03.02.2015 Oversikt • Rusmidler – hva er nå det i 2015? • Hurtigtester Rusmiddelanalyser laboratorieanalyser og hurtigtester Elisabeth Leere Øiestad Avdeling for rusmiddelforskning og metodeutvikling Folkehelseintituttet – Urin – Spytt • Immunologi • Kromatografi Farmasøytisk Institutt Universitetet i Oslo Hva er rusmidler? Amfetamin Metamfetamin Ecstasy Cannabis Kokain Heroin LSD Fensyklidin Khat GHB Benzodiazepiner Opioider Andre legemidler med ruspotensiale VG 6/1-2015 (EMCDDA European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction – early warning system) Økende mengde nye stoffer Phenethylamines Tryptamines Piperazines Cathinones Synthetic cannabinoids Other (chemicals, plants, medicines) 1 03.02.2015 Stoff Stoff Etanol THC Klonazepam Amfetamin Metamfetamin Diazepam Alprazolam Oxazepam Morfin Nitrazepam Zopiklon Kodein Metadon 6-mam Buprenorfin GHB Pregabalin Tramadol Ritalinsyre MDMA Fentanyl Kokain Ketamin Metylfenidat Zolpidem Oksykodon Flunitrazepam Etizolam Flubromazepam Metiopropamin 5F-Apinaca Lorazepam Diclazepam Alfa-PVP Fenazepam Midazolam PMMA Bromazepam Meprobamat Etylmorfin Karisoprodol LSD PMA Mefedron Pyrazolam Antall positive funn 3904 2168 2045 2030 1098 928 515 205 203 180 172 168 168 141 122 114 101 96 92 86 85 80 79 71 63 40 27 v9 v9 vc9 cv7 7 v6 v5 5 5 v5 4 3 2 2 v2 v2 v1 v1 Antall positive Prosent 2013 2013 2012 1 Etanol 4826 5081 56 %* 2 THC 1884 1821 35 % 3 Klonazepam 1883 1935 35 % 4 Amfetamin 1712 1486 32 % 5 Metamfetamin 1512 1574 28 % 6 Diazepam 1058 1116 20 % 7 Alprazolam 441 402 8% 8 Oxazepam 263 230 5% 9 Nitrazepam 224 203 4% 10 Morfin 193 217 4% 2014 Funn av NPS i kjøresaker 2014 Virkning i hjernen STOFF -injeksjon -inhalasjon -peroralt Hurtigtester Laboratorieanalyser “Narkometer” Kromatografiske analyser Totalt n=56 Stoffkonsentrasjon Lagring i vev Cmax ofte 12-24 timer etter inntak STOFF Blod PRODUKT Utskillelse (nyrer) Urin Omdannelse (lever) PRØVETAKING STOFF PRODUKT spytt Blod Urin Timer Dager/uker Tid Inntak 2 03.02.2015 Påvisningstid i forskjellige biologiske medier NB! Påvisningstid avhenger alltid av konsentrasjon i mediet og deteksjonsgrense Blod Hurtigtester – en immunologisk test • Baserer seg på reaksjonen med et antistoff og et antigen (egentlig et kroppsfremmed stoff som danner antistoffer eller i Spytt vårt tilfelle et rusmiddel/legemiddel) Urin • Gjenkjenner deler av molekylet Svette • Gjenkjenner ofte deler som er felles for mange stoff Hår og negler Minutes Hours Days Weeks Years Months Tilpasset fra: Caplan YH, Goldberger BA. Alternative specimens for workplace drug testing. J 13 Anal10.02.2011 Toxicol 2001;25:396-9. 14 Immunologisk metode Direkte «Sandwich» Konkurranse • gjenkjenner deler av molekylet • gjenkjenner deler som er felles innenfor stoffgruppen Benzodiazepiner: ulike BENZO stoffer IMM • • Diazepam (Valium) Oxazepam (Sobril) • • • • Alprazolam (Xanor) Bromazepam Midazolam (Dormicum) Lorazepam • • • • Nitrazepam (Apodorm) Flunitrazepam (Flunipam, Rohypnol) Klonazepam (Rivotril) Fenazepam • • Zopiklon (Imovane) Zolpidem (Stilnoct) Hvilket stoff er blitt inntatt? Et immunologisk resultat kan ikke skille mellom benzodiazepiner. Dersom pasienten står ”lovlig” på Sobril kan han/hun innta ubegrenset av andre benzodiazepiner uten at vi ser det på analyseresultatet. 