Prøveopparbeidelse Hva skjer med prøven under de ulike
27.01.2015 1 Kromatografi 2 Samlenavn på en stor gruppe av separasjons‐ og analysemetoder, basert på at stoffene som skal adskilles fordeler seg kontinuerlig mellom en stasjonær og en mobil fase. Separasjon av stoffer i en prøve skyldes forskjeller i stoffenes kjemiske og fysiske egenskaper, og gjør at de holdes mer eller mindre tilbake i stasjonærfasen når prøven transporteres med mobilfasen gjennom stasjonærfasen. Prøveopparbeidelse Kromatografiske analyser Karen Raaen Roland Bioingeniør Avdeling for klinisk farmakologi St. Olavs Hospital Separasjonsteknikk basert på stoffers ulike fordeling i to separate faser. 3. februar 2015 27.01.2015 27.01.2015 3 Hvorfor opparbeidelse? Typer ekstrahering/felling 4 Fortynning (urin) Rense matriks (prøvemateriale) Oppkonsentrering (Hydrolyse v/enzym eller syre) Proteinfelling‐med/uten oppkonsentrering Fosfolipidfiltrering Fast‐fase‐ekstraksjon (SPE) Mer sensitiv instrumentering gir mulighet til å fortynne prøver uten rensing og oppkonsentrering (f.eks. på LC-MSMS) Væske‐væske‐ekstraksjon (LLE) 27.01.2015 27.01.2015 Proteinfelling Fjerner uønskede forbindelser (makromolekyler) fra plasma, serum eller blod. Prøven tilsettes et organisk løsningsmiddel, en syre eller et salt. Proteinene i prøven felles ut, samtidig som analytten frigjøres fra proteinene og forblir i løsningen som skal analyseres. Kan benyttes for rensing av prøven alene eller som forbehandling før andre ekstraksjonsteknikker (avhengig bl.a av konsentrasjon i prøven). 27.01.2015 5 Proteinfelling 6 Eksempler på fellingsmidler Acetonitril (ACN) Metanol Blanding av metanol og ACN Etanol Aceton ACN tilsatt eddiksyre TCA ZnSO4 + ACN Eks: Etylenglykol i blod (ACN) 27.01.2015 1 27.01.2015 8 7 Felling med acetonitril Oppsummering proteinfelling +ISTD Enkel teknikk Ikke dyrt utstyr Ingen oppkonsentrering Dårlig opprensing Vanskelig å automatisere +Acetonitril (kald, 1+1) Ristes Fryses Sentrifugeres Injiseres direkte eller inndampes Blod 27.01.2015 9 Prinsipp for SPE Fast fase ekstraksjon (SPE) 10 Basert på et stoffs (analytt) fordeling mellom en væske og overflaten av et fast materiale (sorbent). Viktig finne den rette sorbenten (stasjonærfasen). Viktig med god affinitet. 27.01.2015 27.01.2015 Oppsummering SPE 12 11 Væske‐væske‐ekstraksjon (LLE) Bredt utvalg av sorbenter Bedre selektivitet Retensjonsmekanismen kan velges Automatisering mulig (f.eks Tecan) Resultatene er ikke personavhengige Kostnader på kolonnger Flere trinn, må være påpasselig med hastigheten av løsning som suges gjennom. Viskøse prøver (f.eks RM‐prøver) kan føre til tette kolonner. 27.01.2015 Prøve (urin, serum, blod) + IS Analytter må over i nøytral form vha buffer Salt‐tilsetting Hydrolyse Riktig løsemiddel til analytt Sur beskyttelse av flyktige analytter (eks.amf) Oppkonsentrere ved inndamping Derivatisere 27.01.2015 2 27.01.2015 13 14 Ekstraksjon Parametere ved ekstraksjon + Intern standard A) Hva er analyttens pKa? + Buffer B) Analyttens molekylstruktur (syre eller base)? C) Hvilken pH skal bufferen ha? Rister prøvene (og tilsett salt) D) Hydrolyse nødvendig? E) Hva er analyttens logP (polaritet)? Tilsett løsemiddel og ristes 10 minutter Avpipporg fase F) Hvilket løsningsmiddel skal brukes i ekstraksjonen? 1 ml blod/serum/ urin G) Analyttens flyktighet? 27.01.2015 27.01.2015 15 16 Ekstraksjon Sur beskyttelses løsning Fordeler/ulemper ved LLE oppkonsentrering Inndamping av organisk fase 40°C Løsemiddel kan ikke være blandbart med vann Enkel teknikk Rimelige reagenser Kan oppnå høy recovery Høy oppkonsentrering Rent ekstrakt Inndamping/ Stort forbruk av løsemidler Vanskelig å automatisere Manuell opparbeiding Opparbeidelse tar lang tid Oveføring til vial 27.01.2015 27.01.2015 17 Hva velges, SPE eller LLE? SPE LLE Løsemiddel kan være blandbart med vann Løsemiddel kan ikke være blandbart med vann Kan automatiseres Vanskelig å automatisere Kan bruke mindre løsemiddel Bruker mye løsemiddel Ekstraherer amfolytter (har både sur og basisk gruppe) Ekstraherer dårlig amfolytter Omstendelig prosedyre uten automatisering Litt enklere prosedyre? Dyre kolonner Rimelige reagenser 27.01.2015 18 Takk for oppmerksomheten! Håper dere får et flott kurs 27.01.2015 3
© Copyright 2024