27.01.2015
1
Kromatografi
2
Samlenavn på en stor gruppe av separasjons‐ og analysemetoder, basert på at stoffene som skal adskilles fordeler seg kontinuerlig mellom en stasjonær og en mobil fase. Separasjon av stoffer i en prøve skyldes forskjeller i stoffenes kjemiske og fysiske egenskaper, og gjør at de holdes mer eller mindre tilbake i stasjonærfasen når prøven transporteres med mobilfasen gjennom stasjonærfasen.
Prøveopparbeidelse
Kromatografiske analyser
Karen Raaen Roland
Bioingeniør
Avdeling for klinisk farmakologi
St. Olavs Hospital
Separasjonsteknikk basert på stoffers ulike fordeling i to separate faser.
3. februar 2015
27.01.2015
27.01.2015
3
Hvorfor opparbeidelse?
Typer ekstrahering/felling
4
Fortynning (urin)
Rense matriks (prøvemateriale)
Oppkonsentrering
(Hydrolyse v/enzym eller syre)
Proteinfelling‐med/uten oppkonsentrering
Fosfolipidfiltrering
Fast‐fase‐ekstraksjon (SPE)
Mer sensitiv instrumentering gir mulighet
til å fortynne prøver uten rensing og
oppkonsentrering (f.eks. på LC-MSMS)
Væske‐væske‐ekstraksjon (LLE)
27.01.2015
27.01.2015
Proteinfelling
Fjerner uønskede forbindelser (makromolekyler) fra plasma, serum eller blod.
Prøven tilsettes et organisk løsningsmiddel, en syre eller et salt.
Proteinene i prøven felles ut, samtidig som analytten frigjøres fra proteinene og forblir i løsningen som skal analyseres.
Kan benyttes for rensing av prøven alene eller som forbehandling før andre ekstraksjonsteknikker (avhengig bl.a av konsentrasjon i prøven).
27.01.2015
5
Proteinfelling
6
Eksempler på fellingsmidler
Acetonitril (ACN)
Metanol
Blanding av metanol og ACN
Etanol
Aceton
ACN tilsatt eddiksyre
TCA
ZnSO4 + ACN
Eks: Etylenglykol i blod (ACN)
27.01.2015
1
27.01.2015
8
7
Felling med acetonitril
Oppsummering proteinfelling
+ISTD
Enkel teknikk
Ikke dyrt utstyr
Ingen oppkonsentrering
Dårlig opprensing
Vanskelig å automatisere
+Acetonitril (kald,
1+1)
Ristes
Fryses Sentrifugeres
Injiseres direkte
eller inndampes
Blod
27.01.2015
9
Prinsipp for SPE
Fast fase ekstraksjon (SPE)
10
Basert på et stoffs (analytt) fordeling mellom en væske og overflaten av et fast materiale (sorbent).
Viktig finne den rette sorbenten
(stasjonærfasen).
Viktig med god affinitet.
27.01.2015
27.01.2015
Oppsummering SPE
12
11
Væske‐væske‐ekstraksjon (LLE)
Bredt utvalg av sorbenter
Bedre selektivitet
Retensjonsmekanismen kan velges
Automatisering mulig (f.eks Tecan)
Resultatene er ikke personavhengige
Kostnader på kolonnger
Flere trinn, må være påpasselig med hastigheten av løsning som suges gjennom.
Viskøse prøver (f.eks RM‐prøver) kan føre til tette kolonner.
27.01.2015
Prøve (urin, serum, blod) + IS
Analytter må over i nøytral form vha buffer
Salt‐tilsetting
Hydrolyse Riktig løsemiddel til analytt
Sur beskyttelse av flyktige analytter (eks.amf)
Oppkonsentrere ved inndamping
Derivatisere
27.01.2015
2
27.01.2015
13
14
Ekstraksjon
Parametere ved ekstraksjon
+ Intern standard
A) Hva er analyttens pKa?
+ Buffer
B) Analyttens molekylstruktur (syre eller base)?
C) Hvilken pH skal bufferen ha?
Rister
prøvene
(og
tilsett
salt)
D) Hydrolyse nødvendig?
E) Hva er analyttens logP (polaritet)?
Tilsett
løsemiddel og
ristes 10
minutter
Avpipporg fase
F) Hvilket løsningsmiddel skal brukes i ekstraksjonen?
1 ml
blod/serum/
urin
G) Analyttens flyktighet?
27.01.2015
27.01.2015
15
16
Ekstraksjon Sur
beskyttelses
løsning
Fordeler/ulemper ved LLE
oppkonsentrering
Inndamping
av organisk
fase
40°C
Løsemiddel kan ikke være
blandbart med vann
Enkel teknikk
Rimelige reagenser
Kan oppnå høy recovery
Høy oppkonsentrering
Rent ekstrakt
Inndamping/
Stort forbruk av løsemidler
Vanskelig å automatisere
Manuell opparbeiding
Opparbeidelse tar lang tid
Oveføring
til vial
27.01.2015
27.01.2015
17
Hva velges, SPE eller LLE?
SPE
LLE
Løsemiddel kan være
blandbart med vann
Løsemiddel kan ikke være
blandbart med vann
Kan automatiseres
Vanskelig å automatisere
Kan bruke mindre løsemiddel
Bruker mye løsemiddel
Ekstraherer amfolytter (har
både sur og basisk gruppe)
Ekstraherer dårlig amfolytter
Omstendelig prosedyre uten
automatisering
Litt enklere prosedyre?
Dyre kolonner
Rimelige reagenser
27.01.2015
18
Takk for oppmerksomheten!
Håper dere får et flott kurs

27.01.2015
3