Document
DiViD-prosjektet Er type 1 diabetes en virussykdom? LARS KROGVOLD FORSKNINGSGRUPPE FOR BARNE - OG UNGDOMSDIABETES OSLO UNIVERSITETSSYKEHUS Er type 1 diabetes en virussykdom? 1. Ja 2. Nei 3. Vet ikke Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 OK, vi googler det!! Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Et skritt tilbake…hva er feil i kroppen ved T1D? Kroppen, nærmere bestemt betacellene i bukspyttkjertelen, slutter å lage insulin Det skjer oftest gradvis Vi kan ikke stanse det, og “en vakker dag” kommer sykdommen til syne Høyt blodsukker Da er toget gått… Insulin brunt; glukagon rødt Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Men, hva skyldes det egentlig?? Miljø Arv Noen gener, særlig HLA klasse II-gener, er assosiert med økt risiko for T1D Studier av det humane arvematerialet har avslørt en rekke andre kandidat-gener som gir en lett økt risiko for T1D Lista over gener utvides stadig….. Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Noe i maten? Kumelk Gluten Andre proteiner? Noe du mangler? Vitamin D Noe fremmed? Virus Bakterier Annet? Virus og T1D, noe helt nytt? The Journal of Infectious Diseases, Vol. 41, No. 3 (Sep., 1927), pp. 197-202 Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 En kasuistikk Et barn med nyoppdaget type 1 diabetes døde etter innleggelse med diabetes syreforgiftning Et virus (Coxackie B4) ble funnet i bukspyttkjertelen Viruset ble gitt til mus Musene utviklet deretter type 1 diabetes . Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Det er gjort masse forskning… Det er sett på: Blodprøver Hvite blodlegemer Avføringsprøver Tynntarmsprøver Spyttprøver Urinprøver Noe tyder på sammenheng Noe tyder ikke på sammenheng Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Men: Det mangler bevis!!! Et paradoks: Vi vet ikke årsaken til sykdommen….. - Men, vi undersøker aldri det syke organet ved sykdomsdebut! Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 The Diabetes Virus Detection study (DiViD) Den første studien hvor det er tatt: Vevsprøver fra bukspyttkjertelen Frivillige voksne pasienter Nylig diagnostisert med type 1 diabetes Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Diabetes Virus Detection Project (DiViD) Primært mål: Lete etter virus i bukspyttkjertelen hos pasienter med nyoppdaget T1D I tillegg: Beskrive betennelse og funksjon i buksputtkjertel og tynntarm Ansvarlige: Lars Krogvold, stipendiat og barnelege Knut Dahl-Jørgensen, hovedveileder Kristian Hanssen, biveileder Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Inklusjons og eksklusjonskriterier Inklusjon Eksklusjon Kvinner og menn i Graviditet alderen 18-40 år med nydiagnostisert type 1 diabetikere siste to uker Klassisk T1D: Minst ett forhøyet autoantistoff Fastende c-peptid > 0,1 nmol/l Insulindose > 0,1 E/kg/døgn Skriftlig informert samtykke Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Blødningshistorie Trc < 100 x 10 9/l Alkohol eller narkotikamisbruk Resultater Totalt 6 pasienter (tre kvinner, tre menn) ble inkludert i studien Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Kliniske data Pasient Alder Kjønn BMI Uker til biopsi HbA1c% ved biopsi Insulin U/kg/dag Antall positive autoantistoffer HLA risiko alleler* 1 25 ♀ 21,0 4 6,7 0,5 4 Ja 2 24 ♂ 20,9 3 10,3 0,35 3 Ja 3 34 ♀ 23,7 9 7,1 0,17 3 Ja 4 31 ♂ 25,6 5 7,4 0,4 3 Ja 5 24 ♀ 28,6 5 7,4 0,36 3 Ja 6 35 ♂ 26,7 5 7,1 0,52 1 Ja * Nærvær av HLA DR3, HLA DR4 eller begge Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Virusundersøkelser i pankreas, ikke så lett som man kan tro…. Immunhistokjemi: Antistoff mot et enterovirus kapselprotein, VP1 (DAKO, Glostrup, Denmark) Ekspresjon av MHC klasse I, regnes som markør på virus PCR-analyser: RNA hentet fra øyer og exokrint vev i kultur RNA hentet fra 30 mg frossent vev RNA sequencing Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Kontrollgrupper Immunhistokjemi PCR 9 organdonores uten 6 organdonores fra diabetes fra nPODregisteret Alle uten diabetesantistoffer Alder 25 år (18-38) Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Uppsala Alle uten diabetesantistoffer Alder 67 år (55-70) Immunhistokjemi-generelt Baserer seg på at man tilsetter et antistoff til vevet, som fester seg til et kjent antigen (dersom det er der) kalles indirekte immunhistokjemi Det bindes så til et sekundært antistoff, deretter til en polymer som binder et fargestoff Fargestoffet er det vi ser i mikroskopet Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Immunhistokjemi-DiViD Farging med spesifikt antistoff for å påvise enterovirus protein 1 (VP1) Utført i to separate laboratorier Påfølgende snitt fra to forskjellige parafinblokker fra hver av pasientene Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Resultater IHC 6 av 6 pasienter, mot 2 av 9 kontroller, var positive for VP1 i endokrint vev (p<0,01) Et lavt antall øyer og celler er affisert: Totalt 2492 øyer ble identifisert i de 12 snittene 42 øyer (1,7%) med totalt 60 intenst VP1+-celler ble identifisert Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Funn, enterovirusprotein 1 (vp1) Case 1, Uppsala Case 2, Exeter Funn, enterovirusprotein 1 (vp1) Case 3, Exeter Case 3, Tampere Hyperekspresjon klasse I MHC Hyperekspresjon av klasse I MHC i Langerhanske øyer er et klassisk funn ved nyoppdaget T1D Dette er nært korrelert med interferon α, som kan frigjøres fra cellene under en virusinfeksjon Hyperekspresjon av klasse I MHC kan indikere vevsrespons på virusinfeksjon Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Polymerase chain reaction (PCR) En meget følsom metode for å oppdage kjente RNA-sekvenser (arvestoff) fra virus Man trenger en «primer», som man vet reagerer mot det man leter etter Deretter lager man cDNA Dette dobler man, om og om igjen Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 PCR undersøkelser, DiViD Kulturmedium Frossen vevsprøve Øyene ble isolert og 30 mg med hurtig- dyrket i Uppsala RNA ekstrahert fra kulturmediet RNA analysert i: Uppsala Tampere Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 frosset vev Knust og homogenisert RNA ekstrahert Resultater PCR 4 av 6 pasienter (2, 4, 5, 6) var positive for enterovirus RNA i Uppsala og Tampere i medium fra øykultur på dag 1 og/eller dag 3, men ikke på dag 6 Pasient6 var også positiv i frossent vev Ingen av de 6 kontrollene var positive Alle pasientene og kontroller var negative for andre virus (rhino, noro, rota, paercho) i både endokrin og eksokrin kultur Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Resultater PCR Signalet var veldig lavt for alle de positive prøvene, noe som antyder lite virus Fra alle de positive prøvene så ble PCR-produktet sekvensert, og nærvær av «enterovirale sekvenser» ble bekreftet Det betyr: Dette kommer fra enterovirus, men vi kan ikke si sikkert akkurat hvilket virus det er Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Sekvenser av PCR-produkter, Uppsala Case Sequence GTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATTACCCCCTCCCCTAACTGTAACTTAGAAGTAATACACACCGATCAACAGTAAG TGTGGCACGCCAGCCATGCTCCGATCAAGCACTTCTGTTCCCCCGGACCGAGTATCAATAGACTGCCCACGCGGT