1. No category

03.02.2015
Kromatografisk separasjon og
deteksjon
Takk til
• Professor Leon Reubsaet, Farmasøytisk
Institutt
Elisabeth og Åse Marit Leere Øiestad,
Avdeling for rusmiddelforskning og metodeutvikling, Folkehelseinstituttet
Disposisjon
•
•
•
•
Innledning - historikk
Kromatografiske parametere
Analytters egenskaper
Kromatografi – definisjoner
Kromatografi
• Kromatografi = ”fargeskriving” (Tsvet 1903)
– chroma - farge
– grafi – skrive
– Separerte klorofyll og karotenoider
• Samlenavn på separasjonsmetoder
– Typer kromatografi
– prinsipper vs. teknikker
• Deteksjon
Hvorfor separere stoffer?
• Prøvene er komplekse blandinger
– interessert i å analysere noen få stoffer i blandingen
• Kvalitetskontroll
– råvarer
• forurensninger
– preparater
• produktkontroll, holdbarhetskontroll (spaltningsprodukter)
Hvordan separere stoffer?
• La stoffblandingen vandre en viss lengde.
– hvis stoffene vandrer med forskjellig hastighet vil
de kunne separeres
• hvis forskjell i vandringshastighet er stor nok
• hvis veien stoffene vandrer er lang nok
start
mål
• Sporanalyse
– stoffer i biologisk materiale
• fullblod, plasma, urin, spytt, vev, matvarer etc.
“Løypa” stoffene vandrer gjennom kalles en kolonne
1
03.02.2015
Separasjonsprinsipper
• I kromatografi tvinges stoffene gjennom løypa
(kolonnen) med en væske eller gass som presses
gjennom med konstant hastighet
– væsken eller gassen kalles mobil fase
Separasjonsprinsipper
• I kromatografi gjelder det å velge riktige
betingelser som sikrer at stoffene vandrer
gjennom løypa med tilstrekkelig forskjell i
hastighet og samtidig separeres på kortest mulig
tid
• Kolonnen / stasjonærfasen holder stoffene
tilbake - retensjon
– stoffene kan separeres hvis retensjonen er
forskjellig
Retensjon
Kromatografisk separasjon
Cs
1. Stoffene beveger seg med forskjellig hastighet
2. Stoffene spres i lengderetningen når de vandrer
K=
Cm
Fordelingskoeffisienten
bestemmer hvor mye av
stoffet som vil oppholde seg
i stasjonær fase (BESTEMMER
RETENSJONEN)
Båndspredning
Cs
K=
Cm
a. Stoffet oppholder seg bare i mobil fase og retarderes ikke
av stasjonær fase
b. Stoffet oppholder seg i svært stor grad i stasjonær fase og
vandrer svært langsomt - kraftig retensjon
• Får alltid
båndspredning
fordi molekyler
av samme type
har forskjellig
(gjennomsnitts)
hastighet
• Skyldes fysiske
prosesser
2
03.02.2015
Van Deemter
Figur fra Waters
1.7 μm
partikler
5 μm partikel
• Høyere optimal flowhastighet for små partikler enn
store.
60 μm menneskehår
• Høyere flow gir smalere og høyere topper.
Kromatogram
Resultatet av en kromatografisk separasjon
Kromatografiske parametre
• Retensjonsfaktor
– retensjonstid
– retensjonsvolum
• Teoretiske plater
– høydeekvivalenten til en teoretisk plate
1. Retensjonstiden tR karakteriserer retensjonen interaksjonen med stasjonær fase (brukes til identifikasjon)
2. Bredden av toppene tW (ved grunnlinjen) karakteriserer
båndspredningen
3. t0 er tiden et ikke retardert stoff bruker gjennom kolonnen
• Oppløsningsevne
Retensjonsfaktor
Teoretiske plater
eksempel
eksempel
w41/2
k = (tr-t0)/t0
k1?
t0=1.25
1
= 0,44 min
3
28,212
N  16

 0,77 
N?
k1 = (8,944-1,25)
1,25
k1 = 6,16
2
 2
N  16 t r 
w b 

4
5
t0=1.25
1
2
3

4
N  21475
5
3
03.02.2015
Oppløsningsevne

)
1
k
Hva er Rs mellom topp 4 og 5?
