Uudet tekniikat infektiodiagnostiikassa
Labquality Days 5.2.2015
Kaisu Rantakokko-Jalava
Tyks mikrobiologia ja genetiikka
VSSHP – Tyks-Sapa-liikelaitos
Uusia tuulia kl. mikrobiologiassa
• MALDI-TOF bakteerien tunnistamisessa
• Bakteeriviljelyjen osittainen korvautuminen
muilla tutkimuksilla
– virtsan partikkelilaskenta osana virtsaviljelyä
– uusi bakteeriripulidiagnostiikka
• Helpot ja nopeat PCR-testit
– Yksittäiset testit on-demand
– Testipaneelit
MALDI-TOF MS
Matrix-assisted laser
desorption/ionization – time of flight
mass spectrometry
•”Proteiinisormenjälki”
Tunnistus perustuu spektriin
• Tietokannassa ~5000
bakteeri- ja
sienispektriä
• Tutkittavan kannan
spektriä verrataan
tietokantaan ja
saadaan pisteet eli
score (log 0-3)
score
<1.7
Ei luotettavaa tunnistusta
1.7 - 2.0
Tunnistus sukutasolle
>2
Tunnistus lajitasolle
Mitä MALDI-TOF on muuttanut?
• Bakteereille nimi n. 1 vrk aiemmin kuin ennen
– anaerobeilla muutos jopa >3 vrk
• Sama tunnistusmenetelmä sopii lähes kaikille
bakteereille
– Erilaisten tunnistustestien määrä vähentynyt
– Ei tarvita ennakkoarvausta
– Saadaan paljon nimiä, joita ei ennen olisi saatu
• Kun tiedetään nimet heti, voidaan jatkotutkimukset ja herkkyysmääritykset suunnata
paremmin
Dia marraskuulta 2012
Esimerkkinä veriviljely
+
Gram-värjäys
Identifikaatio
Herkkyydet
Uudet
mahdollisuudet
Veriviljely
+
Gram-värjäys
Identifikaatio
Herkkyydet
ID Maldilla 3-4 h
maljakasvatuksen
jälkeen
Uusi Bactec (päivystyslaboratoriossa, 24/7 täyttö)
•Puolella potilaista ensimmäinen veriviljelypullo
hälyttää ≤12 h inkuboinnin jälkeen
MALDI-TOF varhaisesta kasvusta
Bakteeri
n
Laji Suku
Yht. (%)
E. coli
82
80
1
81 (99%)
Muut enterobakteerit
P. aeruginosa
21
4
21
3
0
0
21 (100%)
3 (75%)
S. aureus
Koag.negat. staf.
39
35
30
15
5
5
35 (90%)
20 (57%)
Β-hemol streptokokit
25
24
1
25 (100%)
9
4
1
5 (55%)
111
126
106
77
2
14
108 (97%)
91 (72%)
enterokokit
Gramnegatiiviset yht
Grampositiiviset yht
ECCMID 2014 P495, HUSLAB, ISLAB, Tykslab
Partikkelilaskijan käyttö virtsatieinfektiodiagnostiikassa
Uusissa malleissa (UF 500i
tai 1000i) on paranneltu
bakteerikanava verrattuna
aikaisempiin malleihin
Ihanteellisesta olisi, jos voitaisiin
nopeasti varmistaa VTI
• Jos VTI voidaan
luotettavasti poissulkea,
voidaan
vähentää ”turhien”
viljelyjen määrää
Virtsaviljelyt
Seulonta bakteerija leukosyyttimäärän mukaan
ryhmittäin (N,M,L)
Sarkkinen ym. SLL 2012
Oma aineisto (2011)
• 1123 potilasta, joista
– 640 naisia
– 416 miehiä
– 67 lapsia (<16v)
• Viljelypositiivisia 163 (14,5%)
– (N 117, M 37, L 9)
• Viljelynegatiivisia 847 (75,4%)
– (N 443, M 356, L 48)
• Sekakasvuja yms. 113 (10,1%)
– (N 81, M 23, L 10)
Seulonta bakt + leuk yhdistelmällä
Ptryhmä
Naiset
Miehet
Aikuiset
Rajaarvot
Bakt 200
Leuk 11
Bakt 75
Leuk 37
Bakt 40
Leuk 17
Herkkyys 95.7 %
91.9 %
94.8 %
Tarkkuus 62.5 %
87.4 %
76.3 %
NPV
98.4 %
99.0 %
98.5 %
PPV
43.7 %
43.0 %
43.6 %
VN*
0.78%
0.72 %
0.76 %
77 %
62 %
Seul. neg 52 %
*Laboratorio vastannut merkittävänä pidettyä kasvua. Oireinen infektio oli vain 23:lla 8:sta vääräksi negatiiviseksi luokitellusta.
