serpiini BSZ4 aiheuttaa IgE-välitteisiä allergisia reaktioita elimistössä ja iho-oireita (Figueredo ym. 1999; Fernandez-Anaya ym. 1999).
Vehnän serpiinien on osoitettu aiheuttavan immunologisia reaktioita keliaakikoiden veriseerumeissa
(Huebener
ym.
2014).
Tutkimuksessa
selvitettiin
erilaisten
ei-
gluteeniproteiinien aiheuttamia reaktioita keliakiaa ja autoimmuunitauteihin kuuluvaa ihottumaa sairastavien henkilöiden veriseerumeissa. Eniten immunologisia reaktioita potilaiden veriseerumeissa aiheutti vehnän serpiinit. Johtopäätöksenä tutkijat esittivät, että keliaakikoiden reaktiot vehnään eivät johdu pelkästään gluteeniproteiinien antigeeneista, vaan
myös spesifisistä ei-gluteeniproteiineista.
15
2.2 Proteiinit keliakiassa ja gluteeniyliherkkyydessä
Prolamiinit ovat viljojen päävarastoproteiineja (Shewry ja Tatham 1990). Viljan jyvässä
kaikista proteiineista varastoproteiineja on n. puolet. Prolamiineja esiintyy kaikissa viljoissa, mutta keliaakikoille haitallisia prolamiineja on Triticeae- suvun viljoissa, eli ohrassa,
rukiissa ja vehnässä. Näiden viljojen prolamiineissa olevat spesifiset aminohapposekvenssit laukaisevat gluteenille alttiilla henkilöllä ohutsuolen limakalvolla T-soluvälitteisen immuunireaktion (Vader ym. 2003).
2.2.1 Triticeae- suvun viljojen prolamiinit
Ohran prolamiineja kutsutaan hordeiineiksi, rukiin sekaliineiksi ja vehnän gliadiineiksi,
(Shewry ja Tatham 1990). Prolamiinien rakenteessa toistuvat usein proliinia ja glutamiinia
sisältävät aminohapposekvenssit. Prolamiinit voidaan luokitella aminohappokoostumuksen
mukaan kolmeen ryhmään: rikkiä sisältäviin, rikittömiin ja suurimolekyylimassaisiin eli
HMW (engl. high molecular weight) (taulukko 1). Rakenteeltaan prolamiinit voivat olla
monomeerisiä tai polymeerisiä.
Taulukko 1. Ohran, rukiin ja vehnän prolamiinien luokittelu (Shewry ja Tatham 1990; Shewry ja Halford
2002).
Prolamiini
Ohra
Ruis
Vehnä
γ-hordeiini
γ-sekaliini
γ-gliadiini
Rikkiä sisältävä
Monomeerinen
α-gliadiini
β-gliadiini
Polymeerinen
B-hordeiini
LMW-gluteenialayksikkö
Rikittömät
C-hordeiini
ω-sekaliini
ω-gliadiini
HMW
D-hordeiini
HMW-sekaliini HMW-gluteenialayksikkö
16
Triticeae- suvun viljoissa on eniten rikkiä sisältäviä prolamiineja (Shewry ja Tatham
1990). Niitä on 70–80 %:a kaikista prolamiineista ja ne ovat molekyylimassaltaan 30–110
kDa:a. Rikkiä sisältävistä prolamiineista monomeerisiä ovat ohran γ-hordeiinit, rukiin γsekaliinit ja vehnän γ-, β- ja α -gliadiinit. Polymeerisiä prolamiineja ovat ohran B-hordeiini
ja vehnän matalamolekyylimassaiset eli LMW (engl. low molecular weight)gluteenialayksiköt.
HMW (engl. high molecular weight)-prolamiinien molekyylimassat ovat 65–90 kDa:a ja
niitä on n. 6–10 %:a kaikista Triticeae-suvun viljojen prolamiineista (Shewry ja Halford
2002). HMW-prolamiineja ovat ohran D-hordeiinit, rukiin HMW-sekaliinit ja vehnän
HMW-gluteenialayksiköt (Shewry ja Tatham 1990). Polymeeriset prolamiinit, D-hordeiinit
sekä HMW-sekaliinit ja -gluteenialayksiköt kykenevät muodostamaan molekyylien välisiä
rikkisidoksia, joiden avulla ne voivat muodostaa laajoja molekyylejä. Monomeeriset prolamiinit kykenevät muodostamaan vain molekyylin sisäisiä rikkisidoksia. Triticeae-suvun
viljoissa rikittömiä prolamiineja on n. 10–20 %:a ja niiden molekyylimassat ovat 30–78
kDa:a. (Shewry ja Tatham 1990). Tähän ryhmään kuuluvat ohran C-hordeiinit, rukiin ωsekaliinit ja vehnän ω-gliadiinit. Kirjallisuuskatsauksessa käytetyt aminohappojen lyhenteet löytyvät liitteestä 1.
Ohran hordeiinit
Ohra sisältää 10–12 %:a kuivapainostaan proteiineja, joista 35–55 %:a on hordeiineja (Celus ym. 2006). Hordeiinit ovat suurin varastoproteiiniryhmä ohrassa. Ohran hordeiinit jaetaan neljään ryhmään aminohappokoostumuksen perusteella: B-, C-, D- ja γ -hordeiineihin
(Shewry ym. 1999). B-hordeiineja on 70–80 %:a, C-hordeiineja on 10–20 %:a, D- ja
γ -hordeiineja yhteensä n. 5 %:a.
Monomeerisia hordeiineja ovat C- ja γ -hordeiinit. C-hordeiinit ovat molekyylimassaltaan
55–70 kDa:a ja ne ovat ohran toiseksi suurin hordeiiniryhmä (Shewry ja Tatham 1990).
Niiden proteiiniketju koostuu 440 aminohappotähteestä, jossa toistuu lähes pelkästään oktapeptidi PQQPFPQQ. Pääasiassa C-hordeiinien aminohapot ovat glutamiinia (40 mol- %),
proliinia (30 mol- %) ja fenyylialaniinia (8–9 mol- %). C-hordeiineilla on uniikki sekundäärirakenne β-käännös, α-spiraalin tai β-laskoksen sijasta (Field ym. 1986). Rakennetta
näyttäisi stabiloivan vahvat hydrofobiset vuorovaikutukset ja vetysidokset (Tatham ym.
1985). γ-hordeiineilla on rakenteessaan toistuva oktapeptidi PQQPFPQQ. γ-hordeiinien
17
aminohapoista n. 30 mol- % on glutamiinia ja n. 17 mol- % proliinia. Ohran prolamiineista
γ-hordeiineja on vain hyvin pieni osa.
Polymeerisiä hordeiineja ovat B- ja D -hordeiinit. B-hordeiinit ovat molekyylimassaltaan
36–44 kDa:a ja ne ovat suurin hordeiiniryhmä ohrassa (Shewry ym. 1985; Shewry ja Tatham 1990). B-hordeiinien proteiiniketjun aminohapposekvensseissä toistuu usein peptidi
PQQP (Shewry ja Tatham 1990). B-hordeiinien aminohapoista n. 30 mol- % on glutamiinia ja n. 20 mol- % proliinia (Shewry ym. 1999). D-hordeiinit ovat molekyylimassaltaan
90–110 kDa:a (Shewry ja Tatham 1990). D-hordeiinien proteiiniketju koostuu 686 aminohappotähteestä, joissa usein toistuu heksapeptidi P/GHQGQQ ja peptidi GYYPSXTSPQQ
(Shewry ym. 1999). D-hordeiinien aminohapoista n. 26 mol- % on glutamiinia, n. 10 mol% proliinia ja n. 16 mol- % glysiiniä. γ-hordeiinit ovat molekyylimassaltaan 36–44 kDa:a
ja ne koostuvat 250–300 aminohappotähteestä (Shewry ja Tatham 1990).
Rukiin sekaliinit
Rukiin jyvässä on proteiineja n. 10 %:a kokonaispainosta (Gellrich ym. 2003). Näistä proteiineista prolamiineja on n. 65 %:a, gluteliineja n. 9 %:a ja albumiineja ja globuliineja n.
26 %:a. Vehnään verrattuna rukiissa on enemmän albumiineja ja globuliineja, ja vähemmän gluteliineja. Rukiin prolamiinit eli sekaliinit voidaan jakaa neljään ryhmään:
γ75k-sekaliineihin, γ40k-sekaliineihin, ω-sekaliineihin ja HMW-sekaliineihin. Rukiin sekaliineista γ75k-sekaliineja on n. 46 %:a, γ40k-sekaliineja on n. 24 %:a, ω-sekaliineja on n.
17 %:a ja HMW-sekaliineja on n. 7 %:a.
Monomeerisiä sekaliineja ovat γ40k-sekaliinit ja ω-sekaliinit. γ40k-sekaliinien molekyylimassat ovat 36–44 kDa:a ja ne ovat toiseksi suurin sekaliiniryhmä rukiissa (Shewry ja Tatham 1990; Gellrich ym. 2003). γ40k-sekaliinien aminohapoista n. 40 mol- % on glutamiinia ja n. 20 mol- % proliinia ja niiden rakenteessa toistuu peptidi PQQPFPQ (Shewry ym.
1999). ω-sekaliinien molekyylimassat ovat 48–53 kDa:a (Shewry ja Tatham 1990). ωsekaliinien aminohapoista n. 40 mol- % on glutamiinia, n. 30 mol- % proliinia ja n. 7 mol% fenyylialaniinia (Shewry ym. 1999). ω-sekaliinien rakenteessa toistuu aminohapposekvenssi PQQPFPQQ.
18
Polymeerisiä sekaliineja ovat γ75k-sekaliinit ja HMW-sekaliiinit. γ75k-sekaliinien molekyylimassat ovat n. 75 kDa:a ja ne ovat suurin sekaliiniryhmä rukiissa (Shewry ja Field
1982; Gellrich ym. 2003). γ75k-sekaliinien aminohapoista n. 40 mol- % on glutamiinia ja
n. 20 mol- % proliinia (Gellrich ym. 2003). γ75k-sekaliinien aminohappoketjussa toistuu
peptidi PQQPFPQ (Shewry ym. 1999). HMW-sekaliinien molekyylimassat ovat n. 100
kDa:a ja ne ovat pienin sekaliiniryhmä rukiissa (Shewry ym. 1983; Gellrich ym. 2003).
HMW-sekaliinien aminohapoista glutamiinia on n. 34 mol- %, proliinia n. 14 mol- % ja
glysiiniä n. 17 mol- % (Shewry ym. 1999). HMW-sekaliinien rakenteessa toistuvat peptidit
GQQ, PGQGQQ ja GYYPTSPQQ.
Vehnän gliadiinit ja gluteenialayksiköt
Vehnän jyvässä on n. 12–14 %:a proteiinia (Wieser 2000). Proteiineista n. 80 %:a on prolamiineja, loput albumiineja ja globuliineja (Delcour ym. 2012). Vehnän prolamiinit voidaan
jakaa
kuuteen
ryhmään:
α-,
β-,
ω-,
ja
γ
-gliadiineihin,
HMW-
ja
LMW -gluteenialayksiköihin (Wieser 2007). Gliadiineista α ja β luokitellaan yleensä vain
α-gliadiineihin niiden samanlaisen rakenteen vuoksi. Erottelumenetelmät eivät aina kykene
tunnistamaan α- ja β -gliadiineja erikseen. Vehnän prolamiineista 28–33 %:a on
α-gliadiineja, 23–31 %:a γ-gliadiineja, 7–13 %:a ω-gliadiineja, 19–25 %:a LMWgluteenialayksiköitä ja n. 10 %:a HMW-gluteenialayksiköitä. Vehnän prolamiineista monemeerisiä ovat gliadiinit ja polymeerisiä gluteenialayksiköt.
Vehnän prolamiineista monomeerisiä ovat gliadiinit. α-gliadiinit ovat molekyylimassaltaan
28–35 kDa:a ja ne koostuvat 250–300 aminohappotähteestä (Shewry ja Tatham 1990;
Wieser 2007). α-gliadiinien aminohapoista n. 35 mol- % on glutamiinia ja n. 30 mol- %
proliinia. α-gliadiinien rakenteessa toistuu dodekapeptidi QPQPFPQQPYP (Wieser 2007).
γ-gliadiinit ovat molekyylimassaltaan 31–35 kDa:a. Yhdessä α-gliadiinien kanssa γgliadiinit muodostavat n. 80 % vehnän gliadiineista (Shewry ja Tatham 1990). γ-gliadiinit
koostuvat 250–300 aminohappotähteestä ja niiden aminohapoista n. 35 mol- % on glutamiinia ja n. 16 mol- % proliinia (Shewry ja Tatham 1990; Shewry ym. 1999). γ-gliadiinien
rakenteessa toistuu peptidi PQQPFP (Wieser 2007). ω-gliadiinit ovat molekyylimassaltaan
39–55 kDa:a. ω-gliadiinit sisältävät paljon glutamiinia, proliinia ja fenyylialaniinia ja niitä
on n. 80 mol- % kaikista aminohapoista. ω-gliadiinien rakenteessa toistuu peptidi
PQQPFPQQ.
19
Vehnän prolamiineista polymeerisiä ovat gluteenialayksiköt. LMW-gluteenialayksiköt
ovat molekyylimassaltaan 32–39 kDa:a (Wieser 2007). Niiden rakenteessa toistuu paljon
proliinia sisältävä peptidi QQQPPFS. HMW-gluteenialayksiköt ovat molekyylimassaltaan
67–88 kDa:a. HMW-gluteenialayksiköiden sisältämistä aminohapoista glutamiinia on n. 38
mol- %, proliinia n. 13 mol- % ja glysiiniä n. 19 mol- %. HMW-gluteenialayksiköissä
toistuvat heksapeptidi QQPGQ ja nonapeptidi QYYPTS-P/L-QQ (Shewry ja Tatham
1990).
2.2.2 Keliakia ja prolamiinit
Keliakia on autoimmuunisairaus, jossa ohran, rukiin ja vehnän prolamiinit laukaisevat gluteenille alttiilla henkilöllä ohutsuolessa tulehdusvasteen (Shan ym. 2002; Vader ym. 2003).
Prolamiinien laukaiseman immuunireaktion seurauksena ohutsuolen limakalvon nukka
surkastuu (Vader ym. 2003). Suolinukan surkastuminen johtaa ohutsuolen tulehtumiseen ja
ravintoaineiden imeytymishäiriöihin. Yleisimmät keliakian oireet ovat krooninen tai verinen ripuli, laihtuminen, turvotus, ilmavaivat ja suun haavaumat. Diagnosoimaton keliakia
tai huonosti noudatettu gluteeniton dieetti, johtavat lopulta erilaisiin terveydellisiin ongelmiin (Brousse ja Meijer 2005). Diagnosoituja terveydellisiä ongelmia ovat mm. osteoporoosi, muut autoimmuunisairaudet, ohutsuolen karsinoomat, lymfoomat ja hedelmättömyys
(Green ym. 2003; Brousse ja Meijer 2005; Corazza ym. 2005).
Keliakian patogeneesi
Keliakia on suolistosairaus, jolla on monitekijäinen etiologia (Sollid 2000). Keliakian laukaisevana tekijänä ovat yhdessä geneettiset ja ympäristölliset tekijät. Ympäristötekijänä
immuunireaktion laukaisee geneettisesti alttiilla henkilöillä gluteeniproteiinit (Bergseng
ym. 2008). Keliakian tärkein geneettinen tekijä on HLA (engl. human leukocyte antigen)-DQ2- ja HLA-DQ8 -alleelien esiintyminen (Sollid ym. 1989). Keliaakikoilla ohutsuolen limakalvon läpäisemät gluteeniproteiinit voi laukaista immuunireaktion elimistössä
kahta eri reittiä: hankinnaisen tai luontaisen immuniteetin kautta (Wieser ja Kohler 2008).
