1. No category

(12) Oversettelse av
(11) NO/EP 2300046 B1
europeisk patentskrift
(19)
NORGE
NO
(51) Int Cl.
A61M 5/172 (2006.01)
A61K 38/28 (2006.01)
A61K 38/47 (2006.01)
A61P 3/10 (2006.01)
A61P 5/50 (2006.01)
Patentstyret
(21)
Oversettelse publisert
2015.05.18
(80)
Dato for Den Europeiske
Patentmyndighets
publisering av det meddelte
patentet
2014.12.24
(86)
Europeisk søknadsnr
09739183.3
(86)
Europeisk innleveringsdag
2009.04.28
(87)
Den europeiske søknadens
Publiseringsdato
2011.03.30
(30)
Prioritet
2008.04.28, US, 125835 P
2008.05.09, US, 127044 P
(84)
Utpekte stater
AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR
HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL
PT RO SE SI SK TR
Utpekte samarbeidende
stater
AL BA RS
(73)
Innehaver
Halozyme, Inc., 11388 Sorrento Valley Road, San Diego, CA 92121, US-USA
(72)
Oppfinner
FROST, Gregory, I., 13662 Mercado Drive, Del MarCA 92014, US-USA
BILINSKY, Igor, 104 Hawort St., San DiegoCA 92122, US-USA
VAUGHN, Daniel, 2230 14th St., EncinitasCA 92024, US-USA
SUGARMAN, Barry, 7328 Celata Lane, San DiegoCA 92129, US-USA
(74)
Fullmektig
Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 0104 OSLO, Norge
(54)
Benevnelse
(56)
Anførte
publikasjoner
Superhurtigvirkende insulinanaloger
EP-A- 1 048 264
WO-A-2008/016729
WO-A-2009/047766
CA-A1- 1 243 948
BONITO A: "Effect of hyaluronidase administration on glycemic curves due to insulin in normal
and diabetic subjects" MINERVA MEDICA, EDIZIONI MINERVA MEDICA, TORINO, IT, vol. 45,
no. 31, 18 April 1954 (1954-04-18), pages 1068-1073, XP009124588 ISSN: 0026-4806
JOST F: "Zur Insulinempfindlichkeit der Schizophrenen, Insulineinsparung durch Hyaluronidase
= Insulin sensitivity in schizophrenia; insulin economy with hyaluronidase" WIENER KLINISCHE
WOCHENSCHRIFT, NEW YORK, NY, US, vol. 70, no. 36, 5 September 1958 (1958-09-05),
pages 657-661, XP009124581 ISSN: 0043-5325
HOLDEN J C ET AL: "Use of hyaluronidase in insulin coma therapy" BRITISH MEDICAL
JOURNAL, LONDON, GB, vol. 2, no. 5036, 13 July 1957 (1957-07-13), pages 85-86,
XP009124578 ISSN: 0267-0623
RIET CORREA P ET AL: "Potentialization of the action of insulin by hyaluronidase" ANNALES
D'ENDOCRINOLOGIE, MASSON, PARIS, FR, vol. 23, 1 January 1962 (1962-01-01), pages 2328, XP009124583 ISSN: 0003-4266
VOYER V ET AL: "Insulin therapy with alidase in multiple injections: Sacerodoti-Yagdjoglou
method" UNION MEDICALE DU CANADA, MONTREAL, CA, vol. 86, no. 8, 1 August 1957
(1957-08-01), pages 861-865, XP009124580 ISSN: 0041-6959
KEUP W: "Amorphes Insulin und Hyaluronidase in der Insulinbehandlung der Psychosen //
Amorphous insulin & hyaluronidase in insulin treatment of psychoses" SCHWEIZERISCHE
MEDIZINISCHE WOCHENSCHRIFT, SCHWABE, BASEL, CH, vol. 87, no. 35-36, 31 August
1957 (1957-08-31), pages 1128-1131, XP009124579 ISSN: 0036-7672
BOOKBINDER ET AL: "A recombinant human enzyme for enhanced interstitial transport of
therapeutics" JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol.
114, no. 2, 28 August 2006 (2006-08-28), pages 230-241, XP005625403 ISSN: 0168-3659
HALLER M F: "Converting intravenous dosing to subcutaneous dosing: With recombinant human
hyaluronidase" PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY, ADVANSTAR COMMUNICATIONS,INC,
US, vol. 31, no. 12, 1 December 2007 (2007-12-01), page 118,120,122,124,126,128,130,132,
XP009122858 ISSN: 1543-2521
PIRRELLO ROSENE D ET AL: "Initial experiences with subcutaneous recombinant human
hyaluronidase" JOURNAL OF PALLIATIVE MEDICINE, MARY ANN LIEBERT, US, vol. 10, no.
4, 1 August 2007 (2007-08-01), pages 861-864, XP009124656 ISSN: 1096-6218
HELLER ET AL: "Insulin's 85th anniversary-An enduring medical miracle" DIABETES
RESEARCH AND CLINICAL PRACTICE, AMSTERDAM, NL, vol. 78, no. 2, 26 September 2007
(2007-09-26), pages 149-158, XP022272030 ISSN: 0168-8227
DATABASE IMSDRUGNEWS [Online] 2008, ANONYMOUS: "rHuPH20 Halozyme phase
change II USA (diabetes)" XP002552071 retrieved from STN Database accession no. 2008:5917
& R & D FOCUS DRUG NEWS, 10 November 2008 (2008-11-10),
DATABASE ADISCTI [Online] 9 October 2008 (2008-10-09), YOCUM R C ET AL:
"Pharmacokientics and glucodynamics of an insulin analog injected with recombinant human
hyaluronidase: fast-acting insulin analog made faster. ADIS TITLE: Insulin lispro +/hyaluronidase: pharmacokinetics In volunteers" XP002552072 retrieved from STN Database
accession no. 2008:35541 & 68TH ANNUAL SCIENTIFIC SESSIONS OF THE AMERICAN
DIABETES ASSOCIATION LATE BREAKERS, MEETING INFO: ANNUAL SCIENTIFIC
SESSIONS OF THE AMERICAN DIABETES ASSOCIATION (68TH ) SAN FRANCISCO, CA,
USA), June 2008 (2008-06),
VAUGHN DANIEL E ET AL: "Accelerated pharmacokinetics and glucodynamics of prandial
insulins injected with recombinant human hyaluronidase." DIABETES TECHNOLOGY &
THERAPEUTICS JUN 2009, vol. 11, no. 6, June 2009 (2009-06), pages 345-352, XP002552070
ISSN: 1520-9156
1
Område for oppfinnelsen
Det er tilveiebrakt kombinasjoner, kombinasjoner og sett inneholdende en
hurtigvirkende insulinsammensetning og en hyaluronandegraderende
enzymsammensetning formulert for parenteral administrering. Slike produkter kan bli
5
anvendt i metoder for behandling av insulinbehandlbare sykdommer eller tilstander.
Også tilveiebrakt er metoder for administrering av insulin og et
hyaluronandegraderende enzym.
Bakgrunn
10
Diabetes resulterer i kronisk hyperglykemi grunnet den manglende evnen som
bukspyttkjertelen har til å produsere tilstrekkelige mengder av insulin, eller grunnet
den manglende evnen som cellene har til å syntetisere og frigjøre insulin tilstrekkelig.
Hyperglykemi kan også oppleves ved kritiske syke pasienter, som resulterer i forøket
dødelighet og morbiditet. Insulin er blitt administrert som et terapeutisk middel for å
15
behandle pasienter som har diabetes, inkludert, f.eks. type 1 diabetes, type 2
diabetes, og gestationell diabetes, for å etterlikne den endogene insulinresponsen som
oppstår hos normale individer. Insulin er også blitt administrert til kritisk syke
pasienter med hyperglykemi, for å kontrollere nivåer av blodglukose.
20
Typisk blir hurtigvirkende insuliner administrert til slike individer i respons til
hyperglykemi, eller ved forventning av hyperglykemi, så som etter inntak av et måltid,
som kan resultere i glykemisk kontroll. Derimot har for tiden hurtigvirkende former av
insuliner en forsinkelse i absorpsjon og virkning, og tilnærmer seg derfor ikke den
hurtige endogene insulinvirkningen. Følgelig virker slike formuleringer ikke hurtig nok
25
til å stoppe hepatisk glukoseproduksjon som oppstår kort etter denne første fasen av
insulinfrigjøring. Grunnet forsinkelse i den farmakologiske virkningen, bør
hurtigvirkende insulinprepareringer bli administrert før måltider, for å oppnå den
ønskede glykemiske kontrollen. Videre fører dosene som må bli administrert til en
utvidet virkningsvarighet som bidrar til hypoglykemi, og i mange tilfeller fedme. Det er
30
derfor et behov for alternative insulinsammensetninger, som mer effektivt etterlikner
den endogene insulinresponsen når administrert til et individ, som fører til mer
effektiv glykemisk kontroll, og en reduksjon i de negative bivirkningene av
insulinterapi, så som vektøkning.
35
Bonito, A. ((1954) “Effect of hyaluronidase administration on glycemic curves due to
insulin in normal and diabetic subjects.” Minerva Medica, Edizioni Minerva Medica,
45(31): 1068-1073) beskriver subkutan injeksjon av nativt ikke-humant insulin, og
2
okse (“bull”) testikkel hyaluronidaseprepareringer til normale og diabetiske pasienter.
Det er vist at hyaluronidase øker absorpsjonsraten av insulin, og forlenger
tidseffekten.
5
Riet Correra et al. ((1962) “Potentialization of the action of insulin by hyaluronidase.”
Annales d’Endocrinologie 23:23-28) beskriver intravenøs administrering av regulært
insulin (ekstrahert fra dyrevev) og hyaluronidase og dets effect på blodglukosenivåer
hos hunder, og konkluderer med at kombinasjonen av hyaluronidase med insulin øker
den hyperglykemiske virkningen av insulin.
10
Oppsummering
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en superhurtigvirkende insulinsammensetning,
omfattende:
en terapeutisk effektiv konsentrasjon av en hurtigvirkende insulinanalog for
15
opprettholdelse av normale blodglukosenivåer, hvor:
den hurtigvirkende insulinanalogen er insulinglulisin eller insulinaspart;
blodglukosenivåene er pradialblodglukosenivåer; og
en konsentrasjon av et hyaluronandegraderende enzym tilstrekkelig for å gi
sammensetningen en superhurtigvirkende insulinsammensetning ved administrering,
20
hvori
den superhurtigvirkende insulinsammensetningen har en begynnende virkning
som nært etterlikner den endogene postprandial insulinfrigjøringen til et ikke-diabetisk
individ; og
den superhurtigvirkende insulinsammensetningen blir formulert for en
25
administrasjonsvei valgt blant subkutan, intramuskulær, intradermal og
intraperitoneal administrering.
Det er tilveiebrakt superhurtigvirkende insulinsammensetninger som kan virke mer
hurtig og/eller øke den systemiske eksponeringen i løpet av en forutvalgt tidsperiode
30
sammenliknet med hurtigvirkende sammensetninger. Det er følgelig tilveiebrakt
superhurtigvirkende insulinsammensetninger. Sammensetningene inneholder en
terapeutisk effektiv mengde av et hurtigvirkende insulin, og en mengde av et
hyaluronandegraderende enzym for å gjøre sammensetningen superhurtigvirkende.
Sammensetningene blir formulert for parenteral administrering, så som subkutan,
35
intradermal, eller intramuskulær administrering. Insulindoseringen (mengde
administrert) kan bli bestemt ved mengden som er tilstrekkelig for å oppnå glykemisk
kontroll, som kan bli bestemt empirisk, så som ved glukoseeksponering. Typisk er et
3
mål for behandlingen å administrere den lavest mulige mengden av insulin for å oppnå
glykemisk kontroll, og redusere antallet hyperglykemiske og/eller hypoglykemiske
hendelser. De lavere dosene av insulin anvendt i de superhurtigvirkende
insulinsammensetningene kan redusere risikoen for vektøkning og fedme hos
5
diabetiske individer. Sammensetningene kan bli tilveiebrakt i en hvilken som helst
egnet beholder eller bærer, så som i et sterilt medisinglass, sprøyte, ampulle,
insulinpenn, insulinpumpe, eller i et lukket løkkesystemreservoar.
Det er beskrevet heri superhurtigvirkende insulinsammensetninger inneholdende en
10
terapeutisk effektiv mengde av et hurtigvirkende insulin for å kontrollere
blodglukosenivåene, og en mengde av et hyaluronandegraderende enzym tilstrekkelig
for å gjøre sammensetningen til en superhurtigvirkende insulinsammensetning. Også
beskrevet er metoder for danne superhurtigvirkende insulinsammensetninger, så som
hvilke som helst superhurtigvirkende insulinsammensetninger beskrevet heri, ved å
15
velge et hurtigvirkende insulin, og kombinering derav med en tilstrekkelig mengde av
hyaluronandegraderende enzym for å gjøre sammensetningen til en
superhurtigvirkende insulinsammensetning. Noen eksempler av sammensetningene og
metoder for å danne sammensetningene er den terapeutisk effektive mengden av det
hurtigvirkende insulinet fra omtrent 10 U/mL, til eller til omtrent 500 U/mL insulin, og
20
den tilstrekkelige mengden av et hyaluronandegraderende enzym for å gjøre
sammensetningen til en superhurtigvirkende insulinsammensetning er funksjonelt
ekvivalent med minst eller omtrent 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6
U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL eller 25 U
hyaluronidaseaktivitet/mL. I noen eksempler er den tilstrekkelige mengden av et
25
hyaloronandegraderende enzym for å gjøre sammensetningen til en
superhurtigvirkende insulinsammensetning funksjonelt ekvivalent med minst eller
omtrent 30 eller 35 enheter hyaloronidaseaktivitet/mL. For eksempel kan mengden av
hurtigvirkende insulin i sammensetningene være eller være omtrent 10 U/mL, 20
U/mL, 30 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100
30
U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/mL
eller 500 U/mL, og mengden av hyaloronandegraderende enzym i sammensetningene
kan være funksjonelt ekvivalent med eller til omtrent 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4
U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL, 25
U/mL, 30 U/mL, 35 U/mL, 37,5 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80
35
U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL,
700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/mL, 2000 U/mL, 3000 U/mL, eller 5000
U/mL. Volumet av sammensetningen kan f.eks. være i eller omtrent 1 mL, 3 mL, 5
4
mL, 10 mL, 20 mL eller 50 mL. I noen eksempler blir sammensetningen formulert for
levering ved et lukket løkkesystem (“closed loop system”), en insulinpenn eller en
insulinpumpe, og kan bli formulert for enkeltdoseadministrering eller
multippeldoseadministrering.
5
Den terapeutisk effektive mengden av det hurtigvirkende insulinet kan være mindre
enn den terapeutisk effektive mengden av det hurtigvirkende insulinet som er
nødvendig for å oppnå den samme terapeutiske effekten i fravær av det
hyaluronandegraderende enzymet. Mengden av hyaluronandegraderende enzym er
10
tilstrekkelig for å oppnå en systemisk eksponering for insulin, som er minst eller
omtrent 30 % høyere over de første 3, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 eller 60
minuttene etter parenteral administrering, enn den systemiske eksponeringen over
samme tidsperiode etter parenteral administrering av det samme hurtigvirkende
insulinet uten et hyaluronandegraderende enzym, og/eller er tilstrekkelig for å oppnå
15
systemisk glukosemetabolisme (noen ganger referert til heri som glukosefjerning),
som er minst eller omtrent 30 % høyere over de første 30, 45, 60, 90, 120 eller 180
minuttene etter administrering enn den systemiske glukosemetabolismen over den
samme perioden etter parenteral administrering av det samme hurtigvirkende
insulinet, uten et hyaluronandegraderende enzym. I alle sammensetningene gitt heri,
20
og metoder tilveiebrakt heri, kan mengden av hver komponent variere avhengig av
individet hvortil sammensetningene blir administrert og/eller det bestemte
hurtigvirkende insulinet (eller blandinger derav) som er tilveiebrakt. Om nødvendig
kan mengdene bli bestemt empirisk.
25
Det er beskrevet insulinsammensetninger som inneholder en terapeutisk effektiv
mengde av et hurtigvirkende insulin og en mengde av et hyaluronandegraderende
enzym. Mengden av hyaluronandegraderende enzym er tilstrekkelig for å oppnå en
systemisk eksponering for insulin som er minst eller omtrent 30 % høyere over de
første 30 til 40 minuttene etter administrering enn den systemiske eksponeringen over
30
samme periode etter parenteral administrering av det samme hurtigvirkende insulinet
i fravær av hyaluronandegraderende enzym.
Mengden av hyaluronandegraderende enzym kan være tilstrekkelig, slik at den
resulterende superhurtigvirkende insulinsammensetningen resulterer i en
35
blodglukosenivåøkning etter de første 30, 45, 60, 90, 120 eller 180 minuttene etter
parenteral administrering som er minst eller omtrent 20 % til 30 % lavere enn
økningen i blodglukosenivåene over den samme tidsperioden etter parenteral
5
administrering av det samme hurtigvirkende insulinet, uten et
hyaluronandegraderende enzym. Økningen i blodglukosenivået kan være minst eller
omtrent 30 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 75 % eller 80 %
mindre enn økningen i blodglukosenivået etter parenteral administrering av det
5
hurtigvirkende insulinet uten et hyaluronandegraderende enzym.
Også beskrevet er superhurtigvirkende insulinsammensetninger som inneholder en
terapeutisk effektiv mengde av et hurtigvirkende insulin, og en mengde av
hyaluronandegraderende enzym som er tilstrekkelig for å oppnå systemisk
10
glukosemetabolisme som er minst eller omtrent 30 % høyere enn den systemiske
glukosefjerningen (dvs. metabolisme) over de første 60 minuttene etter parenteral
administrering av det samme hurtigvirkende insulinet uten et
hyaluronandegraderende enzym.
15
I de superhurtigvirkende insulinsammensetningene tilveiebrakt heri, er eksempler på
mengder av insulin (dvs. mengden som sammensetningen tilveiebringer for en enkelt
dosering) er på eller omtrent 0,05 enheter, 0,06 enheter, 0,07 enheter, 0,08 enheter,
0,09 enheter, 0,1 enheter, 0,2 enheter, 0,3 enheter, 0,4 enheter, 0,5 enheter, 0,5
enheter, 0,6 enheter, 0,7 enheter, 0,8 enheter, 0,9 enheter, 1 enhet, 2 enheter, 5
20
enheter, 10 enheter, 15 enheter, 20 enheter, 25 enheter, 30 enheter, 35 enheter, 40
enheter eller 50 enheter. Eksempler på mengder av hyaluronandegraderende enzym
inkluderer en mengde som er funksjonelt ekvivalent med eller er omtrent 0,3 enheter,
0,5 enheter, 1 enhet, 3 enheter, 5 enheter, 10 enheter, 20 enheter, 30 enheter, 40
enheter, 50 enheter, 100 enheter, 150 enheter, 200 enheter, 250 enheter, 300
25
enheter, 350 enheter, 400 enheter, 450 enheter, 500 enheter, 600 enheter, 700
enheter, 800 enheter, 900 enheter, 1000 enheter, 2000 enheter, 3000 enheter, 4000
enheter, eller mer hyaluronidaseaktivitet.
De superhurtigvirkende insulinsammensetningene beskrevet heri kan oppnå prandial
30
(f.eks. 0-4 timer etter administrering) systemisk eksponering for insulin som er minst
eller omtrent 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100
%, 120 %, 140 %, 160 %, 180 %, 200 %, 300 % eller 400 % høyere enn den
systemiske eksponeringen etter parenteral administrering av insulin, i fravær av
hyaluronandegraderende enzym. De superhurtigvirkende insulinsammensetningene
35
beskrevet heri, kan oppnå systemisk glukosemetabolisme (dvs. en kvantifikasjon av
fjerningen av glukose fra blod uttrykt enten som en rate (mengde/tid) eller den totale
mengden i løpet av en forutbestemt tidsperiode) som er minst eller omtrent 30 %, 40
6
%, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100%, 120 %, 140 %, 160 %, 180 %, 200 %,
250 %, 300 %, 350 % eller 400 % høyere enn metabolismen av blodglukose etter
parenteral administrering av insulin, uten et hyaluronandegraderende enzym.
5
De superhurtigvirkende insulinsammensetningene tilveiebrakt heri, inkluderer
eventuelt et gelateringsmiddel, så som, men ikke begrenset til,
etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) eller etylendiamintetraacetat. Gelateringsmidlet
kan bli tilveiebrakt som et kompleks med et metall ved eller omtrent ekvimolare
konsentrasjoner derav, så som gelateringsmiddelkomplekset kalsium EDTA.
10
Konsentrasjonen av kalsium EDTA er, eller er omtrent, 0,02 mM, 0,04 mM, 0,06 mM,
0,08 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9
mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, eller 20 mM.
De superhurtigvirkende insulinsammensetningene heri inkluderer generelt sink.
15
Konsentrasjonen av sink er typisk, eller er omtrent, 0,02 milligram pr. 100 enheter
insulin (mg/100 U), 0,005 mg/100 U, 0,01 mg/100 U, 0,012 mg/100 U, 0,014 mg/100
U, 0,016 mg/100 U, 0,017 mg/100 U, 0,018 mg/100 U, 0,02 mg/100 U, 0,022
mg/100 U, 0,024 mg/100 U, 0,026 mg/100 U, 0,028 mg/100 U, 0,03 mg/100 U, 0,04
mg/100 U, 0,05 mg/100 U, 0,06 mg/100 U, 0,07 mg/100 U, 0,08 mg/100 U, eller 0,1
20
mg/100 U. Generelt blir hurtigvirkende insuliner formulert med sink; mengden
anvendt heri kan være en mengde som beholder den samme konsentrasjonen av sink
når kombinert med det hyaluronandegenererende enzymet. Eksempler på
sammensetninger kan inneholde kalsium EDTA og sink i molare forhold på eller
omtrent 0,5:1, 1:1, 1,5:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1,
25
90:1, 100:1, 300:1 eller 1000:1, så som omtrent eller 0,010-0,50 mg sink, så som
0,017 mg sink pr. 100 U humant insulin, og 0,1 til 50 mM kalsium EDTA. Andre
eksempler på superhurtigvirkende insulinsammensetninger inneholder sink i et molart
forhold på omtrent 1:3 til det hurtigvirkende insulinet og kalsium EDTA, ved et molart
forhold på omtrent 1:3 til 10:1 til det hurtigvirkende insulinet.
30
Superhurtigvirkende insulinsammensetninger inkluderer også eventuelt et
tonisitetsmodifiserende middel, så som, men ikke begrenset til, en aminosyre,
polyalkohol, så som glyserol, og/eller et salt, så som natriumklorid. Osmolariteten av
sammensetningen kan være, eller er omtrent 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240
35
mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340
mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, eller 400 mOsm/kg. pH er egnet for
parenteral administrering, så som omtrent 5,5 til 8,5, spesielt 6 til 8, så som omtrent,
7
eller 6, 6,2, 6,4, 6,6 6,8, 7, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 eller 8. Sammensetningene kan
eventuelt inkludere et stabiliseringsmiddel for hurtigvirkende insulin, et
stabiliseringsmiddel for hyaluronandegraderende enzym, eller begge. Stabilisatorer
inkluderer, men er ikke begrenset til, en detergent, en polyalkohol, et metallsalt, et
5
kooppløsningsmiddel og/eller et protein. Eksempler på slike stabiliseringsmidler er
serumalbumin og/eller polysorbat, i en konsentrasjon som er tilstrekkelig for å oppnå
høyere stabilitet av sammensetningen og/eller en komponent. Serumalbumin kan bli
inkludert i en konsentrasjon på eller omtrent 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4
mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, eller 1 mg/mL.
10
Polysorbat kan f.eks. bli inkludert, i en konsentrasjon på eller omtrent 0,001 %, 0,002
%, 0,003 %, 0,004 %, 0,005 %, 0,006 %, 0,007 %, 0,008 %, 0,009 %, 0,01 %, 0,02
%, 0,03 %, 0,04 %, 0,05 %, 0,06 %, 0,07 %, 0,08 %, 0,09 %, eller 0,1 %. Andre
valgfrie ingredienser inkludere, f.eks. et oksygenoppfangingsmiddel, så som
askorbinsyre, askorbat, sitronsyre, sitrat, metionin, som kan være en konsentrasjon
15
på 1 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM, 10 mM, eller 20 mM, og/eller albumin og/eller et
konserveringsmiddel, så som en forbindelse som inneholder en aromatisk ring, f.eks.
m-kresol eller fenol.
Det hurtigvirkende insulinet kan f.eks. være monomert eller multimert, så som
20
dimerisk eller heksamerisk. Insulinet er en insulinanalog. Eksempler på insulinanaloger
er en insulinanalog valgt blant et insulin med A-kjede inneholdende, eller som har en
sekvens av aminosyrer angitt i SEKV. ID nr. 103, og en B-kjede inneholdende, eller
som har en sekvens av aminosyrer angitt i hvilke som helst av SEKV. ID nr. 147-149.
I noen eksempelvise superhurtigvirkende insulinsammensetninger er det
25
hurtigvirkende insulinet et hurtigvirkende humant insulin. Videre kan de
superhurtigvirkende insulinsammensetningene inneholde blandinger av insuliner.
Blandingene kan være hurtigvirkende insuliner, eller blandinger av et hurtigvirkende
insulin og også et sakterevirkende insulin(er), så som et basalvirkende insulin.
30
Hyaluronandegraderende enzymer innbefattet i sammensetningene tilveiebrakt heri,
inkluderer f.eks., hyaluronidaser, så som dyr, inkludert human, hyaluronidaser,
spesielt oppløselige former derav. Eksempler på hyaluronandegraderende enzymer er
hyaluronidase, spesielt oppløselige hyaluronidaser, så som et PH20, eller en trunkert
form derav. PH20 kan f.eks. være en ovin, bovin eller trunkert human PH20. Inkludert
35
er de som inneholder, eller som har en sekvens av aminosyrer angitt i hvilke som
helst av SEKV. ID nr. 1-39 og 67-96, og trunkerte former derav, eller allele varianter,
spesiesvarianter eller andre varianter derav. Trunkert humant PH20, spesielt
8
oppløselige trunkerte former, inkluderer hvilke som helst fra blant polypeptider som
har en sekvens av aminosyrer angitt i hvilke som helst av SEKV. ID nr. 4-9, eller
allele varianter og andre varianter derav. Varianter av hyaluronidaser har typisk minst
40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95
5
%, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, eller høyere sekvensidentitet med hvilke som helst av
SEKV. ID nr. 1-39 og 67-96, spesielt med oppløselige former, og beholder
hyaluronidaseaktivitet. Den oppløselige hyaluronidasen kan være sammensetningen
som er rHuPH20.
10
Hyaluronandegraderende enzym kan være en kondroitinase, så som, men ikke
begrenset til, kondroitin ABC lyase, kondroitin AC lyase, og kondroitin C lyase.
Eksempler på kondroitinaser har eller inneholder en sekvens av aminosyrer angitt i
hvilke som helst av SEKV. ID nr. 98-100, eller trunkerte former derav, eller allele
varianter, spesiesvarianter, eller andre varianter derav. Varianter har typisk minst 40
15
%, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %,
96 %, 97 %, 98 %, 99%,, eller høyere sekvensidentitet med et polypeptid angitt i
hvilke som helst av SEKV. ID nr. 98-100 eller med villtype kondroitinase.
Superhurtigvirkende insulinsammensetninger tilveiebrakt heri kan bli formulert for
20
multippel doseringsadministrering, eller for enkeltdoseadministrering. Eksempler på
terapeutisk effektive mengder av insulin avhenger av insulinet i sammensetningen, og
avhenger av hvem som mottar sammensetningen. Slike enkeltdoseringsmengder
inkluderer, f.eks., på eller omtrent 0,05 enheter, 0,06 enheter, 0,07 enheter, 0,08
enheter, 0,09 enheter, 0,1 enheter, 0,2 enheter, 0,3 enheter, 0,4 enheter, 0,5
25
enheter, 0,6 enheter, 0,7 enheter, 0,8 enheter, 0,9 enheter, 1 enhet, 2 enheter, 5
enheter, 10 enheter, 15 enheter, 20 enheter, 25 enheter, 30 enheter, 35 enheter, 40
enheter, 50 enheter, eller 100 enheter. I slike sammensetninger kan mengden av
hyaluronandegraderende enzym være eller funksjonelt ekvivalent med på eller
omtrent 0,3 enheter, 0,5 enheter, 1 enhet, 2 enheter, 3 enheter, 4 enheter, 5
30
enheter, 10 enheter, 20 enheter, 30 enheter, 40 enheter, 50 enheter, 100 enheter,
150 enheter, 200 enheter, 250 enheter, 300 enheter, 350 enheter, 400 enheter, 450
enheter, 500 enheter, 600 enheter, 700 enheter, 800 enheter, 900 enheter, eller 1000
enheter av hyaluronidaseaktivitet.
35
De superhurtigvirkende insulinsammensetningene kan bli formulert for levering med
en pumpe. Tilveiebrakt er lukket løkkesystemer for kontrollering av blodglukosenivåer.
Systemene er hvilke som helst kjent for fagfolk innenfor dette området, men
9
modifisert ved å inneholde det hurtigvirkende insulinet eller hyoluronandegraderende
enzym som beskrevet heri, og egnet dosering eller programmering for å levere de
terapeutiske doseringene av hurtigvirkende insulin, og et hyaluronandegraderende
enzym fr å produsere en superhurtigvirkende insulinsammensetning. Lukket
5
løkkesystemer kan inkludere et reservoar inneholdende et hurtigvirkende insulin og et
hyaluronandegraderende enzym, hvor det hyaluronandegraderende enzymet er
tilstede i en mengde tilstrekkelig for å gjøre den resulterende kombinasjonen til en
superhurtigvirkende insulinsammensetning. I en annen utførelsesform er et lukket
løkkesystem for kontrollering av blodglukosenivåer tilveiebrakt, som inneholder et
10
reservoar inneholdende et hurtigvirkende insulin, og et andre reservoar inneholdende
et hyaluronandegraderende enzym.
Lukket løkkesystemer kan eventuelt inkludere én eller flere av en glukosesensor, et
leveringssystem for å levere det hyaluronandegraderende enzymet, og et
15
hurtigvirkende insulin, og programvare programmert for å integrere pumpingen og
registreringen av funksjoner, hvorved hyaluronandegraderende enzym og
hurtigvirkende insulin blir levert for å oppnå glykemisk kontroll, som etterlikner den
glykemiske kontrollen i et ikke-diabetisk individ. De lukket løkkesystemene kan også
inneholde i et separat reservoar, eller blandet med hurtigvirkende insulin og/eller
20
hyaluronan, et sakterevirkende, så som et basal, insulin. Systemet kan også
inkludere hvilke som helst av de eventuelle ingrediensene angitt ovenfor. Det
hurtigvirkende insulinet og hyaluronandegraderende enzymet kan inkludere hvilke
som helst av de som er beskrevet ovenfor.
25
I det lukket løkkesystemet kan reservoaret inneholdende det hurtigvirkende insulinet
inneholde et tilstrekkelig antall enheter for å opprettholde glykemisk kontroll i minst
halvparten av en dag, én dag, eller mer, og kan inneholde på eller omtrent 0,1
enheter, 0,2 enheter, 0,3 enheter, 0,4 enheter, 0,5 enheter, 0,6 enheter, 0,7 enheter,
0,8 enheter, 0,9 enheter, 1 enhet, 2 enheter, 5 enheter, 10 enheter, 15 enheter, 20
30
enheter, 25 enheter, 30 enheter, 35 enheter, 40 enheter, 50 enheter, 100
enheter,200 enheter, 300 enheter, 400 enheter, 500 enheter, 600 enheter, 700
enheter, 800 enheter, 900 enheter, 1000 enheter, 2000 enheter, 5000 enheter, 6000
enheter, 7000 enheter, eller mer insulin. Det lukket løkkesystemet kan levere en
hvilken som helst ønsket mengde eller dosedeler av insulin og/eller
35
hyaluronandegraderende enzym, så som på eller omtrent 0,05 enheter, 0,2 enheter,
0,3 enheter, 0,4 enheter, 0,5 enheter, 0,6 enheter, 0,7 enheter, 0,8 enheter,, 0,9
enheter,, 1 enhet, 2 enheter, 5 enheter, 10 enheter, 15 enheter, 20 enheter, 25
10
enheter, 30 enheter, 35 enheter, 40 enheter, 50 enheter, eller mer insulin pr. del.
Reservoaret inneholdende det hyaluronandegraderende enzymet kan inneholde en
mengde av hyaluronandegraderende enzym som er funksjonelt ekvivalent på eller
omtrent 1 enhet, 5 enheter, 10 enheter, 20 enheter, 30 enheter, 40 enheter, 50
5
enheter, 100 enheter, 150 enheter, 200 enheter, 250 enheter, 300 enheter, 350
enheter, 400 enheter, 450 enheter, 500 enheter, 600 enheter, 700 enheter, 800
enheter, 900 enheter, 1000 enheter, 2000 enheter, 3000 enheter, 4000 enheter, 5000
enheter, 6000 enheter, 7000 enheter, 8000 enheter, 9000 enheter, 10000 enheter,
20000 enheter, eller mer hyaluronidaseaktivitet, og kan levere det
10
hyaluronandegraderende enzymet i de individuelle doseinkrementer av en mengde av
hyaluronandegraderende enzym, som er funksjonelt ekvivalent med eller omtrent
f.eks. 0,3 enheter, 0,5 enheter, 1 enhet, 2 enheter, 3 enheter, 5 enheter, 10 enheter,
20 enheter, 30 enheter, 40 enheter, 50 enheter, 100 enheter, 150 enheter, eller mer
hyaluronidaseaktivitet.
15
Som beskrevet er kombinasjoner inneholdende en første sammensetning
inneholdende fra eller fra omtrent 10 U til omtrent 500 U insulin, og en andre
sammensetning inneholdende tilstrekkelig mengde av hyaluronandegraderende enzym
som, når administrert med insulinet, gir det hurtigvirkende insulinet et
20
superhurtigvirkende insulin. Den tilstrekkelige mengden av hyaluronandegraderende
enzym er funksjonelt ekvivalent med minst eller omtrent 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4
U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL, eller
25 U/mL hyaluronidaseaktivitet/mL. I noen eksempler er den tilstrekkelige mengden
av hyaluronandegraderende enzym funksjonelt ekvivalent med minst eller omtrent 35
25
U hyaluronidaseaktivitet/mL. For eksempel kan mengden av hyaluronandegraderende
enzym i den andre sammensetningen være funksjonelt ekvivalent med, eller til
omtrent 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL,
10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35 U/mL, 37,5 U/mL, 40 U/mL, 50
U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400
30
U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/mL, 2000
U/mL, 3000 U/mL, eller 5000 U/mL. I noen eksempler er mengden av hurtigvirkende
insulin i den første sammensetningen, eller er omtrent 10 U/mL, 20 U/mL, 30 U/mL,
40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200
U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/mL, eller 500 U/mL.
35
Også beskrevet er kombinasjoner av en første sammensetning inneholdende et
hyaluronandegraderende enzym, og en andre sammensetning inneholdende et
11
hurtigvirkende insulin. Sammensetningene blir formulert for parenteral administrering.
I noen tilfeller er mengden av hyaluronandegraderende enzym tilstrekkelig dersom
den er blandet med den andre sammensetningen for å gjøre den resulterende
sammensetningen til en superhurtigvirkende insulinsammensetning. I andre tilfeller er
5
mengden av hyaluronandegraderende enzym tilstrekkelig om administrert før
administreringen av den første sammensetningen, for å gjøre den hurtigvirkende
insulinsammensetningen til en superhurtigvirkende insulinsammensetning.
I sammensetningene beskrevet heri er de hurtigvirkende insulinene og
10
hyaluronandegraderende enzymene og andre komponentene som beskrevet ovenfor
for sammensetningene. Sett inneholdende kombinasjonene er også beskrevet.
Sammensetningen av insulin kan bli formulert for å administrere en prandial dosering
for et enkelt måltid, så som, men ikke begrenset til, omtrent 0,001 U/kg, 0,005 U/kg,
0,01 U/kg, 0,02 U/kg, 0,03 U/kg, 0,04 U/kg, 0,05 U/kg, 0,06 U/kg, 0,07 U/kg, 0,08
15
U/kg, 0,09 U/kg, 0,10 U/kg, 0,11 U/kg, 0,12 U/kg, 0,13 U/kg, 0,14 U/kg, 0,15 U/kg,
0,20 U/kg, 0,25 U/kg, 0,30 U/kg, 0,40 U/kg, 0,50 U/kg, 1 U/kg, 1,5 U/kg, eller 2
U/kg. Mengden av hyaluronandegraderende enzym blir formulert for å administrere til
individet en prandial dosering av et enkelt måltid og, f.eks. er, eller er omtrent 0,3 U,
0,5 U, 1 U, 2 U, 3 U, 4 U, 5 U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U,
20
250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U,
2000 U, 3000 U, 4000 U, 5000 U, eller mer. Sammensetningene i kombinasjonen kan
bli formulert for subkutan administrering.
Beskrevet er metoder hvor de superhurtigvirkende insulinsammensetningene og
25
kombinasjoner derav blir administrert. Typisk er slik administrering parenteral
administrering, så som intravenøs, subkutan, eller via en hvilken som helst egnet vei.
I hvilke som helst av metodene beskrevet heri, kan det hurtigvirkende insulinet og
hyaluronandegraderende enzym bli administrert separat, periodevis eller sammen i
separate sammensetninger, eller ko-formulert. Også beskrevet er metoder for
30
kontrollering av glukosenivåer i et individ, ved administrering av hvilke som helst av
de superhurtigvirkende insulinsammensetningene eller kombinasjoner tilveiebrakt
heri. I noen tilfeller blir sammensetningene eller kombinasjonene administrert som en
parndial dosering, inkludert så som administrert mindre enn eller omtrent 20, 10, 5
minutter før et måltid, til mindre enn eller omtrent 10 minutter etter et måltid, eller
35
med måltidet.
12
Også beskrevet er metoder som involverer instruering av en pasient til å administrere
en hurtigvirkende insulinsammensetning mindre enn eller omtrent 20, 10, 5 minutter
før et måltid, til mindre enn eller omtrent 30 minutter etter et måltid, hvori det
hurtigvirkende insulinet blir koadministrert med en tilstrekkelig mengde av
5
hyaluronandegraderende enzym for å gjøre den hurtigvirkende
insulinsammensetningen til en superhurtigvirkende sammensetning. Det
hurtigvirkende insulinet og hyaluronandegraderende enzym kan bli ko-formulert, eller
tilveiebrakt separat for koadministrering. I slike metoder kan pasienten bli instruert til
å administrere den hurtigvirkende insulinsammensetningen ved eller omtrent
10
tidspunkt for inntak av et måltid. I noen eksempler er instruksjonene skrevne. I andre
eksempler er instruksjonene orale.
Beskrevet er metoder for kontrollering av blodglukosenivåer i et individ, ved
administrering til et individ et hyaluronandegraderende enzym, og et hurtigvirkende
15
insulin, idet hyaluronandegraderende enzym og hurtigvirkende insulin blir administrert
i tilstrekkelige mengder for å
a) oppnå en maksimal økning i insulinkonsentrasjonen i blodet, som er minst
eller omtrent 20 % til 30 % høyere enn den maksimale økningen i
insulinkonsentrasjon i blodet oppnådd etter administrering av det
20
hurtigvirkende insulinet på samme måte i fravær av et
hyaluronandegraderende enzym; og/eller
b) redusere mengden av tid det tar å nå den maksimale insulinkonsentrasjon i
blodet til ikke mer enn 80 % av tiden det tar for å nå den maksimale
insulinkonsentrasjonen i blodet når det hurtigvirkende insulinet blir
25
administrert på samme måte i fravær av et hyaluronandegraderende
enzym; og/eller
c) økning av insulinkonsentrasjonen 15 minutter etter administrering med
minst eller omtrent 50, 60, 70, 80, 90 eller 100 pmol/L.
30
I kraft av metodene er maksimal økning i insulinkonsentrasjon i blodet minst eller
omtrent 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 120 %, 140 %,
160 %, 180 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350%, eller 400 % høyere enn den maksimale
økningen i insulinkonsentrasjon, i fravær av det hyaluronandegraderende enzymet.
Tiden det tar å nå den maksimale insulinkonsentrasjonen i blodet kan bli redusert ikke
35
mer enn 80 % av tiden det tar å nå den maksimale insulinkonsentrasjonen i blodet i
fravær av hyaluronandegraderende enzym. For eksempel kan insulinkonsentrasjonen
etter administrering av en 20 U dose av insulin 15 minutter etter administreringen bli
13
forøket med minst eller omtrent 60 pmol/L, 80 pmol/L, 100 pmol/L, 120 pmol/L, 140
pmol/L, 160 pmol/L, 180 pmol/L, eller 200 pmol/L.
De diabetiske individene kan ha enten type 1 eller type 2 diabetes, og mengden av det
5
hurtigvirkende insulinet administrert til individet blir redusert sammenliknet med når
det hurtigvirkende insulinet blir administrert på samme måte i fravær av et
hyaluronandegraderende enzym. For eksempel kan mengden av hurtigvirkende insulin
administrert til type 1 diabetesindivider bli redusert med minst eller omtrent 5 %, 10
%, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, eller mer, og mengden av hurtigvirkende insulin
10
administrert til et type 2 diabetesindivid kan bli redusert med minst eller omtrent 5
%,, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, eller mer.
Også beskrevet er metoder for kontrollering eller forebygging av vektøkning og/eller
fedme i et diabetesindivid, så som vektøkning assosiert med prandial insulinterapi.
15
Typisk blir dette oppnådd ved administrering av et hyaluronandegraderende enzym,
og et hurtigvirkende insulin i en dose som er mindre enn dosen av et hurtigvirkende
insulin når administrert i fravær av et hyaluronandegraderende enzym.
Diabetesindividene kan være overvektige, eller ha risiko for overvekt, og kan ha type
1 diabetes, type 2 diabetes, gestationell diabetes, eller andre former for diabetes.
20
Eksempler på diabetesindivider er type 2 diabetesindivider. I ett eksempel blir
kontrollering eller forebygging av fedme i et diabetesindivid oppnådd ved
administrering til et overvektig diabetesindivid eller et diabetesindivid med en risiko
for overvekt en terapeutisk effektiv dosering av et hurtigvirkende insulin i
kombinasjon med hyaluronandegraderende enzym. Sammensetningen kan bli
25
administrert ved eller rundt tidspunkt for måltid, og
a) mengden av hyaluronandegraderende enzym er tilstrekkelig for å gjøre det
administrerte hurtigvirkende insulinet til et superhurtigvirkende insulin; og
b) doseringen av det hurtigvirkende insulinet oppnår vesentlig den samme graden
av prandial glukosefjerning i løpet av de første 40 minuttene etter
30
administrering, når en høyere dosering av samme hurtigvirkende insulin
administrert på samme måte i fravær av det hyaluronandegraderende
enzymet. Doseringen av det hurtigvirkende insulinet i den superhurtigvirkende
insulinsammensetningen, sammenliknet med den høyere dosen av
hurtigvirkende insulin, har en redusert tendens til å forårsake postprandial
35
hypoglykemi og fedme. Diabetesindividene kan ha type 2 diabetes, og
mengden av hurtigvirkende insulin administrert til individet kan bli redusert,
sammenliknet med når det hurtigvirkende insulinet blir administrert på samme
14
måte i fravær av et hyaluronandegraderende enzym. For eksempel kan
mengden av hurtigvirkende insulin administrert til et type 2 diabetesindivid bli
redusert med minst eller omtrent 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %,
50 %, 60 %, 70 %, 80 %, eller mer.
5
Også beskrevet er metoder for redusering eller forebygging av vektøkning assosiert
med prandial insulinterapi ved subkutan administrering til et diabetesindivid med
risiko for vektøkning fra prandial insulinterapi, ved eller rundt tidspunkt for måltid, en
insulinsammensetning inneholdende et hurtigvirkende insulin, og et
10
hyaluronandegraderingsenzym, slik at mengden av hurtigvirkende insulin administrert
for å behandle postprandial hyperglykemi i et individ blir redusert sammenliknet med
mengden av det samme hurtigvirkende insulinet som er nødvendig for å behandle
hyperglykemi når administrert på samme måte i fravær av det
hyaluronandegraderende enzymet. Den reduserte mengden av det hurtigvirkende
15
insulinet gjør sammensetningen inneholdende det hyaluronandegraderende enzymet
mindre sannsynlig til å forårsake vektøkning i individet. For eksempel kan et type 2
diabetesindivid bli administrert en insulinsammensetning som beskrevet ovenfor,
inneholdende en mengde av det hurtigvirkende insulinet som er minst eller omtrent 5
%, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, eller 80 % mindre enn
20
mengden av det samme hurtigvirkende insulinet nødvendig for å behandle
hyperglykemi når administrert på samme måte i fravær av det
hyaluronandegraderende enzymet. I noen tilfeller blir insulinsammensetningen
administrert i et kronisk regime av prandial insulinterapi.
25
Beskrevet heri er metoder for redusering eller forebygging av vektøkning i et
diabetesindivid ved administrering til et diabetesindivid med risiko for vektøkning fra
prandial insulinterapi, en kur (“course”) av subkutan prandial insulinterapi over en
periode på minst 30 dager. Prandial insulindoseringene administrert i løpet av terapien
inneholder en kombinasjon av et hurtigvirkende insulin, og et
30
hyaluronandegraderende enzym. Mengden av hyaluronandegraderende enzym i hver
dosering er tilstrekkelig for å gjøre det hurtigvirkende insulinet til en
superhurtigvirkende insulinsammensetning, og en mengde av hurtigvirkende
insulininneholdende innbefattet i doseringen for å behandle individets postprandiale
hyperglykemi, er lavere enn mengden av det samme hurtigvirkende insulinet
35
nødvendig for å behandle hyperglykemi i fravær av hyaluronandegraderende enzym.
En slik kur av prandial insulinterapi kan resultere i mindre vektøkning enn en liknende
15
terapikur ved anvendelse av høyere doseringer av hurtigvirkende insulin i fravær av
hyaluronandegraderende enzym.
Også beskrevet er metoder for kontrollering av glukosenivåer i et individ ved
5
administrering til individet en prandial dosering av superhurtigvirkende
insulinsammensetning, hvor:
a) den superhurtigvirkende insulinsammensetningen omfatter en terapeutisk
effektiv mengde av et hurtigvirkende insulin, og et hyaluronandegraderende
enzym;
10
b) hurtigvirkende insulin er et vanlig (“regular”) insulin;
c) doseringen blir administrert, eller anbefalt for prandial eller preprandial
administrering, nærmere opptil tidspunkt for måltid enn den samme eller en
høyere dosering av samme hurtigvirkende vanlig insulin, administrert ved
samme administreringsvei i fravær av et hyaluronandegraderende enzym;
15
og
d) doseringen av den superhurtigvirkende insulinsammensetningen har minst
den samme terapeutiske effekten som det hurtigvirkende vanlige insulinet,
uten det hyaluronandegraderende enzymet.
20
Den superhurtigvirkende insulinsammensetningen f.eks., blir administrert, eller
anbefalt for administrering, mindre enn eller omtrent 20 minutter før et måltid, til
mindre enn eller omtrent 10 eller 20 minutter etter et måltid. Typisk er doseringen av
det hurtigvirkende insulinet i den superhurtigvirkende insulinsammensetningen mindre
enn eller lik doseringen av det hurtigvirkende insulinet administrert ved samme vei i
25
fravær av det hyaluronandegraderende enzymet.
Ved praktisering av hvilke som helst av metodene beskrevet heri, kan
sammensetningene bli administrert via en hvilken som helst egnet vei, og anvendelse
av en hvilken som helst egnet innretning eller beholder, så som via sprøyte,
30
insulinpenn, insulinpumpe, eller lukket løkke system. Sammensetningene eller
kombinasjonene kan inneholde hvilke som helst av de hurtigvirkende insulinene og
hyaluronandegraderende enzymer beskrevet ovenfor, med hvilke som helst av de
ytterligere reagensene som beskrevet ovenfor. Mengden insulin i sammensetningen
administrert til individet kan være en prandial dosering for et enkelt måltid, og er eller
35
er omtrent 0,001 U/kg, 0,005 U/kg, 0,01 U/kg, 0,02 U/kg, 0,05 U/kg til 0,30 U/kg, så
som 0,05 U/kg, 0,06 U/kg, 0,07 U/kg, 0,08 U/kg, 0,09 U/kg, 0,10 U/kg,, 0,11 U/kg,
0,12 U/kg, 0,13 U/kg, 0,14 U/kg,, 0,15 U/kg, 0,20 U/kg, 0,25 U/kg, 0,30 U/kg, 0,40
16
U/kg, 0,50 U/kg, 1,0 U/kg, 1,5 U/kg, eller 2 U/kg. Mengden av
hyaluronandegraderende enzym administrert til individet er for koadministrering
(separat, periodisk eller sammen i separate sammensetninger eller ko-formulert) med
en prandial dosering av hurtigvirkende insulin for et enkelt måltid. Mengden av
5
hyaluronandegraderende enzym kan være eller er omtrent 0,3 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 5 U,
10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450
U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2000 U, 3000 U, 4000 U, 5000 U, eller
mer.
10
Beskrevet er gjenstander for fremstilling inneholdende forpakningsmateriale og hvilke
som helst av de superhurtigvirkende insulinsammensetningene eller kombinasjoner
innenfor forpakningsmaterialet med eventuelle instruksjoner for administrering til et
individ med diabetes.
15
De hurtigvirkende insulinene, insuliner, hyaluronandegraderende enzymer og andre
komponenter inkluderer de som er beskrevet ovenfor.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 angir de farmakokinetiske profilene til den hurtigvirkende insulinanalogen,
20
Humalog£ insulin, og det hurtigvirkende vanlige insulin, Humulin£ insulin, når
administrert subkutant med eller uten koadministrering av rHuPH20.
Plasmainsulinkonsentrasjonen ved forskjellige tidspunkter følger administreringen til
normale friske individer ved anvendelse av en hyperinsulinemi-euglykemisk clamp
prosedyre ble bestemt ved radioimmunanalyse (RIA).
25
Figur 2 angir de farmakodynamiske profilene til hurtigvirkende insulinanalog,
Humalog£ insulin, og det hurtigvirkende vanlige insulinet, Humulin£ R insulin, når
administrert subkutant med eller uten koadministrering av rHuPH20 ved anvendelse
av en hyperinsulinemi-euglykemisk clamp prosedyre. Glukoseinfusjonsraten som var
30
nødvendig for å opprettholde blodglukosenivåer mellom 90-110 mg/dL etter
insulinadministrering til normale friske individer, ble bestemt¨.
Detaljert beskrivelse
Utkast
35
A. Definisjoner
17
B. “Superhurtigvirkende” insulin
1. Oversikt over insulin, diabetes, og eksisterende hurtigvirkende
insulinterapier
2. Farmakodynamikk og farmakokinetikk til en superhurtigvirkende
5
insulinsammensetning.
C. Insulinpolypeptider og formulering
D. Hyaluronandegraderingsenzymer
1. Hyaluronidaser
a. Pattedyrtype hyaluronidaser
10
b. Bakterielle hyaluronidaser
c. Hyaluronidaser fra igler, andre parasitter, og krepsdyr
2. Andre hyaluronandegraderende midler
3. Oppløselige hyaluronandegraderende enzymer
a. Oppløselig human PH 20
15
b. Rekombinant oppløselig human PH 20 (rHuPH20)
4. Glykosylering av hyaluronandegraderende enzymer
5. Modifikasjoner av hyaluronandegraderende enzymer for å forbedre
deres farmakokinetiske egenskaper
E. Metoder for produsering av nukleinsyrer som koder for en oppløselig
20
hyaluronidase og polypeptider derav
1. Vektorer og celler
2. Linkergrupper
3. Ekspresjon
a. Prokaryote celler
25
b. Gjærceller
c. Insektceller
d. Pattedyrceller
e. Planter
4. Rensingsteknikker
30
F. Fremstilling, formulering og administrering av insulin, og oppløselige
hyaluronidasepolypeptider
1. Formuleringer
Lyofiliserte pulvere
2. Dosering og administrering
35
Administreringsmåte
a. Sprøyte
b. Insulinpenn
18
c. Insulinpumper og andre insulinleveringsinnretninger
d. Lukket løkkesystem
G. Metoder for bestemmelse av aktivitet, biotilgjengelighet og
farmakokinetikk
5
1. Farmakokinetikk, farmakodynamikk og tolererbarhet
2. Biologisk aktivitet
a. Insulin
b. Hyaluronandegraderingsenzymer
H. Terapeutiske anvendelser
10
1. Diabetes mellitus
a. Type 1 diabetes
b. Type 2 diabetes
c. Gestasjonell diabetes
2. Insulinterapi for kritisk syke pasienter
15
I. Kombinasjonsterapier
J. Fremstillingsgjenstander og sett
K. eksempler
A.
20
Definisjoner
Dersom ikke annet er angitt, har alle tekniske og vitenskapelige angivelser anvendt
heri den samme betydningen som er vanlig kjent for fagfolk innenfor dette området,
som oppfinnelsen tilhører. I det tilfellet hvor det er flere definisjoner for angivelsene
heri, vil de i denne delen gjøre seg gjeldende. Hvor referansen er gjort til en URL eller
annen slik identifikasjon eller adresse, er det å forstå at slike identifikasjoner kan
25
forandre seg, og spesiell informasjon på internett kan komme og gå, men ekvivalent
informasjon kan finnes ved søk på internett. Referanse dertil viser tilgjengeligheten og
den offentlige spredningen av slik informasjon.
Som anvendt heri refererer “insulin” til et hormon, forløper eller en syntetisk eller
30
rekombinant analog derav, som virker slik at det øker glukoseopptaket og lagringen,
og/eller reduserer den endogene glukoseproduksjonen. Et eksempelvist humant
insulin blir translatert som et 110 aminosyreforløperpolypeptid, preproinsulin (SEKV.
ID nr. 101), inneholdende et 24 aminosyre signalpeptid som leder proteinet til det
endoplasmatiske retikulum (ER) hvor signalsekvensen blir spaltet, resulterende i
35
proinsulin (SEKV. ID nr. 102). Proinsulin blir prosessert ytterligere for å frigjøre 31
aminosyre C- eller koblende kjedepeptid (som korresponderer med
aminosyreresidiene 57 til 87 av preproinsulinpolypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 101, og
19
til aminosyreresidiene 33 til 63 av proinsulinpolypeptidet som angitt i SEKV. ID nr.
102). Det resulterende insulinet inneholder en 21 aminosyre A-kjede
(korresponderende med aminosyreresidiene 90 til 110 av preproinsulinpolypeptidet
angitt i SEKV. ID nr. 101, og til aminosyreresidiene 66 til 86 av proinsulinpolypeptidet
5
angitt i SEKV. ID nr. 102) og en 30 aminosyre B-kjede (korresponderende med
aminosyreresidiene 25 til 54 av preproinsulinpolypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 101. og
til aminosyreresidiene 1 til 30 av proinsulinpolypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 102) som
er kryssbundet med disulfidbindinger. Et riktig kryssbundet humant insulin inneholder
tre disulfidbroer: én mellomposisjon 7 av A-kjeden, og posisjon 7 av B-kjeden, en
10
andre mellomposisjon 20 av A-kjeden, og posisjon 19 av B-kjeden, og et tredje
mellomposisjoner 6 og 11 i A-kjeden. Referanser til insulin inkluderer preproinsulin,
proinsulin og insulinpolypeptider i enkeltkjede eller to-kjedeformer, trunkerte former
derav som har aktivitet, og inkluderer alleliske varianter og spesiesvarianter, varianter
kodet av spleisevarianter, og andre varianter, så som insulinanaloger, inkludert
15
polypeptider som har minst 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85
%, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, eller mer sekvensidentitet med
forløperpolypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 101, eller den modne formen derav.
Eksempler på insulinanaloger inkluderer de som er angitt i SEKV. ID nr. 147-149, 152,
og de som inneholder en A-kjede angitt i SEKV. ID nr. 150, 156, 158, 160, 162 og
20
164, og/eller B-kjeden angitt i SEKV. ID nr. 151, 153-155, 157, 159, 161, 163 og 165.
Eksempler på insulinpolypeptider er de fra pattedyr, inkludert human opprinnelse.
Eksempler på aminosyresekvenser av insulin med human opprinnelse er angitt i SEKV.
ID nr. 101-104. Eksempler på insulinanaloger inkluderer de som er angitt i SEKV. ID
25
nr. 147-149, 152, og de som inneholder en A-kjede angitt i SEKV. ID nr. 150, 156,
158, 160, 162 og 164, og/eller en B-kjede angitt i SEKV. ID nr. 151, 153-155, 157,
159, 161, 163 og 165. Insulinpolypeptider inkluderer også hvilke som helst av de med
ikke-human opprinnelse inkludert, men ikke begrenset til, hvilke som helst av
forløperinsulinpolypeptider angitt i SEKV. ID nr. 105-146. Referanse til insulin
30
inkluderer monomere og multimere insuliner, inkludert heksamere insuliner, samt
humaniserte insuliner.
Som anvendt heri, refererer “hurtigvirkende insulin” til et hvilket som helst insulin
eller hurtigvirkende insulinsammensetning for akutt administrering til et individ med
35
diabetes, i respons til en virkelig, oppfattet eller antisipert hyperglykemisk tilstand i
individet, som oppstår ved tidspunkt for, eller i løpet av omtrent 4 timer etter,
administrering av det hurtigvirkende insulinet (så som en prandial hyperglykemisk
20
tilstand som resulterer eller antisiperes og resultere fra, opptak av et måltid), hvorved
det hurtigvirkende insulinet har evne til å forebygge, kontrollere, eller lindre den
akutte hyperglykemiske tilstanden. Typisk oppviser den hurtigvirkende
insulinsammensetningen topp insulinnivåer ved eller omtrent ikke mer enn 4 timer
5
etter subkutan administrering til et individ. Hurtigvirkende insulinsammensetninger
inkluderer rekombinante insuliner og isolerte insuliner (også referert til som “vanlige”
insuliner), så som insulinet solgt som Humulin£ R, griseinsuliner og bovine insuliner,
samt insulinanaloger konstruert til å være hurtigvirkende i kraft av
aminosyreforandringer. Eksempelvise vanlige insulinprepareringer inkluderer, men er
10
ikke begrenset til, humane vanlige insuliner, så som de som blir solgt under
varemerket Humulin£ R, Novolin£ R og Velosulin£, Insulin Human, USP og Insulin
Human Injections, USP, samt syreformuleringer av insulin, som f.eks. Toronto Insulin,
Old Insulin og Clear insulin, og vanlige griseinsuliner, så som Iletin II£ (griseinsulin).
Eksempler på hurtigvirkende insulinanaloger inkluderer, f.eks., insulin lispro (f.eks.
15
Humalog£ insulin), insulin aspart (f.eks. NovoLog£ insulin), og insulin glulisin (f.eks.
Apidra£ insulin) den hurtigvirkende insulinsammensetningen solgt som VIAject£ og
VIAtab£ (se f.eks. US patent nr. 7 279 457). Idet betegnelsen “hurtigvirkende insulin”
ikke omfatter “basalvirkende insulin”, kan de superhurtigvirkende
insulinsammensetningene beskrevet heri eventuelt inkludere, i tillegg til et
20
hurtigvirkende insulin, én eller flere basalvirkende insuliner.
Som anvendt heri refererer et humant insulin til et insulin som er syntetisk eller
rekombinant produsert, basert på det humane polypeptidet, inkludert allele varianter
og analoger derav.
25
Som anvendt heri, inkluderer hurtigvirkende humane insuliner eller humane
hurtigvirkende insulinsammensetninger et hvilket som helst humant insulin eller
sammensetning av et humant insulin som er hurtigvirkende, men ekskluderer ikkehumane insuliner, så som vanlig griseinsulin.
30
Som anvendt heri refererer betegnelsene “basalvirkende insuliner” eller “basale
insuliner” til insuliner administrert for å opprettholde et basalt insulinnivå som del av
et totalt behandlingsregime for behandling av en kronisk tilstand, så som diabetes.
Typisk blir et basalvirkende insulin formulert for å opprettholde et omtrent lineært
35
insulinnivå ved kontrollert frigjøring av insulin når administrert periodisk (f.eks. én
eller to ganger daglig). Basalvirkende insuliner inkluderer krystallinske insuliner (f.eks.
NPH og Lente£, protamininsulin, surfeninsulin), basale insulinanaloger (insulin
21
glargine, HOE 901, NovoSol Basal) og andre kjemiske formuleringer av insulin (f.eks.
gummi arabicum, lecitin eller oljesuspensjoner), som hemmer absorpsjonsraten av
vanlig insulin. Som anvendt heri, kan basalvirkende insuliner inkludere insuliner som
typisk blir forstått som lengevirkende (som typisk når relativt lav toppkonsentrasjon,
5
mens den har en maksimal virkningsvarighet over omtrent 20-30 timer), eller
intermediærtvirkende (som typisk forårsaker topp insulinkonsentrasjoner ved omtrent
4-12 timer etter administrering).
