Hvorfor velge kromatografi som metodikk Ingeborg Amundsen
Hva bør man tenke på ved valg av kromatografi som analysemetodikk Ingeborg Amundsen 4. februar 2015 Agenda • • • • • Kromatografiske metoder Ny analysemetode- viktige spørsmål Screening/bekreftelse Ny analysemetode-hvor starter vi Metodevalidering Kromatografi- en svært anvendelig analyse metodikk • • • • • • Miljøgifter (mat og luft) Oljer, gasser og aromastoffer Proteiner og aminosyrer Gener Vitaminer og hormoner Legemidler og narkotiske stoffer Kromatografiske metoder • Kromatografisk separasjon – Gasskromatografi – Væskekromatografi • Spesifikk detektor – Massespektrometri Prinsipp for Kromatografi (separasjon av stoffer) Kromatografi; Eksempel: Væskeromatografi (LC) Separerer stoffer fra hverandre ved at de vandrer med forskjellig hastighet i et system med en mobil- og en stasjonær fase Mobil fase: Væske (ofte blanding av flere) Stasjonær fase: Kolonne pakket med små partikler <2µm Opprenset prøve injiseres med sprøyte i systemet og føres med væskestrømmen gjennom kolonna Kolonne (5-10 cm) A Buffer B Organisk løsningsmiddel (metanol) Ectasy Amfetamin Morfin Prinsipp for Massespektrometri (MS) • Danner og analyserer ioner • Stoffet ioniseres og spaltes (fragmenterer) • Analyserer i vakuum (gassfase) • Måler masse over ladning, m/z Svært spesifikk teknikk Vi veier ioner! Derav navnet massespektrometri Ny analysemetode – Viktige spørsmål • Hvor mange komponenter skal være med i metoden • Kvalitativ/kvantitativ • Hva skal prøveresultatene brukes til • Hvor mange prøver skal analyseres • Hva slags prøvemateriale • Hvor mye prøvemateriale Viktige spørsmål forts. • • • • Skal metoden brukes til rutinedrift Skal metoden publiseres Hva er publisert tidligere Analyttenes egenskaper: pKa verdi, polaritet, LogP verdi • Tilgjengelige instrumenter • Høydoserte/lavdoserte stoffer Hva er viktigst • • • • • • • • Lav deteksjonsgrense Pålitelige resultater God separasjon Rene prøveekstrakter Rask kromatografi Lite løsemiddelforbruk Lite forbruk av matriks Ergonomi IS-13 • Prøveresultatet benyttes kun til behandling og diagnostikk • Medisinske analyser • Analysen trenger ikke å være spesifikk • En screeninganalyse – Positiv prøve – 1 metode og 1 uttak Screening metode • Positive/negative prøver • Prøveopparbeidelse som tar høyde for at alle komponenter ekstraheres • UPLC-MS/MS: Benytter 1 MRM overgang for stoffene • Mest fokus rund påvisningsgrensen IS-14 • Prøveresultatet kan danne grunnlag for alvorlige sanksjoner • Rettstoksikologiske analyser • Et positivt resultat skal alltid bekreftes med nytt uttak fra prøven med en spesifikk teknikk – Positiv prøve – 2 metoder og 2 uttak pos Mottak Registrering Screening negativ Ikke påvist pos Bekreftelse negativ Ikke påvist Vurdering påvist stoff(er) Bekreftelsesmetode • Ønsker metoder for komponenter med noenlunde samme kjemiske egenskaper • Spesifikk prøveopparbeidelse • Separasjonsprinsippet i UPLC forskjellig fra screeningen • 2 MRM overganger • Konsentrasjonsområde for komponentene Eksempler på komponenter som kan ekstraheres sammen Mianserin pKa 8,3 MW 264,16 C18H20N2 Mirtazapin pKa 7,1 MW 265,16 C17H19N3 Nortriptylin pKa 9,9 MW 263,17 C19H21N Paroxetin pKa 9,9 MW 329,14 C19H20FNO3 Trimipramin pKa 9,8 MW 294,21 C20H26N2 Sertralin pKa 9,48 MW 305,07 C17H17Cl2N Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS • Finne MRM-overganger til komponentene NH Mianserin m/z 265 m/z 208 NH N Mirtazapin m/z 266 m/z 195 Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS • Finne MRM-overganger til komponentene • Finne aktuelle internstandarder Intern standard • Et kjemisk stoff som tilsettes i en konstant mengde til prøver, de blanke kontroller og kalibreringsstandarder • Korrigerer for tap av analytt under prøveopparbeidelse • Korrigerer for matrikseffekter • Gjerne deuteriummerket analytt Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS • Finne MRM-overganger til komponentene • Finne aktuelle internstandarder • Teste ulike kolonner og mobilfaser TIC for BEH Fenyl kolonne med mobilfase bestående av 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 8 og MeOH TIC for BEH C18 kolonne med mobilfase bestående av 5 mM ammoniumacetatbuffer pH 5 og ACN TIC for BEH C18 kolonne med mobilfase bestående av 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,2 og MeOH TIC for BEH C18 kolonne med mobilfase bestående av 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,2 og ACN Sammenligning av retensjonsrekkefølge med ulike separasjonssystemer Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS • • • • Finne