Hankinnaisen immuniteetin kautta tapahtuvassa immuunireaktiossa HLA-DQ2- ja HLADQ8 -alleelit esittelevät gluteenipeptidit CD4+T -soluille (Bergseng ym. 2008). Luontaisen
immuniteetin kautta tapahtuvassa immuunireaktiossa gluteenipeptidit aiheuttavat ohut-
20
suolen limakalvolla nopean reaktion lisäten tulehdustekijöiden tuotantoa elimistössä
(Brandtzaeg 2006; Wieser ja Kohler 2008). Alun perin keliakiaa pidettiin hankinnaisen
immuniteetin kautta tapahtuvana reaktiona. Kuitenkin nykyään myös luontaisen immuniteetin kautta tapahtuvalla reaktiolla on osoitettu olevan rooli keliakian patogeneesissa
(Tuckova ym. 2002; Nikulina ym. 2004; Palova-Jelinkova ym. 2005).
Hankinnaisen immuniteetin kautta tapahtuvassa immuunireaktiossa ruoansulatusentsyymeille resistentit gluteenipeptidit läpäisevät kokonaisina ohutsuolen limakalvon epiteelikerroksen (Koning ym. 2005; Bergseng ym. 2008). Ohutsuolen epiteelikerroksessa kudostransglutaminaasientsyymi (tTG2) muuttaa gluteenipeptidien glutamiinit glutamiinihapoksi
deamidaatiolla (van de Wall ym. 1998). Deamidoidut gluteenipeptidit sitoutuvat
HLA-DQ2/8 -alleeliin, jotka esittelevät ne CD4+T -soluille (Koning ym. 2005; Bergseng
ym. 2008). (kuva 2). Tämä johtaa tulehdustekijöiden, esim. vasta-aineiden ja sytokiinien
tuotannon lisääntymiseen elimistössä.
Kuva 2. Keliakian patogeneesi. Ohutsuolen harjareunuksen tuottamille entsyymeille resistentit gluteenipeptidit eivät pilkkoudu ruoansulatuksessa, jolloin ne kulkeutuvat kokonaisina limakalvon epiteelikerroksen läpi.
Kudostransglutaminaasientsyymi (TG2) deamidoi gluteenipeptidit yleisimmin limakalvon epiteelissä, osittain myös harjareunuksessa. Limakalvon tukikerroksen CD4+T -solut tunnistavat HLA-DQ2/8 -molekyylien
esitteleminä deamidoidut gluteenipeptidit antigeenejä esittelevien solujen (engl. antigen precenting cell,
APC) pinnalla. (Sollid 2002).
21
Keliaakikolle haitalliset proteiinit ja peptidit
Keliaakikoille haitallisissa proteiineissa prolamiineissa on paljon proliinia ja glutamiinia,
jotka esiintyvät toistuvissa sekvensseissä (Vader ym. 2003; Darewicz ym. 2007). Nämä
aminohapot ja niiden muodostavat sekvenssit ovat haitallisia keliaakikoille. Haitallisimmat
peptidit ovat α-gliadiinien N-pään toistuvat aminohapposekvenssit, joissa on proliinin ja
glutamiinin lisäksi joko fenyylialaniini tai tyrosiini (Wieser ja Koehler 2008).
α-gliadiineissa toistuvat eniten tetrapeptidit PSQQ ja QQQP, joiden tunnistaminen oli
avain muiden toksisten peptidien tutkimiselle (de Ritis ym. 1988).
Viime vuosina tutkimus on mennyt siihen suuntaan, että haitallisten peptidien tunnistamisessa käytetään T-soluja aktivoivia synteettisiä pepetidejä (Wieser ja Koehler 2008). Synteettisiä peptidejä on johdettu mm. α- ja γ -gliadiineista, hordeiineista ja aveniineista (Wieser ja Koehler 2008). Suurin osa synteettisistä peptideistä täytyy osittain deamidoida eli
käsitellä transglutaminaasientsyymillä, jotta ne stimuloivat T-soluja. Myös elimistössä gluteenipeptidien glutamiinin on todettu muuttuvan deamidaatiolla negatiivisesti varautuneeksi glutamiinihapoksi, ennen kuin ne kykenevät sitoutumaan HLA-DQ2/8 -molekyyliin (van
de Wall ym. 1998). Elimistössä deamidaatio tapahtuu ohutsuolessa kudostransglutaminaasientsyymin tTG2 vaikutuksesta. Eri tutkimuksissa tunnistettuja T-soluja stimuloivia
peptidejä löytyy gliadiineista, gluteeenialayksiköistä, hordeiineista, sekaliineista ja aveniineista (taulukko 2).
22
Taulukko 2. Muutamia keliaakikoilla T-soluvasteen aiheuttavia peptidejä ja niiden aminohapposekvenssit.
Peptidi
Sekvenssi
Lähde
α-gliadiini (57–68)
QLQPFPQPQLPY
Arentz-Hansen ym. 2000
α-gliadiini (56–88)
LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLP
Shan ym. 2002
YPQPQPF
α-gliadiini (226–237)
PSGQGSFQPSQQ
van de Wal ym. 1998
γ-gliadiini (66–78)
FPQQPQQPYPQQP
Arentz-Hansen ym. 2002
γ-gliadiini (102–113)
FSQPQQQFPQPQ
Arentz-Hansen ym. 2002
γ-gliadiini (222–236)
VQGQIIPQQPAL
Vader ym. 2002
LMW-gluteenialayksikkö
QQQQPPFSQQQQSPPS
Vader ym. 2002
LMW-gluteeenialayksikkö
QQPPFSQQQQPLPQ
Vader ym. 2002
HMW-gluteeenialayksikkö
GQQGYYPTSPQQS
van de Wal ym. 1999
sekaliini α2
QPFPQPQQQPFPQSQ
Vader ym. 2003
hordeiini α2
QQFPQPQQPFPPQQP
Vader ym. 2003
aveniini α9
QYQPYPEQQQEPFVQ
Vader ym. 2003
Yksi tunnetuimmista ja tutkituimmista aminohapposekvensseistä on α-gliadiinista johdettu
peptidi 33-meeri (LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF) (Shan ym. 2002).
33-meeri on kiinnostava kahdesta syystä. Ensiksi 33-meeri on hyvin stabiili ruoansulatuskanavan proteolyyttisille entsyymeille, eikä helposti pilkkoudu pienemmiksi peptideiksi.
Toiseksi 33-meeri sisältää kolme erilaista T-soluja aktivoivaa peptidiä; PFPQPQLPY,
PQPQLPYPQ ja PYPQPQLPY. 33-meeriä käytetään usein tutkimuksissa keliaakikoille
haitallisten peptidien mallina.
23
2.2.3 Gluteeniyliherkkyys
Gluteeniyliherkkyyden patogeneesi on vielä tutkimuksen alla (Catassi ym. 2013). Gluteeniyliherkkyyttä sairastavilla potilailla ei synny samoja tulehdustekijöitä kuin keliakiassa
(Sapone ym. 2010). Lisäksi gluteeniyliherkkyydestä kärsivillä ihmisillä ohutsuolen nukka
on yleensä normaali. Joillakin ihmisillä gluteenia sisältävä ruokavalio aiheuttaa samoja
oireita kuin keliaakikoilla, vaikka allergista- tai autoimmuunireaktiota ei pystytä todentamaan (Biesiekierski ym. 2010; Sapone ym. 2012). Yleensä gluteeniyliherkkyys on kyseessä, kun keliakia, allergia tai muut tekijät on suljettu pois. Kaksoissokkokokeena tehdyn
tutkimuksen mukaan ärtyneen suolen oireyhtymästä kärsivillä potilailla, joilla ei ollut keliakiaa, gluteeni aiheutti suolisto-oireita (Biesiekierski ym. 2010). Kuitenkaan suolistossa
ei havaittu tulehdusta tai vaurioita, eikä piilevää keliakiaa selittämään gluteenin aiheuttamia oireita. Tämän vuoksi tutkijoiden johtopäätöksenä oli, että gluteeni-introleranssia, joka
ei ole keliakiaa, voi esiintyä.
Sapone ym. (2010) mukaan interleukiini-17 eritys lisääntyi keliaakikoiden, mutta ei gluteeniyliherkkien biopseissa. Interleukiini-17 on hankinnaisen immuunireaktion merkkiaine.
Sapone ym. (2011) mukaan gluteeniyliherkillä potilailla suolen läpäisevyys ei ole lisääntynyt, kuten keliaakikoilla. Samassa tutkimuksessa tutkittiin hankinnaisen ja luontaisen immuunireaktion merkkiaineita. Hankinnaisen immuniteetin merkkiaineita (interleukiini-6 ja
-12) ei esiintynyt gluteeniyliherkillä potilailla, toisin kuin keliaakikoilla. Luontaisen immuniteetin merkkiaineen TLR (engl. toll-like reseptor)-2:n määrä lisääntyi, toisin kuin keliaakikoilla. Voi olla, että gluteeniyliherkkyys eroaa keliakiasta erilaisen immuunireaktion
vuoksi. Gluteeniyliherkkyys ilmeisesti aktivoi luontaisen immuniteetin vasteen. Aiheesta
tarvitaan lisää tutkimusta, koska gluteeniyliherkkyydelle ei ole olemassa biomarkkereita,
joita voitaisiin tutkia laboratoriokokein (Sapone ym. 2012). Tämän vuoksi diagnoosi
yleensä perustuu gluteenin eliminointiin ruokavaliosta. Uusien tutkimusten mukaan viljoissa esiintyvät inhibiittorit saattavat olla yksi gluteeniyliherkkyyden aiheuttajista. Viljoissa
esiintyvien amylaasi/trypsiini-inhibiittoreiden on esitetty olevan uusi myötävaikuttaja keliakian synnyssä ja yksi gluteeniyliherkkyyden aiheuttajista (Junker ym. 2012). Vehnän
serpiinien on osoitettu aiheuttavan immunologisia reaktioita keliaakikoiden verinseerumeissa ja olevan mahdollisesti yksi myötävaikuttaja keliakian synnyssä (Huebener ym.
2014).
24
2.3 Proteiinien hydrolyysi
Entsyymit ovat proteiineja, joita esiintyy kaikissa elävissä organismeissa ja luonnosta niitä
löytyy useita tuhansia erilaisia (Tucker 1995; Mathewson 1998). Entsyymeillä on useita
tehtäviä soluissa, mutta pääsääntöisesti ne tuottavat ravintoaineista energiaa ja kasvuun
tarvittavia aineita. Entsyymit toimivat biologisina katalyytteina, eli ne nopeuttavat kemiallisia reaktioita kulumatta itse sen aikana. Entsyymit ovat spesifisiä substraatille ja katalysoimalleen reaktiolle (Tucker 1995). Tämän vuoksi puhutaan lukko ja avain käsitteestä,
eli vain tietty entsyymi ja substraatti linkittyvät yhteen. Yleisesti entsyymit luokitellaan
niiden katalysoimien reaktioiden ja nimetään substraatin mukaan (Tucker 1995).
2.3.1 Proteiineista peptidejä
Proteiinit ovat lineaarisia polymeerejä, jotka ovat rakentuneet aminohapoista peptidisidoksin (Kunst 2003). Proteiinien hydrolyysi tarkoittaa peptidisidoksen katkaisemista hapon,
emäksen tai entsyymin avulla. Proteiinien hydrolyysissä syntyy lyhyempiä peptidejä ja
vapaita aminohappoja. Entsymaattinen hydrolyysi on miedompi ja spesifisempi, kuin hapolla tai emäksellä tehty. Proteolyyttiset entsyymit katkaisevat proteiineja tai peptidejä
spesifisten peptidisidosten kohdalta (Whitaker 2003). Proteolyyttiset entsyymit eivät täysin
tehoa natiiviin proteiinin, joten proteiinin tulee olla denaturoitunut. Tavallisissa ruoanvalmistusprosesseissa proteiinit denaturoituvat. Proteolyyttisten entsyymien aktiivisuus ja
katalyyttinen spesifisyys määräytyy katkaistavan peptisidoksen sijainnin mukaan. Proteolyyttisten entsymien tehokkuuteen vaikuttavat pH, lämpötila ja entsyymin määrä (Kunst
2003; Whitaker 2003).
Proteolyyttiset enstyymit ovat ryhmä erilaisia proteaaseja ja peptidaaseja (Gänzle ym.
2008). Proteaasit pilkkovat proteiinit pienemmiksi peptideiksi, peptidaasit pilkkovat spesifisiä peptidisidoksia tai pilkkovat peptidit täydellisesti vapaiksi aminohapoiksi. Tässä kirjallisuuskatsauksessa proteolyyttisiä entsyymejä kutsutaan yksinkertaisesti peptidaaseiksi.
Peptidaasit jaetaan aktiivisen paikan mukaan kahteen ryhmään, ekso- ja endopeptidaaseihin (Rao ym. 1998). Eksopeptidaasit pilkkovat peptidisodoksia läheltä proteiiniketjun amino- tai karboksyylipäätä, kun endopeptidaasit pilkkovat peptidisidoksia keskeltä proteiiniketjua (kuva 3). Eksopeptidaaseja ovat amino- ja karboksipeptidaasit. Aminopeptidaasit
pilkkovat peptidisidoksia proteiiniketjun aminopäästä ja karboksipeptidaasit karboksyylihappopäästä (Rao ym. 1998; Whitaker 2003). Endopeptidaasit jaetaan aktiivisen keskuksen
25
mukaan neljään ryhmään; seriini-, aspartyyli-, kysteiini- ja metallopeptidaaseihin (Rao ym.
1998).
a)
b)
Kuva 3. Eksopeptidaasien ja endopeptidaasien toimintaperiaate. Eksopeptidaasit (a) katkaisevat peptidisidoksia amino- tai karboksyyli- eli terminaalipäästä, tuottaen di- tai tri -peptidejä tai vapaita aminohappoja
tai ne pilkkovat vain tietyn kokoisia peptidejä (mustat pallot kuvastavat aminohappoja peptidiketjun terminaalipäissä). Endopeptidaasit (b) katkaisevat peptidisidoksia peptidiketjun keskeltä, tuottaen peptidejä. Nuolet osoittavat kohdan josta entsyymi katkaisee peptidisidoksen (Rao ym. 1998).
2.3.2 Prolamiinien hydrolyysi perinteisillä menetelmillä
Viljan varastoproteiinit eli prolamiinit toimivat aminohapoista saatavan typen varastona,
kunnes sitä tarvitaan alkion kasvuun (Simpson 2001). Prolamiineissa on paljon kahta aminohappoa; proliinia ja glutamiinia. Proliini on uniikki aminohappo rengasrakenteensa
vuoksi (Cunningham ja O’Connor 1997) (kuva 4).
Kuva 4. Aminohappojen ja proliinin rakenteelliset ominaisuudet ja eroavaisuudet. a) Aminohappojen perusrakenne: karboksyyli-, amino- ja R-ryhmä ovat kiinnittyneet kiraaliseen α-hiileen (C´). Proliinissa amiini ja
–CH2–CH2–CH3 -ryhmä luovat syklisen rakenteen (Cunningham ja O’Connor 1997).
26
Proliinin spesifinen konformaatio rajoittaa peptidien ja proteiinien rakenteellisia ominaisuuksia, kuten rotaatiota (Cunningham ja O’Connor 1997). Proliinit eivät kykene muodostamaan vetysidoksia, mikä vaikuttaa peptidiketjun rotaatioon ja tekee siitä joustamattoman
(Simpson 2001). Tämä ominaisuus tekee proliineja sisältävistä proteiineista resistenttejä
useille entsyymeille. Proliinin fysiologinen tehtävä on suojata biologisesti aktiivisia peptidejä entsymaattiselta pilkkoutumiselta (Cunningham ja O’Connor 1997). Proliinia sisältävien peptidiketjujen entsymaattinen pilkkominen vaatii spesifisiä peptidaaseja. Proliinispesifisiä peptidaaseja eli prolyylipeptidaaseja on luontaisesti viljan jyvässä ja lisäksi muutamat mikrobit pystyvät tuottamaan niitä. Tutkimusten mukaan prolamiineja voidaan pilkkoa idätyksen, hapantaikinafermentaation, mikrobien tuottamien entsyymien tai hapetuksen avulla.