0 3 03.02.2015 Interaksjoner Falsk positiv/falsk negativ • Beslektede stoffer • Falsk negativ – testen er ikke følsom nok – Amfetamin : Efedrin (i bl.a.Tuxidrin og andre hostesafter samt noen • Finner ikke stoff som er i kroppen naturpreparater). Rinexin /Monydrin. Nesespray(?). Fenfluramin (slankemidler). • Falsk positiv - testen reagerer på andre stoffer Selegilin (mot parkinson). – Opiater : Kodein (Paralgin Forte), Valmuefrø. I «gamle dager» Tuxi hostesaft. • Helt andre stoffer 20 Hurtigtester • Teststripsene lages i store ark – Kan være ujevne, slik at en batch er «bedre» enn en annen – Flere leverandører kan ha samme teststripe «i bunnen» – Påvisningsgrenser satt ut fra ønske evt. hva som er «mulig» Påvisningsgrenser Amfetamin Benzodiazepiner Buprenorfin Kokainstoffer Metadon Kryssreaktivitet Opiater Cannabisstoffer • Testen er laget basert på ett stoff • Men både inntatt stoff og metabolitter eller beslektede stoffer gir utslag Påvisningsgrenser (ng/ml) 300 300 10 300 300 300 OK for oxazepam (Sobril), ikke for klonazepam (Rivotril) 50 Stoff Morfin 6-monoacetylmorfin (6-MAM) Kodein Cut-off (ng/ml) Kryssreaktivitet (%) 20 100 35 25 57 80 Opiatkonsentrasjon (kombinert) = 100% kons (morfin) + 57% kons(6-MAM) + 80% kons(kodein) 4 03.02.2015 Veikanttesting – ”narkometer” År: 2004 År: 2013 År: 2009 Påvisningsgrenser Faste grenser for narkotika og sløvende legemidler i trafikken • Vegtrafikkloven er endret til å innføre faste grenser for Amfetamin Benzodiazepiner Kokainstoffer Opiater Cannabisstoffer 300 300 300 300 50 60 25 20 40 20 andre stoffer enn alkohol • Et utvalg ledet av Jørg Mørland foreslo konsentrasjonsgrenser i desember 2010 • 20 stoffer: Både narkotika og sløvende legemidler • Det ble også åpnet for bruk av hurtigtester for spytt URIN Påvisningsgrenser (ng/ml) SPYTT Påvisningsgrenser (ng/ml) 27 Påvirkning i forhold til konsentrasjon Number of persons Konstruert eksempel valiumbrukere blod Driving under the influence of alcohol, drugs and medicines Kjøring under påvirkning av alkohol, andre rusmidler og medisiner Diazepam blood-concentration www.druid-project.eu Figur fra H. Gjerde, FHI 5 03.02.2015 Påvirkning i forhold til konsentrasjon Påvirkning i forhold til konsentrasjon Valium-brukere: konsentrasjonsfordeling i spytt Number of persons Number of persons Konstruert eksempel: Valium brukere (81 personer) 1 person Influenced Possibly influenced Not influenced 1 person Influenced Possibly influenced Not influenced Diazepam blood-concentration Diazepam oral-fluid concentration Spytt reflekterer ikke nødvendigvis blodkonsentrasjonen Figur fra H. Gjerde, FHI Figur fra H. Gjerde, FHI Undersøkelse av spytt i forhold til blod – I Italia, Belgia og Finland for å undersøke tilfeldige bilister (veikantstudie) – I Norge for å undersøke bilister som ble mistenkt for ruspåvirket kjøring i samarbeid med Oslo Politikammer • Spytt og blod ble analysert med sikre metoder (LC-MS) – Alle prøver ble analysert uavhengig av mistanke 20,0 Diazepam i spytt (ng/ml) • I DRUID-prosjektet ble det samlet inn spytt og blodprøver fra flere hundre bilførere Valium (diazepam) 