Rs  4,2
(
w4b = 0,77 min
w5b = 0,86 min
Effekt av selektivitet, effektivitet og retensjon
t5  t4
4
5
2 (w b  w b )
31,62  28,21
Rs  1
2 (0,77  0,86)
Rs 
2
 4
3
5
Rs = 1/4 (  - 1)
1
N

t0=1.25
1 + k
eksempel
Analytten
Analytten
• Flyktighet, størrelse, stabilitet
• Lipofilisitet = fettløselighet
• Egenskaper av betydning for deteksjon
• Hydrofilisitet = vannløselighet
• UV-absorbans
• Polare funksjonelle grupper - lokalisert eller
spredt ut over molekylet?
• Fluorescens
• Størrelsen på upolar del av molekylet
• Bestemte grunnstoffer (nitrogen, fosfor, halogener)
• Oksiderbarhet
• Konsentrasjon
• Sure og basiske grupper – pKa-verdier
Eksempel: Ladningen av morfin ved
forskjellige pH-verdier
• Vanlige komponenter som må vurderes
Morfin: pKa1= 8.0 pKa2 =9.9
Ladet
Ladet
+
CH3
CH3
OH
O
+
N
NH
OH
OH
O
pH = 8
50% av molekylene er ladet på
aminet
CH3
OH
O
OH
pH ~ 6
99% av
molekylene er
ladet på aminet
50% er uladet på aminet
~99% er uladet på oksygenene
CH3
100% er uladet på
oksygenene
CH3
N
NH
OH
Matriks
-O
Ladet
O
N
OH
OH
O
–
–
–
–
–
Proteiner
Fett
Salter
Endogene forbindelser
Andre stoffer/metabolitter
OH
pH = 10
99% av molekylene er uladet på aminet
~50% er ladet på det ene oksygenet
~50% er uladet på oksygenene
Figur lånt av Thomas Berg, FHI
• Hvordan foreligger analytten
– Grad av proteinbinding
– Konjugert
• Er det forbindelser som kan interferere eller
ødelegge for analysen?
4
03.02.2015
Prinsipper
Uegnet prøve
• Flere grunner til at en prøve kan være uegnet
NB! Prinsipp er ikke det samme som teknikk (metode)
• Prinsipper (type stasjonærfase i kolonnen)
– Adsorpsjon
– Fordeling/faste kjemisk bundne stasjonærfaser
– Ionebytte
– Eksklusjon (gel)
– Ikke egnet for prøveopparbeidelsesmetoden
– Ikke egnet for analyseinstrumentet
– Inneholder andre stoffer som gir falske negative
eller positive utslag
• En prøve kan derfor godt være uegnet for f.eks
en GC-analyse, men OK for en HPLC-analyse
• Stasjonærfasen i kolonnen holder stoffene tilbake retensjon
– Stoffene tvinges i gjennom kolonnen med en væske
eller gass som presses gjennom med konstant
hastighet (gassen/væsken kalles mobilfasen)
Kromatografi
Teknikker
• Gasskromatografi (GC)
Stasjonærfase
– Mobilfasen er en gass
Prøve (a,b,c)
• Væskekromatografi (UHPLC/HPLC el LC)
– Mobilfasen er en væske
– Kolonne
Mobilfase
• preparativ eller analytisk
– Tynnsjikt (TLC)
• Superkritisk fluid kromatografi
– Mobilfasen er et superkritisk fluid (vanligvis
superkritisk CO2)
•
Separasjon av en blanding av stoffer (a,b,c) fås hvis
stoffene har forskjellig interaksjon med
stasjonærfasen (og evt. mobilfasen)
Fordelingskromatografi
• Basert på fordeling av et stoff mellom to ikke blandbare
væsker. Den ene væsken er adsorbert til en bæresubstans
• Den bundne, adsorberte væsken kalles den stasjonære
fase og den andre væsken den mobile fase
Gasskromatografi
• Detektorer
– Flammeionisasjonsdetektor
– Nitrogen-fosfor detektor
– MS
• Gasskromatografi
– den stasjonære fase er impregnert som en tynn film på
en bæresubstans eller på veggen av en kapillærkolonne
Vanligvis helium
5
03.02.2015
Fordelingskromatografi (GC)
• I GC er stasjonærfasen vanligvis silikoner evt
silikonoljer eller -gummier
• Disse har god termisk stabilitet, og variasjon av
kjedegrupper gir ulik grad av polaritet.