Idätys
Mallastus on kontrolloitua itämistä, jonka aikana jyvässä syntyy ja aktivoituu paljon välttämättömiä hydrolyyttisiä entsyymejä. (Autio ym. 2001; Osman ym. 2002). Hydrolyyttisistä entsyymeistä osa on varastoitu jyvän endospermiin, mutta suurin osa syntyy vasta itämisvaiheessa (Simpson 2001). Itävässä jyvässä syntyviä hydrolyyttisiä entsyymejä ovat
esim. peptidaasit ja amylaasit. Itävässä jyvässä entsyymiaktiivisuus alkaa lisääntyä gibberelliinihormonin vaikutuksesta. Itämisen aikana jyvän varastoproteiinit pilkkoutuvat peptidaasien vaikutuksesta peptideiksi ja vapaiksi aminohapoiksi. (Jones 2005). Proteiinien
pilkkoutuminen tuottaa rakennusaineita uuden alkion kasvuun. Tämän vuoksi proteolyyttisten entsyymien toiminta on välttämätöntä itämisen aikana (Osman ym. 2002). Itämisen
aikana aleuronista erittyvien happojen vaikutuksesta endospermin pH laskee arvoon 5,
joten aktiivisimpia ovat pH:ssa 4–5,5 toimivat peptidaasit (Johnson 2001).
Itävästä jyvästä on löydetty yli 40 erilaista peptidaasia, jotka ovat kysteiini-, aspartyyli-,
seriini- ja metallopeptidaaseja (Jones ym. 2005). Kysteiinipeptidaasit osallistuvat idätyksen
aikana proteiinien pilkkomiseen yhdessä aspartyylipeptidaasien kanssa (Jones ym. 2005).
Seriini- ja metallopeptidaaseille ei näytä olevan roolia idätyksen aikana tapahtuvassa proteiinien pillkomisessa. Oluenvalmistuksessa metallopeptidaasit pilkkovat proteiineja mäskäysvaiheen aikana. Karboksi- ja aminopeptidaasit osallistuvat proteiinien pilkkomisesta
syntyneiden oligo-, tri- ja di -peptidien pilkkomiseen vapaiksi aminohapoiksi.
27
Tutkimusten mukaan idätyksen aikana vehnän, ohran ja rukiin jyvässä syntyvät entsyymit
pilkkovat tehokkaasti peptidiä PQPQLPYPQPQLPY (Schwalb ym. 2012). Ohran jyvässä
itämisen aikana muodostuvien entsyymien on todettu pilkkovan tehokkaasti rukiin sekaliineja in vitro, sekä vehnän gliadiineja ja ohran C-hordeiineja (Davy ym. 2000; Stenman ym.
2010).
Hapantaikinafermentaatio
Hapantaikinafermentaation aikana tapahtuva proteiinien pilkkoutuminen perustuu hapantaikinassa oleviin happamiin olosuhteisiin (Loponen 2006). Hapantaikinafermentaatio on
perinteinen tapa valmistaa ruis- ja vehnäleipää (Gänzle ym. 2008). Hapantaikina on systeemi, jossa pH vaihtelee maitohappobakteerien glukoosista tuottaman maitohapon vaikutuksesta (Loponen ym. 2007). Syntyvä maitohappo alentaa hapantaikinan pH:a, jolloin
happamassa toimivat peptidaasit aktivoituvat (Gänzle ym. 2008). Viljojen endogeeniset
peptidaasit ovat pääasiassa aspartyyli- ja karboksipeptidaaseja. Molemmat entsyymit ovat
aktiivisia happamissa olosuhteissa ja osittain pilkkovat prolamiineja (Gänzle ym. 2008;
Loponen 2006).
Hapantaikinafermentaation aikana aktivoituvien peptidaasien on todettu pilkkovan vehnän
gliadiineja ja niistä johdettuja peptidejä PQPQLPYSQPQPFR (62–75) ja 33-meeriä,
LMW- ja HMW -gluteenialayksiköitä sekä rukiin sekaliineja (Zotta ym. 2006; De Angelis
ym. 2006a, 2006b; Wieser ym. 2008). Hapantaikinafermentaation jälkeen gliadiineista
johdetut peptidit PQPQLPYSQPQPFR (62–75) ja 33-meeri eivät olleet enää keliaakikoille
haitallisia in vitro (De Angelis ym. 2006a). Käyttämällä hapantaikinafermentaatiossa mukana mallasta tai proliinispesifisiä endopeptidaaseja saadaan aikaan erittäin tehokas prolamiinien hydrolyysi. Tutkimusten mukaan lisäämällä vehnämallasta vehnähapantaikinaan
vehnän prolamiineista yli 95 %:a pilkkoutui ja lisäämällä ruishapantaikinaan ruismallasta
rukiin prolamiineista yli 99,5 %:a pilkkoutui (Loponen ym. 2007; Loponen ym. 2009).
Yhdistämällä hapantaikinafermentaatio ja kahden mikrobin tuottamat prolyyliendopeptidaasit, saatiin vehnän gluteenipitoisuus laskemaan alle 20 ppm (engl. parts per million)
(Rizzello ym. 2007). Näin käsitelty vehnä ei ollut enää keliaakikoille haitallista in vitro.
28
2.3.3 Prolyyliendopeptidaasit
Prolyyliendopeptidaaseja (PEP) tuottavat yleisimmin mikrobit tai kasvit (Sollid ja Khosla
2005). Ihminen kykenee tuottamaan PEP:ja, mutta vain solujen sytosoleissa. Tämän vuoksi
ihmisen omat PEP:t eivät osallistu ruoansulatuskanavassa tapahtuviin proteolyyttisiin prosesseihin. Toisin kuin ihmisen ruoansulatuskanavan peptidaasit, bakteerien tuottamat PEP:t
pystyvät pilkkomaan keliaakikoille haitallisia peptidejä (Marti ym. 2005). Mikrobien tuottamia PEP:ja on tutkittu keliakian yhteydessä paljon. Flavobacterium meningosepticum-,
Myxococcus xanthus- ja Sphingomonas capsulate -bakteerien tuottamat PEP:t pilkkovat
keliaakikoille haitallisia peptidejä (Shan ym. 2004). Aspergillus niger -homesienen tuottama PEP pilkkoo myös keliaakikoille haitallisia peptidejä ja sen on esitetty olevan potentiaalisin entsyymilääkehoito keliaakikoille (Stepniak ym. 2006).
Aspergillus niger
Aspergillus niger on homesieni, joka pystyy tuottamaan solunulkoista prolyyliendopeptidaasia happamissa olosuhteissa (Edens ym. 2005). A.niger:n tuottama entsyymi prolyyliendopeptidaasi (AN-PEP) kuuluu seriinipeptidaasien S28 heimoon. AN-PEP pilkkoo
peptidejä proliinin C-pään puoleisesta peptidisidoksesta ja sen avulla pystytään pilkkomaan pitkiäkin peptidiketjuja. AN-PEP toimii optimaalisimmin pH-arvossa 4–5 (kuva 5)
ja on stabiili vielä pH-arvossa 2 (Stepniak ym. 2006). AN-PEP on kiinnostava entsyymi,
koska sitä voidaan tuottaa kustannustehokkaasti suuriakin määriä ja se on turvallinen elintarvikekäytössä.
Kuva 5. AN-PEP:n aktiivisuus eri pH-arvoissa. Aktiivisuus eri pH-arvoissa on mitattu spektrofometrisesti
käyttämällä substraattina Z-Gly-Pro-pNA (Sebela ym. 2009).
29
Ensimmäiseksi AN-PEP:n käyttökelpoisuutta tutkittiin oluenvalmistusprosessissa (Lopez
ja Edens 2005). Oluen valmistuksessa proteiinit ja polyfenolit muodostavat keskenään
kompleksisen yhdisteen, joka aiheuttaa olueen sameutta. AN-PEP estää sameuden muodostumista pullotetussa oluessa pilkkomalla sameutta muodostavia proteiineja proliinin
kohdalta. Tähän tarkoitukseen on kaupallisesti saatavilla Brewer’s ClarexTM -niminen entsyymi, joka on prolyyliendopeptidaasi (DSM 2012). AN-PEP kiinnostaa keliakian entsyymilääkehoitona ja prolamiinien eliminoijana ruokavaliosta. AN-PEP on resistentti ruoansulatuskanavan proteiineja pilkkovalle entsyymille pepsiinille, joten se säilyy toimintakykyisenä ruoansulatuskanavassa (Stepniak ym. 2006). AN-PEP pilkkoo keliaakikoiden T-soluja
stimuloivia gliadiineista ja gluteniineista johdettuja peptidejä in vitro. Stepniak ym. (2006)
mukaan AN-PEP on potentiaalisin vaihtoehto keliaakikoiden entsyymilääkehoidoksi.
AN-PEP:a on käytetty tehostamaan itämisen tai hapantaikinafermentaation aikana tapahtuvaa gluteenin pilkkoutumista. Rizzello ym. (2007) mukaan vehnän gluteenin pilkkoutuminen hapantaikinafermentaation aikana tehostui käytettäessä mukana AN-PEP:a. Näin käsitelty vehnä voisi tulevaisuudessa olla osa keliaakikoiden ruokavaliota. Luoto ym. (2012)
mukaan vehnä- tai ruismaltaasta tehtyjen uutteiden prolamiinipitoisuudet saatiin laskemaan
käyttämällä AN-PEP:a. AN-PEP:lla käsitellyn vehnäuutteen prolamiinipitoisuus oli
20±7 ppm ja ruisuutteen 18±17 ppm. AN-PEP:lla käsiteltyjä uutteita voisi käyttää gluteenittomissa tuotteissa.
Muiden mikrobien tuottamat prolyyliendopeptidaasit
Flavobacterium meningosepticum, Myxococcus xanthus ja Sphingomonas capsulate ovat
bakteereita, jotka pystyvät tuottamaan prolyyliendopeptidaaseja (Shan ym. 2004). F. meningosepticum -bakteerin tuottama prolyyliendopeptidaasi FM-PEP, toimii optimaalisimmin pH-arvossa 6–8. FM-PEP on resistentti ruoansulatuskanavan ja haiman peptidaaseille.
FM-PEP:n on todettu pilkkovan peptidiä PQPQLPY P↓QPQLP tehokkaasti nuolen osoittamasta kohdasta. FM-PEP pilkkoo tehokkaimmin P–Q välistä peptidisidosta. Lisäksi FMPEP pilkkoo tehokkaasti 33-meeriä in vitro ja in vivo (Piper ym 2004; Shan ym. 2004).
Piper ym. (2004) mukaan FM-PEP:n käytöllä voitaisiin vähentää tai eliminoida haitallisia
peptidejä suolistossa, mikä voisi olla potentiaalinen tapa hoitaa keliakiaa.
M. xanthus -bakteerin tuottama prolyyliendopeptidaasi MX-PEP on resitentti ruoansulatuskanavan ja haiman peptidaaseille, ja se toimii optimaalisimmin pH-arvossa 6-8 (Shan
30
ym. 2004). MX-PEP pilkkoo peptidiä PQPQLP↓YPQPQLP nuolen osoittamasta kohdasta.
MX-PEP pilkkoo parhaiten P–(Y/F) välistä peptidisidosta. Haitallisten peptidien käsittely
MX-PEP:lla tuottaa pääasiassa 4–5 aminohappotähteen peptidejä. MX-PEP ei pilko yhtä
tehokkaasti 33-meeriä kuin FM-PEP. Myös S. capsulate -bakteerin tuottama prolyyliendopeptidaasi SC-PEP on resistentti ruoansulatuskanavan ja haiman entsyymeille sekä toimii
parhaiten pH-arvossa 6–8 (Shan ym.2004). SC-PEP pilkkoo PQPQLPYPQPQLP peptidiä
samasta kohdasta, kuin FM- ja MX-PEP:t. SC-PEP pilkkoo parhaiten sekä P–Q että P–Y
välisiä peptidisidoksia. Se ei pysty pilkkomaan tehokkaasti 33-meeriä. Tutkimuksen mukaan SC-PEP yhdessä ohrasta saatavan endopeptidaasi EP-B2 kanssa voisi vähentää imeytyvän gluteenin haitallisuutta keliaakikoilla (Gass ym. 2007). Näiden entsyymien yhdistelmän on todettu eliminoivan keliaakikoille haitallisia peptidejä in vitro.
2.3.4 Prolamiinien hydrolyysi hapettamalla
Kemiallisesti katsottuna jokainen yhdiste, joka voi ottaa vastaa elektroneja, on hapetin
(Cohen ja Nyska 2002). Aine, joka luovuttaa elektroneja, on pelkistin. Hapetus on prosessi,
jossa häviää elektroneja. Samaan aikaan, kun pelkistin luovuttaa elektroneja jokin toinen
aine (hapetin) pelkistyy. Hapetin vastaanottaa elektronit samaan aikaan pelkistin hapettuu.
Biologisissa systeemeissä happea esiintyy eri molekyyleistä runsaimmin (Kehrer 2000).
Hapen tuottamia radikaaleja muodostuu elimistössä metabolisissa prosesseissa. Muodostuvat reaktiiviset happiyhdisteet ovat aineenvaihdunnassa syntyviä toksisia välituotteita, jotka aiheuttavat oksidatiivista stressiä. Reaktiiviset happiyhdisteet ja muut radikaalit osallistuvat useisiin biologisiin tapahtumiin, kuten mutaatioihin, rappeuttaviin ja muihin sairauksiin, tulehduksiin, ikääntymiseen ja kehittymiseen (Cohen ja Nyska 2002). Biologisissa
prosesseissa yleensä pelkistimen luovuttamat elektronit ovat vetyä tai happea. Vetyä luovutetaan ja happea siirretään. Fentonin reaktion on todettu olevan tärkein selitys biologisessa ympäristössä tapahtuvalle oksidatiiviselle vauriolle. Transitiometalleista kupari ja
rauta ovat keskeisimmät tekijät Fentonin reaktiossa (1). Transitiometallit toimivat katalyytteinä Fentonin reaktiossa.
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH· + OH–
(1)
31
Proteiinit ovat reaktiivisten happiyhdisteiden mahdollisia kohteita joihin hyökätä (Cohen ja
Nyska 2002). Esimerkiksi proliinia sisältävät pepetidit pilkkoutuivat proliinin kohdalta
OH· vaikutuksesta (Uchida ym. 1990). Reaktiivisten happiyhdisteiden aiheuttama proteiinien hapettuminen muodostaa pysyviä ja reaktiivisia yhdisteitä (Kehrer 2000). Hapetetut
proteiinit yleensä denaturoituvat ja tekevät niistä entistä herkempiä proteolyyttiselle pilkkoutumiselle. Keliaakikoille haitallisia peptidejä on mahdollista muokata metallikatalysoidun hapetuksen avulla. Keliaakikoille haitallisen peptidin 33-meerin immunologinen aktiivisuus väheni 18 %:a raudalla katalysoidun vetyperoksihapetuksen jälkeen (Huang ym.
2013).
32
3 KOKEELLINEN TUTKIMUS
3.1 Koeasetelma ja tavoite
Kokeellisen tutkimuksen tavoitteena oli eristää mallasuutteen ja gluteenittoman oluen serpiinit ja eliminoida ne Aspergillus niger -homesienen tuottamalla prolyyliendopeptidaasilla
(AN-PEP), Tritirachium album -homesienen tuottamalla seriiniendopeptidaasilla (Proteaasi K) tai hapettamalla vetyperoksidilla.
3.2 Materiaalit ja menetelmät
Tutkimuksen raaka-aineina käytettiin ohra-ruismallasuutetta (Laihian Mallas Oy, Suomi)
ja Laitilan Kukko lager olutta (Laitilan Wirvoitusjuomatehdas, Suomi). Molempien raakaaineiden sisältämien proteiinien molekyylimassajakaumat selvitettiin natriumlauryylisulfaattipolyakryyliamidi- geelielektroforeesin (engl. sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) avulla. Molempien raaka-aineiden serpiinejä käsiteltiin
AN-PEP -entsyymillä (DSM Food Specialties, Delft, Alankomaat). Lisäksi oluen serpiinejä käsiteltiin vetyperoksidilla ja Proteaasi K -entsyymillä (Merck KGaA, Darmstad, Saksa).
Eri käsittelyjen vaikutusta serpiineihin tutkittiin geelielektroforeesin (SDS-PAGE) ja kokoekskluusiokromatografian (SEC) avulla.