15,0 10,0 5,0 0,0 0,0 • Mengden rusmiddel i spytt ble sammenlignet med mengden i blod Hurtigtester i spytt – Mange falskt negative og noen falskt positive prøver Positive svar må bekreftes – Spesielt dårlige for påvisning av cannabis – Kan ikke påvise lav-dose benzodiazepiner unntatt ved stort inntak – Enkelte er vanskelige i bruk og lite robuste 100,0 200,0 300,0 400,0 Diazepam i blod (ng/ml) – Lave cutoff-grenser (I tillegg 5 personer utenfor skalaen) Immunologiske screeningmetoder • Mer nøyaktige enn hurtigtester • Er rask • Skiller ut negative prøver • Gir indikasjon på stoffgruppe • Kan finne nye stoffer med kryssreaktivitet 6 03.02.2015 Immunologiske screeningmetoder • Positiv screening betyr ikke nødvendigvis at prøven er positiv • Tar ofte lang tind å inkludere nye stoffer • Kan ha problemer med følsomhet • Kan være dyr ved stort repertoar Analyseprogram • • • • • • • • pH og kreatinin • pH (surhetsgrad) påvirker utskillelse av visse stoffer f.eks amfetamin • • • • • • • Amfetaminer Opiater Kokain-stoffer Cannabis Benzodiazepiner Buprenorfin Kreatinin pH Urinmanipulering • Før prøvetaking: – Fortynning av urin ved inntak av store væskemengder. – Inntak av sure stoffer (sitron etc) • pH kan påvirke noen analysemetoder • Under prøvetaking: • kreatinin måles for å kunne korrigere for • Etter prøvetaking: vanninnhold i urinen • kontroll av evt. manipulering – Annens urin. – Tilsetting av diverse, fortynning med vann. • Kun fantasien setter grenser! Rettssikker analyse Manipulering av spytt? • Ikke så aktuelt med kjemikalier • Finnes også produkter å få kjøpt for å forstyrre spyttanalyser • Lettere å ta prøvene under observasjon gir mindre risiko for manipulering • Nytt spytt dannes kontinuerlig – Kan skylle munnen og vente en stund ved mistanke Metadon Oxycodon 6-MAM Barbiturater Etylglukronid PCP, LSD Syntetiske cannabinoider • 2 uavhengige analysemetoder • 2 uavhengige prøveuttak Kromatografi pos Mottak Registrering Screening negativ Immunologi Ikke påvist pos Bekreftelse Vurdering påvist stoff(er) negativ Ikke påvist 7 03.02.2015 Kromatografiske analyser Kvalitetskrav FHI • Akkrediterte analyser • Ønsker å skille mellom alle de ulike • Standard prosedyrer stoffene = ønsker spesifikk metode • Standarder og kontroller analyseres sammen med reelle prøver • Strenge krav til resultatene på kontrollprøvene (både positive og negative kontroller) • Intern og ekstern kvalitetskontroll • Reanalyse 1001_34417_03 3.70 % 100 3.81 4.01 0 1.00 1001_34417_03 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 100 % Eksempel fra opiat/kokainbekreftelse Cosylan - hostesaft 0 1.00 1001_34417_03 1.50 2.00 100 Ved kromatografi koblet til MS kan man se flere stoffer 4.14 samtidig 2.50 3.00 3.50 4.00 % 2 3 5 6 789 1.00 10 11 12 13 1001_34417_03 14 1.50 2.00 2.50 3.00 3.78 3.50 5.00 5.50 6.00 4.50 5.00 5.50 6.00 4.50 5.00 5.50 6.00 4.50 5.00 5.50 6.00 5.00 5.50 6.00 5.00 5.50 6.00 5.00 5.50 6.00 5.00 5.50 6.00 4.05 4.00 Bromazepam 3.65 % 100 6-MAM – fra heroin 4.50 Klonazepam 3.70 - ett signal per stoff 0 1 4.14 4.00 3.77 Paralgin forte 0– smertestillende 1.00 1001_34417_03 3.72 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 Flunitrazepam 3.78 % 100 0 1.00 1001_34417_03 4 1.50 2.00 % 1.0 1.5 2.0 2.5 0 3.0 3.5 1.00 1001_34417_03 2.50 3.00 3.50 Ikke mulig med en FID eller UVdetektor 100 4.0 1.50 2.00 2.50 3.00 4.00 4.08 4.00 4.50 Alprazolam % 4.01 0 Oksymorfon 9. Dihydrokodein 13. Acetylkodein 1.00 1.50 1001_34417_03 6-mam 10. Folkodin 14. Kokain 100 Kodein 11. Oksykodon 0 Hydrokodon 12. Etylmorfin 3.67 2.00 2.50 3.00 1.00 1.50 4.12 3.76 3.50 4.00 3.93 % 5. 