Forbedring af fødevaresikkerhed gennem eliminering af patogene bakterier i blandede biofilm Lone Gram, Karen Kiesbye Dittmann og Virginie Oxaran [email protected] Et projekt støttet af DSF/IF Samarbejde med Brasilien/São Paulo Faculty of Animal Science and Food Engineering, USP Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto, USP Faculty of Pharmacy, Federal University of Goiás Professor Elaine C.P. De Martinis Professor Carlos Augusto Fernandes de Oliveira Professor Carlos Humberto Corassin Ass. Professor Virginia Alves 2 Baggrund, mål, work-in-progress (Brasilianske) oste associeret med sygdom forårsaget af Staphylococcus aureus og Listeria monocytogenes Spørgsmål: • De patogene bakterier koloniserer og persisterer i produktions-anlægget ? • De patogene bakterier er vanskelige at fjerne i ”blandede biofilm” ? 3 4 5 Minas cheese • Frisk ost; fra både rå og pasteuriseret mælk • Kan modnes, kort/lang tid 6 Rå mælk Minas cheese Starterkultur, Filtrering (pasteurisering) Ostemasse (32°C, 50-70 min) løbe, CaCl2 Opskæring af ostemasse Fjernelse af valle Overføres til forme, dræning, saltning Eventuel modning Plastpakning Kølelagring 7 Persistens ? • Prøver af råvarer, miljøprøver, færdigvarer analyseres for L. monocytogenes og S. aureus (og ”normal” mikrobiologi) • Isolater sendes til DK • Identificeres (fænotype, 16S rRNA gen) • Sub-types (multilocus sequence typing, MLST) 8 Loci for MLST-typning L. monocytogenes abcZ (ABC transporter) bglA (beta glucosidase) cat (catalase) dapE (succinyl diaminopimelate desuccinylase) dat (D-amino acid aminotransferase) ldh (L-lactate dehydrogenase) lhkA (histidine kinase) Inst. Pasteur MLST base 9 S. aureus arc (Carbamate kinase) aroE (Shikimate dehydrogenase) glpF (Glycerol kinase) gmk (Guanylate kinase) pta (Phosphate acetyltransferase) tpi (Triosephosphate isomerase) yqiL (Acetyle coenzyme A acetyltransferase) MLST data base (mlst.net) L. monocytogenes persistens 8-10 prøveindsamlinger: eet isolat – ST2 Tidligere (2008-2009): – 3 virksomheder – 393 prøver – 28 positive (to virksomheder) – 85 isolater 10 L. monocytogenes MLST Antal isolater Pulsotype ST 9 XXV, XXVI, XXVII, XXVIII, XXIX 1 52 11 XIV, XV, XVII XVIII XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV 2 10 I, II, III, IV, XVI 3 8 VIII, IX, X, XI, XII, XIII 218 2 2 1 1 VI, VII XXX V XXI 520 9 New New L. monocytogenes persistens • Dominans af lineage 1 (ikke lineage 2) • Sekvenstype 2 re-isoleres hyppigt (30-40% af isolater); ofte i kølerum/gulv • Inst. Pasteur MLST-base: ST2 er primært humane isolater • PFGE giver bedre opløsning • Sekvenstyper tillader sammenligning med andre indsamlinger og sub-typninger 12 S. aureus persistens • Første indsamling – Eet isolat – Sekvenstypet: ST398 – ST398 MSSA hos mennesker har fået MetR og TetR I grise og er blevet MRSA [Price et al. 2012] • Anden indsamling – 64 isolater (43 sekvenstypet) 13 S. aureus persistens (43 stammer) # S. aureus isolater ST 30 1 3 1 1 4 3 1 126 97 5 30 188 ? Ingen nye isolater af ST398 Alle stammer antibiotika-resistens-testes 14 S. aureus ST1? • ST1 tilhører clonal complex (CC) 1, der inkluderer community-associated MRSA (CA-MRSA) også kaldet USA400 • MRSA spa type t127, ST1 er først for nylig fundet hos grise • Muligvis ny MRSA-infektion hos mennesker • Omtales ofte sammen med ST398 15 Kontrol af persistens Forhindre kolonisering (bakterie-biofilm) Fjernelse (rengøring / desinfektion) • Er persistente stammer bedre til at danne biofilm? • Er persistente stammer mere tolerante overfor rengøring / desinfektion? 16 17 persisterende V518a 4666 7418 7291 La22 4446 No40-1 4459 O57 6895 R479a EGD 4239 LO28 H13-1 La111 N53-1 M103-1 Crystal violet (OD590) L. monocytogenes biofilm 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 andre Jensen et al. 2007 JFP L. monocytogenes desinfektions-tolerance 5 b b 4 b b b b b b,d b,c b,d c,d 3 a a 2315 2 EGD log10 reduction (cfu/ml) b 1 4446 7291 7418 Scott A LO28 Br22 3R1 N22-2 La22 V518a N53-1 La111 0 Reduktion i celletal ved behandling med Incimaxx 18 Kastebjerg og Gram 2009 JAM Biofilm/desinfektion afhænger af miljø • Naturlig snavs (mælk, protein, fedt, salt) og mikrobiologi Biofilmdannelse hos fire jordbakterier i monokultur eller blandet kultur Ren et al. 2015 ISME J 19 Isolering af ”microbial community” BZ002 - Klebsiella sp L. monocytogenes BZ001 BZ003 - Escherichia coli BZ004 - Comamonas sp BZ006 - Acinetobacter sp BZ008 - Macrococcus caseolytens S. aureus BZ007 BZ009 - Lactococcus lactis BZ010 - Kurthia gibsonii BZ011 - Acinetobacter sp BZ013 - Aeromonas sp S. aureus BZ012 BZ014 - Lactococcus lactis BZ017 - Candida tropicalis BZ018 - Lactobacillus sp 20 Elimineres den patogene bakterie af andre? 1,2E+10 1E+10 8E+09 6E+09 4E+09 2E+09 0 21 Total S. aureus Mere biofilm i blanding (L.m.) 72H biofilm mass in microplate -Static, Cristal violet Ratio Biofilm mass (CV OD595nm)/ Biomass (OD600nm) 1,8 1,6 1,4 1,2 L. monocytogenes udgør 6-34% af den blandede biofilm 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 L. monocytogenes 22 Mixed community (Foreløbige) konklusioner og planer • L. monocytogenes kontaminering (i Minas osterier) er reduceret markant • Sekvens-typning af L. monocytogenes tillader sammenligning på tværs, men PFGE giver bedre opløsning • S. aureus isoleres hyppigt fra Minas osterier • Muligvis hyppig forekomst af MRSA 23 (Foreløbige) konklusioner og planer • ”Blandede bakteriebiofilm” er etableret • Kvantificering af den patogene i blandede biofilm er en udfordring (selektive plader el qPCR) • Test af desinfektions-tolerance følger • Undersøgelse af virulens-egenskaber efter dyrkning i blandede biofilm følger 24
© Copyright 2024