3.2.1 Ohra-ruismallasuutteen ominaisuudet
Valmistajalta saadun tiedon mukaan tutkimuksessa käytetyn ohra-ruismallasuutteen kuivaainepitoisuus oli 30 %:a ja proteiinipitoisuus 2,6 %:a. Aluksi uutteesta sakattiin proteiinit
ammoniumsulfaatin avulla. Ammoniumsulfaattia lisättiin uutteeseen 70 %:n kylläisyyteen
asti. Ammoniumisulfaattia sisältävää uutetta sekoitettiin magneettisekoittajalla 3 tunnin
ajan. Uuton jälkeen kiintoaines erotettiin sentrifugoimalla (Sorvall RC56, Instruments DuPont, USA) 4 °C:ssa, 18 000 × g, 15 min. Proteiinisakka otettiin talteen ja säilytettiin pakastimessa –19 °C:ssa käyttöön asti.
33
Uutteen proteiinijakauma
Uutteesta erotetusta proteiinisakasta analysoitiin proteiinien molekyylimassajakauma geelielektroforeesilla (SDS-PAGE). Ennen geelielektroforeesiajoa proteiinit uutettiin liukoisuuden mukaan neljään ryhmään: vesiliukoisiin albumiineihin, suola-vesiliukoisiin globuliineihin, alkoholiliukoisiin prolamiineihin ja happamaan liukeneviin globuliineihin. Uutteessa ei ollut muita proteiineja kuin albumiineja, joiden molekyylimassat olivat n. 40
kDa:a. Serpiinien molekyylimassat ovat n. 40 kDa:a (Hejgaard 1982), joten uutteen proteiinit tunnistettiin serpiineiksi.
Antigliadiini Western plot
Proteiinisakasta tutkittiin prolamiineja ja serpiinien mahdollisia ristireaktioita antigliadiini
Western plot -menetelmällä. Western plot -menetelmää käytetään proteiinien tunnistamiseen. Menetelmässä proteiinit siirretään geeliltä PVPD -membraanille sähkövirran avulla.
Siirron jälkeen proteiineja voidaan tunnistaa spesifisellä vasta-aineella ja erottaa ne muista
proteiineista. Tässä tutkimuksessa Western plot tehtiin käyttäen antigliadiini vasta-ainetta
(Anti-Gliadin (wheat) antibody produced in rabbit G9144, Sigma-Aldrich, USA). Antiglidiini vasta-aineen ja serpiinien välillä ei tapahtunut ristireaktioita. Uutteen proteiinisakassa
ei ollut prolamiineja. Esikokeiden perusteella saatiin selville, että alkuperäisessä uutteessa
ei ollut muita proteiineja kuin serpiinejä. Tämän tiedon perusteella päätettiin keskittyä vain
serpiineihin.
Pelkistämisen ja pH:n vaikutus proteiinisakan uutto-ominaisuuksiin
Proteiinisakkaa uutettiin Tris (Tris(hydroksimetyyli)aminometaani)-HCl -puskuriin (pH 8)
tai natriumlauryylisulfaatti (SDS) -näytepuskuriin (pH 6,8) ilman pelkistintä ja pelkistimen
kanssa.
Proteiinisakasta
ja
puskureista
tehtiin
6-prosenttiset
(w/v)
liuokset.
SDS -näytepuskurina käytettiin 62,5 mM Tris-HCl -puskuria, jossa oli 10 %:a glyserolia,
2 %:a SDS:a ja bromofenolin sinistä väriainetta. Tris-HCl -puskurin ja proteiinisakan liuokseen pelkistimeksi lisättiin 20 mM:a ditiotreitolia (DTT). SDS -näytepuskurin ja proteiinisakan liuokseen pelkistimeksi lisättiin 2 %:a 2-merkaptoetanolia. Liuoksia inkuboitiin
40 °C:ssa jatkuvassa sekoituksessa 15 min. Näytteet säilytettiin pakastimessa –19 °C:ssa
käyttöön asti.
34
Proteiinisakkaa uutettiin eri pH-arvon puskureihin. Puskureina käytettiin 0,1 M natriumasetaattipuskuria
(pH
4
ja
5),
0,1
M
Bis-Tris
(Bis(2-hydroksietyyli)-
amino-tris(hydroksimetyyli)-metaani) -puskuria (pH 6), 0,1 M Tris-HCl -puskuria (pH 8)
ja milliQ -vettä (Millipore Corporation, Billerica, USA). Proteiinisakasta ja puskureista
tehtiin 6-prosenttiset (w/v) liuokset. Liuoksia inkuboitiin 40 °C:ssa jatkuvassa sekoituksessa 15 min. Inkuboinnin jälkeen liuosten kiintoainekset erotettiin sentrifugoimalla (Eppendorf centrifuge 5810R, Saksa) 22 ˚C:ssa, 18 514 × g, 10 min. Supernatantit otettiin talteen
ja säilytettiin pakastimessa –19 °C:ssa käyttöön asti.
3.2.2 Oluen ominaisuudet
Kaupallisten oluiden proteiinijakauma
Tutkittiin kaupasta saatavilla olevien gluteenittomien oluiden sisältämiä proteiineja (serpiinejä) geelielektroforeesilla (SDS-PAGE). Analysoitavat gluteenittomat oluet olivat Laitilan Kukko lager ja tumma (Laitilan Wirvoitusjuomatehdas, Suomi) sekä Koff 1 ja Light
Beer (Oy Sinerbrychoff Ab, Suomi), gluteenia sisältävänä kontrollina käytettiin Karjalaa
(Oy Hartwall Ab, Suomi). Ennen geelielektroforeesia oluista poistettiin hiilidioksidi ja ne
konsentroitiin vakuumikonsentraattorilla (Savant Speedvac Plus SC 110A, GMI Inc, Minnesota, USA) ¼ osaan alkuperäisestä. Jatkoanalyyseihin valittiin Laitilan Kukko lager, sillä
sen serpiinit näkyivät geelillä voimakkaimmin.
Oluen inkubaation- ja lämmönkesto
Esikokeissa oluen serpiinien autohydrolyysiä ja lämpödenaturaatiota tutkittiin samoissa
olosuhteissa kuin olutnäytteen AN-PEP käsittely toteutettiin. Olut konsentroitiin vakuumikonsentraattorilla (Savant Speedvac Plus SC 110A, GMI Inc, Minnesota, USA) ¼ osaan
alkuperäisestä. Konsentroitua olutta inkuboitiin 50 ˚C:ssa jatkuvassa sekoituksessa 24 h:a.
Reaktio pysäytettiin kuumentamalla olutta 80 °C:ssa 15 min. Lisäksi olutta kuumennettiin
80 °C:ssa 15 min ilman edeltävää inkubointia.
35
3.2.3 AN-PEP:n inkubaation- ja lämmönkesto
AN-PEP autohydrolyysiä ja lämpödenaturaatiota vedessä tutkittiin samoissa olosuhteissa
kuin olutnäytteen AN-PEP käsittely toteutettiin. AN-PEP:n inkubaation- ja lämmönkestoa
testattiin myös oluen pH:ssa (pH 4,68). pH:lla ei ollut vaikutusta AN-PEP:n inkubaatio- ja
lämmönkestoon, vaan tulokset olivat samanlaisia kuin saatiin inkuboimalla ja kuumentamalla AN-PEP:a veden kanssa. Jatkossa päätettiin tutkia AN-PEP:n inkubaation- ja lämmönkestoa vain vedessä.
AN-PEP:a lisättiin 17,5 µl:a 500 µl:an milliQ -vettä ja liuosta käsiteltiin kolmella eri tavalla. Yhdessä käsittelyssä liuosta inkuboitiin 50 ˚C:ssa jatkuvassa sekoituksessa 24 h:a. Reaktio pysäytettiin kuumentamalla liuosta 80 °C:ssa 15 min. Toisessa käsittelyssä liuosta
kuumennettiin 80 °C:ssa 15 min ilman edeltävää inkubointia. Viimeisessä käsittelyssä ANPEP:a lisättiin vain milliQ -veteen. Reaktion pysäyttämisen jälkeen liousten kiintoainekset
erotettiin sentrifugoimalla (Eppendorf centrifuge 5424, Hampuri, Saksa) 22 ˚C:ssa,
20 000 × g, 5 min. Supernatantit ja sakat otettiin talteen eri Eppendorf-putkiin. Näytteitä
säilytettiin pakastimessa –19 °C:ssa käyttöön asti. Kuumennuksen (80 ˚C 15 min) aikana
AN-PEP denaturoitui ja sakkasi sentrifugoinnin jälkeen. (kuva 6).
Kuva 6. AN-PEP vedessä inkuboinnin (24 h 50 °C) jälkeen, (a), kuumennuksen (15 min 80 °C) jälkeen (b)
ja sentrifugoinnin jälkeen (c).
36
3.2.4 Ohra-ruismallasuutteen käsittely prolyyliendopeptidaasilla (AN-PEP)
Proteiinisakasta ja 0,1 M Na-asetaattipuskurista (pH 4) tehtiin 0,6- ja 6-prosenttiset (w/v)
liuokset. AN-PEP:a lisättiin17,5 µl:a 500 µl:an liuosta. Entsyymiä sisältäviä liuoksia inkuboitiin 50 °C:ssa jatkuvassa sekoituksessa 1, 2 ja 4 h:a. Reaktio pysäytettiin kuumentamalla liuosta 80 °C:ssa 15 min, jotta entsyymi inaktivoituu. Nollanäyte tehtiin kuumentamalla
liuosta 80 °C:ssa 15 min heti entsyymin lisäyksen jälkeen. Kuumennuksen jälkeen liuosten
kiintoainekset erotettiin sentrifugoimalla (Eppendorf centrifuge 5424, Hampuri, Saksa) 22
˚C:ssa, 20 000 × g, 5 min. Supernatantit ja sakat otettiin talteen eri Eppendorf-putkiin.
0,6 %:a (w/v) proteiinisakkaa sisältäneiden liuosten supernatantit konsentroitiin vakuumikonsentraattorilla (Savant Speedvac Plus SC 110A, GMI Inc, Minnesota, USA) noin puoleen alkuperäisestä. Käsittelyn jälkeen saatuja näytteitä säilytettiin pakastimessa –19 °C:ssa
käyttöön asti.
3.2.5 Oluen käsittelyt
Oluen serpiinejä yritettiin eliminoida AN-PEP:lla, hapettamalla ja Proteaasi K:lla (kuva 7).
Ennen eliminointikäsittelyjä olut konsentroitiin vakuumikonsentraattorilla (Savant Speedvac Plus SC 110A, GMI Inc, Minnesota, USA) ¼ osaan alkuperäisestä.
Kuva 7. Vuokaavio oluen käsittelystä AN-PEP:lla, vetyperoksidilla ja Proteaasi K:lla, sekä näytteille tehdyt
analyysit.
37
Oluen serpiinien käsittely seriiniendopeptidaasilla (Proteaasi K)
Konsentroidun oluen joukkoon lisättiin Proteaasi K- entsyymiä (Merck KGaA, Darmstad,
Saksa) 100 µg/ml. Liuosta inkuboitiin 40 °C:ssa jatkuvassa sekoituksessa 2 ja 4 h:a. Reaktio pysäytettiin kuumentamalla liuosta 80 °C:ssa 15 min. Nollanäyte tehtiin kuumentamalla
liuos heti entsyymin lisäämisen jälkeen. Käsittelyn jälkeen saatuja näytteitä säilytettiin
pakastimessa –19 °C:ssa käyttöön asti.
Oluen serpiinien hapetuskäsittely
Konsentroitua olutta pipetoitiin 100 µl:a kahteen 1,5 ml:n Eppendorf-putkeen, joista toiseen lisättiin 0,05 mM:a kuparisulfaattia (CuSO4) katalyytiksi. Liuokseen pipetoitiin
10 µl:a 50 mM vetyperoksidia (H2O2). Liuoksia inkuboitiin 40 °C:ssa jatkuvassa sekoituksessa 2 ja 24 h:a. Reaktio pysäytettiin lisäämällä joukkoon 11 µl:a 1 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA). Hapetuskäsittelyn jälkeen saatuja näytteitä säilytettiin pakastimessa –19 °C:ssa käyttöön asti.
Oluen serpiinien käsittely prolyyliendopeptidaasilla (AN-PEP)
AN-PEP:a lisättiin 17,5 µl:a 500 µl:an konsentroitua olutta. Entsyymiä sisältäviä liuoksia
inkuboitiin 50 °C:ssa jatkuvassa sekoituksessa 2 ja 24 h:a. Reaktio pysäytettiin kuumentamalla liuoksia 80 °C:ssa 15 min, jotta entsyymi inaktivoituu. Nollanäyte tehtiin kuumentamalla liuosta 80 °C:ssa 15 min heti entsyymin lisäyksen jälkeen. Reaktion pysäyttämisen
jälkeen liuosten kiintoainekset erotettiin sentrifugoimalla (Eppendorf centrifuge 5424,
Hampuri, Saksa) 22 ˚C:ssa, 20 000 × g, 5 min. Näytteet samentuivat reaktion pysäyttämisen jälkeen. (kuva 8). Supernatantit ja sakat otettiin talteen eri Eppendorf-putkiin. Käsittelyn jälkeen saatuja näytteitä säilytettiin pakastimessa –19 °C:ssa käyttöön asti.
38
Kuva 8. AN-PEP oluessa inkubaation (24 h, 50 °C) jälkeen (a), reaktion pysäyttämisen (15 min, 80 °C) jälkeen (b) ja sentrifugoinnin jälkeen (c).
3.2.6 Proteiinien kokojakauman tarkastelu elektroforeesi- ja kokoekskluusioerotuksella
SDS- geelielektroforeesi
Oluen, ohra-ruismallasuutteen, AN-PEP:n ja AN-PEP:lla käsiteltyjen näytteiden proteiinijakaumat erotettiin molekyylimassojen perusteella natriumlauryylisulfaattipolyakryyliamidielektroforeesilla (engl. sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis,
SDS-PAGE). Menetelmässä proteiinit erotetaan elektroforeettisesti toisistaan koon mukaisesti käyttäen ajavana voimana sähkövirtaa. Sähkövirta kuljettaa proteiineja läpi geelin,
samalla negatiivisesti varautuneet SDS -liuoksella ympyröidyt proteiinit liikkuvat kohti
positiivisesti varautunutta kohtaa geelissä. Pienet molekyylit liikkuvat geelin läpi nopeammin kuin suuremmat molekyylit. Erottamisen jälkeen proteiinit kiinnitetään geelille
Coomassie Brilliant Blue -väriliuoksen avulla.
Nestemäisiä näytteitä sekoitettiin 40 µl:a 60 µl:an konsentroitua SDS -näytepuskuria ja
AN-PEP -käsittelyn jälkeen saatua sakkaa 15 mg:a 0,25 ml:an SDS -näytepuskuria.
SDS -näytepuskurina käytettiin 62,5 mM Tris-HCl -puskuria (pH 6,8), jossa oli 10 %:a
glyserolia, 2 %:a SDS:a ja bromofenolin sinistä väriainetta. Näytteitä kuumennettiin kopeutkikuumentajalla (Grant QBD2, Grant Instruments Ltd, Cambridge, Iso-Britannia)
2 minuuttia 100 °C:ssa ennen geelielektroforeesiajoa.
39
Valmiit näytteeet analysoitiin 10-prosenttisella NuPAGE® Bis-Tris Mini geelillä (Life
technologies, Carlsbad, USA). Ajoliuoksena käytettiin NuPAGE® MES SDS -ajopuskuria
(Life technologies, Carlsbad, USA). Ajo tehtiin 200 V:n jännitteellä 35 minuutin ajan (Power Pac 300 Bio-Rad Laboratories, Inc. USA). Moleekyylimassamarkkerina käytettiin
Novex Sharp Pre-Stained Protein -standardia (Life technologies, Carlsbad, USA). Ajon
jälkeen geelit värjättiin yön yli Coomassie Brillian Blue -väriliuoksessa. Coomassie Brilliant Blue -liuos sisälsi 14 %:a Serva Blue R-stock -liuosta, 43 %:a 12-prosenttista trikloorianisolia (TCA), 43 %:a milliQ -vettä (Millipore Corporation, Billerica, USA). Värjäyksen
jälkeen geeliä pestiin vedellä, kunnes geelin tausta oli kirkas. Geelit valokuvattiin.