Som anvendt heri refererer “superhurtigvirkende insulinsammensetning” til en
10
insulinsammensetning inneholdende et hurtigvirkende insulin, og et
hyaluronandegraderingsenzym (så som oppløselig hyaluronidase, inkludert men ikke
begrenset til, rHuPH20-prepareringer), slik at insulinsammensetningen, over de første
40 minuttene etter parenteral administrering til et individ, tilveiebringer en kumulativ
systemisk insulineksponering i individet, som er høyere enn den kumulative
15
systemiske insulineksponeringen gitt til individet over den samme perioden etter
administrering av den samme doseringen av det samme hurtigvirkende insulinet, ved
samme vei, i fravær av hyaluronandegraderingsenzymet. Den superhurtigvirkende
insulinsammensetningen som beskrevet heri, kan eventuelt inkludere et basalvirkende
insulin.
20
Som anvendt heri, refererer betegnelsene “hyperglykemisk tilstand” eller
“hyperglykemi” til en uønsket forhøyning av blodglukose.
Som anvendt heri refererer betegnelsen “hypoglykemisk tilstand” eller “hypoglykemi”
25
til et uønsket fall i blodglukose.
Som anvendt heri, refererer “systemisk glukosefjerning” eller “systemisk
glukosemetabolisme” til fjerning av glukose fra blodet, og kan bli uttrykt som enten en
rate (mengde/tid) eller kvantitet (mengde over en tidsperiode). Systemisk
30
glukosefjerning kan bli bestemt ved anvendelse av en hvilken som helst egnet metode
kjent innenfor fagområdet. F.eks. kan systemisk glukosefjerning bli målt ved
anvendelse av den Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp prosedyren under fastende
betingelser, som den som er eksemplifisert og beskrevet heri, hvor mengden eller
raten av glukose infusert intravenøst for å opprettholde konstante blodglukosenivåer,
35
så som, f.eks. 90-110 mg/dL, ekvivalent med den systemiske glukosefjerningen.
Forskjellen i systemisk glukosefjerning oppnådd ved forskjellige
insulinsammensetninger, så som forskjellen i systemisk glukosefjerning oppnådd ved
22
administrering av en superhurtigvirkende insulinsammensetning i forhold til det som
blir oppnådd med et hurtigvirkende insulin, kan derfor bli bestemt ved anvendelse av
slike prosedyrer. Forskjellen i systemisk glukosefjerning blant sammenliknende
insuliner kan også bli bestemt ved måling av den relative glukosereduserende
5
aktiviteten til komparatorinsuliner ved et gitt tidspunkt etter en
glukoseeksponeringstest. F.eks. kan en glukoseeksponeringstest (så som f.eks. en 75g oral glukosetoleransetest eller en standardisert test målt tidsformulering, velkjent
for fagfolk innenfor dette området) bli anvendt for å sammenlikne forskjellige
insulinprepareringer. I slike eksponeringstester blir en mengde av glukose eller annet
10
karbohydrat administrert til et individ, øyeblikkelig etterfulgt av en ikke-intravenøs
parenteral administrering av insulinsammensetningen. Blodglukosenivåer (dvs.
konsentrasjonen av glukose i individets blod) blir deretter målt ved et forutbestemt
tidspunkt for å bestemme den blodreduserende effekten av insulin. I disse orale
eksponeringssammenlikningene mellom forskjellige insulinprepareringer, må
15
tidspunktet som går etter at blodglukosenivåene blir målt være adekvate for å
muliggjøre systemisk glukoseopptak. Studiene beskrevet ovenfor for å bestemme
systemisk glukosefjerning kan bli utført ved anvendelse av dyremodeller og/eller
humane individer.
20
Som anvendt heri refererer glykemisk kontroll eller “kontrollerende blodglukosenivåer”
til opprettholdelse av blodglukosekonsentrasjoner ved et ønsket nivå, typisk mellom
70-130 mg/dL eller 90-110 mg/dL.
Som anvendt heri, refererer “kumulativ systemisk insulineksponering” eller “kumulativ
25
systemisk eksponering for insulin” til mengden av insulin som er blitt absorbert i
blodet etter parenteral administrering av insulin. Kumulativ systemisk eksponering for
insulin kan bli bestemt ved beregning av arealet under kurven for en spesifikk
tidsperiode, hvor kurven blir dannet ved å plotte insulinkonsentrasjonen i blodet,
serum eller plasma som en funksjon av tiden.
30
Som anvendt heri, er et lukket løkkesystem et integrert system for tilveiebringing av
kontinuerlig glykemisk kontroll. Lukket løkkesystemer inneholder en mekanisme for
måling av blodglukose, en mekanisme for levering av én eller flere sammensetninger,
inkludert en insulinsammensetning, og en mekanisme for å bestemme mengden av
35
insulin som er nødvendig å bli levert for å oppnå glykemisk kontroll. Typisk derfor,
lukket løkkesystemer inneholder en glukosesensor, en insulinleveringsinnretning, så
som en insulinpumpe, og en kontrollinnretning som mottar informasjon fra
23
glukosesensoren, og tilveiebringer kommandoer til insulinleveringsinnretningen.
Kommandoene kan bli dannet av programvare i kontrollinnretningen. Programvaren
inkluderer typisk en algoritme for å bestemme mengden av insulin som er nødvendig å
bli levert for å oppnå glykemisk kontroll, basert på blodglukosenivåer detektert av
5
glukosesensoren eller antisipert av brukeren.
Som anvendt heri, refererer doseringsregimet til mengden av insulin administrert og
frekvensen av administreringen. Doseringsregimet er en funksjon av sykdommen eller
tilstanden som skal bli behandlet, og kan dermed variere.
10
Som anvendt heri, refererer et hyaluronandegraderingssystem til et enzym som
katalyserer spaltingen av en hyaluronanpolymer (også referert til som hyaluronsyre
eller HA) til fragmenter med mindre molekylvekt. Eksempel på
hyaluronandegraderingsenzymer er hyaluronidaser, og spesielt kondroitinaser og
15
lyaser som har evnen til å depolymerisere hyaluronan. Eksempelvise kondroitinaser
som er hyaluronandegraderingsenzymer inkluderer, men er ikke begrenset til,
kondroitin ABC lyase (også kjent som kondroitinase ABC), kondroitin AC lyase (også
kjent som kondroitinsulfat lyase eller kondroitinsulfat eliminase) og kondroitin C lyase.
Kondroitin ABC lyase omfatter to enzymer, kondroitin-sulfat-ABC endolyase (EC
20
4.2.2.20) og kondroitin-sulfat-ABC eksolyase (EC 4.2.2.21). En eksempelvis
kondroitin-sulfat-ABC endolyase og kondroitin-sulfat-ABC eksolyase inkluderer, men er
ikke begrenset til, de fra Proteus vulgaris og Flavobacterium heparinum (Proteus
vulgaris kondroitin-sulfat-ABC endolyase er angitt i SEKV. ID nr. 98; Sato et al.,
(1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46). Eksempelvis kondroitinase AC-
25
enzymer fra bakterier inkluderer, men er ikke begrenset til, de fra Flavobacterium
heparinum Victivallis vadensis, angitt i SEKV. ID nr. 99, og Arthrobacter aurescens
(Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al.
(1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444).
Eksempler på kondroitinase C-enzymer fra bakterier inkluderer, men er ikke begrenset
30
til, de fra Streptococcus og Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett.
48(2): 121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999)
Eur. J. Biochem. 262:127-133).
Som anvendt heri, refererer hyaluronidase til en klasse av
35
hyaluronandegraderingsenzymer. Hyaluronidase inkluderer bakterielle hyaluronidaser
(EC 4.2.2.1 eller EC 4.2.99.1), hyaluronidaser fra igler, andre parasitter, og krepsdyr
(EC 3.2.1.36), og pattedyrtype hyaluronidaser (EC 3.2.1.35). Hyaluronidaser
24
inkluderer hvilke som helst av ikke-human opprinnelse, inkludert, men ikke begrenset
til, murin, kanin, felin, leporin, avian, bovin, ovin, porcin, equin, piscin, ranin,
bakteriell og hvilke som helst fra igler, andre parasitter, og krepsdyr. Eksempler på
ikke-humane hyaluronidaser inkluderer hyaluronidaser fra kuer (SEKV. ID nr. 10, 11,
5
64 og BH55 (US patenter nr. 5 747 027 og 5 827 721), gulkappeveps (SEKV. ID nr.
12 og 13), honningbier (SEKV. ID nr. 14), white-fase hornet (geitehams) (SEKV. ID
nr. 15), papirveps (SEKV. ID nr. 16), mus (SEKV. ID nr. 17-19, 32), gris (SEKV. ID nr.
20-21), rotte (SEKV. ID nr. 22-24, 31), kanin (SEKV. ID nr. 25), sau (SEKV. ID nr. 26,
27, 63 og 65), orangutang (SEKV. ID nr. 28), cynomolgusape (SEKV. ID nr. 29),
10
marsvin (SEKV. ID nr. 30), Arthrobacter sp. (stamme FB24) (SEKV. ID nr. 67),
Bdellovibrio bacteriovorus (SEKV. ID nr. 68), Propionibacterium acnes (SEKV. ID nr.
69), Streptococcus agalactiae ((SEKV. ID nr. 70), 18RS21 (SEKV. ID nr. 71), serotype
Ia (SEKV. ID nr. 72), serotype III (SEKV. ID nr. 73), Staphylococcus aureus (stamme
COL) (SEKV. ID nr. 74), stamme MRSA252 (SEKV. ID nr. 75 og 76), stamme
15
MSSA476 (SEKV. ID nr. 77), stamme NCTC8325 (SEKV. ID nr. 78), stamme bovin
RF122 (SEKV. ID nr. 79 og 80), stamme USA300 (SEKV. ID nr. 81),. Streptococcus
pneumoniae ((SEKV. ID nr. 82), stamme ATCC BAA-255/R6 (SEKV. ID nr. 83),
serotype 2, stamme D39/NCTC 7466 (SEKV. ID nr. 84), Sreptococcus pyogenes
(serotype M1) (SEKV. ID nr. 85), serotype M2, stamme MGAS10270 (SEKV. ID nr.
20
86), serotype M4, stamme MGAS10750 (SEKV. ID nr. 87), serotype M6 (SEKV. ID nr.
88), serotype M12, stamme MGAS2096 (SEKV. ID nr. 99 og 90), serotype M12,
stamme MGAS9429 (SEKV. ID nr. 91), serotype M28 (SEKV. ID nr. 92), Streptococcus
suis (SEKV. ID nr. 93-95), Vibrio fischeri (stamme ATCC 700601/ES114 (SEKV. ID nr.
96)), og Streptomyces hyaluronolyticus hyaluronidaseenzymet, som er spesifikk for
25
hyaluronsyre, og spalter ikke kondroitin eller kondroitinsulfat (Ohya, T. og Kaneko, Y.
(1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607). Hyaluronidaser inkluderer også de med
human opprinnelse. Eksempler på humane hyaluronidaser inkluderer HYAL1 (SEKV. ID
nr. 36), HYAL2 (SEKV. ID nr. 37), HYAL3 (SEKV. ID nr. 38), HYAL4 (SEKV. ID nr. 39),
og PH20 (SEKV. ID nr. 1).Også inkludert blant hyaluronidasene er oppløselige
30
hyaluronidaser, inkludert, ovin og bovin PH20, oppløselig human PH20, og oppløselig
rHuPH20. Eksempler på kommersielt tilgjengelige bovine eller ovine oppløselige
hyaluronidaser Vitrase£ (ovin hyaluronidase) og Amphadase£ (bovin hyaluronidase).
Referanse til hyaluronandegraderende enzymer inkluderer
35
forløperhyaluronandegraderende enzympolypeptider og modne
hyaluronandegraderende enzympolypeptider (så som de hvor en signalsekvens er blitt
fjernet), forkortede (“trunkerte”) former derav som har aktivitet, og inkluderer allele
25
varianter og spesiesvarianter, varianter som blir kodet av spleisevarianter, og andre
varianter, inkludert polypeptider som har minst 40 %, 50 %, 55 %, 65 %, 70 %, 75
%, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, eller mer sekvensidentitet
med forløperpolypeptidene angitt i SEKV ID nr. 1 og 10-48, 63-65, 67-100, eller i de
5
modne formene derav. For eksempel inkluderer referanse til hyaluronandegraderende
enzym også de humane PH20 forløperpolypeptidvariantene angitt i SEKV. ID nr. 5051. Hyaluronandegraderende enzymer inkluderer også de som inneholder kjemiske
eller posttranslasjonelle modifikasjoner, og de som ikke inneholder kjemiske eller
posttranslasjonelle modifikasjoner. Slike modifikasjoner inkluderer, men er ikke
10
begrenset til, pegylering, albuminering, glykosylering, farnesylering, karboksylering,
hydroksylering, fosforylering, og andre polypeptidmodifikasjoner kjent innenfor
fagområdet.
Som anvendt heri, refererer en oppløselig hyaluronidase til et polypeptid karakterisert
15
ved dets oppløselighet under fysiologiske betingelser. Oppløselige hyaluronidaser kan
bli skjelnet, f.eks., ved dets inndeling i den vandige fasen til en Triton X-114oppløsning varmet til 37oC (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7).
Membranforankret, så som lipidforankrede hyaluronidaser, vil deles i den
detergentrike fasen, men vil deles inn i den detergentreduserte eller vandige fasen
20
etter behandling med fosfolipase-C. Inkludert blant oppløselige hyaluronidaser er
membranforankrede hyaluronidaser hvor én eller flere regioner assosiert med
forankring av hyaluronidasen til membranen er blitt fjernet eller modifisert, hvor den
oppløselige formen beholder hyaluronidaseaktivitet. Oppløselige hyaluronidaser
inkluderer rekombinante oppløselige hyaluronidaser, og de som erinnbefattet i eller
25
renset fra naturlige kilder, så som, f.eks., tester ekstrahert fra sau eller ku. Eksempler
på slike oppløselige hyaluronidaser er oppløselig human PH20. Andre oppløselige
hyaluronidaser inkluderer ovin (SEKV. ID nr. 27, 63, 65) og bovin (SEKV. ID nr. 11,
64 PH20.
30
Som anvendt heri, inkluderer oppløselig human PH20 eller sHuPH20 modne
polypeptider som mangler alle eller en del av glykosylfosfatidylinositol (GPI)
koblingssetet ved den C-terminale enden, slik at ved ekspresjon er polypeptidene
oppløselige. Eksempler på sHuPH20-polypeptider inkluderer modne polypeptider som
har en aminosyresekvens angitt i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 4-9 og 47-48.
35
Forløperpolypeptider for slike eksempelvise sHuPH20-polypeptider inkluderer en
signalsekvens. Eksempler på forløpere er de som er angitt i SEKV. ID nr. 3 og 40-46,
hvor hver inneholder en 35 aminosyre signalsekvens ved aminosyreposisjonene 1-35.
26
Oppløselig HuPH20-polypeptider inkluderer også de som blir degradert i løpet av, eller
etter de produksjons- og rensingsmetodene beskrevet heri.
Som anvendt heri, refererer oppløselig rekombinant human PH20 (rHuPH20) til en
5
oppløselig form av human PH20, som blir rekombinant uttrykt i kinesisk hamsterovarie
(CHO-celler. Oppløselig rHuPH20 blir kodet av nukleinsyre som inkluderer
signalsekvensen som angitt i SEKV. ID nr. 49, Også inkludert er DNA-molekyler som
er allele varianter derav, og andre oppløselige varianter. Nukleinsyren som koder for
oppløselig rHuPH20 blir uttrykt i CHO-celler, som utskiller modent polypeptid. Som
10
produsert i kulturmediet, er det heterogenisitet ved den C-terminale enden, slik at
produktet inkluderer en blanding av arter som kan inkludere en hvilken som helst,
eller mer av SEKV. ID nr. 4-9 forskjellig hyppighet. Korresponderende allele varianter
og andre varianter er også inkludert, inkludert de som korresponderer med forløper
humane PH20-polypeptider angitt i SEKV. ID nr. 50-51. Andre varianter kan ha 60 %,
15
70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99
%, eller mer sekvensidentitet med hvilke som helst av SEKV. ID nr. 4-9 og 47-48,
dersom de beholder en hyaluronidaseaktivitet, og er oppløselige.
Som anvendt heri, refererer aktivitet til en funksjonell aktivitet eller aktiviteter til et
20
polypeptid eller del derav, assosiert med et fullengde (fullstendig) protein.
Funksjonelle aktiviteter inkluderer, men er ikke begrenset til, biologisk aktivitet,
katalytisk eller enzymatisk aktivitet, antigenisitet (evne til å binde eller konkurrere
med et polypeptid for binding til et anti-polypeptidantistoff), immunogenisitet, evne til
å danne multimerer, og evnen til å spesifikt bli bundet til en reseptor eller ligand for
25
polypeptidet.
Som anvendt heri, refererer hyaluronidaseaktivitet til evnen til å enzymatisk
katalysere spaltingen av hyaluronsyre. The United States Pharmacopeia (USP) XXIIanalyse for hyaluronidase bestemmer hyaluronidaseaktiviteten indirekte ved måling av
30
mengden av høyere molekylvekt hyaluronsyre, eller hyaluronan (HA) substrat, som er
igjen etter at enzymet blir latt reagere med HA i 30 min. ved 37oC (USP XXII-NF XVII
(1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD). En
referansestandardløsning kan bli anvendt i en analyse for å bekrefte den relative
aktiviteten, i enheter, av en hvilken som helst hyaluronidase. In vitro analyse for å
35
bestemme hyaluronidaseaktiviteten til hyaluronidase, så som oppløselig rHuPH20, er
kjent innenfor fagområdet, og beskrevet heri. Eksempelvise analyser inkluderer
mikroturbiditetsanalysen beskrevet nedenfor (se f.eks. eksempel 3), som måler
27
spalting av hyaluronsyre av hyaluronidase indirekte ved detektering av det
uoppløselige presipitatet dannet når den uspaltede hyaluronsyren bindes med
serumalbumin. Referansestandarder kan bli anvendt, f.eks., for å danne en
standardkurve for å bestemme aktiviteten i enheter av hyaluronidasen som blir testet.
5
Som anvendt heri, refererer “funksjonelt ekvivalent mengde” eller grammatikalske
variasjoner derav, med referanse til et hyaluronandegraderende enzym, til mengden
av hyaluronandegraderende enzym, som oppnår den samme effekten som en mengde
(så som et kjent antall enheter av hyaluronidaseaktivitet) av et referanseenzym, så
10
som en hyaluronidase. F.eks. kan aktiviteten til et hvilket som helst
hyaluronandegraderende enzym bli sammenliknet med aktiviteten av rHuPH20 for å
bestemme den funksjonelt ekvivalente mengden av et hyaluronandegraderende
enzym som ville ha oppnådd den samme effekten som en kjent mengde av rHuPH20.
For eksempel kan evnen som et hyaluronandegraderende enzym har til å virke som et
15
sprednings- eller diffunderende middel bli vurdert ved injisering derav, inn i den
laterale huden til mus med trypan blå (se f.eks. US patentsøknad nr. 20050260186),
og mengden av hyaluronandegraderende enzym nødvendig for å oppnå den samme
mengden av diffusjon, som f.eks. 100 enheter av en hyaluronidase referansestandard,
kan bli bestemt. Mengden av hyaluronandegraderende enzym som er nødvendig, er
20
derfor funksjonelt ekvivalent med 100 enheter. I et annet eksempel kan evnen som et
hyaluronandegraderende enzym har til å øke nivået og raten av absorpsjon av et
koadministrert insulin bli vurdert i humane individer, så som bestemt nedenfor i
eksempel 1, og mengden av hyaluronandegraderende enzym nødvendig for å oppnå
den samme økningen i nivået av absorpsjonsraten av insulin som, f.eks., administrert
25
kvantitativt rHuPH20, kan bli bestemt (så som ved vurdering av den maksimale
insulinkonsentrasjonen i blodet (Cmaks), tid nødvendig for å oppnå maksimal
insulinkonsentrasjon i blodet (tmaks) og kumulativ systemisk insulineksponering over
en gitt tidsperiode (AUC).
30
6RPDQYHQGWKHULHUUHVLGLHQHDYQDWXUOLJIRUHNRPPHQGHĮDPLQRV\UHUUHVLGLHQHDY
GHĮDPLQRV\UHQHIXQQHWLQDWXUHQVRPHULQNRUSRUHUWLQQLSURWHLQYHGVSHVLILNN
gjenkjenning av det ledede tRNA-molekylet med dets kognate mRNA-kodon i
mennesker.
35
Som anvendt heri, inkluderer nukleinsyrer DNA, RNA og analoger derav, inkludert
peptidnukleinsyrer (PNA) og blandinger derav. Nukleinsyrene kan være enkelt- eller
dobbelttrådede. Når det refereres til prober eller primere, som er eventuelt merket, så
28
som med en detekterbar markør, så som fluorescerende eller radiomerket,
enkelttrådede molekyler kommer i betraktning. Slike molekyler har typisk en lengde
slik at deres mål er statistisk unikt, eller med et lavt kopiantall (typisk mindre enn 5,
generelt mindre enn 3) for probing eller priming av et bibliotek. Generelt inneholder
5
en probe eller primer minst 14, 16 eller 30 nabostilte nukleotider med sekvens
komplementær til, eller identisk med et gen av interesse. Prober og primere kan være
10, 20, 30, 50, 100, eller flere nukleinsyrer.
Som anvendt heri, refererer et peptid til et polypeptid som er større enn, eller som er
10
to aminosyrer i lengde, og mindre enn eller lik 40 aminosyrer i lengde.
Som anvendt heri, blir aminosyrer som oppstår i de forskjellige sekvensene av
aminosyrene tilveiebrakt heri, identiske ifølge deres kjente, tre-bokstav- eller énbokstavforkortelser (tabell 1). Nukleotider som oppstår i forskjellige
15
nukleinsyrefragmenter blir angitt med standard enkelt-bokstavbetegnelser anvendt
rutinemessig innenfor fagområdet.
Som anvendt heri, er en “aminosyre” en organisk forbindelse inneholdende en
aminogruppe og en karboksylsyregruppe. Et polypeptid inneholder to eller flere
20
aminosyrer. For formål heri, inkluderer aminosyrer de 20 naturlig forekommende
aminosyrene, ikke-naturlige aminosyrer, og aminosyreanaloger (dvs. aminosyrer hvor
ĮNDUERQHWKDUHQVLGHNMHGH
Som anvendt heri, refererer “aminosyreresidie” til en aminosyre dannet ved kjemisk
25
spalting (hydrolyse) av et polypeptid og dets peptidbindinger. Aminosyreresidiene
beskrevet heri antas å være “L”-isomer form. Residiene i “D”-isomer form, som er
angitt slik, kan bli substituert med et hvilket som helst L-aminosyreresidie, dersom
den ønskede funksjonelle egenskapen blir opprettholdt av polypeptidet. NH2 refererer
til den frie aminogruppen tilstede ved den aminoterminale enden av et polypeptid.
30
COOH refererer til den frie karboksygruppen tilstede i den karboksylterminale enden
av et polypeptid. Ved å holde seg til standard polypeptidnomenklatur beskrevet i J.
Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968) og tilpasset 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, er
forkortelser for aminosyreresidier vist i tabell 1:
35
Tabell 1 – tabell med samsvar
SYMBOL
1-bokstav
3-bokstav
AMINOSYRE
29
Y
TYR
Tyrosin
G
Gly
Glycin
F
Phe
Fenylalanin
M
Met
Metionin
A
Ala
Alanin
S
Ser
Serin
I
Ile
Isoleucin
L
Leu
Leucin
T
Thr
Treonin
V
Val
Valin
P
Pro
Prolin
K
Lys
Lysin
H
His
Histidin
Q
Gln
Glutamin
E
Glu
Glutaminsyre
Z
Glx
Glu og/eller Gln
W
Trp
Tryptofan
R
Arg
Arginin
D
Asp
Asparaginsyre
N
Asn
Asparagin
B
Asx
Asn og/eller Asp
C
Cys
Cystein
X
Xaa
Ukjent eller annen
Det er å bemerke at alle aminosyreresidiesekvensene representert heri med formlene
har en venstre til høyre orientering i den konvensjonelle retningen av aminoterminale
5
enden til karboksylterminale enden. I tillegg er angivelsen “aminosyreresidie” bredt
definert til å inkludere aminosyrene oppført i samsvarstabellen (tabell 1) og
modifiserte og uvanlige aminosyrer, så som de som blir referert til i 37 C.F.R. §§
1.821-1.822, og inkorporert heri som referanse. Videre er det å bemerke at en strek
ved begynnelsen eller slutten av en aminosyreresidiesekvens indikerer en
10
peptidbinding til en ytterligere sekvens av én eller flere aminosyreresidier, til en
aminoterminal gruppe så som NH2, eller til en karboksylterminal gruppe så som
COOH.
30
Som anvendt heri refererer “naturlig forekommende aminosyrer” til 20 L-aminosyrer
som oppstår i polypeptider.
Som anvendt heri, refererer “ikke-naturlig aminosyre” til en organisk forbindelse som
5
har en struktur som er lik en naturlig aminosyre, men som er blitt modifisert
strukturelt for å etterlikne strukturen og reaktiviteten til en naturlig aminosyre. Ikkenaturlig forekommende aminosyrer inkluderer dermed, f.eks., aminosyrer eller
analoger av aminosyrer forskjellige fra de 20 naturlig forekommende aminosyrene, og
inkluderer, men er ikke begrenset til, D-isostereomerene av aminosyrene. Eksempler
10
på ikke-naturlige aminosyrer er beskrevet heri, og er kjent for fagfolk innenfor dette
området.
Som anvendt heri, er en DNA-konstruksjon et enkelt- eller dobbelttrådet, lineært eller
sirkulært DNA-molekyl som inneholder segmenter av DNA kombinert og sammenstilt
15
på en måte som ikke finnes i naturen. DNA-konstruksjoner eksisterer som et resultat
av human manipulasjon, og inkluderer kloner og andre kopier av de manipulerte
molekylene.
Som anvendt heri, er et DNA-segment en del av et større DNA-molekyl som har
20
spesifiserte attributter. For eksempel er et DNA-segment kodende for et spesifisert
polypeptid en del av et lengre DNA-molekyl, så som et plasmid eller plasmidfragment,
som, når lest fra 5’- til 3’-retningen, koder for sekvensen til aminosyrene til det
spesifiserte polypeptidet.
25
Som anvendt heri, betyr betegnelsen polynukleotid en enkelt- eller dobbelttrådet
polymer av deoksyribonukleotider eller ribonukleotidbaser lest fra 5’- til 3’-enden.
Polynukleotider inkluderer RNA og DNA, og kan bli isolert fra naturlige kilder,
syntetisert in vitro, eller dannet fra en kombinasjon av naturlige og syntetiske
molekyler. Lengden av et polynukleotidmolekyl blir gitt heri med hensyn på
30
nukleotider (forkortet “nt”), eller basepar (forkortet “bp”). Betegnelsen nukleotider blir
anvendt for enkelt- og dobbelttrådede molekyler når innholdet muliggjør dette. Når
betegnelsen blir anvendt for dobbelttrådede molekyler, blir det anvendt for å angi total
lengde, og vil bli forstått å være ekvivalent med betegnelsen basepar. Det er kjent for
fagfolk innenfor dette området at de to trådene av et dobbelttrådet polynukleotid kan
35
være delvis forskjellig i lengde, og at endene derav kan være forskjøvet (“staggered”).
Følgelig kan det hende at alle nukleotidene innenfor et dobbelttrådet
31
polynukleotidmolekyl ikke er paret. Slike uparede ender vil, generelt, ikke overskride
20 nukleotider i lengde.
Som anvendt heri, refererer “likhet” mellom to proteiner eller nukleinsyrer til likheter
5
mellom sekvensen av aminosyrene til proteinene eller nukleotidsekvensene til
nukleinsyrene. Likheten kan være basert på graden av identitet og/eller homologi til
sekvensene av residiene, og residiene innbefattet deri. Metoder for å vurdere grad av
likhet mellom proteiner eller nukleinsyrer er kjent for fagfolk innenfor dette området.
For eksempel, i én metode for vurdering av sekvenslikhet, blir to aminosyrer eller
10
nukleotidsekvenser oppstilt på en måte som tilveiebringer et maksimalt identitetsnivå
mellom sekvensene. “Identitet” refererer til graden hvorved aminosyren eller
nukleotidsekvensene er invariante. Oppstilling av aminosyresekvenser, og i en viss
grad nukleotidsekvenser, kan også ta i betraktning forskjeller og/eller
frekvenssubstitusjoner i aminosyrene (eller nukleotidene). Konservative forskjeller er
15
de som bevarer de fysisk-kjemiske egenskapene til de involverte residiene.
Oppstillinger kan være globale (oppstilling av sammenliknende sekvenser over hele
lengden av sekvensene, og inkludert alle residiene) eller lokal (oppstilling av en del av
sekvensene som inkluderer kun den mest like regionen eller regionene).
20
“Identitet” per se har en betydning kjent innenfor fagområdet, og kan bli beregnet ved
anvendelse av publiserte teknikker. (Se f.eks. Computational Molecular Biology, Lesk,
A.M., red., Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and
Genome Projects, Smith, D.W., red., Academic Press, New York, 1993, Computer
Analysis of Sequence Data, del I, Griffin, A.M., og Griffin, H.G., red., Humana Press,
25
New Jersey, 1994, Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic
Press, 1987, og Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. og Devereux J., red., M
Stockton Press, New York, 1991). Idet det eksisterer et antall metoder for å måle
identiteten mellom to polynukleotid eller polypeptider, er betegnelsen “identitet”
velkjent for fagfolk innenfor dette området (Carillo, H. & D., SIAM J Applied Math
30
48:1073 (1988)).
Som anvendt heri, betyr homolog (med hensyn til nukleinsyre og/eller
aminosyresekvenser) omtrent høyere enn eller lik 25 % sekvenshomologi, typisk
høyere enn eller lik 25 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, eller 95 %
35
sekvenshomologi; den nøyaktige prosentandelen kan om nødvendig bli spesifisert. For
formål heri, blir betegnelsene “homologi” og “identitet” ofte anvendt om hverandre,
dersom ikke annet er angitt. Generelt, for bestemmelse av prosentandel homologi
32
eller identitet, blir sekvensen oppstilt slik at høyeste orden paring blir oppnådd (se
f.eks. Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., red., Oxford University Press, New
York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., red.,
Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data. Del I, Griffin,
5
A.M., og Griffin, H.G., red., Humana Press, New Jersey, 1994, Sequence Analysis in
Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, og Sequence Analysis
Primer, Gibskov, M. og Devereux, J., red., M Stockton Press, New York, 1991, Carillo
et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Med sekvenshomologi, blir antallet
konserverte aminosyrer bestemt ved standard oppstillingsalgoritmeprogrammer, og
10
kan bli anvendt med “default gap penalties” etablert av hver forhandler. Vesentlig
homologe nukleinsyremolekyler vil typisk hybridisere med moderat stringens, eller
med høy stringens langs hele lengden av nukleinsyren som er av interesse. Også
betraktet er nukleinsyremolekyler som inneholder degenererte kodoner istedenfor
kodoner i det hybridiserende nukleinsyremolekylet.
15
Om hvilke som helst to molekyler har nukleotidsekvenser eller aminosyresekvenser
som er minst 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, eller 99 %
“identisk” eller “homolog” kan bli bestemt ved anvendelse av kjente dataalgoritmer så
som “FASTA” programmet, ved anvendelse av f.eks. “default”-parametere som i
20
Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (andre programmer
inkluderer GCG-programpakken (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research
12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215:
403 (1990)), Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, red., Academic Press, San
Diego, 1994, og Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). For eksempel kan
25
BLAST-funksjonen til National Center for Biotechnology Information database bli
anvendt for å bestemme identitet. Andre kommersielt eller offentlig tilgjengelige
programmer inkluderer DNAStar “MegAlign”-programmet (Madison, WI) og the
University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) “Gap”-program (Madison,
WI). Prosent homologi eller identitet til proteinene og/eller nukleinsyremolekylene kan
30
f.eks. bli bestemt ved sammenlikning av sekvensinformasjonen ved anvendelse av et
GAP-dataprogram (f.eks. Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, som revidert
av Smith og Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482). I korte trekk, GAPprogrammet definerer likheter som antallet oppstilte symboler (dvs. nukleotider eller
aminosyrer), som er like, delt opp med det totale antall symboler i den korteste av de
35
to sekvensene. “Default”-parametere for GAP-programmet kan inkludere: (1) en
enhetlig sammenlikningsmatrise (inneholdende en verdi 1 for identiteter og 0 for ikkeidentiteter), og den vektede sammenlikningsmatrisen til Gribskov et al. (1986) Nucl.
33
Acids Res. 14:6745, som beskrevet av Schwartz og Dayhoff, red., ATLAS OF PROTEIN
SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, sidene 353358 (1979); (2) en “penalty” på 3,0 for hvert gap, og en ytterligere 0,10 “penalty” for
hvert symbol I hvert gap; og (3) ingen “penalty” for endegap.
5
Derfor, som anvendt heri, representerer betegnelsen “identitet” eller “homologi” en
sammenlikning mellom en test og et referansepolypeptid eller polynukleotid. Som
anvendt heri, refererer betegnelsen minst “90 % identisk med” til prosent identiteter
fra 90 til 99,99 i forhold til referansenukleinsyren eller aminosyresekvensen til
10
polypeptidet. Identitet i et nivå på 90 % eller mer, indikerer det faktum at, ved å anta
for eksempelvise formål en test og referansepolypeptidlengde på 100 aminosyrer blir
sammenliknet. Ikke mer enn 10 % (dvs. 10 av 100) av aminosyrene i testpolypeptidet
forskjellig fra de til referansepolypeptidet. Liknende sammenlikninger kan bli utført
mellom test- og referansepolynukleotider. Slike forskjeller kan bli representert som
15
punktmutasjoner som blir tilfeldig distribuet over hele lengden av et polypeptid, eller
de kan bli klumpet sammen i én eller flere beliggenheter med varierende lengder
opptil det maksimalt tillatte, f.eks. 10/100 aminosyreforskjell (omtrent 90 %
identitet). Forskjeller blir definert som nukleinsyre- eller aminosyresubstitusjoner,
innskudd eller delesjoner. På nivå med at homologier eller identiteter over omtrent
20
85-90 %, bør resultatet være uavhengig av programmet og gap-parametere som er
innstilt; slike høye nivåer av identitet kan bli lett vurdert, ofte ved manuell oppstilling
uten å være avhengig av programvare.
Som anvendt heri, refererer den oppstilte sekvens til anvendelse av homologi (likhet
25
og/eller identitet) for å oppstille korresponderende posisjoner i en sekvens av
nukleotider eller aminosyrer. Typisk blir 2 eller flere sekvenser som er relatert med 50
% eller mer identitet oppstilt. Et oppstilt sett av sekvenser refererer til to eller flere
sekvenser som er oppstilt ved korresponderende posisjoner, og kan inkludere
oppstillende sekvenser avledet fra RNA, så som EST og andre cDNA, oppstilt med
30
genomisk DNA-sekvens.
Som anvendt heri, refererer “primer” til et nukleinsyremolekyl som kan virke som et
initieringspunkt for templatrettet DNA-syntese under hensiktsmessige betingelser
(f.eks. i nærvær av fire forskjellige nukleosidtrifosfater og et polymeriseringsmiddel,
35
så som DNA-polymerase, RNA-polymerase eller revers transkriptase) i en
hensiktsmessig buffer, og ved en egnet temperatur. Det er å bemerke at visse
nukleinsyremolekyler kan virke som en “probe” og som en “primer”. Primer har
34
derimot en 3’ hydroksylgruppe for utvidelse. En primer kan bli anvendt i forskjellige
metoder, inkludert, f.eks., polymerasekjedereaksjon (PCR), revers transkriptase (RT)PCR, RNA PCR, LCR, multipleks PCR, panhandle PCR, capture PCR, ekspresjons PCR, 3’
og 5’ RACE, in situ PCR, ligeringsmediert PCR, og andre amplifikasjonsprotokoller.
5
Som anvendt heri, refererer “primerpar” til et sett av primere som inkluderer en 5’
(oppstrøms) primer som hybridiserer med 5’-enden av en sekvens som skal bli
amplifisert (f.eks. ved PCR), og en 3’ (nedstrøms) primer, som hybridiserer med
komplementet av 3’-enden av sekvensen som skal bli amplifisert.
10
Som anvendt heri, refererer “spesifikt hybridisere” til kobling, ved komplementær
baseparing, av et nukleinsyremolekyl (f.eks. et oligonukleotid) til et
målnukleinsyremolekyl. Fagfolk innenfor dette området er kjent med in vitro og in vivo
parametere som påvirker spesifikk hybridisering, så som lengde og sammensetning av
15
det bestemte molekylet. Parametere som er spesielt relevante for in vitro
hybridisering inkluderer videre sammensmelting og vasketemperatur,
buffersammensetning, og saltkonsentrasjon. Eksempler på vaskebetingelser for
fjerning av uspesifikt bundne nukleinsyremolekyler med høy stringens er 0,1 x SSPE,
0,1 % SDS, 65oC, og ved middels stringens 0,2 x SSPE, 0,1 % SDS, 50oC. Ekvivalente
20
stringensbetingelser er kjent innenfor fagområdet. Fagpersonen kan lett justere disse
parameterne for å oppnå spesifikk hybridisering av et nukleinsyremolekyl til et
målnukleinsyremolekyl hensiktsmessig for en bestemt anvendeles. Komplementært,
når det refereres til to nukleotidsekvenser, betyr at de to sekvensene av nukleotidene
har evne til å hybridisere, typisk med mindre enn 25 %, 15 % eller 5 % feilparing
25
mellom motstående nukleotider. Om nødvendig vil prosentandel komplementaritet
være spesifisert. Typisk blir de to molekylene valgt slik at de vil hybridisere under
betingelser med høy stringens.
Som anvendt heri, betyr vesentlig identisk med et produkt tilstrekkelig likhet, slik at
30
egenskapen av interesse er vesentlig uforandret, slik at det vesentlig identisk
produktet kan bli anvendt istedenfor produktet.
Som anvendt heri, er det også underforstått at betegnelsene “vesentlig identisk” eller
“lik” varierer med sammenhengen som kjent for fagfolk innenfor det relevante
35
fagområdet.
35
Som anvendt heri, refererer en allelvariant eller allel variasjon til hvilke som helst av
to eller flere alternative former for et gen som okkuperer det samme kromosomale
lokus. Allelvariasjon oppstår naturlig gjennom mutasjon, og kan resultere i fenotypisk
polymorfisme innenfor populasjonene. Genmutasjoner kan være stille (ingen
5
forandring i det kodede polypeptidet), eller kan kode for polypeptider som har endret
aminosyresekvens. Betegnelsen “allel variant” blir også anvendt heri for å angi et
protein som blir kodet av en allel variant av et gen. Typisk koder referanseformen av
genet for en villtypeform og/eller predominerende form av et polypeptid fra en
populasjon eller et referansemedlem av en art. Typisk har allele varianter, som
10
inkluderer varianter mellom og blant arter, minst 80 %, 90 %, eller høyere
aminosyreidentitet med en villtype og/eller predominant form av den samme arten;
idet graden av identitet avhenger av genet, og om sammenlikningen er interspesies
eller intraspesies. Generelt har intraspesies allele varianter minst omtrent 80 %, 85
%, 90%, eller 95 %, identitet eller høyere, med en villtype og/eller predominant form,
15
inkludert 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, eller høyere identitet, med en villtype og/eller
predominant form av et polypeptid. Referanse til en allel variant heri refererer
generelt til variasjoner i proteiner blant medlemmene av den samme arten.
Som anvendt heri, refererer “allel” som blir anvendt om hverandre heri med “allel
20
variant” til alternative former av et gen eller deler derav. Alleler okkuperer det samme
lokuset eller posisjonen på homologe kromosomer. Når et individ har to identiske
alleler av et gen, angis det at individet er homozygot for det genet eller allelet. Når et
individ har to forskjellige alleler av et gen, er det angitt at individet er heterozygot for
genet. Alleler av et spesifikt gen kan være forskjellig fra hverandre i et enkelt
25
nukleotid eller flere nukleotider, og kan inkludere modifikasjoner så som
substitusjoner, delesjoner og innskudd av nukleotider. Et allel av et gen kan også
være en form av et gen inneholdende en mutasjon.
Som anvendt heri, refererer spesiesvarianter til varianter i polypeptider blant
30
forskjellige spesies, inkludert forskjellige pattedyrspesies, så som mus og menneske.
Som anvendt heri, refererer en spleisevariant til en variant produsert ved
differensialprosessering av et primært transkript av genomisk DNA, som resulterer i
mer enn én type av mRNA.
35
Som anvendt heri, er modifikasjon i referanse til modifikasjon av en sekvens av
aminosyrer av et polypeptid, eller en sekvens av nukleotider i et nukleinsyremolekyl,
36
og inkluderer delesjoner, innskudd og erstatning av aminosyrer og nukleotider.
Metoder for modifisering av et polypeptid er rutinemessig for fagfolk innenfor dette
området, så som ved anvendelse av rekombinante DNA-metodologier.
5
Som anvendt heri, betyr angivelsen promoter en del av et gen inneholdende DNAsekvenser som tilveiebringer binding av RNA-polymerase og initiering av
transkripsjon. Promotersekvenser blir vanligvis, men ikke alltid, funnet i den 5’ ikkekodende regionen av genene.
10
Som anvendt heri, er isolert eller renset polypeptid eller protein eller biologisk aktiv
del derav vesentlig fri for cellulært materiale eller andre kontaminerende proteiner fra
cellen eller vev som proteinet er avledet fra, eller vesentlig fri for kjemiske forløpere
eller andre kjemikalier når kjemisk syntetisert. Prepareringer kan bli bestemt å være
vesentlig frie hvis de fremstår fri for lett detekterbare urenheter som bestemt ved
15
standard analysemetoder, så som tynnsjiktskromatografi (TLC), gelelektroforese og
høy ytelse væskekromatografi (HPLC), anvendt av fagfolk innenfor dette området for å
vurdere slik renhet, eller tilstrekkelig ren, slik at ytterligere rensing ville ikke
detekterbart endre de fysiske og kjemiske egenskapene, så som enzymatiske og
biologiske aktiviteter, til forbindelsen. Metoder for rensing av forbindelsene for å
20
produsere vesentlig kjemisk rene forbindelser er kjent for fagfolk innenfor dette
området. En vesentlig kjemisk ren forbindelse, kan derimot være en blanding av
stereoisomerer. I slike tilfeller, kan ytterligere rensing øke den spesifikke aktiviteten til
forbindelsen.
25
Betegnelsen vesentlig fri for cellulært materiale inkluderer prepareringer av proteiner,
hvor proteinet blir separert fra de cellulære komponentene til cellene, hvorifra de er
isolert eller produsert rekombinant. I én utførelsesform inkluderer betegnelsen
vesentlig fri for cellulært materiale prepareringer av enzymproteiner som er mindre
enn omtrent 30 % (i tørrvekt) av ikke-enzymproteiner (også referert til heri som et
30
kontaminerende protein), generelt mindre enn omtrent 20 % av ikke-enzymproteiner,
eller 10 % av ikke-enzymproteiner, eller mindre enn omtrent 5 % av ikkeenzymproteiner. Når enzymproteinene blir produsert rekombinant, er det også
vesentlig fritt for kulturmedium, dvs. kulturmediet representerer mindre enn omtrent
eller 20 %, 10 %, eller 5 %, av volumet til enzymproteinprepareringen.
35
Som anvendt heri, inkluderer betegnelsen vesentlig fri for kjemiske forløpere eller
andre kjemikalier prepareringer av enzymproteiner, hvor proteinet blir separert fra
37
kjemiske forløper eller andre kjemikalier som er involvert i syntesen av proteinet.
Betegnelsen inkluderer prepareringen av enzymproteiner som er mindre enn omtrent
30 % (i tørrvekt) 20 %, 10 %, 5 %, eller mindre av kjemiske forløpere eller ikkeenzymkjemikalier eller komponenter.
5
Som anvendt heri, refererer syntetisk, med referanse til, f.eks., et syntetisk
nukleinsyremolekyl eller et syntetisk gen, eller et syntetisk peptid et
nukleinsyremolekyl eller polypeptidmolekyl som blir produsert ved rekombinante
metoder og/eller ved kjemiske syntesemetoder.
10
Som anvendt heri, betyr produksjon ved rekombinante metoder ved anvendelse av
rekombinante DNA-metoder anvendelse av velkjente metoder innen molekylær biologi
for uttrykking av proteiner kodet av klonet DNA.
15
Som anvendt heri, refererer vektor (eller plasmid) til diskrete elementer som ble
anvendt for å introdusere en heterolog nukleinsyre inn i cellene for enten ekspresjon
eller replikasjon derav. Vektorene forblir typisk episomale, men kan bli konstruert til å
påvirke integrasjonen av et gen eller del derav, inn i et kromosom til genomet. Også
betraktet er vektorer som er kunstige kromosomer, så som gjærkunstige kromosomer
20
og pattedyrkunstige kromosomer. Valg og anvendelse av slike bærere er velkjente for
fagfolk innenfor dette området.
Som anvendt heri, inkluderer en ekspresjonsvektor vektorer med evne til å uttrykke
DNA som er operabelt koblet med regulatoriske sekvenser, så som promoterregioner,
25
som har evne til å tilveiebringe ekspresjon av slike DNA-fragmenter. Slike ytterligere
segmenter kan inkludere promoter- og terminatorsekvenser, og kan eventuelt
inkludere én eller flere replikasjonsorigoer, én eller flere selekterbare markører, en
enhancer, et polyadenyleringssignal, og liknende. Ekspresjonsvektorer er generelt
avledet fra plasmid eller viralt DNA, eller kan inneholde elementer av begge. Følgelig
30
refererer en ekspresjonsvektor til en rekombinant DNA- eller RNA-konstruksjon, så
som et plasmid, et fag, rekombinant virus, eller annen vektor som, ved introduksjon
inn i en hensiktsmessig vertscelle, resulterer i ekspresjon av klonet DNA.
Hensiktsmessige ekspresjonsvektorer er velkjente for fagfolk innenfor dette området,
og inkluderer de som kan replikeres i eukaryote celler og/eller prokaryote celler, og de
35
som forblir episomale, eller de som integreres inn i vertscellegenomet.
38
Som anvendt heri, inkluderer vektor også “virusvektorer” eller “virale vektorer”. Virale
vektorer er omkonstruerte viruser som er operativt koblet til eksogene gener for å
overføre (som bærere eller “shuttles”) de eksogene genene inn i cellene.
5
Som anvendt heri, betyr operabelt eller operativt koblet når det refereres til DNAsegmenter at segmentene er arrangert slik at de virker i samsvar med deres mente
formål, f.eks. transkripsjon initieres nedstrøms for promoteren og oppstrøms for hvilke
som helst transkriberte sekvenser. Promoteren er vanligvis domenen hvortil det
transkripsjonelle maskineriet bindes for å initiere transkripsjonen, og forløper gjennom
10
det kodende segmentet til terminatoren.
Som anvendt heri, skal betegnelsen vurdering inkludere kvantitativ og kvalitativ
bestemmelse i den hensikt av å oppnå en absolutt verdi for aktiviteten til en protease,
eller en domene derav, tilstede i prøven, og også for å oppnå en indeks, et forhold, en
15
prosentandel, visuell eller annen verdi som indikerer aktivitetsnivået. Vurderingen kan
være direkte eller indirekte, og de kjemiske artene som virkelig blir detektert behøver
selvfølgelig ikke å være proteolyseprodukter derav, men kan f.eks. være et derivat
derav, eller en ytterligere forbindelse. For eksempel deteksjon av spaltbart produkt av
et komplementprotein, så som ved SDS-PAGE og protein farget med Coomasie blå.
20
Som anvendt heri, refererer biologisk aktivitet til in vivo aktivitetene til en forbindelse
eller fysiologiske responser som et resultat av in vivo administrasjon av en
forbindelse, sammensetning eller annen blanding. Følgelig omfatter biologisk aktivitet
terapeutiske effekter og farmasøytisk aktivitet til slike forbindelser, sammensetninger
25
og blandinger. Biologiske aktiviteter kan bli observert i in vitro systemer konstruert for
å teste eller anvende slike aktiviteter. Følgelig, for formål heri, er en biologisk aktivitet
av en protease er dets katalytiske aktivitet, hvor polypeptid blir hydrolysert.
Som anvendt heri, betyr ekvivalent, når det refereres til to sekvenser av nukleinsyrer,
30
at de to sekvensene det gjelder koder for den samme sekvensen av aminosyrer eller
ekvivalente proteiner. Når ekvivalent blir anvendt for å referere til to proteiner eller
peptider, betyr det at de to proteinene eller peptidene har vesentlig den samme
aminosyresekvensen med kun aminosyresubstitusjoner som ikke vesentlig endrer
aktiviteten eller funksjonen av proteinet eller peptidet. Når ekvivalent refererer til en
35
egenskap, behøver egenskapen ikke være tilstede i samme grad (f.eks. to peptider
kan utvise forskjellige rater av den samme typen av enzymatisk aktivitet), men
aktivitetene er vanligvis vesentlig de samme.
39
Som anvendt heri, refererer “modulere” og “modulering” eller “endring” til en
forandring av en aktivitet av et molekyl, så som et protein. Eksempelvise aktiviteter
inkluderer, men er ikke begrenset til, biologiske aktiviteter, så som
5
signaltransduksjon. Modulering kan inkludere en økning i aktivitet (dvs. oppregulering
eller agonistaktivitet), en reduksjon i aktivitet (dvs. nedregulering eller inhibisjon)
eller en hvilken som helst annen endring i en aktivitet (så som en endring i
periodisitet, frekvens, varighet, kinetikk, eller annen parameter). Modulering kan være
kontekstavhengig, og typisk blir modulering sammenliknet med en angitt tiltand,
10
f.eks. villtypeproten, proteinet i en konstitutiv tilstand, eller proteinet som uttrykt i en
angitt celletype eller tilstand.
Som anvendt heri, refererer en sammensetning til en hvilken som helst blanding. Det
kan være en løsning, suspensjon, væske, pulver, pasta, vandig, ikke-vandig, eller en
15
hvilken som helst kombinasjon derav.
Som anvendt heri, refererer en kombinasjon til en hvilken som helst assosiasjon
mellom eller blant to eller flere gjenstander. Kombinasjonen kan være to eller flere
separate gjenstander, så som to sammensetninger eller to kolleksjoner, kan være en
20
blanding derav, så som en enkeltblanding av to eller flere gjenstander, eller en hvilken
som helst variasjon derav. Elementene av en kombinasjon er generelt funksjonelt
assosierte eller relaterte.
Som anvendt heri, refererer “sykdom eller forstyrrelse” til en patologisk tilstand i en
25
organisme som er et resultat av å forårsake eller en tilstand som inkluderer, men er
ikke begrenset til, infeksjoner, ervervede tilstander, genetiske tilstander, og
karakterisert ved identifiserbare symptomer. Sykdommer og forstyrrelser av interesse
heri er de som involverer komponenter av ECM.
30
Som anvendt heri, betyr “behandling” av et individ med den sykdom eller tilstand at
individets symptomer blir delvis eller totalt hindret, eller forblir statisk etter
behandling. Følgelig omfatter behandling profylakse, terapi og/eller leging. Profylakse
refererer til forebygging av en potensiell sykdom og/eller en forebygging av forverring
av symptomene eller progresjon av en sykdom. Behandling omfatter også en hvilken
35
som helst farmasøytisk anvendelse av en superhurtigvirkende insulinsammensetning
tilveiebrakt heri.
40
Som anvendt heri, inkluderer et farmasøytisk effektivt middel et hvilket som helst
terapeutisk middel eller bioaktive midler, inkludert, men ikke begrenset til, f.eks.
anestesimidler, vasokonstriktorer, dispergeringsmidler, konvensjonelle terapeutiske
medikamenter, inkludert små molekylmedikamenter og terapeutiske proteiner.
5
Som anvendt heri, betyr behandling en hvilken som helst måte hvor symptomene på
en tilstand, forstyrrelse eller sykdom, eller annen indikasjon, blir lindret eller på annen
måte fordelaktig endret.
10
Som anvendt heri, betyr en terapeutisk effekt en effekt som resulterer fra behandling
av et individ som endrer, typisk forbedrer eller lindrer symptomene på en sykdom
eller tilstand, eller som leger en sykdom eller tilstand. En terapeutisk effektiv mengde
refererer til den mengden av en sammensetning, molekyl eller forbindelse som
resulterer i en terapeutisk effekt etter administrering til et individ.
15
Som anvendt heri, refererer betegnelsen “individ” til et dyr, inkludert et pattedyr, så
som et menneske.
Som anvendt heri, refererer en pasient til et menneske som utviser symptomer på en
20
sykdom eller forstyrrelse.
Som anvendt heri, refererer lindring av symptomer på en bestemt sykdom eller
forstyrrelse ved en behandling, så som ved administrering av en farmasøytisk
sammensetning eller annet terapeutisk middel, til hvilke som helst redusering, enten
25
permanent eller temporært, varende eller forbigående, av symptomer som kan
skyldes eller som er assosiert med administrering av sammensetningen eller det
terapeutiske midlet.
Som anvendt heri, refererer prevensjon eller profylakse til metoder hvor risikoen for
30
utvikling av sykdom eller tilstand blir redusert.
Som anvendt heri, refererer en “terapeutisk effektiv mengde” eller en “terapeutisk
effektiv dose” til mengden av et middel, forbindelse, materiale eller sammensetning
inneholdende en forbindelse som er minste tilstrekkelig for å produsere en terapeutisk
35
effekt. Følgelig er det mengden nødvendig for å forebygge, lege, lindre, stoppe, eller
delvis stoppe et symptom på en sykdom eller forstyrrelse.
41
Som anvendt heri, er en terapeutisk effektiv insulindosering mengden av insulin som
er nødvendig eller tilstrekkelig for å oppnå glykemisk kontroll. Denne mengden kan bli
bestemt empirisk, så som ved glukose eller måltidseksponering. Sammensetningene
tilveiebrakt heri inneholder en terapeutisk effektiv mengde eller konsentrasjon av
5
insulin, slik at terapeutisk effektive doseringer blir administrert.
Som anvendt heri, refererer enhetsdoseform til fysiske diskrete enheter egnet for
mennesker og dyr, og pakket individuelt som kjent innenfor fagområdet.
10
Som anvendt heri, refererer en enkeltdoseformulering til en formulering for direkte
administrering.
Som anvendt heri, er en “fremstillingsgjenstand” et produkt som blir dannet og solgt.
Som anvendt i denne søknaden, skal angivelsen omfatte en hurtigvirkende
15
insulinsammensetning og hyalurondegraderende enzymsammensetning innbefattet i
denne eller separate forpakningsgjenstander.
Som anvendt heri, refererer fluid til en hvilken som helst sammensetning som kan
strømme. Fluider omfatter følgelig sammensetninger som er i form av halvfaste,
20
pastaer, løsninger, vandige blandinger, geler, lotioner, kremer og andre slike
sammenestninger.
Som anvendt heri, refererer et “kit” til en kombinasjon av sammensetninger
tilveiebrakt heri, og en annen gjenstand for et formål inkludert, men ikke begrenset
25
til, rekonstitusjon, aktivering, instrumenter/innretninger for levering, administrasjon,
diagnose og vurdering av en biologisk aktivitet eller egenskap. Sett inkluderer
eventuelt instruksjoner for bruk.
Som anvendt heri, refererer et cellulært ekstrakt eller lysat til en preparering eller
30
fraksjon som blir dannet fra en lysert eller ødelagt celle.
Som anvendt heri, inkluderer dyr et hvilket som helst dyr, så som, men ikke
begrenset til primater inkludert mennesker, gorillaer og aper; gnagere, så som mus og
rotter; fugler, så som kyllinger; drøvtyggere, så som geiter, kuer, reinsdyr, sauer;
35
ovin, så som griser og andre dyr. Ikke-humane dyr ekskluderer mennesker som
betraktet dyr. Enzymene tilveiebrakt heri er fra en hvilken som helst kilde, dyr, plante,
42
prokaryot og sopp. De fleste enzymene er av dyreopprinnelse, inkludert
pattedyropprinnelse.
Som anvendt heri, refererer en kontroll til en prøve som er vesentlig identisk med
5
testprøven, med unntagelse av at den ikke er behandlet med en testparameter, eller,
dersom det er en plasmaprøve, kan det være fra en normal frivillig som ikke er
påvirket av tilstanden av interesse. En kontroll kan også være en indre kontroll.
Som anvendt heri, inkluderer singulære former “en” og “et” flertallsbetegnelser
10
dersom ikke innholdet klart indikerer noe annet. Referanse til en forbindelse omfatter
følgelig for eksempel “en ekstracellulær domene” som inkluderer forbindelser med én
eller en mengde ekstracellulære domener.
Som anvendt heri, kan områder og mengder bli uttrykt som “omtrent” av en bestemt
15
verdi, eller et område. Omtrent inkluderer også den nøyaktige mengden. Følgelig
betyr “omtrent 5 baser” “omtrent 5 baser, og også “5 baser”.
Som anvendt heri, betyr “eventuell” eller “eventuelt” at den deretter beskrevne
hendelsen eller omstendigheten skjer eller ikke skjer, og at beskrivelsen inkluderer
20
tilfeller hvor nevnte hendelse eller omstendighet oppstår, og tilfeller hvor den ikke
oppstår. For eksempel betyr en eventuelt substituert gruppe at gruppen er
usubstituert, eller er substituert.
Som anvendt heri, er forkortelsene for en hvilken som helst beskyttende gruppe,
25
aminosyrer og andre forbindelser, dersom ikke annet er angitt, i henhold til deres
vanlige bruk, anerkjente forkortelser, eller IUPAC-IUB Commission on Biochemical
Nomenclature (se, (1972) Biochemistry 11:1726).
B. Superhurtigvirkende insulinsammensetninger
30
Tilveiebrakt heri er superhurtigvirkende insulinsammensetninger. De
superhurtigvirkende insulinsammensetningene blir oppnådd ved kombinering, før, eller
ved tidspunkt for administrering, av et hurtigvirkende insulin, og et
hyaluronandegraderende enzym. Også beskrevet er metoder og anvendelser av
superhurtigvirkende insulinsammensetning for å behandle de samme sykdommene og
35
tilstandene hvor hurtigvirkende insuliner tidligere er blitt indikert, f.eks. diabetes
mellitus for kontroll av hyperglykemi og andre sykdommer og tilstander.
Hurtigvirkende insuliner (for eksempel Humalog£ insulin lispro og Humulin£ R insulin)
43
etterlikner ikke tilstrekkelig den endogene insulintoppen (“spike”) av første fase
prandial insulinfrigjøring. Det er nå oppdaget at ved kombinering av et hurtigvirkende
insulin med et hyaluronandegraderende enzym, tilveiebringer metodene,
sammensetningene og kombinasjonene beskrevet heri en superhurtigvirkende
5
insulinsammensetning som nærmere etterlikner den nedogene (dvs. naturlige)
postprandiale insulinfrigjøringen til et ikke-diabetesindivid.
1. Oversikt over insulin, diabetes og eksisterende hurtigvirkende
insulinterapier
10
Insulin er et naturlig forekommende polypeptidhormon utskilt av bukspyttkjertelen.
Insulin er nødvendig for cellene i kroppen for å effektivt ta opp og anvende glukose fra
blodet. Glukose er det vesentlige energisubstratet for å utføre cellulære funksjoner. I
tillegg til å være de primære modulatoren av karbohydrathomeostase, har insulin
effekter på fettmetabolismen. Den kan forandre evnen som leveren og adiposevev,
15
blant andre, har til å frigjøre fettlagre. Insulin har forskjellige farmakodynamiske
effekter i kroppen, inkludert men ikke begrenset til økning i lipidsyntese, reduksjon i
lipidnedbrytning, økning i proteinsyntese, regulering av nøkkelenzymer og prosesser i
glukosemetabolisme (inkludert glukoseopptaksstimulering,
glukoseoksidasjonsstimulering, forøket glykogensyntese, og redusert
20
glykogennedbrytning).
Til tross for at insulin blir utskilt basalt, vanligvis i området på 0,5 til 1,0 enheter pr.
time, blir nivåene forøket etter et måltid. Etter et måltid utskiller bukspyttkjertelen en
bolus av insulin i respons til økning i glukose. Insulin stimulerer opptaket av glukose
25
inn i cellene, og signaliserer at leveren reduserer glukoseproduksjonen; dette
resulterer videre i blodglukose til normale nivåer. I normale voksne er det to faser av
insulinfrigjøring i respons til et måltid. Den tidlige fasen er en topp av insulinfrigjøring
som oppstår i løpet av 2-15 minutter etter spising. Sen fasefrigjøring varer i omtrent 2
timer. Den tidlige fasen er ansvarlig for nedbrytning av hepatisk glukoseproduksjon,
30
for derved å redusere blodglukosenivåer og sensibilisering eller signalisering av
perifere vev til å øke glukoseopptaket. I muskler blir store mengder av glukose lagret
som glykogen. Noe av glykogenet blir brutt ned til laktat, som sirkulerer til leveren, og
kan bli omdannet tilbake til glukose og lagret som glykogen. Mellom måltidene bryter
leveren ned disse glykogenlagrene for å tilveiebringe glukose til hjerne og andre vev.