• Upolar stasjonærfase
Fordelingskromatografi (GC)
• Polar stasjonærfase
– separasjon etter polaritet (interaksjon) og kokepunkt
(dvs. kan separere forbindelser med samme kokepunkt,
men forskjellige funksjonelle grupper)
• Temperaturgradient
– separasjon etter kokepunkt (flyktighet)
Fordelingskromatografi
• HPLC (faste kjemisk bundne stasjonærfaser)
– den stasjonære fase er vanligvis kjemisk bundet til
overflaten av en bæresubstans (silika eller polymer)
Separasjonsprinsipper i LC
• Omvendt fase
– Stasjonærfasen er upolar og mobilfasen er polare
væsker slik som metanol, acetonitril eller vann.
– Vanlige stasjonærfaser: C18, C8
Væskekromatografi (LC)
• Detektorer
– UV
– Fluorescence
– Elektrokjemisk
– MS
I omvendt fase kromatografi retarderes
stoffene ved hydrofob interaksjon
O Si
Si
O H3 C
Si O Si CH3
O H3C
Si
Si
O
H3CO
HCH3
C
COOH
– Mer upolare forbindelser har større retensjon i
systemet.
– Aller mest brukte system innen LC per i dag!
Hydrofob interaksjon – van der Waalske krefter
Interaksjon mellom hydrokarbonkjedene på C18
og den hydrofobe delen av naproxen
6
03.02.2015
Separasjonsprinsipper i LC
Separasjonsprinsipper i LC
• Normalfase
• HILIC
– Stasjonærfasen er sterkt polar og mobilfasen er
hovedsakelig upolar (slik som heksan).
– Stasjonærfasen er polar og
mobilfasen er upolar
(“normalfasesystem”)
– Mobilfasen inneholder vann
– Alternativ til omvendt fase
kromatografi for polare
forbindelser
– Fordeling mellom mobilfasen
og vannlag utenpå
Begynner å få stor utbredelse.
stasjonærfasen
Isokratisk eluering vs. gradient eluering
• Isokratisk eluering: mobilfasens sammensetning
endrer seg ikke under analysen.
H2O2 = hydrogenperoksid
• Gradienteluering: mobilfasens sammensetning
endrer seg under analysen.
– Brukes når stoffene har stor forskjell i hydrofobisitet
– Topper som eluerer sent blir smalere
– Sparer tid!
39
Gradienteluering
Retensjonsrekkefølge RP C18
90
% organic modifier
% organic modifier
• Ulike muligheter for programmering av gradienten
80
convex
70
60
50
90
block
• Forgrenet før rettkjedet
60
50
linear
40
concave
• Lenger hydrofob kjedelengde gir lengre
retensjonstid
80
70
combined
40
30
30
20
20
10
10
2
4
6
8
10
12
Time (min)
• Minst hydrofob kommer først ut
• Umettet før mettet
• Ionisert form før
ikke-ionisert
2
4
6
8
10
12
Time (min)
7
03.02.2015
Retensjonen påvirkes av:
Retensjonen påvirkes av:
• Mobilfasens sammensetning
• Stasjonær fase
– Økende innhold av organisk modifikator (ACN, MeOH) gir
mindre retensjon
– Omvendt fase materialer med lange hydrokarbonkjeder
som C18 gir større retensjon enn materialer med kortere
hydrokarbonkjeder
– Materialer med polare overflatergrupper gir mindre
retensjon
– Forskjellige typer C18 materialer kan gi forskjellig retensjon
• pH
– Syrer blir minst retardert ved høy pH
– Baser blir minst retardert ved lav pH
• Tilsetning av salter
– Salter kan minske løseligheten i mobil fase
– Ionepardannere øker stoffets lipofile karakter
– Tilsetningsstoffer som adsorberes til kolonnen (eks.
aminer) gir mindre retensjon samt bedre symmetri og
mindre båndspredning ved analyse av baser
• Temperatur
– Økende temperatur gir mindre retensjon
– Ofte ca. 35 grader HPLC, 65 grader UPLC
GC vs LC
Detektorer
• En detektor skal gi en respons dvs. et elektrisk signal
for de stoffer en ønsker å identifisere/kvantifisere
• Forskjell i kolonnelengde betyr at man kan få bedre
separasjon på en GC-kolonne enn en LC-kolonne
– GC 10 – 30 m
– LC 2 – 30 cm
• Responsen skal være proporsjonal med
–konsentrasjon av stoff i mobilfasen
• I HPLC kan vi i større grad variere mobilfasen og
stasjonærfasen – flere muligheter
–mengde (massen) av stoff i mobilfasen
slik at det kan utføres kvantitative analyser basert
på måling av topphøyder/arealer
• Forskjellige krav til flyktighet, løselighet osv.