Kokoekskluusiokromatografi
Korkean erotuskyvyn nestekromatografia (engl. high performance liquid chromatography,
HPLC) on menetelmä, jota käytetään yhdisteiden erottamiseen, tunnistamiseen ja kvantitatiiviseen määrittämiseen. Menetelmässä liikuvaan faasiin eli ajoliuokseen liuotettu näyte
ajetaan kolonnin läpi, joka on pakattu tiiviisti stationäärifaasilla. Yhdisteiden erottuminen
perustuu yhdisteiden vuorovaikutukseeen kiinteän stationäärifaasin ja liikkuvan nestefaasin
välillä. Kokoekskluusiokromatografiassa (engl. size-exclusion chromatography, SEC) molekyylit erottuvat toisistaan koon perusteella. Menetelmässä pienet molekyylit tunkeutuvat
huokoiseen väliaineeseen ja eluoituvat hitaasti. Suuret molekyylit eivät mahdu tunkeutumaan huokoisiin, vaan kulkeutuvat ajoliuoksen mukana detektorille ensiksi. Toisistaan
erottuneet yhdisteet havaitaan detektorilla, jonka avulla yhdisteitä ja niiden pitoisuuksia
voidaan tunnistaa ja määrittää. Tässä tutkimuksessa SEC -menetelmän avulla selvitettiin
oluen, AN-PEP -käsitellyn oluen ja AN-PEP:n proteiinien ja peptidien kokojakaumaa.
Nestemäisiä näytteitä (olut, AN-PEP -käsitelty olut, AN-PEP) pipetoitiin 200 µl:a 1,5 ml:n
Eppendeorf-putkiin. Joukkoon pipetoitiin 200 µl:a 50 mM natrium-fosfaattipuskuria
(pH 6,9), jossa oli 1,5 %:a natriumlayryylisulfaattia (SDS). Kaikki AN-PEP -käsittelyn
jälkeen saatu sakka sekoitettiin 400 µl:aan puskuria. Näytteitä inkuboitiin 50 °C:ssa
30 minuutin ajan. Näytteitä sentrifugoitiin (Eppendorf centrifuge 5424, Hampuri, Saksa)
20 000 g:ssä 10 minuutin ajan. Tämän jälkeen näytteet suodatettiin 0,45 µm:n nylonmembraanisuodattimella (PALL life sciences Acrodisc 13 mm syringe filter, Pall Corporation,
New York, USA). Puhdistetuista näytteistä analysoitiin proteiinien ja peptidien kokojakaumat kokoekskluusiokromatografilla. Ajoliuoksena käytettiin 50 mM fosfaattipusku-
40
ria (pH 6,9), jossa oli 0,1 %:a SDS:a ja 20 % asetonitriiliä. Se valmistettiin sekoittamalla
55 ml:a 1 M dinatriumvetyfosfaattia (Na2HPO4), 45 ml:a 1 M natriumdivetyfostaattia
(NaH2PO4), 2 g:a SDS:a, 400 ml:a asetonitriiliä ja täyttämällä 2 l:n mittapullo merkkiviivaan asti milliQ -vedellä. Ajoliuosta sonikoitiin (Ultrasonic Cleaner, VWR International
Radnor USA) puolen tunnin ajan kuplien poistamiseksi.
SEC -kolonneina käytettiin SuperdexTM 200 10/300 GL (Amersham Bioscience AB, Uppsala, Ruotsi) ja SuperdexTM Peptide 10/300 GL (GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala,
Ruotsi). Näistä ensimmäinen kolonni erotteli suurikokoisia proteiineja ja sen optimaalinen
erotusalue oli 10–600 kDa:a. Toinen kolonni erotteli pieniä peptidejä ja sen optimaalinen
erotusalue oli 0,1–7 kDa:a. Kolonnit kytkettiin sarjaan Waters HPLC -laitteistoon, jossa oli
UV-VIS detektori (Waters 996 photodiode array detector, Waters Corporation, Milford,
USA). UV-VIS detektori mittasi aallonpituuksilla 190–600 nm:ä, mutta tuloksia tarkasteltiin vain 210 nm:n aallonpituudella, koska se on herkkä peptidisidoksille. Näytteitä injektoitiin 25 µl:a ja ajoliuoksen virtausnopeudeksi säädettiin 0,5 ml:a / min ja ajo pysäytettiin
automaattisesti 120 min kuluttua.
41
3.3 Tulokset
3.3.1 Ohra-ruismallasuutteen ominaisuuksien tarkastelu elektroforeesierotuksella
Proteiinisakan uutto-ominaisuuksien tarkastelu elektroforeesierotuksella
Kuva 9. Uutteen proteiinien kokojakauma geelielektroforeesilla pelkistämättöminä, pelkistettyinä ja eri pHarvoissa. Proteiinisakasta ja puskureista tehtiin 6-prosenttiset (w/v) liuokset. Geelin vasemmassa reunassa on
molekyylimassat ja yläreunassa näytteiden numerot. 1) molekyylimassamerkkiaine, 2) sakka + SDS -puskuri,
3) sakka + Tris-HCl -puskuri, 4) sakka + SDS -puskuri + 2-merkaptoetanoli, 5) sakka + Tris-HCl -puskuri +
DTT, 6) sakka + mQ-vesi, 7) sakka + Tris-HCl -puskuri (pH 8), 8) sakka + Bis-Tris -puskuri (pH 6), 9) sakka
+ Na-asetaattipuskuri (pH 5), 10) sakka + Na-asetaattipuskuri (pH 4).
Ohra-ruismallasuutten proteiinien uuttumista pelkistettyinä, pelkistämättöminä ja eri pHarvoissa seurattiin geelielektroforeesilla (kuva 9). Liuoksissa näkyi n. 40 kDa:n kohdalla
serpiinit. Näytteet ns. häntivät geelillä eli värjäsivät koko näytesarakkeen. Saatujen tulosten perusteella pelkistyksellä ja eri pH-arvoilla ei ollut vaikutusta proteiinien uuttumiseen
proteiinisakasta, eivätkä ne vähentäneet häntimistä geelillä. Häntimistä yritettiin vähentää
ja poistaa kokonaan käsittelemällä näytteitä metanolilla, asetonilla ja polyvinyylipolypyrrolidonilla (PVPP). Tässä tutkimuksessa mikään käsittelyistä ei toiminut. Häntimisen
vuoksi päädyttiin vaihtamaan tutkimuksessa käytetty raaka-aine gluteenittomaan olueen.
42
3.3.2 Oluen ominaisuuksien tarkastelu elektroforeesi- ja kokoekskluusioerotuksella
Kaupallisten oluiden proteiinijakauman tarkastelu elektroforeesierotuksella
Kuva 10. Kaupallisten oluiden proteiinien kokojakauma geelielektroforeesilla. Geelin vasemmassa reunassa
on molekyylimassat ja yläreunassa näytteiden numerot. 1) molekyylimassamerkkiaine, 2) Karjala, 3) Koff 1,
4) Laitilan Kukko tumma, 5) Laitilan Kukko lager ja 6) Light beer.
Kaikissa tutkituissa kaupallisissa oluissa näkyi voimakkaasti yksi molekyylimassaltaan
n. 40 kDa:a oleva proteiini, joka tunnistettiin serpiiniksi (kuva 10). Aikaisemman tutkimuksen mukaan oluen proteiinit ovat molekyylimassaltaan n. 40 kDa:a SDS-PAGE:lla ja
ne kuuluvat serpiineihin (Curioni ym. 1995). Karjala-oluessa näkyi haaleasti peptidejä 10–
15 kDa:n välillä. Jatkoanalyyseihin valittiin Laitilan Kukko lager, sillä sen serpiinit näkyivät geelillä voimakkaimmin, eikä se häntinyt geelillä kuten mallasuute.
43
Oluen inkubaatio- ja lämmönkeston tarkastelu elektroforeesi- ja kokoekskluusioerotuksella
Oluen serpiinien autohydrolyysiä ja lämpödenaturaatiota tutkittiin samoissa olosuhteissa
kuin olutnäytteen AN-PEP käsittely toteutettiin.
Kuva 11. Laitilan Kukko Lager oluen proteiinien kokojakauma inkubaation ja kuumennuksen jälkeen geelielektroforeesilla. Konsentroitua olutta inkuboitiin 24 h ja kuumennettiin 80 °C:ssa 15 min inkubaation jälkeen. Lisäksi olutta kuumennettiin 80 °C:ssa 15 min ilman inkubaatiota. Geelin vasemmassa reunassa on
molekyylimassat ja yläreunassa näytteiden numerot. 1) molekyylimassamerkkiaine, 2) konsentroitu olut, 3)
kuumennettu olut, 4) 24 h:a inkuboitu olut.
Oluessa havaittiin serpiinejä n. 40 kDa:n kohdalla ja molekyylimassaltaan 3,5–15 kDa:a
olevia pienempiä peptidejä (kuva 11). Oluen proteiinien ei havaittu pilkkoutuneen inkubaation tai kuumennuksen aikana.
44
Kuva 12. Oluen (Laitilan Kukko Lager) proteiinifraktiot kokoekskluusiokromotografialla (kolonnit: SuperdexTM Peptide 10/300 GL ja SuperdexTM 200 10/300 GL, detektio: Waters 996 UV-VIS 210 nm, injektiotilavuus 25 µl, virtausnopeus 0,5 ml/min). Nuolet 1 ja 2 ovat molekyylimassamerkkiaineiden eluutioajat minuuteissa. Nuoli 1 on painoltaan n. 1100 Da ja nuoli 2 n. 150 Da.
Kokoekskluusiokromatografinen analyysi osoitti, että oluen proteiinit eivät pilkkoutuneet
inkubaation tai kuumennuksen aikana (kuva 12). Oluissa oli havaittavissa kaksi proteiinia,
joiden eluutioajat olivat n. 40 ja 47 minuuttia. Kokoekskluusiokromatogrammin ja geelielektroforeesin perusteella pääteltiin, että toinen näistä proteiineista oli serpiinejä. Oluessa havaittiin paljon pieniä peptidejä, joiden eluutioajat olivat välillä 70–80 minuuttia ja
pääosa peptideistä oli kooltaan 1100 Da:a tai pienempiä.
45
3.3.3 AN-PEP:n inkubaatio- ja lämmönkeston tarkastelu elektroforeesi- ja kokoekskluusioerotuksella
AN-PEP autohydrolyysiä ja lämpödenaturaatiota vedessä tutkittiin samoissa olosuhteissa
kuin olutnäytteen AN-PEP käsittely toteutettiin.
Kuva 13. AN-PEP:n proteiinien kokojakauma inkubaation ja kuumennuksen jälkeen geelielektroforeesilla.
AN-PEP:a sekoitettiin milliQ-veteen (17,5 µl:a AN-PEP:a ja 500 µl:a milliQ -vettä) ja sitä käsiteltiin kolmella tavalla; inkuboimalla 24 h:a ja pysäyttämällä reaktio kuumentamalla 80 °C:ssa 15 min, kuumentamalla
80 °C 15 min ja lisäämällä AN-PEP:a pelkkään milliQ-veteen. Geelin vasemmassa reunassa on molekyylimassat ja yläreunassa näytteiden numerot. 1) molekyylimassamerkkiaine, 2) AN-PEP, 3) kuumennuksen
jälkeen saatu supernatantti, 4) 24 h:n hydrolyysin jälkeen saatu supernatantti, 5) kuumennuksen jälkeen saatu
sakka, 6) 24 h:n hydrolyysin jälkeen saatu sakka.
AN-PEP:n proteiinit näkyivät geelillä voimakkaasti n. 66 kDa:n kohdalla ja aika voimakkaasti myös 30–40 kDa:n kohdalla (kuva 13). AN-PEP:ssa oli jotain epäpuhtauksia, koska
kirjallisuuden mukaan AN-PEP:n molekyylimassa SDS -geelillä on n. 66 kDa:a (Edens
ym. 2005). AN-PEP pilkkoutui jonkin verran inkubaation ja kuumennuksen aikana, koska
supernatantissa näkyy proteiineja n. 10 kDa:n kohdalla ja sakassa 15–25 kDa:n välillä.
46
Näitä proteiineja ei näkynyt alkuperäisessä näytteessä. Alkuperäisen näytteen molekyylimassaltaan n. 30 kDa:n proteiinit pilkkoutuivat kuumennuksen jälkeen pienemmiksi, koska
niitä ei havaittu supernatantissa eikä sakassa. Kuumennuksen jälkeen suurin osa AN-PEP:n
proteiineista voi olla sakassa.
Kuva 14. AN-PEP:n supernatantin (a) ja sakan (b) proteiinifraktiot kokoekskluusiokromatografilla inkubaation ja kuumennuksen jälkeen. (kolonnit: SuperdexTM Peptide 10/300 GL ja SuperdexTM 200 10/300 GL,
detektio: Waters 996 UV-VIS 210 nm, injektiotilavuus 25 µl, virtausnopeus 0,5 ml/min). AN-PEP:a sekoitettiin milliQ-veteen (17,5 µl AN-PEP:a ja 500 µl:a milliQ-vettä)ja sitä käsiteltiin kolmella tavalla; inkuboimalla 24 h:a ja pysäyttämällä reaktio kuumentamalla 80 °C:ssa 15 min, kuumentamalla 80 °C:ssa 15 min ja lisäämällä AN-PEP:a pelkkään milliQ-veteen. Nuolet 1 ja 2 ovat molekyylimassamerkkiaineiden eluutioajat
minuuteissa. Nuoli 1 on painoltaan n. 1100 Da ja nuoli 2 n. 150 Da.
47
Kokoekskluusiokromatogrammissa AN-PEP:n proteiinifraktioissa oli havaittavissa yksi
selkeä proteiinipiikki, jonka eluutioaika oli n. 39 minuuttia (kuva 14 a). Verrattaessa proteiinipiikkiä geelielektroforeesilla nähtyihin proteiineihin, voitiin päätellä, että se vastasi
molekyylimassaltaan n. 66 kDa:n proteiineja. AN-PEP pilkkoutui jonkin verran inkubaation ja kuumennuksen aikana. Sakan kokoekskluusiokromatogrammissa AN-PEP:n selkein
proteiinipiikki madaltui inkubaation ja kuumennuksen jälkeen (kuva 14 b). AN-PEP:n proteiineista vain pieni osa jäi supernatanttiin inkubaation ja kuumennuksen jälkeen (kuva 14
a).
3.3.4 Ohra-ruismallasuutteen proteiinijakauman tarkastelu elektroforeesierotuksella
AN-PEP -käsittelyn jälkeen
Kuva 15. AN-PEP:lla käsiteltyjen proteiinisakasta ja Na-asetaattipuskurista tehtyjen 0,6 % ja 6 %:sten (w/v)
liuosten proteiinien kokojaukama geelielektroforeesilla. Reaktion pysäyttämisen jälkeen liuokset sentrifugoitiin. Supernatanteista ja sakoista analysoitiin proteiinit. Geelin vasemmassa reunassa on molekyylimassat ja
yläreunassa näytteiden numerot. 1) molekyylimassamerkkiaine, 2) AN-PEP vedessä, 3) 0,6 % liuos, 4) 6 %
liuos, 5) nollanäyte, supernatantti (0,6 %), 6) nollanäyte, supernatantti (6 %), 7) 2 h, supernatantti (0,6 %), 8)
2h, supernatantti (6 %), 9) 4 h, supernatantti (0,6 %), 10) 4 h, supernatantti (6 %), 11) nollanäyte, sakka (0,6
%), 12) nollanäyte, sakka (6 %), 13) 2 h, sakka (0,6 %), 14) 2 h, sakka (6 %), 15) 4 h, sakka (0,6 %), 16) 4 h,
sakka (6 %).