35
Diabetes resulterer i kronisk hyperglykemi grunnet manglende evne eller redusert
evne som bukspyttkjertelen har til å produsere tilstrekkelige mengder av insulin, eller
44
grunnet den manglende evnen eller reduserte evnen som cellene har til å syntetisere
og/eller frigjøre det påkrevde insulinet. I diabetes blir effektiviteten til ovenfor
beskrevne første-faseresponsen redusert eller er fraværende, og dette fører til
forhøyede postprandiale glukosenivåer. For eksempel er blodglukoseområdet under
5
kurven (AUC) i løpet av de første fire postprandiale timene (dvs. første fire timer etter
spising), 2,5 til 3,0 ganger høyere i diabetikere enn i ikke-diabetikere. Postprandiale
glukoseutslag bidrar til den totale hyperglykemi, og forhøyede HbA1c-nivåer, og disse
utslagene er de primære bidragsyterne til HbA1c-forhøyninger som ses i tidlige stadier
av type 2 diabetes.
10
Mange diabetespasienter krever behandling med insulin når bukspyttkjertelen
produserer utilstrekkelige mengder av insulin, eller kan ikke anvende insulin som den
produserer, for å opprettholde adekvat glykemisk kontroll. Insulin er blitt administrert
som et terapeutisk middel for å behandle pasienter som har diabetes, inkludert,
15
f.eks.,type 1 diabetes, type 2 diabetes, og gestasjonell diabetes, for å etterlikne den
endogene insulinresponsen som oppstår i normale individer. Insulin er også blitt
administrert til kritisk syke pasienter med hyperglysemi for å kontrollere
blodglukosenivåer. Forskjellige kilder for insulin blir anvendt, avhengig av pasientens
behov. Kommersielle insulinprepareringer kan bli klassifisert avhengig av deres
20
aktivitetsvarighet (se f.eks. DeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and
Pharmacokinetics. I Ellenberg og Rifkin’s Diabetes Mellitus (sidene 481-500) McGrawHill Professional). For eksempel, blir insulin tilveiebrakt I hurtigvirkende formuleringer,
i tillegg til intermediære- eller lengevirkende formuleringer, idet de siste to
klassifiseringene blir referert til heri som basaltvirkende insuliner. Hurtigvirkende
25
former har en hurtig begynnelse, typisk utvisende topp insulinnivåer i løpet av 2-3
timer eller mindre, og ikke mer enn fire timer. Følgelig blir hurtigvirkende former av
insulin anvendt i prandial glukoseregulering. Andre former for insulin inkluderer
intermediærtvirkende, som når topp insulinkonsentrasjon ved omtrent 4-12 timer
etter subkutan administrering, og lengevirkende insuliner som når en relativt moderat
30
topp, og som har en maksimal virkningsvarighet på 20-30 timer. De intermediære- og
lengevirkende formene består ofte av amorfe og/eller krystallinske
insulinprepareringer, og blir hovedsakelig anvendt i basale terapier.
Målet med prandial administrering av hurtigvirkende insulinsammensetninger er å
35
oppnå et stabilt blodglukosenivå over tid, ved parenteral administrering av
hurtigvirkende insulin før, i løpet av, eller rett etter tidspunkt for måltidet. På denne
måten blir blodnivåene av insulin temporært forhøyet for å (a) stenge den hepatiske
45
glukoseproduksjon, og (b) øke glukoseopptak; for dermed å opprettholde glykemisk
kontroll i løpet av forhøyning i blodglukose assosiert med fordøying av måltidet.
Rekombinant human insulin (f.esk. Humulin£ R insulin) blir anvendt for
5
selvadministrering ved injeksjon før tidspunkt for måltid. Derimot må rekombinant
humant insulin bli dosert ved injeksjon omtrent en halv time eller mer før tidspunkt for
måltidet, for å forsikre at en økning i blodglukose ikke oppstår uten motstand av
eksogene insulinnivåer. En av grunnene til den sakte absorpsjonen av rekombinant
humant insulin, er på grunn av at insulin danner heksamere komplekser i nærvær av
10
sinkioner både in vivo og in vitro. Slike heksamere sinkinneholdende komplekser er
mer stabile enn monomere insulinmanglende sink. Ved subkutan injeksjon må disse
insulinheksamerene dissosiere i mindre dimerer eller monomerer før de kan bli
absorbert gjennom kapillære sjikt, og passere inn i den systemiske sirkulasjonen.
Dissosiasjonen av heksamerer til dimerer og monomerer er konsentrasjonsavhengig,
15
oppstår kun ved lavere konsentrasjoner når insulin diffunderer fra injeksjonssetet.
Følgelig eksisterer det et lokalt insulindepot ved injeksjonssetet etter subkutan
administrering av insulin, som tilveiebringer en innledende høy konsentrasjon av
heksamerisk insulin ved injeksjonssetet som ikke kan bli absorbert, helt til
insulinkonsentrasjonen reduseres (Soeborg et al., (2009) Eur. J. Pharm. Sci. 36:78-
20
90). Når insulinet sakte diffunderer fra injeksjonssetet, reduseres
insulinkonsentrasjonen når avstanden fra injeksjonssetet øker, og resulterer i
dissosiasjon av heksamerene, og absorpsjon av insulinmonomerer og dimerer.
Følgelig, til tross for at utbredelsen av heksamere insulinkomplekser oppstår naturlig i
kroppen, kan det ta en viss tid å oppstå, og dette forsinker den systemiske
25
tilgjengeligheten av insulin. Videre, på grunn av denne konsentrasjonsavhengige
absorpsjonen, høyere insulinkonsentrasjoner og høyere doser, og blir absorbert
saktere (Soeborg et al., (2009) Eur. J. Pharm. Sci. 36:78-90).
På grunn av at insulin i monomer form blir absorbert hurtigere, mens insuliner i
30
heksamer tilstand er mer stabile, har hurtigvirkende analoge former av insulin blitt
utviklet som utviser en hurtigere dissosiasjon fra heksamer til monomer ved subkutan
administrering. Slike insuliner blir modifisert, så som ved aminosyreutveksling, for å
øke dissosiasjonsraten, for derved å tilveiebringe hurtigere farmakodynamisk aktivitet
ved injeksjon. Som beskrevet i del C, inkluderer hurtigvirkende analoge former av
35
insulin, men er ikke begrenset til, insulin glulisin, insulin aspartat, og insulin lispro.
46
Hurtigvirkende former av insuliner, inkludert hurtigvirkende analoger, har en forsinket
absorpsjon og virkning, og derfor nærmer seg ikke endogent insulin, som har en tidlig
fase som oppstår omtrent 10 minutter etter spising. Følgelig, virker slike formuleringer
ikke hurtig nok til å stenge av hepatisk glukoseproduksjon som oppstår rett etter
5
denne første fasen av insulinfrigjøring. På grunn av dette, må selv de hurtigvirkende
insulinanalogprepareringene bli gitt før måltider for å oppnå noen som helst mulighet
for ønsket glykemisk kontroll. Til tross for at det er lettere å vurdere tidspunkt for
spising innenfor 15 minutter enn innenfor 30-60 minutter som er krevd for vanlig
insulin, er det en risiko for at en pasient kan spise for tidlig eller for sent for å
10
tilveiebringe den beste blodglukosekontrollen.
Videre, én av hovedbieffektene for behandling med en hvilken som helst insulinterapi,
inkludert hurtigvirkende insulinterapier, er hypoglykemi. Hypoglykemi er definert som
lav blodglukose, og er assosiert med forskjellige morbiditeter som kan variere fra sult
15
til mer brysomme symptomer som tremor, svetting, forvirring, eller helt til anfall,
koma og død. Hypoglykemi kan oppstå fra mangelen på å spise nok, hoppe over
måltider, mer trening enn vanlig, eller inntak av for mye insulin, eller anvendelse av et
prandial insulinpreparat som har en uhensiktsmessig lang eksponeringsvarighet og
virkning. For eksempel, på grunn av at mange hurtigvirkende insulinterapier må bli
20
gitt før et måltid, er det en risiko for at en pasient kan gjennomgå eller hoppe over
måltidet, som fører til hypoglykemi. I tillegg, ved administrering av et hurtigvirkende
insulin, forblir seruminsulinnivåer og insulinvirkningen (målt, f.esk. som
glukoseinfusjonsrate (GIR)) typisk blir forhøyede etter at den prandiale
glukosebelastningen har avtatt, som truer hypoglykemi. Forsøk på å bedre kontrollere
25
topp glukosebelastninger ved økende insulindose, øker videre denne faren. Også, på
grunn av at postprandial hypoglykemi er et vanlig resultat ved insulinterapi, forårsaker
det ofte eller nødvendiggjør at pasienten spiser snacks mellom måltidene. Dette bidrar
til vektøkning og fedme, ofte assosiert med insulinterapier.
30
2. Farmakodynamikko g farmakokinetikk til en superhurtigvirkende
insulinsammensetning
Det er oppdaget heri at kombinasjonen av et hurtigvirkende insulin og et
hyaluronandegraderende enzym resulterer i en forøket absorpsjon av hurtigvirkende
insulin, som resulterer i en mer hurtig økning i seruminsulinkonsentrasjon (dvs. mer
35
hurtig absorpsjonsrate) og farmakologisk virkning. Følgelig resulterer kombinasjonen
av et hurtigvirkende insulin og et hyaluronandegraderende enzym i en
superhurtigvirkende insulinsammensetning, som har evne til å oppnå en hurtig økning
47
i blodglukose etter parenteral (dvs. ikke-intravenøs) bolusadministrering (så som
f.eks. parenteral administrering via subkutan (SC), intramuskulær (IM),
intraperitoneal (IP), eller intradermal ID) veier for administrering.
5
Uten å være bundet av noen teori, kan kombinasjonen av et hurtigvirkende insulin og
et hyaluronandegraderende enzym resultere i forøket absorpsjon av det
hurtigvirkende insulinet, sammenliknet med når insulinet blir administrert alene,
grunnet forandringen i dispersjonsmekanismen etter subkutan administrering. Typisk
tilveiebringer tilstedeværelse av høy molekylærvekt hyaluronan en barriere for
10
strømning av bulkfluid etter subkutan injeksjon av insulin alene. Følgelig, som
diskutert ovenfor, blir insulinet dispergert fra injeksjonssetet ved diffusjonsmedierte
mekanismer. Når insulinet dispergerer fra injeksjonssetet, reduseres konsentrasjonen,
letter dissosiasjonen av insulinheksamerene til monomerer og dimerer, som er små
nok til å bli absorbert gjennom de kapillære sjiktene. Følgelig, for å bli absorbert etter
15
subkutan injeksjon, må insulinet først sakte dispergere fra injeksjonssetet for å danne
de tilstrekkelig lave insulinkonsentrasjonene for å lette dissosiasjon og, derfor,
absorpsjon. Derimot, når insulinet blir koadministrert med et hyaluronandegraderende
enzym, så som, f.eks. en oppløselig hyaluronidase, blir hyaluronan degradert av
hyaluronandegraderende enzym, som muliggjør strømningen av bulkfluid, som blir
20
hurtig dispergert proporsjonalt med trykkgradienten (eller hydraulisk ledningsevne).
Ved fysiologisk trykk, danner f.eks. en oppløselig hyaluronidase så som rHuPH20 en
omtrent 20-ganger økning i hydraulisk ledningsevne. Følgelig, når koadministrert med
et hyaluronandegraderende enzym, blir insulinet hurtig dispergert på en
konveksjonsmediert måte etter degradering av hyaluronanbarrieren. Denne hurtige
25
absorpsjonen av insulin når koadministrert subkutant med hyaluronandegraderende
enzym, kan resultere i forbedrede farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaper
til insulinet, sammenliknet med når insulinet blir administrert alene.
For eksempel, som tilveiebrakt heri, blir den superhurtigvirkende
30
insulinsammensetningen absorbert hurtigere som demonstrert ved reduksjonen av
tmaks, og forøket Cmaks og kumulativ systemisk insulineksponering som er spesielt
uttralt over de første 40 minuttene. Denne forbedrede farmakokinetikkprofilen er
reflektert i en forkortet begynnelse og varighet av insulineffekten. Dette kan bli
eksemplifisert ved farmakodynamiske mål, så som ved glukoseinfusjonsrater i
35
euglykemiske clamp-eksperimenter så som beskrevet i eksempel 1. Følgelig blir en
superhurtigvirkende insulinsammensetning mer hurtig absorbert enn det
korresponderende hurtigvirkende insulinet. Det er interessant, som angitt i figurene 1
48
og 2, at de superhurtigvirkende insulinsammensetningene inneholdende et
hyaluronandegraderende enzym utviser en akselerert absorpsjon av både
hurtigvirkende vanlige insuliner, og hurtigvirkende insulinanaloger som resulterer i
liknende farmakodynamiske (PD) og farmakokinetiske (PK) profiler, til tross for at den
5
hurtigvirkende insulinanalogen er vesentlig hurtigere enn den hurtigvirkende vanlige
insulinet uten hyaluronandegraderende enzym. Følgelig utviser superhurtigvirkende
insulinsammensetninger liknende farmakodynamiske PD- og farmakokinetiske PKprofiler, uansett om en hurtigvirkende insulinanalog eller hurtigvirkende vanlig insulin
blir inkludert i sammensetningen. Denne likheten er spesielt uttalt i de første 40-60
10
minuttene etter administrering (se f.eks. figurene 1 og 2). Følgelig, en ytterligere
fordel med den superhurtigvirkende insulinsammensetningen er evnen til å oppnå
sammenliknbare farmakokinetiske og farmakodynamiske profiler i de første 40-60
minuttene etter administrering, uten hensyn til om det hurtigvirkende insulinet er et
hurtigvirkende vanlig insulin (f.eks. Humulin£ R insulin) eller en hurtigvirkende analog
15
(så som Humalog£ insulin lispro, Novalog£ insulin aspart eller Apidra £ insulin
glulisine). I noen tilfeller, så som når det hurtigvirkende insulinet i den
superhurtigvirkende insulinsammensetningen er en hurtigvirkende insulinanalog,
istedenfor et vanlig insulin, blir absorpsjonen av det hurtigvirkende insulinet når
administrert med hyaluronandegraderende enzym (dvs. som en superhurtigvirkende
20
insulinsammensetning) hurtigere enn det hurtigste av det hurtigvirkende insulinet
alene. Dette kan manifestere seg selv som f.eks. redusert tmaks og forøket kumulativ
systemisk insulineksponering, spesielt over de første 40 minuttene.
Farmakokinetikken til den superhurtigvirkende insulinsammensetningen er forskjellig
25
fra det korresponderende hurtigvirkende insulinet i flere viktige aspekter. For det
første blir profilen av insulinblodkonsentrasjonen som en funksjon av tid endret til ett
med høyere konsentrasjoner ved tidligere tidspunkter (se f.eks. figur 1). Denne raten
av fremkost av insulin inn i den systemiske sirkulasjonen er beskrevet som
absorpsjonsrate, som skjelnet fra raten av fjerning fra den systemiske sirkulasjonen,
30
som er beskrevet som fjerningsraten. Superhurtigvirkende insulinsammensetninger
har en høyere absorpsjonsrate, som resulterer i høyere tidlig eksponering, enn det
korresponderende hurtigvirkende insulinet. Videre, på grunn av at det
hyaluronandegraderende enzymet er forbigående, og lokalt virkende på
administreringssetet, er fjerningsraten av den superhurtigvirkende
35
insulinsammensetningen og dets potens når i den systemiske sirkulasjonen ikke
materielt forskjellig fra det korresponderende hurtigvirkende insulinet. Ved økning av
absorpsjonsraten med opprettholdelse av samme fjerningsrate, blir den maksimale
49
blodkonsentrasjon av insulin (Cmaks) også forøket for en superhurtigvirkende
insulinsammensetning, i forhold til korresponderende hurtigvirkende insulin. Følgelig
er den samme totale mengden av systemisk tilgjengelig insulin distribuert forskjellig,
som en funksjon av tiden for en superhurtigvirkende insulinsammensetning i forhold til
5
det korresponderende hurtigvirkende insulinet, slik at, etter parenteral administrering
av en superhurtigvirkende insulinsammensetning, oppstår en høyere fraksjon av den
kumulative systemiske insulineksponeringen over tidligere tidspunkter, og en mindre
fraksjon av den kumulative systemiske insulineksponeringen oppstår over senere
tidspunkter, sammenliknet med et insulin som bare er hurtigvirkende. Dette skiftet i
10
absorpsjonsrate muliggjør at den superhurtigvirkende insulinsammensetningen
etterlikner nærmere kroppens endogene insulinrespons til toppen i blodglukosenivåer
som oppstår etter konsumering av et måltid.
Den andre og uavhengige farmakokinetikkparameteren, fraksjonen av administrert
15
dose som når den systemiske sirkulasjonen, kan også være forskjellig fra den
superhurtigvirkende insulinsammensetningen i forhold til dets korresponderende
hurtigvirkende insulin. For visse hurtigvirkende insuliner, blir hovedmajoriteten av den
administrerte dosen systemisk biotilgjengelig, og det kan derfor kun være en
voksende økning for den korresponderende superhurtigvirkende sammensetningen.
20
Derimot, for andre hurtigvirkende insuliner, så som vanlig insulin (f.eks. Humulin£ R
insulin), kan økningen i biotilgjengelighet være signifikant. Den relative
biotilgjengeligheten av en superhurtigvirkende insulinsammensetning som beskrevet
heri, til dets korresponderende hurtigvirkende insulin er beskrevet ved forholdet til
den totale systemiske eksponeringen (AUC0-uendelig), til de to sammensetningene følger
25
identiske ikke-IV parenterale administreringer.
Et ytterligere viktig aspekt av de superhurtigvirkende insulinsammensetningene
vedrører evnen til å oppnå forbedring i farmakodynamiske parametere som måler den
fysiologiske responsen til systemisk tilgjengelig insulin. På grunn av at de
30
superhurtigvirkende insulinsammensetningene beskrevet heri har den samme
farmakologiske potensen for å nå den systemiske sirkulasjonen som korresponderende
hurtigvirkende insulin, tilveiebrakte de forbedrede farmakokinetiske profilene til
superhurtigvirkende insulinsammensetninger (som diskutert ovenfor) resulterte i
fordelaktige forandringer i farmakodynamiske parametere som måler den fysiologiske
35
responsen til systemisk tilgjengelig insulin. For eksempel glukoseinfusjonsraten (GIR)
målt når insulin blir administrert til individer i en euglykemisk clamp-prosedyre
representerer et farmakodynamisk parameter, idet det måler raten av intravenøs
50
glukoseadministrering som en funksjon av tiden nødvendig for å opprettholde en stabil
målblodglukosekonsentrasjon. I kraft av den farmakokinetiske fordelen med høyere
absorpsjonsrate oppnådd av en superhurtigvirkende insulinsammensetning,
sammenliknet med korresponderende hurtigvirkende insulin, har den
5
superhurtigvirkende insulinsammensetningen evne til å skifte GIR-profiler (et mål på
den fysiologiske responsen til insulin) mot høyere infusjonsrater (dvs. høyere
fysiologisk respons) ved tidligere tidspunkter. For de superhurtigvirkende
insulinsammensetningene hvor det også er en betydelig økning i relativ systemisk
biotilgjengelighet, kan en ytterligere økning i GIR-responsen bli observert, til tross for
10
at den totale GIR er en funksjon av både distribusjonen av insulinnivåer som en
funksjon av tiden, og av den systemiske dosen administrert.
De farmakokinetiske og farmakodynamiske fordeler tilveiebrakt av de
superhurtigvirkende insulinsammensetningene beskrevet heri, har ført til et antall
15
viktige anvendelser. For det første, ved å skifte PK- og PD-responser til tidligere
tidspunkter, kan en mer naturlig insulinrespons for den superhurtigvirkende
sammensetningen bli produsert for å kontrollere postprandial glukosenivåer enn er
mulig med den korresponderende hurtigvirkende insulinsammensetningen alene.
Kroppens naturlige insulinrespons inkluderer både (a) et innledende utbrudd av insulin
20
i løpet av de første 10-15 minuttene som signaliserer avbrudd av den hepatiske
glukosefrigjøringen, og tilveiebringing av minimale glukoseblodkonsentrasjoner
mellom måltidene, og (b) en total insulineksponering over omtrent 2 timer, som er
matchet til karbohydratsammensetningen til måltidet ved justering av insulin frigjort
inn i den systemiske sirkulasjonen som en funksjon av glukosenivåer gjennom et
25
komplekst spill av hormonale responser, inkludert både betacelleresponser til
systemisk metabolitt (hovedsakelig glukose) nivåer, og inkretinhormoner som
potensierer insulinsekresjonen når tarmkanalen senser tilstedeværelse av
næringsmaterialer. Ved å ha en høyere andel av den systemisk tilgjengelige
insulineksponeringen oppstående over de første 10-15 minuttene, har den
30
superhurtigvirkende insulinsammensetningen en bedre evne til å signalisere
avbrytning av den hepatiske glukosefrigjøringen (som kroppens endogene prandiale
insulinrespons) sammenliknet med den korresponderende hurtigvirkende
insulinsammensetningen. Videre har de superhurtigvirkende insulinsammensetningene
beskrevet heri også bedre evne til å etterlikne den naturlige kontrollen av postprandial
35
glukose, ved å ha en høyere fraksjon av systemisk tilgjengelig insulineksponering over
de første 2 timene, og en tilsvarende reduksjon i insulineksponering etter 2 timer.
Forhøyede insulinnivåer som oppstår mer enn 2 timer etter administrering, kan
51
resultere i en øket glukosemetabolisme når postprandialt glukoseabsorpsjon er
fullstendig, en situasjon som fører til lave blodglukosenivåer eller hypoglykemi. I
tillegg, på grunn av at de superhurtigvirkende insulinsammensetningene har en
begynnende virkning som likner naturlig insulinrespons, kan disse sammensetningene
5
bli administrert ved tidspunkt for måltid, mens mange hurtigvirkende
insulinsammensetninger (f.eks. Humulin£ R insulin) blir administrert 30-60 minutter
før et måltid, som introduserer en risiko for hypoglykemi, dersom individet forsinker
eller hopper over det antatte måltidet. Følgelig, gjennom kombinasjonen av øket
insulineksponering over de første 15 minuttene, og redusert insulineksponering etter 2
10
timer, har de superhurtigvirkende insulinsammensetningene en bedre evne til å
kontrollere postprandiale glukosenivåer enn de korresponderende hurtigvirkende
insulinsammensetningene.
Hurtigvirkende insuliner blir typisk administrert over en rekke doser som bestemt av
15
legen eller annet kvalifisert helsepersonell, avhengig av mange faktorer som
inkluderer de virkelige glukosenivåene, individet, type av diabetes, og
sammensetningen av måltidet. Typisk kan slike hurtigvirkende insulindoser være i
området på mellom 0,05 enheter/kg til 2 enheter/kg. Grunnet deres farmakokinetikk
og farmakodynamikk, kan superhurtigvirkende insulinsammensetninger bli
20
administrert ved lavere doser, sammenliknet med et hurtigvirkende insulin
administrert i fravær av et hyaluronandegraderende enzym. Graden hvorved mengden
av et hurtigvirkende insulin kan bli redusert ved administrering derav, som en
superhurtigvirkende insulinsammensetning varierer, avhengig av, f.eks., type diabetes
som pasienten har. Typisk er reduksjon i mengde av hurtigvirkende insulin
25
administrert til type 2 diabetespasienter når administrert som en superhurtigvirkende
insulinsammensetning, høyere enn reduksjonen i mengden av hurtigvirkende insulin
administrert til type 1 diabetespasienter når administrert som en superhurtigvirkende
insulinsammensetning. F.eks. i tilfeller hvor en type 1 diabetespasient og type 2
diabetespasient hver blir administrert 0,20 U/kg hurtigvirkende insulin for å
30
kontrollere postprandial glukosenivåer, kan type 1 diabetespasienten bli administrert
0,15 U/kg hurtigvirkende insulin i en superhurtigvirkende insulinsammensetning for å
oppnå den samme eller bedre glykemisk kontroll, og type 2 diabetespasienten kan bli
administrert 0,10 U/kg hurtigvirkende insulin i en superhurtigvirkende
insulinsammensetning for å oppnå den samme eller bedre glykemisk kontroll. Følgelig,
35
i noen eksempler, er det betraktet heri at mengden av et hurtigvirkende insulin som
blir administrert til en type 2 diabetespasient for å oppnå glykemisk kontroll, kan bli
redusert med, f.eks. 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %,
52
55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, eller mer når administrert med et
hyaluronandegraderende enzym som en superhurtigvirkende insulinsammensetning
sammenliknet med mengden som er nødvendig for glykemisk kontroll eller når
administrert uten et hyaluronandegraderende enzym, og at mengden av et
5
hurtigvirkende insulin som blir administrert til en type 1 diabetespasient for å oppnå
glykemisk kontroll kan bli redusert med, f.eks., 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %,
35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, eller mer når administrert med
et hyaluronandegraderende enzym som en superhurtigvirkende insulinsammensetning
sammenliknet med mengden som er nødvendig for glykemisk kontroll når administrert
10
uten et hyaluronandegraderende enzym.
Uten å være bundet av noen teori, er den høyere reduksjonen i hurtigvirkende
insulindose for type 2 diabetespasienter sammenliknet med type 1 diabetespasienter
når insulin blir administrert med et hyaluronandegraderende enzym som en
15
superhurtigvirkende insulinsammensetning, en refleksjon av de forskjellige
postprandiale glykemiske profilene til type 1 og type 2 pasienter, og evnen som det
superhurtigvirkende insulinet har til å nærmere etterlikne den naturlige førstefase
insulinfrigjøringen i friske individer. Type 2 diabetes utvikles som et resultat av
redusert betacellefunksjon, insulinresistens og/eller redusert insulinsekresjon. Disse
20
pasientene mangler tidlig fase insulinfrigjøring som oppstår i løpet av minutter etter
en glukoseeksponering, så som et måltid, men som fortsatt frigjør insulin sakte over
tid. I kontrast til dette, produserer type 1 diabetespasienter ikke noe insulin, og
mangler følgelig både den første og andre fasen av insulinfrigjøringen, idet den siste
er vedvarende i friske individer, helt til glykemisk kontroll blir oppnådd. Følgelig, på
25
grunn av at type 2 diabetes generelt kun krever insulinterapi primært for å behandle
postprandial hyperglykemi, er et problem som må løses i prandial insulinterapi i slike
diabetiske pasienter, forekomsten av hypoglykemi. Hypoglykemi kan resultere dersom
individets egen forsinkede og/eller basale insulinsekresjon er koblet med den
glukosereduserende effekten til eventuell overskudd eksogen insulin som er igjen etter
30
den prandiale toppen er blitt redusert. Over tid, gjentatt forekomst av slike
postprandiale hypoglykemiske eposider kan bidra til vektøkning og fedme.
Farmakokinetikk og farmakodynamikk til hurtigvirkende insuliner er slik at dosen som
er nødvendig for å oppnå en hensiktsmessig konsentrasjon av insulin i blodet, hurtig
nok til å redusere glukosenivåene rett etter fordøyelse av et måltid (dvs. en dose som
35
dekker den naturlige tidlig fase insulinfrigjøringen) er en som resulterer i overskudd
insulinsirkulering i blodet etter fordøyelsen, og redusering av de postprandiale
glukosenivåene. Derfor mottar type 2 diabetespasienter insulindoser som dekker mer
53
enn bare tidlig fase insulinfrigjøring. Superhurtigvirkende insulinsammensetninger
tilveiebrakt heri etterlikner nærmere den endogene insulinresponsen. Følgelig kan type
2 diabetikere bli administrert en hurtigvirkende insulinsammensetning i en dose som
kun dekker førstefase insulinfrigjøring, mens type 1 diabetikere kan bli administrert en
5
superhurtigvirkende insulinsammensetning i en dose som dekker alle fasene av
insulinfrigjøringen.
Følgelig, en annen anvendelse av superhurtigvirkende insulinsammensetnigner
tilveiebrakt heri, er å redusere bivirkningene av vektøkning og fedme assosiert med
10
hurtigvirkende insulinterapi. Størrelsen på disse bivirkningene er omtrent, eller er
proporsjonal med dosen av insulin som blir administrert. Som diskutert ovenfor, kan
superhurtigvirkende insulinsammensetninger tilveiebringe ekvivalent glykemisk
kontroll fra lavere doser av hurtigvirkende insulin, som korresponderende
hurtigvirkende sammensetninger gjennom f.eks. en kombinasjon av høyere
15
biotilgjengelighet og høyere fraksjon av kumulativ systemisk insulineksponering over
de første 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5 eller 2 timene etter administrering. Til tross for at
type 1 og type 2 diabetespasienter kan oppleve vektøkning som et resultat av
insulinterapi, har pasienter med type 2 diabetes en spesiell risiko for vektøkning som
fører til fedme. Typie 2 diabetikere mangler første-fase insulinfrigjøring, men frigjør
20
fortsatt insulin sakte over tid. Som et resultat av dette, i de tidlige stadiene av
sykdommen, er type 2 diabetikernes endogene insulinnivåer for lave ved begynnelsen
av et måltid, og for høy etter fordøyelse av måltidet. I fravær av første-fase
insulinfrigjøring, mottar leveren ikke signalet som omfatter stopp av dannelse av
glukose. Leveren fortsetter å produsere glukose ved et tidspunkt når kroppen
25
begynner å produsere ny glukose gjennom fordøyelse av måltidet, som resulterer i
hyperglykemi. Mellom 2 og 3 timer etter et måltid, blir blodglukosen til en ubehandlet
diabetiker så forhøyet at pankreas mottar et signal til å utskille en stor mengde av
insulin. I en pasient med tidlig type 2 diabetes kan pankreas fortsatt respondere, og
utsliller denne store mengden av insulin. Dette oppstår ved tidspunkter når
30
fordøyelsen er nesten over, og blodglukosenivåene bør begynne å falle. Denne store
mengden av insulin har to skadelige effekter. Den første er at det innbefatter en
unødvendig belastning på den allerede belastede pankreas, som kan føre til hurtigere
ødeleggelse derav, og til slutt gjør at pankreas ikke har evnen til å produsere insulin.
For det andre kan for mye insulin etter fordøyelse bidra til vektøkning, som videre kan
35
forverre sykdomstilstanden. Når pasienter med type 2 diabetes blir administrert et
hurtigvirkende insulin for å kontrollere postprandial hyperglykemi, som diskutert
ovenfor, kan et overskudd av insulin forbli etter fordøyelsen. Følgelig kan type 2
54
diabetespasienter som mottar insulinterapi ha for mye insulin etter fordøyelsen, som
kan føre til hypoglykemi, og resultere i vektøkning. Administrering av
superhurtigvirkende insulinsammensetninger tilveiebrakt heri for å kontrollere
postprandial hyperglykemi, reduserer risikoen for vektøkning og fedme i
5
diabetespasienter. De superhurtigvirkende insulinsammensetningene kan inneholde
lavere doser av hurtigvirkende insulin.
For å oppnå glykemisk kontroll, kan hurtigvirkende insulin i superhurtigvirkende
insulinsammensetninger bli administrert ved 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %,
10
80 %, eller 90 %, av nivået som det hurtigvirkende insulinet ville måtte bli
administrert dersom det hyaluronandegraderende enzymet ikke var tilstede. Følgelig,
f.eks., er mengden av hurtigvirkende insulin administrert i en superhurtigvirkende
sammensetning, typisk, eller er omtrent 0,05 U/kg, 0,06 U/kg, 0,07 U/kg, 0,08 U/kg,
0,09 U/kg, 1,0 U/kg, 1,1 U/kg, 1,2 U/kg, 1,3 U/kg, 1,4 U/kg, 1,5 U/kg, 1,6 U/kg, 1,7
15
U/kg, 1,8 U/kg, 1,9 U/kg, eller 2,0 U/kg. I kraft av lavere doser kan
virkningsvarigheten av slike insuliner bli redusert for å minimalisere potensialet for
sen hypoglykemi som oppstår grunnet forhøyet plasmainsulinkonsentrasjon, som
vedvarer over flere timer. Følgelig, er en hurtigere begynnende virkning av den
superhurtigvirkende insulinsammensetningen, som nærmere etterlikner den endogene
20
insulintoppen av førstefase prandial insulinfrigjøringen, ventet å tilveiebringe kliniske
fordeler med hensyn til bedre glykemisk kontroll, og mindre vektøkning hos pasienter
med diabetes mellitus.
Videre, ved å tilveiebringe en forøket absorpsjonsrate, kan superhurtigvirkende
25
insulinsammensetninger beskrevet heri tilveiebringe en kortere feedback-syklus
mellom effekten av administrert insulin, og effekten på observerte glukosenivåer enn
de korresponderende hurtigvirkende insulinsammensetningene, og har derfor bedre
evne til å etterlikne den naturlige reguleringen av postprandiale glukosenivåer.
Følgelig, de modifiserte farmakokinetikkene til en superhurtigvirkende
30
insulinsammensetning kan også være gunstig for ytelsen til den eksisterende
“insulinpumpen”, og kontinuerlig glukoseregistrerings (GCM) teknologi. Ved å forkorte
tidspunktet mellom en postprandial insulinbolusinjeksjon og en systemisk glykemisk
respons, kan tettere kontroll av glukosenivåer fra gjentatte mindre subkutane
injeksjoner av insulin med GCM “lukke løkken” på en kombinert
35
insulinpumpe/glukoseregistreringsinnretning (dvs. lukket løkkesystem eller kunstig
pankreas).
55
De superhurtigvirkende insulinsammensetningene, enten tilveiebrakt som en enkelt
blanding, eller som separate prepareringer, av hurtigvirkende insulin og
hyaluronandegraderende enzym, kan inneholde ytterligere ingredienser for å
tilveiebringe ønskede fysiske eller kjemiske egenskaper. For eksempel kan en
5
injiserbar løsning inneholde én eller flere tonisitetsmodifiserende midler, for å
tilveiebringe en hensiktsmessig isoton løsning, og et vandig løsningsmiddel titrert til
naturlig pH med en syre eller base, og muligens med en pH-bufrende komponent.
Hurtigvirkende insulinformuleringer kan ofte inkludere Zn og et fenolantimikrobielt
konserveringsmiddel, så som m-kresol for å strukturelt stabilisere dem i en mer stabil
10
heksamer tilstand. Metallgelatorer, så som EDTA, kan bli anvendt for å justere
dissosiasjonsraten til disse heksamerene, og andre divalente metaller så som kalsium
kan være tilstede for å bufre gelaterende kapasitet. Hyaluronandegraderende enzymer
krever ofte ytterligere komponenter for å tilveiebringe fysisk og kjemisk stabilitet,
inkludert, men ikke begrenset til overflateaktive midler, oksygenoppfangere, salter,
15
aminosyrer og polyalkoholer.
Superhurtigvirkende insulinsammensetninger kan være tilstede som et sett av to
separate beholdere, ett inneholdende en hurtigvirkende insulinsammensetning, og et
annet inneholdende hyaluronandegraderende enzymsammensetning, for sekvensiell (i
20
en hvilken som helst rekkefølge) eller samtidig koadministrering; eller som et sett
inneholdende en enkelt beholder inneholdende en blanding av en hurtigvirkende
insulinsammensetning og en hyaluronandegraderende enzymsammensetning. Dersom
det hurtigvirkende insulinet og hyaluronandegraderende enzym blir koadministrert,
kan nevnte koadministrering være sekvensiell i en hvilken som helst rekkefølge (f.eks.
25
blir det hyaluronandegraderende enzymet administrert før det hurtigvirkende
insulinet, hvorved det hyaluronandegraderende enzymet degraderer hyaluronan ved
injeksjonssetet før administrering av hurtigvirkende insulin); eller koadministrering av
hurtigvirkende insulin og hyaluronandegraderende enzym kan være samtidig. Den
hurtigvirkende insulinsammensetningen og hyaluronandegraderende
30
enzymsammensetninger kan bli formulert (sammen eller separat) som et fast stoff for
injeksjon etter gjenoppretting med et hensiktsmessig fortyningsmiddel, som
injiserbare løsninger, eller som injiserbare suspensjoner.
Følgende seksjoner beskriver eksempelvise hurtigvirkende insuliner og oppløselige
35
hyaluronandegraderende enzymer anvendt i de superhurtigvirkende
insulinsammensetningene beskrevet heri, fremgangsmåter for fremstilling derav, og
56
anvendelser derav, for å behandle sykdommer og tilstander hvor for tiden
hurtigvirkende insuliner blir anvendt.
C. Insulinpolypeptider og formuleringer
5
Insulin er et polypeptid bestående av 51 aminosyreresidier som har 5808 daltons i
molekylvekt. Det blir produsert i betacelle Langerhanske øyer i pankreas. Et
eksempelvis humant insulin blir translatert som et 110 aminosyreforløperpolypeptid,
preproinsulin (SEKV. ID nr. 101), inneholdende et 24 aminoyresignalpeptid til ER,
signalsekvensen blir spaltet, resulterende i proinsulin (SEKV. ID nr. 102).
10
Proinsulinmolekylet blir deretter omdannet til et modent insulin ved virkningen av de
proteolytiske enzymene, kjent som prohormonkonvertaser (PC1 og PC2), og ved
virkningene til eksoproteasekarboksypeptidase E. Dette resulterer i fjerning av fire
basiske aminosyreresidier, og den gjenværende 31 aminosyre C-peptid eller koblende
kjeden (korresponderende med aminosyreresidiene 57 til 87 av
15
preproinsulinpolypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 101). Det resulterende insulinet
inneholder en 21 aminosyre A-kjede (korresponderende med aminosyreresidiene 90 til
110 av proinsulinpolypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 102) og en 30 aminosyre B-kjede
(korresponderende til aminosyreresidiene 1 til 30 av proinsulinpolypeptidet angitt i
SEKV. ID nr. 102), som blir kryssbundet med disulfidbindinger. Typisk inneholder
20
modent insulin tre disulfidbroer: én mellom posisjon 7 av A-kjeden og posisjon 7 av Bkjeden, en annen mellom posisjon 20 av A-kjeden og posisjon 19 av B-kjeden, og en
tredje mellom posisjonene 6 og 11 i A-kjeden. Sekvensen av A-kjeden til et modent
insulin er angitt i SEKV. ID nr. 103, og sekvensen til B-kjeden er angitt i SEKV. ID nr.
104.
25
Referanse til insulin inkluderer preproinsulin, proinsulin og insulinpolypeptider i
enkeltkjede- eller to-kjedeformer, forkortede former derav som har aktivitet, og
inkluderer allele og spesiesvarianter, varianter kodet av spleisevarianter og andre
varianter, så som insulinanaloger eller andre derivatiserte former, inkludert
30
polypeptider som har minst 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80
%, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, eller mer sekvensidentitet med
forløperpolypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 101, eller den modne formen derav, dersom
insulin bindes til den humane insulinreseptoren for å initiere en signaliseringskaskade
som resulterer i en økning av glukoseopptak og lagring og/eller en reduksjon av
35
endogen glukoseproduksjon. For eksempel inkluderer insuliner spesiesvarianter av
insulin. Dette inkluderer, men er ikke begrenset til, insuliner avledet fra bovin (angitt i
SEKV. ID nr. 133) og gris (SEKV. ID nr. 123). Bovint insulin er forskjellig fra humant
57
insulin ved aminosyrene 8 og 10 av A-kjeden, og aminosyren 30 i B-kjeden.
Porcininsulin kun forskjellig fra human insulin ved aminosyre 30 i B-kjeden, hvor, som
den bovine sekvensen, det er en alaninsubstitusjon istedenfor treonin. Andre
eksempelvise spesiesvarianter av insulin er angitt i hvilke som helst av SEKV. ID nr.
5
105-146. Også inkludert blant varianter av insulin er insulinanaloger som inneholder
én eller flere aminosyremodifikasjoner sammenliknet med et humant insulin angitt i
SEKV. ID nr. 103 og 104 (A- og B-kjedene). Eksempelvise insulinanaloger (A- og Bkjeder), inkludert hurtigvirkende og lengre-virkende analogeformer, er angitt i SEKV.
ID nr. 147-165, 182-184). For eksempel inkluderer insulinanaloger, men er ikke
10
begrenset til, glulisin (LysB3, GluB29, angitt i SEKV. ID nr. 103 (A-kjede) og SEKV. ID
nr. 149 (B-kjede)), HMR-1 153 (LysB3, IleB28, angitt i SEKV. ID nr. 103 (A-kjede) og
SEKV. ID nr. 182 (B-kjede)), HMR-1423 (GlyA21, HisB31, HisB32, angitt i SEKV. ID
nr. 183 (A-kjede) og SEKV. ID nr. 184 (B-kjede)), insulin aspart (AspB28, angitt i
SEKV. ID nr. 103 (A-kjede) og SEKV. ID nr. 147 (B-kjede)), og insulin lispro (LysB28,
15
ProB29, angitt i SEKV. ID nr. 103 (A-kjede) og SEKV. ID nr. 148 (B-kjede)). I hvert
tilfelle ovenfor, er nomenklaturen til analogene basert på en beskrivelse av
aminosyresubstitusjonen ved spesifikke posisjoner på A- eller B-kjeden av insulin,
nummerert fra den N-terminale enden av kjeden, hvor det gjenværende av sekvensen
er det til naturlig humant insulin.
20
Hvilke som helst av overnevnte insulinpolypeptider inkluderer de som blir produsert av
pankreas fra en hvilken som helst art, så som et menneske, og som også inkluderer
insuliner som blir produsert syntetisk eller ved anvendelse av rekombinante teknikker.
For eksempel, som beskrevet andre steder heri, kan insulin bli produsert biosyntetisk
25
ved uttrykking av syntetiske gener for A- og B-kjedene av insulin, ved å uttrykke hele
proinsulinet og eksponering derav for hensiktsmessige enzymatiske og kjemiske
metoder for å danne et modent insulin, eller ved uttrykking av A- og B-kjedene koblet
av et linkerpeptid (se f.eks. DeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and
Pharmacokinetics. In Ellenberg og Rifkin’s Duabetes Mellitus (sidene 481-500)
30
McGraw-Hill Professional).
Insuliner inkluderer også monomere og oligomere former, så som heksamere former.
Insulin kan eksistere som en monomer når det sirkulerer i plasma, og det bindes også
til dets reseptor i en monomer form. Insulin har derimot en tilbøyelighet til
35
selvassosiering i dimerer, og i nærvær av metallioner så som Zn2+ kan det lett
assosiere i strukturer med høyere orden, så som heksamerer. Det er to symmetriske
høyaffinitetsbindingsseter for Zn2+, til tross for at andre svakere sinkbindingsseter
58
også er blitt rapportert (se f.eks. DeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and
Pharmacokinetics. I Ellenberg og Rifkin’s Diabetes Mellitus (sidene 481-500) McGrawHill Professional). Selvassosiasjon er viktig for stabiliteten av molekylet for å unngå
kjemisk degradering og fysisk denaturering. Følgelig, i lagringsvesikler i pankreas
5
betaceller eksisterer insulin som en heksamer. Ved frigjøring inn i det ekstracellulære
rommet er det derimot antatt at insulinheksamerene kan oppleve en forandring i pH til
mer nøytrale betingelser, og sinkioneinneholdende heksamerer blir fortynnet, som
destabiliserer heksameren. Det kan være andre grunner som bidrar til
destabiliseringen av insulinheksameren i det ekstracellulære rommet. Insulin blir
10
følgelig hovedsakelig funnet i blodet som en monomer. For å dra nytte av
stabiliseringseffektene, inneholder de fleste kommersielle formuleringene av insulin
sinkioner i tilstrekkelige mengder for å fremme selvassosiering heksamerer. Den
heksamere strukturen reduserer derimot absorpsjojnsraten av disse formuleringene
ved subkutan administrering.
15
Som diskutert i del B, blir insulin anvendt som et terapeutisk middel for glykemisk
kontroll, så som i diabetespasienter. Det er forskjellige typer av insulinformuleringer
som eksisterer, avhengig av om insulinet blir administrert for å kontrollere glukse for
basal terapi, for prandial terapi, eller for en kombinasjon derav. Insulinformuleringer
20
kan bli tilveiebrakt sakte som hurtigvirkende formuleringer, kun som basalvirkende
formuleringer (dvs. øyeblikkelig-virkende og/eller lenge-virkende former), eller som
blandinger derav (se f.eks. tabell 2). Typisk inneholder blandinger et hurtigvirkende
og et intermediært- eller lenge-virkende insulin. For eksempel kan hurtigvirkende
insuliner bli kombinert med et NPH-insulin (et eksempelvist intermediært-virkende
25
insulin som diskutert nedenfor) i forskjellige blandingsforhold som inkluderer 10:90,
20:80, 30:70, 40:60 og 50:50. Slike forblandede prepareringer kan redusere antall
daglige insulininjeksjoner ved å hensiktsmessig tilveiebringe både måltidsrelaterte og
basale insulinbehov i en enkelt formulering. Følgelig, inkluderer de
superhurtigvirkende insulinsammensetningsformuleringene beskrevet heri, de som
30
eventuelt kan tilveiebringe et basaltvirkende insulin.
Generelt inkluderer en hvilken som helst preparering av insulin et insulinpolypeptid
eller variant 8dvs. analog) derav, og er bare forskjellig i de andre substansene som
utgjør formuleringen. Det er derfor innholdet av formuleringen som kan influere på
35
virkningsvarigheten til forskjellige insulintyper. Eksempler på substanser inkludert i
insulinpreparatene, inkludere, men er ikke begrenset til, stabiliseringsmidler så som
sink, pH-buffer, et tonisitetsmodifiserende middel så som glyserin; et
59
konserverings/antimikrobielt middel så som m-kresol; og protamin eller annet
presipiterings- eller middel med kontrollert frigjøring. Videre, som tilveiebrakt heri,
kan insulinprepareringer også bli fremstilt inneholdende kalsium og en metallgelator
så som EDTA eller EGTA. Hvilke som helst én eller flere av overnevnte substanser kan
5
bli tilsatt til et insulinpolypeptid, så som i en superhurtigvirkende
insulinsammensetning. De spesifikke komponentene som blir tilsatt, og deres
mengder, influerer på type insulin, dets varighetsvirkning, dets absorpsjon og
biotilgjengelighet, og følgelig, applikasjon derav.
10
For eksempel, inneholder de fleste insulinpreparatene et metallion så som sink, i
formuleringen, som stabiliserer insulinet ved å fremme selvassosiering av molekylet.
Selvassosiering til heksamere former kan påvirke absorpsjonen av insulin ved
administrering. Følgelig tillater forholdet av slike stabiliseringsmidler, og tilsetning av
EDTA eller EGTA til insulin, ytterligere modulering og kontroll av absorpsjonen og
15
biotilgjengeligheten av insulin, f.eks., ved å influere på forekomsten av høyere ordens
struktur tilstede i polypeptidet. Generelt, vanlige insulinprepareringer som er
hurtigvirkende inneholdende sink i en mengde som er eller er omtrent 0,01-0,04
mg/100 enheter. Kjemiske studier har vist at oppløseligheten av insulin blir stort sett
bestemt av sinkinnholdet og naturen til bufferen som det blir suspendert i. Følgelig blir
20
noen lengre-virkende basale insulinformuleringer dannet ved presipitering av insulin
fra en acetatbuffer (istedenfor for fosfat) ved tilsetning av sink. Store krystaller av
insulin med høyt sinkinnhold, når samlet og resuspendert i en løsning av
natriumacetat-natriumklorid (pH 7,2 til 7,5), blir sakte absorbert etter subkutan
injeksjon, og utviser en virkning med lang varighet. Denne krystallprepareringen blir
25
betegnet utvidet insulinsinksuspensjon (ultralent insulin). Andre sinkinneholdende
insulinprepareringer inkluderer, for eksempel, semilentinsuliner (“prompt”
insulinsinksuspensjoner) og lentinsuliner (insulinsinksuspensjoner), som er
hovedsakelig forskjellige i sinkkonsentrasjonen som blir anvendt. Sinkinneholdende
insulinprepareringer inkluderer også de som er modifisert av protamin, så som NPH-
30
insulin.
I et annet eksempel kan et presipiteringsmiddel, så som protamin, bli tilsatt til et
insulinpolypeptid for å danne en mikrokrystallinsk suspensjon. Typisk har krystallinske
insuliner en forlenget virkningsvarighet sammenliknet med insuliner som ikke
35
eksisterer i krystallinsk form. En protaminsinkinsulin, når injisert subkutant i en vandig
suspensjon, oppløses kun sakte ved deponeringssete, og insulinet blir absorbert i
redusert rate. Protaminsinksuspensjoninsulin er stort sett blitt erstattet av
60
isofaninsulinsuspensjon, også kjent som NPH-insulin. Det er et modifisert
protaminsinkinsulinsuspensjon som er krystallinsk. Konsentrasjonene av insulin,
protamin og sink er slik arrangert at prepareringen har en begynnelse og en
virkningsvarighet som er mellomliggende mellom de til vanlig insulin og
5
protaminsinkinsulinsuspensjon.
Videre, influerer pH-differansene i preparatene også på type og egenskap av insulin.
De opprinnelige vanlige insulinpreparatene ble dannet ved en pH på 2,8 til 3,5, hvis
ikke ville de danne partikler ved høyere pH-områder. Sterkt rensede insulinpreparater
10
kan derimot bli dannet ved en rekke pH-verdier. Videre, bufring av
insulinprepareringen muliggjør at insulin blir dannet i en løsning over en rekke pH.
Typisk, et insulin som blir dannet ved nøytral pH har en høyere stabilitet enn de som
blir dannet ved sur pH. Følgelig blir de fleste insulinene formulert ved nøytral pH. En
unntagelse er insulin glargine, som blir tilveiebrakt som en kommersiell formulering
15
ved pH 4,0. I kraft av tilsetning av to argininer til den C-terminale enden av Bkjedene, blir det isoelektriske punktet til glargininsulin skiftet, og gjør det mer
oppløselig ved en sur pH. En ytterligere aminosyreforandring eksisterer i A-kjeden
(N21G) for å forebygge deaminering og dimerisering som er et resultat av en
syresensitiv asparagin. Sekvensen til A-kjeden av glargininsulin er angitt i SEKV. ID
20
nr. 150 og B-kjeden er angitt i SEKV. ID nr. 151. På grunn av at eksponering for
fysiologisk pH oppstår ved administrering, blir mikropresipitater dannet, som danner
glargin i likhet med et krystallinsk, lengevirkende insulin.
Tabell 2 nedenfor oppsummerer forskjellige typer av insulin, deres virkningsforløp, og
25
deres applikasjon.
Tabell 2: Typer av insuliner
Type
Merkenavn
Begynnelse
Topp
Varighet
Applikasjon
Hurtigvirkende:
Lispro
5-15
45-90
3-4 timer
Postprandial
insulinanaloger
(f.eks.
minutter
minutter
Humalog£),
Aspart
(f.eks.
NovoLog£),
Glulisin
glukosekontroll
61
Hurtigvirkende:
Regular
30 minutter
vanlig insulin
insulin
– 1 time
2-5 timer
5-8 timer
Postprandial
glukose-
(f.eks.
kontroll
Humulin£ R,
Novolin£ R,
Velosulin£
human)
Intermediær
Lente£
virkning
(f.eks.
1-3 timer
6-12
20-24
Basal
timer
timer
insulin-
Humulin£ L,
supple-
£
mentering
Novolin L),
NPH (f.eks.
Humulin£ N,
Novolin£ N),
Lengevirkende
Ultralente
4-6 timer
18-28
28 timer
timer
(f.eks.
Basal
insulin-
Humulin£
supple-
U), glargin,
mentering
detemir (en
analog)
Blandinger
Humulin£
Varierer
Varierer
Varierer
50/50,
Humulin£
70/30,
Novolin£
70/30,
Humalog£
Mix 75/25
De mest vanlig anvendte insulinene er hurtigvirkende insuliner, som inkluderer vanlig
insulin (dvs. nativ eller villtype insulin, inkludert allele og spesiesvarianter derav) og
5
hurtigvirkende insulinanaloger. For formål heri, referanse til insulin er et
hurtigvirkende insulin, hvis ikke annet er spesifikt angitt.
Hurtigvirkende insulin
62
Tilveiebrakt heri er superhurtigvirkende insulinsammensetninger som inneholder et
hurtigvirkende insulin, og et oppløselige hyaluronandegraderende enzym. Genrelt blir
disse superhurtigvirkende insulinsammensetningene absorbert etter subkutan
administrering, og er detekterbare og har en begynnende virkning i blodet i løpet av
5
30 minutter eller mindre. Hurtigvirkende insuliner som kan bli anvendt for å oppnå en
superhurtigvirkende insulinsammensetning som beskrevet heri, inkluderer vanlig
insulin, som er villtype eller nativt insulin. Hurtigvirkende insuliner inkluderer også
insulinanaloger. I kraft av deres hurtige absorpsjonsrate sammenliknet med
basalvirkende insuliner, blir hurtigvirkende insuliner anvendt hovedsakelig for
10
postprandiale kontrollformål. Eksempler på hurtigvirkende insuliner er angitt i tabell 3
nedenfor. Hurtigvirkende insuliner inkluderer også hvilke som helst kjent innenfor
fagområdet, så som, men ikke begrenset til, hvilke som helst insulinprepareringer og
anordninger beskrevet i US patent 7 279 457 og US patentpublikasjoner
20070235365, 20080039368, 20080039365, 20070086952, 20070244467 og
15
20070191757. Hvilke som helst hurtigvirkende insulin kan bli gjort
superhurtigvirkende ved ko-formulering og/eller koadministrering med et
hyaluronandegraderende enzym. En supervirkende insulinsammensetningformulering
kan også videre inkludere en blanding av et hurtigvirkende insulin med et
intermediært eller lengevirkende insulin, i tillegg til et hyaluronandegraderende
20
enzym.
Tabell 3: Hurtigvirkende insuliner
Navn
Vanlig insulin
Art
Human
A-kjede
B-kjede
Kommersielt
(SEKV. ID
(SEKV. ID
navn
nr.)
nr.)
SEKV. ID nr.
SEKV. ID nr.
f.eks.
103
104
Humulin£,
Novolin£ R,
Velosulin£
Vanlig insulin
Aspart-insulin
Lispro-insulin
Porcin
Human analog
Human analog
88-108 av
25-54 av
SEKV. ID nr.
SEKV. ID nr.
123
123
SEKV. ID nr.
SEKV. ID nr.
103
147
SEKV. ID nr.
SEKV. ID nr.
103
148
Iletin II£
Novolog£
Humalog£
63
Glulisin-insulin
Human analog
SEKV. ID nr.
SEKV. ID nr.
103
149
Apidra£
a. Vanlig insulin
Vanlige insuliner inkluderer formuleringer som inkluderer nativt eller villtype
insulinpolypeptid. Disse inkluderer humant insulin, samt insuliner fra bovin, porcin og
5
andre arter. Slike insuliner kan bli dannet ved en sur pH (f.eks. 2,5-3,5) eller kan bli
dannet ved en nøytral pH (f.eks. 7,0-7,8). Vanlige insuliner inkluderer også de som
inneholder sink. Typisk varierer sinkinnholdet i vanlige insulinpreparater fra ved eller
omtrent 0,01-0,04 mg/100 enheter. Vanlige humane insuliner blir markedsført som
Humulin£ R, Novolin£ R og Velosulin£. Porcininsulin ble markedsført som Iletin II£.
10
Generelt har vanlig insulin en begynnende virkning på 30 minutter etter subkutan
administrering. Maksimale plasmanivåer blir sett i løpet av 1-3 timer, og
intensitetsvarigheten øker med dosering. Plasmahalveringstiden etter subkutan
administrering er omtrent 1,5 timer.
15
b. Hurtigvirkende analoger
Hurtigvirkende insulinanaloger er modifiserte former av insulin som typisk inneholder
én eller flere aminosyreforandringer. Analogene er konstruert for å redusere
selvassosiering av insulinmolekylet for formålet av å øke absorpsjonsraten, og
begynnende virkning sammenliknet med vanlig insulin. Generelt blir slike analoger
20
formulert i nærvær av sink, og dermed eksisterer som stabile sinkheksamerer.
Grunnet modifikasjonen har de derimot en hurtigere dissosiasjon fra
heksamertilstanden etter subkutan administrering, sammenliknet med vanlig insulin.
i.
25
Insulin lispro
Human insulin lispro er en insulinpolypeptidformulering inneholdende
aminosyreforandringer ved posisjon 28 og 29 i B-kjeden, så som Pro-Lys ved denne
posisjonen i villtype insulin B-kjeden angitt i SEKV. ID nr. 104, blir omdannet til LysPro. Sekvensen av insulin lispro er angitt i SEKV. ID nr. 103 (A-kjeden) og SEKV. ID
nr. 148 (B-kjeden). Det blir markedsført under navnet Humalog£. Resultatet av
30
inversjonen av disse to aminosyrene er et polypeptid med en redusert tilbøyelighet til
selvassosiering, som muliggjør en mer hurtig virkningsbegynnelse. Spesifikt,
resulterer ombytting av sekvensen i B-kjeden til eliminering av to hydofobe
interaksjoner, og redusering av de to beta-pleated sheet hydrogenbindingene som
stabiliserer dimeren (se f.eks. DeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry and
35
Pharmacokinetics . I Ellenberg og Rifkin’s Diabetes Mellitus (sidene 481-500) McGraw-
64
Hill Professional). Polypeptidet selvassosierer, og danner heksamerer som et resultat
av eksipienter tilveiebrakt i formuleringen, så som antimikrobielle midler (f.eks. mkresol) og sink for stabilisering. Til tross for dette, grunnet aminosyremodifikasjon, er
insulin lispro hurtigere virkende enn vanlig insulin.
5
ii.
Insulin aspart
Humant insulin aspart er en insulinpolypeptidformulering inneholdende en
aminosyresubstitusjon i posisjon 28 av B-kjeden av humant insulin angitt i SEKV. ID
nr. 104 fra en prolin til en asparaginsyre. Sekvensen av insulin aspart er angitt i
10
SEKV. ID nr. 103 (A-kjede) og SEKV. ID nr. 147 (B-kjede). Det ble markedsført under
navnet Novolog£. Modifikasjonen i insulin aspart har en negativt ladet
sidekjedekarboksylgruppe for å danne ladningsrepulsjon og destabilisere monomermonomer-interaksjonen. Videre, fjerning av prolinet eliminerer en hovedhydrofob
interaksjon mellom monomerer (se f.eks. DeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry
15
and Pharmacokinetics. I Ellenberg og Rifkin’s Diabetes Mellitus (sidene 481-500)
McGraw-Hill Professional). Analogen eksisterer stort sett som en monomer, og er
mindre mottakelig for å aggregere sammenliknet med andre hurtigvirkende analoger
såsom lispro. Generelt er insulin aspart og insulin lispro lik deres respektive
farmakokinetikk- og farmakodynamikkegenskaper.
20
iii.
Insulin glulisin
Human insulin glulisin er en insulinpolypeptidformulering inneholdende en
aminosyresubstitusjon i B-kjeden i posisjon B3 fra asparagin til lysin, og ved
aminosyre B29 fra lysin til glutaminsyre, sammenliknet med sekvensen til B-kjeden av
25
humant insulin angitt i SEKV. ID nr. 104. Sekvensen av insulin glulisin er angitt i
SEKV. ID nr. 103 (A-kjede) og SEKV. ID nr. 149 (B-kjede). Det blir markedsført under
navnet Apidra£. Modifikasjonene gjør polypeptidmolekylet mindre mottakelig for
selvassosiasjon sammenliknet med human insulin. Ulikt andre insulinanaloger, blir
polypeptidet formulert kommersielt i fravær av heksamerfremmende sink (Becker et
30
al. 2008) Clinical Pharmacokinetics, 47:7-20). Følgelig, insulin glulisin har en hurtigere
begynnende rate enn insulin lispro og insulin aspart.
D. Hyaluronandegraderende enzymer
Tilveiebrakt heri er superhurtigvirkende insulinsammensetninger og kombinasjoner
35
som resulterer fra kombinasjonen av et hurtigvirkende insulin, og et hyaluronan
(hyaluronsyre) degraderende enzym, og metoder for anvendelse av slike
sammensetninger og kombinasjoner for behandling av insulinmedierte sykdommer og
65
tilstander. Hyaluronandegraderende enzymer inkluderer et hvilket som helst enzym
som degraderer hyaluronan. Eksempler på hyaluronandegraderende enzymer
inkluderer, men er ikke begrenset til hyaluronidaser, og spesielt kondroitinaser og
lyaser som har evnen til å spalte hyaluronan. Hvor metodene og anvendelsene
5
tilveiebrakt heri beskriver anvendelse av en hyaluronidase med insulin, kan et hvilket
som helst hyaluronandegraderende enzym bli anvendt. Eksempler på
hyaluronandegraderende enzymer i sammensetninger, kombinasjoner og metoder
tilveiebrakt heri, er oppløselige hyaluronandegraderende enzymer. I kraft av evnen
som hyaluronandegraderende enzymer, så som hyaluronidase, har til å bryte ned
10
hyaluronsyre i den ekstracellulære matriksen, letter slike enzymer administreringen av
terapeutiske midler. For eksempel blir absorpsjonen og dispersjonen av terapeutiske
midler som blir koadministrert med et hyaluronandegraderende enzym så som ved
subkutan administrering, øket.
15
Hyaluronan, også betegnet hyaluronsyre eller hyaluronat, er et ikke-sulfatert
glykosaminoglykan som blir omfattende distribuert gjennom bindevev, epitelialvev og
nevralvev. Hyaluronan er en vesentlig komponent i den ekstracellulære matrisen, og
en hovedbestanddel av den interstitielle barrieren. Ved katalysering av hydrolysen av
hyaluronan reduserer hyaluronandegraderende enzymer viskositeten til hyaluronan,
20
for derved å øke vevspermeabiliteten og øke absorpsjonsraten av fluider administrert
parenteralt. Følgelig er hyaluronandegraderende enzymer, så som hyaluronidase, blitt
anvendt, f.eks., som spredning eller dispergeringsmidler i sammenheng med andre
midler, medikamenter og proteiner for å forøke deres dispersjon og levering.