Virtsaviljelyn tulkinnasta
• Tulkinta riippuu
– Kasvavasta bakteerista/bakteereista
– Näytteenottotavasta (plv, katetri, punktio…)
– Rakkoajasta
– Laboratoriosta ja lukijasta
• Bakteerilöydös ilman oireita EI ole vti
• Partikkelilaskennassa raja-arvot vs.
”liikkuva maali”
Virtsaviljely Tykslabissa nyt
U-BaktVi
•2 partikkelilaskijaa
– Tyks, TKS näytteet
”Ohituskaista”
U-BaktEVi (erikoisviljely)
•Lapset
•Hematologia
•Muut leukosyyttipuutteiset?
•N. 50% seulontanegatiivisia (vastaus
heti)
•Viljellyistä n. puolet
kasvaa; +sekakasvut
•Samat löydökset
kuin 2012
Antibioottiripulin diagnostiikka
F-CldiVi
•Korvannut FBaktVi2:n
•Kasvavan kannan
toksiinintuotto
varmistetaan PCR:llä
F-CldiTx
•Suora toksiinin
osoitus ulosteesta
epäherkkä (<70%)
•Korvattava
– GDH + varmistus
toksiinintuotosta
– PCR l. toksiinigeenin osoitus
suoraan ulosteesta
GDH Cdiff seulontatestinä
• Soluseinäantigeeni, jota esiintyy sekä toksiinia
tuottavissa että ei-tuottavissa kannoissa (ja C.
sordelliissa)
– Herkkyys >>90%
– Ribotyyppi 002 voi olla ongelma (Suomessa 6%)
• Testattu 257 näytettä GDH vs 2-3 PCR-testiä
– Toksiinigeenipositiivisia oli yht. 73
– GDH löysi 71 (97%).
• ”Missatut” negatiivisia myös yhdellä PCR:llä, muilla
myöhäinen Ct (siis heikkoja positiivisia)
• Toinen viljelynegatiivinen, toinen ei viljelty
• GDH-positiivisista 90% on toksiinigeenipositiivisia
Tykslabin uusi C. difficile -seulonta
GDH Vidaksella
-
+
Seulonta
negat
PCR
Seulonta
negat
+
Seulonta
posit
Vastaus
Tulkinta
Positiivinen
Näytteessä on C. difficile, jonka kyky tuottaa toksiinia on
varmistettu PCR:llä
Negatiivinen
Näytteessä ei todeta C. difficilen antigeenia tai
Näytteessä on C. difficilen antigeeni, mutta kanta ei tuota
toksiinia
GenXpert
C. difficile toksiini-PCR
Markkinoilla helppoja PCR-testejä
•Kohde toksiini B:tä koodaava geeni
•Näyte vorteksoidaan puskuriin, laite
hoitaa loput
•Tulos 1-2 tunnissa
•Herkkyys > viljelyllä (kliinisesti?)
Genomera
BD Max
Samoilla laitteilla esim.
influenssaa, norovirusta,
MRSA, klamydia…
Mahdollistavat nopeat
PCR-tutkimukset keskussairaalassa/jopa
päivystysaikana
Cldi seulonta vs. viljely (tx+)
Seulonta pos
Seulonta neg
Yht
Viljely pos, tx pos
155
16
171
Viljely neg
28
999
1027
1198
• Seulonta (GDH+ toxB-PCR) os:lla 938
• F-CldiVi os:lla 906, eristetyistä kannoista
toksiini-PCR (toxA, toxB, säätelygeenin deleetio)
• Seulonnan herkkyys 91%, spesifisyys 97%
• 7/16 missatussa GDH pos /toxB-PCR neg
– GDH:n herkkyys 95%
Helpot PCR-laitteet jatkuu
Xpert -kasetti
GeneXpert -laite
GeneXpert
Testivalikoima
• MRSA
– kannan varmistaminen
– veriviljelypullot, joissa
värj stafylokokkia
– suoraan näytteestä
tietyin varauksin
• VRE
– kannan varmistaminen
• Carba
– kannan varmistaminen
• Str. agalactiae
– vaginanäytteestä
synnyttäjältä
• Enterovirus
– Likvorista
• Influenssavirukset
– A / A H1N1 / B
• C. difficile toksiini
– Tox B / binaaritx /”027”
– Mtb/rif
Laajat paneelit päivystyksenä?
• Hematologisten potilaiden
respiratoriset infektiot
• Tehopotilaiden illalla
hälyttävät veriviljelyt
• Meningiitit/enkefaliitit
Yhteenveto
• Mikrobiologiseen diagnostiikkaan on jo
saatu ja tulossa uutta teknologiaa, joiden
avulla vastauksia voidaan nopeuttaa
• Usein kallista, hyödyn arviointi
• Hyödyntäminen voi vaatia työtapojen ja
työnjaon uudistamista
– Mikrobiologian laboratorio ja sen aukioloajat
– Muutenkin päivystävä laboratorio
– Vieritestaus
KIITOKSET