48
Ohra-ruismallasuutteen proteiinien pilkkoutumista AN-PEP -inkubaation aikana seurattiin
geelielektroforeesilla (kuva 15). AN-PEP näkyi geelillä voimakkaasti n. 66 kDa:n ja selkeästi 40 ja 30 kDa:n kohdalla. AN-PEP peitti alleen mallasuutteen proteiineja, koska se näkyi geelillä niin voimakkaasti. Mallasuutteessa selkeimmin näkyi n. 40 kDa:n kohdalla
serpiinit. Inkubaation jälkeen supernatanttien ja sakkojen proteiinien ei havaittu pilkkoutuvan. Sakassa oli näkyvissä joitain proteiineja 20–30 kDa:n kohdalla. Näitä proteiinejä ei
näy alkuperäisissä näytteissä eikä pelkässä AN-PEP:ssa. Tästä voidaan päätellä, että jotkut
proteiinit ovat pilkkoutuneet pienemmiksi.
3.3.5 Oluen proteiinijakauman tarkastelu elektroforeesi- ja kokoekskluusioerotuksella käsittelyjen jälkeen
Seriiniendopeptidaasi (Proteaasi K) -käsittely
Kuva 16. Proteaasi K:lla käsitellyn oluen proteiinien kokojakauma geelielektroforeesilla. Geelin vasemmassa
reunassa on molekyylimassat ja yläreunassa näytteiden numerot. 1) molekyylimassamerkkiaine, 2) proteaasi
K, 3) konsentroitu olut, 4) nollanäyte, 5) 2 h, 6) 4 h.
49
Oluen proteiinien pilkkoutumista Proteaasi K -inkubaation aikana seurattiin geelielektroforeesilla (kuva 16). Proteaasi K näkyi geelillä haaleasti n. 30 kDa:n kohdalla. Oluessa voimakkaimmin näkyi n. 40 kDa:n kohdalla serpiinit ja haaleammin pienempiä peptidejä.
Proteaasi K -inkubaation aikana oluen proteiinit ja peptidit hävisivät lähes kokonaan 4 h:n
inkubaatioajan jälkeen. Proteiinien ja peptidien pilkkoutuminen oli havaittavissa jo 2 h:n
inkubaatioajan jälkeen.
Hapetuskäsittely
Kuva 17. Vetyperoksidilla hapetetun oluen proteiinien kokojakauma geelielektroforeesilla. Geelin vasemmassa reunassa on molekyylimassat ja yläreunassa näytteiden numerot. 1) molekyylimassamerkkiaine, 2)
konsentroitu olut 3) H2O2 ja CuSO4, 2 h, 4) H2O2, 2 h, 5) H2O2 ja CuSO4, 24 h, 6) H2O2, 24 h.
50
Oluen proteiinien pilkkoutumista vetyperoksidihapetuksen aikana seurattiin geelielektroforeesilla (kuva 17). Oluessa voimakkaimmin näkyi n. 40 kDa:n kohdalla serpiinit ja haaleammin pienempiä peptidejä. Vetyperoksidihapetuksen aikana oluen proteiineille ei havaittu tapahtuneen pilkkoutumista. Kuparisulfaatin käyttö katalyyttinä ei vaikuttanut proteiinien pilkkoutumiseen.
Prolyyliendopeptidaasi (AN-PEP) -käsittely
Kuva 18. AN-PEP:lla käsitellyn oluen supernatanttien ja sakkojen proteiinien kokojakauma geelielektroforeesilla. Geelin vasemmassa reunassa on molekyylimassat ja yläreunassa näytteiden numerot. 1) molekyylimassamerkkiaine, 2) AN-PEP, 3) konsentroitu olut, 4) nollanäyte supernatantti, 5) 2 h supernatantti, 6) 24 h
supernatantti, 7) nollanäyte sakka, 8) 2 h sakka, 9) 24 h sakka.
51
Oluen proteiinien pilkkoutumista AN-PEP -inkubaation aikana seurattiin geelielektroforeesilla (kuva 18). AN-PEP näkyi geelillä todella voimakkaasti n. 66 kDa:n ja selkeästi 40 ja
30 kDa:n kohdalla. AN-PEP peitti alleen oluen proteiineja, koska se näkyi geelillä niin
voimakkaasti. Oluessa voimakkaimmin näkyi n. 40 kDa:n kohdalla serpiinit ja haaleasti
pienempiä peptidejä. Oluen proteiineista suurin osa hävisi supernatantista 24 h:n inkubaation aikana. 24 h:n inkubaation jälkeen supernatantissa näkyi AN-PEP:sta peräisin olevat
proteiinit n. 60 kDa:n kohdalla ja pieniä peptidejä 3,5–10 kDa:n kohdalla. Sakan proteiinit
pysyivät samana inkubaation ajan. Suurin osa sakan proteiineista näyttäisi olevan peräisin
AN-PEP:sta. Varmasti ei pystytä näkemään kuinka paljon sakassa on oluesta peräisin olevia proteiineja. Sakan proteiinit kooltaan n. 25 ja n. 3,5 kDa:a, voivat olla peräisin oluesta
ja/tai AN-PEP:sta. AN-PEP:sta peräisin oleva n. 30 kDa:n proteiini pilkkoutui inkubaation
aikana, koska sitä ei näy supernatantissa eikä sakassa.
AN-PEP:lla käsitellyn oluen proteiinien kokojakauma määritettiin kokoekskluusiokromatografilla. Kokoekskluusiokromatografi tehtiin nollanäytteestä, 2 h:a ja 24 h:a inkuboitujen
näytteiden supernatanteista ja sakoista. Kokoekskluusiokromatografiassa proteiinit erottuvat toisistaan molekyylikoon perusteella, kun ne kulkeutuvat kolonnin läpi erilaisilla nopeuksilla.
Kuva 19. Konsentroidun oluen, nollanäytteen ja AN-PEP:lla 2 ja 24 h:a käsiteltyjen oluiden supernatanttien
proteiinifraktiot kokoekskluusiokromatografialla (kolonnit: SuperdexTM Peptide 10/300 GL ja SuperdexTM
200 10/300 GL, detektio: Waters 996 UV-VIS 210 nm, injektiotilavuus 25 µl:a, virtausnopeus 0,5 ml:a/min).
Nuolet 1 ja 2 ovat molekyylimassamerkkiaineiden eluutioajat minuuteissa. Nuoli 1 on painoltaan n. 1100 Da
ja nuoli 2 n. 150 Da.
52
Supernatanttien kokoekskluusiokromatogrammissa oli havaittavissa oluen proteiinien pienentyminen inkubaatioajan edetessä (kuva 19). Oluissa oli havaittavissa kaksi proteiinia,
joiden eluutioajat olivat n. 40 ja 47 minuuttia. Toinen näistä proteiineista oli serpiinejä.
Supernatanteissa näkyi proteiini n. 39 minuutin eluutioajan kohdalla. Tämän pääteltiin olevan AN-PEP. Oluen proteiinit, joiden eluutioajat olivat n. 40 ja 47 minuuttia pilkkoutuivat
inkubaatioajan edetessä ja 24 h:n inkubaation jälkeen niitä ei havaittu enää
SEC -kromatogrammissa. Molekyylimassaltaan alle 1100 Da:n ja 150 Da:n peptidien määrät kasvoivat inkubaatioajan edetessä, ollen suurimmillaan 24 h:n inkubaation jälkeen.
Kuva 20. AN-PEP:lla käsitellyn oluen sakan ja pelkän AN-PEP:n (vedessä) proteiinifraktiot kokoekskluusiokromotografialla (kolonnit: SuperdexTM Peptide 10/300 GL ja SuperdexTM 200 10/300 GL, detektio: Waters 996 UV-VIS 210 nm, injektiotilavuus 25 µl:a, virtausnopeus 0,5 ml:a/min). Nuolet 1 ja 2 molekyylimassamerkkiaineiden eluutioaikaa minuuteissa. Nuoli 1 on painoltaan n. 1100 Da ja nuoli 2 n. 150 Da.
Nollanäytteen, sekä 2 h:a ja 24 h:a inkuboitujen näytteiden sakkojen kokoekskluusiokromatogrammit olivat samanlaiset (kuva 20). Nollanäytteen, 2 h:n ja 24 h:n inkubaation sakoissa oli ilmeisesti samat proteiinit. Lisäksi pelkän AN-PEP:n sakan kokoekskluusiokromatogrammi oli vastaavanlainen kuin AN-PEP:lla käsitellyn oluen sakan.
53
3.4 Pohdinta
Ohra-ruismallasuutteen ominaisuudet ja käsittely AN-PEP:lla
Ohra-ruismallasuutteen proteiinisakka hänti geelielektroforeesierotuksessa myös AN-PEP
käsittelyn jälkeen. Häntimistä yritettiin poistaa/ vähentää erilaisilla menetelmillä. Ohra
sisältää polyfenoleja ja niiden määrä lisääntyy mallastuksen aikana (Leitao ym. 2011). Näitä polyfenoleja on myös oluessa, jossa ne aiheuttavat mm. punaruskeaa väriä (Briggs ym.
2004). Oluen valmistuksen aikana polyfenolit ja polypeptidit muodostavat hyvin kestäviä
komplekseja. Tässä työssä käytetyn ohra-ruismallasuutteen valmistus muistuttaa oluen
valmistusta. Voidaan päätellä, että SDS-PAGE:lla nähty häntiminen johtui mallasuutteessa
olevista fenoleista ja niiden muodostamista fenoli-proteiinikomplekseista. Mallasuutetta
käsiteltiin metanolilla ja asetonilla, koska tutkimuksen mukaan niiden avulla saadaan uutettua fenoliset yhdisteet maltaan versosta (Meng ym. 2009). Lisäksi mallasuutetta käsiteltiin polyvinyylipolypyrrolidonilla (PVPP), koska sitä käytetään poistamaan oluesta polyfenoleja (Briggs ym. 2004). Tässä tutkimuksessa mentanoli-, asetoni- ja PVPP -käsittelyt
eivät parantaneet proteiinien uuttumista. Lopulta päädyttiin vaihtamaan tutkimuksessa käytetty ohra-ruismallasuute gluteenittomaan olueen.
Oluen serpiinien käsittely Proteaasi K:lla
Tässä tutkimuksessa Proteaasi K pilkkoi serpiinejä oluesta. Proteaasi K on Tritirachium
album -homesienen tuottama seriiniendopeptidaasi, joka pystyy pilkkomaan proteiineja
usean eri peptidisidoksen kohdalta (Ebeling ym. 1974). Proteaasi K pilkkoo proteiineja
alifaattisten ja aromaattisten aminohappojen karboksyyliryhmän puoleisen peptidisidoksen
kohdalta. Alifaattisia aminohappoja ovat glysiini, alaniini, valiini, leusiini, isoleusiin ja
proliini, aromaattisia ovat fenyylialaniini, tyrosiini ja tryptofaani. Se toimii laajalla pH alueella 7,5–12. Proteaasi K pystyy pilkkomaan natiiveja proteiineja, kuten hiuksen kreatiinia.
Proteaasi K:ta käytetään yleisesti molekyylibiologian laboratoriotöissä. Yhdysvaltojen
elintarvike- ja lääkeviraston GRAS (engl. generally recognized as safe) -entsyymien listalta ei löydy Proteaasi K:ta (U.S. Food and Drug Administration 2013). GRAS tarkoittaa
yleisesti turvalliseksi tunnistettua ainetta, jonka turvallisuus on tutkittu asiantuntijoiden
toimesta. Proteaasi K:n käyttö elintarvikkeissa ei ole sallittua Yhdysvalloissa. Euroopan
elintarviketurvallisuusviraston EFSA:n tekemä entsyymien turvallisuusarviointi on vielä
kesken, joten Proteaasi K:n sallitusta käytöstä Euroopassa ei löytynyt tietoa. Tämän tietä-
54
myksen mukaan Proteaasi K:ta ei ole sallittua käyttää elintarvikkeissa. Tässä työssä Proteaasi K:ta käytettiin sen laajan spesifisyyden vuoksi.
Oluen serpiinien hapetuskäsittely
Hapetus vetyperoksidilla ei pilkkonut serpiinejä oluesta. Natiivi ohra sisältää polyfenoleja
ja niiden määrä lisääntyy mallastuksen aikana (Leitao ym. 2011). Tästä syystä myös oluessa on paljon polyfenoleja, jotka toimivat antioksidantteina. Oluen sisältämät polyfenoliset
yhdisteet voivat estää serpiinien hapettumista. Hapetus tuottaa vapaita radikaaleja, jotka
voivat aloittaa monia ketjureaktioita (Shebis ym. 2013). Antioksidantit poistavat vapaita
radikaaleja hapettuen itse ja inhiboivat muita hapettumisreaktioita pysäyttäen ketjureaktion.
Oluen serpiinien käsittely AN-PEP:lla
Aikaisempien tutkimuksien mukaan oluen proteiinit ovat molekyylimassaltaan n. 40 kDa:a
ja kuuluvat serpiineihin (Curioni ym. 1995). Tässä työssä saadut tulokset olivat samanlaisia. Geelielektroforeesilla analysoitaessa oluessa ei ollut muita proteiineja kuin serpiinejä.
Aspegillus niger -homesienen tuottama prolyyliendopeptidaasi AN-PEP pilkkoi serpiinejä
oluesta. Hydrolyysin jälkeen saadusta supernatantista havaittiin serpiinien katoaminen geelielektroforeesilla ja kokoekskluusiokromatografilla analysoitaessa.
Ohran serpiineillä ei tutkimusten mukaan ole samankaltaisia aminohapposekvenssejä prolamiinien kanssa (Dahl ym. 1996; Evans ja Hejgaard 1999; Østergaard ym. 2000). Tämän
tiedon mukaan tässä tutkimuksessa käytetyssä oluessa oli proliinia todella vähän tai ei ollenkaan. Sebelan ym. (2009) mukaan Brewer’s Clarex™ -entsyymi pilkkoo proteiiniketjuja
tehokkaasti proliinin sekä alaniinin kohdalta. Brewer’s Clarex™ pilkkoo myös vähäisissä
määrin proteiineja myös glysiinin, leusiinin, arginiinin, seriinin ja tyrosiinin kohdalta.
Brewer’s Clarex™ on AN-PEP:n tapaan prolyyliendopeptidaasi ja niillä on sama spesifisyys. Todennäköisesti myös AN-PEP pilkkoo proteiineja samojen aminohappojen kohdalta. Proteiinitietopankin (engl. Universal Protein Resource, Uniprot) mukaan ohran serpiinien (Z4, Z7 ja Zx) aminohapoista noin 10 %:a on alaniinia, joten AN-PEP pystyi pilkkomaan oluen sisältämiä ohran serpiinejä.
55
Aluksi hydrolyysireaktio pysäytettiin neutraloimalla 1 M NaOH:lla, mutta SDS-PAGE
erotuksessa AN-PEP peitti alleen olutnäytteen proteiinivyöhykkeet. Tämän takia tutkimuksessa käytettiin vaihtoehtoista tapaa pysäyttää reaktio. Kun AN-PEP:n aktiivisuus pysäytettiin kuumentamalla, syntyi olutnäytteeseen näkyvä sakka. Sakasta ei pystytty varmuudella
toteamaan serpiiniä. AN-PEP on seriinipeptidaasi, joka hydrolysoi substraattinsa kaksivaiheisen katalyyttimekanismin kautta, jossa lopuksi entsyymi vapautuu (Whitaker 2003;
Edens ym. 2005) (kuva 21). AN-PEP:n ei siis pitäisi kiinnittyä substraattiin niin tiukasti,
että se veisi sen mukanaan sakkaan.
Kuva 21. Seriinipeptidaasin hydrolyysimekanismi. Kaksiportaisen katalyyttimekanismin ensimmäisessä
vaiheessa entsyymi (E) ja substraatti (S) muodostavat Michaelis-Menten kompleksin. Toisessa vaiheessa
substraatissa oleva asyyliryhmä siirretään entsyymin aktiiviseen keskukseen, jolloin muodostuu esterisidos ja
kompleksi EP2. Viimeisessä vaiheessa entsyymi-substraattikompleksi hajoaa vapaaksi entsyymiksi ja lopputuotteeksi (P2) (Whitaker 2003).