25
Hyaluronandegraderende enzymer virker slik at de degraderer hyaluronan ved spalting
av hyaluronanpolymerer, som består av gjentatte disakkaridenheter, deglukuronsyre
*OF$RJ1DFHW\O'JOXNRVDPLQ*OF1$FNREOHWVDPPHQYLDDOWHUQHUHQGHǃo4 og
ǃo3 glykosidbindinger. Hyaluronankjeder kan nå omtrent 25000
disakkaridgjentakelser eller mer i lengde, og polymerer av hyaluronan kan variere i
30
størrelse fra omtrent 5000 til 20000000 Da in vivo. Følgelig inkluderer
hyaluronandegraderende enzymer for anvendelser og metoder som er tilveiebrakt et
hvilket som helst enzym som har evnen til å katalysere spaltingen av en
hyaluronandisakkaridkjede eller polymer. I noen eksempler spalter
K\DOXURQDQGHJUDGHUHQGHHQ]\Pǃo4 glykosidbindingen i hyaluronankjeden eller
35
polymeren. I andre eksempler katalyserer hyaluronandegraderende enzym spaltingen
DYǃo3 glykosidbindingen i hyaluronankjeden eller polymeren.
66
Som beskrevet nedenfor, eksisterer hyaluronandegraderende enzymer i
membranbundet eller oppløselig form. For formål heri, blir oppløselige
hyaluronandegraderende enzymer tilveiebrakt for anvendelse i metoder, anvendelser,
sammensetninger eller kombinasjoner heri. Følgelig, hvor hyaluronandegraderende
5
enzymer inkluderer en glykosylfosfatidylinositol (GPI) anker og/eller er på annen måte
membranforankret eller uoppløselig, hyaluronandegraderende enzymer er tilveiebrakt
heri, i oppløselig form. Følgelig inkluderer hyaluronandegraderende enzymer
forkortede varianter, f.eks. forkortet for å fjerne hele eller en del av et GPI-anker.
Hyaluronandegraderende enzymer tilveiebrakt heri, inkluderer også allele eller
10
spesiesvarianter eller andre varianter, av et oppløselig hyaluronandegraderende
enzym. For eksempel kan hyaluronandegraderende enzymer inneholde én eller flere
variasjoner i dets primære sekvens, så som aminosyresubstitusjoner, addisjoner
og/eller delesjoner. En variant av et hyaluronandegraderende enzym utviser generelt
minst eller omtrent 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %,
15
97 %, 98 %, 99 %, eller mer sekvensidentitet sammenliknet med
hyaluronandegraderende enzym som ikke inneholder variasjonen. En hvilken som
helst variasjon kan bli inkludert i hyaluronandegraderende enzym for formålene heri,
forutsatt at enzymet beholder hyaluronidaseaktiviteten, så som minst eller omtrent 5
%, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %,
20
70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, eller mer av aktiviteten til et
hyaluronandegraderende enzym som ikke inneholder variasjonen (som målt ved in
vitro og/eller in vivo analyser velkjente innenfor fagområdet, og beskrevet heri).
1. Hyaluronidaser
25
Hyaluronidaser er medlemmer av en stor familie av hyaluronandegraderende
enzymer. Det er tre generelle klasser av hyaluronidaser: pattedyrtype hyaluronidaser,
bakterielle hyaluronidaser, og hyaluronidaser fra igler, andre parasitter, og krepsdyr.
Slike enzymer kan bli anvendt i sammensetningene og metodene tilveiebrakt heri.
30
a. Pattedyrtype hyaluronidaser
Pattedyrtype hyaluronidaser (EC 3.2.1.35) er HQGRǃ1acetylheksosaminidaser som
K\GURO\VHUHUǃo4 glykosidbindingen til hyaluronan til forskjellige
oligosakkaridlengder så som tetrasakkarider og heksasakkarider. Disse enzymene har
begge hydrolytiske og transglukosidaseaktiviteter, og kan degradere hyaluronan og
35
kontroitinsulfater (CS), generelt C4-S og C6-S. Hyaluronidaser av denne typen
inkluderer, men er ikke begrenset til, hyaluronidaser fra kuer (bovin) (SEKV. ID nr.
10, 11 og 64 og BH55 (US pat.nr. 5 747 027 og 5 827 721)), sauer (ovis aries)
67
(SEKV. ID nr. 26, 27, 63 og 65), yellow jacket veps (SEKV. ID nr. 12 og 13),
honningbie (SEKV. ID nr. 14), white-face hornet (SEKV. ID nr. 15), paper veps (SEKV.
ID nr. 16), mus (SEKV. ID nr. 17-19, 31), gris (SEKV. ID nr. 20-21), rotte (SEKV. ID
nr. 22-24, 30), kanin (SEKV. ID nr. 25), orangutang (SEKV. ID nr. 28),
5
cynomolgusape (SEKV. ID nr. 29), marsvin (SEKV. ID nr. 32), og humane
hyaluronidaser. Eksempler på hyaluronidaser i sammensetningene og metodene
tilveiebrakt heri er oppløselige hyaluronidaser.
Pattedyrhyaluronidaser kan bli videre delt inn i de som er nøytrale aktive,
10
hovedsakelig funnet i testikkelekstrakter, og syreaktive, hovedsakelig funnet i organer
så som leveren. Eksempler på nøytrale aktive hyaluronidaser inkluderer PH20,
inkludert men ikke begrenset til, PH20 avledet fra forskjellige arter så som ovin
(SEKV. ID nr. 27), bovin (SEKV. ID nr. 11) og human (SEKV ID nr. 1). Human PH20
(også kjent som SPAM1 eller spermoverflateprotein PH20), blir generelt koblet til
15
plasmamembranen via et glykosylfosfatidylinositol (GPI) anker. Det er naturlig
involvert i sperm-egg-adhesjon, og hjelper med penetrering av spermier av laget med
kumulusceller ved fordøying av hyaluronsyre.
Bortsett fra human PH20 (også betegnet SPAM1), er fem hyaluronidaseliknende gener
20
blitt identifisert i det humane genomet, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 og HYALP1.
HYALP1 er et pseudogen, og HYAL3 (SEKV. ID nr. 38) er ikke blitt vist å inneha en
enzymaktivitet overfor noen kjente substrater. HYAL4 (forløperpolypeptidet angitt i
SEKV: ID nr. 39) er en kondroitinase og utviser liten aktivitet overfor hyaluronan.
HYAL1 (forløperpolypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 36 er prototypisk syreaktivt enzym,
25
og PH20 (forløperpolypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 1) er prototypisk nøytral-aktivt
enzym. Syreaktive hyaluronidaser, så som HYAL1 og HYAL2 (forløperpolypeptidet
angitt i SEKV. ID nr. 37) mangler generelt katalytisk aktivitet ved nøytral pH (dvs. pH
7). For eksempel har HYAL1 liten katalytisk aktivtet in vitro over pH 4,5 (Frost et al.
(1997) Anal. Biochem. 251:263-269). HYAL2 er et syreaktivt enzym med en meget
30
lav spesifikk aktivitet in vitro. Hyaluronidaseliknende enzymer kan også bli
karakterisert av de som generelt blir koblet til plasmamembranen via et
glykosylfosfatidylinositol (GPI) anker så som human HYAL2 og human PH20
(Danilkovitch-Miagkova, et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-5), og de
som er generelt oppløselige så som human HYAL1 (Frost et al. (1997) Biochem
35
Biophys Res Commun. 236(1):10-5).
PH20
68
3+VRPDQGUHSDWWHG\UK\DOXURQLGDVHUHUHQHQGRǃ1DFHW\OKHNVRVDPLQLGDVH
VRPK\GURO\VHUHUǃo4 glykosidbindingen til hyaluronsyre til forskjellige
oligosakkaridlengder så som tetrasakkarider og heksasakkarider. De har begge
hydrolytiske og transglykosidaseaktiviteter, og kan degradere hyaluronsyre og
5
kondroitinsulfater, så som C4-S og C6-S. PH20 er naturlig involvert i sperm-eggadhesjonen, og behjelper penetreringen av sperm av laget med kumulusceller ved
fordøyning av hyaluronsyre. PH20 er lokalisert på spermoverflaten, og i
lysosomavledet akrosom, hvor det er bundet til den indre akrosomalmembranen.
Plasmamembranen PH20 har hyaluronidaseaktivitet kun ved nøytral pH, mens den
10
indre akrosomalmembran PH20 har aktivitet ved både nøytral og sur pH. I tillegg til å
være en hyaluronidase, ser PH20 også ut til å være en reseptor for HA-indusert
cellesignalisering, og en reseptor for zona pellucida omgir oocytten.
Eksempelvise PH20-proteiner inkluderer,men er ikke begrenset til, human
15
(forløperpolypeptidet angitt i SEKV: ID nr. 1, modent polypeptid angitt i SEKV. ID nr.
2), sjimpanse (SEKV. ID nr. 185), Rhesus ape (SEKV. ID nr. 186) bovin (SEKV. ID nr.
11 og 64), kanin (SEKV. ID nr. 25), ovin PH20 (SEKV. ID nr. 27, 63 og 65),
cynomolgusape (SEKV. ID nr. 29), marsvin (SEKV. ID nr. 30), rotte (SEKV. ID nr. 31)
og mus (SEKV. ID nr. 32) PH20-polypeptider.
20
Bovin PH20 er et 553 aminosyreforløperpolypeptid (SEKV. ID nr. 11). Oppstilling av
bovin PH20 med human PH20 viser kun svak homologi, idet multiple gap eksisterer fra
aminosyre 470 til den respektive karboksytermini som skyldes fravær av et GPI-anker
i bovint polypeptid (se f.eks. Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427-440).
25
Det er et faktum at klar GPI-ankre er ikke antatt i mange andre PH20-arter, bortsett
fra mennesker. Følgelig eksisterer PH20-polypeptider produsert fra ovin og bovin
naturlig som oppløselige former. Til tross for at bovin PH20 eksisterer meget løst
koblet til plasmamembranen, er det ikke forankret via et fosfolipasesensitivt anker
(Lalancette et al. (2001) Biol Reprod. 65(2):628-36). Dette unike trekket ved bovin
30
hyaluronidase har tillatt anvendelsen av oppløselig bovin testikkel hyaluronidaseenzym
som et ekstrakt for klinisk bruk (Wydase£, Hyalase£).
Human PH20 mRNA-transkript blir normalt translatert for å danne et 509
aminosyreforløperpolypeptid (SEKV. ID nr. 1, og replikert nedenfor) inneholdende en
35
35 aminosyre singalsekvens ved den N-terminale enden (aminosyreresidieposisjonene
1-35), og en 19 aminosyre glykosylfosfatidylinositol (GPI) ankerkoblingssignalsekvens
ved den C-terminale enden (aminosyreresidieposisjonene 491-509). Modent PH20 er
69
derfor et 474 aminosyrepolypeptid angitt i SEKV. ID nr. 2. Etter transport av
forløperpolypeptidet til ER og fjerning av signalpeptidet blir det C-terminale GPIkoblingssignalpeptidet spaltet for å lette kovalent kobling av et GPI-anker til den nylig
dannede C-terminale aminosyren ved aminosyreposisjonen som korresponderer med
5
posisjon 490 av forløperpolypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 1. Følgelig blir et 474
aminosyre GPI-forankret modent polypeptid med en aminosyresekvens angitt i SEKV.
ID nr. 2 produsert.
Aminosyresekvensen til humant PH20 forløperpolypeptid (SEKV. ID nr. 1; 509
10
aminosyrer):
MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP
LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFY
MPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK
DFLVETIKLGKLLRPHHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPS
15
IYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETV
ALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSS
DYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIA
DGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLSATMFIVSILFLIISSVASL
20
Human PH20 utviser hyaluronidaseaktivitet ved både nøytral og sur pH. I ett aspekt er
human PH20 prototypisk nøytralaktiv hyaluronidase, som generelt er lukket til
plasmamembranen via et CPI-anker. I et annet aspekt blir PH20 uttrykt på den indre
akrosomale membranen, hvor det har hyaluronidaseaktivitet ved både nøytral og sur
pH. Det ser ut som om PH20 inneholder to katalytiske seter ved bestemte regioner av
25
polypeptidet: peptid 1- og peptid 3-regioner (Cherr et al., (2001) Matrix Biology
20:515-525). Bevis tyder på at peptid 1-regionen av PH20, som korresponderer med
aminosyreposisjonene 107-137 av det modne polypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 2, og
posisjonene 142-172 av forløperpolypeptidet som angitt i SEKV. ID nr. 1, er
nødvendig for enzymaktivitet ved nøytral pH. Aminosyrene i posisjonene 111 og 113
30
(korresponderende med det modne PH20 polypeptid angitt i SEKV. ID nr. 2) innenfor
regionen ser ut til å være viktig for aktivitet, siden mutagenese ved
aminosyreerstatning resulterer i PH20 polypeptider med 3 % hyaluronidaseaktivitet
eller udetekterbar hyaluronidaseaktivitet, sammenliknet med villtype PH20 (Arming et
al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
35
Peptid 3-regionen, som korresponderer med aminosyreposisjonene 242-262 av det
modne polypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 2, og posisjonene 277-297 av
70
forløperpolypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 1, ser ut til å være viktig for enzymaktivitet
ved sur pH. Innenfor denne regionen ser aminosyrene i posisjonene 249 og 252 av
modent PH20 polypeptid ut til å være essensielle for aktivitet, og mutagenese av
hvilke som helst derav resulterer i et polypeptid som vesentlig mangler aktivitet
5
(Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
I tillegg til de katalytiske setene inneholder PH 20 også et hyaluronanbindingssete.
Eksperimentelle bevis foreslår at dette setet er lokalisert i peptid 2-regionen, som
korresponderer med aminosyreposisjonene 205-235 av forløperpolypeptidet angitt i
10
SEKV. ID nr. 1 og posisjonene 170-200 av det modne polypeptid angitt i SEKV. ID nr.
2. Denne regionen er sterkt konservert blant hyaluronidaser, og er likt med
heparinbindingsmotivet. Mutering av argininresidiet i posisjon 176 (som
korresponderer med modent PH20 polypeptid angitt i SEKV. ID nr. 2) til et glysin,
resulterer i et polypeptid med kun omtrent 1 % av hyaluronidaseaktiviteten til villtype
15
polypeptidet (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
Det er syv potensielle N-koblede glykosyleringsseter i human PH20 ved N82, N166,
N235, N254, N368, N393, N490 av polypeptidet eksemplifisert i SEKV. ID nr. 1. På
grunn av at aminosyrene 36 til 464 av SEKV. ID nr. 1 ser ut til å inneholde den
20
minimalt aktive humane PH20 hyaluronidasedomenen, er det N-koblede
glykosyleringssetet N-490 ikke nødvendig for riktig hyaluronidaseaktivitet. Det er seks
sulfidbindinger i human PH20. To disulfidbindinger mellom cysteinresidiene C60 og
C351, og mellom C224 og C238 av polypeptidet eksemplifisert i SEKV. ID nr. 1 (som
korresponderer med residiene C25 og C316, og C189 og C203 av det modne
25
polypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 2). Ytterligere fire disulfidbindinger blir dannet
mellom cysteinresidiene C376 og C387; mellom C381 og C435; mello9m C437 og
C443; og mellom C458 og C464 av polypeptidet eksemplifisert i SEKV. ID nr. 1 (som
korresponderer med residiene C341 og C352, mellom C346 og C400, mellom C402 og
C408, og mellom C423 og C429 av det modne polypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 2).
30
b. Bakterielle hyaluronidaser
Bakterielle hyaluronidaser (EC 4.2.2.1 eller EC 4.2.99.1) degraderer hyaluronan og, i
forskjellig grad, kondroitinsulfater og dermatansulfater. Hyaluronan lyaser isolert fra
bakterier er forskjellige fra hyaluronidaser (fra andre kilder, f.eks.
35
K\DOXURQRJOXNRVDPLQLGDVHU(&YHGGHUHVYLUNQLQJVPnWH'HHUHQGRǃ1
acetylheksoaminidaser som katalyserer en elimineringsreaksjon, istedenfor hydrolyse,
DYǃo4-glykosidbindingen mellom N-acetyl-beta-D-glukosamin og D-
71
JOXNXURQV\UHUHVLGLHQHLK\DOXURQDQVRPWLOYHLHEULQJHUGHRNV\ǃ'JOXF
enuronosyl)-N-acetyl-D-glukosamin tetra- og heksasakkarider, og
disakkaridendeprodukter. Reaksjonen resulterer i dannelsen av oligosakkarider med
umettede heksuronsyreresidier ved deres ikke-reduserende ender.
5
Eksempelvise hyaluronidaser fra bakterier for anvendelse i sammensetningene,
kombinasjonene, og metodene tilveiebrakt heri inkluderer, men er ikke begrenset til,
hyaluronandegraderende enzymer i mikroorganismer, inkludert stammene av
Arthrobacter, Bdellovibrio, Clostridium, Micrococcus, Streptococcus, Peptococcus,
10
Propionibacterium, Bacteroides, og Streptomyces. Spesielle eksempler på slike
enzymer inkluderer, men er ikke begrenset til Arthrobacter sp. (stamme FB24) (SEKV.
ID nr. 67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEKV. ID nr. 68), Propionibacterium acnes
(SEKV. ID nr. 69), Streptococcus agalactiae ((SEKV. ID nr. 70), 18RS21 (SEKV. ID nr.
71), serotype Ia (SEKV. ID nr. 72), serotype III (SEKV ID nr. 73), Staphylococcus
15
aureus (stamme COL) (SEKV. ID nr. 74), stamme MRSA252 (SEKV. ID nr. 75 og 76),
stamme MSSA476 (SEKV. ID nr. 77), stamme NCTC 8325 (SEKV. ID nr. 78) , stamme
bovin RF122 (SEKV. ID nr. 79 og 80), stamme USA300 (SEKV. ID nr. 81),
Streptococcus pneumoniae ((SEKV. ID nr. 82), stamme ATCC BAA-255/R6 (SEKV. ID
nr. 83), serotype 2, stamme D39/NCTC 7466 (SEKV. ID nr. 84), Streptococcus
20
pyogenes (serotype M1) (SEKV. ID nr. 85), serotype M2, stamme MGAS10270 (SEKV.
ID nr. 86), serotype M4, MGAS10750 (SEKV. ID nr. 87), serotype M6 (SEKV. ID nr.
88), serotype M12, stamme MGAS2096 (SEKV. ID nr. 89 og 90), serotype M12,
stamme MGAS9429 (SEKV. ID nr. 91), serotype M28 (SEKV. ID nr. 92), Streptococcus
suis (SEKV. ID nr. 93-95), Vibrio fischeri (stamme ATCC 70060/ES114 (SEKV. ID nr.
25
96)), og Streptomyces hyaluronolyticus hyaluronidaseenzym, som er spesifikk for
hyaluronsyre, og som ikke spalter kondroitin eller kondroitinsulfat (Ohya, T. og
Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607).
c. Hyaluronidaser fra igler, andre parasitter, og krepsdyr
30
+\DOXURQLGDVHUIUDLJOHUDQGUHSDUDVLWWHURJNUHSVG\U(&HUHQGRǃ
glukuronidase som danner tetra- og heksasakkaridsluttprodukter. Disse enzymene
katalyserer hydrolysen av 1oELQGLQJHUPHOORPǃ'JOXNXURQDWRJ1DFHW\O'
glukosaminresidier i hyaluronat. Eksempelvise hyaluronidaser fra igler inkluderer, men
er ikke begrenset til, hyaluronidase fra Hirudinidae (f.eks. Hirudo medicinalis),
35
Erpobdellidae (f.eks. Nephelopsis obscura og Erpobdella punctata), Glossiphoniidae
(f.eks. Desserobdella picta, Helobdella stagnalis, Glossiphonia complanata, Placobdella
ornata og Theromyzon sp.) og Haepoidae (Haemopis marmorata) (Hovingh et al.
72
(1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 124(3):319-26). Et eksempel på
hyaluronidase fra bakterier som har samme virkningsmekanisme som
iglehyaluronidase er den fra cyanobakterier, Synechococcus sp. (stamme RCC307,
SEKV. ID nr. 97).
5
2. Andre hyaluronandegraderende enzymer
I tillegg til hyaluronidasefamilien, kan andre hyaluronandegraderende enzymer bli
anvendt i sammenheng med hurtigvirkende insulin i sammensetningene og metodene
som er gitt. F.eks. kan enzymer, inkludert spesielt kondroitinaser og lyaser, som har
10
evnen til å spalte hyaluronan bli anvendt. Eksempler på kondroitinaser som kan
degradere hyaluronan inkluderer, men er ikke begrenset til, kontroitin ABC lyase (også
kjent som kondroitinase ABC), kondroitin AC lyase (også kjent som kondroitinsulfat
lyase eller kondroitinsulfat eliminase) og kondroitin C lyase. Metoder for produksjon og
rensing av slike enzymer for anvendelse i sammensetninger og metoder tilveiebrakt er
15
kjent innenfor fagområdet (f.eks. US patent nr. 6 054 569, Yamagata, et al. (1968) J.
Biol. Chem. 243(7):1523-1535, Yang et al. (1985) J. Biol. Chem. 160(30): 18491857).
Kondroitin ABC lyase inneholder to enzymer, kondroitin-sulfat-ABC endolyase (EC
20
4.2.2.20) og kondroitin-sulfat-ABC eksolyase (EC 4.2.2.21) (Hamai et al. (1997) J Biol
Chem. 272 (14):9123-30), som degraderer forskjellige glykosaminoglykaner av
kondroitin-sulfat- og dermatan-sulfattype. Kondroitinsulfat, kondroitin-sulfatproteoglykan og dermatansulfat er foretrukne substrater for kondroitin-sulfat-ABC
endolyase, men enzymet kan også virke på hyaluronan i lavere grad. Kondroitin-
25
sulfat-ABC endolyase degraderer forskjellige glykosaminoglykaner av kondroitinsulfat- og dermatan-sulfattype, som produserer en blanding av '4-umettede
oligosakkarider med forskjellige størrelser som til slutt blir degradert til '4-umettede
tetra- og disakkarider. Kondroitin-sulfat-ABC eksolyase har den samme
substratspesifisiteten, men fjerner disakkaridresidier fra den ikke-reduserende enden
30
av både polymere kondroitinsulfater og deres oligosakkaridfragmenter produsert av
kondroitin-sulfat-ABC endolyase (Hamai, A. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:91239130). En eksempelvis kondroitin-sulfat-ABC endolyaser og kondroitin-sulfat-ABC
eksolyaser inkluderer, men er ikke begrenset til, de fra Proteus vulgaris og
Flavobacterium heparinum (Proteus vulgaris kondroitin-sulfat-ABC enolyasen er angitt
35
i SEKV. ID nr. 98 (Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46).
73
Kondroitin AC lyase (EC 4.2.2.5) er aktiv på kondroitinsulfatene A og C, kontroitin og
hyaluronsyre, men er ikke aktiv på dermatansulfat (kondroitinsulfat B). Eksempelvise
kondroitinase AC-enzymer fra bakterier inkluderer, men er ikke begrenset til, de fra
Flavobacterium heparinum og Victivallis vadensis, angitt i henholdsvis SEKV. ID nr. 99
5
og 100, og Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental
Microbiology 66(1):29-35, Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology 30(5):387-444).
Kondroitinase C spalter kondroitinsulfat C som produserer tetrasakkarid pluss et
10
umettet 6-sulfatert disakkarid (delta Di-6S). Det spalter også hyaluronsyre som
produserer umettet ikke-sulfatert disakkarid (delta Di-OS). Eksempler på
kondroitinase C-enzymer fra bakterier inkluderer, men er ikke begrenset til, de fra
Streptococcus og Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. (48)2:121-4,
Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8, Tsuda et al. (1999) Eur. J.
15
Biochem. 262:127-133).
3. Oppløselige hyaluronandegraderende enzymer
Tilveiebrakt i sammensetningene og metodene heri, er oppløselige
hyaluronandegraderende enzymer, inkludert oppløselige hyaluronidaser. Oppløselige
20
hyaluronandegrderende enzymer inkluderer hvilke som helst hyaluronandegraderende
enzymer som eksisterer i oppløselig form, inkludert, men ikke begrenset til,
oppløselige hyaluronidaser, inkludet ikke-humane oppløselige hyaluronidaser,
inkludert ikke-humane dyr oppløselig hyaluronidaser, bakterieoppløselige
hyaluronidaser og humane hyaluronidaser, Hyal1, bovin PH20 og Ovin PH20, allele
25
varianter derav, og andre varianter derav. For eksempel, inkludert blant oppløselige
hyaluronandegraderende enzymer er hvilke som helst hyaluronandegraderende
enzymer som er blitt modifisert å være oppløselige, inkludert hvilke som helst
beskrevet i U.S. Provisional Application serienummer 61/201,384. For eksempel kan
hyaluronandegraderende enzymer som inneholder et GPI-anker bli gjort oppløselig
30
ved forkortelse av, og fjerning av alle eller en av GPI-ankeret. I ett eksempel, det
humane hyaluronidase PH20, som er normalt membranforankret via et GPI-anker, kan
bli gjort oppløselig ved forkortelse av og fjerning av alle eller en del av GPI-ankeret
ved den C-terminale enden.
35
Oppløselige hyaluronandegraderende enzymer inkluderer også nøytrale aktive og
syreaktive hyaluronidaser. Avhengig av fakturer, så som, men ikke begrenset til,
ønsket aktivitetsnivå av enzymet etter administrering og/eller sete for administrering,
74
kan nøytrale aktive og syreaktive hyaluronidaser bli valgt. I et spesielt eksempel er
hyaluronandegraderende enzym for anvendelse i sammensetninger, kombinasjoner og
metoder heri en oppløselig nøytral aktiv hyaluronidase.
5
Eksempler på en oppløselig hyaluronidase er PH20 fra en hvilken som helst art, så
som en hvilken som helst angitt i hvilke som helst av SEKV. ID nr. 1, 2, 11, 25, 27,
30, 31, 63-65 og 185-186, eller forkortede former derav som mangler hele eller en del
av det C-terminale GPI-ankeret, forutsatt at hyaluronidasen er oppløselig, og beholder
hyaluronidaseaktiviteten. Også inkludert blant oppløselige hyaluronidaser er allele
10
varianter eller andre varianter av hvilke som helst av SEKV. ID nr. 1, 2, 11, 25, 27,
30, 31, 63-65 og 185-186, eller forkortede former derav. Allele varianter og andre
varianter er kjent for fagfolk innenfor dette området, og inkluderer polypeptider som
har 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %,
eller mere sekvensidentitet enn hvilken som helst av SEKV. ID nr. 1, 2, 11, 25, 27,
15
30, 31, 63-65 og 185-186, eller forkortede former derav. Aminosyrevarianter
inkluderer konservative og ikke-konservative mutasjoner. Det er underforstått at
residier som er viktige eller ellers nødvendige for aktiviteten av en hyaluronidase, så
som hvilke som helst beskrevet ovenfor eller kjent for fagfolk innenfor dette området,
er generelt konstant. Disse inkluderer, for eksempel, aktive seteresidier. Følgelig er
20
f.eks. aminosyreresidiene 111, 113 og 176 (korresponderende med residier i moden
PH20 polypeptid angitt i SEKV. ID nr. 2) av et humant PH20 polypeptid, eller
oppløselig form derav, generelt invariant, og er ikke endret. Andre residier som utviser
glykosylering og dannelse av disulfidbindinger nødvendig for riktig folding kan også
være invariant.
25
I noen tilfeller er det oppløselige hyaluronandegraderende enzymet normalt GPIforankret (så som, for eksempel, human PH20) og blir gjort oppløselig ved forkorting
ved den C-terminale enden. En slik forkorting kan fjerne alle GPIankerkoblingssignalsekvenser, eller kan fjerne kun noen av GPI30
ankerkoblingssignalsekvensen. Det resulterende polypeptidet er derimot oppløselig. I
tilfeller hvor det oppløselige hyaluronandegraderende enzymet beholder en del av GPIankerkoblingssignalsekvensen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, eller mer aminosyreresidier i GPIankerkoblingssignalsekvensen kan bli beholdt, forutsatt at polypeptidet er oppløselig.
Polypeptider inneholdende én eller flere aminosyrer av GPI-ankeret er betegnet
35
utvidede oppløselige hyaluronandegraderende enzymer. Fagfolk innenfor dette
området kan bestemme om et polypeptid er GPI-forankret ved anvendelse av metoder
velkjent innenfor fagområdet. Slike metoder inkluderer, men er ikke begrenset til,
75
anvendelse av kjente algoritmer for å forutsi tilstedeværelsen og beliggenheten av
GPI-ankerkoblingssignalsekvensen og Z-setet, og utførelse av solubilitetsanalyser før
og etter spaltingen med fosfatidylinositolspesifikk fosfolipase C (PI-PLC) eller D (PIPLD).
5
Utvidede oppløselige hyaluronandegraderingsenzymer kan bli produsert ved å danne
C-terminale forkortelser til en hvilken som helst naturlig GPI-forankret
hyaluronandegraderingsenzym, slik at det resulterende polypeptidet er oppløselig, og
inneholder én eller flere aminosyreresidier fra GPI-ankerkoblingssignalsekvensen.
10
Eksempler på utvidede oppløselige hyaluronandegraderingsenzymer som er Cterminalt forkortede, men som har beholdt en del av GPIankerkoblingssignalsekvensen inkluderer, men er ikke begrenset til, utvidet
oppløselige PH20 (esPH20) polypeptider av primatopprinnelse, så som f.eks., human
og sjimpanse esPH20 polypeptider. For eksempel kan esPH20 polypeptider bli dannet
15
ved C-terminal forkortelse av hvilke som helst av de modne eller
forløperpolypeptidene angitt i SEKV. ID nr. 1, 2 eller 185, eller allele eller andre
variasjoner derav, inkludert aktivt fragment derav, hvor det resulterende polypeptidet
er oppløselig, og beholder én eller flere aminosyreresidier fra GPIankerkoblingssignalsekvensen. Allele varianter og andre varianter er kjent for fagfolk
20
innenfor dette området, og inkluderer polypeptider som er 60 %, 70 %, 80%, 90%,
91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, eller mer sekvensidentitet med hvilke som helst av
SEKV. ID nr. 1 eller 2. esPH20 polypeptider tilveiebrakt heri kan være C-terminalt
forkortede med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 eller flere aminosyrer sammenliknet med
villtype polypeptidet, så som et polypeptid med en sekvens angitt i SEKV. ID nr. 1, 2
25
eller 185, forutsatt at det resulterende esPH20 polypeptidet er oppløselig, og beholder
én eller flere aminosyreresidier fra GPI-ankerkoblingssignalsekvensen.
Typisk, for anvendelse i sammensetninger, koblingasjoner og metoder heri, et
oppløselig humant hyaluronandegraderende enzym, så som et oppløselig humant
30
PH20, blir anvendt. Til tross for at hyaluronandegraderende enzymer, så som PH20,
fra andre dyr kan bli anvendt, er slike prepareringer potensielt immunogene, på grunn
av at de er dyreproteiner. For eksempel, en signifikant andel av pasienter
demonstrerer før sensibilisering sekundært til inntatte matvarer, og siden disse er
dyreproteiner, har alle pasienter en risiko for påfølgende sensibilisering. Følgelig kan
35
ikke-humane prepareringer ikke være egnet for kronisk bruk. Dersom ikke-humane
preparater er ønskelige, er det betraktet heri at slike polypeptider kan bli dannet slik
at de har redusert immunogenisitet. Slike modifikasjoner er innenfor nivået til fagfolk
76
innenfor dette området, og kan f.eks. inkludere fjerning og/eller erstatning av én eller
flere antigene epitoper på molekylet.
Hyaluronandegraderende enzymer, inkludert hyaluronidase (f.eks. PH20), anvendt i
5
metodene heri, kan bli produsert rekombinant, eller kan bli renset eller delvis renset
fra naturlige kilder, så som, f.eks., fra testikkelekstrakter. Metoder for produksjon av
rekombinante proteiner, inkludert rekombinante hyaluronandegraderende enzymer, er
tilveiebrakt andre steder heri, og er velkjente innenfor fagområdet.
10
a. Oppløselig human PH20
Eksempel på en oppløselig hyaluronidase er oppløselig human PH20. Oppløselige
former av rekombinant human PH20 er blitt produsert, og kan bli anvendt i
sammensetningene, kombinasjonene og metodene beskrevet heri. Produksjonen av en
slik oppløselig form av PH20 er beskrevet i US publiserte patentsøknader nr. US
15
20040268425, US 20050260186 og US 20060104968, og i eksemplene nedenfor. For
eksempel, oppløselige PH20 polypeptider, inkluderer C-terminalt forkortede
variantpolypeptider som inkluderer en sekvens av aminosyrene i SEKV. ID nr. 1, eller
har minst 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 % sekvensidentitet med en
sekvens av aminosyrene inkludert i SEKV.ID nr. 1, beholder hyaluronidaseaktivitet og
20
er oppløselige. Inkludert blant disse polypeptider er oppløselige PH20 polypeptider
som fullstendig mangler hele eller en del av GPI-ankerkoblingssignalsekvensen. Også
inkludert er utvidet oppløselig PH20 (esPH20) polypeptider som inneholder minst én
aminosyre av GPI-ankeret. Følgelig, istedenfor å ha et GPI-anker kovalentlig bundet til
den C-terminale enden av proteinet i ER, og forankret til det ekstracellulære laget av
25
plasmamembranen, blir disse polypeptidene utskilt, og er oppløselige. C-terminalt
trunkerte PH20 polypeptider kan være C-terminalt trunkert med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 5, 60, eller flere
aminosyrer sammenliknet med fullengde villtype polypeptidet, så som et fullengde
villtype polypeptid med en sekvens angitt i SEKV. ID nr. 1 eller 2, eller allele eller
30
spesiesvarianter eller andre varianter derav.
Eksempelvise C-terminalt trunkerte humane PH20 polypeptider tilveiebrakt heri
inkluderer hvilke som helst som har C-terminale forkortelser for å danne polypeptider
inneholdende aminosyrene 1 til aminosyre 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472,
35
473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488,
489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, av sekvensen til aminosyrene angitt i
SEKV. ID nr. 1, eller korresponderende posisjoner i en allel eller spesiesvariant derav.
77
Når uttrykt i pattedyrceller, blir 35 aminosyre N-terminal signalsekvens spaltet i løpet
av prosesseringen, og den modne formen av proteinet blir utskilt. Følgelig kan
eksempelvise modne C-terminalforkortede oppløselige PH20 polypeptider inneholde
aminosyrene 36 til 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477,
5
478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493,
494, 495, 496, 497, av sekvensen til aminosyrene angitt i SEKV. ID nr. 1, eller
korresponderende posisjoner i en allel eller spesiesvariant derav. Tabell 4
tilveiebringer ikke-begrensende eksempler på eksempelvise C-terminalt forkortede
PH20 polypeptider, inkludert C-terminalt trunkerte oppløselige PH20 polypeptider. I
10
tabell 4 nedenfor, lengden (i aminosyrene) av forløperen og modne polypeptider, og
sekvenskjennetegnet (SEKV. ID nr.) hvor eksempelvise aminosyresekvenser til
forløperen og modne polypeptider av C-terminalt forkortede PH20 proteiner er angitt,
er gitt. Villtype PH20 polypeptidet er også inkludert i tabell 4 for sammenlikning.
15
Tabell 4. Eksempler på C-terminalt forkortede PH20 polypeptider
Polypeptid
Forløper
Forløper
Modne
Modne
(aminosyrer)
SEKV. ID nr.
(aminosyrer)
SEKV. ID nr.
Villtype
509
1
474
2
SPAM1-FIVS
497
191
462
235
SPAM1-MFIV
496
225
461
269
SPAM1-TMFI
495
192
460
236
SPAM1-ATMF
494
226
459
270
SPAM1-SATM
493
193
458
237
SPAM1-LSAT
492
227
457
271
SPAM1-TLSA
491
194
456
238
SPAM1-PSTL
489
195
454
239
SPAM1-SPST
488
228
453
272
SPAM1-STLS
490
196
455
240
SPAM1-ASPS
487
197
452
241
SPAM1-NASP
486
229
451
273
SPAM1-YNAS
485
198
450
242
SPAM1-FYNA
484
199
449
243
SPAM1-IFYN
483
46
448
48
SPAM1-QIFY
482
3
447
4
SPAM1-PQIF
481
45
446
5
SPAM1-EPQI
480
44
445
6
SPAM1-EEPQ
479
43
444
7
78
SPAM1-TEEP
478
42
443
8
SPAM1-ETEE
477
41
442
9
SPAM1-METE
476
200
441
244
SPAM1-PMET
475
201
440
245
SPAM1-PPME
474
202
439
246
SPAM1-KPPM
473
203
438
247
SPAM1-LKPP
472
204
437
248
SPAM1-FLKP
471
205
436
249
SPAM1-AFLK
470
206
435
250
SPAM1-DAFL
469
207
434
251
SPAM1-IDAF
468
208
433
252
SPAM1-CIDA
467
40
432
47
SPAM1-VCID
466
209
431
253
SPAM1-GVCI
465
210
430
254
Oppløselige former inkludert, men er ikke begrenset til, hvilke som helst som har Cterminale forkortelser for å danne polypeptider inneholdende aminosyrene 1 til
5
aminosyre 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 og 483 av sekvensen til aminosyrene
angitt i SEKV. ID nr. 1. Når uttrykt i pattedyrceller, blir 35 aminosyre N-terminal
signalsekvens spaltet i løpet av prosesseringen, og den modne formen av proteinet
blir utskilt. Følgelig inneholder de modne oppløselige polypeptidene aminosyrene 36 til
467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 og 483 i SEKV. ID nr. 1. Delesjonsmutanter som
10
slutter ved aminosyreposisjonen 477 til 483 (korresponderende med
forløperpolypeptidet angitt i SEKV. ID nr. 1) utviser høyere utskilt
hyaluronidaseaktivitet enn fullengde GPI-forankret form. Følgelig, eksempler på
oppløselige hyaluronidaseoppløselige humane PH20 polypeptider som er 442, 443,
444, 445, 446 eller 447 aminosyrer i lengde, som angitt i hvilke som helst av SEKV.
15
ID nr. 4-9, eller allele eller spesiesvarianter eller andre varianter derav.
Generelt blir oppløselige former av PH20 produsert ved anvendelse av
proteinekspresjonssystemer som letter korrekt N-glykosylering for å forsikre at
polypeptidet beholder aktivitet, siden glykosylering er viktig for den katalytiske
20
aktiviteten og stabiliteten til hyaluronidasene. Slike celler inkluderer, for eksempel
kinesisk hamsterovarie (CHO) celler (f.eks. DG44 CHO-celler).
b. rHuPH20
79
Rekombinante oppløselige former av human PH20 er blitt dannet, og kan bli anvendt i
sammensetningene og metodene tilveiebrakt heri. Dannelse av slike oppløselige
former av rekombinant human PH20 er beskrevet i US publiserte patentsøknader nr.
US 20040268425, US 20050260186 og US 20060104968, og i eksemplene 2-6
5
nedenfor. Eksempler for slike polypeptider er de som blir dannet fra et
nukleinsyremolekyl kodende for aminosyrene 1-482 (angitt i SEKV. ID nr. 3). Et slikt
eksempelnukleinsyremolekyl er angitt i SEKV. ID nr. 49. Posttranslasjonell
prosessering fjerner 35 aminosyresignalsekvensen, etterlater et 447
aminosyreoppløselig rekombinant humant PH20 (SEKV. ID nr. 4). Som produsert i
10
kulturmediet, er det heterogenisitet ved den C-terminale enden, slik at produktet,
betegnet rHuPH20, inkluderer en blanding av arter som kan inkludere hvilke som helst
én eller flere av SEKV. ID nr. 4-9 i forskjellig hyppighet. Typisk blir rHuPH20 produsert
i celler som letter korrekt N-glykosylering for å beholde aktivitet, så som CHO-cellene
(f.eks. DG44 CHO-celler).
15
4. Glykosylering av hyaluronandegraderende enzymer
Glykosylering, inkludert N- og O-koblet glykosylering, av noen
hyaluronandegraderende enzymer, inkludert hyaluronidaser, kan være viktig for deres
katalytiske aktivitet og stabilitet. Idet endring av type av glykan som modifiserer et
20
glykoprotein kan ha dramatiske effekter på proteinets antigenisitet, strukturell folding,
oppløselighet og stabilitet, er de fleste enzymene ikke tenkt å kreve glykosylering for
optimal enzymaktivitet. For noen hyaluronidaser, kan fjerning av N-koblet
glykosylering resultere i nærmest fullstendig inaktivering av hyaluronidaseaktiviteten.
Følgelig, for slike hyaluronidaser, er tilstedeværelse av N-koblede glykaner kritisk for
25
dannelse av et aktivt enzym.
N-koblede oligosakkarider faller inn i flere hovedtyper (oligomannose, kompleks,
hybrid, sulfatert), og alle har (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-kjerner koblet via
amidnitrogenet til Asn-residiene som faller innenfor Asn-Xaa-Thr/Ser-sekvensene
30
(hvor Xaa ikke er Pro). Glykosylering ved et An-Asn-Xaa-Cys-sete er blitt rapportert
for koagulasjonsprotein C. I noen tilfeller kan et hyaluronandegraderende enzym, så
som en hyaluronidase, inneholde både N-glykosid- og O-glykosidbindinger. For
eksempel har PH20 O-koblede oligosakkarider samt N-koblede oligosakkarider. Det er
syv potensielle N-koblede glykosyleringsseter ved N82, N166, N235, N254, N368,
35
N393, N490 av human PH20 eksemplifisert i SEKV. ID nr. 1. Som angitt ovenfor, er Nkoblet glykosylering ved N490 nødvendig for hyaluronidaseaktivitet.
80
I noen eksempler blir hyaluronandegraderende enzymer for anvendelse i
sammensetningene og/eller metodene tilveiebrakt glykosylert ved én eller alle
glykosyleringsseter. For eksempel, for human PH20, eller en oppløselig form derav, er
2, 3, 4, 5 eller 6 av N-glykosyleringssetene korresponderende med aminosyrene N82,
5
N166, N235, N254, N368 og N393 av SEKV. ID nr. 1 glykosylerte. I noen eksempler er
hyaluronandegraderende enzymer glykosylerte ved én eller flere native
glykosyleringsseter. I andre eksempler er hyaluronandegraderende enzymer
modifisert ved én eller flere ikke-native glykosyleringsseter for å tilveiebringe
glykosylering av polypeptidet ved ett eller flere ytterligere seter. I slike eksempler kan
10
kobling av ytterligere sukkerenheter forøke de farmakokinetiske egenskapene til
molekylet, så som forbedret halveringstid og/eller forbedret aktivitet.
I andre eksempler er hyaluronandegraderende enzymer for anvendelse i
sammensetningene og/eller metodene tilveiebrakt heri delvis glykosylert (eller N15
delvis glykosylerte polypeptider). For eksempel, kan delvis glykosylerte oppløselige
PH20 polypeptider som beholder hele eller en del av hyaluronidaseaktiviteten til
fullstendig glykosylert hyaluronidase bli anvendt i sammensetningene og/eller
metodene gitt heri. Eksempler på delvis deglykosylerte hyalurodinaser inkluderer
oppløselige former av delvis deglykosylerte PH20 polypeptider fra hvilke som helst
20
arter, så som hvilken som helst angitt i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 1, 2, 11, 25,
27, 29, 30, 31, 32, 63, 65, 185 og 186, eller allele varianter, forkortede varianter,
eller andre varianter derav. Slike varianter er kjent for fagfolk innenfor dette området,
og inkluderer polypeptider som har 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94
%, 95 %, eller mere sekvensidentitet med hvilke som helst av SEKV. ID nr. 1, 2, 11,
25
25, 27, 29, 30, 31, 32, 63, 65, 185 og 186, eller forkortede former derav. De delvis
deglykosylerte hyaluronidasene tilveiebrakt heri, inkluderer også hybrid, fusjon og
chimere delvis deglykosylerte hyaluronidaser, og delvis deglykosylerte
hyaluronidasekonjugater.
30
Glykosidaser, eller glykosidhydrolaser, er enzymer som katalyserer hydrolysen av
glykosidbindingen for å danne to mindre sukre. Hovedtyper av N-glykaner i
vertebrater inkluderer høy mannoseglykaner, hybridglykaner og komplekse glykaner.
Det er flere glykosidaser som resulterer i kun delvis proteindeglykosylering,
inkluderende: EndoF1, som spalter høy mannose og hybridtypeglykaner; EndoF2, som
35
spalter biantennære kompleks type glykaner; EndoF3, som spalter biantennære og
mer forgrenede komplekse glykaner; og EndoH, som spalter høy mannose og
hybridtypeglykaner. Behandling av et hyaluronandegraderende enzym, så som en
81
oppløselig hyaluronidase, så som en oppløselig PH20, med én eller alle av disse
glykosidasene kan resultere i kun delvis deglykosylering og, derfor, retensjon av
hyaluronidaseaktivitet.
5
Delvis deglykosylerte hyaluronandegraderende enzymer, så som delvis deglykosylerte
oppløselige hyaluronidaser, kan bli produsert ved spalting med én eller flere
glykosidaser, generelt en glykosidase som ikke fjerner alle N-glykaner, men kun delvis
glykosylerer proteinet. For eksempel, behandling av PH20 (f.esk. et rekombinant PH20
betegnet rHuPH20) med én eller alle overnevnte glykosidser (f.eks. EndoF1, EndoF2
10
og/eller EndoF3) resulterer i delvis deglykosylering. Disse delvis deglykosylerte PH20
polypeptidene kan utvise hyaluronidaseenzymatisk aktivitet, som kan sammenliknes
med fullstendig glykosylerte polypeptider. I kontrast, behandling av PH20 med
PNGaseF, en glykosidase som spalter alle N-glykanene, resulterer i fullstendig fjerning
av alle N-glykanene, og gjør derfor PH20 enzymatisk inaktiv. Følgelig, til tross for at
15
alle N-koblede glykosyleringssetene (så som f.eks., de ved aminosyrene N82, N166,
N235, N254, N368, og N393 av human PH20, eksemplifisert i SEKV. ID nr. 1) kan bli
glykosylerte, kan behandling med én eller flere glykosidaser gjøre grad av
glykosylering redusert, sammenliknet med en hyaluronidase som ikke ble spaltet med
én eller flere glykosidaser.
20
Delvis deglykosylerte hyaluronandegraderende enzymer, inkludert delvis
deglykosylerte oppløselige PH20 polypeptider, kan ha 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50
%, 60 %, 70 %, eller 80 % av nivået av glykosylering av et fullstendig glykosylert
polypeptid. Typisk, utviser delvis deglykosylert hyaluronandegraderende enzymer,
25
inkludert delvis deglykosylerte oppløselige PH20 polypeptider, hyaluronidaseaktivitet
som er 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %,
120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 %, eller mer av
hyaluronidaseaktiviteten utvist ved fullstendig glykosylert polypeptid.
30
5. Modifikasjoner av hyaluronandegraderende enzymer for å forbedre
deres farmakokinetikkegenskaper
Hyaluronandegraderende enzymer kan bli modifisert for å forbedre deres
farmakokinetiske egenskaper, så som økning av deres halveringstid in vivo og/eller
aktiviteter. Modifikasjon av hyaluronandegraderende enzymer for anvendelse i
35
sammensetningene og/eller metodene som er tilveiebrakt, kan inkludere kobling,
direkte eller indirekte via en linker, så som kovalent eller med annen stabil kobling, en
82
polymer, så som dekstran, en polyetylenglykol (pegylering (PEG)) eller sialylgruppe,
eller andre slike polymerer, så som naturlige eller sukkerpolymerer.
Pegylering av terapeutiske midler er kjent for å øke motstanden mot proteolyse, øke
5
plasmaets halveringstid, og redusere antigenisiteten og immunogenisiteten. Kovalent
eller annen stabil kobling (konjugering) av polymere molekyler, så som
polyetylenglykolgruppen (PEG), til hyaluronandegraderende enzym, kan dermed
tilveiebringe fordelaktige egenskaper til den resulterende
enzympolymersammensetningen. Slike egenskaper inkluderer forbedret
10
biokompatibilitet, utvidelse av protein (og enzymatisk aktivitet) halveringstid i blod,
celler og/eller i andre vev i et individ, som tilveiebringer beskyttelse av proteinet fra
proteaser og hydrolyse, forbedre biodistribusjon, forøke farmakokinetikk og/eller
farmakodynamikk, og øke vannoppløseligheten.
15
Eksempelvise polymerer som kan bli konjugert til hyaluronandegraderende enzym,
inkluderer naturlige og syntetiske homopolymerer, så som polyoler (dvs. poly-OH),
polyaminer (dvs. poly-NH2) og polykarboksylsyrer (dvs. poly-COOH), og ytterligere
heteropolymerer dvs. polymerer omfattende én eller flere forskjellige koblingsgrupper
f.eks. en hydroksylgruppe og amingrupper. Eksempler på egnede polymere molekyler
20
inklyderer polymere molekyler valgt fra blant polyalkylenoksider (PAO), så som
polyalkylenglykoler (PAG), inkludert polypropylenglykoler (PEG),
metoksypolyetylenglykoler (mPEG) og polypropylenglykoler, PEG-glysidyletere (EpoxPEG), PEG-oksykarbonylimidazol (CD1-PEG) forgrenede polyetylenglykoler (PEGs),
polyvinylalkohol (PVA), polykarboksylater, polyvinylpyrrolidon, poly-D,L-aminosyrer,
25
polyetylen-ko-maleinsyreanhydrid, polystyren-ko-malinsyreanhydrid, dekstraner
inkludert karboksymetyl-dekstraner, heparin, homolog albumin, celluloser, inkludert
metylcellulose, karboksymetylcellulose, etylcellulose,
hydroksyetylcellulosekarboksyetylcellulose og hydroksypropylcellulose, hydrolysater
av chitosan, stivelser så som hydroksyetylstivelser og hydroksypropylstivelser,
30
glykogen, agaroser og derivater derav, guargummi, pullulan, inulin, xantangummi,
karrageenan, pektin, alginsyrehydrolysater og bio-polymerer.
Typisk er polymerene polyalkylenoksider (PAO), så som polyetylenoksider, så som
PEG, typisk mPEG, som, sammenliknet med polysakkarider så som dekstran, pullulan
35
og liknende, har fem reaktive grupper som har evne til kryssbinding. Typisk er
polymerene ikke-toksiske polymere molekyler så som (m)polyetylenglykol (mPEG)
83
som kan bli kovalent konjugert til hyaluronandegraderende enzym (f.eks. til
koblingsgrupper på proteinoverflaten) ved anvendelse av en relativt enkel kjemi.
Egnede polymere molekyler for kobling til hyaluronandegraderende enzym inkluderer,
5
men er ikke begrenset til, polyetylenglykol (PEG) og PEG-derivater så som metoksypolyetylenglykoler (mPEG), PEG-glykidyletere (Epox-PEG), PEG-oksykarbonylimidazol
(CDI-PEG), forgrenede PEGs, og polyetylenoksid (PEO) (se f.eks. Roberts et al.,
Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476, Harris og Zalipsky, S (red.)
“Poly(etylenglykol), Chemistry and Biological Applications” ACS Symposium serier 680,
10
1997, Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000, Harris, Nature
Review 2:215 et seq. (2003), og Tsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004).
Polymere molekyler kan ha en molekylvekt som typisk omfatter fra omtrent 3 kDa til
omtrent 60 kDa. I noen utførelsesformer har det polymere molekylet som er konjugert
til et protein, så som rHuPH20, en molekylvekt på 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,
15
50, 55, 60 eller mer enn 60 kDa.
Forskjellige metoder for modifisering av polypeptider ved kovalent kobling
(konjugering) av et PEG eller PEG-derivat (dvs. “PEGylering”) er kjent innenfor
fagområdet (se f.eks. US 2006/0104968, US 5 672 662, US 6 737 505 og US
20
2004/0235734). Teknikker for PEGylering inkluderer, men er ikke begrenset til,
spesialiserte linkere og koblingskjemier (se f.eks. Harris, Adv. Drug Deliv. Rev.
54:459-476, 2002), kobling av multiple PEG-grupper til et enkelt konjugeringssete (så
som via anvendelse av forgrenede PEG; se f.eks. Veronese et al., Bioorg. Med. Chem.
Lett. 12:177-180, 2002), setespesifikk PEGylering og/eller mono-PEGylering (se f.eks.
25
Champman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999), og seterettet enzymatisk
PEGylering (se f.eks. Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002) (se også for
eksempel, Lu og Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. . 43:127-138, Lu og Felix
(1993) Peptide Res. 6:142-6, 1993, Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64,
Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404, Brumeanu et al. (1995) J
30
Immunol. 154:3088-95, se også Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev.
55(10):126-77 og Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). Metoder og
teknikker beskrevet innenfor fagområdet kan produsere proteiner som har 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10 eller mer enn 10 PEG eller PEG-derivater koblet til et enkelt
proteinmolekyl (se f.eks. US 2006/0104968).
35
En mengde reagenser for PEGylering er blitt beskrevet innenfor fagområdet. Slike
reagenser inkluderer, men er ikke begrenset til N-hydroksysuksinimidyl (NHS) aktivert
84
PEG, suksinimidyl-mPEG, mPEG2-N-hydroksysuksinimid, mPEG-suksinimidyl alfametylbutanoat, mPEG-suksinimidylpropionat, mPEG-suksinimidylbutanoat, mPEGkarboksymetyl 3-hydroksybutansyresiksinimidylester, homobifunksjonell PEGsuksinimidylpropionat, homobifunksjonell PEG-propionaldehyd, homobifunksjonell
5
PEG-butyraldehyd, PEG-maleimid, PEG-hydrazid, p-nitrofenylkarbonat-PEG, mPEGbenzotriazolkarbonat, propionaldehyd-PEG, mPEG-butyraldehyd, forgrenet mPEG2butyraldehyd, mPEG-acetyl, mPEG-piperidon, mPEG-metylketon, mPEG “linkerless”
maleimid, mPEG-vinylsulfion, mPEG-tiol, mPEG-ortopyridyltioester, mPEGortopyridyldisulfid, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinylsulfon PEG-NHS, akrylat PEG-
10
NHS, fluorescein PEG-NHS, og biotin PEG-NHS (se f.eks. Monifardini et al.,
Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995, Veronese et al., J. Bioactive Comaptible Polymers
12:197-207, US 5 672 662, US 5 932 462, US 6 495 659, US 6 737 505, US
4 002 531, US 4 179 337, US 5 122 614, US 5 183 550, US 5 324 844, US 5 446 090,
US 5 612 460, US 5 643 575, US 5 766 581, US 5 795 569, US 5 808 096, US
15
5 900 461, US 5 919 455, US 5 985 263, US 5 990 237, US 6 113 906, US 6 214 966,
US 6 258 351, US 6 340 742, US 6 413 507, US 6 420 339, US 6 437 025, US
6 448 369, US 6 461 802, US 6 828 401, US 6 858 736, US 2001/0021763, US
2001/9944526, US 2001/0046481, US 2002/0052430, US 2002/0072573, US
2002/0156047, US 2003/0114647, US 2003/0143596, US 2003/0158333, US
20
2003/0220447, US 2004/0013637, US 2004/0235734, US 2005/000360, US
2005/0114037, US 2005/0171328, US 2005/0209416, EP 01064951, EP 0822199,
WO 0176640, WO 0002017, WO 0249673, WO 9428024, og WO 0187925).
I ett eksempel er det hyaluronandegraderende enzymet for anvendelse i metoder,
25
sammensetninger og kombinasjoner tilveiebrakt en oppløselig hyaluronidase som er
PEGylert. I et spesielt eksempel er den oppløselige hyaluronidasen en PEGylert PH20
hyaluronidase. I et annet bestemt eksempel er den oppløselige hyaluronidasen
PEGylert rHuPH20, så som den beskrevet i eksempel 10.
30
E. Metoder for produsering av nukleinsyrer kodende for et insulin eller
hyaluronandegraderende enzym og polypeptider derav
Polypeptider av et insulin og hyaluronandegraderende enzym angitt heri, kan bli
oppnådd ved metoder som er velkjente innen fagområdet for proteinrensing og
rekombinant proteinekspresjon. Polypeptider kan også bli syntetisert kjemisk. For
35
eksempel kan A-kjeden og B-kjeden av insulin bli kjemisk syntetisert, og deretter
kryssbundet med disulfidbindinger gjennom, f.eks., en reduksjonreoksideringsreaksjon. Når polypeptidene blir produsert ved rekombinante metoder,
85
kan en hvilken som helst metode kjent for fagfolk innenfor dette området for
identifikasjon av nukleinsyrer som koder for de ønskede genene bli anvendt. En
hvilken som helst metode tilgjengelig innenfor fagområdet kan bli anvendt for å oppnå
et fullengde (dvs. omfattende hele den kodende regionen) cDNA eller genomisk DNA5
klon, kodende for en hyaluronidase, så som fra en celle eller vevskilde. Modifisert eller
variantinsuliner eller hyaluronandegraderende enzymer kan bli konstruert fra et
villtype polypeptid, så som ved seterettet mutagenese.
Polypeptider kan bli klonet eller isolert ved anvendelse av hvilke som helst
10
tilgjengelige metoder kjent innenfor fagområdet, for kloning og isolering av
nukleinsyremolekyler. Slike metoder inkluderer PCR-amplifikasjon av nukleinsyrer og
screening av biblioteker, inkludert nukleinsyrehybridiseringsscreening, antistoffbasert
screening, og aktivitetsbasert screening.
15
Metoder for amplifikasjon av nukleinsyrer kan bli anvendt for å isolere
nukleinsyremolekyler som koder for et ønsket polypeptid, inkludert f.eks.,
polymerasekjedereaksjons (PCR) metoder. Et nukleinsyreinneholdende materiale kan
bli anvendt som et utgangsmateriale, hvorfra et ønsket polypeptidkodende
nukleinsyremolekyl kan bli isolert. For eksempel kan DNA- og mRNA-prepareringer,
20
celleekstrakter, vevsekstrakter, fluidprøver (dvs. blod, serum, spytt), prøver fra friske
og/eller syke individer bli anvendt i amplifikasjonsmetodene. Nukleinsyrebibliotek kan
også bli anvendt som en kilde for utgangsmaterialer. Primere kan bli konstruert for å
amplifisere et ønsket polypeptid. For eksempel kan primere bli konstruert basert på de
uttrykte sekvensene hvorfra et ønsket polypeptid er dannet. Primere kan bli
25
konstruert basert på tilbaketranslasjon av en polypeptidaminosyresekvens.
Nukleinsyremolekyler dannet ved amplifikasjon kan bli sekvensert og bekreftet å kode
for et ønsket polypeptid.
Ytterligere nukleotidsekvenser kan bli koblet til et polypeptidkodende
30
nukleinsyremolekyl, inkludert linkersekvenser inneholdende
restriksjonsendonukleaseseter for det formålet å klone det syntetiske genet inn i en
vektor, f.eks., en proteinekspresjonsvektor, eller en vektor konstruert for
amplifikasjon av kjerneproteinkodende DNA-sekvenser. Videre kan ytterligere
nukleotidsekvenser som spesifiserer funksjonelle DNA-elementer bli operabelt koblet
35
til et polypeptidkodende nukleinsyremolekyl. Eksempler på slike sekvenser inkluderer,
men er ikke begrenset til, promotersekvenser konstruert for å lette intracellulær
proteinekspresjon, og sekresjonssekvenser, f.eks. heterologe signalsekvenser,
86
konstruert for å lette proteinsekresjon. Slike sekvenser er kjent for fagfolk innenfor
dette området. Ytterligere nukleotidresidiesekvenser så som sekvenser av baser som
spesifiserer proteinbindingsregioner kan også bli koblet til enzymkodende
nukleinsyremolekyler. Slike regioner inkluderer, men er ikke begrenset til, sekvenser
5
av residier som letter eller koder for proteiner som letter opptak av et hvilket som
helst enzym til spesifikke målceller, eller på annen måte endre farmakokinetikken til et
produkt av et syntetisk gen. For eksempel kan enzymer bli koblet til PEG-gruppene.
I tillegg kan tagger eller andre grupper bli tilsatt, f.eks., for å behjelpe deteksjon eller
10
affinitetsrensing av polypeptidet. For eksempel kan ytterligere
nukleotidresidiesekvenser så som sekvenser av baser som spesifiserer en epitopetag
eller annen detekterbar markør, også bli koblet til enzymkodende
nukleinsyremolekyler. Eksempler på slike sekvenser inkluderer nukleinsyresekvenser
som koder for en His-tag (f.eks. 6xHis HHHHHH, SEKV. ID nr. 54) eller Flag Tag
15
(DYKDDDDK, SEKV. ID nr. 55).