– GC – må ofte derivatisere
– Større og mer polare molekyler -> LC
Flammeionisasjonsdetektor (FID)
• Vanlig GC-detektor
• Organiske forbindelse med CH-bindinger forbrennes i en
luft/hydrogenflamme og
danner ioner (CO, CO2
detekteres ikke)
• Ioner samles opp ved anoden
under påvirkning av en
polariserende spenning (-200
V)
• Dette gir opphav til en målbar
strøm på 10-6 – 10-12 A
Flammeionisasjonsdetektor (FID)
Collector
Signal
probe
Flame tip
• Generell detektor som registrer de aller fleste
stoffer som inneholder karbon
• Stabil og reproduserbar
• Stort lineært område
• Lett å bruke
Signal
probe
Air
Figur fra Perkin Elmer
Column Hydrogen
8
03.02.2015
UV detektoren
• Vanlig LC-detektor
• Svært mange legemidler absorberer UV lys
• UV detektoren er derfor den mest anvendte
detektor i farmasøytisk analyse
• Filterfotometer
• Spektrofotometer
Flow cell
Diffraction grating
Mirror
Mirror
D2 lamp
Slit
Mirror
– f. eks. diodearraydetektoren gir stoffenes UV
spektra
Flowcellevolum: klassisk vs. nano LC
lys
fotodetektor
Massespektrometer som detektor
• Mye benyttet som detektor til GC og LC
• Generell og spesifikk detektor
• «Gullstandard» innen dopinganalyse og
rettstoksikologisk analyse
lysvei: 1cm
volum: 10 µl
Flow: 1 mL/min tid til å fylle detektor: < 1 sec.
5 µL/min tid til å fylle detektor: 2 min.!!!!
Flowcellen må tilpasses flow!
Mobil fase
Massespektrometre
• Nødvendige egenskaper:
- Analytt må kunne komme i gassfasen
- Analytt må kunne ioniseres
• Til sammenligning:
– UV: analytt må absorbere lys (kromofor)
– fluorescens: analytt må fluorescere
– elektrokjemisk: analytt må ha red/ox egenskaper
Prinsipp for MS
• Danner og analyserer ioner
– stoffet ioniseres og spaltes (fragmenterer)
• Måler masse over ladning, m/z
• Analyserer i vakuum (gassfase)
• Destruktiv teknikk
9
03.02.2015
Konsekvenser av disse prinsippene
• Hvis man ikke får dannet ioner kan man ikke se
noe til stoffet!
• Må ha vakuum, ellers blir ionene borte ved
kollisjoner med luft
Gode MS-betingelser = godt vakuum
Hva med mobilfasen??
• GC: mobilfasen er en gass, og er derfor
kompatibel med MS’en.
• LC: mobilfasen er en væske - kan ikke føres
direkte inn i vakuum (0,1 mL/min væske  ca.
100 mL/min gass!!)
• Når molekylene blir til ioner ”går de i stykker”
slik at man ikke kan måle en gang til på det
samme prøvematerialet
Elektronionisering, EI
EI
• Molekyler i gassfase kommer inn ionekilden fra
en GC eller fordampes i ionekilden ved hjelp av
oppvarming
• Ved et lavt trykk skytes det på molekylene med
en elektronstråle med en energi på 70 eV.
Elektronstrålen kommer fra et filament.
• Molekylene ioniseres til M+.som så går i stykker i
mindre biter = fragmenter
Ionisering ved atmosfærisk
trykk (API-teknikker)
Elektrosprayionisering, ESI
• Løsning på mobilfaseproblemet  ionisering ved
atmosfærisk trykk før vakuum-delen av MS’en
• Sprayer væske med analytten i ut av et
kapillærrør
• Deretter ledes ionene inn i MS’en og inn i stadig
bedre vakuum (flere steg med pumping).
• Har på en høy spenning som gjør at det dannes
ladde dråper
• Flere typer API-teknikker:
• Fordamper løsningsmiddelet fra dråpene og får
ioner. Store molekyler kan få mange ladninger.
– ESI – electrospray ionisation
– APCI – atmospheric pressure chemical ionisation
– APPI - atmospheric pressure photoionisation
• Myk teknikk = mindre fragmenter
10
03.02.2015
Kvadrupol masseanalysator
• Brukes både til GC-MS og LC-MS
– Har en enkel oppbygning og er enkle i bruk
– Dekker et bra masseområde
– Har god linearitet for kvantitativt bruk
– Bra oppløsning og kvalitet på massespektrene
– Er relativt rimelige og tar liten plass
– Er lite følsomme for forurensninger
– Skanner veldig hurtig (bra i SIM-modus)
03.02.2015
61
Hva ser vi i MS’en ?