Tässä tutkimuksessa on voinut käydä myös niin, että reaktio ei olisi edennyt täysin loppuun
asti ja entsyymi-substraatti kompleksi siirtyi sakkaan yhdessä. Tässä tutkimuksessa sakassa
olevien proteiinien kokoekskluusiokrotamogrammit olivat samanlaiset inkubaatioajasta
riippumatta. On todennäköistä että reaktiot etenivät loppuun asti ja entsyymi-substraatti
kompleksi irtosi ja vain entsyymi sakkautui kuumennuksessa. Voidaan päätellä, että reaktion pysäyttämiseen käytetty kuumennus sai aikaan entsyymin denaturoitumisen ilman
substraattia.
56
4 PÄÄTELMÄT
Tässä tutkimuksessa osoitettiin, että Aspergillus niger- homesienen tuottaman prolyyliendopeptidaasin AN-PEP:n ja Tritirachium album- homesienen tuottama seriiniendopeptidaasin Proteaasi K:n avulla voitiin pilkkoa gluteenittoman oluen sisältämiä serpiinejä. Hapetetun oluen serpiinit eivät pilkkoutuneet tai saostuneet metallikatalysoidussa hapetusreaktiossa käyttämällä rautaa ja vetyperoksidia reagensseina. Serpiinit ovat oluen pääallergeeneja ja lisäksi uuden tutkimustiedon valossa niiden on osoitettu mahdollisesti aiheuttavan keliaakikoilla immunologisia reaktioita. AN-PEP:n avulla on mahdollista eliminoida
pääosa oluen sisältämistä serpiineistä. AN-PEP:n käyttö on turvallista ja sallittua elintarvikkeissa ja sitä käytetäänkin laajasti oluenvalmistusprosesseissa.
Ihmisillä erilaiset allergiat ja yliherkkyydet ovat viime vuosina lisääntyneet. Monet ihmiset
kokevat saavansa erilaisia oireita syötyään viljatuotteita, vaikka heillä ei olisi diagnosoitu
keliakiaa tai vilja-allergiaa. Tällöin usein on kyse gluteeniyliherkkyydestä tai jostain muusta yliherkkyydestä. Viljoista löytyvien peptidaasi-inhibiittoreiden, kuten serpiinien uskotaan olevan yksi tekijä, joka voi laukaista näitä reaktioita.
57
LÄHDELUETTELO
Arentz-Hansen H, Körner R, Molberg Ø, Quarsten H, Vader W, Kooy YMC, Lundin KEA,
Koning F, Roepstorff P, Sollid LM, McAdam SN. 2000. The intestinal T cell response to
α-gliadin in adult celiac disease is focused on a single deamidated glutamine targeted by
tissue transglutaminase. J Exp Med 191: 603–612.
Arentz-Hansen H, McAdam SN, Molberg Ø, Fleckenstein B, Lundin KEA, Jørgensen
TJD, Jung G, Roepstorff P, Sollid LM. 2002. Celiac lesion T cells recognize epitopes that
cluster in regions of gliadins rich in proline residues. Gastroenterol 123:803–809.
Autio K, Simoinen T, Suortti T, Salmenkallio-Marttila M, Lassila K, Wilhelmson A. 2001.
Structural and enzymic changes in germinated barley and rye. J Inst Brew 107(1):19–25.
Bergseng E, Sidney J, Sette A, Sollid LM. 2008. Analysis of the binding of gluten T-cell
epitopes to various human leukocyte antigen class II molecules. Human Immunol 69: 94–
100.
Biesiekierski JR, Newnham ED, Irving PM, Barrett JS, Haines M, Doecke JD, Shepherd
SJ, Muir JG, Gibson PR. 2011. Gluten causes gastrointestinal symptoms in subjects without celiac disease: a double-blind randomized placebo-controlled trial. Am J Gastroenterol
106:508–514.
Brandtzaeg P. 2006. The changing immunological paradigm in coeliac disease. Immunol
Lett 105:127–139.
Briggs DE, Boulton CA, Brookes PA, Stevens R. 2004. Brewing science and practice.
Cambridge, UK: Woodhead Publishing Limited. 963 s.
Brousse N, Meijer JWR. 2005. Malignant complications of coeliac disease. Best Pract Res
Cl Ga 19:401–412.
Catassi C, Fasano A. 2008. Celiac disease. Curr Opin Gastroenterol 24:687–691.
Catassi C, Bai JC, Bonaz B, Bouma G, Calabro A, Carroccio A, Castillejo G, Ciacci C,
Cristofori F, Dolinsek J, Francavilla R, Elli L, Green P, Holtmeier W, Koehler P, Koletzko
S, Meinhold C, Sanders D, Schumann M, Schuppan D, Ullrich R, Vecsei A, Volta U, Zevallos V, Sapone A, Fasano A. 2013. Non-celiac gluten sensitivity: the new frontier of gluten related disorders. Nutrients 5:3839–3853.
Carbonero P, Garcia-Olmedo F. 1999. A multigene family of Trypsin/α-Amylase inhibitors from cereals. Teoksessa: Shewry PR, Casey R (toim.) Seed Proteins. Dordrecht, Netherlands: Kluwer Academic Publishers. s 35-78.
Celus I, Brijs K, Delcour JA. 2006. The effects of malting and mashing on barley protein
extractability. J Cereal Sci 44:203‒211.
Constantini S, Rossi M, Colonna G, Facchiano AM. 2005. Modelling of HLA-DQ2 and its
interaction with gluten peptides to explain molecular recognition in celiac disease. JMGM
23:419–431.
Corazza GR, Di Stefano M, Mauriño E, Bai JC. 2005. Bones in coeliac disease: diagnosis
and treatment. Best Pract Res Cl Ga 19:453–465.
58
Cunningham DF, O’Connor B. 1997. Proline spesific peptidases. Biochim Biophys Acta
1343:160‒186.
Curioni A, Pressi G, Furegon L, Peruffo ADB. 1995. Major proteins of beer and their precursors in barley: electrophoretic and immunological studies. J Agric Food Chem 43:2620–
2626.
Dahl SW, Rasmussen SK, Hejgaard J. Heterologous expression of three plant serpins with
distinct inhibitory specificities. J Biol Chem 271:25083–25088.
Davy A, Sørensen MB, Svendsen I, Cameron-Mills V, Simpson DJ. 2000. Prediction of
protein cleavage sites by the barley cysteine endoprotease EP-A and EP-B Based on the
kinetics of synthetic peptide hydrolysis. Plant Physiol 122:137–145.
De Angelis M, Rizzello CG, Fasano A, Clemente MG, De Simone C, Silano M, De Vincenzi M, Losito I, Gobbetti M. 2006a. VSL#3 probiotic preparation has the capacity to
hydrolyze gliadin polypeptides responsible for Celiac Sprue. Biochim Biophys Acta
1762:80–93.
De Angelis M, Coda R, Silano M, Minervini F, Rizzello CG, Di Gagno R, Vicentini O, De
Vincenzi M, Gobbetti M. 2006b. Fermentation by selected sourdough lactic acid bacteria
to decrease coeliac intolerance to rye flour. J Cereal Sci 43:301–314.
Delcour JA, Joye IJ, Pareyt B, Wilderjans E, Brijs K, Lagrain B. 2012.Wheat gluten functionality as a quality determinant in cereal-based food products. Annu Rev Food Sci Technol 3:469–492.
de Ritis G, Auricchio S, Jones HW, Lew EJ, Bernardins JE, Kasarda DD. 1988. In vitro
(organ culture) studies of the toxicity of specific A-gliadin peptides in celiac disease. Gastroenterology 94: 41–49.
DSM.
2012.
Brewer’s
Clarex
[online].
Luettu
27.12.2013.
http://www.dsm.com/products/brewersclarex/en_US/home.html.
Saatavilla:
Ebeling W, Hennrich N, Klockow M, Metz H, Orth HD, Lang H. 1974. Proteinase K from
Tritirachium album Limber. Eur J Biochem 47:91–97.
Edens L, Dekker P, van der Hoeven R, Deen F, de Roos AA, Floris R. 2005. Extracellular
prolyl endoprotease from Aspergillus niger and its use in the debittering of protein hydrolysates. J Agric Food Chem 53:7950–7957.
Evans DE, Hejgaard J. 1999. The impact of malt derived proteins on beer foam quality.
Part I. The effect of germination and kilning on the levelof protein Z4, protein Z7 and
LTP1. J Inst Brew 105:159–169.
Fernandez-Anaya S, Crespo SF, Julia R. Rodriguez JR, Daroca P, Carmona E, Herraez L,
Lopez-Rubio A. 1999. Beer anaphylaxis. J Allergy Clin Immunol 103:959–960.
Field JM, Tatham AS, Baker AM, Shewry PR. 1986. The structure of C hordein. FEBS
3619 200:76–80.
Figueredo E, Quirce S, del Amo A, Cuesta J, Arrieta J, Lahoz C, Sastre J. 1999. Beerinduced anaphylaxis: identification of beer allergens. Allergy 54:630–634.
59
Garcia-Casado G, Crespo JF, Rodriguez J, Salcedo G. 2001. Isolation and characterization
of barley lipid transfer protein and protein Z as beer allergens. J Allergy Clin Immunol
108:647–649.
Gass J, Bethune MT, Siegel M, Spencer A, Khosla C. 2007. Combination enzyme therapy
for gastric digestion of dietary gluten in patients with celiac sprue. Gastroenterology
133:472–480.
Gellrich C, Schieberle P, Wieser H. 2003. Biochemical characterization and quantification
of the storage protein (secalin) types in rye flour. Cereal Chem 80:102–109.
Gettins PGW, Olson ST. 2009. Exosite determinants of serpin specificity. J Biol Chem
284:20441–20445.
Green PHR, Fleischauser AT, Bhagat G, Goyal R, Jabri B, Neugut AI. 2003. Risk of malignancy in patients with celiac disease Am J Med 115:191–195.
Gänzle MG, LoponenJ, Gobetti M. 2008. Proteolysis in sourdough fermentations: mechanisms and potential for improved bread quality. Trends Food Sci Tech 19:513–521.
Hejgaard J. 1982. Purification and properties of protein Z– a major albumin of barley endosperm. Physiol Plant 54:174–182.
Hejgaard J, Rasmussen SK, Brandt A, Svendsen I. 1985. Sequence homology between
barley endosperm protein Z and protease inhibitor of the α1-antitrypsin family. FEBS
180:89–94.
Hejgaard J. 2001. Inhibitory serpins from rye grain with glutamine as P1 and P2 residues in
reactive center. FEBS 488:149–153.
Hejgaard J. 2005. Inhibitory plant serpins with sequence of three glutamine residues in the
reactive center. Biol Chem 386:1319–1323.
Huang X, Kanerva P, Salovaara H, Loponen J, Sontag-Strohm T. 2013. Oxidative modification of a proline-rich gliadin peptide. Food Chem 141:2011–2016.
Huebener S, Tanaka CK, Uhde M, Zone JJ, Vensel WH, Kasarda DD, Beams L, Briani C,
Green PHR, Altenbach SB, Alaedini A. 2014. Spesific nongluten proteins of wheat are
novel target antigens in celiac disease humoral response. J Proteome Res 14:503–511.
Islamov RA, Fursov OV. 2007. Bifunctional inhibitor of α-amylase/trypsin from wheat
grain. Appl Biochem Micro 43:379–382.
Iulek J, Franco OL, Silva M, Slivinski CT, Bloch Jr C, Rigden DJ, Grossi de Sa MF. 2000.
Purification, biochemical characterisation and partial primary structure of a new α-amylase
inhibitor from Secale cereale (rye). Int J Biochem Cell B 32:1195–1204.
Jones BL.2005. Endoproteases of barley and malt. J Cereal Sci 42:139–156.
Junker Y, Zeissig S, Kim S-J, Barisani D, Wieser H, Leffler DA, Zevallos V, Libermann
TA, Dillon S, Freitag TL, Kelly CP, Schuppan D. Wheat amylase trypsin inhibitors drive
intestinal inflammation via activation of toll-like receptor 4. J Exp Med 209:2395–2408.
60
Kehrer JP. 2000. The Haber-Weiss reaction and mechanism of toxicity. Toxicol 149:43–
50.
Kohen R, Nyska A. 2002. Oxidation of biological systems: Oxidative stress phenomena,
antioxidants, redox reactions, and method for their quantification. Toxicol Pathol 30:620–
650.
Koning F, Gilissen L, Wijmenga C. 2005. Gluten: a two-edged sword. Immunopathogenesis of celiac disease. Springer Semin Immun 27:217–232.
Kunst T. 2003. Protein modification to optimize functionality protein hydrolysates. Teoksessa: Whitaker JR, Voragen AJ, Wong DWS (toim.) Handbook of food enzymology.
New York, USA: Mark Dekker Inc. s. 221–236.
Laing W, McManus MT. 2002. Proteinase inhibitors. Teoksessa: McManus MT, Laing
WA, Allan AC (toim.). Protein-protein interactions in plant biology. Sheffield: Sheffield
Academic Press Ltd. s. 77–119.
Law RHP, Zhang Q, McGowan S, Buckle AM, Silverman GA, Wong W, Rosado CJ,
Langendorf CG, Pike RB, Bird PI, Whisstock JC. 2006. An overview of the serpin superfamily. Genome Biology 7:216.
Leitao C, Marchioni E, Bergaentzle M, Zhao M, Didierjean L, Taidi B, Ennahar S. 2011.
Effects of processing steps on the phenolic content and antioxidant activity of beer. J Agric
Food Chem 59:1249–1255.
Lopez M, Edens L. 2005. Effective preventino of chill-haze in beer using acid prolinespecific endoprotease from Aspergillus niger. J Agric Food Chem 53:7944–7949.
Loponen J. 2006. Prolamin degradation in sourdoughs. Helsingin yliopisto. EKT-sarja
1372. 77 s.
Loponen J, Sontag-Strohm T, Venäläinen J, Salovaara H. 2007. Prolamin Hydrolysis in
Wheat Sourdoughs with Differing Proteolytic Activities. J Agric Food Chem 55:978–984.
Loponen J, Kanerva P, Zhang C, Sontag-Strohm T, Salovaara H, Gänzle MG. 2009. Prolamin hydrolysis and pentosan solubilization in germinated-rye sourdoughs determined by
chromatographic and immunological methods. J Agric Food Chem 57:746–753.
Luoto S, Jiang Z, Brinck O, Sontag-Strohm T, Kanerva P, Bruins M, Edens L, Salovaara
H, Loponen J. 2012. Malt hydrolysates for gluten-free applications: Autolytic and proline
endopeptidase assisted removal of prolamins from wheat, barley and rye. J Cereal Sci
56:504–509.
Marti T, Molberg Ø, Li Q, Gray GM, Khosla C, Sollid LM. 2005. Prolyl endopeptidasemediated destruction of T cell epitopes in whole gluten: chemical and immunological characterization. J Pharmacol Exp Ther 312:19–26.
Mathewson PR. 1998. Enzymes. St.Paul, Minnesota, USA: Eagan Press cop. 109 s.
Mazzarella G, Maglio M, Paparo F, Nardone G, Stefanile R, Greco L, van de Wal Y, Kooy
Y, Koning F, Auricchio S, Troncone R. 2003. An immunodominant DQ8 restricted gliadin
peptide activates small intestinal immune response in in vitro cultured mucosa from HLADQ8 positive but not HLA-DQ8 negative coeliac patients. Gut 52:57–62.
61
Meng D-J, Lu J, Fan W, Dong J-J, Zhang J, Kong W-B, Lin Y, Shan L-J. 2009. Optimization of extraction conditions for antioxidant phenolic compounds from malt rootlets using
response surface methodology. J Food Biochem 33:291–305.
Nikulina M, Habich C, Flohe SB, Scott F, Kolb H. 2004. Wheat gluten causes dendritic
cell maturation and chemokine secretion. J Immunol 173:1925–1933.
Osman AM, Coverdale SM, Cole N, Hamilton SE, de Jersey J, Inkerman PA. 2002. Characteristic and assessment of the role of barley malt endoproteases during malting and
mashing. J Inst Brew 108(1):62–67.
Palova-Jelinkova L, Rozkova D, Pecharova B, Bartova J, Sediva A, Tlaskova-Hogenova
H, Spisek R, Tuckova L. 2005. Gliadin fragments induce phenotypic and functional maturation of human dendritic cells. J Immunol 175:7038–7045.