Identifiserte og isolerte nukleinsyrer kan deretter bli tatt inn i en hensiktsmessig
kloningsvektor. Et stort antall vektorvertssystemer kjent innenfor fagområdet kan bli
anvendt. Mulige vektorer inkluderer, men er ikke begrenset til, plasmider eller
20
modifiserte viruser, men vektorsystemet må være kompatibelt med anvendt
vertscelle. Slike vektorer inkluderer, men er ikke begrenset til, bakteriofager så som
lambdaderivater, eller plasmider så som pCMV4-, pBR322- eller pUC-plasmidderivater
eller Bluescriptvektorer (Stratagene, La Jolla, CA). Andre ekspresjonsvektorer
inkluderer HZ24-ekspresjonsvektoren eksemplifisert heri. Innskudd inn i en
25
kloningsvektor kan f.eks. bli oppnådd ved ligering av DNA-fragmentet inn i en
kloningsvektor som har komplementære kohesive termini. Innskudd kan bli oppnådd
ved anvendelse av TOPO-kloningsvektorer (INVITROGEN, Carlsbad, CA). Dersom de
komplementære restriksjonssetene anvendt for å fragmentere DNA ikke er tilstede i
kloningsvektoren, kan endene av DNA-molekylene bli enzymatisk modifisert.
30
Alternativt kan et hvilket som helst ønsket sete bli produsert ved ligering av
nukleotidsekvensene (linkere) på DNA-termini; disse ligerte linkerne kan inneholde
spesifikk kjemisk syntetiserte oligonukleotider kodende for
restriksjonsendonukleasegjenkjenningssekvenser. I en alternativ metode, kan det
spaltede vektor- og proteingenet bli modifisert ved homopolymer “tailing”.
35
Rekombinante molekyler kan bli introdusert inn i vertsceller via, f.eks. transformasjon,
transfeksjon, infeksjon, elektroporasjon, og sonoporasjon, slik at mange kopier av
gensekvensen blir dannet.
87
Insulin kan bli produsert ved anvendelse av forskjellige teknikker (se f.eks. Ladisch et
al. (1992) Biotechnol. Prog. 8:469-478). I noen eksempler blir nukleinsyre kodende
for et preproinsulin eller proinsulinpolypeptid tatt inn i en ekspresjonsvektor. Ved
5
ekspresjon blir preproinsulinet eller proinsulinpolypeptidet omdannet til insulin med
enzymatiske eller kjemiske metoder som spalter signalsekvensen eller C-peptidet,
resulterende i A- og B-kjeder som er kryssbundet av disulfidbindinger gjennom, f.eks.
en reduksjons-reoksidasjonsreaksjon (se f.eks. Cousens et al., (1987) Gene 61:265275, Chance et al., (1993) Diabetes Care 4:147-154). I et annet eksempel blir
10
nukleinsyren kodende for A-kjeden og B-kjeden av et insulin satt inn i én eller to
ekspresjonsvektorer for ko-ekspresjon som et enkelt polypeptid fra en
ekspresjonsvektor eller ekspresjon som to polypeptider fra én eller to
ekspresjonsvektorer. Følgelig kan A- og B-kjedepolypeptider bli uttrykt separat, og
deretter kombinert, for å danne et insulin, eller kan bli ko-uttrykt, i fravær av en C-
15
kjede. I tilfeller hvor A- og B-kjedene blir ko-uttrykt som et enkelt polypeptid, kan
nukleinsyren kodende for subenheter også kode for en linker eller spacer mellom Bkjeden og A-kjeden, så som en linker eller spacer beskrevet nedenfor. Nukleinsyren
tatt inn i ekspresjonsvektoren kan f.eks. inneholde nukleinsyre kodende for insulin Bkjeden, en linker, så som f.eks., en alanin-alanin-lysin-linker, A-kjeden, som
20
resulterer i ekspresjon av, f.eks., “insulin B-kjede-Ala-Ala-Lys-insulin A-kjede”.
I spesifikke utførelsesformer muliggjør transformasjon av vertsceller med
rekombinante DNA-molekyler som inkorporerer det isolerte proteingenet, cDNA, eller
syntetisert DNA-sekvens dannelsen av multiple kopier av genet. Følgelig kan genet bli
25
oppnådd i store mengder ved å virke transformanter, isolering av rekombinante DNAmolekyler fra transformantene og, når nødvendig, oppnå det innsatte genet fra isolert
rekombinant DNA.
1. Vektorer og celler
30
For rekombinant ekspresjon av én eller flere av de ønskede proteinene, så som hvilke
som helst beskrevet heri, kan nukleinsyren inneholdende alle eller en del av
nukleotidsekvensen kodende for proteinet bli satt inn i en hensiktsmessig
ekspresjonsvektor, dvs. en vektor som inneholder de nødvendige elementene for
transkripsjon og translasjon av den innsatte proteinkodende sekvensen. De
35
nødvendige transkripsjonelle og translasjonelle signalene kan også bli tilført av den
native promoteren for enzymgener, og/eller deres flankerende regioner.
88
Også tilveiebrakt er vektorer som inneholder en nukleinsyre kodende for enzymet.
Celler inneholdende vektorene er også tilveiebrakt. Cellene inkluderer eukaryote og
prokaryote celler, og vektorene er hvilke som helst egnet for anvendelse deri.
Prokaryote og eukaryote celler, inkludert endotelceller, inneholdende vektorene er
5
tilveiebrakt. Slike celler inkluderer bakterielle celler, gjærceller, soppceller, archea,
planteceller, insektceller og dyreceller. Cellene blir anvendt for å produsere et protein
derav ved dyrking av overnevnte celler under betingelser hvorved det kodede
proteinet blir uttrykt av cellene, og isolering av det uttrykte proteinet. For formål heri,
kan f.eks. enzymet bli utskilt inn i mediet.
10
Tilveiebrakt er vektorer som inneholder en sekvens av nukleotider som koder for det
oppløselige hyaluronidasepolypeptidet koblet til den native eller heterologe
signalsekvensen, samt multiple kopier derav. Vektorene kan bli valgt for ekspresjon av
enzymproteinet i cellen, eller slik at enzymproteinet blir uttrykt som et utskilt protein.
15
Forskjellige vert-vektor-systemer kan bli anvendt for å uttrykke den proteinkodende
sekvensen. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, pattedyrcellesystemer infisert
med virus (f.eks.vaksiniavirus, adenovirus og andre viruser); insektcellesystemer
infisert med virus (f.eks. baulovirus); mikroorganismer så som gjærinneholdende
20
gjærvektorer; eller bakterier transformert med bakteriofag, DNA, plasmid DNA eller
kosmid DNA. Ekspresjonselementer av vektorer varierer i deres styrke og
spesifisiteter. Avhengig av vert-vektorsystem som blir anvendt, kan hvilke som helst
av et antall egnede transkripsjons- og translasjonselementer bli anvendt.
25
Hvilke som helst metoder kjent for fagfolk innenfor dette området for innskudd av
DNA-fragmenter inn i en vektor kan bli anvendt for å konstruere ekspresjonsvektorer
inneholdende et chimært gen inneholdende hensiktsmessige
transkripsjonelle/translasjonelle kontrollsignaler og proteinkodende sekvenser. Disse
metodene kan inkludere in vitro rekombinante DNA og syntetiske teknikker og in vivo
30
rekombinanter (genetisk rekombinasjon). Ekspresjon av nukleinsyresekvenser
kodende for protein, eller domener, derivater, fragmenter eller homologer derav, kan
bli regulert ved en andre nukleinsyresekvens, slik at genene eller fragmentene derav
blir uttrykt i en vert transformert med det rekombinante DNA-molekylet(ene). For
eksempel kan ekspresjonen av proteinene bli kontrollert ved en hvilken som helst
35
promoter/enhancer kjent innenfor fagområdet. I en spesifikk utførelsesform er
promoteren ikke nativ for genene for et ønsket protein. Promotere som kan bli
anvendt, inkluderer, men er ikke begrenset til, SV40 early promoter (Bernoist og
89
Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), promoteren innbefattet i den 3’ lange
terminale gjentagelsen av Rous sarkomavirus (Yamamoto et al. Cell 22:787-797
(1980)), herpestymidinkinasepromoter (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:1441-1445 (1981)), regulatoriske sekvenser av metallotioneingenet (Brinster et
5
al., NatureSURNDU\RWHHNVSUHVMRQVYHNWRUHUVnVRPǃ
laktamasepromoteren (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) eller tacpromoteren (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)), se også
“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”: in Scientific American 242:79-94
(1980)), planteekspresjonsvektorer inneholdende nopalinsyntetasepromoteren
10
(Herrara-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)) eller cauliflower mosaikkvirus
35S RNA-promoter (Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), og promoteren
til fotosynteseenzymet ribulosebifosfatkarboksylase (Herrera-Estrella et al., Nature
310:115-120 (1984)), promoterelementer fra gjær og andre sopparter, såsom Gal4promoteren, alkoholdehydrogenasepromoteren, fosfoglyserolkinasepromoteren,
15
alkalisk fosfatasepromoter, og følgende dyr transkripsjonelle kontrollregioner som
utviser vevsspesifisitet, og som har blitt anvendt i transgene dyr: elastase I
genkontrollregionen som er aktiv i pankreatiske acinarceller (Swift et al., Cell 38:639646 (1984), Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986),
MacDonald, Hepatology 7: 425-515 (1987)), insulingenkontrollregionen som er aktiv i
20
pankreas beta-celler (Hanahan et al., Nature 315: 115-122 (1985)),
immunoglobulingenkontrollregionen som er aktiv i lymfoide celler (Grosschedl et al.,
Cell 38: 647-658 (1984); Adams et al., Nature 318: 533-538 (1985), Alexander et al.,
Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), musebrysttumorviruskontrollregion som er aktiv i
testikulære, bryst, lymfoid og mastceller (Leder et al., Cell 45: 485-495 (1986)),
25
albumingenkontrollregionen som er aktiv i leveren (Pinckert et al., Genes and Devel.
1:268-276 (1987)), alfa-fetoproteingenkontrollretionen som er aktiv i leveren
(Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985), Hammer et al., Science 235:5358 (1987)), alfa-1 antitrypsingenkontrollregionen som er aktiv i leveren (Kelsey et al.,
Genes and Devel. 1:161-171 (1987)), betaglobulingenkontrollregionen som er aktiv i
30
myeloidceller (Magram et al., Nature 315:338-340 (1985), Kollias et al., Cell 46:89-94
(1986)), myelin basic proteingenkontrollregionen som er aktiv i oligodendrocyttcellene
i hjernen (Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)), myosin lettkjede-2
genkontrollretionen som er aktiv i skjelettmuskel (Shani, Nature 314:283-286
(1985)), og gonadotrofisk frigjørende hormongenkontrollretion som er aktiv i
35
gonadotrofer av hypotalamus (Mason et al., Science 234: 1372-1378 (1986)).
90
I en spesifikk utførelsesform blir en vektor anvendt som inneholder en promoter
operabelt koblet til nukleinsyrer kodende for et ønsket protein, eller en domene,
fragment, derivat eller homolog derav, én eller flere replikasjonsorigoer, og eventuelt,
én eller flere selekterbare markører (f.eks. et antibiotikaresistensgen). Eksempler på
5
plasmidvekotrer for transformasjon av E. coli celler, inkluderer, f.eks. pQEekspresjonsvektorer (tilgjengelig fra Qiagen, Valencia, CA, se også litteratur publisert
av Qiagen som beskriver systemet). pQE-vektorer har en fag T5-promoter (gjenkjent
av E. coli RNA-polymerase) og en dobbel lac-operatorrepresejonsmodul for å
tilveiebringe tett regulering, høy-nivåekspresjon av rekombinante proteiner i E. coli, et
10
syntetisk ribosomalt bindingssete (RBS II) for effektiv translasjon, en 6XHis tagkodende sekvens, t0 og T1 transkripsjonelle terminatorer, ColE1 replikasjonsorigo, og
et beta-laktamasegen for å utvise ampicillinresistens. pQE-vektorer muliggjør
plassering av en 6xHis tag ved hvilke som helst av N- eller C-terminusen av det
rekombinante proteinet. Slike plasmider inkluderer pQE 32, pQE 30, og pQE 31 som
15
tilveiebringer multiple kloningsseter for alle tre leserammer, og tilveiebringer
ekspresjon av de N-terminalt 6xHis-taggede proteinene. Andre eksempler på
plasmidvektorer for transformasjon av E. coli celler, inkluderer, f.eks. pETekspresjonsvektorene (se US patent 4 952 596, tilgjengelig fra NOVAGEN, Madison,
WI; se også litteratur publisert av Novagen som beskriver systemet). Slike plasmider
20
inkluderer pET 11a, som inneholder T7lac-promoteren, T7-terminator, induserbar E.
coli lac-operator, og lac-repressorgen; pET 12a-c, som inneholder T7-promoteren, T7terminator og E. coli ompT sekresjonssignal; og pET 15b og pET19b (NOVAGEN,
Madison, WI), som inneholder en His-TagTM ledersekvens for anvendelse ved rensing
med en His-kolonne og et trombinspaltingssete som muliggjør spalting etter rensing
25
over kolonnen, T7-lac-promoterregion og T7-terminatoren.
Eksempler på en vektor for pattedyrcelleekspresjon er HZ24-ekspresjonsvektoren.
HZ24-ekspresjonsvektoren ble oppnådd fra pCI-vektorskjelettet (Promega). Det
inneholder DNA kodende for beta-laktamaseresistensgenet (AmpR), en F1
30
replikasjonsorigo, en cytomegalovirus immediate-early enhancer/promoter-region
(CMV), og et SV40 late polyadenyleringssignal (SV40). Ekspresjonsvektoren har også
et indre ribisominngangssete (IRES) fra ECMV-virus (Clontech) og
musedihydrofolatreduktase (DHFR) gen.
35
2. Linkergrupper
I noen eksempler blir insulin dannet ved å danne A-kjede og B-kjedepolypeptider med
en linker, slik at f.eks. C-terminusen av B-kjeden blir koblet til N-terminusen til A-
91
kjeden med en kort linker. A-kjeden og B-kjeden kan bli uttrykt fra et enkelt
polypeptid inneholdende en linker, eller kan bli uttrykt separat, og deretter koblet med
en linker. Linkergruppen blir valgt avhengig av ønskede egenskaper. Linkergruppen
bør være lang nok og fleksibel nok til å muliggjøre at A-kjeden og B-kjeden etterlikner
5
den naturlige konformasjonen av insulin. Linkere kan være en hvilken som helst
gruppe egnet for insulin A-kjeden og B-kjeden. Slike grupper inkluderer, men er ikke
begrenset til, peptidbindinger; aminosyre og peptidbindinger, typisk inneholdende
mellom én og omtrent 60 aminosyrer; kjemiske linkere, så som heterobifunksjonelle
spaltbare krysslinkere, fotospaltbare linkere, og syrespaltbare linkere.
10
Linkergruppene kan være peptider. Peptidet har typisk fra omtrent 2 til omtrent 60
aminosyreresidier, for eksempel fra omtrent 5 til omtrent 40, eller fra omtrent 10 til
omtrent 30 aminosyreresidier. Peptidlinkere kan hensiktsmessig bli kodet av
nukleinsyre, og inkorporert i fusjonsproteiner ved ekspresjon i en vertscelle, så som E.
15
coli. I ett eksempel blir en alanin-alanin-lysin (AAK) (SEKV. ID nr. 178) linker kodet i
en nukleinsyre mellom nukleinsyren kodende for insulin B-kjede og nukleinsyren
kodende for A-kjeden, slik at ved ekspresjon blir en “insulin B-kjede-AAK-insulin Akjede” polypeptid produsert. Peptidlinkere kan være en fleksibel
spaceraminosyresekvens, så som de som er kjent i enkeltkjedeantistofforskning.
20
Eksempler på slike kjente linkergrupper inkluderer, men er ikke begrenset til, RPPPPC
(SEKV. ID nr. 166) eller SSPPPC (SEKV. ID nr. 167), GGGGS (SEKV. ID nr. 168),
(GGGGS)n (SEKV. ID nr. 169), GKSSGSGSESKS (SEKV ID nr. 170),
GSTSGSGKSSEGKG (SEKV. ID nr. 171), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEKV. ID nr. 172),
GSTSGSGKSSEGKG (SEKV. ID nr. 173), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEKV. ID nr. 174),
25
EGKSSGSGSESKEF (SEKV. ID nr. 175), SRSSG (SEKV. Id NR. 176) og SGSSC (SEKV.
ID nr. 177).
Alternativt kan peptidlinkergruppen være VM (SEKV. ID nr. 179) eller AM (SEKV. ID
nr. 180), eller ha strukturen beskrevet i formel: AM(G2 til 4S)xAM, hvor X er et tall fra 1
30
til 11 (SEKV. ID nr. 181). Ytterligere linkergrupper er f.eks. beskrevet i Huston et al.
(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Whitlow, M., et al. (1993) Protein
Engineering 6:989-995; Newton et al. (1996) Biochemistry 35:545-553; A. J. Cumber
et al. (1972) Bioconj. Chem. 3:397-401; Ladurner et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:330337; og US patent nr. 4 894 443.
35
I noen eksempler blir peptidlinkere kodet av nukleinsyren, og inkorporert mellom Bkjeden og A-kjeden ved ekspresjon i en vertscelle, så som E. coli eller S. cerevisiae. I
92
andre eksempler blir en peptidlinker syntetisert ved kjemiske metoder. Dette kan bli
utført i en separat protokoll for syntese av én eller flere av A- og B-kjeden, hvoretter
komponentene blir koblet, så som med anvendelse av heterobifunksjonelle linkere.
Alternativt kan en peptidlinker bli syntetisert ved N- eller C-terminusen til én av
5
insulinkjedene, som deretter blir koblet til den andre kjeden via peptidlinkeren, så som
med en heterobifunksjonell linker.
En hvilken som helst linker kjent for fagfolk innenfor dette området kan bli anvendt
heri, for å koble insulin A-kjeden og B-kjeden. Linkere og bindinger som er egnet for
10
kjemisk kobling av kjedene inkluderer, men er ikke begrenset til, disulfidbindinger,
tioesterbindinger, hindrede disulfidbindinger, og kovalente bindinger mellom frie
reaktive grupper, så som amin- og tiolgrupper. Disse bindingene blir produsert ved
anvendelse av heterobifunksjonelle reagenser for å produsere reaktive tiolgrupper på
én eller begge polypeptidene, og deretter reagering av tiolgruppene på et polypeptid
15
med reaktive tiolgrupper eller amingrupper, hvortil reaktive maleimidogrupper eller
tiolgrupper kan bli koblet på den andre. Andre linkere inkluderer syrespaltbare linkere,
så som bismaleimidoksypropan, syrelabile-transferinkonjugater og
adipinsyredihydrazid, kan bli spaltet i flere sure intracellulære rom; krysslinkere som
blir spaltet ved eksponering for UV eller synlig lys og linkere, så som forskjellige
20
domener, så som CH1, CH2 og CH3, fra den konstante regionen av human IgG1 (se
Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30:379-386). I noen utførelsesformer kan
flere linkere bli inkludert for å dra nytte av de ønskede egenskapene til hver linker.
Kjemiske linkere og peptidlinkere kan bli satt inn ved kovalent kobling av linkeren til
insulin A-kjeden og B-kjeden. De heterobifunksjonelle midlene, beskrevet nedenfor,
25
kan bli anvendt for å oppnå slik kovalent kobling. Peptidlinkere kan også bli koblet ved
uttrykking av DNA kodende for linkeren mellom B-kjeden og A-kjeden.
Andre linkere som kan bli anvendt for å koble A-kjeden og B-kjeden av insulin
inkluderer: enzymsubstrater, så som katepsin B-substrat, katepsin D-substrat,
30
trypsinsubstrat, trombinsubstrat, subtilisinsubstrat, faktor Xa-substrat, og
enterokinasesubstrat; linkere som øker oppløselighet, fleksibilitet og/eller intracellulær
spaltparhet inkluderer linkere, så som (glymser)n og (sermgly)n, hvor m er 1 til 6,
fortrinnsvis 1 til 4, mer foretrukket 2 til 4, og n er 1 til 30, fortrinnsvis 1 til 10, mer
foretrukket 1 til 4 (se f.eks. internasjonal PCT-søknad nr. WO 96/06641, som
35
tilveiebringer eksempler på linkere). I noen utførelsesformer kan flere linkere bli
inkludert for å dra nytte av de ønskede egenskapene til hver linker.
93
3. Ekspresjon
Insulin og hyaluronandegraderende enzympolypeptider kan bli produsert ved en
hvilken som helst metode kjent for fagfolk innenfor dette området, inkludert in vivo og
in vitro metoder. Ønskede proteiner kan bli uttrykt i en hvilken som helst organisme
5
egnet for å produsere de nødvendige mengdene og formene av proteinene, så som
f.eks., nødvendig for administrasjon og behandling. Ekspresjonsverter inkluderer
prokaryote og eukaryote organismer, så som E. coli, gjær, planter, insektceller,
pattedyrceller, inkludert humane cellelinjer og transgene dyr. Ekspresjonsverter kan
være forskjellige i deres proteinproduksjonsnivåer, samt typer av post-translasjonelle
10
modifikasjoner som er tilstede på de uttrykte proteinene. Valg av ekspresjonsvert kan
bli utført basert på disse og andre faktorer, så som regulatoriske og
trygghetsbetraktninger, produksjonskostnader, og behovet og rensingsmetodene.
Mange ekspresjonsvektorer er tilgjengelige og kjent for fagfolk innenfor dette
15
området, og kan bli anvendt for ekspresjon av proteiner. Valg av ekspresjonsvektor vil
være influert av valg av vertekspresjonssystem. Generelt kan ekspresjonsvektorer
inkludere transkripsjonelle promotere og eventuelle enhancere, translasjonssignaler
og transkripsjonelle og translasjonelle termineringssignaler. Ekspresjonsvektorer som
blir anvendt for stabil transformasjon har typisk en selekterbar markør som muliggjør
20
seleksjon og opprettholdelse av de transformerte cellene. I de fleste tilfellene kan
replikasjonsorigo bli anvendt for å amplifisere kopiantallet av vektoren.
Oppløselige hyaluronidasepolypeptider kan også bli anvendt eller uttrykt som
proteinfusjoner. For eksempel kan en enzymfusjon bli dannet for å tilsette ytterligere
25
funksjonalitet til et enzym. Eksempler på enzymfusjonsproteiner inkluderer, men er
ikke begrenset til, fusjoner av en signalsekvens, en tag så som for lokalisering, f.eks.
en his6 tag eller en myc tag, eller en tag for rensing, f.eks. en GST-fusjon, og en
sekvens for å lede proteinsekresjon og/eller membranassosiasjon.
30
a. Prokaryote celler
Prokaryoter, spesielt E. coli, tilveiebringer et system for produsering av store mengder
proteiner. Transformasjon av E. coli er en enkel og hurtig teknikk velkjent for fagfolk
innenfor dette området. Ekspresjonsvektorer for E. coli kan inneholde induserbare
promotere, slike promotere er nyttige for indusering av høye nivåer av
35
proteinekspresjon og for uttrykking av proteiner som utviser en viss toksisitet på
vertscellene. Eksempler på induserbare promotere inkluderer lac-promoteren, trp-
94
promoteren, hybrid tac-promoter, T7- og SP6 RNA-promotere og temperaturregulert
OPL-promoter.
Proteiner, så som hvilke som helst tilveiebrakt heri, kan bli uttrykt i det cytoplasmiske
5
miljøet til E. coli. Cytoplasma er et reduserende miljø, og for noen molekyler kan dette
resultere i dannelsen av uoppløselige inklusjonslegemer. Reduksjonsmidler så som
GLWLRWUHRWRORJǃPHUNDSWRHWDQRORJGHQDWXUHULQJVPLGOHUVnVRPJXDQLGLQ+&ORJXUHD
kan bli anvendt for å resolubilisere proteinene. En alternativ tilnærming er ekspresjon
av proteinene i det periplasmiske rommet til bakteriene som tilveiebringer et
10
oksiderende miljø, og chaperoninliknende og disulfidisomeraser og kan føre til
produksjon av oppløselig protein. Typisk blir en ledersekvens fusjonert til proteinet
som skal bli uttrykt som lederproteinet til periplasma. Lederen blir deretter fjernet av
signalpeptidaser inne i periplasma. Eksempler på periplasmamålsøkende
ledersekvenser inkluderer pelB-lederen fra pektatlyasegenet, og lederen avledet fra
15
alkalisk fosfatasegenet. I noen tilfeller muliggjør periplasmaekspresjon lekkasje av det
uttrykte proteinet inn i kulturmediet. Sekresjon av proteiner muliggjør hurtig og enkel
rensing fra kultursupernatanten. Proteiner som ikke blir utskilt, kan bli oppnådd fra
periplasma ved osmotisk lysering. I likhet med cytoplasmisk ekspresjon, kan i noen
tilfeller proteinene bli oppløselige, og denatureringsmidler og reduksjonsmidler kan bli
20
anvendt for å lette solubilisering og refolding. Temperaturen på induksjon og vekst
kan også influere på ekspresjonsnivåer og oppløselighet, typisk blir temperaturer
mellom 25oC og 37oC anvendt. Typisk produserer bakterier aglykosylerte proteiner.
Følgelig, dersom proteiner krever glykosylering for funksjon, kan glykosylering bli
tilført in vitro etter rensing fra vertscellene.
25
b. Gjærceller
Gjærtyper så som Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia
lipolytica, Kluyveromyces lactis og Pichia pastoris er velkjente gjærekspresjonsverter
som kan bli anvendt for produksjon av proteiner, så som et hvilket som helst
30
beskrevet heri. Gjær kan bli transformert med episomale replikasjonsvektorer eller
ved stabil kromosomal integrasjon ved homolog rekombinasjon. Typisk blir
induserbare promotere anvendt for å regulere genekspresjonen. Eksempler på slike
promotere inkluderer GAL1, GAL7 og GAL5 og metallotioneinpromotere, så som CUP1,
AOX1 eller annen Pichia eller annen gjærpromoter. Ekspresjonsvektorer inkluderer
35
ofte en selekterbar markør så som LEU2, TRP1, HIS3 og URA3 for seleksjon og
opprettholdelse av transformert DNA. Proteiner uttrykt i gjær er ofte oppløselige. Koekspresjon med chaperoniner så som Bip og proteindisulfidisomerase kan forbedre
95
ekspresjonsnivåene og oppløselighet. I tillegg kan proteiner uttrykt i gjær bli ledet for
sekresjon ved anvendelse av sekresjonssignalpeptidfusjoner slik at gjær “mating” type
alfa-faktorsekresjonssignal fra Saccharomyces cerevisae og fusjoner med
gjærcelleoverflateproteiner så som Aga2p-matingadhesjonsreseptoren eller Arxula
5
adeninivorans glukamylase. Et proteasespaltingssete så som for Kex-2-proteasen, kan
bli omkonstruert for å fjerne de fusjonerte sekvensene fra de uttrykte polypeptidene
når de forlater sekresjonsreaksjonsveien. Gjær har også evne til glykosylering ved
Asn-X-Ser/Thr-motivene.
10
c. Insektceller
Insektceller, spesielt ved anvendelse av bakulovirusekspresjon, er nyttige for
uttrykking av polypeptider så som hyaluronidasepolypeptider. Insektceller uttrykker
høye nivåer av protein, og har evne til de fleste post-trasjonelle modifikasjonene
anvendt av høyere eukaryoter. Bakulovirus har et restriktivt vertsområde som
15
forbedrer tryggheten og reduserer regulatoriske bekymringer ved eukaryot
ekspresjon. Typiske ekspresjonsvektorer anvender en promoter for ekspresjon i høyt
nivå, så som polyhedrinpromoteren til bakulovirus. Vanlig anvendte
bakulovirussystemer inkluderer bakuloviruser så som Autographa californica nukleær
polyhedrosisvirus (AcNPV), og Bombyx mori nukleær polyhedrosisvirus (BmNPV) og en
20
insektcellelinje så som Sf9 avledet fra Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta
(A7S) og Danaus plexippus (DpN1). For ekspresjon i høyt nivå, blir
nukleotidsekvensen til molekylet som skal bli uttrykt fusjonert rett nedstrøms for
polyhedrininitieringskodonet til viruset. Pattedyrsekresjonssignaler blir nøyaktig
prosessert i insektceller, og kan bli anvendt for å utskille det uttrykte proteinet inn i
25
kulturmediet. I tillegg produserer cellelinjene Pseudaletia unipuncta (A7S) og Danaus
plexippus (DpN1) proteiner med glykosyleringsmønstre som likner
pattedyrcellesystemene.
Et alternativt ekspresjonssysem i insektceller er anvendelse av stabilt transformerte
30
celler. Cellelinjer så som Schneider 2 (S2) og Kc-cellene (Drosophila melanogaster) og
C7-cellene (Aedes albopictus) kan bli anvendt for ekspresjon. Drosophila
metallotioneinpromoteren kan bli anvendt for å indusere høye nivåer av ekspresjon i
nærvær av tungmetallinduksjon med kadmium eller kobber. Ekspresjonsvektorer blir
typisk opprettholdt ved anvendelse av selekterbare markører så som neomycin og
35
hygromycin.
d. Pattedyrceller
96
Pattedyrekspresjonssystemer kan bli anvendt for å uttrykke proteiner som inkluderer
oppløselige hyalironidasepolypeptider. Ekspresjonskonstruksjoner kan bli overført til
pattedyrceller ved viral infeksjon, så som adenovirus eller ved direkte DNA-overføring
så som liposomer, kalsiumfosfat, DEAE-dekstran, og ved fysiske midler så som
5
elektroporasjon og mikroinjeksjon. Ekspresjonsvektorer for pattedyrceller innbefatter
typisk et mRNA cap-cete, en TATA-boks, en translasjonell initieringssekvens (Kozak
konsensussekvens) og polyadenyleringselementer. IRES-elementer kan også bli tilsatt
for å muliggjøre bisistronisk ekspresjon med et annet gen, så som en selekterbar
markør. Slike vektorer inkluderer ofte transkripsjonelle promoter-enhancere for
10
høynivåekspresjon, f.eks. SV40-promoter-enhancer, humant cytomegalovirus (CMV)
promoter, og lang terminal gjentagelse av Rous sarkomavirus (RSV). Disse promoterenhancerne er aktive i mange celletyper. Vev og celletypepromotere og
enhancerregioner kan også bli anvendt for ekspresjon. Eksempler på
promoter/enhancerregioner inkluderer, men er ikke begrenset til, de fra gener så som
15
elastase I, insulin, immunoglobulin, mysebrysttumorvirus, albumin, alfafetoprotein,
alfa 1 antitrypsin, betaglobin, myelin basic protein, myosin lettkjede 2, og
gonadotrofisk frigjøringshormongenkontroll. Selekterbare markører kan bli anvendt for
å selektere for, og opprettholde celler med ekspresjonskonstruksjonen. Eksempler på
selekterbare markørgener inkluderer, men er ikke begrenset til, hygromycin B
20
fosfotransferase, adenosindeaminase, xantin-guaninfosoribosyltransferase,
aminoglykosidfosfotransferase, dihydrofolatreduktase (DHFR) og tymidinkinase. For
eksempel kan ekspresjonen bli utført i nærvær av metaotreksat for å selektere for kun
de cellene som uttrykker DHFR-genet. Fusjon med
celleoverflatesignaliseringsmolekyler så som TCR-9 og FcHRI-J kan lede ekspresjonen
25
av proteinene i en aktiv fase på celleoverflaten.
Mange cellelinjer er tilgjengelige for pattedyrekspresjon inkludert mus-, rotte-,
menneske-, ape-, kylling- og hamsterceller. Eksempler på cellelinjer inkluderer, men
er ikke begrenset til CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, mus NS0 (ikke-utskillende) og andre
30
myelomcellelinjer, hybridom og heterohybridomcellelinjer, lymfocytter, fibroblaster,
Sp2/0-, COS-, NIH3T3-, HEK293-, 293S-, 2B8-, og HKB-celler. Cellelinjer er også
tilgjengelig tilpasset for serumfritt medium som letter rensingen av utskilte proteiner
fra cellekulturmedier. Eksempler inkluderer CHO-S-celler (Invitrogen, Carlsbad, CA,
kat.nr. 11619-012) og serumfri EBNA-1-cellelinje (Pham et al., (2003) Biotechnol.
35
Bioeng. 84:332-42). Cellelinjer er også tilgjengelige som er tilpasset for å vokse i
spesialmediumer optimalisert for maksimal ekspresjon. For eksempel er DG44 CHO-
97
celler tilpasset til å vokse i suspensjonskultur i et kjemisk definert, dyreproduktfritt
medium.
e. Planter
5
Transgene planteceller og planter kan bli anvendt for å uttrykke proteiner så som
hvilke som helst beskrevet heri. Ekspresjonskonstruksjoner blir typisk overført til
planter ved anvendelse av direkte DNA-overføring, så som
mikroprosjektilbombardement og PEG-mediert overføring i protoplaster, og med
agrobakteriummediert transformasjon. Ekspresjonsvektorer kan inkludere promoter-
10
og enhancersekvenser, transkripsjonelle termineringselementer og
translasjonskontrollelementer. Ekspresjonsvektorer og transformasjonsteknikker blir
vanligvis delt mellom dikotverter, så som Arabidopsis og tobakk, og monokotverter, så
som korn og ris. Eksempler på plantepromotere anvendt for ekspresjon inkluderer
blomkålmosaikkviruspromoteren, nopalinsyntasepromoteren,
15
ribosebifosfatkarboksylasepromoteren, og ubiquitin og UBQ3-promoterne.
Selekterbare markører så som hygromycin, fosfomannoseisomerase og
neomycinfosfotransferase blir ofte anvendt for å lette seleksjon, og opprettholde
transformerte celler. Transformerte planteceller kan bli opprettholdt i kultur som
celler, aggregater (kallusvev) eller regenerert i hele planter. Transgene planteceller
20
kan inkludere alger omkonstruert for å produsere hyaluronidasepolypeptider. På grunn
av at planter har forskjellige glykosyleringsmønstre enn pattedyrceller, kan dette
influere på valg av protein produsert i disse vertene.
4. Rensingsteknikker
25
Metode for rensing av polypeptider, inkludert insulin og
hyaluronandegraderingsenzympolypeptider eller andre proteiner, fra vertsceller vil
avhenge av de valgte vertscellene og ekspresjonssystemene. For utskilte molekyler,
blir proteiner generelt renset fra kulturmediet etter fjerning av cellene. For
intracellulær ekspresjon kan cellene bli lysert, og proteiner renset fra ekstraktet. Når
30
transgene organismer såsoså somnsgene planter og dyr ble anvendt for ekspresjon,
kan vev eller organer bli anvendt som utgangsmateriale for å danne et lysert
celleekstrat. I tillegg kan transgen dyreproduksjon inkludere produksjon av
polypeptider i melk eller egg, som kan bli samlet, og om nødvendig, kan proteinene bli
ekstrahert og ytterligere renset ved anvendelse av standardmetoder innenfor
35
fagområdet.
98
Proteiner, så som insulinpolypeptider eller hyaluronandegraderende
enzympolypeptider, kan bli renset ved anvendelse av standard
proteinrensingsteknikker kjent innenfor fagområdet som inkludererer, men ikke er
begrense til, SDS-PAGE, størrelsesfraksjonering og størrelseseksklusjonskromatografi,
5
ammoniumsulfatpresipitering og ionebyttekromatografi, så som anionbytte.
Affinitetsrensingsteknikker kan også bli anvendt for å forbedre effektiviteten og
renheten til prepareringene. For eksempel kan antistoffer, reseptorer og andre
molekyler som binder hyaluronidaseenzymer bli anvendt i affinitetsrensingen.
Ekspresjonskonstruksjoner kan også bli omkonstruert for å tilsette en affinitetstag til
10
et protein, så som en myc-epitop, GST-fusjon eller His6 og affinitetsrenset med mycantistoff, glutationharpiks og Ni-harpiks. Renheten kan bli vurdert ved en hvilken som
helst metode kjent innenfor fagområdet, og inkluderer gelelektroforese, ortoganal
HPLC-metoder, farging og spektrofotometriteknikker.
15
F. Preparering, formulering og administrering av insulin og
hyaluronandegraderende enzympolypeptider
Farmasøytiske sammensetninger av hurtigvirkende insulin og
hyaluronandegraderende enzymer er gitt heri for administrering.
Hyaluronandegraderende enzymer blir ko-formulert eller koadministrert med
20
farmasøytiske formuleringer av hurtigvirkende insulin for å øke leveringen av
hurtigvirkende insulin til blodet, ved å øke absorpsjonsraten, og å øke
biotilgjengeligheten av insulin. Forøket rate av absorpsjon og biotilgjengelighet kan bli
oppnådd, f.eks., ved reversibel depolymerisasjon av hyaluronandegraderende enzym,
som temporært (typisk for en periode på mindre enn 24 timer) øker den hydrauliske
25
ledningsevnen til det subkutane rommet. Følgelig kan hyaluronandegraderende
enzymer bli anvendt for å oppnå forhøyede og/eller mer hurtig oppnådde
konsentrasjoner av insulin etter parenteral, så som, f.eks., subkutan, administrering,
sammenliknet med konvensjonelle metoder for subkutan administrering, for å
tilveiebringe, f.eks., en mer potent og/eller mer hurtig respons for en gitt dose.
30
Koadministrering av et hyaluronandegraderende enzym med hurtigvirkende insulin
kan derfor gjøre det hurtigvirkende insulinet til superhurtigvirkende insulin.
Hyaluronandegraderende enzymer kan også bli anvendt for å oppnå glykemisk kontroll
med en lavere dose av administrert insulin. Evnen som hyaluronandegraderende
enzymer har til å forøke bulkfluidstrømningen ved eller nær ved et injeksjonssete eller
35
infusjonssete, kan også forbedre andre aspekter av assosiert farmakologisk levering.
For eksempel kan økning i bulkfluidstrømning hjelpe til med å muliggjøre at volumet
av fluidet injisert blir hurtigere dispergert fra injeksjonssetet (redusering av
99
potensielle smertefulle eller andre negative konsekvenser av injeksjonen). Detter er
spesielt viktig for subkutane infusjoner for å muliggjøre høyere doser å bli
administrert.
5
Følgelig, i kraft av den økte absorpsjonsraten, kan parenteralt administrert
hurtigvirkende insuliner bli superhurtige insuliner når administrert med et
hyaluronandegraderende enzym. Fordelene over administrering av insulin uten et
hyaluronandegraderende enzym, er at koadministrert eller ko-formulert
hyaluronandegraderende enzym/insulin kan resultere i mer gunstige
10
doseringsregimer, f.eks. lavere insulindoser og/eller anvendelse av mer effektive
lukket løkkesystemer, og forbedrede terapeutiske effekter, f.eks., effektiv glykemisk
kontroll og/eller redusert overskudd insulin. For eksempel, ved å redusere dosen, kan
bieffekter assosiert med overskudd sirkulerende insulin, så som observert med høyere
doser av insulin, bli redusert. Slike sideeffekter inkluderer, men er ikke begrenset til,
15
hypoglykemi og fedme.
Sammensetningene kan bli formulert i lyofilisert eller flytende form. Når
sammensetningene er gitt i lyofilisert form, kan de bli gjenopprettet like før
anvendelse med en hensiktsmessig løsning, f.eks., en steril saltvannsløsning eller
20
sterilt vann for injeksjon. Sammensetningene kan bli tilveiebrakt sammen eller
separat. F.eks. kan hurtigvirkende insulin og hyaluronandegraderende enzym bli koformulert i en enkel sammensetning, eller kan bli tilveiebrakt som separate
sammensetninger. Når tilveiebrakt som separate sammensetninger, kan
hyaluronandegraderende enzym og insulin bli pakket for administrering sammen,
25
sekvensielt eller periodisk- Kombinasjonene kan bli pakket som et sett.
1. Formuleringer
Forbindelsene kan bli formulert i en hvilken som helst egnet farmasøytisk preparering
for parenteral administrering så som løsninger, suspensjoner, formuleringer med
30
vedvarende frigjøring, eller pulvere. Typisk blir forbindelsene formulert til
farmasøytiske sammenetninger ved anvendelse av teknikker og prosedyrer velkjente
innenfor fagområdet (se f.eks. Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,
fjerde utgave, 1985, 126). Farmasøytisk akseptable sammensetninger blir dannet i lys
av godkjennelse fra regulerende myndigheter eller andre myndigheter dannet i
35
henhold til generell anerkjent farmakopeia for anvendelse i dyr og i mennesker.
Formuleringen bør passe til administreringsmåten.
100
Farmasøytiske sammensetninger kan inkludere bærere så som et fortynningsmiddel,
adjuvant, eksipient eller bærer med hvilke et hyaluronandegraderende enzym og
insulin blir administrert. Eksempler på egnede farmasøytiske bærere er beskrevet i
“Remington’s Pharmaceutical Sciences” av E. W. martin. Slike sammensetninger vil
5
inneholde en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen, generelt i renset form eller
delvis renset form, sammen med en egnet mengde bærer for å tilveiebringe formen
for riktig administrering til pasienten. Slike farmasøytiske bærere kan være sterile
væsker, så som vann og oljer, inkludert de til petroleum, dyr, grønnsaker eller
syntetisk opprinnelse, så som peanøttolje, soyabønneolje, mineralolje og sesamolje.
10
Vann er en typisk bærer når den farmasøytiske sammensetningen blir administrert
intravenøst. Saltvannsoppløsninger og vandig dekstrose- og glyseroloppløsninger kan
også bli anvendt som flytende bærere, spesielt for injiserbare løsninger.
Sammensetninger kan inneholde sammen med et aktivt ingrediens: et bulkmiddel så
som laktose, sukrose, dikalsiumfosfat, eller karboksymetylcellulose; et smøremiddel,
15
så som magnesiumstearat, kalsiumstearat og talk; og et bindemiddel så som stivelse,
naturlige gummier, så som gummi akasiagelatin, glukose, molasser,
polyvinylpyrrolidin, celluloser og derivater derav, povidon, krosspovidoner og andre
slike bindemidler kjent for fagfolk innenfor dette området. Egnede farmasøytiske
eksipienter inkluderer stivelse, glykose, laktose, sukrose, gelatin, malt, ris, mel, kritt,
20
silikagel, natriumstearat, glyserol, monostearat, glyserin, talk, natriumklorid, tørket
skummet melk, glyserol, propylen, glykol, vann og etanol. En sammensetning kan
også om ønsket inneholde mindre mengder av fukte- eller emulgeringsmidler, eller
pH-bufringsmidler, f.eks. acetat, natriumsitrat, glyserin, syklodekstrinderivater,
sorbitanmonolaurat, trietanolaminnatriumacetat, trietanolaminoleat, og andre slike
25
midler.
Farmasøytisk terapeutiske aktive forbindelser og derivater derav blir typisk formulert
og administrert i enhetsdoseringsformer eller multiple doseringsformer. Hver
enhetsdose inneholder en forutbestemt mengde av terapeutisk aktiv forbindelse
30
tilstrekkelig for å produsere den ønskede terapeutiske effekten, i assosiasjon med den
nødvendige farmasøytiske bæreren, beholderen eller fortynningsmiddel. Eksempler på
enhetsdoseformer inkluderer ampuller og sprøyter, og individuelle pakkede tabletter
eller kapsler. Enhetsdoseformer kan bli administrert i fraksjoner eller multipler derav.
En multippel doseform er en mengde av identiske enhetsdoseringsformer pakket i en
35
enkelt beholder som skal bli administrert i segregerte enhetsdoseformer. Eksempler
på multiple doseformer inkluderer beholdere, ampuller, flasker av tabletter eller
kapsler, eller flasker på ca. 0,6 L eller 4,5 L. På grunn av at multiple doseformer er en
101
multippel av enhetsdoser som ikke er segregerte i forpakningen. Generelt kan
doseringsformer eller sammensetninger inneholdende aktiv ingrediens i området
0,005 % til 100 % med balansen dannet av en ikke-toksisk bærer bli dannet.
5
Sammensetningene tilveiebrakt heri blir typisk formulert for administrering ved
subkutan vei, til tross for at andre administreringsveier kommer i betraktning, så som
en hvilken som helst vei kjent for fagfolk innenfor dette området, inkludert
intramuskulært, intraperitonealt, intravenøst, intradermalt, intralesjonalt,
intraperitoneal injeksjon, epidural, vaginal, rektal, lokal, otisk, transdermal
10
administrering eller en hvilken som helst vei. Formuleringer egnet for slike veier er
kjent for fagfolk innenfor dette området. Administreringen kan være lokal, topisk eller
systemisk, avhengig av stedet for behandling. Lokal administrering til et område som
trenger behandling kan bli oppnådd ved f.eks., men ikke begrenset til, lokal influsjon i
løpet av kirurgi, topisk applikasjon, f.eks. i sammenheng med sårbehandling etter
15
kirurgi, ved injeksjon, ved hjelp av et kateter, ved hjelp av en suppositorie, eller ved
hjelp av et implantat. Sammensetningene kan også bli administrert med andre
biologisk aktive midler, enten sekvensielt, periodevis, eller i den samme
sammensetningen.
20
Den mest egnede veien i ethvert gitt tilfelle avhenger av en mengde faktorer, så som
naturen til sykdommen, toleransen til individet for en bestemt administrasjonsvei,
alvorligheten av sykdommen og den bestemte sammensetningen som blir anvendt.
Typisk blir sammensetningene tilveiebrakt heri administrert parenteralt. I noen
eksempler blir hyaluronandegraderende enzymer administrert slik at de oppnår
25
interstitium i hud eller vev, for derved å degradere interstitialrommet for påfølgende
levering av insulin. Følgelig, i noen eksempler, blir direkte administrering under
huden, så som ved subkutane administreringsmetoder, betraktet. Følgelig i ett
eksempel, kan lokal administrering bli oppnådd ved injeksjon, så som fra en sprøyte
eller insulinpenn, eller annen fremstillingsgjenstand inneholdende en
30
injeksjonsinnretning så som en nål. I et annet eksempel kan lokal administrering bli
oppnådd ved infusjon, som kan bli oppnådd ved anvendelse av en pumpe eller annen
liknende innretning. Andre administreringsmåter kommer også i betraktning.
Farmasøytiske sammensetninger kan bli formulert i doseringsformer hensiktsmessig
for hver administreringsvei.
35
Subkutan administrering, generelt karakterisert ved injeksjon eller infusjon, er
betraktet heri. Injiserbare midler kan bli fremstilt i konvensjonelle former, enten som
102
flytende løsninger eller suspensjoner, faste former egnet for løsning eller suspensjon i
væsker for injeksjon, eller som emulsjoner. Egnede eksipienter er f.eks. vann,
saltvann, dekstrose, glyserol eller etanol. Farmasøytiske sammensetninger kan
inneholde andre mindre mengder av ikke-toksiske hjelpesubstanser så som
5
fuktemidler eller emulgeringsmidler, pH-bufringsmidler, stabiliseringsmidler,
oppløselighetsfremmere, eller andre slike midler, så som f.eks., natriumacetat,
natriumfosfat, sorbitanmonolaurat, trietanolaminoleat og syklodekstriner. I noen
eksempler blir sink, kalsium, serumalbumin, EDTA, kalsiumklorid og/eller fenoliske
konserveringsmidler inkludert i sammensetningene. Prosentandel og aktiv forbindelse
10
innbefattet i slike sammensetninger er sterkt avhengig av den spesifikke naturen
derav, samt aktivitetne til forbindelsen og behovet til individet.
Injiserbare midler er konstruert for lokal og systemisk administrering. For formålene
heri er lokal administrering ønskelig for direkte administrering til påvirket interstitium.
15
Prepareringer for parenteral administrering inkluderer sterile løsninger klare for
injeksjon, sterile tørre oppløselige produkter, så som lyofiliserte pulvere, klare til å bli
kombinert med et løsningsmiddel like før bruk, inkludert hypodermiske tabletter,
sterile suspensjoner klare for injeksjon, sterile tørre uoppløselige produkter klare for å
bli kombinert med en bærer like før anvendelse, og sterile emulsjoner. Løsningene kan
20
være enten vandige eller ikke-vandige. Dersom administrert intravenøst, inkluderer
egnede bærere fysiologisk saltvann eller fosfatbufret saltvann (PBS), og løsninger
inneholdende fortykningsmidler og oppløsningsmidler, så som glukose,
polyetylenglykol og polypropylenglykol, og blandinger derav.
25
Farmasøytisk akseptable bærere anvendt i parenterale preparater inkluderer vandige
bærere, ikke-vandige bærere, antimikrobielle midler, isotoniske midler, buffere,
antioksidanter, lokale anestesimidler, suspenderings- og dispergeringsmidler,
emulgeringsmidler, sekvestreringsmidler, eller gelateringsmidler og andre
farmasøytisk akseptable substanser. Eksempler på vandige bærere inkluderer
30
natriumkloridinjeksjon, Ringers injeksjon, isotonisk dekstroseinjeksjon, sterilt vann
injeksjon, dekstrose og laktert Ringers injeksjon. Ikke-vandige parenterale bærere
inkluderer fikserte oljer av vegetabilsk opprinnelse, bomullsfrøolje, maisolje,
sesamolje og peanøttolje. Antimikrobielle midler i bakteriostatiske eller fungistatiske
konsentrasjoner kan bli tilsatt til parenterale preparater pakket i multiple
35
dosebeholdere, som inkluderer fenoler eller kresoler, merkurialer, benzylalkohol,
klorbutanol, metyl og propyl p-hydroksybenzosyreestere, timerosal,
benzalkoniumklorid og benzetoniumklorid. Isotoniske midler inkluderer natriumklorid
103
og dekstrose. Buffere inkluderer fosfat og sitrat. Antioksidanter inkluderer
natriumbisulfat. Lokale anestesimidler inkluderer prokainhydroklorid. Suspenderingsog dispergeringsmidler inkluderer natriumkarboksymetylcellulose,
hydroksypropylmetylcellulose og polyvinylpyrrolidon. Emulgeringsmidler inkluderer
5
Polysorbat 80 (TWEEN 80). Et sekvestrerings- eller gelateringsmiddel av metallioner
inkluderer EDTA. Farmasøytiske bærere inkluderer også etylalkohol, polyetylenglykol
og propylenglykol for vannblandbare bærere og natriumhydroksid, saltsyre, sitronsyre,
eller melkesyre for pH-justering.
10
Konsentrasjonen av den farmasøytisk aktive forbindelsen blir justert, slik at en
injeksjon eller infusjon tilveiebringer en effektiv mengde for å produsere den ønskede
farmakologiske effekten, så som glykemisk kontroll. Den nøyaktige dosen avhenger av
alder, vekt og tilstanden til pasienten eller dyret som kjent innenfor fagområdet.
Enhetsdose parenterale prepareringer kan bli pakket i f.eks. en ampulle, en patron, en
15
beholder eller en sprøyte med en nål. Volumet til den flytende løsningen eller
rekonstituert pulverpreparering, inneholdende den farmasøytisk aktive forbindelsen, er
en funksjon av sykdommen som skal bli behandlet og den bestemte fremstilte
gjenstanden valgt for forpakning. Alle prepareringene for parenteral administrering må
være sterile, som kjent og praktisert innenfor fagområdet.
20
I ett eksempel kan farmasøytisk preparering være i flytende form, f.eks., løsninger,
siruper eller suspensjoner. Hvis tilveiebrakt i flytende form, kan de farmasøytiske
preparatene bli tilveiebrakt som en konsentrert preparering som skal bli fortynnet til
en terapeutisk effektiv konsentrasjon før bruk. Slike flytende prepareringer kan bli
25
dannet ved konvensjonelle metoder med farmasøytisk akseptable additiver, så som
suspenderingsmidler (f.eks. sorbitolsirup, cellulosederivater eller hydrogenerte spiselig
fett); emulgeringsmidler (f.eks. lecitin eller akasi); ikke-vandige bærere (f.eks.
mandelolje, oljeholdige estere eller fraksjonerte vegetabilske oljer); og
konserveringsmidler (f.eks. metyl eller propyl-p-hydroksybenzoater eller sorbinsyre). I
30
et annet eksempel kan de farmasøytiske preparatene være tilstede i lyofilisert form,
for gjenoppretting med vann eller annen egnet bærer før bruk.
Hurtigvirkende insulin og hyaluronandegraderende enzymsammensetninger kan bli koformulert som en enkelt sammensetning, eller kan bli tilveiebrakt som to separate
35
sammensetninger. Når tilveiebrakt som to sammensetninger, kan sammensetningene
bli blandet før administrering, for å bli koadministrert, eller kan bli holdt separat, og
deretter koadministrert sammen, sekvensielt eller periodisk. I noen eksempler blir
104
hurtigvirkende insulin og hyaluronandegraderende enzym ko-formulert som
superhurtigvirkende insulinsammensetninger. Som diskutert nedenfor, kan
sammensetningene bli formulert for enkelt eller multippel dosering, hvor doseringene
kan bli tilveiebrakt som et forhold av mengden av et hyaluronandegraderende enzym,
5
og insulin administrert. For eksempel kan et hyaluronandegraderende enzym bli
administrert i en hyaluronidase U/insulin U (1:1) til 50:1 eller mer, f.eks. ved eller
omtrent 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1,
15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, eller mer. I andre eksempler blir
lavere forhold mellom hyaluronandegraderende enzym og insulin administrert,
10
inkludert, f.eks., 1 hyaluronidase U/2 insulin U (1:2), 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8,
1:9, 1:10, 1:15 eller 1:20. Det hurtigvirkende insulinet kan være tilstede i de koformulerte eller separate sammensetningene i konsentrasjonen på eller omtrent 10
U/ml, 20 U/ml, 30 U/ml, 40 U/ml, 50 U/ml, 60 U/ml, 70 U/ml, 80 U/ml, 90 U/ml, 100
U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml, 250 U/ml, 300 U/ml, 350 U/ml, 400 U/ml, 450 U/ml, eller
15
500 U/ml. Typisk er mengden av hyaluronandegraderende enzym i ko-formulerte eller
separate sammensetninger funksjonelt ekvivalent med eller med minst 1 U/ml, 2
U/ml, 3 U/ml, 4 U/ml, 5 U/ml, 6 U/ml, 7 U/ml, 8 U/ml, 9 U/ml, 10 U/ml, 15 U/ml, 20
U/ml, eller 25 U/ml av hyaluronidaseaktiviteten. I noen eksempler er mengden av
hyaluronandegraderende enzym i de ko-formulerte eller separate sammensetningene
20
funksjonelt ekvivalent med eller med minst 30 eller 35 U/ml av hyaluronidaseaktivitet,
så som eller 30 U/ml, 35 U/ml, 37,5 U/ml, 40 U/ml, 50 U/ml, 60 U/ml, 70 U/ml, 80
U/ml, 90 U/ml, 100 U/ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ml, 500 U/ml, 600 U/ml, 700
U/ml, 800 U/ml, 900 U/ml, 1000 U/ml, 2000 U/ml, 3000 U/ml, eller 5000 U/ml av
hyaluronidaseaktiviteten.
25
De superhurtigvirkende insulinsammensetningene tilveiebrakt heri kan inneholde én
eller flere pH-buffere (så som f.eks., histidin, fosfat, Tris eller andre buffere), eller sur
buffer (så som acetat, sitrat, pyruvat, Gly-HCl, suksinat, laktat, maleat eller andre
buffere), tonisitetsmodifiserende midler (så som f.eks., en aminosyre, polyalkohol,
30
glyserl, NaCl, trehalose, andre salter og/eller sukre), stabiliseringsmidler (så som
natriumbenzoat for å stabilisere insulin), gelateringsmiddel, så som
etylendiamintetraeddiksyre, etylendiamintetraacetat eller kalsium EDTA,
oksygenoppfanger, så som metionin, askorbinsyre/askorbat, sitronsyre/sitrat, eller
albumin, og/eller et konserveringsmiddel, så som konserveringsmiddel inneholdende
35
en aromatisk ring (f.eks. fenol eller kresol). Eksempler på konserveringsmidler som er
nyttige i sammensetningene tilveiebrakt heri, inkluderer, men er ikke begrenset til, mkresol, fenol og paraben, eller en hvilken som helst kombinasjon derav. I noen
105
eksempler blir m-kresol tilsatt ved eller hensiktsmessig 0,05 % til 0,2 %, så som 0,1
% til 0,15 % (f.eks. i en mengde på omtrent 0,1 %, 0,11 %, 0,12 %, 0,13 %, 0,14
%, eller 0,15 %). Egnede konsentrasjoner av fenol eller paraben inkluderer 0,05-0,25
%, så som 0,1 % til 0,2 % (f.eks. ved eller omtrent 0,1 %, 0,12 %, 0,13 %, 0,14 %,
5
0,15 %, 0,16 %, 0,17 %, 0,18 %,, 0,19 %, og 0,2 %). Typisk blir NaCl eller annet
salt tilveiebrakt i sammensetninger inneholdende et hyaluronandegraderende enzym.
Eksempler på konsentrasjoner av NaCl inkluderer 50 mM til 200 mM, så som 50 mM til
150 mM, inkludert 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM,100 mM, 120 mM, 130
mM, 140 mM, og 150 mM, NaCl. I noen eksempler for å beholde stabiliteten av
10
sammensetningene tilveiebrakt heri, når saltkonsentrasjonen i sammensetningen blir
forøket, da også pH. Glyserol kan også bli inkludert som et tonisitetsmodifiserende
middel og/eller for å øke viskositeten av sammensetningene.
Eksempler på stabiliseringsmidler som er nyttige for sammensetningene inneholdende
15
et hyaluronandegraderende enzym, inkluderer detergenter eller overflateaktive midler,
så som polysorbater og proteiner så som humant serumalbumin. I noen eksempler er
ett eller flere overflateaktive midler (f.eks. så som Pluronic F68) inkludert i
sammensetningene, så som ved eller omtrent 0,001 % til 0,1 %, typisk ved eller
omtrent 0,005 % til 0,03 % (f.eks. 0,005 %, 0,006 %, 0,007 %, 0,008 %, 0,009 %,
20
0,01 %, 0,012 %, 0,014 %, 0,016 %, 0,018 %,, 0,02 %, eller 0,03. Eksempler på
konsentrasjoner av serumalbumin som er nyttige i sammensetningene heri, inkluderer
0,1 mg/ML, 0,2 mg/ML, 0,3 mg/ML, 0,4 mg/ML, 0,5 mg/ML, 0,6 mg/ML, 0,7 mg/ML,
0,8 mg/ML, 0,9 mg/ML, eller 1 mg/ML, men kan være høyere eller mindre.
Polysorbater kan også være tilstede i sammensetningene ved f.eks. konsentrasjoner
25
på omtrent 0,001 %, 0,002 %, 0,003 %, 0,004 %, 0,005 %, 0,006 %, 0,007 %,
0,008 %, 0,009 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,03 %, 0,04 %, 0,05 %, 0,06 %, 0,07 %, 0,08
%, 0,09 %, eller 0,1 %. Eksempler på stabiliseringsmidler som er nyttige for
sammensetningene inneholdende et insulin inkluderer sink og m-kresol. F.eks. kan
sink virke slik at det stabiliserer insulinheksameren. Sink kan f.eks. bli tilveiebrakt
30
som sinkoksid, sinkacetat eller sinkklorid. Sink kan være tilstede i en sammensetning
tilveiebrakt heri på mellom eller omtrent 0,001 til 0,1 mg pr. 100 enheter av insulin,
så som 0,002 milligram pr. 100 enheter insulin (mg/100 U), 0,005 mg/100 U, 0,01
mg/100 U, 0,012 mg/100 U, 0,014 mg/100 U, 0,016 mg/100 U, 0,017 mg/100 U,
0,018 mg/100 U, 0,02 mg/100 U, 0,022 mg/100 U, 0,024 mg/100 U, 0,026 mg/100
35
U, 0,28 mg/100 U, 0,03 mg/100 U, 0,04 mg/100 U, 0,05 mg/100 U, 0,06 mg/100 U,
0,07 mg/100 U, 0,08 mg/100 U, eller 0,1 mg/100 U. I ett eksempel er sink tilstede på
0,017 mg pr. 100 U insulin. Et metallgelateringsmiddel, så som kalsium EDTA
106
(CaEDTA), kan også være tilstede, så som f.eks., i konsentrasjoner på mellom
omtrent 0,02 mM til 20 mM, så som 0,02 mM, 0,04 mM, 0,06 mM, 0,08 mM, 0,1 mM,
0, mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1 mM, 5 mM, 10
mM, 15 mM, 20 mM, eller mer. I noen eksempler, når både et gelateringsmiddel og
5
sink er tilstede i en sammenstning tilveiebrakt heri, er gelateringsmidlet tilstede i
omtrent like mengde (dvs. 0,6 til 1,4 molart forhold) eller molart overskudd til sink, så
som f.eks., i et forhold på eller omtrent 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1,
70:1, 80:1, 90:1, 100:1, eller mer gelateringsmiddel:sink. Kalsiumklorid kan også bli
inkludert i sammensetningene, ved f.eks. mellom omtrent 0,2 mM til 20 mM.