6. 7. 8. Metadon 4.01 3.50 Retention time (min)100  1.Benzoylecgonin 2.Norkodein 3.Morfin 4.Hydromorfon 4.50 3.78 3.69 2.00 2.50 3.00 3.76 3.50 4.50 Oksazepam 4.03 4.17 4.00 4.50 Analyse av isomere BHB • Jevnlig saker med mulig ketoacidose • Beta-Hydroxy butyrsyre er et “ketonlegeme” slik som aceton eller acetoacetate • Kunne vi separere GHB og BHB i GHB-metoden? • Mye ketonlegemer indikerer diabetisk eller alkoholisk ketoacidose • Eller kunne BHB gi falsk positiv GHB i obduksjonssaker? • For alkoholisk ketoacidose er det høyest konsentrasjon av BHB – Kvantisere BHB GHB BHB 8 03.02.2015 43040_103_2_03 2: MRM of 2 Channels ES+ 111.242 > 93.231 (GHB-d6) 4.77e6 1.09 % 100 0 0.60 43040_103_2_03 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 1.97 100 2.20 2.40 5: MRM of 4 Channels ES+ 166.13 > 148.12 (Pregabalin-d6) 1.32e7 Relativt lett å inkludere nye stoffer • For å inkludere et nytt stoff må man % – Ha renstoff 0 0.60 43040_103_2_03 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 1.98 100 – Bestemme retensjonstid (og evt. MS-overganger/UV- 2.20 2.40 6: MRM of 3 Channels ES+ 160.13 > 142.12 (Pregabalin) 5.95e6 spekter) % – Sjekke om prøveopparbeidelsesmetoden får med stoffet 0 0.60 43040_103_2_03 100 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.43 GHB 1.80 2.00 BHB – Sjekke mulige forstyrrelser 2.20 2.40 3: MRM of 3 Channels ES+ 105.242 > 87.231 (GHB/BHB) 1.85e6 – NB! Mer validering ved akkreditering % 1.12 1.52 0 Time 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 • 2.5I-NBOMe i standard http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug _chem_info/nbome.pdf • 2.5I-NBOMe i spyttprøve fra Oslos uteliv Mescalin Syntetiske cannabinoider – hva skal man lete etter i urin? Bruke flere kromatografiske kolonner for forskjellig selektivitet UPLC-MS/MS analyse 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Compound: 2.6 Enklere med blod eller spytt hvor stoffet selv kan analyseres 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 Time (min) => UPC2-MS/MS analyse 6 14 1.25 13 1.50 10 8 1.75 2.00 2.25 5 11 9 7 12 4 2.50 2.75 3 2 3.00 3.25 3.50 1 1. JWH-073 N-butanoic acid 2. JWH-018 N-pentanoic acid 3. UR-144 N-5-OH-pentanoic acid-degradant 4. UR-144 N-5-OH-pentanoic acid 5. RCS-4 N-5-OH-pentyl 6. Diazepam-D5 7. JWH-073 N-4-OH-butyl 8. AM-2201 N-4-OH-pentyl 9. JWH-018 N-5-OH-pentyl 10. MAM-2201 N-4-OH-pentyl 11. JWH-122 N-5-OH-pentyl 12. AM-2233 13. UR-144 N-5-OH-pentyl 14. MAM-2201 Time (min) => 9 03.02.2015 Kromatografiske analyser Ukjente rusmidler…. 5F-APINACA RT = 6.36 Ion ratio 9 Men hva er dette? RT = 6.41 Ion ratio 28 • Spesifikk metode • Kan gi kvantitative svar – Vurdering av påvirkning – Vurdering av nye inntak • Relativt lett å legge til stoffer • Finner vanligvis bare det vi ser etter Spørsmål ? 10