Piper JL, Gray GM, Khosla C. 2004. Effects of prolyl endopeptidase on digestive-resistant
gliadin peptides in vivo. JPET 311:213–219.
Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS, Deshpande VV. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol Mol Biol R 62(3):597–635.
Rizello CG, De Angelis M, Di Cagno R, Camarca A, Silano M, Losito I, De Vincenzi M,
De Bari MD, Palmisano F, Maurano F, Gianfrani C, Gobbetti M. 2007. Highly efficient
gluten degradation by lactobacilli and fungal proteases during food processing: New perspectives for celiac disesase. Appl Environ Microbiol 73:4499‒4507.
Roberts TH, Marttila S, Rasmussen SK, Hejgaard J. 2003. Differential gene expression for
suicide-substrate serine proteinase inhibitors (serpins) in vegetative and grain tissues of
barley. J Exp Bot 54:2251–2263.
Roberts TH, Hejgaard J. 2008. Serpins in plant and green algae. Funct Integr Genomics
8:1–27.
Sapone A, Lammers KM, Mazzarella G, Mikhailenko I, Carteni M, Casolaro V, Fasano A.
2010. Differential mucosal IL-17 expression in two gliadin-induced disorders: gluten sensitivity and the autoimmune enteropathy celiac disease. Int Arch Allergy Immunol 52:75–
80.
Sapone A, Lammers KM, Casolaro V, Cammarota M, Giuliano MT, De Rosa M, Stefaniles R, Mazzarella G, Tolone C, Russo MI, Esposito P, Ferraraccio F, Cartenì M, Riegler
G, de Magiatris L, Fasano A. 2011. Divergence of gut permeability and mucosal immune
gene expression in two gluten associated conditions: celiac disease and gluten sensitivity.
BMC Medicine 2011, 9:23.
Sapone A, Bai JC, Ciacci C, Dolinsek J, nGreen PHR, Hadjivassilou M, Kaukinen K, Rostami K, Sanders DS, Schumann M, Ullrich R, Villalta D, Volta U, Catassi C, Fasano A.
2012. Spectrum of gluten-related disorders: consensus on new nomenclature and classification. BMC Medicine 2012, 10:13.
Schwalb T, Wieser H, Koehler P. 2012. Studies on the gluten-spesific peptidase activity of
germinated grains from different cereal species and cultivars. Eur Food Res Technol
235:1161–1170.
62
Sebela M, Rehulka P, Kabrt J, Rehulkova H, Ozdian T, Raus M, Franc V, Chmelik J.
2009. Identification of N-glycosylation in prolyl endoprotease from Aspergillus niger and
evaluation of the enzyme for its possible application in proteomics. J Mass Spectrom
44:1587–1595.
Shan l, Molberg Ø, Parrot I, Hausch F, Filiz F, Gray GM, Sollid LM, Khosla C. 2002.
Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue. Science 297:2275–2279.
Shan L, Marti T, Sollid LM, Gray GM, Khosla C. 2004. Comparative biochemical analysis
of three bacterial prolyl endopeptidase: implications for coeliac sprue. Biochem J 383:311–
318.
Shan L, Qiao S-W, Arentz-Hansen H, Molberg Ø, Gray GM, Sollid LM, Khosla C.
2005.Identification and analysis of multivalent proteolytically resistant peptides from gluten: implications for celiac sprue. J Proteome Res 4:1732–1741.
Shewry PR, Field JM. 1982. The purification and characterization of two groups of storage
proteins (secalins) from rye (Secale cereale L.). J Exp Botany 33:261–268.
Shewry PR, Parmar S, Miflin BJ. 1983. Extraction, separation, and polymorphism of the
prolamin storage proteins (secalins) of rye. Cereal Chem 60:1–6.
Shewry PR, Kreis M, Parmar S, Lew EJL, Kasarda DD. 1985. Identification of γtype hordeins in barley. FEBS 2924 190:61–64.
Shewry PR, Tatham AS. 1990. The prolamin storage proteins of cereal seeds: structure and
evolution. Review article. Biochem 267:1–12.
Shewry PR, Tatham AS, Halford NG. 1999. The prolamins of the Triticeae. Teoksessa:
Shewry PR, Casey R (toim.) Seed Proteins. Dordrecht, Netherlands: Kluwer Academic
Publishers. s. 35-78.
Shewry PR, Beaudoin F, Jenkins J, Griffiths-Jones S, Mills ENC. Plant protein families
and their relationship to food allergy. Biochem Soc T 30:906–910.
Shewry PR, Halford NG. 2002. Cereal seed storage proteins: structure, properties and role
in grain utilization. J Exp Botany 53(370):947–958.
Silverman GA, Bird PI, Carrell RW, Church FC, Coughlin PB, Gettins PGW, Irving JA,
Lomas DA, Luke CJ, Moyer RW, Pemberton PA, Remold-O’Donnell E, Salvesen GS,
Travis J, Whisstock JC. 2001. The serpins are an expanding superfamily of structurally
similar but functionally diverse proteins. J Biol Chem 276:33293–33296.
Shebis Y, Iluz D, Kinel-Tahan, Dubinsky Z, Yehoshua Y. 2013. Natural antioxidants:
function and sources. FNS 4:643–649.
Simpson DJ. 2001. Proteolytic degradation of cereal prolamins–the problem with proline.
Plant Sci 161:825–838.
Sollid LM, Markussen G, Ek J, Gjerde H, Vartdal F, Thorsby E. 1989. Evidence for a primary association of celiac disease to a particular HLA-DQ α/β heterodimer. J Exp Med
169:345–350.
Sollid LM. 2000. Molecular basis of celiac disease. Annu Rev Immunol 18:53–81.
63
Sollid LM. 2002. Coeliac disease: dissecting a complex inflammatory disorder. Nature
Reviews 2:647–655.
Sollid LM, Khosla C. 2005. Future therapeutic options for celiac disease. Nature Clinical
Practice Gastroenterology & Hepatology 2:140–147.
Stenman SM, Lindfors K, Venäläinen JI, Hautala A, Männistö PT, Garcia-Horsman JA,
Kaukovirta-Norja A, Auriola S, Mauriala T, Mäki M, Kaukinen K. 2010. Degradation of
coeliac disease-inducing rye secalin by germinating cereal enzymes: diminishing toxic
effects in intestinal epithelial cells. Clinical Exp Immunol 161:242–249.
Stepniak D, Spaenij-Dekking L, Mitea C, Moester M, de Ru A, Baak-Pablo R, van Veelen
P, Edens L, Koning F. 2006. Highly efficient gluten degradation with newly identified
prolyl endoprotease: implications for celiac disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 291:G621–G629.
Tatham AS, Drake AF, Shewry PR. 1985. A corformational study of glutamine- and proline-rich cereal seed protein, C hordein. Biochem J 226:557–562.
Tatham AS, Marsh MN, Wieser H, Shewry PR. 1990. Conformational studies of peptides
corresponding to the coeliac-activating regions of wheat a-gliadin. Biochem. J 270:313318.
Tatham AS, Shewry PR. 2008. Allergens in wheat and related cereals. Clinical Exp Allergy 38:1712–1726.
Tucker GA. 1995. Fundamentals of enzyme activity. Teoksessa: Tucker GA, Woods LFJ
(toim.) Enzymes In Food Processing. 2.p. Glasgow, UK: Blackie Academis & Professional. s. 1–25.
Tuckova L, Novotna J, Novak P, Flegelova Z, Kveton T, Jelinkova L, Zidek Z, Man P,
Tlaskova-Hogenova H. 2002. Activation of macrophages by gliadin fragments: isolation
and characterization of active peptide. J Leuk Biol 71:625–631.
Uchida K, Kato Y, Kawakishi S. 1990. A novel mechanism for oxidative cleavage of
prolyl peptides induced by the hydroxyl radical. Biochem Bioph Res Co 169:265–271.
Universal Protein Resource, Uniprot. Saatavilla: http://www.uniprot.org/. Tulostettu:
2.9.2014.
U.S. Food and Drug Administration. 2013. Enzyme Preparations Used in Food (Partial
List) [online]. Saatavilla:
http://www.fda.gov/food/ingredientspackaginglabeling/gras/enzymepreparations/default.ht
m. Tulostettu: 2.9.2014
Vader W, Kooy Y, van Veelen P, De Ru, Harris D, Benckhuijsen W, Peña S, Mearin L,
Drijfthout JW, Koning F. 2002.The gluten response in children with celiac disease is directed toward multiple gliadin and glutenin peptides. Gastroenterology 122:1729–1737.
Vader LW, Stepniak DT, Bunnik EM, Kooy YMC, De Haan W, Drijfhout JW, van Veelen
PA, Koning F. 2003. Characterization of cereal toxicity for celiac disease patients based on
protein homology in grains. Gastroenterology 125:1105–1113.
64
van de Wal Y, Kooy YMC, van Veelen P, Peña SA, Mearin LM, Molberg Ø, Lundin KEA,
Sollid LM, Mutis T, Benckhuijsen WE, Drijfhout JW, Koning F. 1998.Small intestinal T
cells of celiac disease patients recognize a natural pepsin fragment of gliadin. Proc Natl
Acad Sci USA 95:10050–10054.
van de Wal Y, Kooy YMC, van Veelen P, Vader W, August SA, Drijfhout JW, Peña SA,
Koning F. 1999.Glutenin is involved in the gluten-driven mucosal T cell response. Eur J
Immunol. 29:3133–3139.
Whitaker JR. 2003. Proteolytic Enzymes. Teoksessa: Whitaker JR, Voragen AJ ja Wong
DWS (toim.) Handbook of food enzymology. New York, USA: Mark Dekker Inc. s. 993–
1018.
Wieser H, Koehler P. 2008. The biochemical basis of the celiac disease. Cereal Chem
85:1–13.
Zotta T, Piraino P, Ricciardi A, McSweeney PLH, Parente E. 2006. Proteolysis in model
sourdough fermentations. J Agric Food Chem 54:2567–2574.
Østergaard H, Rasmussen SK, Roberts TH, Hejgaard J. 2000.Inhibitory serpins from wheat
grain with reactive centers resembling glutamine-rich repeats of prolamin storage proteins.
J Biol Chem 43:33272–33279.
Liite 1
LIITE 1. Aminohapot ja niiden lyhenteet
Aminohappo
Glysiini
Alaniini
Valiini
Leusiini
Isoleusiini
Proliini
Fenyylialaniini
Tyrosiini
Tryptofaani
Seriini
Treoniini
Kysteiini
Metioniini
Arginiini
Histidiini
Lysiini
Asparagiinihappo
Glutamiinihappo
Asparagiini
Glutamiini
3-kirjaiminen lyhenne
Gly
Ala
Val
Leu
Ile
Pro
Phe
Tyr
Trp
Ser
Thr
Cys
Met
Arg
His
Lys
Asp
Glu
Asn
Gln
1-kirjaiminen lyhenne
G
A
V
L
I
P
F
Y
W
S
T
C
M
R
H
K
D
E
N
Q
Liite 2 (1/3)
LIITE 2. Tutkimuksessa käytetyt reagenssit ja laitteet
Kaikki käytetyt reagenssit olivat analyysilaatuisia
Ohra-ruismallasuutteen käsittelyssä käytetyt reagenssit ja laitteet:
Ammoniumsulfaatti ((NH)2SO4), Mallindckrodt Baker B.V., Deventer, Alankomaat
Kylmäsentrifuugi, Sorvall RC56, DuPont Instruments, USA
Western plot- analyysissä käytetyt reagenssit, tarvikkeet ja laitteet:
Polyvinyylideenifluoridikalvo, Immun-Blot PVDF Membrane for protein Blotting, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA
NuPAGE® Transfer Buffer, Life technologies, Carlsbad, CA, USA
Metanoli (CH3OH), Mallindckrodt Baker B.V., Deventer, Alankomaat
Natriumkloridi (NaCl), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Tween 20 (polyoksietyleenisorbitaanimonolauraatti, C58H114O27), Merck KGaA, München, Saksa
1. vasta-aine: Anti-Gliadin (wheat) antibody produced in rabbit G9144, Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA
2. vasta-aine: IRDye®680LT Donkey (polyclonal) Anti-Rabbit IgG (H+L), LI-COR biosciences,
Lincoln, NE, USA
Rasvaton maitojauhe, Valio Oy, Suomi
Skanneri, LI-COR Odyssey (ODY-2860), LI-COR biosciences, Lincoln, NE, USA
SDS-geelielektroforeesissa käytetyt reagenssit, tarvikkeet ja laitteet:
10 % NuPAGE® Bis-Tris Mini geeli, Life technologies, Carlsbad, CA, USA
NuPAGE® MES (2-(N-morfolino)etaanisulfonihappo) ajopuskuri, Life technologies, Carlsbad, CA,
USA
Glyseroli (HOCH2CH(OH)CH2OH), May & Baker Ltd, Dagenham, Englanti
Bromfenolisininen (C19H10Br4O5S), Merck KGaA, Darmstad, Saksa
NuPAGE® antioksidatti, Life technologies, Carlsbad, CA, USA
Liite 2 (2/3)
Molekyylimassamerkkiaine: Novex Sharp Pre-Stained Protein- standard, Life technologies, Carlsbad, CA, USA
Elektrofireesilaite: XClee SureLock Mini Cell, Life technologies, Carlsbad, CA, USA
Virtalähde: Power Pack 300, Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA
Väriaine: Coomassie Brilliant Blue R-250, MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA
Trikloorietikkahappo (TCA, C2HCl3O2), Merck KGaA, Darmstad, Saksa
Kokoekskluusiokromatografisissa määrityksissä tarvittavat reagenssit, tarvikkeet ja laitteet:
Asetonitriili, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Dinatriumvetyfosfaatti (Na2HPO4), Riedel-de Haen GmbH, Seelze, Saksa
Natriumdivetyfosfaatti (NaH2PO4), Riedel-de Haen GmbH, Seelze, Saksa
Kolonni 1: SuperdexTM Peptide 10/300 GL, GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Ruotsi
Kolonni 2: SuperdexTM 200 10/300 GL, Amersham Bioscience AB, Uppsala, Ruotsi
1200 HPLC-laitteisto, Agilent Technologies, Saksa
Detektori: Waters 996 photodiode array detector, Waters Corporation, Milford, MA, USA
Muut kokeellisessa tutkimuksessa käytetyt reagenssit:
Natriumlauryylisulfaatti (SDS, Cl2H25NaO4S), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Tris(hydroksimetyyli)aminometaani (C4H11NO3), Trisma-Base, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
USA
Ditriotreitoli (DTT, C4H10O2S2), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
2-merkaptoetanoli (C2H6OS), Fluka Chemie Ag, Buchs, Sveitsi
Bis(2-hydroksietyyli)-amino-tris(hydroksimetyyli)-metaani (C8H19NO5), Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA
MilliQ- vesi, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA
Natriumasetaatti (CH3COONa), Merck KGaA, Darmstad, Saksa
Etanoli (Etax Aa, C2H5OH), Altia Oy, Rajamäki, Suomi
Liite 2 (3/3)
Vetyperoksidi (H2O2), Merck KGaA, Darmstad, Saksa
Kuparisulfaatti (CuSO4), Merck KGaA, Darmstad, Saksa
Proteaasi K- entsyymi, Merck KGaA, Darmstad, Saksa
Etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA, C10H16N2O8),
Muut kokeellisessa tutkimuksessa käytetyt laitteet:
Inkubaattori: Heidolph Incubator 1000, Heidolph Instruments, Schwabach, Saksa
pH-mittari: PHM92 LAB pH METER, Radiometer, Kööpenhamina, Tanska
Koeputkikuumentaja: Grant QBD2, Grant Instruments Ltd, Cambridge, Iso-Britannia
Koeputkiravistelija; Vortex GenieTM 2, Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY, USA
Sentrifuugi: Eppendorf Centrifuge 5424, Eppendorf AG, Hampuri, Saksa
Vakuumikonsentraattori: Savant Speedvac Plus SC 110A, GMI Inc, Ramsey, MN, USA
Sonikointilaite: VWR Ultrasonic Cleaner, VWR International, Radnor, PA, USA