10
I noen tilfeller er hvilke som helst én eller flere av komponentene beskrevet ovenfor
tilstede i kun hurtigvirkende insulinsammensetning eller hyaluronandegraderende
sammenstning, helt til de to sammensetningene blir enten ko-formulert eller levert til
individet som en superhurtigvirkende insulinsammensetning. For eksempel kan den
15
hurtigvirkende insulinsammensetningen inneholde sink med mellom eller omtrent
0,001 til 0,1 mg per 100 enheter av insulin, så som 0,002 milligram pr. 100 enheter
insulin /mg/100 U), 0,005 mg/100 U, 0,01 mg/100 U, 0,012 mg/100 U, 0,014 mg/100
U, 0,016 mg/100 U, 0,017 mg/100 U, 0,018 mg/100 U, 0,02 mg/100 U, 0,022
mg/100 U, 0,024 mg/100 U, 0,026 mg/100 U, 0028 mg/100 U, 0,03 mg/100 U, 0,04
20
mg/100 U, 0,05 mg/100 U, 0,06 mg/100 U, 0,07 mg/100 U, 0,08 mg/100 U, eller 0,1
mg/100 U, og ikke noe gelateringsmiddel, så som EDTA, mens den
hyaluronandegraderende sammensetningen kan inneholde et gelateringsmiddel, så
som EDTA, ved eller omtrent 0,02 mM til 20 mM, så som 0,02 mM, 0,04 mM, 0,06
mM, 0,08 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM,
25
0,9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, eller mer og ikke noe sink. Følgelig er
det kun når de to sammensetningene blir blandet, så som når de blir ko-formulert
eller koadministrert, at sammensetning inneholdende insulin også inneholder EDTA, og
sammensetningen inneholdende et hyaluronandegraderende enzym også inneholder
sink. I noen tilfeller inneholder den opprinnelige hurtigvirkende
30
insulinsammensetningen og hyaluronandegraderende enzymsammensetningen
tilstrekkelige mengder sink eller gelateringsmiddel, som når blandet for ko-formulering
eller koadministrering, er gelateringsmidlet tilstede i omtrent ekvimolare mengder
(dvs. 0,6 til 1,4 molart forhold) eller molart overskudd til sink, så som for eksempel, i
et forhold på eller omtrent 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1,
35
80:1, 90:1, 100:1 eller mer gelaterende middel:sink.
107
pH og osmolariteten til sammensetningene kan bli justert av en fagperson for å
optimalisere betingelsene for ønsket aktivitet og stabilitet av sammensetningen. For
eksempel, som angitt ovenfor, i noen tilfeller, dersom saltkonsentrasjonen blir forøket,
kan pH også bli forøket for å holde stabiliteten av sammensetningen. Videre kan en
5
fagperson innenfor dette området forandre pH for å øke oppløseligheten av det
bestemte hurtigvirkende insulin anvendt i de superhurtigvirkende insulinene
tilveiebrakt heri. I noen eksempler har sammensetningene tilveiebrakt heri som
inneholder én eller begge av et hurtigvirkende insulin og et hyaluronandegraderende
enzym med en osmolaritet ved eller omtrent 100 mOsm/kg, 120 mOsm/kg, 140
10
mOsm/kg, 160 mOsm/kg, 180 mOsm/kg, 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240
mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340
mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 420 mOsm/kg, 440
mOsm/kg, 460 mOsm/kg, 500 eller mer mOsm/kg, og en pH på eller omtrent 6, 6,2,
6,4, 6,6 6,8, 7, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 eller 8. I noen eksempler pH fra eller fra omtrent 6,5
15
til eller til omtrent 7,5, så som 6,5, 6,6 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 eller 7,5.
Administreringsmetoder kan bli anvendt for å redusere eksponeringen av valgte
forbindelser til degradative prosesser, så som proteolytisk degradering og
immunologisk intervensjon via antigene og immunogene responser. Eksempler på
20
slike metoder inkluderer lokal administrering ved sted for behandling. Pegylering av de
terapeutiske midlene er blitt rapportert for å øke resistensen overfor proteolyse, øket
plasmahalveringstid, og redusere antigenisiteten og immunogenisiteten. Eksempler på
pegyleringsmetodologier er kjent innenfor fagområdet (se f.eks. Lu og Felix, Int. J.
Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu og Felic, Peptide Res., 6: 142-6, 1993;
25
Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46: 253-64, 1995, Benhar et al., J. Biol. Chem., 269:
13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154: 3088-95, 1995; se også Caliceti
et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10): 1261-77 og Molineux (2003)
Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2): 3S-8S). Pegylering kan også bli anvendt for levering av
nukleinsyremolekyler in vivo. For eksempel kan pegylering av adenovirus øke
30
stabiliteten og genoverføringen (se f.eks. Cheng et al., (2003) Pharm. Res. 20(9):
1444-51).
Lyofiliserte pulvere
Av interesse heri er lyofiliserte pulvere, som kan bli gjenopprettet for administrering
35
som løsninger, emulsjoner eller andre blandinger. De kan også bli gjenopprettet og
formulert som faste stoffer eller geler.
108
Det sterile, lyofiliserte pulveret blir dannet ved oppløsning av en aktiv forbindelse i en
bufferløsning. Bufferløsningen kan inneholde en eksipient som forbedrer stabiliteten
eller annen farmakologisk komponent av pulver eller gjenopprettet løsning, dannet fra
pulveret. Påfølgende steril filtrering av løsningen etterfulgt av lyofilisering under
5
standardbetingelser kjent for fagfolk innenfor dette området tilveiebringer den
ønskede formuleringen. I korte trekk, det lyofiliserte pulveret blir dannet ved
oppløsning av en eksipient, så som dekstrose, sorbital, fruktose, maissirup, xylitol,
glyserin, glukose, sukrose eller annet egnet middel, i en egnet buffer, så som sitrat,
Tris, histidin, natrium eller kaliumfosfat eller en annen slik buffer kjent for fagfolk
10
innenfor dette området. Deretter blir et valgt enzym tilsatt til den resulterende
blandingen, og omrørt helt til den er oppløst. Den resulterende blandingen blir
sterilfiltrert eller behandlet for å fjerne partikler, og for å forsikre sterilitet, og fordelt i
beholdere for lyofilisering. Hver beholder vil inneholde en enkeltdosering eller multiple
doseringer av forbindelsen. Det lyofiliserte pulveret kan bli lagret under
15
hensiktsmessige betingelser, så som ved omtrent 4oC til romtemperatur.
Gjenoppretning av dette lyofiliserte pulveret med en bufferløsning tilveiebringer en
formulering for anvendelse i parenteral administrering.
2. Dosering og administrering
20
Hyaluronandegraderende enzym tilveiebrakt heri kan bli formulert som farmasøytiske
sammensetninger for enkeltdosering eller multippel doseringsadministrering. For
eksempel kan sammensetningene tilveiebrakt heri inneholde hyaluronandegraderende
enzym på en hyaluronidase U/insulin (1:1) til 50:1 eller mer, for eksempel, eller
omtrent 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1,
25
15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1 eller mer. I andre eksempler er lavere
forhold mellom hyaluronandegraderende enzym og insulin tilveiebrakt i
sammensetningene, inkludert, f.eks. 1 hyaluronidase U/2 insulin U (1:2), 1:3, 1:4,
1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15 eller 1:20. Det valgte hyaluronandegraderende
enzymet blir inkludert i en mengde tilstrekkelig for å utvise en terapeutisk nyttig
30
effekt i fravær av uønskede bieffekter på den behandlede pasienten. Den terapeutisk
effektive konsentrasjonen kan bli bestemt empirisk ved å teste polypeptider i kjente in
vitro og in vivo systemer, så som ved anvendelse av analysene tilveiebrakt heri eller
kjent innenfor fagområdet (se f.eks. Taliani et al. (1996) Anal. Biochem., 240: 60-67;
Filocamo et al. (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al. (1996) Anitviral Res.
35
32: 9-18; Buffard et al. (1995) Virology, 209: 52-59; Bianchi et al. (1996) Anal.
Biochem., 237: 239-244; Hamatale et al. (1996) Intervirology 39:249-258;
Steinkuhler et al. (1998) Biochem., 37:8899-8905; D’Souza et al. (1995) J Gen.
109
Virol., 76:1729-1736; Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem, 247: 242-246; se også
f.eks. Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol.
70:7219-7223; Mizutani et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227:822826; Lu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 93: 1412-1417; Hahm et al., (1996)
5
Virology, 226:318-326; Ito et al. (1996) J. Gen. Virol., 77:1043-1054; Mizutani et al.
(1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:906-911; Cho et al. (1997) J. Virol.
Meth. 65:201-207) og deretter ekstrapolert derifra for doseringer for mennesker.
Terapeutisk effektive doseringer for superhurtigvirkende insulinsammensetninger
10
inneholdende et hurtigvirkende insulin og et hyaluronandegraderende enzym kan bli
bestemt basert på, f.eks., farmakokinetikk (PK) data og farmakodynamikk (PD) data,
så som beskrevet nedenfor og i eksempel 1, og de kjente terapeutiske dosene av
hurtigvirkende insulin når levert uten et hyaluronandegraderende enzym. Forandringer
i insulinkonsentrasjon i blodet eller plasma eller serum med tiden tilveiebringer
15
informasjon på in vivo (1) absorpsjon for parenteral administrering, (2) distribusjon,
og (3) eliminering av insulin. En farmakokinetikkmodell definerer disse fysiologiske
forandringer i konsentrasjonen av insulin som en funksjon av tiden (dvs.,
(ௗ௑)
(ௗ௧)
) og
karakteriserer dem matematisk ved anvendelse av rater og volumer.
Modellparameterne dermed oppnådd for insulin vil forbli relativt konstant, helt til en
20
perturbasjon oppstår. En godt etablert PK-modell for insulin kan tilveiebringe gunstige
antagelser om eksponering (som er nært relatert til effektivitet og for
medikamenttrygghet som er et resultat av forbedret farmakologi). Kliniske avgjørelser
på dosevalg og doseskjema av insulin kan bli lettet og begrunnet ved anvendelse av
PK-modelldannelse og simuleringer. En farmakodynamisk modell har et liknende
25
formål for forutsigelse av klinisk resultat.
Typisk er en terapeutisk effektiv dose av et hyaluronandegraderende enzym på eller
omtrent 0,3 enheter (U) til 5000 U av et hyaluronandegraderende enzym. For
eksempel kan et hyaluronandegraderende enzym bli administrert subkutant ved eller
30
omtrent 0,3 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 3 U, 5 U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U,
200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000
U, 2000 U, 3000 U, 4000 U, 5000 U eller mer. I noen eksempler kan doseringer bli
tilveiebrakt som et forhold av mengden av et hyaluronandegraderende enzym og
insulin administrert. For eksempel kan et hyaluronandegraderende enzym bli
35
administrert ved 1 hyaluronidase U/insulin U (1:1) til 50:1 eller mer, f.eks. ved eller
omtrent 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1,
15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1 eller mer. I andre eksempler blir
110
lavere forhold mellom hyaluronandegraderende enzym og insulin administrert,
inkludert, f.eks., 1 hyaluronidase U/2 insulin U (1:2), 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8,
1:9, 1:10, 1:15 eller 1:20. Typisk er volumer av injeksjoner eller infusjoner av
hyaluronandegraderende enzym betraktet heri fra på eller omtrent 0,01 mL, 0,05 mL,
5
0,1 mL, 0,2 mL, 0,3 mL, 0,4 mL, 0,5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL,
8 mL, 9 mL, 10 mL, eller mer. Hyaluronandegraderende enzym kan bli tilveiebrakt
som en stamløsning ved eller omtrent 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6
U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35
U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 150
10
U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 800 U/mL, eller 1000
U/mL, eller kan bli tilveiebrakt i en mer konsentrert form, f.eks. på eller omtrent 2000
U/mL,, 3000 U/mL, 4000 U/mL, 5000 U/mL, 8000 U/mL, 10000 U/mL, eller 20000
U/mL, for anvendelse direkte eller for fortynning til den effektive konsentrasjonen før
anvendelse derav. Det hyaluronandegraderende enzymet kan bli tilveiebrakt som en
15
væske eller lyofilisert formulering.
Insulinprepareringene tilveiebrakt heri kan bli formulert som farmasøytiske
sammensetninger for enkel eller multippel dosebruk. For eksempel, i noen tilfeller, blir
insulinpreparering formulert for enkeltdoseadministrering i en mengde som er
20
tilstrekkelig for å tilveiebringe postprandial glykemisk kontroll. I andre eksempler blir
insulinprepareringer formulert for multippel doseadministrering eller multippel bruk
beholdere, så som for anvendelse i en insulinpenn, insulinpumpe, eller annen
kontinuerlig insulinleveringsinnretning, eller lukket løkkesystem. Insulinprepareringene
kan bli tilveiebrakt i lyofilisert eller flytende form som diskutert andre steder heri.
25
Insulinet kan bli tilveiebrakt i en terapeutisk effektiv dose. Terapeutisk effektive doser
kan bli bestemt empirisk ved å teste forbindelsene i kjente in vitro og in vivo
systemer, så som analysene tilveiebrakt heri, og kan også bli individualisert for hvert
individ basert på slike faktorer som metabolisme, matinntak og alvorlighet av
30
sykdommen. Konsentrasjonen av et valgt insulin i sammensetningen avhenger f.eks.
av absorpsjon, inaktivering og eksklusjonsrater av komplekset, fysiokjemiske
karaktertrekk til komplekset, doseringsskjema, og mengde administrert, blant andre
faktorer kjent for fagfolk innenfor dette området. For eksempel er det underforstått at
den nøyaktige doseringen for behandling er en funksjon av blodglukosenivåene i et
35
individ, og kan bli bestemt empirisk ved anvendelse av kjente algoritmer eller ved
ekstrapolasjon fra in vivo eller in vitro testdata, tidligere erfaring til individet,
karbohydrattelling for å bestemme karbohydratinnholdet i et måltid og, derfor, den
111
beregnede prandialblodglukoseøkningen og påfølgende insulinbehov. Det er å
bemerke at konsentrasjoner og doseringsverdier kan variere med hvert behandlet
individ. Det er videre underforstått at for et hvilket som helst spesielt individ bør de
spesifikke doseringsregimene bli justert over tid ifølge det individuelle behovet og den
5
profesjonelle vurderingen av personen som administrerer eller overvåker
administreringen av formuleringene, og at konsentrasjonsområdene angitt heri kun er
eksempler, og ikke ment å begrense omfanget derav. Mengden av en valgt
insulinpreparering som skal bli administrert for behandling av en diabetestilstand kan
bli bestemt ved standard kliniske teknikker. I tillegg, kan in vitro analyser og
10
dyremodeller bli anvendt for å hjelpe med å identifisere optimale doseringsområder.
Følgelig, kan nøyaktig dosering, som kan bli bestemt empirisk, avhenge av den
bestemte insulinprepareringen, regimet og doseringsskjemaet med
hyaluronandegraderende enzym, administreringsvei, type av diabetes som skal bli
15
behandlet, alvorlighetsgraden av sykdommen, og individet som blir behandlet.
Generelt blir insulin tilveiebrakt i en mengde som oppnår glykemisk kontroll. For
eksempel, for å oppnå postprandial glykemisk kontroll, blir diabetesindivider typisk
administrert en bolusinjeksjon på eller omtrent 0,05 U av hurtigvirkende insulin pr. kg
kroppsvekt (U/kg) til 1,0 U/kg 30 minutter til 5 minutter før et måltid, når insulin blir
20
levert uten et hyaluronandegraderende enzym. Det er underforstått at denne dosen
kan bli forøket eller redusert etter behov, basert på f.eks. metabolismen av et bestemt
individ, innholdet av måltidet, og blodglukosenivåer. Det er videre underforstått at
tidspunktet hvor insulinet blir levert for postprandial glykemisk kontroll kan bli
forandret til å bli nærmere eller lengre fra tidspunktet for inntak av et måltid, og, i
25
noen tilfeller, kan bli forandret slik at insulinet blir levert et tidspunkt for måltidet eller
etter måltidet. Et individ kan derfor bli administrert en superhurtigvirkende
insulinsammensetning tilveiebrakt heri ved administrering av et insulin, så som et
hurtigvirkende insulin, i kombinasjon med et hyaluronandegraderende enzym, med en
dose lavere enn det administrert når insulin blir administrert alene og/eller ved
30
tidspunkt nærmere inntak av et måltid sammenliknet med tidspunktet hvor insulin
alene dosen blir typisk administrert.
Hurtigvirkende insuliner blir typisk administrert i doser på mellom 0,05 enheter/kg til
0,25 enheter/kg, så som f.eks., 0,10 enheter/kg, til tross for at den bestemte dosen
35
varierer. Superhurtigvirkende insulinsammensetninger kan bli administrert ved lavere
doser sammenliknet med hurtigvirkende insulin administrert i fravær av et
hyaluronandegraderende enzym. Som diskutert andre steder heri, kan graden hvorved
112
mengden av et hurtigvirkende insulin blir redusert ved administrering derav som en
superhurtigvirkende insulinsammensetning variere, avhengig av, f.eks. type av
diabetes som pasienten har. Typisk er reduksjonen i mengde av hurtigvirkende insulin
administrert til type 2 diabetespasienter når administrert som en superhurtigvirkende
5
insulinsammensetning høyere enn reduksjonen i mengden av hurtigvirkende insulin
administrert til type 1 diabetespasienter når administrert som en superhurtigvirkende
insulinsammensetning. For eksempel, i tilfeller hvor en type 1 diabetespasient og type
2 diabetespasient begge blir administrert 0,20 U/kg hurtigvirkende insulin til kontroll
postprandiale glukosenivåer, kan type 1 diabetespasienten bli administrert 0,15 U/kg
10
hurtigvirkende insulin i en superhurtigvirkende insulinsammensetning for å oppnå
samme eller bedre glykemisk kontroll, og type 2 diabetespasienten kan bli
administrert 0,10 U/kg hurtigvirkende insulin i en superhurtigvirkende
insulinsammensetning for å oppnå samme eller bedre glykemisk kontroll. Følgelig, i
noen eksempler, er det betraktet heri at mengden av et hurtigvirkende insulin som blir
15
administrert med et hyaluronandegraderende enzym som et superhurtigvirkende
insulin til en type 2 diabetespasient for å oppnå glykemisk kontroll, ble redusert med,
f.eks. 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %,
eller mer sammenliknet med mengden nødvendig for glykemisk kontroll når
administrert uten et hyaluronandegraderende enzym, og mengden av et
20
hurtigvirkende insulin som blir administrert med et hyaluronandegraderende enzym
som en superhurtigvirkende insulinsammensetning til en type 1 diabetespasient for å
oppnå glykemisk kontroll kan bli redusert med, f.eks., 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30
%, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, eller mer sammenliknet med
mengden nødvendig for glykemisk kontroll når administrert uten et
25
hyaluronandegraderende enzym.
Eksempler på doseringsområder for parenteral, så som subkutan, administrering av
insulin ved anvendelse av metoder og sammensetninger tilveiebrakt heri for å
kontrollere postprandial blodglukosenivåer er på eller omtrent 0,05 U/kg til 0,50 U/kg,
30
så som 0,05 U/kg, 0,06 U/kg, 0,07 U/kg, 0,08 U/kg, 0,09 v 0,10 U/kg, 0,11 U/kg,
0,12 U/kg, 0,13 U/kg, 0,14 U/kg, 0,15 U/kg, 0,20 U/kg, 0,25 U/kg, 0,30 U/kg, 0,40
U/kg, 0,50 U/kg, eller 1,0 U/kg. Den bestemte doseringen og formuleringen derav
avhenger av sykdommen og individet. Dersom nødvendig kan dosering bli bestemt
empirisk. For å oppnå slike doseringer, kan volumer av insulinprepareringer
35
administrert subkutant for å kontrollere postprandialglukosenivåer være på eller
omtrent 10 PL, 20 PL, 30 PL, 40 PL, 50 PL, 75 PL, 100 PL, 150 PL, 200 PL, 250 PL, 300
PL, 400 PL, 500 PL, 600 PL, 700 PL, 800 PL, 900 PL, 1000 PL, eller mer. For eksempel
113
kan en 100 U/mL insulinformulering for indikasjonene beskrevet heri bli administrert
subkutant til et 70 kg individ i et volum på 35 PL til 350 PL, for å oppnå en dosering på
0,05 U/kg til 0,50 U/kg av insulinet. Sammensetningene og metodene tilveiebrakt heri
kan også bli administrert til diabetesindivider for å tilveiebringe glykemisk kontroll i
5
løpet av dagen og natten, i tillegg til postprandial glykemisk kontroll. Typisk er
doseringer av insulin administrert for å tilveiebringe kontinuerlig glykemisk kontroll
mindre enn det som er nødvendig for å oppnå postprandial glykemisk kontroll.
Doseringene kan derimot bli forøket eller redusert, basert på blodglukosenivåene.
Eksempler på doseringsområder for parenteral, så som subkutan, administrering av
10
insulin ved anvendelse av metoder og sammensetningene tilveiebrakt heri for å
tilveiebringe kontinuerlig glykemisk kontroll er fra på eller omtrent 0,001 U/kg til 0,30
U/kg, så som 0,001 U/kg, 0,005 U/kg, 0,01 U/kg, 0,02 U/kg, 0,05 U/kg, 0,30 U/kg, så
som 0,05 U/kg, 0,06 U/kg, 0,07 U/kg, 0,08 U/kg, 0,09 U/kg, 0,10 U/kg, 0,11 U/kg,
0,12 U/kg, 0,13 U/kg, 0,14 U/kg, 0,15 U/kg, 0,20 U/kg, 0,25 U/kg, 0,30 U/kg, 0,40
15
U/kg, 0,50 U/kg, eller 1,0 U/kg. Den spesielle doseringen og formuleringen derav
avhenger av sykdommen, tidspunkt for administrering, og individet. Dersom
nødvendig kan dosering bli bestemt empirisk. Doseringen for et individ blir typisk
titrert ned til den minimale doseringen som er nødvendig for å oppnå en terapeutisk
effekt, så som den minimale doseringen nødvendig for å oppnå glykemisk kontroll.
20
Mengden av insulin tilstrekkelig for å oppnå glykemisk kontroll kan bli bestemt
empirisk, så som ved glukoseeksponering.
Hyaluronandegraderende enzym kan bli administrert før, etter, innimellom eller
samtidig med insulinprepareringen. Generelt blir hyaluronandegraderende enzym
25
administrert før eller samtidig med administrering av insulinprepareringen for å
muliggjøre at hyaluronandegraderende enzym degraderer hyaluronsyren i det
interstitielle rommet. I ett eksempel blir insulinsammensetningen og
hyaluronandegraderende enzymsammensetning ko-formulert og, derfra, administrert
samtidig. I et annet eksempel blir hyaluronandegraderende enzymsammensetning
30
administrert før insulinsammensetningen, så som 1 minutt, 2 minutter, 3 minutter, 4
minutter, 5 minutter eller mer før administrering av insulinprepareringen. I noen
eksempler blir hyaluronidasen administrert sammen med insulinprepareringen. Som
gunstig for fagfolk innenfor dette området kan ønsket nærhet av koadministrering lett
bli optimalisert ved testing av effektene av administrering av midlene ved varierende
35
tidspunkter i egnede modeller, så som i egnede dyremodeller.
114
Både insulinprepareringen og hyaluronandegraderende enzympreparering kan bli
administrert med én gang, eller kan bli delt inn i et antall mindre doser som skal bli
administrert ved tidsintervaller. Valgte insulinprepareringer kan bli administrert i én
eller flere doser i løpet av en behandlingstid, f.eks. over flere minutter, timer, dager,
5
uker eller måneder. I noen tilfeller er kontinuerlig administrering nyttig. Det er
underforstått at den nøyaktige doseringen og administreringsforløpet avhenger av
indikasjonen og toleransen til pasienten.
Det er også underforstått at den nøyaktige doseringen og varigheten av behandlingen
10
er en funksjon av diabetes som blir behandlet, og kan bli bestemt empirisk ved
anvendelse av kjente testeprotokoller eller ved ekstrapolering fra in vivo eller in vitro
testdata. Det er å bemerke at konsentrasjoner og doseringsverdier også kan variere
med hvor alvorlig diabetestilstanden er og andre faktorer, så som metabolisme,
matinntak, og kroppsvekt til individet. Det er videre underforstått at for et hvilket som
15
helst spesielt individ bør spesifikke doseringsregimer bli justert over tid ifølge det
individuelle behovet og den profesjonelle vurderingen av personen som administrerer
eller overvåker administreringen av sammensetningene, og at
konsentrasjonsområdene angitt heri kun er eksempelvise, og er ikke ment å begrense
omfanget eller anvendelsen av sammensetningene eller kombinasjonene som
20
inneholder disse. Sammensetningene kan bli administrert hvert minutt, hvert flere
minutter, hver time, daglig, ukentlig, månedlig, årlig eller én gang, avhengig av
individet og diabetestilstanden. Generelt blir doseringsregimer valgt for å begrense
toksisiteten og/eller andre negative effekter, så som insulin i overskudd. Det er å
bemerke at den behandlende legen vil vite hvordan og når man skal avslutte, avbryte
25
eller justere terapien til lavere dosering. Behandlende lege vil også vite hvordan og
når behandlingen skal justeres til høyere nivåer dersom den kliniske responsen ikke er
tilstrekkelig (for å utelukke toksiske bieffekter).
Administreringsmetode
30
a. Sprøyter
Sammensetningene tilveiebrakt heri kan bli administrert parenteralt til et individ ved
anvendelse av én eller flere administreringsmåter, inkludert, men ikke begrenset til,
sprøyter, insulinpenner, insulinpumper eller i sammenheng med et lukket løkkesystem
35
eller en hvilken som helst kombinasjon derav. For eksempel kan engangssprøyter,
inkludert insulinsprøyter, bli anvendt for å administrere diskrete bolusinjeksjoner av
sammensetningene. Sammensetningene kan bli administrert ved anvendelse av den
115
samme sprøyten, så som når insulinet og hyaluronandegraderende
enzymprepareringer blir koformulert, eller kan bli administrert sekvensielt ved
anvendelse av forskjellige sprøyter. Sprøyter nyttige for administreringer av
sammensetningene tilveiebrakt heri, inkluderer insulinsprøyter, kan bli konstruert for
5
å holde standardkonsentrasjoner av insulinpreparatene, inkludert 100 U/ml
konsentrasjoner av insulinprepareringer, og ha markeringer i insulinenheter for lettere
administrering. I andre eksempler blir en hvilken som helst eller flere av en
insulinsprøyte eller insulinpumpe eller liknende innretning anvendt for å administrere
én eller begge av insulinprepareringen og hyaluronandegraderende enzympreparering.
10
b. Insulinpenn
En insulinpenn er et leveringssystem som kan bli anvendt for å administrere
sammensetningene tilveiebrakt heri. Insulinpennene inkluderer de med erstattbare
patroner fylt med sammensetningen som skal bli administrert, og de med ikke15
erstattbare ampuller. Insulinpenner med ikke-erstattbare ampuller blir typisk kastet
når ampullen er blitt tømt. Insulinpenner muliggjør dosering i, f.eks., halv enhet, en
enhet eller to enhetsdeler, som generelt blir målt ved anvendelse av en doseringsskive
eller annen mekanisme for å sette dosen (se f.eks. US patenter nr. 5 947 834,
6 074 372, 6 110 149, 6 524 280, 6 582 404). Sammensetningen blir deretter levert
20
ved hjelp av en fin nål koblet til pennen. Insulinpennene er velkjente innenfor
fagområdet, og inkluderer de som er beskrevet andre steder, inkludert, men ikke
begrenset til, de beskrevet i US patenter nr. 5 947 934, 4 973 318, 5 462 535,
5 599 323, 5 626 566, 5 984 906, 6 074 372, 6 110 149, 6 302 869, 6 379 339 og
7 241 278. Andre liknende doseringsinnretninger, så som f.eks., de beskrevet i US
25
patenter nr. 5 947 394, 6 074 372, 6 110 149 og 6 379 339, kan også bli anvendt for
å administrere sammensetningene tilveiebrakt heri, enten som en ko-formulering av
insulin og hyaluronandegraderende enzym, eller separat som en
insulinsammensetning og en hyaluronandegraderende enzymsammensetning. I noen
eksempler inneholder insulinpennen og liknende innretning også en sensor eller
30
monitor som kan måle blodglukosenivået til individet (se f.eks. WO 2003047426).
Insulinpenner og liknende leveringsinnretninger som kan bli anvendt, eller modifisert
for å bli anvendt, for å levere insulinsammensetningene tilveiebrakt heri, er velkjente
innenfor fagområdet, og inkluderer, men er ikke begrenset til, de som blir markedsført
35
under varemerkene Autopen£ (Owen Mumford, Inc.), Disetronic Pen (Disetronic
Medical Systems), Humalog£ Pen (Eli Lilly and Company), Humalog
(Eli Lilly and Company), Humulin
£
£
Mix 75/25 Pen
70/30 Pen (Eli Lilly and Company), Humulin£ N Pen
116
(Eli Lilly and Company), Novolog
£
FlexPen (Novo Nordisk), NovoPen£ 3 (Novo
Nordisk), NovoPen£ 4 (Novo Nordisk), NovoPen£ Junior (Novo Nordisk), Novolog£ Mix
70/30 FlexPen (Novo Nordisk), Induo£ (Novo Nordisk), Novolin£ InnoLet£ (Novo
Nordisk), Innovo£ (Novo Nordisk), OptiPen£ (Sanofi-Aventis) OptiPen£ Pro2 (Sanofi5
Aventis), OptiSet£ (Sanofi-Aventis) og SoloSTAR£ (Sanofi-Aventis).
c. Insulinpumper og andre insulinleveringsinnretninger
Sammensetningene tilveiebrakt heri kan bli administrert til et diabetesindivid ved
anvendelse av en insulinleveringsinnretning, så som en insulinpumpe eller annen
10
liknende kontinuerlig infusjonsinnretning. Insulinleveringsinnretninger inneholder
typisk minst ett engangs (“disposable”) reservoar, inneholdende en
insulinsammensetning, en pumpe (inkludert hvilke som helst kontroller, programvare,
prosesseringsmoduler og/eller batterier) og et engangsinfusjonssett, inkludert en
kanyle eller nål for subkutan injeksjon, og et rør som kobler kanylen eller nålen til
15
insulinreservoaret. For anvendelse med en superhurtigvirkende insulinsammensetning
kan insulinleveringsinnretningen inneholde et reservoar inneholdende en ko-formulert
insulin og hyaluronandegraderingsenzymsammensetninger, eller kan inneholde ett
eller flere reservoarer, slik at det hurtigvirkende insulinet og
hyaluronandegraderingsenzymsammensetningene er innbefattet i samme eller
20
separate reservoarer. I slike tilfeller kan insulinleveringsinnretningen levere hver
sammensetning samtidig eller etter hverandre. Følgelig kan slike innretninger bli
anvendt for å administrere de superhurtigvirkende insulinsammensetningene
tilveiebrakt heri. Sammensetningene kan bli administrert kontinuerlig eller i
bolusinjeksjoner. Videre har insulinleveringsinnretningsbrukeren evnen til å influere på
25
insulinprofilen ved å forme bolusen. For eksempel kan en standardbolus bli
administrert, som er en infusjon som likner en diskret injeksjon ved at hele dosen blir
pumpet øyeblikkelig. En utvidet bolus er en takteinfusjon over tid, som unngår en høy
innledende dose, og utvider virkningen av sammensetningen. En kombinasjonsbolus
inneholdende både en standardbolus og en utvidet bolus kan også bli administrert ved
30
anvendelse av en insulinpumpe eller annet kontinuerlig leveringssystem.
Insulinleveringsinnretninger er kjent innenfor fagområdet og beskrevet andre steder
inkludert, men ikke begrenset til i US patenter nr. 6 554 798, 6 641 533, 6 744 350,
6 852 104, 6 872 200, 6 936 029, 6 979 326, 6 999 854, 7 025 713 og 7 109 878.
Insulinleveringsinnretninger kan også være koblet til en glukosemonitor eller sensor,
35
og/eller kan inneholde et middel for å beregne den anbefalte insulindosen basert på
blodglukosenivåer, karbohydratinnholdet av et måltid, eller annet input. Ytterligere
117
insulinleveringsinnretninger kan være implanterbare, eller kan være i det ytre for
brukeren.
d. Lukket løkkesystemer (“closed loop systems”)
5
Lukket løkkesystemer, noen ganger referert til som en kunstig pankreas, er av spesiell
interesse for anvendelse med sammensetningene og metodene tilveiebrakt heri.
Lukket løkkesystemer refererer til systemer med en integrert kontinuerlig
glukosemonitor, en insulinpumpe eller annet leveringssystem, og kontroller som
inkluderer en matematisk algoritme som konstant beregner den krevde
10
insulininfusjonen for glykemisk kontroll, basert på reell tid målinger av
blodglukosenivåene. Slike systemer, når optimalisert, kan lette konstant og meget tett
glykemisk kontroll, i likhet med naturlig insulinrespons og glykemisk kontroll observert
i et friskt ikke-diabetesindivid. For å være effektiv, krever derimot lukket
løkkesystemer både en pålitelig og nøyaktig kontinuerlig glukosemonitor, og levering
15
av et insulin med en meget hurtig virkning. For eksempel kan forsinkinger i
insulinabsorpsjon og virkning assosiert med subkutan levering av hurtigvirkende
insuliner føre til store postprandiale glykemiske ekskursjoner (Hovorka et al. (2006)
Diabetic Med. 23:1-12). Forsinkelsen på grunn av insulinabsorpsjon, insulinvirkning,
interstitiell glukosekinetikk og transporttiden for ex vivo-baserte
20
registreringssystemer, så som de basert på mikrodialyseteknikkene, kan resultere i
totalt 100 minutter eller mer tid forsinkelse fra tidspunkt for insulinlevering til toppen
av dets detekterbare glukosereduserende effekt (Hovorka et al. (2006) Diabetic Med.
23:1-12). Følgelig, når administrert, vil insulin fortsette å øke dets målbare effekt i
nesten 2 timer. Dette kan komplisere den effektive reduseringen av
25
glukosekonsentrasjonen etter inntak av måltid ved anvendelse av et lukket
løkkesystem. Først må en glukoseøkning bli detektert. Dette hender typisk kun etter
omtrent 10-40 minutter forsinkelse (“lag”). Systemet må bestemme at et måltid er
blitt inntatt, og administrere en hensiktsmessig insulindose. Evnen som systemet har
for å kompensere deretter for en “feilvurdert” insulindose, blir ofret ved lange
30
forsinkelser og den manglende evnen til å “fjerne” insulin når administrert. Slike
problemer kan, i det minste delvis, bli løst ved anvendelse av en superhurtigvirkende
insulinsammensetning, så som de tilveiebrakt heri, som utviser en øket rate og
absorpsjonsnivå, og en assosiert forbedring i farmakodynamikken (som beskrevet i
eksempel 1 nedenfor). Superhurtigvirkende insulinsammensetninger tilveiebragt heri
35
har en redusert tmaks (dvs. oppnår maksimal konsentrasjon hurtigere) enn
hurtigvirkende insuliner, og begynner å kontrollere blodglukosenivåer hurtigere enn
hurtigvirkende insuliner. Denne økende raten av absorbans og virkningsbegynnelse
118
reduserer forsinkelsen mellom insulinvirkningen og glukoseregistreringen og input,
som resulterer i et mer effektivt lukket løkkesystem som kan tettere kontrollere
blodglukosenivåer, som reduserer glykemiske ekskursjoner.
5
Lukket løkkesystemer er velkjente innenfor fagområdet, og er blitt beskrevet andre
steder, inkludert, men ikke begrenset til US patenter nr. 5 279 543, 5 569 186,
6 558 351, 6 558 345, 6 589 229, 6 669 663, 6 740 072, 7 267 665 og 7 354 420.
Disse og liknende systemer, lett identifiserbare av fagfolk innenfor dette området, kan
bli anvendt for å levere superhurtigvirkende insulinsammensetningene tilveiebrakt
10
heri. Lukket løkkesystemer inkluderer et sensorsystem for å måle blodglukosenivåer,
en kontroller og et leveringssystem. Dette integrerte systemet er konstruert for å
HWWHUOLNQHHQSDQNUHDWLVNEHWDFHNNHǃFHOOHVOLNDWGHQNRQWUROOHUHUHQ
infusjonsinnretning for å levere insulin til et individ i en liknende konsentrasjonsprofil,
VRPYLOOHEOLGDQQHWDYIXOOVWHQGLJYLUNHQGHKXPDQHǃFHOOHUQnUPDQUHVSRQGHUHUWLO
15
forandringene i blodglukosekonsentrasjonene i kroppen. Følgelig simulerer systemet
kroppens naturlige insulinrespons til blodglukosenivåer, og ikke bare gjør effektiv bruk
av insulin, men også utgjør andre kroppsfunksjoner også siden insulin har både
metabolske og mitogene effekter. Videre, den glykemiske kontrollen oppnådd ved
anvendelse av et lukket løkkesystem blir oppnådd uten å kreve noen informasjon
20
angående størrelse og tidsbestemmelse av et måltid, eller andre faktorer. Systemet
kan være kun basert på reell tid blodglukosemålinger. Glukosesensoren danner et
sensorsignal representativt til blodglukosenivåene i kroppen, og tilveiebringer
sensorens signal til kontrolleren. Kontrolleren mottar sensorsignalet, og danner
beskjeder som blir kommunisert til insulinleveringssystemet. Insulinleveringssystemet
25
mottar kommandoene og infuserer insulin inn i kroppen i respons til beskjedene.
Tilveiebrakt nedenfor er beskrivelser av eksempelvise komponenter av lukket
løkkesystemer som kan bli anvendt for å levere de superhurtigvirkende
insulinsammensetningene tilveiebrakt heri. Det er underforstått at fagfolk innenfor
dette området lett kan identifisere egnede lukket løkkesystemer for anvendelse heri.
30
Slike systemer er blitt beskrevet i fagområdet, inkludert, men ikke begrenset til, de
beskrevet i US patenter nr. 5 279 543, 5 569 186, 6 558 351, 6 558 345, 6 589 229,
6 669 663, 6 740 072, 7 267 665 og 7 354 420. De individuelle komponentene av
systemene har også blitt beskrevet innenfor fagområdet, individuelt og i sammenheng
med et lukket løkkesystem for anvendelse for oppnåelse av glykemisk kontroll. Det er
35
underforstått at eksemplene tilveiebrakt heri er kun eksempelvise, og at andre lukket
løkkesystemer eller individuelle komponenter kan bli anvendt for å levere de
superhurtigvirkende insulinsammensetningene tilveiebrakt heri.
119
Lukket løkkesystemer inneholder en glukosesensor eller monitor som virker
kontinuerlig. Slike innretninger kan inneholde nål-typesensorer som blir satt inn under
huden og koblet til en liten overfører som kommuniserer glukosedata trådløst ved
5
radiofrekvenstelemetri til en liten mottaker. I noen eksempler blir sensoren satt inn
gjennom huden til individet ved anvendelse av en insersjonsnål, som blir fjernet og
kastet når sensoren er posisjonert i det subkutane vevet. Innskuddsnålen har en skarp
tupp og en åpen port til å holde sensoren i løpet av innskudd i huden (se f.eks. US
patenter nr. 5 586 553 og 5 954 643). Sensoren anvendt i lukket løkkesystemet kan
10
eventuelt inneholde tre elektroder som er eksponert for det interstitielle fluidet (ISF) i
det subkutane vevet. De tre elektrodene inkluderer en arbeidselektrode, en
referanseelektrode og en tellerelektrode som blir anvendt for å danne en krets. Når en
hensiktsmessig strøm blir tilført over arbeidselektroden og referanseelektroden,
tilveiebringer ISF impedansen mellom elektrodene. Et analogt strømsignal driver fra
15
arbeidselektroden gjennom kroppen, og til teller (“counter”) elektroden. Strømmen
ved arbeidselektroden blir generelt holdt til bunnen (“ground”), og strømmen i
referanseelektroden kan bli holdt ved en fast strøm Vset, så som f.eks. mellom 300 og
700 mV. Den mest prominente reaksjonen stimulert av strømforskjellen mellom
elektrodene er reduksjonen av gluksoe hvor den først reagerer med
20
glukoseoksidaseenzymet (GOX) for å danne glukonsyre og hydrogenperoksid (H2O2).
Deretter blir H2O2 redusert til vann (H2O) og (O-) på overflaten av arbeidselektroden.
O- trekker en positiv ladning fra sensorelektriske komponenter, følgelig frastøter et
elektron, og forårsaker en elektrisk strømningsflyt. Dette resulterer i at det analoge
strømsignalet er proporsjonalt med konsentrasjonen av glukose i ISF som er i kontakt
25
med sensorelektroder (se f.eks. US patent nr. 7 354 420).
I noen eksempler, blir mer enn én sensor anvendt for å måle blodglukose. For
eksempel kan overflødige sensorer bli anvendt, og individet kan bli gitt beskjed når en
sensor svikter ved telemålte karakteristisk monitor transmitterelektronikk. En
30
indikator kan også informere individet på hvilke sensorer som enda virker og/eller
antall sensorer som enda virker. I andre eksempler blir sensorsignaler kombinert
gjennom gjennomsnittet eller andre metoder. Videre kan forskjellige typer av sensorer
bli anvendt. For eksempel kan en indre glukosesensor og en ytre glukosesensor bli
anvendt for å måle blodglukose samtidig.
35
Glukosesensorer kan bli anvendt i et lukket løkkesystem som leverer
superhurtigvirkende insulinsammensetninger tilveiebrakt heri er velkjente og kan lett
120
bli identifisert, og eventuelt videre modifisert, av fagfolk innenfor dette området.
Eksempler på indre glukosesensorer inkluderer, men er ikke begrenset til, de
beskrevet i US patenter nr. 5 497 772, 5 660 163, 5 791 344, 5 569 186, 6 895 265.
Eksempler på en glukosesensor som anvender fluorescens er den beskrevet i US
5
patent nr. 6 011 984. Glukosesensorsystemer kan også anvende andre
sensibiliseringsteknologier, inkludert lysstråler, ledningsevne, jetprøving, mikrodialyse,
mikroporasjon, ultrasonisk prøving, revers iontoforese, eller andre metoder (f.eks. US
patenter nr. 5 433 197 og 5 945 676, og internasjonal patentpublikasjon WO
199929230). I noen eksempler er kun arbeidselektroden lokalisert i det subkutane
10
vevet, og i kontakt med ISF, og telleren (“counter”) og referanseelektroder er
lokalisert i det ytre i forhold til kroppen, og i kontakt med huden. Tellerelektroden og
referanseelektroden kan være lokalisert på overflaten av et monitorhus, og kan bli
holdt til huden som del av en telemålt karakteristisk monitor. I ytterligere eksempler
blir tellerelektroden og referanseelektroden holdt mot huden under anvendelse av
15
andre innretninger, så som kjøring av en ledning til elektroder og taping av
elektrodene til huden, inkorporering av elektrodene på undersiden av et ur som rører
huden. Videre kan mer enn én arbeidselektrode bli plassert i det subkutane vevet for
reservekapasitet. Interstitielt fluid kan også bli høstet fra kroppen til et individ, og
strømmet over en ytre sensor som ikke er implantert i kroppen.
20
Kontrolleren mottar input fra glukosesensoren. Kontrolleren er konstruert for å
HWWHUOLNQHHQSDQNUHDVEHWDFHOOHǃFHOOHRJWLOYHLHEULQJHUEHVNMHGHUWLO
insulinleveringsinnretningen til å infusere den nødvendige mengden av insulin for
glykemisk kontroll. Kontrolleren anvender programvare med algoritmer for å beregne
25
den krevde mengden av insulin basert på glukosenivåene detektert av
JOXNRVHVHQVRUHQ(NVHPSOHUSnDOJRULWPHULQNOXGHUHUGHVRPHWWHUOLNQHUǃFHOOHQH
nært, siden algoritmene konstruert for å minimalisere glukoseeksklusjoner i kroppen,
uten hensyn til hvordan slik insulin er levert, kan forårsake omfattende vektøkning,
hypertensjon og aterosklerose. Typisk er systemet ment å etterlikne in vivo
30
LQVXOLQVHNUHVMRQVP¡QVWUHRJnMXVWHUHGHWWHP¡QVWHUHWLVDPVYDUPHGLQYLYRǃ
celleadapsjonen opplevd av normale friske individer. Kontrollalgoritmer nyttige for
lukket løkkesystemer inkluderer de som blir anvendt av en proportional-integralderivative (PID) kontroller. Proportional derivative kontrollere og modellprediktiv
kontroll (MPC) algorigmer kan også bli anvendt i noen systemer (Hovorka et al.
35
(2006) Diabetic Med. 23:1-12). Eksempler på algoritmer inkluderer, men er ikke
begrenset til, de beskrevet av Hovorka et al. (Diabetic Med. (2006) 23:1-22, Shimoda
et al., (Front Med Biol Eng (1997) 8:197-211), Schiciri et al. (Artif. Organs (1998)
121
22:32-42), Steil et al. (Diabetes Technol Ther (2003) 5:953-964), Kaletz et al., (Acta
Diabetol. (1999) 36:215) og US patenter nr. 5 279 543, 5 569 186, 6 558 351,
6 558 345, 6 589 229, 6 740 042, 6 669 663, 6 740 072, 7 267 665, 7 354 420 og US
patentpublikasjon nr. 20070243567.
5
I ett eksempel blir en PID-kontroller anvendt i lukket løkkesystemet. En PID-kontroller
justerer kontinuerlig insulininfusjonen ved vurdering av glukoseeksklusjoner fra tre
utgangspunkter: avgang fra målglukosen (proporsjonal komponent), arealet under
kurven mellom omgivende og målglukose (integrert komponent), og forandring i
10
RPJLYHQGHJOXNRVHGHULYDWLYNRPSRQHQWHQ*HQHUHOWHULQYLYRǃFHOOHUHVSRQVHQWLO
forandringer i glukose karakterisert av “første” og “andre” fase insulinresponser. Den
ELIDVLVNHLQVXOLQUHVSRQVHQWLOHQǃFHOOHNDQEOLHWWHUOLNQHWYHGDQYHQGHOVHDY
komponentene til et proporsjonalt, plussintegral, plussderivativ (PID) kontroller (se
f.eks. US patent nr. 7 354 420).
15
Kontrolleren danner beskjeder for ønsket insulinlevering. Insulinleveringssystemer, så
som insulinpumper, er kjent innenfor fagområdet, og kan bli anvendt i lukket
løkkesystemene. Eksempler på insulinleveringsinnretninger (så som de beskrevet
ovenfor) inkluderer, men er ikke begrenset til, de beskrevet i US patenter nr.
20
4 562 751, 4 678 40. 4 685 903, 4 373 527, 4 573 994, 6 554 798, 6 641 533,
6 744 350, 6 852 104, 6 872 200, 6 936 029, 6 979 326, 6 999 854, 7 025 713 og
7 109 878. Insulinleveringsinnretninger inneholder typisk én eller flere reservoarer,
som generelt er engangs, inneholdende en insulinpreparering, så som en
superhurtigvirkende insulinsammensetning beskrevet heri. Reservoarene kan
25
inneholde mer enn ett insulin, så som, f.eks., et basalvirkende insulin, og et
hurtigvirkende insulin, enten koformulert og innbefattet i et enkelt reservoar, eller
innbefattet separat i to eller flere reservoarer. For anvendelse med en
superhurtigvirkende insulinsammensetning kan insulinleveringsinnretningen inneholde
et reservoar inneholdende en ko-formulert hurtigvirkende insulin og
30
hyaluronandegraderende enzymsammensetning, eller kan inneholde to eller flere
reservoarer, slik at det hurtigvirkende insulinet og hyaluronandegraderende
enzymsammensetningene er innbefattet separat i to reservoarer. I slike tilfeller kan
insulinleveringsinnretningen levere hver sammensetning samtidig, eller etter
hverandre. I noen eksempler blir sammensetningene levert ved anvendelse av et
35
infusjonsrør og en kanyl eller nål. I andre eksempler er infusjonsinnretningen koblet
direkte til huden, og sammensetningene strømmer fra infusjonsinnretningen, gjennom
en kanyle eller nål direkte inn i kroppen, uten anvendelse av et rør. I ytterligere
122
eksempler er infusjonsinnretningen inne i kroppen, og et infusjonsrør kan eventuelt bli
anvendt for å levere sammensetningene. Lukket løkkesystemer kan også inneholde
ytterligere komponenter, inkludert, men ikke begrense til filtre, kalibratorer og
transmittere.
5
G. Metoder for vurdering av aktivitet, farmakokinetikk og
farmakodynamikk
Analyser kan bli anvendt for å vurdere in vitro og in vivo aktivitetene til insulin alene
eller i kombinasjon med et hyaluronandegraderende enzym. Inkludert blant slike
10
analyser er de som vurderer farmakokinetikk- og farmakodynamikkegenskapene til
subkutant eller intraperitonealt-administrert insulin, inkludert biotilgjengelighet, og
tolererbarhet. Den biologiske aktiviteten til både insulin og et hyaluronandegraderende
enzym kan også bli vurdert ved anvendelse av analyser velkjent innenfor fagområdet.
Slike analyser kan f.eks. bli anvendt for å bestemme hensiktsmessig plassering av et
15
insulin, så som et hurtigvirkende insulin, og et hyaluronandegraderende enzym, og
frekvensen på doseringen, for behandling.
1. Farmakokinetikk, farmakodynamikk og tolererbarhet
Farmakokinetikk (PK), farmakodynamikk (PD) og tolererbarhetsstudier, så som de
20
beskrevet i eksempel 1, nedenfor, kan bli utført ved anvendelse av dyremodeller,
inkludert grisemodeller som er beskrevet i eksemplene 11 og 12, eller kan bli utført i
løpet av kliniske studier med pasienter. Dyremodeller inkluderer, men er ikke
begrenset til, mus, rotter, kaniner, hunder, marsvin og ikke-humane primatmodeller,
så som cynomolgusaper eller resusmasakes. I noen tilfeller blir farmakokinetikk og
25
tolererbarhetsstudier utført ved anvendelse av friske dyr eller humane individer. I
andre eksempler blir studier utført ved anvendelse av dyremodeller for diabetes, så
som de som er beskrevet nedenfor, eller individer, humane med diabetes.
Eksempelvise prosedyrer nyttige for å utføre disse studier inkluderer
glukoseclampteknikker (Brehm et al. (2007) i Clin Diabetes Res: Methods and
30
Techniques. Ed Michael Rosen, sidene 43-76, eksempel 1). I hyperinsulinemi
euglykemisk clampprosedyre blir heksogent insulin infusert for å danne
hyperinsulinemiplasmainsulinkonsentrasjoner, mens plasmaglukosekonsentrasjonen
blir holdt constant på euglykeminivået ved hjelp av en variable eksogen
glukoseinfusjon. Glukoseinfusjonsraten (GIR) nødvendig for å opprettholde konstante
35
glukosenivåer i løpet av perioden med hyperinsulinemi, tilveiebringer et mål på
effekten av det infuserte insulinet på glukosemetabolismen. GIR er en refleksjon av
mengden av glukose som blir anvendt av kroppen (dvs. mer eksogent glukose må bli
123
infusert for å opprettholde normale blodglukosenivåer, dvs. mellom 90-110 mg/dL,
når kroppen bruker mer glukose ), og, derfor, aktiviteten av administrert insulin (dvs.
øket insulinaktivitet resulterer i redusert endogent glukoseytelse, og forøket
blodglukoseanvendelse, som resulterer i en total reduksjon av blodglukose). Følgelig
5
kan en slik prosedyre, i tillegg til å bli anvendt for å vurdere insulinsekresjon og
insulinresistens i et individ, bli anvendt for en trygg vurdering av farmakokinetikk- og
farmakodynamikkegenskapene til et insulin, så som et insulin koadministrert med
hyaluronandegraderende enzym.
10
Farmakokinetikk til subkutant eller intraperitonealt administrert insulin kan bli vurdert
ved måling av tidskonsentrasjonsprofilen av insulin, og beregning av slike parametere
så som maksimal (topp) seruminsulinkonsentrasjon (Cmaks), topptid (dvs. når
maksimal seruminsulinkonsentrasjon oppstår, tmaks), og areal under kurven (dvs.
arealet under kurven dannet ved å plotte tid mot blodinsulinkonsentrasjonen; AUC),
15
for et hvilket som helst gitt tidsintervall etter administrasjon. Den absolutte
biotilgjengeligheten av subkutant administrert insulin blir bestemt ved sammenlikning
av arealet under kurven til insulin, etter subkutan levering (AUCsc) med AUC av insulin
etter intravenøs levering (AUCiv). Absolutt biotilgjengelighet (F), kan bli beregnet ved
anvendelse av formelen: F = [([AUC]sc x dosese)/([AUC]iv x doseiv)] x 100. Den
20
relative biotilgjengeligheten (Frel) til to behandlinger via samme administreringsvei, så
som f.eks., et insulin med eller uten koadministrering med et
hyaluronandegraderingsenzym, kan også bli beregnet, så som i eksempel 1. For
eksempel kan den relative biotilgjengeligheten (Frel) til subkutant administrert
Humalog£ insulin lispro koadministrert med rHuPH20 og subkutant administrert
25
Humalog£ insulin lispro alene, blir beregnet {[AUC (Humalog£ insulin
lispro/rHuPH20)]/ [AUC (Humalog£ insulin lispro alene]} x 100, hvor hver dose av
Humalog£ insulin lispro er den samme, og AUC blir beregnet over det samme
tidsintervallet. Konsentrasjonen av insulin i plasma etter subkutan administrering kan
bli målt ved anvendelse av en hvilken som helst metode kjent innenfor fagområdet,
30
egnet for vurdering av konsentrasjonen av insulin i blodprøver. Eksempler på metoder
inkluderer, men er ikke begrenset til, ELISA og RIA.
De farmakodynamiske egenskapene til subkutan eller intraperitoneal administrert
insulin, kan bli vurdert ved måling av slike parametere som glukoseinfusjonsrate (GIR)
35
(mg/kg/min.), tid til maksimal effekt (tGIRmaks) (minutter); tid til sen halvmaksimal
effekt (tGIRsen 50 %) (minutter); tid til tidlig halvmaksimal effekt (tGIRtidlig 50 %)
(minutter); maksimal metabolsk effekt (GIRmaks) (mg/kg/minutter); AUC-GIR0-60 min.
124
(g/kg); AUC-GIR0-120 min. (g/kg); AUC-GIR0-180 min. (g/kg); AUC-GIR0-240 min. (g/kg); AUCGIR0-300 min. (g/kg); og AUC-GIR0-360 min. (g/kg).
En rekke doser og forskjellige doseringsfrekvens av dosering kan bli administrert i
5
farmakokinetiske studier for å vurdere effekten av økning eller reduksjon av
konsentrasjonene av insulin og/eller et hyaluronandegraderende enzym i dosen.
Farmakokinetikk- og farmakodynamikkegenskapene til subkutant eller intraperitonealt
administrert insulin, så som biotilgjengelighet, kan også bli vurdert med eller uten
koadministrering av et hyaluronandegraderingsenzym. For eksempel kan dyr eller
10
humane individer bli administrert insulin subkutant alene eller i kombinasjon med et
hyaluronandegraderende enzym i løpet av en hyperinsulinemi
euglykemiclampprosedyre. Blodprøver kan deretter bli tatt ved forskjellige
tidspunkter, og mengden av insulin i serum bli bestemt, så som ved
radioimmunoanalyse (RIA) eller enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA).
15
Glukoseinfusjonsraten gjennom prosedyren kan også bli beregnet. Farmakokinetikkog farmakodynamikkegenskapene til subkutant administrert insulin administrert med
eller uten et hyaluronandegraderende enzym, kan deretter bli bestemt for å vurdere
effekten av koadministrering med et hyaluronan som degraderer ved slike egenskaper
til et hvilket som helst insulin.
20
Studier for å vurdere trygghet og tolererbarhet er også kjent innenfor fagområdet, og
kan bli anvendt heri. En subkutan administrering av insulin, med eller uten
koadministrering av et hyaluronandegraderende enzym, kan utviklingen av hvilke som
helst negative reaksjoner bli registrert. Negative reaksjoner kan inkludere, men er
25
ikke begrenset til, injeksjonssetereaksjoner, så som ødem eller svelling, hodepine,
feber, tretthet, forkjølelse, rødming, svimmelhet, økt urtikaria, tungpustethet eller
trangt bryst, kvalme, oppkast, stivhet, ryggsmerte, brystsmerte, muskelkramper,
anfall eller sammentrekninger, forandringer i blodtrykk og anafylaktisk eller alvorlig
hypersensitivitetsresponser. Typisk, blir en rekke doser og forskjellige
30
doseringsfrekvenser administrert i trygghets- og tolererbarhetsstudiene, for å vurdere
effekten av økning eller redusering av konsentrsjonene av insulin og/eller et
hyaluronandegradrend enzym i dosen.
2. Biologisk aktivitet
35
a. insulin
Evnen som et insulin, så som en insulinanalog, har til å virke som et terapeutisk
middel, kan bli vurdert in vitro eller in vivo. For eksempel kan in vitro analyser
125
velkjente innenfor fagområdet bli utført for å vurdere evnen som insulin har til å bli
bundet til insulinreseptoren. I ett eksempel blir en konkurrerende bindingsanalyse
utført, hvor humane placentacellemembraner blir dannet som en kilde på
insulinreseptorer, og inkubert med radiomerket humant insulin med eller uten den
5
umerkede insulinanalogen. Mengden av bundet radiomerket insulin blir deretter
detektert for å bestemme evnen som insulinanalogen har til å konkurrere for binding
og den relative affiniteten som insulinanalogen har for placentainsulinreseptoren blir
beregnet (se f.eks. Weiss et al., (2001), J. Biol. Chem. 276:40018-40024). Andre
kilder for insulinreseptorer, inkludert andre celler som naturlig eller rekombinant
10
uttrykker insulinreseptoren, kan også bli anvendt i slike konkurrerende
bindingsanalyser (Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258).
Evnen som insulin har til å stimulere glukoseopptak eller påvirke hvilke som helst
andre av dets typiske metabolske resultater kan bli vurdert in vitro. For å måle
15
insulinstimulert glukoseopptak blir adipocytter inkubert med merket glukose, så som
2-deoksy-D-[2,63-H]glukose eller D-[U-14C]glukose med eller uten insulin. Den
inkorporerte radioaktiviteten ble deretter målt for å bestemme mengden av
glukoseopptak i nærvær eller fravær av insulin (Louveau et al., (2004) J Endocrin.
181:271-280, Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258). Ved vurdering av
20
aktiviteten til en insulinanalog, kan aktiviteten av humant insulin også bli vurdert og
anvendt for sammenlikning. In vitro analyser for å vurdere glukoseproduksjon i H4IIEceller i nærvær av insulin kan også bli utført (Wang et al., (2000) J. Bioche,
275:14717-14721, Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258).
25
In vivo studier ved anvendelse av diabetes eller modeller for friske dyr eller humane
individer, kan også bli utført for å vurdere den terapeutiske aktiviteten til insulin.
Insulin kan bli administrert til dyremodeller av diabetes for å vurdere effektene på
nivåene av blodglukose, sirkulerende insulinnivåer og hemoglobin A1c (HbA1c), for
eksempel. Hemoglobin A1c dannes når glukose kobles til hemoglobin, som oppstår når
30
nivåene av blodglukose blir forhøyet. HbA1c-nivåene i en blodprøve kan bli vurdert
ved f.eks. HPLC, ELISA, RIA eller annen immunoanalyse, normale HbA1c-verdier for
friske individer er omtrent 4,0-6,2 prosent. Amerikanske diabetesforening anbefaler at
det ville være under 7 % (eller under 6 % i visse personer) for pasienter med diabetes
for å hjelpe med å forebygge komplikasjonene fra diabetes. Insulinnivåene kan bli
35
målt ved f.eks. ELISA eller RIA. Glukosenivåer blir typisk målt ved anvendelse av en
glukosesensor eller analysator.
126
Dyremodeller for type 1 diabetes inkluderer ikke-overvektig diabetes (NOD) mus og
BioBreeding (BB) rotte (Atkinson et al., (1999) Nature Med. 5:601.604). Dyremodeller
for type 2 diabetes inkluderer, men er ikke begrenset til, ob/ob-mus og db/db-mus,
som har mutasjoner i leptingenet eller leptinreseptoren, KK-mus, Nagoya-Shibata5
Yasuda (NSY) mus, Zucker diabetesfett (ZDF) rotter og Gato-Katazaki (GK) rotter
(Cefalu (2006) ILAR Journal 47:186-198). I andre eksempler blir friske dyr anvendt
for å teste aktiviteten av et insulin, med eller uten et hyaluronandegraderende enzym.
b. Hyaluronandegraderende enzymer
10
Aktiviteten til et hyaluronandegraderende enzym kan bli vurdert ved anvendelse av
metoder velkjente innenfor fagområdet. For eksempel USP XXII-analysen for
hyaluronidase bestemmer aktiviteten indirekte ved måling av mengden av ikkedegradert hyaluronsyre, eller hyaluronan, (HA) substrat gjenværende etter at enzymet
blir latt reagere med HA i 30 min. ved 37oC (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United
15
States Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD). En hyaluronidase Reference
standard (USP) eller National Formulary (NF) standard hyaluronidaseløsning kan bli
anvendt i en analyse for å bestemme aktiviteten, i enheter, av en hvilken som helst
hyaluronidase. I ett eksempel ble aktiviteten målt ved anvendelse av en
mikroturbiditetsanalyse. Denne er basert på dannelsen av et uoppløselig presipitat når
20
hyaluronsyren bindes med serumalbumin. Aktiviteten blir målt ved inkkubering av
hyaluronidase med natriumhyaluronat (hyaluronsyre) for en gitt tidsperiode (f.eks. 10
minutter) og deretter presipitering av ufordøyd natriumhyaluronat med tilsetning av
surgjort serumalbumin. Turbiditeten til den resulterende prøven blir målt ved 640 nm
etter en ytterligere utviklingsperiode. Reduksjonen i turbiditet som resulterer fra
25
hyaluronidaseaktiviteten på natriumhyaluronatsubstratet er et mål på
hyalurinidaseenzymaktivitet. I et annet eksempel blir hyaluronidaseaktivitet målt ved
anvendelse av en mikrotiteranalyse hvor gjenværende biotinylert hyaluronsyre blir
målt etter inkubasjon med hyaluronidase (se f.eks. Frost og Stern (1997) Anal.