TGAAGGAGAAAGTGTCCGTTATCCGGCCAACTACTTcGAGAAGCCCAGTAACACCATGGAAGTTGCAGAGTGTT 2 TCGCTCAGCACAACCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACTGCATACCCCACGGGTGACCGTGGCAGTGGCT GCGTTGGCGGCCTGCCTATGGGGAAGCCCATAGGACGCTCTAATACAGACATGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCTA GTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGTGGAGCATACGCCCTCAAGCCAGGGGGCAGTG TGTcGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTAC 4 NNGCCNGTATAGGAATAAATAGAAACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTCNNCNNNNNANTTACCCGTTACGAC ACACCACCCACTGGTTTGTGGGCATGTGCTCCACAGTTAGGATTAGCCGCATTCAGGGNN 5 AANAGTAAAAGAAACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTCCGCTGCNNAGTTACCCATTACGACAGACTGCCCA CTGGCTTGTGGGTNNCTGCTCCGCAGTTAGGATTAN GTGGGCAGTCTGTCGTAATGGGTAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCTTTTACTCTTT 6 TATTGGCTGCTTATGGTGACAATAAAAGAGTAAAAGAAACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTCCGCTGCAGAG TTACCCATTACGACAGACTGCCCACTGGTTTGTGGGTATNTGCTCCGCAGTTAGGATTAGCCGCANTCAGGGNN Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 RNA-sekvensering, Oslo RNA ble isolert fra fryst vev fra pasienter 1-6 og sekvensert på HiSeq 2000 ved Morten Eike Ingen virale sekvenser ble oppdaget ved standard sekvensering Dette illustrerer at det fortsatt er en forskjell i følsomhet mellom PCR og RNA-sekvensering Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Oppsummering virusfunn i pankreas Metode Materiale Laboratorium Case Immunhistokjemi VP1 Pankreasøyer Entero specific RT-PCR Viral RNA Håndplukkede øyer* RNA sequencing Hele pankreas** Hele pankreas** Tampere Exeter Uppsala Tampere Tampere Oslo 1 Positiv Positiv Negativ Negativ Negativ Negativ 2 Positiv Positiv Positiv Positiv Negativ Negativ 3 Positiv Positiv Negativ Negativ Negativ Negativ 4 Positiv Negativ Positiv Positiv Negativ Negativ 5 Positiv Positiv Positiv Positiv Negativ Negativ 6 Positiv Positiv Negativ* Positiv Publisert i Diabetes, 2014 Nov 24 Positiv Negativ * Positiv i RNA fra den eksokrine kulturen, som også inneholder ukjent mengde endokrint vev Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Konklusjoner DiViD er den første studien av pasienter med nyoppdaget T1D som viser mulig tilstedeværelse av enterovirus i bukspyttkjertelen øyene Virus er påvist med flere ulike teknikker Resultatene kan være forenlig med en vedvarende, lavvirulent enterovirusinfeksjon i bukspyttkjertelen hos pasienter med nyoppdaget T1D Denne studien er imidlertid basert på bare 6 pasienter og videre studier er nødvendig for å avklare om virus spiller en primær rolle i patogenesen av T1D Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Hva vet vi og hva vet vi ikke: Vi vet: Vi vet ikke: Det er relativt vanlig Om virus fører til T1D med virus i bukspyttkjertelen hos pasienter med nyoppdaget T1D Det er svært uvanlig med virus i bukspyttkjertelen hos pasienter uten T1D Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015 Om behandling eller forebygging (vaksine) av virusinfeksjon påvirker forløpet av T1D Takk til: Mine veiledere: Knut Dahl-Jørgensen Kristian F. Hanssen Oslo universitetssykehus PEVNET (Persistent Virus Infection in Diabetes Network): Barneklinikken kirurgisk avdeling: Uppsala Terje Rotwelt Anne Amdam Trond Buanes Bjørn Edwin Oskar Skog Gun Frisk Olle Korsgren Trine Roald, Heikki Hyöty Sami Oikarinen Maarit Oikarinen Jutta Laiho Sykepleiere og leger på Noel Morgan Sarah Richardson Pia Leete Johnny Ludvigsson spesialsykepleier Tampere lokalsykehus Exeter Linköping Pasientene som deltok i studien Lars Krogvold, ODF jubileumssymposium, 2015
© Copyright 2024