Kvadrupol masseanalysator
resonant ion
EI
non-resonant ion
_
Detector
+
_
.
• Molekylioner  [M]+
Stable
(resonant) ion
CI, ESI
[M+H]+/[M-H]-
.
+
• Fragmentioner [M]+ [M+H]+/[M-H]- - X1
Prefilter
Ion
Source
Quadrupole Mass
Filter
Postfilter
... - Xn
- X2
• Addukter  [M+ NH4]+ (M+18)
DC and AC
Voltages
hovedsakelig
for LC-MS
[M+ Na]+ (M+23)
[M+ K]+
(M+39)
[M+ CH3CN + H]+ (M+42)
Rejected ions
“Trippelkvadrupol”-instrumenter
MS1
Kollisjonscelle
MS2
• I et «trippelkvadrupol» eller tandem
massespektrometer er MS1 og MS2
masseanalysatorer som filtrerer ioner
• Kollisjonscellen er fylt med argon, og et
potensiale settes på for å fragmentere ionene.
Opptak av MS-spektra – scan vs.
SIM/MRM
• Scan sveiper over et valgt masseområde og
detekterer alle masser
– Gir mye informasjon
– Kan plukke ut interessante masser i ettertid
– Biblioteksøk – ”fingeravtrykk”
• SIM (=single ion monitoring)/MRM (=multiple
reaction monitoring) detekterer en valgt masse eller
overgang
– gir mye lavere deteksjonsgrense
– NB! Får bare det man ser etter
11
03.02.2015
• Fullt scan (eksempel GC-MS – bibl. søk)
Eksempel - godt molekylion og tydelige fragmenter
215-0029 STD 3
8918_A_ny_5
100
4: SIR of 4 Channels ES+
285.1
2.12e6
Height
8.51
2105697
BBT095D
8663_A_16
100
• Diazepam har en RT på 8,51 min
Eksempel på bruk av
fragment til avkrefting av
identitet:
%
• Molekylmasse (molekylion)
er 285,1 (M+H)+
0
8918_A_ny_5
100
• Fragmentionet har
– riktig retensjonstid
– riktig masse (193,1)
– riktig størrelse i forhold
til molekylionet
(høyde 285/193 = 2,8)
4: SIR of 4 Channels ES+
193.1
7.65e5
Height
8.51
747879
%
2: SIR of 4 Channels ES+
316.1
2.65e4
Height
4.54
22489
SIM
%
Er dette klonazepam?
0
8663_A_16
100
Riktig molekylmasse,
men ikke noe fragment
dvs. negativ
2: SIR of 4 Channels ES+
302.1
4.75
2.80e3
101
Height
%
0
Time
3.50
0
4.00
4.50
5.00
Time
8.20
8.40
8.60
8.80
9.00
Sammenlikning av SIM og MRM
MixIso_1G14_022
100
Ionekromatogram av m/z=255
MixIso_1G14_023
100
SIR of 1 Channel ES+
TIC
5.95e6
1.31
60 ng/mL Ketoprofen
60 ng/mL Fenbufen
Fenbufen
SIR of 1 Channel ES+
TIC
6.03e6
1.31
SIM av
m/z= 255
%
O
%
O
0
0.80
OH
Ketoprofen
Ketoprofen
0
0.80
O
0.90
1.00
1.10
1.20
1.30
1.40
1.50
1.60
Time
1.70
O
OH
0.90
1.00
1.10
1.20
1.30
1.40
60 ng/mL Ketoprofen
6 ng/mL Fenbufen
MixIso_1G14_024
100
1.31
60 ng/mL Ketoprofen
6 ng/mL Fenbufen
1.31
MRM av
m/z= 255 > 209
Ketoprofen
0
MixIso_1G14_024
100
%
Ketoprofen
1.00
1.10
Time
1.70
SIR of 1 Channel ES+
TIC
6.03e6
Begge har MW på 254
0.90
1.60
MRM of 2 Channels ES+
255.25 > 209.2
1.43e6
%
MixIso_1G14_023
100
0
0.80
1.50
Fenbufen
Fenbufen ??
1.20
71 1.40
1.30
1.50
1.60
Time
1.70
%
0
0.80
1.42
MRM of 2 Channels ES+
255.25 > 237.2
8.06e4
MRM av
m/z= 255 > 237
0.90
1.00
1.10
1.20
Fenbufen
1.30
72
1.40
1.50
1.60
Time
1.70
12
03.02.2015
Spørsmål ?
13