Biochem. 251:263-269, US patentpublikasjon nr. 20050260186). De frie
30
karboksylgruppene på glukuronsyreresidiene av hyaluronsyre er biotinylerte, og det
biotinylerte hyaluronsyresubstratet er kovalentlig koblet til en mikrotiterplate. Etter
inkubasjon med hyaluronidase, blir gjenværende biotinylert hyaluronsyresubstrat
detektert ved anvendelse av en avidin-peroksidasereaksjon, og sammenliknet med
den oppnådd etter reaksjonen med hyaluronidasestandarder med en kjent aktivitet.
35
Andre analyser for å måle hyaluronidaseaktivitet er også kjent innenfor fagområdet,
og kan bli anvendt i metodene heri (se f.eks. Delpech et al., (1995) Anal. Biochem.
229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).
127
Evnen som et hyaluronandegraderingsenzym har til å virke som et sprednings- eller
diffusjonsmiddel kan også bli vurdert. For eksempel kan trypan blå fargestoff bli
injisert subkutant med eller uten et hyaluronandegraderende enzym inn i den laterale
5
huden på hver side av nakne mus. Det fargede området blir deretter målt, så som
med en mikrokaliper, for å bestemme evnen som hyaluronandegraderende enzym har
til å virke som et spredningsmiddel (US patent nr. 20060104968). Effekten av
koadministrering av hyaluronidase med et annet middel, så som et insulin, på
farmakokinetikk og farmakodynamikkegenskapene til det midlet kan også bli vurdert
10
in vivo ved anvendelse av dyremodell og/eller humane individer, så som ved setting
av et klinisk forsøk, som diskutert ovenfor, og demonstrert i eksempel 1 nedenfor.
Den funksjonelle aktiviteten til et hyaluronandegraderingsenzym som ikke er en
hyaluronidase, kan bli sammenliknet med en hyaluronidase ved anvendelse av hvilke
som helst av disse analysene. Dette kan bli utført for å bestemme hva en funksjonell
15
ekvivalent mengde av et hyaluronandegraderingsenzym er. For eksempel kan evnen
til et hyaluronandegraderingsenzym har til å virke som et sprednings- eller
diffusjonsmiddel bli vurdert ved injisering derav inn i den laterale huden til mus med
trypan blå, og mengden nødvendig for å oppnå samme mengden av diffusjon som,
f.eks., 100 enheter av en hyaluronidasereferansestandard,kan bli bestemt. Mengden
20
av hyaluronandegraderingsenzym som er nødvendig er derfor funksjonelt ekvivalent
med 100 hyaluronidaseenheter.
H. Terapeutiske anvendelser
Metodene beskrevet heri kan bli anvendt for behandling av en hvilken som helst
25
tilstand hvor et hurtigvirkende insulin blir anvendt. Insulin kan bli administrert
subkutant, i kombinasjon med et hyaluronandegraderingsenzym, for å behandle en
hvilken som helst tilstand som er mottakelig for behandling med insulin. Typisk blir et
hyaluronandegraderingsenzym koadministrert med et hurtigvirkende insulin. Denne
delen tilveiebringer eksempler på terapeutiske anvendelser for hurtigvirkende insulin.
30
De terapeutiske anvendelsene beskrevet nedenfor er eksempler, og skal ikke begrense
anvendelser av metodene beskrevet heri. Terapeutiske anvendelser inkluderer, men er
ikke begrense til, behandling for type 1 diabetes mellitus, type 2 diabetes mellitus,
gestasjonell diabetes, og for glykemisk kontroll i kritisk syke pasienter. For eksempel
kan hurtigvirkende insulin bli administrert i kombinasjon med et
35
hyaluronandegraderende enzym subkutant i diskrete doser, så som via en sprøyte
eller insulinpenn, før et måltid som prandial insulinterapi i individer med diabetes for å
oppnå glykemisk kontroll. Hurtigvirkende insuliner kan også bli administrert subkutant
128
eller intraperitonealt i kombinasjon med et hyaluronandegraderende enzym ved
anvendelse av en insulinpumpe eller innholdet av et lukket løkkesystem for
kontinuerlig å kontrollere blodglukosenivåene gjennom dagen og natten, og/eller for å
kontrollere postprandial glykemiske eksklusjoner. Det er innenfor kunnskapene til en
5
behandlende lege å identifisere slike sykdommer eller tilstander.
Som diskutert ovenfor, er bestemte doseringer og behandlingsprotokoller typisk
individualiserte for hvert individ. Om nødvendig, kan en bestemt dose og varighet og
behandlingsprotokoll bli bestemt empirisk eller ekstrapolert. For eksempel kan
10
eksempelvise doser av hurtigvirkende insulin uten et hyaluronandegraderingsenzym
bli anvendt som et utgangspunkt for å bestemme hensiktsmessige doseringer for
metodene tilveiebrakt heri. Doseringsnivåer kan bli bestemt basert på forskjellige
faktorer, så som kroppsvekt til individet, generell helse, alder, aktiviteten til den
spesifikke forbindelsen anvendt, kjønn, diett, metabolsk aktivitet,
15
blodglukosekonsentrasjoner, administreringstid, utskillingsrate,
medikamentkombinasjon, alvorlighetsgrad og forløp av sykdommen, og pasientens
disposisjon til sykdom og vurdering av behandlende lege. Spesielt kan
blodglukosenivåer, så som målt av en blodglukosesensor, bli målt og anvendt for å
bestemme mengden av insulin og et hyaluronandegraderende enzym som skal bli
20
administrert for å oppnå glykemisk kontroll. Algoritmer er kjent innenfor fagområdet
som kan bli anvendt for å bestemme en dose basert på absorpsjonsraten og nivå av
absorpsjon av de superhurtigvirkende sammensetningene tilveiebrakt heri, også
basert på blodglukosenivåer. Doseringer av insulin for postprandial glykemisk kontroll
kan også bli beregnet eller justert, f.eks., ved å bestemme karbohydratinnholdet til et
25
måltid (Bergenstal et al., (2008) Diabetes Care, Lowe et al., (2008) Diabetes Res.
Clin. Pract., Chiesa et al., (2005) Acta Biomed. 76:44-48).
1. Diabetes mellitus
Diabetes mellitus (eller diabetes) er karakterisert ved en redusert
30
glukosemetabolisme. Blodglukose blir oppnådd fra karbohydrater absorbert i magen,
og produsert i leveren. Økende blodglukosenivåer stimulerer insulinfrigjøring.
Postprandial glukoseinfluks kan være 20 til 30 ganger høyere enn den hepatiske
produksjonen av glukose observert mellom måltider. Tidlig fase insulinfrigjøring, som
varer 10 minutter eller der omkring, undertrykker hepatisk glukoseproduksjon, og har
35
en lengre (sen) frigjøringsfase, som varer to timer eller mer, og som dekker
måltidskarbohydratinfluks. Mellom måltidene dekker et lavt kontinuerlig insulinnivå,
basal insulin, pågående metabolske krav, spesielt for å regulere hepatisk glukoseeffekt
129
samt glukoseanvendelse av adiposvev, muskelvev og andre målseter. Pasienter med
diabetes har forhøyede blodglukosenivåer (hyperglysemi). Diabetes kan bli klassifisert
i to hovedgrupper: type 1 diabetes og type 2 diabetes. Type 1 diabetes, eller
insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM), er karakterisert ved et tap av
5
LQVXOLQSURGXVHUHQGHǃFHOOHULGHODQJHUKDQVNH¡\HQHLSDQNUHDVVRPI¡UHUWLOPDQJHO
SnLQVXOLQ'HQSULP UHnUVDNHQWLOǃFHOOHPDQJHOHU7FHOOHPHGLHUWDXWRLPPXQLWHW
Type 2 diabetes, eller ikke-insulinavhengig diabetes mellitus (NIDDM), oppstår i
SDVLHQWHUPHGHQUHGXVHUWǃFHOOHIXQNVMRQ'LVVHSDVLHQWHQHKDULQVXOLQUHVLVWHQVHOOHU
redusert insulinsensitivitet, kombinert med redusert insulinsekresjon. Type 2 diabetes
10
kan til slutt bli utviklet til type 1 diabetes. Også inkludert i diabetes er gestasjonell
diabetes. Pasienter med diabetes kan bli administrert insulin for å både opprettholde
basale insulinnivåer, og å forebygge glykemiske ekskursjoner, så som etter et måltid.
a. Type I diabetes
15
Type I diabetes er en T-celleavhengig autoimmun sykdom karakterisert ved infiltrering
DYODQJHUKDQVNH¡\HUGHQHQGRNULQHHQKHWHQWLOSDQNUHDVRJGHVWUXNVMRQDYǃFHOOHU
som fører til mangel på insulinproduksjon og hyperglykemi. Type 1 diabetes blir som
oftest diagnostisert hos barn og unge voksne, men kan bli diagnostisert ved en hvilken
som helst alder. Pasienter med type 1 diabetes kan ha, i tillegg til lave insulinnivåer
20
og høye blodglukosenivåer, polyuri, polydispi, polyfagi, sløret syn, og tretthet.
Pasienter kan bli diagnostisert ved frembringelse med fastende plasmaglukosenivåer
på eller over 126 mg/dL (7,0 mmol/l), plasmaglukosenivåer på eller over 200 mg/dL
(11,1 mmol/l) to timer etter en 75 g oral glukosebelastning, så som i en
glukosetoleransetest, og/eller tilfeldige plasmaglukosenivåer på eller over 200 mg/dL
25
(11,1 mmol/l).
Den primære behandlingen for pasienter med type 1 diabetes er administrering av
insulin som erstatningsterapi, som typisk blir utført i sammenheng med
blodglukoseregistrering. Uten tilstrekkelig erstatningsinsulin kan diabetisk ketoacidose
30
bli utviklet, som kan resultere i koma eller død. Pasienter kan bli administrert
subkutane injeksjoner av hurtigvirkende insulin ved anvendelse av f.eks. en sprøyte
eller insulinpenn, eller en insulinpumpe for å opprettholde hensiktsmessige
blodglukosenivåer i løpet av dagen, og også for å kontrollere postprandiale
glukosenivåer. I noen tilfeller kan en insulinpumpe, inkludert sammenheng med et
35
lukket løkkesystem, bli anvendt for å levere insulin intraperitonealt. Følgelig, kan
pasienter med type 1 diabetes bli administrert superhurtigvirkende
insulinsammensetning beskrevet heri subkutant eller intraperitonealt via sprøyte,
130
insulinpenn eller insulinpumpe, eller ved en hvilken som helst annen nyttig metode
nyttig for levering av insulin, ved anvendelse av metodene beskrevet heri, for
hurtigere å kontrollere blodglukose og insulinnivåene.
5
b. Type 2 diabetes
Type 2 diabetes assosiert med insulinresistens og i noen populasjoner, også ved
LQVXOLQRSHQLWDSDYǃFHOOHIXQNVMRQ,W\SHGLDEHWHVHUSDVLHQWIULJM¡ULQJDYLQVXOLQ
fraværende, og fase 2 frigjøringen er forsinket og utilstrekkelig. Den skarpe toppen av
insulinfrigjøring som oppstår i friske individer i løpet av og etter et måltid, er forsinket,
10
forlenget, og utilstrekkelig i mengde i pasienter med type 2 diabetes, og resulterer i
hyperglykemi. Pasienter med type 2 diabetes kan bli administrert insulin for å
kontrollere blodglukosenivåene (Mayfield et al. (2004) Am Fam Physican 70:489-500).
Dette kan bli utført i kombinasjon med andre behandlinger og behandlingsregimer,
inkludert diett, mosjon og andre anti-diabetesterapier (f.eks. sulfonylureaer,
15
biguanider, meglitinider, tiazolidindioner og alfa-glukosidaseinhibitorer). Følgelig kan
pasienter med type 2 diabetes administreres superhurtigvirkende
insulinsammensetninger beskrevet heri subkutant eller intraperitonealt via sprøyte,
insulinpenn eller insulinpumpe, eller en hvilken som helst annen metode nyttig for
levering av insulin, ved anvendelse av metodene beskrevet heri, for mer hurtig
20
kontroll av blodglukose og insulinnivåer. Som diskutert andre steder heri, kan
administrering av superhurtigvirkende insulinsammensetninger til type 2
diabetespasienter, i tillegg til å oppnå bedre glykemisk kontroll sammenliknet med
korresponderende hurtigvirkende insulin, redusere risikoen for vektøkning og fedme,
som ofte er assosiert med insulinterapi i type 2 diabetespasienter.
25
c. Gestasjonell diabetes
Gravide kvinner som aldri har hatt diabetes før, men som har høye blodglukosenivåer i
løpet av graviditeten blir diagnostisert med gestasjonell diabetes. Denne typen av
diabetes påvirker omtrent 1-14 % av alle gravide kvinner, avhengig av den studerte
30
populasjonen (Carr et al., (1998) Clinical Diabetes 16). Idet den underliggende
årsaken fortsatt er ukjent, ser det ut som om det er sannsynlig at hormonene
produsert i løpet av graviditeten reduserer gravide kvinners sensibilitet overfor insulin.
Mekanismen for insulinresistens er sannsynligvis en post-reseptordefekt, siden normal
insulinbinding av insulinsensitive celler er blitt demonstrert. Pankreas frigjør 1,5-2,5
35
ganger mer insulin for å respondere overfor den resulterende økningen i
insulinresistens. Pasienter med normal pankreasfunksjon har evne til å møte disse
behovene. Pasienter med grenselinjepankreasfunksjon har vanskeligheter med å øke
131
insulinsekresjon, og produserer dermed utilstrekkelige insulinnivåer. Gestasjonell
diabetes resulterer dermed når det er forsinket eller utilstrekkelig insulinsekresjon i
nærvær av forøket perifer insulinresistens.
5
Pasienter med gestasjonell diabetes kan bli administrert insulin for å kontrollere
blodglukosenivåer. Følgelig kan pasienter med gestasjonell diabetes bli administrert de
superhurtigvirkende insulinsammensetningene beskrevet heri subkutant via sprøyte,
insulinpenn, insulinpumpe eller kunstig pankreas, eller hvilke som helst andre
metoder, ved anvendelse av metodene beskrevet heri, for å hurtigere kontrollere
10
blodglukose og insulinnivåene.
2. Insulinterapi for kritisk syke pasienter
Hyperglykemi og insulinresistens oppstår ofte i medisinske og/eller kirurgiske kritiske
syke pasienter, og har vært assosiert med forøket morbiditet og mortalitet i både
15
diabetes- og ikke-diabetespasienter, og i pasienter med traumatisk skade, slag,
anoksisk hjerneskade, akutt myokardial infarkt, post-kardiakkirurgi, og andre årsaker
til kritisk sykdom (McCowen et al. (2001) Crit Clin. Care 17:107-124). Kritisk syke
pasienter med hyperglykemi er blitt behandlet med insulin for å kontrollere
blodglukosenivåene. Slik behandling kan redusere morbiditet og mortalitet blant
20
denne gruppen (Van den Berghe et al. (2006) N. Eng. J Med. 354:449-461). Insulin
blir typisk administrert intravenøst til pasienten, så som ved injeksjon med en sprøyte
av en praktiserende medisinsk person, eller ved infusjon ved anvendelse av en
insulinpumpe. I noen eksempler blir algoritmer og programvare anvendt for å beregne
dosen. Følgelig kan kritisk syke pasienter med hyperglykemi bli administrert en
25
superhurtigvirkende insulinsammensetning beskrevet heri for å kontrollere
blodglukosenivåer, og derved lindre hyperglykemi og redusere morbiditet og
mortalitet.
1. Kombinasjonsterapier
30
Hvilke som helst av de superhurtigvirkende insulinsammensetningene beskrevet heri
kan bli administrert i kombinasjon med, før, innimellom, eller etter, andre terapeutiske
midler eller prosedyrer, som inkluderer, men er ikke begrenset til, andre biologiske og
småmolekylforbindelser. For en hvilken som helst sykdom eller tilstand, inkludert alle
de som er eksemplifisert ovenfor, for hvilke et hurtigvirkende insulin er indikert, eller
35
er blitt anvendt, og for hvilke andre midler og behadlinger er tilgjengelige, kan
superhurtigvirkende insulinsammensetninger bli anvendt i kombinasjon med disse.
Avhengig av sykdommen eller tilstanden som skal bli behandlet, innbefatter
132
eksempelvise kombinasjoner, men er ikke begrenset til, kombinasjonen med
antidiabetesmedikamenter, inkludert, men ikke begrenset til, sulfonylureaer,
biguanider, meglitinider, tiazolidindioner, alfa-glukosidaseinhibitorer, peptidanaloger,
inkludert glukagonliknende peptid (GLP) analoger og, gastrisk inhibitorisk peptid (GIP)
5
analoger og DPP-4-inhibitorer. I et annet eksempel kan de superhurtigvirkende
insulinsammensetningene beskrevet heri bli administrert i kombinasjon med, før,
innimellom, eller etter, med én eller flere andre insuliner, inkludert hurtigvirkende
insulin og basalvirkende insuliner.
10
J. Industriprodukter og sett
Farmasøytiske sammensetninger av de superhurtigvirkende
insulinsammensetningene, insulin og/eller hyaluronandegraderende
enzymsammensetninger tilveiebrakt heri, kan bli forpakket som fabrikkerte produkter
inneholdende forpakningsmateriale, en farmasøytisk sammensetning som er effektiv
15
for kontrollering av blodglukosenivåer, så som hos diabetes eller kritiske individer, og
et merke som indikerer at de superhurtigvirkende insulinsammensetningene, insulin
og/eller hyaluronandegraderende enzymsammensetninger skal bli anvendt for
kontrollering av blodglukosenivåene.
20
De fremstilte gjenstandene beskrevet heri inneholder forpakningsmaterialer.
Forpakningsmaterialer blir anvendt i forpakning av farmasøytiske produkter som er
velkjent for fagfolk innenfor dette området. Se f.eks. US patenter nr. 5 323 907,
5 052 588 og 5 033 352. Eksempler på farmasøytiske forpakningsmaterialer
inkluderer, men er ikke begrenset til blærepakker, flasker, rør, inhalatorer, pumper,
25
bagger, beholdere, bokser, sprøyter, flasker og et hvilket som helst
forpakningsmateriale egnet for en valgt formulering, og ment for
administreringsmetode og behandling. En rekke formuleringer av forbindelsene og
sammensetningene tilveiebrakt heri kommer i betraktning, og også forskjellige
behandlingsmetoder for en hvilken som helst hemostatisk sykdom eller forstyrrelse.
30
Superhurtigvirkende insulinsammensetninger, insulin og/eller
hyaluronandegraderende enzymsammensetninger kan også bli tilveiebrakt som sett.
Settene kan inkludere en farmasøytisk sammensetning beskrevet heri, og en
administreringsgjenstand. Settene kan også inkludere ytterligere farmasøytiske
35
sammensetninger. I ett eksempel kan settene innbefatte én eller flere av
superhurtigvirkende insulinsammensetninger, insulin og/eller hyaluronandegradrende
enzymsammensetninger tilveiebrakt heri, og én eller flere andre
133
insulinsammensetninger, så som f.eks., saktevirkende eller intermediærtvirkende
insuliner, inkludert krystallinske insuliner, eller en hvilken som helst kombinasjon
derav. De superhurtigvirkende insulinsammensetningene, insulin og/eller
hyaluronandegraderende enzymsammensetninger og/eller andre farmasøytiske
5
sammensetninger kan bli frembrakt med en innretning for administrering, så som en
sprøyte, en insulinpenn, en pumpe, eller et reservoar, som er satt inn i en insulinpenn,
en pumpe eller annen leveringsinnretning. Settet kan eventuelt inkludere
instruksjoner for applikasjon inkludert doseringer, doseringsregimer og instruksjoner
for administreringsmåter. Settene kan også inkludere en farmasøytisk sammensetning
10
beskrevet heri, og gjenstand for diagnose. For eksempel kan slike sett inkludere en
glukosemonitor eller sensor.
Settene kan også f.eks. inneholde forskjellige hurtigvirkende insulinsammensetninger,
eller andre insulinsammensetninger, inkludert én eller flere basaltvirkende insuliner,
15
tilveiebrakt i separate beholdere og i varierende doseringer, hvorved brukeren blir gitt
muligheten av å velge en gitt insulindosering, så som en prandialdosering, overfor
spesifikke omstendigheter som involverer en virkelig eller antisipert forekomst av
hyperglykemi.
20
K. Eksempler
Følgende eksempler er kun inkludert for illustrerende formål, og er ikke ment å
begrense omfanget av oppfinnelsen.
Eksempel 1
25
Koadministrering av rekombinant human PH20 (rHuPH20) og hurtigvirkende
insulin tilveiebringer forbedret farmakokinetikk og farmakodynamikk
Inslun, inkludert insulinanaloger, blir administrert til individer med diabetes mellitus
for kontroll av hyperglykemi. I et forsøk for mer effektivt å replikere normal fysiologisk
prandial insulinfrigjøring observert i friske individer, ble kliniske studier utført for å
30
bestemme om koadministrering av rekombinant human PH20 (rHuPH20) kunne øke
den tidlige absorpsjonsraten og mengden av absorpsjon av administrert
hurtigvirkende insulin. Forøket absorpsjon kunne resultere i at hurtigvirkende insulin
blir til og med hurtigere virkende, og derfor, etterlikner nærmere den endogene
insulinkonsentrasjon-tidprofilen observert i friske individer. Dette kan tilveiebringe
35
klinisk fordel med hensyn til bedre glykemisk kontroll og redusert vektøkning i
individer med diabetes mellitus. De kliniske studiene ble konstruert for å oppnå
trygghet, tolererbarhet, farmakokinetikk (PK) og farmakodynamikk (PD) av Humulin£
134
R insulin og Humalog£ insulin lispro (begge er hurtigvirkende insuliner som beskrevet
heri) administrert subkutant, enten alene eller i kombinasjon med rHuPH20.
Eksempel 1a
5
Farmakokinetikk og farmakodynamikk til Humalog£ insulin lispro eller
Humulin£ R insulin med og uten koadministrering av rHuPH20 i friske (ikkediabetes) individer
En randomisert, dobbeltblind, overkrysning, to-trinns, sekvensiell 2-arm studie for å
vurdere subkutan administrering 20 enheter (U) Humalog£ insulin lispro eller Humulin£
10
R insulin med og uten koadministrering av rHuPH20 ble utført. Tjuefem friske voksne
hannindivider ble innlemmet i studien. I trinn 1 ble 12 individer gitt en subkutan
injeksjon av Humalog£ insulin lispro og rHuPH20 og en separat subkutan injeksjon av
Humalog£ insulin lispro alene. Injeksjonene var vanligvis med 7 dagers mellomrom,
idet halvparten av individene mottok Humalog£ insulin lispro, og rHuPH20 først,
15
etterfulgt av Humalog£ insulin lispro alene, og halvparten av individene mottok
Humalog£ insulin lispro alene først, og deretter Humalog£ insulin lispro og rHuPH20. I
stadie 2, tok 13 individer en subkutan injeksjon av Humulin£ R insulin og rHuPH20 og
en separat subkutan injeksjon av Humulin£ R insulin alene. Injeksjonene var vanligvis
med 7 dagers mellomrom, idet omtrent halvparten av individene mottok Humulin£ R
20
og rHuPH20 først, etterfulgt av Humulin£ R insulin alene, og halvparten av individene
mottok Humulin£ R insulin alene først, og deretter Humulin£ R insulin og rHuPH20.
Omtrent 14 timer før hver injeksjon mottok hver av individene en middag basert på en
American Diabetes Association 2000-kalori måltidsplan med 60 g karbohydrater. En
25
snack på 30 g karbohydrat ble også gitt. Omtrent 6 timer etter middagen, begynte
individene å faste (unntatt vann) i minst 8 timer før de begynte på en
hyperinsulinemic-euglycemic clamp prosedyre i en 8 timers periode. Forbehandlede
blodprøver ble samlet og vitale tegn og vekt ble målt før individene ble injisert med
Humalog£ insulin lispro/rHuPH20, Humulin£ R insulin eller Humulin£ R insulin/rHuPH20
30
2 timer etter hyperinsulinemic-euglycemic clamp prosedyren ble påbegynt. Blodprøver
ble samlet ved foreskrevne intervaller, som beskrevet nedenfor, og glukose- og
insulinnivåene ble kvantifisert i en periode på 6 timer.
A. Dosering
35
Som beskrevet ovenfor, ble 12 individer administrert 20 U Humalog£ insulin lispro og
300 U rHuPH20 i 220 PL, og 20 U Humalog£ insulin lispro i 200 PL subkutant i nedre
venstre abdominalkvadrant i det første stadiet av studien. Humalog£ insulin
135
lispro/rHuPH20 dose ble preparert ved først tining av rHuPH20 (1 mg/mL, ekvivalent
til omtrent 120000 U/mL i 10 mM HEPES/130 mM NaCl ved pH a7,0) ved
romtemperatur i en time, og aseptisk aspirering av 0,153 cc (ekvivalent med 18360
U) rHuPH20 inn i en 0,3 cc kapasitet insulinsprøyte. 0,153 cc rHuPH20 ble deretter
5
sakte overført i en beholder inneholdende 1,17 mL av 150 U/mL. HYLENEX (rHuPH20).
Fra denne beholderen ble 1,1 mL aspirert og overført inn i en beholder inneholdende
omtrent 10,2 mL 100 U/mL Humalog£ insulin lispro aspirert fra beholderen.
Tohyndreogtyve mikroliger av Humalog£ insulin lispro/rHuPH20 blanding ble deretter
aspirert ved anvendelse av en 0,3 cc kapasitet insulinsprøyte, og anvendt i løpet av 4
10
timer for subkutan administrering til et enkelt individ.
Følgelig ble Humalog£ insulin lispro/rHuPH20-blandingen som ble levert 220 PL, og
inneholdt 300 U rHuPH20 fra Hylenex-formulering (virker for å stabilisere rHuPH20
mot adsorptive tap, og kan også ha stabiliserende egenskaper i forhold til insulin
15
og/eller virke som en oksidasjonsoppfanger); 3 mg glyserin (fra Humalog£ insulin
lipro-formuleringen (tilstede som en pH-buffer, stabilisator av insulin og/eller
tonisitetsmodifisereinde middel); 0,6 mg m-kresol (fra Humalog£ insulin lisproformulering (antimikrobiell vekstkonserveringsmiddel tilstede ved forhøyede
konsentrasjoner for å stabilisere insulinheksamerkonformasjonen); 0,004 mg sink (fra
20
Humalog£ insulin lispro-formuleringen anvendt for å stabilisere insulin
heksamerkonformasjonen); 0,18 mg NaCl (fra Hylenex-formuleringen, og rHuPH20
API, som et tonisitetsmodifiserende middel); 0,4 fosfat, natrium dibasisk (fra Hylenexformuleringen, som en pH-buffer); 0,017 mg EDTA, dinatrium (fra Hylenexformuleringen som en metallgelator med potensiale til å binde Zn2+ og Ca2+ ioner);
25
0,006 mg kalsiumklorid (fra Hylenex-formuleringen, danner et kompleks med EDTA,
og kan forbedre subkutan injeksjonskomfort); 0,006 mg HEPES (fra rHuPH20 APIformuleringen, som pH-buffer); vann (som løsningsmiddel) og NaOH og/eller HCl for
pH-justering.
30
I stadie 2, som beskrevet ovenfor, ble 13 individer administrert både 20 U Humulin R
insulin og 240 U rHuPH20 i 200 PL og 20 U Humulin£ R insulin i 200 PL subkutant inn i
nedre venstre abdominal kvadrant. Humulin£ R insulin/rHuPH20-dosen ble dannet ved
først aspirering av 0,3 cc (150 U) fra en beholder av Humulin£ R insulin ved
anvendelse av en 0,3 cc kapasitet insulinsprøyet, og overføring derav inn i en beholder
35
inneholdende 1,2 mL av 1500 U/mL rHuPH20 (formulert som en 10X sammensetning
av HYLENEX). Blandingen ble forsiktig blandet, og 0,3 cc luft ble fjernet fra beholderen
før 200 PL (inneholedende 20 U Humulin£ R insulin og 240 U rHuPH20) ble aspirert
136
ved anvendelse av en 0,3 cc kapasitet insulinsprøyte. Dette ble anvendt i løpet av 4
timer for subkutan administrering til et enkelt individ. 20 U Humulin£ R insulin i 200 PL
dose ble dannet ved subkutan anvendelse av en enkelt sprøyte.
5
Følgelig ble Humulin£ R insulin/rHuPH20-blandingen som var levert 200 PL, og
inneholdt 240 USP U rHuPH20 (2 Pg), 20 U Humulin£ R insulin, 0,16 mg Human
serumalbumin (fra 10X HYLENEX-formuleringen, som virker for å stabilisere rHuPH20
overfor adsorptive tap, og også potensielt for å tilveiebringe stabiliserende egenskaper
i forhold til insulin og/eller virke som en oksidasjonsoppfanger); 3 mg glyserin (fra
10
Humulin£ R-formuleringen, som virker som en pH-buffer, stabilisator av insulin
og/eller tonisitetsmodifiserende middel); 0,4 mg m-kresol (fra Humulin£ Rformuleringen, som virker som et antimikrobielt vekstkonserveringsmiddel tilstede ved
forhøyede konsentrasjoner for å stabilisere insulinheksamerkonformasjonen); 0,34 mg
sink (fra Humulin£ R-formuleringen, som virker for å stabilisere
15
insulinheksamerkonformasjonen); 1,36 mg NaCl (fra 10X Hylenex-formuleringen og
rHuPH20 API, som virker som tonisitetsmodifiserende middel); 0,224 fosfat,
natriumdibasisk (fra 10X Hylenex-formuleringen, for pH-buffer); 0,61 mg EDTA,
dinatrium (fra 10X Hylenex-formuleringen, som metallgelator med potensiale til å
binde Zn2+ og Ca2+ ioner); 0,048 mg kalsiumklorid (fra 10X Hylenex-formuleringen,
20
som danner et kompleks med EDTA, og kan forbedre subkutan injeksjonskomfort);
vann (som løsningsmiddel) og NaOH og/eller HCl for pH-justering.
B. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp-prosedyre
Effekten av koadministrering av rHuPH20 på farmakokinetikk og farmakodynamikk av
25
subkutant administrert Humalog£ insulin lispro eller Humulin£ R insulin ble vurdert ved
å ta blodprøver for å måle insulin (dvs. Humalog£ insulin lispro eller Humulin£ R
insulin) og glukosenivåer. En hyperinsulinemic-euglycemic clamp-prosedyre ble
anvendt for å opprettholde plasmaglukosenivåene mellom 90-110 mg/dL, slik at
insulinprepareringene kunne bli administrert uten å forårsake hypoglykemi.
30
Prosedyren bestod av innledningsvis oppnåelse av individets vekt og høyde, og måling
av vitale tegn etter å ha hvilt i en sittende posisjon i 5 minutter. Begge armene ble
plassert i oppvarmingspolstringer for å dilatere venene, og IV-kateteret ble deretter
satt inn. Et kateter ble plassert inn i antikubitalvenen av én arm for infusjon av
35
dekstrose 20 % via to separate stopphaner. Det andre intraarterielle kateteret ble
plassert på den andre armen for prøvetaking av aterialisert blod for glukosemålinger.
Oppvarmingspolstringen kan bli fjernet fra glukoseinfusjonssetet, men
137
retrogradkatetersetet ble opprettholdt ved 65oC. En innledende blodprøve ble oppnådd
for å måle grunnlinjeglukose 30 minutter før injeksjon av insulinprepareringene. Blod
ble samlet 10 minutter og 1 minutt før injeksjon av Humalog£ insulin lispro, Humalog£
insulin lispro/rHuPH20, Humulin£ R insulin eller Humulin£ R insulin/rHuPH20, deretter
5
hvert tredje minutt i de første 60 minuttene, hvert femtende minutt fra 60 minutter til
3 timer, deretter hver time deretter til 6 timer. Glukosenivåene til hvert individ ble
analysert gjennom prosedyren ved anvendelse av en YSI 2300 Glucose Analyzer (YSI
Inc.) og glukoseinfusjonsraten (GIR) ble justert etter behov for å opprettholde
plasmaglukose mellom 90-110 mg/dL. Sirkulerende nivåer av insulin ble analysert ved
10
anvendelse av en radioimmunsorbantanalyse (RIA) som kvantifiserer nivåene av
Humalog£ insulin lispro og Humulin£ R insulin (Millipore BioPharma Services Division,
St. Charles, MO).
C. Effekt av koadministrering av rHuPH20 på farmakokinetikken til
15
hurtigvirkende insulin
Flere parametere ble målt for å bestemme effekten av koadministrering av rHuPH20
på farmakokinetikken til hurtigvirkende insulinsammensetning Humalog£ insulin lispro
og Humulin£ R insulin. Disse inkluderer maksimal målt insulinkonsentrasjon i løpet av
det valgte doseringsintervallet (Cmaks); tid til Cmaks (tmaks); og arealet under
20
konsentrasjonen vs. tidskurvene (AUC), som ble vurdert for forskjellige tidsintervaller.
1. Effekt av koadministrering av rHuPH20 og Humalog£ insulin på
insulinfarmakokinetikk
Insulinkonsentrasjonen for hvert tidsintervall etter administrering av Humalog£ insulin
25
lispro eller Humulin£ insulin lispro/rHuPH20 ble vurdert ved RIA, og er angitt i
henholdsvis tabellene 5 og 6. AUC for de forskjellige tidsintervallene (0 minutter til x
minutter; f.eks. AUC0-3 minutter, AUC0-6 minutter, AUC0-9 minutter, osv.) er også gitt, det er
også den relative biotilgjengeligheten (Frel), som er beregnet som [AUC0-x (Humulin£ R
insulin + rHuPH20)]/[AUC0-x (Humulin£ R insulinalene]*100. Den gradvis økende
30
kurven som blir bestemt ved beregning av forandring i geometriske gjennomsnittlige
insulinnivåer over en tidsintervall, er også presentert, og det er også den
gjennomsnittlige kurveforandringen, som er et utjevnet gjennomsnitt av tre verdier av
den stigende kurven.
35
Tabell 5. Insulinkonsentrasjon i blod etter Humalog£ insulin lisproadministrering
Immunoreaktivt insulin (pmol/L)
138
Tid
Gjennom-
(min.)
snitt
Median
SD
SE
Geo-
Voksende
AUC
Stignings-
gjennom-
stignings-
(0-x)
kurve-
snitt
kurve
forandring
(avg)
(min.)
(pmol/L)
(pmol/L
(pmol
(pmol
min.)
min./
min./ L)
L)
0
72,4
64,8
35,2
10,2
65,2
3
78,7
67,8
31,8
9,6
73,2
2,67
208
6
82,3
84,8
24,9
7,5
79,0
1,93
436
2,85
9
96,9
86,3
36
10,8
90,8
3,94
691
2,72
12
108,0
102,0
54,2
16,4
97,7
2,28
973
3,63
15
126,3
110,6
75,5
21,8
111,7
4,67
1287
5,16
18
160,9
146,1
116
33,5
137,2
8,52
1661
6,71
21
194,0
143,6
175,8
50,7
158,1
6,95
2104
8,21
24
233,9
172,0
228,5
66,0
185,6
9,17
2619
7,25
27
273,4
198,7
296,5
85,6
202,5
5,63
3201
10,1
30
324,9
242,3
332,9
96,1
249,0
15,51
3879
13,47
33
388,1
302,3
359,2
108,3
306,8
19,26
4712
15,43
36
417,0
325,4
343,8
103,6
341,3
11,51
5685
16,68
39
485,4
355,2
419,7
121,2
399,1
19,26
6795
12,2
42
495,2
354,7
381,9
110,3
416,6
5,83
8019
13,93
45
552,6
430,4
408,6
118,0
466,7
16,71
9344
9,11
48
553,6
451,4
387,3
111,8
481,1
4,78
10766
9,9
51
576,7
483,9
384,9
111,1
505,7
8,2
12246
9,83
54
612,8
504,7
306,3
88,4
555,2
16,5
13837
3,27
57
594,1
476,6
400,1
115,5
510,5
-14,9
15436
-0,47
60
551,3
460,1
258,5
74,6
501,4
-3,03
16954
75
596,4
595,1
214,5
64,7
561,1
3,98
24923
90
573,6
556,5
193,1
55,8
541,6
-1,3
33193
105
584,8
575,7
131,4
37,9
571,8
2,01
41543
120
566,4
558,9
92,2
26,6
559,3
-0,83
50026
135
530,3
536,4
76,1
22,0
525,4
-2,26
58162
150
533,6
515,7
92,3
26,6
526,6
0,08
66052
165
491,6
486,8
96,9
28,0
482,8
-2,92
73623
180
463,1
467,1
93,3
26,9
454,2
-1,9
806,50
240
348,6
332,3
97,8
28,2
335,7
-1,98
104350
300
261,1
255,5
81,6
23,6
248,7
-1,45
121882
360
190,4
181,9
49,5
14,3
184,2
-1,08
134867
139
Tabell 6. Insulinkonsentrasjon i blodet etter koadministrering av Humalog£
insulin lispro og rHuPH20
Immunoreaktivt insulin (pmol/L)
Tid
Gjennom-
(min.)
snitt
Median
SD
SE
Geo-
Voksende
AUC
Stignings-
gjennom-
stignings-
(0-x)
kurve-
snitt
kurve
Frel
forandring
(avg)
(min.)
(pmol/L)
(pmol/L
(pmol
(pmol
min.)
min./
min./ L)
(%)
L)
0
70,5
66,3
32,8
9,5
64,3
3
97,0
80,7
36,6
11,0
91,5
0,09
234
6
144,7
112,2
92,4
27,8
126,7
11,73
561
9,68
129
9
183,9
117,3
156,9
45,3
151,4
8,22
978
11,91
142
12
254,4
161,1
252,9
73,0
198,7
15,78
1503
15,21
154
15
354,6
216,8
391,1
112,9
263,6
21,63
2197
20,13
171
18
442,8
293,2
475,4
137,2
332,5
22,97
3091
28,43
186
21
539,4
387,6
400,5
115,6
454,6
40,7
4271
33,51
203
24
651,7
489,4
426,4
123,1
565,2
36,86
5801
40,17
221
27
759,8
621,2
390,2
112,6
694,0
42,94
7690
35,71
240
30
839,7
705,4
414,5
119,7
775,9
27,31
9895
37,81
255
33
958,2
791,4
360,4
104,0
905,4
43,17
12417
33,44
263
36
1040,5
890,4
352,4
101,7
994,9
29,83
15267
30,15
269
39
1118,0
940,3
445,8
128,7
1047,3
17,47
18331
18,89
270
42
1138,7
991,1
431,6
124,6
1075,5
9,38
21515
20,93
268
45
1239,1
1181,6
408,6
118
1183,3
35,93
24903
12,26
267
48
1234,0
1128,7
497,1
143,5
1157,6
-8,53
28414
6,46
264
51
1173,8
1124,0
326,9
94,4
1133,6
-8,01
31851
-12,3
260
54
1095,6
1070,5
236,6
68,3
1072,6
-20,34
35160
-57,21
254
57
924,7
961,4
433,0
125,0
642,7
-143,29
37733
-16,71
244
60
1055,0
1006,7
363,8
105,0
983,2
113,48
40172
237
75
926,2
890,4
218,2
63,0
905,2
-5,2
54335
218
90
818,2
788,9
212,1
61,2
793,7
-7,43
67077
202
105
689,7
667,7
175,3
50,6
666,6
-8,47
78029
188
120
586,5
371,2
145,3
41,9
569,5
-6,48
87300
175
135
492,5
482,9
124,2
35,8
478,0
-6,1
95157
164
150
423,0
432,4
127,4
36,8
405,3
-4,85
101781
154
165
371,6
363,2
114,8
33,1
354,7
-3,37
107481
146
113
140
180
342,0
339,6
95,4
27,5
329,3
-1,69
112610
140
240
232,4
248,8
83,0
24,0
218,1
-1,85
129033
124
300
178,3
146,6
75,0
21,7
164,1
-0,9
140501
115
360
148,7
135,1
62,6
18,1
136,6
-0,46
149523
111
Cmaks (pmol/L), tmaks (minutter), og AUC0-360 (min*pmol/L) for Humalog£ insulin lispro
og Humalog£ insulin lispro koadministrert med rHuPH20 er tilveiebrakt i tabell 7. AUC
5
for de forskjellige tidsintervallene er gitt i tabell 8. Resultatene indikerer at individer
som mottok Humalog£ insulin lispro/rHuPH20-dose hadde høyere eksponering for
Humalog£ lispro insulin ved hvert tidsintervall enn de dosert med kun Humalog£
insulin lispro. Tabell 9 tilveiebringer en oppsummering av spesifikke PK-parametere for
hver doseringssekvens (f.eks. OH for Humalog insulin lispro/rHuPH20 administrert 1.
10
(1) eller 2. (2) og begge aIIe)), og en statistisk oppsummering som demonstrerer at
doseringssekvensen ikke hadde en effekt på absorbert farmakokinetikk. Statisk
analyse bestemte p-verdien til differansen i PK observert ved anvendelse av de
forskjellige behandlingsgruppene (dvs. Humalog£ insulin lispro alene mot Humalog£
insulin lispro/rHuPH20), og forskjellen i PK observert ved anvendelse av de forskjellige
15
doseringssekvensene (dvs. Humalog£ insulin lispro alene først, og deretter Humalog£
insulin lispro/rHuPH20, mot Humalog£ insulin lispro/rHuPH20 først, og deretter
Humalog£ insulin lispro alene). Også tilveiebrakt i tabellen er den relative
biotilgjengeligheten (Frel) som blir beregnet som [AUC0-360 (Humalog£
insulin/rHuPH20)]/[AUC0-360 (Humalog£ insulin alene]*100.
20
For insulin PK ble middels tmaks redusert med 54 % når koadministrering av rHuPH20,
fra 105 til 48 min. (p=0,0006), en effekt som blir sett i alle 12 individene.
Gjennomsnittlig Cmaks økte 87 % fra 697 pmol/L når individene ble kun administrert
Humalog£ insulin lispro til 1300 pmol/L (p=0,0003) med koadministrering av
25
rHuPO20. AUC0-360 min. økte 11 % fra 134867 til 149523 min.*pmol/L, mens med
tidligere tidsintervaller var differansene mer tydelige (dvs. AUC0-30 min. og AUC0-60 min.
økte med 155 % og 140 %). Inter-individvariabilitet (SD/gjennomsnitt) i tmaks
forbedret seg fra 34 % når individer mottok Humalog£ insulin lispro alene til 17 % når
individene mottok Humalog£ insulin lispro i kombinasjon med rHuPH20. Dette
30
eksemplet demonstrerer at Humalog£ insulin lispro, ved koadministrering med et
hyaluronandegraderingsenzym (rHuPH20) ble et superhurtigvirkende insulin som
beskrevet heri.
141
Tabell 7. Farmakokinetikk til insulin etter subkutan Humalog£ insulin lisproinjeksjon med og uten koadministrering av rHuPH20
Behandling
Individ_ID
Cmax
Tmaks
AUC0-360
(pmol/L)
(min.)
(min.*pmol/L)
Frel
Kun
1
590
105
136000
Humalog£
2
496
57
126000
3
562
105
106000
4
721
90
150000
5
972
54
154000
6
449
150
105000
7
1770
39
174000
8
795
75
156000
9
672
120
138000
10
502
120
113000
11
851
105
183000
12
631
150
160000
N
12
12
12
Gjennomsnitt
751
98
142000
SD
357
36
25600
Median
652
105
144000
Geometrisk
697
91
139000
38,8
44
18,8
Cmax
Tmaks
AUC0-360
(pmol/L)
(min.)
(min.*pmol/L)
1
1090
54
192000
141
2
1310
57
161000
128
3
1640
48
172000
162
4
853
48
146000
97
5
1140
45
130000
84
6
971
57
139000
132
Humalog£
7
2000
30
152000
87
med
8
2420
48
186000
119
rHuPH20
9
1320
45
135000
98
gjennomsnitt
CV%
geometrisk
gjennomsnitt
Individ_ID
Frel (%)
142
10
930
57
123000
109
11
1590
39
189000
103
12
1080
48
179000
112
N
12
12
12
12
Gjennomsnitt
1360
48
159000
114
SD
473
8
24500
23
Median
1230
48
157000
110
Geometrisk
1300
47
157000
112
32,8
19
15,7
gjennomsnitt
CV%
geometrisk
gjennomsnitt
Tabell 8. Tidsintervall AUC på geometrisk gjennomsnittlige
insulinkonsentrasjoner for kun Humalog£ insulin lispro eller koadministrert
5
med rHuPH20
AUC (min.*pmol/L)
Kun Humalog£
Tidsintervall
Humalog£ med
Prosent forskjella
rHuPH20
0-15
1287
2197
70,7
0-21
2104
4271
103,0
0-30
3879
9895
155,1
0-45
9344
24903
166,5
0-60
16954
40172
136,9
0-75
24923
54335
118,0
0-90
33193
67077
102,1
0-120
50026
87300
74,5
0-150
66052
101781
54,1
0-180
80650
112610
39,6
0-360
134867
149523
10,8
a
Prosent forskjell: (AUC0-x [rHuPH20]- AUC0-x [ingen rHuPH20])/(AUC0-x [ingen rHuPH20])
Tabell 9. Effekt av Humalog£ insulin lispro doseringssekvens på observert
farmakokinetikk
Behandling
Doseringssekvens
Cmaks
tmaks
AUCalle
143
Humalog£
1
Gjennomsnitt
688
94
140000
SD
172
38
21000
SE
70
16
8600
Gjennomsnitt
814
102
143500
SD
491
37
31600
SE
200
15
12900
Gjennomsnitt
751
98
141800
SD
357
36
25700
SE
103
10
7400
Gjennomsnitt
1239
48
156800
med
SD
456
11
27800
rHuPH20
SE
186
4
11400
Gjennomsnitt
1485
49
160500
SD
498
4
23300
SE
203
2
9500
Gjennomsnitt
1362
48
158700
SD
473
8
24500
SE
137
2
7100
Behandlingsforskjell p-verdi
0,0003
0,0006
0,0760
Sekvensgruppeeffekt p-verdi
0,7889
0,7783
0,9948
2
Alle
Humalog£
1
2
Alle
2. Effekt av koadministrering av rHuPH20 og Humalin£ R insulin på
insulinfarmakokinetikk
5
I trinn 2 mottok pasienten enten Humulin£ R insulin/rHuPH20-dosen først og Humulin£
R insulin alene dosen deretter, eller Humulin£ R insulin alenedosen først, og deretter
Humulin£ R insulin/rHuPH20-dosen vanligvis 7 dager senere. Konsentrasjonen av
insulin ved hvert tidspunkt etter administrering av Humulin£ R insulin eller Humulin£ R
insulin koadministrert med rHuPH20 er tilveiebrakt i henholdsvis tabellene 10 og 11.
10
AUC for forskjellige tidsintervaller (dvs. AUC for 0 til x minutter (AUC(o-x)), f.eks. AUC03 minutter,
AUC0-6 minutter, AUC0-9 minutter, osv.) (tabellene 10, 11 og 12), som den relative
144
biotilgjengeligheten (Frel), som er beregnet som [AUC0-x (Humulin£ R
insulin/rHuPH20]/[AUC0-x (Humulin£ R insulin alene]*100. Den økende kurven, som
blir bestemt ved beregning av forandring i geometriske gjennomsnittlige insulinnivåer
over et tidsintervall, er også presentert, og det er også gjennomsnittlig
5
kurveforandring, som er et utjevnet gjennomsnitt av fem verdier av den økende
kurven.
Tabell 10. Insulinkonsentrasjon i blodet etter administrasjon av Humulin£
insulinadministrering
Immunoreaktivt insulin (pmol/L)
Tid
Gjennom-
(min.)
snitt
Median
SD
SE
Geo-
Voksende
AUC
Stignings-
gjennom-
stignings-
(0-x)
kurve-
snitt
kurve
forandring
(avg)
0
67,4
59,2
29,8
8,3
62,4
3
62,3
59,5
26,9
7,5
58,3
-1,38
181
6
70,3
62,8
29,7
8,2
65,4
2,37
366
9
70,1
64,9
26,1
7,2
66,0
0,22
564
0,75
12
71,1
66,3
28,8
8,0
66,5
0,15
762
1,72
15
79,2
74,8
32,3
9,0
73,6
2,38
973
2,18
18
89,8
86,8
34,2
9,5
84,1
3,47
1209
3,29
21
104,2
103,4
36,5
10,1
98,1
4,68
1482
4,92
24
123,3
130,5
46,1
13,9
115,3
5,75
1802
6,39
27
149,8
143,2
57,6
16,0
140,2
8,3
2186
7,59
30
179,4
171,3
59,6
16,5
169,5
9,75
2650
7,45
33
208,9
202,8
69,9
19,4
198,0
9,5
3202
8,02
36
223,9
238,6
79,6
22,1
209,9
3,97
3813
7,30
39
248,3
231,6
78,7
21,8
235,6
8,57
4482
6,12
42
261,4
265,9
79,7
22,1
249,8
4,74
5210
4,57
45
272,3
274,1
78,1
21,7
261,2
3,81
5976
3,90
48
279,8
280,0
87,6
24,3
266,6
1,78
6768
3,00
51
278,6
262,5
77,2
21,4
268,4
0,59
7570
3,04
54
292,2
255,0
84,3
23,4
280,5
4,06
8394
2,49
57
313,7
278,3
110,6
30,7
295,4
4,95
9258
60
316,2
280,3
111,2
30,8
298,6
1,05
10149
75
349,0
320,4
132,7
36,8
325,5
1,79
14829
90
358,0
298,9
152,1
42,2
329,5
0,27
19741
105
364,8
363,6
128,5
35,6
344,9
1,03
24798
120
372,9
339,6
111,2
30,8
358,8
0,92
30076
145
135
400,8
402,8
123,6
34,3
382,6
1,59
35636
150
423,1
490,9
165,2
45,8
391,9
0,62
41445
165
423,9
424,9
164,1
45,5
392,6
0,04
47329
180
412,6
447,9
148,0
41,1
386,2
-0,43
531,69
240
336,0
309,9
90,4
26,1
325,8
-1,01
74528
300
308,6
292,8
77,0
21,4
299,7
-0,43
93292
360
242,9
238,7
64,5
17,9
234,5
-1,09
109319
Tabell 11. Insulinkonsentrasjon i blodet etter koadministrering av Humulin£ R
insulin og rHuPH20
Immunoreaktivt insulin (pmol/L)
Tid
Gjennom-
(min.)
snitt
Median
SD
SE
Geo-
Voksende
AUC
Stignings-
gjennom-
stignings-
(0-x)
kurve-
snitt
kurve
Frel
forandring
(avg)
0
55,0
56,9
14,6
4,1
53,2
3
94,7
95,6
20,3
5,6
92,5
13,08
219
121
6
148,3
142,9
40,6
11,3
141,7
16,42
570
156
9
194,2
174,7
43,7
12,1
189,9
16,07
1067
13,2
189
12
223,1
227,3
66,1
18,3
213,2
7,76
1672
16,3
219
15
262,2
250,1
75,6
21,0
251,3
12,69
2369
16,67
244
18
352,8
331,6
108,1
30,0
336,9
28,54
3251
17,25
269
21
402,0
381,5
96,6
26,8
391,7
18,27
4344
18,16
293
24
463,7
437,6
126,5
38,1
448,6
18,97
5605
10,86
311
27
504,5
506,6
135,6
37,6
485,6
12,33
7006
17,39
321
30
492,0
477,1
210,5
58,4
414,3
-23,79
8356
17,64
315
33
614,5
620,5
146,8
40,7
597,8
61,16
9874
14,5
308
36
675,7
676,6
167,1
46,3
656,3
19,51
11755
19,13
308
39
690,4
649,8
194,2
53,6
666,1
3,28
13739
21,57
307
42
805,2
786,4
244,9
67,9
772,6
35,49
15897
12,53
305
45
772,3
741,5
235,2
65,2
737,9
-11,57
18162
11,13
304
48
809,8
811,3
204,4
56,7
785,7
15,95
20448
10,65
302
51
847,7
822,0
209,2
58,0
823,2
12,5
22861
6,13
302
54
854,1
800,2
222,3
61,6
825,9
0,88
25335
5,77
302
57
894,5
840,2
242,6
67,3
864,5
12,87
27870
301
60
852,3
818,3
229,2
63,6
824,4
-13,37
30404
300
75
916,8
937,5
226,5
62,8
890,9
4,44
43268
292
90
835,2
858,4
269,4
74,7
796,4
-6,3
55923
283
105
774,9
692,0
314,6
87,2
703,0
-6,23
67169
271
146
120
666,1
650,6
248,7
69,0
620,1
-5,53
77092
256
135
599,7
557,3
233,7
64,8
550,2
-4,66
85868
241
150
573,9
514,9
185,5
51,5
549,5
-0,05
94116
227
165
522,3
452,2
166,8
46,3
500,2
-3,29
101988
215
180
446,2
445,7
100,7
27,9
435,6
-4,31
109007
205
240
250,5
255,7
61,2
17,7
243,1
-3,21
129369
174
300
172,7
161,0
62,8
17,4
161,3
-1,36
141501
152
360
115,5
123,6
36,9
10,2
109,2
-0,87
149614
137
Tabell 12. Tidsintervall AUC på geometriske insulinkonsentrasjoner for
Humulin£ R insulin alene eller koadministrert med rHuPH20
AUC (min.*pmol/L)
Tidsintervall
Kun Humulin£ R
Humulin£ R med
Prosent forskjella
rHuPH20
5
0-15
973
2369
143,5
0-21
1482
4344
193,1
0-30
2650
8356
215,3
0-45
5976
18162
203,9
0-60
10149
30404
199,6
0-75
14829
43268
191,8
0-90
19741
55923
183,3
0-120
30076
77092
156,3
0-150
41445
94116
127,1
0-180
53169
109007
105,0
0-360
109319
149614
36,9
a
Prosent forskjell: (AUC0-x [rHuPH20]- AUC0-x [ingen rHuPH20])/(AUC0-x [ingen rHuPH20])
3. Sammenlikning av farmakokinetikken til Humalog£ insulin og Humulin£
R insulin med og uten koadministrering av rHuPH20
Farmakokinetikk til Humalog£ insulin lipro og Humulin£ R insulin med eller uten
10
koadministrering av rHuPH20 ble sammenliknet. Figur 1 representerer et plott av det
geometriske gjennomsnittet (for alle individe for hver sammensetning)
insulinkonsentrasjoner ved hvert tidsintervall. For både Humalog£ og Humulin£ R ble
konsentrasjonstidskurvene skiftet opp (høyere insulinkonsentrasjoner) og til venstre
(hurtigere tider). For eksempel ble den geometriske gjennomsnittlige maksimale
15
insulinkonsentrasjon (Cmaks) nesten fordoblet (til 1200 fra 697 pmol/L) og Humalog£
147
og mer enn fordoblet (til 967 fra 433 pmol/L) for Humulin£ R i fravær av rHuPH20
relativt til kontrollen. Likeledes ble den gjennomsnittlige tiden til å nå denne
maksimale konsentrasjonen (tmaks) redusert (fra 105 til 48 minutter) for Humalog£ og
(fra 165 til 60 minutter) for Humulin£ R i nærvær av rHuPH20 relativt til kontrollen.
5
Dette skiftet til høyere konsentrasjoner ved tidligere tidspunkter er i samsvar med en
forøket absorpsjonsrate, og en konstant fjerningsrate. Følgelig, koadministrering av
rHuPH20 økte absorpsjonsraten til både Humalog£ insulin lispro, en hurtigvirkende
insulinanalog, og Humulin£ R insulin, et hurtigvirkende vanlig insulin.
10
Den naturlige prandiale insulinresponsen inkluderer en øyeblikkelig bolus som oppstår
over de første 10-15 minuttene etter matinntak. Denne hurtige økningen i
insulinnivåene tilveiebringer et viktig fysiologisk signal som resulterer i nedbrytning av
hepatisk glukosefrigjøring inn i systemisk sirkulasjon. Derfor er økning i
insulinkonsentrasjonen over 15 minutter en spesielt viktig parameter. Dataene
15
presentert ovenfor demonstrerer at geometriske gjennomsnittlige insulin lisprokonsentrasjoner 15 minutter etter administrering av Humalog£ blir forøket 70 % fra
deres pre-administreringsnivåer (fra 65-112 pmol/L) uten rHuPH20, men ved
koadministrering med rHuPH20 er konsentrasjonen mer enn firedobbelt (fra 64 til 264
pmol/L). Selv mer dramatisk, så øker den geometriske gjennomsnittlige
20
insulinkonsentrasjonen kun noe (fra 62 til 74 pmol/L) for Humulin£ R administrert uten
rHuPH20, men har på ny mer enn firedoblet (fra 53 til 251 pmol/L) når koadministrert
med rHuPH20. Følgelig, koadministrering med rHuPH20 tilveiebringer en hurtig økning
i insulinkonsentrasjoner som bedre representerer den tidlige fysiologiske prandiale
insulinresponsen i friske individer.
25
Naturlig prandialrespons fortsetter i omtrent 2 timer, og tilveiebringer glykemisk
kontroll for måltidskarbohydrater, og derfor er den kumulative systemiske
insulineksponeringen over de første omtrent 2 timene en annen spesielt viktig
parameter. Ifølge data tilveiebrakt her, ble det kumulative arealet under den
30
geometriske gjennomsnittlige insulinkurven for de første to timene (AUC0-120) forøket
(fra 50000 til 87000 min.*pmol/L) for Humalog£ og (fra 30000 til 77000 min.*pmol/L)
for Humulin£ R i nærvær av rHuPH20 i forhold til kontroll. Likeledes blir den naturlige
prandialresponsen effektivt fullført innen omtrent 4 timer etter et måltid, og
insulineksponering som postprandialtider kan føre til hypoglykemiske ekskursjoner.
35
Den korresponderende eksponeringen fra 4 helt til de siste observasjonene ved 6
timer (AUC240-360) ble redusert (fra 31000 til 20000 min.*pmol/L) for Humalog£ og
(fra 35000 til 20000 min.*pmol/L) for Humulin£ R i nærvær av rHuPH20 i forhold til
148
kontrollen. Følgelig, koadministrering med rHuPH20 økte den ønskelige
insulineksponeringen med 175 og 256 %, og reduserte den uønskede
insulineksponeringen med henholdsvis 67 og 58 % for koadministrering med rHuPH20
relativt til kontrollen.
5
Mellompasientvariabilitet i farmakokinetikk til insulinadministrering krever at legene
introduserer pasientene for insulinterapi på subterapeutiske nivåer, og øker
progressivt dosen for å unngå overdosering av pasient og risiko for en hypoglykemisk
hendelse. Variabiliteten i farmakokinetikk kan bli uttrykt som variasjonskoeffisienten
10
(CV; definert som standardavvik/gjennomsnittlig typisk uttrykt som en prosentandel)
for nøkkelparametere. CV til maksimal konsentrasjon (Cmaks) sammenliknet mellom
individer ble redusert (fra 48 % til 35 %) for Humalog£ og (fra 34 % til 26 %) for
Humulin£ R i nærvær av rHuPH20 i forhold til kontrollen. CV til tid til maksimal
konsentrasjon (tmaks) ble redusert (fra 48 % til 35 %) for Humalog£ og (fra 32 % til 28
15
%) for Humulin£ R i nærvær av rHuPH20 i forhold til kontrollen. Dataene ovenfor
demonstrerer at CV av forandring i insulinkonsentrasjonen over den første 15 minutter
postadministreringen ble redusert (fra 147 % til 141 %) for Humalog£ og (fra 165 %
til 40 %) for Humulin£ R i nærvær av rHuPH20 i forhold til kontrollen. CV til kumulativ
insulineksponering over de første 2 timene (AUC0-120) ble redusert (fra 41 % til 22 %)
20
for Humalog£ og (fra 34 % til 26 %) for Humulin£ R i nærvær av rHuPH20 i forhold til
kontrollen. Derfor ble interpasientvariabiliteten av insulinfarmakokinetikk redusert for
insulin, når koadministrert med rHuPH20 relativt til kontroll.
Farmakokinetikken for Humulin£ R insulin ble forbedret ved koadministrering av
25
rHuPH20, hvorved farmakokinetikken vesentlig liknet farmakokinetikkprofilen til
Humalog£ insulin lispro, når koadministrert med rHuPH20. Spesielt var raten av
insulinabsorpsjon og serumnivåene av insulin over de første 20 minuttene
sammenliknbare mellom de to forskjellige typene av insulin, når koadministrert med
rHuPH20 (refererer til tabellene 9 og 13). I kontrast til dette, når administrert uten
30
rHuPH20, utviser Humulin£ R insulin en mye saktere rate og redusert absorpsjonsnivå,
sammenliknet med Humalog£ insulin lispro i de tidlige tidsintervallene. Følgelig,
kombinasjon av rHuPH20, et hyaluronandegraderende enzym, og et hurtigvirkende
insulin resulterer i sammensetninger som virker hurtigere, og i større grad enn
hurtigvirkende insulin alene og, for tidlige tidspunkter (dvs. mindre enn 20 minutter
35
etter administrering), vesentlig uavhengig av type hurtigvirkende insulin.