MRM-overganger til komponentene Finne aktuelle internstandarder Teste ulike kolonner og mobilfaser. Prøveopparbeidelse Prøveopparbeidelse “Opparbeidelses teknikk avhenger mye av matriks” BLOD (utfordring: fosfolipider, ioneundertrykkelse) - SPE, LLE, ACN-felling + fosfolipid-removal kolonne (96 format) URIN (utfordring: salter, overdrag, ioneundertrykkelse) - SPE, LLE, Fortynning (96 format), Fortynning + filtrering (96 format) SPYTT (utfordring: prøvetakingsbuffer + diverse tilsetningstoffer, overdrag, ioneundertrykkelse) - LLE LLE = væske-væske ekstraksjon, SPE = fast fase ekstraksjon Sammenligning av EtG respons i blod med ulike filtreringsplater og utfellingsreagenser 25000 20000 18000 20000 16000 14000 15000 12000 10000 10000 8000 6000 5000 4000 2000 0 ACN (EtG) 0 ACN:MeOH(85:15) (EtG) Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS • • • • • Finne MRM-overganger til komponentene Finne aktuelle internstandarder Teste ulike kolonner og mobilfaser. Prøveopparbeidelse Validering av metoden! Metodevalidering • Robusthetstesting og retensjonstids stabilitet 2,6 2,4 2,2 9-OH Risperidon 2 Risperidon 1,8 Propranolol 1,6 Klozapin 1,4 Hydroxyzin Aripiprazol 1,2 1 pH 10 ionestyrke 2,5 mM pH 10,4 ionestyrke 2,5 mM pH 10 ionestyrke 7,5 mM pH 10,4 ionestyrke 7,5 mM pH 10,2 ionestyrke 5,0 mM Metodevalidering • Standardkurve, lineært konsentrasjonsområde Klonazepam Diazepam Metodevalidering • Matrikseffekter: Forhold i prøven som gjør at MS-responsen for en spesiell analytt forandres fordi en matriks er tilstede • Exogene stoffer(andre legemidler/narkotika) • Endogene stoffer (proteiner, lipider, karbohydrater og salter) • MS-responsen kan forsterkes eller undertrykkes Ioneundertrykking 0,211 0,266 0,369 Fosfolipider • Felling kontra LLE 98 % MeOH 90 % MeOH Fosfolipid bakgrunn v/ PPT Fosfolipid bakgrunn v/ LLE 5 % MeOH Fosfolipider- ulike fosfolipidfjerningsplater Metodevalidering • • • • MDK= minste detekterbare konsentrasjon MKK= minste kvantifiserbare konsentrasjon Metodens presisjon og nøyaktighet Metodens reproduserbarhet og nøyaktighet Metodevalidering • Spesifisitet: Metodens evne til å bestemme analytten nøyaktig i nærvær av andre komponenter i prøven • Prøveopparbeidelsen, kromatografisk separasjon og valg av detektor har betydning for metodens spesifisitet God Spesifisitet N CH3 Morfin C17H19NO3 MV= 285,34 HO O OH N CH3 Hydromorfon C17H19NO3 MV= 285,34 HO O O NH Norkodein C17H19NO3 MV= 285,34 H3C O O OH UPLC MS/MS 100 N CH3 201 % Morfin 165 155 HO O OH 145 121 107 0 100 183 173 181 185 209 157 193 219 123 120 131 141 161 140 160 229 211 268 227 237 239 180 200 220 269 255 240 m/z 260 185 100 N CH3 Hydromorfon 227 % 157 199 211 229 183 HO O O 100 100 0 100 123 128 129 145 120 140 243 171 153 165 187 201 161 160 180 225 200 240 220 240 255 258 268 271 m/z 260 268 Norkodein % NH 121 165 181 215 193 137 H3C O O OH 105 118 0 100 120 153 155 175 187 225 209 207 219 132 141 140 160 180 200 236 243 253 226 220 257 240 260 269 m/z Metodevalidering • Ekstraksjonsutbytte: Hvor mye av analytten går over fra matriks til organisk løsningsmiddel under ekstraksjonen Metodevalidering • Holdbarhet: • Standard- og kontroll-løsningene • Stoffene i matriks før ekstraksjon • Ekstrakter etter ekstraksjon Metodevalidering • Sammenligne resultater • Screening/bekreftelse • Gammel bekreftelse/ny bekreftelse Ulik reløsning-ulik respons 1) 10% ACN og 90% 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,2 2) 30% ACN og 70% 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,2 3) 25% ACN og 75% 5 mM ammoniumacatatbuffer pH 5. Sammenligning ny og gammel metode (EtG) «Krav» til positiv prøve • Over påvisningsgrensen (cut-off) • Riktig retensjonstid/relativ retensjonstid • OK internstandard (høyde, retensjonstid) • Krav til ioneratio (MS) Kromatografiske metoder Ulemper: • Vi finner kun de stoffene som er inkludert i metoden (MRM-metoder) • Til dels arbeidskrevende og dyr instrumentering Fordeler: • Sikrere identifikasjon siden denne gjøres på stoffnivå med krav til retensjonstid, ioneratio og intern standard • Kvantitativ, kan si noe om påvirkning • Kan raskt ta inn nye stoffer i metoden Analytiske utfordringer • Nye stoffer – mangler renstoff • Lave konsentrasjoner • Veldig like stoffer – Tilstrekkelig separasjon – Isobare stoffer JWH-073, MW 327,42 JWH-015, MW 327,42 Oppsummering • Kromatografiske metoder – Sikker identifikasjon av stoff – Kvantitativ – Ser kun etter de stoff som er lagt inn i metoden • Metodevalidering – Grundig, for å vite at du har en robust analysemetode som du kjenner svakhetene til!
© Copyright 2024