149
D. Effekt av koadministrering av rHuPH20 på glukoseinfusjonsrate (GIR)
farmakodynamikk
For å vurdere farmakodynamikkeffekten koadministrering med rHuPH20 har på
glukoseinfusjonsraten (GIR) forskjellige farmakodynamikk (eller glykodynamikk (GD))
5
parametere bestemt for individer dosert med Humulin£ R med og uten rHuPH20. Disse
inkluderte tidspunkt til maksimal effekt (tGIRmaks) (minutter); tid til sen halvmaksimal
effekt (tGIRsen 50 %) (minutter); tid til tidlig halvmaksimal effekt (tGIRtidlug 50 %)
(minutter); maksimal metabolsk effekt (GIRmaks) (mL/t); AUC-GIR0-60 min., AUC-GIR0-120
min.;
10
AUG-GIR0-180 min.; AUC-GIR0-240 min.; AUC-GIR0-300 min.; og AUG-GIR0-360 min.. GIR ble
uttrykt som millimeter dekstrose infusert pr. time (mL/t), som kan bli omdannet til
mg/kg/min. ved anvendelse av følgende:
GIR (mg/kg/min.) = [IV-infusjonsrate (mL/t) x dekstrosekonsentrasjon (g/dL) x
0,0167 individets masse (kg),
15
hvor dekstrosekonsentrasjonen = 190,6 mg/mL.
1. Effekt av koadministrering av rHuPH20 og Humalog£ insulin på GIR
farmakodynamikk
20
Glukoseinfusjonsraten for hvert tidsintervall etter administrering av Humalog£ insulin
lispro alene eller Humalog£ insulin lispro/rHuPH20 ble beregnet, og er presentert i
tabellene 13 og 14. Også beregnet var AUC (proporsjonal med kumulativ
glukoseadministrering) og relativ AUC (Frel). Trinnvise kurve (“incremental slope”),
som blir bestemt ved beregning av forandring i GIR over et tidsintervall, er også
25
tilstede.
Tabell 13. Glukoseinfusjonsrater etter Humalog£ insulin lispro-administrering
GIR (IV infusjonsrate, mL/t)
Tid
Gjennom-
Median
SD
SE
snitt
Trinnvis
AUC(0-x)
kurve
(min.)
mL/t)
(mL/t*min.)
(min.*mL/t)
0
3,1
0
7,4
2,1
3
8,4
0
13,6
3,9
1,78
17
6
9,8
0
16,3
4,7
0,44
45
9
10,8
0
16,0
4,6
0,36
75
12
10,8
0
16,0
4,6
0
108
15
11,0
0
16,4
4,7
0,06
141
150
18
11,3
0
17,1
4,9
0,08
174
21
14,1
9,0
16,3
4,7
0,94
212
24
15,9
13,0
15,9
4,6
0,61
257
27
20,9
20,5
19,7
5,7
1,67
312
30
24,3
22,0
20,4
5,9
1,11
380
33
29,7
29,5
16,2
4,7
1,81
461
36
35,8
37,5
18,0
5,2
2,03
559
39
42,0
39,5
20,3
5,9
2,08
676
42
50,1
46,0
27,3
7,9
2,69
814
45
55,7
48,0
32,9
9,5
1,86
972
48
63,0
55,5
37,2
10,7
2,44
1150
51
68,3
57,5
42,0
12,1
1,75
1347
54
76,6
69,0
53,2
15,4
2,78
1565
57
85,7
75,5
69,4
20,0
3,03
1808
60
97,7
82,8
90,0
26,0
4
2083
75
112,3
80,0
77,2
22,3
0,97
3657
90
130,7
93,0
77,3
22,3
1,23
5479
105
142,3
114,0
73,0
21,1
0,78
7527
120
155,3
122,0
79,7
23,0
0,86
9759
135
166,4
143,5
76,1
22,0
0,74
12171
150
170,7
148,0
75,4
21,8
0,28
14699
165
175,8
151,5
74,6
21,5
0,34
17297
180
178,4
162,5
73,8
21,3
0,18
19954
240
184,9
167,0
88,3
25,5
0,11
30854
300
141,3
130,0
67,4
19,4
-0,73
40641
360
110,3
105,5
50,8
14,7
-0,52
48191
Tabell 14. Glukoseinfusjonsrater etter koadministrering av Humalog£ insulin
lispro og rHuPH20
GIR (IV infusjonsrate)
Tid
Gjennom-
Median
SD
SE
snitt
Trinnvis
AUC(0-x)
Frel
(mL/t*min.)
(min.*mL/t)
(%)
1,15
21
124
kurve
(min.)
mL/t)
0
5,4
0
9
2,6
3
8,8
0
13,5
3,9
151
6
15,8
10
18,1
5,2
2,31
58
131
9
11,8
0
14,8
4,3
-1,31
100
132
12
13,6
0
17,2
5,0
0,58
138
128
15
17,0
10
18,6
5,6
1,14
184
131
18
20,9
25
19,1
5,8
1,3
240
138
21
26,3
27
23,6
7,1
1,79
311
147
24
33,8
29,5
27,1
7,8
2,52
401
156
27
43,9
40
32,7
9,4
3,36
518
166
30
53,8
49,5
36,2
10,5
3,31
665
175
33
68,1
59
43,5
12,6
4,75
847
184
36
82,1
68,5
49,4
14,3
4,67
1073
192
39
104,0
80
64,5
18,6
7,31
1352
200
42
115,5
89
64,7
18,7
3,83
1681
207
45
127,9
96,5
64,1
18,5
4,14
2046
210
48
134,8
104
66,8
19,3
2,31
2440
212
51
142,6
107,5
72,1
20,8
2,58
2856
212
54
145,8
112
70,6
20,4
1,08
3289
210
57
146,8
121
60,7
17,5
0,31
3728
206
60
159,2
124,5
71,1
20,5
4,14
4187
201
75
174,6
138,5
84,8
24,5
1,03
6690
183
90
186,3
176
77,0
22,2
0,78
9397
172
105
182,3
147
78,9
22,8
-0,27
12162
162
120
180,2
131,5
83,5
24,1
-0,14
14881
152
135
183,8
132
88,8
25,6
0,24
17611
145
150
184,8
139
87,1
25,2
0,06
20375
139
165
185,0
143,5
88,8
25,6
0,02
23148
134
180
181,8
139,5
85,1
24,6
-0,22
25899
130
240
139,7
129,5
75,1
21,7
-0,7
35541
115
300
98,6
85
61,2
17,7
-0,68
42689
105
360
87,7
65
62,6
18,1
-0,18
48276
100
GIRmaks, tmaks, og AUC-GIR for forskjellige tidsintervaller ble også bestemt for disse
individene, og er presentert i tabellene 15 og 16. Tabell 17 tilveiebringer en
5
oppsummering av PD-parameterne for hver doseringssekvens (f.eks. GIR PD for
Humalog£ insulin lispro/rHuPH20 administrert 1. (1) eller 2. (2) og begge (alle)), og
en statistisk analyse for å bestemme om doseringssekvensen påvirket de observerte
152
farmakodynamikkene. Den statistiske analysen bestemte p-verdien av forskjellen i PD
observert ved anvendelse av forskjellige behandlingsgrupper (dvs. Humalog£ insulin
lispro alene mot Humalog£ insulin lispro/rHuPH20), og forskjellen i PK observert ved
anvendelse av forskjellige doseringssekvenser (dvs. Humalog£ insulin lispro alene
5
først, og deretter Humalog£ insulin lispro/rHuPH20, mot Humalog£ insulin
lispro/rHuPH20 først og deretter Humalog£ insulin lispro alene).
Tabell 15. Farmakodynamikk til insulin etter subkutan Humalog£ insulin
lispro-injeksjon med og uten koadministrering av rHuPH20
Behandling
Individ ID
GIRmaks
50 %
tGIRtidlig50 %
tGIRsen50 %
GIRmaks
(min.)
(min.)
Kun
1
137
68,5
83
NC
Humalog£
2
326
163
98
NC
3
247
124
68
NC
4
178
89,0
83
NC
5
119
59,5
68
330
6
158
79,0
98
NC
7
350
175
53
270
8
90,0
45,0
47
NC
9
115
57,5
83
330
10
180
90,0
68
330
11
132
66,0
56
NC
12
382
191
68
330
N
12
12
12
5
Gjennom-
201
101
72
318
SD
100
50,2
17
27
SE
29,0
14,5
5
12
Median
168
84,0
68
330
Geometrisk
181
90,4
70
317
50,5
50,5
24
9
126
63,0
44
270
snitt
gjennomsnitt
CV%
geometrisk
gjennomsnitt
1
153
2
320
160
32
270
3
385
193
44
270
4
200
100
83
360
5
149
74,5
50
270
6
260
130
NC
NC
7
223
112
26
210
8
109
54,5
29
210
9
154
77,0
42
210
Humalog£
10
257
129
38
270
med
11
138
69,0
38
NC
rHuPH20
12
336
168
47
330
N
12
12
11
10
Gjennom-
221
111
43
279
SD
91,1
45,6
15
49
SE
26,3
13,2
5
16
Median
212
106
42
270
Geometrisk
205
102
41
275
43,8
43,8
32
18
snitt
gjennomsnitt
CV%
geometrisk
gjennomsnitt
NC = ikke beregnet
Tabell 16. Farmakodynamikk av insulin etter subkutan Humalog£ insulin
lispro-injeksjon med og uten koadministrering av rHuPH20-intervall GIR-AUC
GIR AUC (min.*mL/t)
Behandling
Individ ID
GIRmaks
tmaks
0-60
0-120
0-180
0-240
0-360
min.
min.
min.
min.
min.
1
137
240
1040
5400
13200
21400
33800
2
326
150
330
14000
33100
52200
82800
3
247
240
1770
13500
27100
41400
66500
4
178
240
1940
8570
18600
29200
46500
5
119
180
1050
5340
11400
18500
28700
6
158
240
752
4780
12600
21800
39200
7
350
60
4920
22100
37600
50900
68900
8
90,0
135
1490
5390
10500
15500
23100
154
9
115
165
590
4200
10500
17100
25800
10
180
180
2030
9090
18700
29400
44400
11
132
240
2880
8070
14600
22000
35600
12
382
240
3240
16700
31600
50800
83000
N
12
12
12
12
12
12
12
Gjennom-
201
193
2080
9760
20000
30900
48200
SD
100
58
1280
5640
9800
14200
21600
SE
29,0
17
371
1630
2830
4090
6250
Median
168
210
1850
8320
16600
25600
41800
Område
292
180
4330
17800
27100
36800
59900
Geometrisk
181
181
1740
8470
18000
28100
44000
50,5
42,5
71,9
59,1
50,1
47,3
46,9
1
126
60
2180
8600
15400
21200
28500
2
320
135
7800
24500
43400
58800
72300
3
385
75
5330
25800
43500
58100
77000
4
200
90
3020
11400
19300
28100
43200
5
149
165
1990
9250
17600
24100
31400
6
260
360
2100
9780
16300
22200
36400
7
223
135
6590
19300
32200
42400
55500
8
109
57
3670
10200
15900
19900
24200
9
154
75
2250
10300
16500
21300
27300
10
257
150
6070
18800
34000
48100
62600
11
138
165
3640
10600
18700
26000
36800
12
336
165
5610
19900
38200
56300
84100
N
12
12
12
12
12
12
12
Gjennom-
221
136
4190
14900
25900
35500
48300
SD
91,1
82
2010
6350
11400
15900
21200
SE
26,3
24
582
1830
3290
4600
6120
Median
212
135
3650
11000
19000
27000
40000
Humalog£
Område
276
303
5810
17200
28100
38900
59800
med
Geometrisk
205
118
3750
13700
23800
32500
44200
snitt
gjennomsnitt
CV%
geometrisk
gjennomsnitt
snitt
gjennomsnitt
155
rHuPH20
CV%
43,8
57,5
52,9
42,8
44,6
46,1
46,0
geometrisk
gjennomsnitt
Tabell 17. Effekt av Humalog£ insulin lispro doseringssekvens på observert
farmakodynamikk
GIR AUC (min.*mL/t)
Behandling
Humalog
£
Doserings-sekvens
1
Gjennom-
GIR maks
tmaks
0-60
0-120
0-180
0-240
0-360
min.
min.
min.
min.
min.
213
185
1910
9860
20700
32580
51650
SD
123
45
1130
5470
11030
17460
28930
SE
50
18
460
2230
4500
7130
11810
Gjennom-
189
200
2260
9670
19220
29120
44730
SD
81
73
1510
6340
9380
11300
12810
SE
33
30
620
2590
3830
4610
5230
Gjennom-
201
193
2080
9760
19960
30850
48190
SD
100
58
1280
5640
9790
14140
21630
SE
29
17
370
1630
2830
4080
6250
Gjennom-
201
160
3930
13080
22650
31330
43830
snitt
alene
2
snitt
Alle
snitt
Humalog£
1
snitt
og
SD
58
105
1950
4720
8240
11210
12870
rHuPH20
SE
24
43
800
1930
3370
4580
5260
Gjennom-
242
112
4440
16660
29180
39750
52720
SD
118
49
2230
7650
13860
19760
27830
SE
48
20
910
3120
5660
8070
11360
Gjennom-
221
136
4190
14870
25920
35540
48280
SD
91
82
2010
6340
11390
15940
21190
SE
26
24
580
1830
3290
4600
6120
Behandlings-forskjell p-verdi
0,3502
0,0627
0,0002
0,0011
0,0044
0,0484
0,9746
Sekvens-gruppeeffekt p-verdi
0,5517
0,3445
0,9365
0,5879
0,5219
0,5075
0,5403
2
snitt
Alle
snitt
5
156
Glukoseinfusjonsrate PD-data understøtter PK-funnene, og viser tid til maksimal effekt
(tGIRmaks) forkortet med 36 % når pasientene ble administrert Humalog£ insulin lispro
i kombinasjon med rHuPH20 (median 135 minutter) sammenliknet med Humalog£
5
insulin lispro alene (median 210 minutter), og maksimal metabolsk effekt (GIRmaks)
forøket med 13 % fra et gjennomsnitt på 181 mL/t når individene mottak Humalog£
insulin lispro alene til 205 mL/t når individene mottok Humalog£ insulin lispro og
rHuPH20 (p=0,35). Tid til tidlig halvmaksimal effekt (tGIRtidlig50%) ble redusert med 38
% fra en median på 68 når pasientene ble administrert Humalog£ insulin lispro alene
10
til 42 min. når pasientene ble administrert Humalog£ insulin lispro i kombinasjon med
rHuPH20 (p=0,0006).
2. Effekt av koadministrering av rHuPH20 og Humulin£ R insulin på GIR
farmakodynamikk
15
I stadie 2 mottok pasientene enten Humulin£ R insulin/rHuPH20-dose først, og
Humulin£ R insulin alene dose som nummer to, eller Humulin£ R insulin alene dose
først, og deretter Humulin£ R insulin/rHuPH20-dose vanligvis 7 dager senere.
Glukoseinfusjonsraten for hvert tidsintervall etter administrering av Humulin£ R insulin
alene eller Humulin£ R insulin/rHuPH20 ble beregnet, og er presentert i henholdsvis
20
tabellene 18 og 19. Også beregnet var AUC og den relative mengden av glukose
infusert over forskjellige tidspunkter (Grel). Den trinnvise kurven, som blir beregnet
ved beregning av forandring i GIR over et tidsintervall, er også presentert.
Tabell 18. Glukoseinfusjonsrater etter Humalin£ R insulinadministrering
GIR
Tid
Gjennom-
(min.)
snitt
Median
SD
SE
Trinnvis
AUC(0-x)
kurve
(min.)
(mL/t)
mL/t*min.)
(min.*mL/t
0
8,5
0
11
3,1
3
15,0
7
17
4,7
2,17
35
6
15,7
12
17,4
4,8
0,23
81
9
18,0
21
17,8
4,9
0,77
132
12
18,8
21
17,8
4,9
0,28
187
15
20,4
21
18,9
5,3
0,51
246
18
20,5
21
19
5,3
0,05
307
21
22,2
21
18,5
5,1
0,56
371
157
24
22,9
27
18,2
5
0,23
439
27
24,1
30
18,5
5,1
0,38
510
30
28,4
30
21
5,8
1,44
588
33
29,3
32
20
5,5
0,31
675
36
30,9
32
19,6
5,4
0,54
765
39
32,7
32
19,8
5,5
0,59
861
42
34,8
34
20,4
5,7
0,72
962
45
40,2
37
21,6
6
1,77
1075
48
42,2
40
19,4
5,4
0,67
1198
51
44,3
39
19,3
5,4
0,72
1328
54
47,8
47
17,5
4,8
1,18
1466
57
51,5
49
17,6
4,9
1,23
1615
60
56,9
63
19,3
5,3
1,79
1778
75
72,5
77
27,4
7,6
1,04
2749
90
83,6
85
41,7
11,6
0,74
3920
105
92,8
97
47,3
13,1
0,62
5243
120
102,6
99
50,1
13,9
0,65
6709
135
119,4
105
55,1
15,3
1,12
8374
150
127,5
109
57,2
15,9
0,54
10226
165
138,9
136
55,8
15,5
0,76
12223
180
146,2
147
61,5
17,1
0,48
14362
240
178,9
193
61,2
17
0,55
24114
300
172,0
176
59,1
16,4
-0,12
34642
360
150,3
164
45,4
12,6
-0,36
44311
Tabell 19. Glukoseinfusjonsrater etter Humalin£ R insulin og rHuPH20administrering
GIR
Tid
Gjennom-
Median
SD
SE
snitt
Trinnvis
AUC(0-x)
Grel
mL/t*min.)
(min.*mL/t
(%)
kurve
(min.)
(mL/t)
0
7,4
0
12,5
3,5
3
16,0
12
15
4,2
2,86
35
100
6
17,5
19
15,2
4,2
0,51
85
105
158
9
20,1
24
15,3
4,3
0,85
142
108
12
21,8
24
14,7
4,1
0,59
205
109
15
24,8
26
14,4
4
1
275
112
18
30,6
32
13,2
3,7
1,92
358
116
21
36,4
35
15,7
4,4
1,92
458
123
24
48,2
45
13,4
3,7
3,95
585
133
27
54,8
47
16,2
4,5
2,21
740
145
30
65,9
66
21,6
6
3,69
921
157
33
74,3
74
25,8
7,2
2,79
1132
168
36
82,1
78
28,4
7,9
2,59
1366
179
39
91,8
87
28,2
7,8
3,26
1627
189
42
99,8
91
33,1
9,2
2,67
1915
199
45
110,5
109
36,8
10,2
3,56
2230
208
48
121,5
124
42,4
11,8
3,67
2578
215
51
133,7
134
49,7
13,8
4,05
2961
223
54
143,4
145
54,4
15,1
3,23
3377
230
57
153,5
162
62,8
17,4
3,38
3822
237
60
164,6
172
73,8
20,5
3,69
4299
242
75
184,8
178
99
27,5
1,34
6920
252
90
179,7
194
62,1
17,2
-0,34
9653
246
105
183,9
211
60,5
16,8
0,28
12380
236
120
191,1
220
64,1
17,8
0,48
15193
226
135
206,5
216
66
18,3
1,03
18174
217
150
215,5
206
64
17,8
0,6
21339
209
165
202,9
214
62,4
17,3
-0,84
24477
200
180
197,4
214
57,1
15,8
-0,37
27479
191
240
181,5
183
64,2
17,8
-0,26
38847
161
300
117,5
116
44,6
12,4
-1,07
47819
138
360
86,5
80
28,7
8
-0,52
53939
122
3. Sammenlikning av farmakodynamikk til Humalog£ insulin lispro og
Humulin£ R insulin med og uten koadministrering av rHuPH20
5
Farmakodynamikk til Humalog£ insulin lipro og Humulin£ R insulin med og uten
koadministrering av rHuPH20 ble sammenliknet. Den relative effekten av
koadministrering av rHuPH20 på farmakodynamikk av hver type av insulin ble vurdert.
Figur 2 presenterer et plott av glukoseinfusjonsrater ved hvert tidsintervall. Det ble
159
observert av koadministrering av rHuPH20 og Humalog£ eller Humulin£ R i betydelig
grad skiftet glukoseinfusjonsrate som en funksjon av tiden opp og til venstre,
sammenliknet med når insulinene ble administrert uten rHuPH20, i likhet med skiftet i
insulinkonsentrasjon som en fusjon av tidsplottinger. Den maksimale infusjonsraten
5
ble noe forøket fra et gjennomsnitt på 201 til 221 mL/t for Humalog£ og 187 til 203
mL for Humulin£ R koadministrering med rHuPH20 i forhold til kontrollen. Likeledes ble
tid til maksimal GIR redusert fra 193 til 136 minutter for Humalog£ og 253 til 206
minutter for Humulin£ R koadministrert med rHuPH20 i forhold til kontrollen.
Begynnende virkning, målt ved tidspunkt til tidlig halvmaksimal GIR (tGIRtidlig 50 %) ble
10
redusert fra 72 til 43 minutter for Humalog£ og 113 til 83 minutter for Humulin£ R
koadministrert med rHuPH20 i forhold til kontrollen.
Karbohydrater ved måltidstidspunkt blir stort sett fordøyd og introdusert inn i den
systemiske sirkulasjonen over de første par (f.eks. to til fire) timene etter et måltid
15
avhengig av type av karbohydrat, og følgelig den kumulative GIR over de første 2 eller
3 timene (f.eks. fra 0 til 120 minutter) er spesielt relevant. Det kumulative volumet til
en 190,6 mg/mL glukoseløsning levert over de første 2 timene økte fra 163 til 248 mL
for Humalog£ og 112 til 226 mL for Humulin
£
R koadministrering med rHuPH20 i
forhold til kontrollen. Forøket glukosemetabolisme etter fordøying av karbohydrater
20
ved tidspunkt for måltid er fullført, kan føre til negative hypoglykemiske forekomster.
Det kumulative volumet av glukoseløsningen levert fra 4 til 6 timer reduserte fra 289
til 212 mL for Humalog£ og 337 til 252 mL for Humulin£ R koadministrert med
rHuPH20 i forhold til kontrollen. Følgelig, koadministrering av enten en hurtigvirkende
insulinanalog, eller en hurtigvirkende vanlig insulinpreparering med rHuPH20 øker den
25
glukosereduserende kapasiteten tidlig for å oppnå postprandial spalting, og reduserer
den glukosereduserende aktiviteten når aktiviteten kunne føre til hypoglykemiske
ekskursjoner.
GIR er en refleksjon av mengden av glukose som blir anvendt av kroppen (dvs. mer
30
eksogen glukose må bli infusert for å opprettholde blodglukosenivåer mellom 90-110
mg/dL når kroppen anvender mer glukose), og derfor den farmakologiske aktiviteten
til administrert insulin (dvs. insulinaktiviteten resulterer i redusert endogen
glukoseytelse og/eller forøket blodglukoseanvendelse, som resulterer i en total
reduksjon av blodglukosen). Disse data demonstrerer følgelig at den biologiske
35
virkningen til hver av insulinene ble vesentlig forøket, både i hastighet (begynnelse av
glukosemetabolisme) og grad når koadministrert med rHuPH20, et
160
hyaluronandegraderende enzym, sammenliknet med når insulinene ble administrert
uten rHuPH20.
I denne studien ble de farmakodynamiske egenskapene til Humulin£ R insulin når
5
koadministrert med rHuPH20 forbedret, hvorved farmakodynamikkene vesentlig liknet
på den farmakodynamiske profilen til Humalog£ når koadministrert med rHuPH20, i
kontrast med de vesentlig forsinkede farmakodynamiske egenskapene til Humulin£ R
insulin i forhold til Humalog£ insulin lispro administrert i fravær av rHuPH20. GIR
krevde å holde blodglukosenivåene mellom 90-110 mg/dL, over de første 60
10
minuttene, og, ved utvidelse, var den farmakologiske aktiviteten til insulin, spesielt i
de første 60-90 minuttene etter injeksjon, vesentlig de samme mellom de to
forskjellige typene av insulin, når koadministrert med rHuPH20. I kontrast til dette,
når Humulin£ R insulin, som er et hurtigvirkende vanlig insulin, ble administrert uten
rHuPH20 har en GIR-profil som indikerer en saktere rate av insulinvirkning
15
sammenliknet med Humalog£ insulin lispro insulin, når administrert uten rHuPH20.
Følgelig, kombinasjonen av rHuPH20, et hyaluronandegraderende enzym, og et
hurtigvirkende insulin under, f.eks., betingelser som de som er beskrevet i denne
studien resulterer i superhurtigvirkende insulinsammensetninger som virker fortere,
og i en høyere grad enn hurtigvirkende insulin alene, og, ved tidlige tidspunkter (dvs.
20
mindre enn 60 minutter post administrering), vesentlig uavhengig av type
hurtigvirkende insulin.
Eksempel 1b
Farmakokinetikk og postprandial glykemisk respons til subkutant injisert
25
Humalog£ R insulin med og uten koadministrering av rHuPH20 etter et
flytende måltid i pasienter med type 1 diabetes mellitus
En studie som vurderer farmakokinetikken (PK) og postprandial glykemisk respons
(dvs. farmakodynamikken (PD)) til subkutant injisert Humalog£ insulin lispro og
Humulin£ R insulin, med og uten koinjeksjon av rHuPH20, etter et flytende måltid i
30
pasienter med type 1 diabetes mellitus ble utført. Studien var en enkeltblind (blindet
kun for pasientene), enkelsenter, overkrysning, flytende måltidsforsøk, bestående av
en serie av standardiserte utfordringer med flytende måltider, i type 1
diabetespasienter med 2 timer med fordosering og etter 8 timer med blodprøvetaking
etter dosering for PK- og PD-parameterne.
35
Hvert individ undergikk en serie dosefunnvisitter for Humalog£ insulin lispro og
rHuPH20 (visittene 2A-C; opp til tre injeksjoner) for å bestemme den hensiktsmessige
161
individuelle insulindosen når koinjisert med rHuPH20 for å dekke det flytende måltidet
ved optimal glykemisk kontroll (definert ved opprettholdelse av pasientens
postprandiale blodglukose innenfor et område på 60 mg/dL og 160 mg/dL). Når
bestemt, ble den samme optimaliserte dosen anvendt for et forsøksmåltid som ble
5
omfattet av Humalog£ insulin lispro uten rHuPH20 (visitt 3). Individene gjennomgikk
deretter de samme seriene av undersøkelser (visittene 4A-B; opp til to injeksjoner)
ved anvendelse av vanlig human insulin (Humulin£ R insulin), for å bestemme den
hensiktsmessige individuelle vanlige insulindosen med rHuPH20 for optimal glykemisk
kontroll. Den samme optimaliserte dosen ble anvendt for et testmåltid som dekket av
10
Humulin£ R insulin uten rHuPH20 (visitt 5).
Studien muliggjorden sammenlikning av PK-profiler og postprandial
glukoseeksklusjoner når prandialinsulin ble administrert med eller uten rHuPH20.
Hypoglykemi etter måltid ble også vurdert for å verifisere den kliniske relevansen til
15
eventuelt observerte PK-forskjeller. Hovedhensikten var å sammenlikne tidlig
insulineksponering som målt med primære farmakokinetikk (PK) sluttpunkter til AUC060
av Humalog£ insulin lispro, og Humulin£ insulin injisert subkutant (SC) før et
flytende måltid med og uten rekombinant human hyaluronidase (rHuPH20). Andre
insulin PK-parametere som ble målt inkluderte Cmaks; tmaks; tidlig t50 % (tid til tidlig
20
halvmaksimal serumkonsentrasjon), sen t50 % (tid til sen halvmaksimal
serumkonsentrasjon, AUCsist (område under konsentrasjon-tid kurven fra tid 0 til siste
observasjon, som ifølge protokollen er 480 minutter postdose); AUC(0-inf) (total AUC fra
tid 0 til uendelig); intervall AUCs (0-15, 0-30, 0-45, 0-60, 0-90, 0-120, 0-180, 0-240,
0-360, 0-480, 15-480, 30-480, 45-480, 60-480, 90-480, 120-480, 180-480 og 240-
25
480 minutter). Oz (terminal elimineringsratekonstant; bestemt ved lineær regresjon av
terminale punkter i log-lineær serumkonsentrasjon-tid kurven); t1/2 (eliminering
halveringstid, definert som 0,693/O/z); CL/F (fjerning som en funksjon av
biotilgjengelighet; beregnet som dose/AUC(0-inf)); MRT (sist) (gjennomsnittlig
residenstid fra tid 0 til siste observasjon, som ifølge protokollen er 480 minutter
30
posdose); MRT(0-inf) (gjennomsnittlig resistenstid fra tid 0 til uendelig), og Vz(F
volum for distribusjon som en funksjon av biotilgjengelighet).
Farmakodynamikk (PD) sluttpunkter var postprandial glykemiske responsparametere,
inkludert AUCBg 0-4t (hvor BG angir blodglukose), og andre PD-sluttpunkter inkludert
35
AUCBG ved spesifiserte tidsintervaller, BGmaks, tBGmaks, tidlig tBG 50 %, sen tag 50 %,
hypoglykemiske episoder (HE) ved spesifiserte tidsintervaller, infusjon av 20 %
glukoseløsning (mengde og varighet) for å behandle hypoglykemi, anvendelse av 50
162
% glukoseløsning for nødsituasjon gjenopplivning (dvs. tilstedeværelse av alvorlige
symptomer og/eller blodglukose <36 mg/dL) og hypoglykemiske ekskursjoner som
kvantifisert ved AUC over blodglukose 36 mg/dL og under 70 mg/dL.
Trygghetsparameterne så som negative hendelser, hematologi, biokjemi, urinanalyser,
5
fysiske undersøkelser, vitale tegn, ECG, blodglukose, lokal tolererbarhet ved
injeksjonsete, og antistoffdannelse til insulinmidler og til rHuPH20 ble også undersøkt.
A. Seleksjon av pasient
Pasienter av hann- og hunkjønn med type 1 diabetes mellitus, behandlet med insulin i
10
> 12 måneder, var godkjent for innlemming av studien. Pasientene måtte være 18 til
65 år gamle. Hunkjønn med potensiale for å bli gravide måtte anvende en standard og
effektiv prevensjon i løpet av varigheten av studien. Andre innlemminskriterier
inkluderte: BMI 18,0 til 29,0 kg/m2, inkludert; HbA1c (glukosylert hemoglobin A1c) <
10 % basert på lokale laboratorieresultater; fastende C-peptid < 0,6 ng/mL;
15
gjeldende behandling med insulin < 1,2 U/kg/dag. Det var også påkrevd at pasientene
var i generell god helse basert på medisinsk bakgrunn og fysiske undersøkelser, uten
medisinske tilstander som kunne forhindre fullførelse av studiemedikamentinjeksjoner
og vurderinger nødvendig i denne protokollen.
20
De forskjellige studieeksklusjonskriteriene inkluderte: kjent eller antatt allergi for en
hvilken som helst komponent av hvilke som helst av studiemedikamentene i forsøket;
tidligere innlemming i forsøket; pasienter med proliferativ retinopati eller makulopati,
og/eller alvorlig nevropati, spesielt autonomisk nevropati; kliniske tegn på aktiv
sykdom i mage-tarm, kardiovaskulær (inkludert en historie med arytmi eller
25
ledningsforsinkelser ved ECG), hepatiske, nevrologiske, nyre, genitourinær, eller
hematologiske systemer, eller ukontrollert hypertensjon (diastolisk blodtrykk > 100
mmHg og/eller systolisk blodtrykk > 160 mmHg etter 5 minutter i supin posisjon);
bakgrunn med en hvilken som helst sykdom som kan forveksle resultatene i forsøket
eller inneha ytterligere risiko for administrering av studiemedikamentene til pasienten;
30
kliniske signifikante funn i rutinemessige laboratoriedata; anemi med hemoglobin
mindre enn de lavere grensene for det normale ved screening er spesifikt
utelukkende; anvendelse av medikamenter som kan interferere med vurderingen av
forsøksresultatene, og er kjent for å forårsake klinisk relevant interferens med
insulinvirkningen, glukoseanvendelsen, eller helbredelse fra hypoglykemi;
35
tilbakevendende hovedhypoglykemi eller hypoglykemisk uvitenhet, som vurdert av
granskeren; pågående avhengighet av alkohol eller misbruk av stoffer; bloddonasjon
(> 500 mL) i løpet av de siste 9 ukene før visitt 2A (se del B nedenfor) i studien;
163
graviditet, amming, hensikt å bli gravid, eller ikke bruk av tilstrekkelige
befruktningshindrende tiltak (tilstrekkelige befruktningshindrende forholdsregler så
som sterilisering, intra-uterin innretning [IUD], orale eller injiserbare
befruktningshindrende midler eller barrieremetoder); mental inkapasitet, uvillighet,
5
eller språkbarrierer som utelukker adekvat forståelse eller samarbeid; symptomatisk
gastroparese; inntak av noen undersøkende medikamenter i løpet av 4 uker av visitt
2A (se del B nedenfor) i denne studien; en hvilken som helst tilstand (intrinsisk eller
ekstrinsisk) som kan interferere med deltakelse i forsøket eller evaluering av data; for
tiden bruk av insulinpumpeterapi, og uvillighet ved forandring til lantus i sammenheng
10
med et kortvirkende insulin i løpet av varigheten av forsøket.
Tjueen evaluerbare pasienter fullførte forsøket: 14 hannkjønn; 7 hunnkjønn; alder =
41,6 + 10,6 år; BMI = 24,4 + 286 kg/m2). En vurderbar pasient var en pasient sm
fullførte visitt 3 og visitt 5, og som hadde tilstrekkelig blodprøver og
15
trygghetsvurderinger for analyser av sluttpunktet. En hvilken som helst pasient som
ikke fullførte alle protokollspesifiserte studiemedikamentinjeksjoner og/eller uten
tilstrekkelig blodprøver og trygghetsvurderinger i løpet av visitt 5 ble erstattet ved
innføring av en ytterligere pasient.
20
B. Studiemetoder
1. Prosedyrer for visitt
Hver pasient deltok i en screeningvisitt (visitt 1) for å bestemme berettigelsen for
deltakelse i forsøket. Når innlemmet, hadde hver pasient minst én og opp til tre
dosefunn visitter 2A-C (Humalog£ insulin lispro med rHuPH20), én dosering visitt 3
25
(Humalog£ insulin lispro alene), minst én og opp til to dosefunn visittene 4A-B
(Humulin£ R insulin med rHuPH20), én dosevisitt 5 (Humulin£ R insulin alene), og en
oppfølgingsvisitt (visitt 6).
Pasienter på en insulinpumpe, NPH, eller en hvilken som helst annen lengevirkende
30
insulin, som deltok i studien, ble omdannet til lantus for varigheten av studien.
Omdanningen foregikk når individet har fått godtatt vurdering av screeningen, men i
det minste 36 timer før deres første doseringsvisitt.
Hver dosefunnvisitt og hver doseringsvisitt ble fullført på en enkelt dag. Etter
35
innlemming tidlig om morgenen, ble pasienten observert og stabilisert for omtrent 2
timer ved anvendelse av intravenøs glukose og/eller insulin som er nødvendig for å
bringe blodglukosen innenfor en målverdi på 100 mg/dL. Ingen insulin eller
164
glukoseinfusjon ble tillatt i løpet av 30 minutter rett før dosering. Det ble deretter fulgt
ved dosering med testgjenstanden (dvs. Humalog£ insulin lispro, Humalog£ insulin
lispro/rHuPH20, Humulin£ insulin eller Humulin£ insulin/rHuPH20) og deretter inntak
av flytende måltid ved omtrent kl. 8:30. Ved alle doseringsvisittene, foregikk PK- og
5
PD-vurderinger i 8 timer helt til omtrent kl. 16:30, hvorpå pasientene mottok et måltid
og latt gå dersom dette var trygt.
2. Prepareringer for dosefunn visittprosedyrer
Et 18-gauge kateter ble satt inn i kubitalvenen i samme arm for analysering av
10
seruminsulin og blodglukose ved anvendelse av YSI STAT2300 Glucose Analyzer.
Blodkoagulering i kateteret og linjen ble unngått ved spyling med 0,15 mmol/L
saltvann. Et andre 18-gauge PTFE-kateter ble plassert i en vene i motsatt forarm for
infusjon av 20 % glukoseløsning, saltvann, og insulin etter hva som er hensiktsmessig
i løpet av pre-doseringsperioden. Seksti minutter før dosering ble
15
blodglukosekonsentrasjonen bestemt ved følgende tidspunkter i forhold til doseringen:
-60, -30, -20 og -10 min. med en YSI STAT2300 Glucose Analyzer. Gjennomsnittet av
blodglukoseavlesningene fra -30, -20 og -10 min. ble anvendt for å bestemme den
individuelle pasientens fastende blodglukosenivå for hvert dosefunn, og
doseringsvisitt. En pasient med forskjeller mellom innledende faste blodglukoseverdier
20
som er ansett å være for store, ble på ny satt opp for visitten, eller trukket fra
studien.
3. Pre-doseringsperiode
I løpet av innkjøringsperioden på 2 timer, ble blodglukose registrert etter behov for å
25
stabilisere blodglukosen i målområdet. Den 2 timer lange innkjøringsperioden ble
anvendt for å justere blodglukosenivåer etter behov ved IV-administrering av glukose
og/eller insulin ved hjelp av en presisjonsinfusjons/sprøytepumpe. Ikke noe insulin
eller glukoseinfusjon ble administrert i løpet av de 30 minuttene rett før dosering. Ved
tidspunkt for medikamentadministrering, var blodglukosenivået til pasienten i et
30
område mellom 80 og 140 mg/dL (målsøke en verdi så nær opptil området på 100120 mg/dL som mulig).
4. Dosering og fordøying av standard flytende måltid
Etter den 2 timer lange innkjøringsperioden ble studiemedikamentinjeksjonen
35
administrert (ved tidspunkt 0) ved subkutan injeksjon med en sprøyte inn i en løftet
hudfold i abdominalveggen. Testgjenstandene ble dannet som følger. Humulin£ R
insulindose alene ble dannet ved utsuging av korrekt dose (som bestemt ved visitt 4)
165
fra en beholder av Humulin£ R insulin (100 U/mL; Eli Lilly) ved anvendelse av en 0,3
cc kapasitet insulinsprøyte. Humulin£ R insulin/rHuPH20 ble dannet ved først å utsuge
0,3 cc (150 enheter) fra en beholder av Humulin£ R insulin (500 U/mL; Eli Lilly) ved
anvendelse av en 0,3 cc kapasitet insulinsprøyte og overføring derav inn i en beholder
5
inneholdende 1 mL rHuPH20 (20 Pg/mL; 3000 U/mL). Løsningen ble blandet ved
forsiktig omdreining.
Humalog£ insulin lispro eneste dose ble dannet ved aspirering av den korrekte dosen
(som bestemt ved visitt 2) fra en beholder av Humalog£ insulin lispro (100 U/mL; Eli
10
Lilly) ved å anvende en 3 cc kapasitet insulinsprøyte. Humalog£ insulin lispro/rHuPH20
ble dannet ved først å tine en beholder av rHuPH20 (1 mg/mL; omtrent 1200000
U/mL) ved romtemperatur i 1 til 2 timer. Ved anvendelse av en steril 0,3 cc kapasitet
insulinsprøyte, ble 0,27 cc luft trukket inn i sprøyten, og utgitt i øverste rommet
(“headspace”) av rHuPH20-beholderen, før 0,27 cc (0,27 mg; omtrent 32400 U)
15
rHuPH20 ble trukket inn i sprøyten. Dette ble deretter sakte overført, for å unngå
skumming, inn i en beholder av Hylenex og forsiktig omrørt. Ved anvendelse av en
steril 3,3 cc insulinsprøyte, ble 1,1 mL luft trukket og avgitt i øverste rommet av
Hylenex (inneholdende en ekstra 0,27 mg rHuPH20; omtrent 32400 U) beholder før
1,1 mL av løsningen ble aspirert og dispansert inn i en beholder av Humalog£ insulin
20
lispro (100 U/mL; Eli Lilly). Løsningen ble blandet ved forsiktig røring.
En gjennomsnitlig dose av 5,8 (+ 3,0) Humalog£ insulin lispro, med eller uten
rHuPH20 (0,2 Pg/U insulin) ble administrert. En gjennomsnittlig dose av 6,2 (+ 3,5)
Humulin£ R insulin,med eller uten rHuPH20 (0,2 Pg/U insulin) ble administrert.
25
Injeksjonssetet for insuliner koadministrert med rHuPH20 var som følger: injeksjon for
visitt 2A var i venstre midt-abdominal region, neste visitt (visitt 2B eller visitt 3
dersom visitt 2B ikke var nødvendig) anvendte høyre midt-abdominale region, og den
neste visitten anvendte venstre midt-abdominale region, med påfølgende
injeksjonsseter som alternerer således. Injeksjonsnålen ble plassert i en 45 grader
30
vinkel, og holdt i hudfolden i 10 sekunder.
I løpet av 10 minutter etter studiemedikamentdosering, inntok pasientene et flytende
måltid (Ensure) som tilveiebringer 60 g karbohydrat. Det flytende måltidet ble
fullstendig fordøyd i løpet av 10 minutter. Blodglukose ble målt i de neste 8 timene
35
ved spesifikke tidspunkter. Ytterligere blodglukosemålinger for trygghetsgrunner ble
utført etter behov.
166
5. Prøvetaking og vurdering
I løpet av pre-doseringsperioden og etter dosering, ble blodglukosekonsentrasjonen
registrert ved hyppige blodglukosemålinger ved anvendelse av YSI STAT2300 Glucose
Analyzer ved spesifikke tidspunkter -60, -30, -20, -10, 0, 3, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 30,
5
40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200,
210, 220, 230, 240, 255, 270, 285, 300, 315, 330, 345, 360, 375, 390, 415, 420,
430, 445, 460, 475 og 480 minutter. Serieblodprøver for bestemmelse av
seruminsulin ble tatt ved -30, -30, -10, 0, 3, 6, 9, 12, 15, 20, 30, 45, 60, 120, 150,
180, 210, 240, 300, 360, 420 og 480 minutter.
10
B. Farmakokinetikk til Humulin£
£ R insulin og Humalog£ insulin lispro med
og uten rHuPH20
Farmakokinetikk for både Humalog£ insulin lispro/rHuPH20 og Humulin£ R
insulin/rHuPH20 viste akselerert, men stort sett sammenliknbar eksponering
15
sammenliknet med hver uten rHuPH20. Tabell 19a angir en oppsummering av
forskjellige PK-parametere for 12 pasienter. Dette var en interimanalyse som ble
utført før data fra alle pasienter ble samlet. Følgelig, kun data fra 12 av de 21
pasientene bidro til denne analysen. Effekten av koadministrering med rHuPH20 er
vist ved % kontroll, beregnet ved [gjennomsnittlig (geometrisk eller aritmetisk) PK-
20
verdi for insulin med rHuPH20]/[gjennomsnittlig (geometrisk eller aritmetisk) PK-verdi
for kun insulin] x 100), er også inkludert. Geometrisk gjennomsnitt og p-verdi for
loggtransformerte data for Cmaks og AUC-parametere, mens basert på aritmetisk
gjennomsnitt og utransformerte verdier for tmaks og tidlig og sen t50 %. Det primære
sluttpunktet, total insulineksponering over første 1 time (AUC0-60), ble øket 135 % for
25
Humalog£ insulin lispro/rHuPH20 sammenliknet med Humalog£ insulin lispro alene
(p=0,0197) og 304 % for Humulin£ R insulin/rHuPH20 over Humulin£ R insulin alene
(p=0,0005). Tidlig T50 % reduserte fra 19,9 til 12,6 min. (p=0,0002) for Humalog£
insulin lispro og 40,1 til 14,8 (p=0,033) for Humulin£ R insulin. tmax ble redusert fra
43,8 til 27,9 min. (p=0,002) for Humalog£ insulin lispro og 96,7 til 52,1 (p=0,086) for
30
vanlig; Sen T50 % ble redusert fra 98,6 til 68,6 min. (p=0,0001) for Humalog£ insulin
lispro og 219,2 til 111,2 (p=0,008) Humulin£ R insulin.
Tabell 19a. Farmakokinetikk av insulin administrert med elleruten rHuPH20 i
en flytende måltidsstudie
Humalog£ insulin lispro (N=12)
Humulin£ R insulin (N=12)
-
+
Effekt av
-
+
Effekt av
rHuPH20
rHuPH20
rHuPH20
rHuPH20
rHuPH20
rHuPH20
167
Median
Median
% kontroll
Median
Median
%
(område)
(område)
(p-verdi)a
(område)
(område)
kontroll
(p-verdi)a
Insulin-
6
6
6
6
dose (U)
(3,16)
(3,16)
(2,18)
(2,18)
Tidlig
20,2
13,6
63 %
27,3
16,2
60 % (p
t50%
(13,3,
(6,3,
(p=0,0002)
(14,6,
(3,9,
=
(min.)
25,6)
18,2)
146,0)
22,9)
0,0329)
tmaks
45
30
67 % (p =
60
45
75 % (p
(min.)
(30,60)
(15, 45)
0,0015)
(20, 240)
(20, 150)
=
0,0856)
Sen t50%
86,6
71,0
82 % (p =
172,0
104,5
61 % (p
(min.)
(69,2,
(42,5,
0,0001)
(91,8,
(67,2,
=
135,0)
93,9)
370,0)
173,0)
0,0066)
Cmaks
40,7
53,2
126 % (p = 21,1
38,5
186 % (p
(pmol/
(25,5,
(31,2,
0,0394)
(6,0,
(21,7,
=
L*U)
76,2)
101,5)
52,3)
76,8)
0,0047)
AUC-intervall (min.*pmol/L*U)
0-60
0-sist
0-inf
1373
2310
135 %
583
1495
304 %
(947,
(1238,
(p =
(150,
(856,
P=
3113)
3683)
0,0197)
1860)
3600)
0,0005)
3840
3452
105 %
3633
4021
133 %
(1673,
(2133,
P=
(745.
(2417,
P=
5133)
6375)
0,7332)
6500)
5656)
0,1679)
4016
3491
102 %
3867
4143
105 % (p
(1783,
(2167,
(p =
(990,
(2433,
=
5667)
6650)
0,9004)
11467)
5700)
0,8366)
a
Analyse av varians ved anvendelse av en blandet modell med fiksert effekt for
behandling. En ustrukturert kovariansmatriks blant gjentatte målinger, utført på
loggtransformerte verdier for AUC og Cmaks-parametere, og utransformerte data for
tmaks og t50% parametere. Verdier på 0 ble satt til 1 før loggtransformasjonen.
5
Tabell 19b angir en oppsummering av forskjellige PK-parametere for alle 21
pasientene som fullførte studien, og viser gjennomsnitt og standardavvik. PKanalysene i tabell 19b ble utført på grunnlinje subtrahert (hvor grunnlinjen var målt
168
ved tid 0) individuell Humalog£ insulin lispro eller
£
R insulinkonsentrasjon mot
tidsdata ved anvendelse av ikke-kompartmental tilnærming (lineær trapezoidal regel
for AUC-beregning). WinNonlin seleksjonskriterier ble anvendt for bestemmelse av
lambda z, eliminasjonsratekonstanten, hvorpå halveringstid, AUC INFobs, MRT, CL, og
5
Vz var baserte. Alle målinger lavere enn 20,0 pM ble satt til null for PK-beregning.
Tilsetning av rHuPH20 til Humolog£ insulin lispro eller Humulin£ R insulininjeksjon økte
den tidlige insulineksponeringen. Gjennomsnittlig dosenormalisert grunnlinje
subtrahert Cmaks ble øket 74 % fra 46,6 til 81,2 pmol/L med tilsetning av rHuPH20 til
10
Humalog£ insulin lispro, og 122 % fra 25,4 til 56,5 pmol/L for Humulin£ R insulin. For
primært PK-sluttpunkt, AUC0-60 min. koadministrering med rHuPH20 økte tidlig
Humulog£ insulin lisproeksponering med 75 % fra 1690 til 2950 min.*pmol/L/IU og
økte tidlig Humulin£ R insulineksponering med 210 % fra 649 til 2010 min.*pmol/L/IU
i forhold til kontrolladministrasjon uten enzym. Biotilgjengeligheten ved
15
koadministrering med rHuPH20 ble ikke signifikant endret i forhold til
kontrollinjeksjonen av Humalog£ insulin lispro alene: 98 % for AUC0-inf og 116 % for
AUC0-sist. Den relative biotilgjengeligheten var 120 % for AUC0-inf og 174 % for AUC0-sist
med koadministrering av Humulin£ R insulin med rHuPH20 i forhold til
kontrolladministrasjon uten enzym (geometrisk gjennomsnittlig dosenormalisert
20
grunnlinje subtraherte data anvendt for disse beregningene; data ikke vist).
Koadministrering av både insulin og lispro med rHuPH20 akselererte Tmaks og tidlig og
sen T50% sammenliknet med kontrollinjeksjonen uten rHuPH20.
Tidspunkt til topp insulinkonsentrasjon var hurtigere for Humalog£ insulin
25
lisproinjeksjon med rHuPH20, med aritmetisk gjennomsnitt tmaks ved 38,8 minutter,
mot 47,1 minutter med Humalog£ insulin lisproinjeksjon uten rHuPH20. Subkutan
injeksjon av Humulin£ R insulin med rHuPH20 resulterte i en tmaks på 58,3 minutter,
sammenliknet med 104 minutter uten rHuPH20.
30
Tabell 19b. Farmakokinetikk av insulin administrert med eller uten rHuPH20 i
en flytende måltidsstudie
Humalog£ insulin lispro (N =21)
-rHuPH20
Gjennom-
SD
snitt
Cmaks
(pmol/L*U)
46,6
+ rHuPH20
Gjennom-
SD
snitt
23,3
Humulin£ insulin (N = 21)
81,2
-rHuPH20
Gjennom-
SD
snitt
92,9
25,4
+ rHuPH20
Gjennom-
SD
snitt
13,1
56,5
52,1
169
AUCsist
4440
2360
8470
19400
3850
1840
6570
8690
4680
2580
4410
1700
4200
1620
4810
1580
82,1
105
262
183
36
43,6
188
172
485
394
1190
1080
171
125
698
461
1080
681
2190
1980
395
269
1340
763
1690
926
2950
2530
649
422
2010
1070
2680
1320
4030
3800
1210
693
3140
1520
3370
1620
4980
6080
1770
934
4050
2320
4070
1900
5980
9120
2810
1170
4900
3040
4310
2060
7230
14200
3560
1280
5230
3450
4500
2440
7950
16900
4190
1540
5950
6040
4540
2450
8520
19300
4280
1630
6910
9950
4460
2360
8270
19200
4250
1620
6720
9870
4050
2140
7330
18300
4110
1610
6210
9690
3460
1960
6340
17500
3890
1600
5560
9480
(min.*pmol/
L*U)
AUC0-inf
(min.*pmol/
L*U)
AUC0_15
(min.*pmol/
L*U)
AUC0_30
(min.*pmol/
L*U)
AUC0_45
(min.*pmol/
L*U)
AUC0_60
(min.*pmol/
L*U)
AUC0_90
(min.*pmol/
L*U)
AUC0_120
(min.*pmol/
L*U)
AUC0_180
(min.*pmol/
L*U)
AUC0_240
(min.*pmol/
L*U)
AUC0_360
(min.*pmol/
L*U)
AUC0_480
(min.*pmol/
L*U)
AUC15_480
(min.*pmol/
L*U)
AUC30_480
(min.*pmol/
L*U)
AUC45_480
(min.*pmol/
L*U)
170
AUC60_480
2850
1810
5570
16900
3630
1620
4890
9220
1860
1490
4470
15600
3080
1600
3770
8820
1160
1190
3540
1330
2520
1550
2850
7910
473
782
2540
10300
1480
1350
2000
7090
223
525
1300
5130
726
903
1680
6620
0,0214
0,0094
0,0253
0,00905
0,0224
0,0118
0,0249
0,0118
38,7
16,3
31,8
14,1
40,8
21,4
36,2
24,8
tmaks (min.)
47,1
15,2
38,8
40,2
104
65
58,3
32,5
Tidlig t50%
21,1
5,83
13,9
3,34
38,7
31,6
18,5
10,8
112
30,5
81,9
45,2
214
70,7
118
30,8
Vz_F_obs (L)
87,4
52,2
67,1
30,2
117
141
70,5
50,5
Cl_F_obs
1,56
0,668
1,56
0,582
1,81
1,27
1,37
0,435
86,1
23,3
72,4
34,3
131
50,5
93,6
43,7
97,6
31,6
73,6
27
144
38,2
90,7
33,5
(min.*pmol/
L*U)
AUC90_480
(min.*pmol/
L*U)
AUC120-480
(min.*pmol/
L*U)
AUC180_480
(min.*pmol/
L*U)
AUC240_480
(min.*pmol/
L*U)
Lambda_z
(1/min.)
HL_Lambda_z
(min.)
(min.)
Sen t50%
(min.)
(L/min.)
MRTlast
(min.)
MRTINF_obs
(min.)
C. Sammenlikning av glykemisk respons overfor måltidseksponering etter
vanlig human insulin og insulin lispro med og uten rHuPH20
5
Den glykemiske responsen overfor en måltidseksponering ble forbedret Humalog£
insulin lispro eller Humulin£ R insulin ble administrert med rHuPH20 sammenliknet
med når insulinene ble administrert alene. Tabell 19c angir farmakodynamiske
parametere som målt fra 12 pasienter. Koadministrering av enten Humalog£ insulin
lispro eller Humulin£ R insulin med rHuPH20 resulterte i reduserte postprandiale
10
blodglukosenivåer i forhold til kontrollinjeksjonen uten rHuPH20. Den maksimale
blodglukosen observert i 4 t postprandialperioden ble redusert fra 186 til 154 mg/dL
når Humalog£ insulin lispro ble administrert med rHuPH20 sammenliknet med
171
Humalog£ insulin lispro alene (p=0,0213) og fra 212 til 166 mg/dL når Humulin£ R
insulin ble administrert med rHuPH20 sammenliknet med Humulin£ R insulin alene
(p=0,0406). 2 t postprandial glukose (PPG) og totalt ekskursjonsareal høyere enn 140
mg/dL ble likeledes redusert. Det totale ekskursjonsarealet mindre enn 70 mg/dL var
5
minimalt, og likt for alle testgjenstander, med en mindre trend mot øket område for
Humalog£ insulin lispro og redusert område for Humulin£ R insulin med rHuPH20
koadministrering.
Tabell 19c. Farmakodynamikk av insulin administrert med eller uten rHuPH20
10
i en flytende måltidsstudie
Humalog£ insulin lispro (N=12)
Humulin£ R insulin (N=12)
-
+
%
-
+
%
rHuPH20
rHuPH20
Kontroll
rHuPH20
rHuPH20
Kontroll
median
median
(p-verdi)a
median
median
(p-verdi)a
(område)
(område)
(område)
(område)
BGmaks
186
154
83 %
212
166
79 %
(mg/dL)
(127,
(98, 196)
(p =
(128,
(137,
(p =
0,00213)
343)
274)
0,0406)
270)
tBGmaks
70
95
136 %
90
70
78 %
(min.)
(30, 120)
(20, 240)
P=
(45, 120)
(45, 140)
(p =
0,1854)
0,5744)
2 t PPG
156
124
80 %
192
132
69 %
(mg/dL)
(70, 239)
(74, 194)
(p =
(101,
(79, 207)
(p =
0,0862)
329)
0,0084)
AUC >
3573
400
11 %
5254
847
16 %
140
(0,15758)
(0,6864)
(p =
(0,35013)
(2,14513)
(p =
(mg*min./
0,0693)
0,2105)
dL)
AUC < 70
0
0
0%
347
0
0%
(mg*min./
(0,0)
(0,642)
(p =
(0,1148)
(0,939)
(p =
0,0958)
dL
0,2803)
a
t-test, paret, 2-hale
D. Trygghet
Ingen alvorlige negative hendelser (AEs) ble rapportert. Den mest vanlig rapporterte
15
AE var redusert blodglukose/hypoglykemi (147 hendelser). Av de 147 hendelsene av
redusert blodglukose/hyperglykemi ble 21 betraktet muligens eller sannsynligvis
172
relatert til rHuPH20. 17 hendelser ble angitt som moderate i intensitet, 4 ble betraktet
muligens relatert til rHuPH20. De gjenværende 126 hendelsene ble beregnet som
svake i intensitet. Alle andre AEs oppstod med mindre enn 5 % frekvens i denne
studien. Alle episodene med hypoglykemi (definert som ha en blodglukoseverdi på
5
>70 mg/dL) uansett symptomer, ble oppfanget som AE i denne studien.
E. Oppsummering
Koadministrering av enten Humalog£ insulin lispro eller Humulin£ R insulin med
rHuPH20 resulterte i tidlig insulineksponering med tidligere tmaks, tidlig t50% og sen t50%
10
parametere, samt høyere toppinsulinkonsentrasjon i forhold til kontrollinjeksjoner uten
rHuPH20, uten en signifikant forandring i biotilgjengelighet. Denne tidligere
insulineksponeringen førte til mindre postprandial hyperglykemi, med redusert topp 04 t glukosenivåer, reduserte 2 t postprandiale glukosenivåer, og mindre
hyperglykemiske ekskursjoner, som målt ved AUC > 140 mg/dL. Hypoglykemiske
15
ekskursjoner, som mplt ved AUC < 70 mg/dL, var minimale, og like for alle testede
gjenstander, med en mindre trend overfor forøket område for Humalog£ insulin lispro
og reduserte områder for vanlig human insulin (Humulin£ R insulin) ved rHuPH20
koadministrering.
20
Eksempel 1c
Farmakokinetikk og farmakodynamikk ved subkutan administrert Humulin£ R
insulin eller Humalog£ insulin lispro med eller uten varierende doser av
rekombinant rHuPH20 i friske humane individer
Som del av et enkelt senter, fase 1, åpen-merke, enkel-blind (individer uvitende om
25
innholdet av hver injeksjon), 4 stadiestudie for å bestemme farmakokinetikk,
farmakodynamikk (eller glukodynamikk; GD), trygghet, tolererbarhet, og optimalt
forhold på rHuPH20:insulin, en rekke rHuPH20 doseforhold ble administrert subkutant
(SC) med doser av vanlig insulin (Humulin£ R insulin) eller Humalog£ insulin lispro, og
farmakokinetikken (PK) og optimalt forhold til rHuPH20:insulin ble vurdert ved å
30
bestemme tmaks, Cmaks, AUC0ot, og relativ biotilgjengelighet basert på
seruminsulinkonsentrasjoner samlet ved spesifiserte tidspunkter.
Effekt av koadministrering av varierende doser av rHuPH20 på farmakokinetikk og
farmakodynamikk (eller glukodynamikk (GD)) til subkutant administrert Humulin£ R
35
insulin eller Humalog£ insulin lispro ble vurdert ved å ta blodprøver for å måle insulinog glukosenivåene. En hyperinsulinemi-euglykemi clamp prosedyre (som beskrevet i
eksempel 1) ble anvendt for å opprettholde plasmaglukosenivåer mellom 90-110
173
mg/dL. Insulinkonsentrasjonene ble vurdert for å bestemme insulin PK-parameterne:
tmaks, tidlig t50%, sen t50%, AUC0ot, og AUCtoslutt, (hvor t = 30, 60, 90, 120, 180, 250,
360 og 480 min. etter injeksjon), AUC0oalle, AUC0oinf, Cmaks, relativ biotilgjengelighet
(sammenliknet uten rHuPH20), og inter- og intra-individvariabilitet basert på
5
variasjonskoeffisienten for alle PK-parameterne. Glukoseinfusjonsrate (GIR) rate for å
opprettholde euglykemi mens på clamp ble målt og anvendt for å bestemme følgende
GD-parametere: tGIRmaks, tidlig tGIR50%, sen tGIR50%, GIR AUC0ot, og GIR AUC0oslutt
(hvor t = 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360 og 80 min. etter injeksjon), GIR AUC0oalle, og
cGIRmaks, og inter- og intra-individvariabilitet basert på variasjonskoeffisienten for alle
10
GD-parameterne. Trygghet og lokal tolererbarhet til hver av SC-injeksjonene ble også
vurdert.
A. Administrasjon Humulin£ R insulin med eller uten varierende doser av
rHuPH20
15
Friske frivillige ble administrert 30 PL eller 120 P Humulin£ R insulin (fortynnet til 100
U/mL) med en sluttkonsentrasjon på enten 0 Pg/mL, 1,25 Pg/mL, 5 Pg/mL, 10 Pg/mL,
20 Pg/mL eller 80 Pg/mL rHuPH20 (omtrent 0 U/mL, 150 U/mL, 600 U/mL, 1200
U/mL, 2400 U/mL eller 9600 U/mL). Følgelig ble de frivillige administrert med enten
30 PL inneholdende 3 U Humulin£ R insulin med omtrent 0, 4,5, 18, 36, 72 eller 288
20
enheter rHuPH20, eller 120 PL inneholdende 12 U Humulin£ R insulin med omtrent 0,
18, 82, 144, 288 eller 1152 enheter rHuPH20. Tabell 19d angir de målte
farmakokinetikkparameterne for individer som mottar 12 U insulin. PK-parameterne
karakteristiske for hyaluronidase koadministrasjon (tidligere tmaks og t1/2maks, høyre
Cmaks og tidlig systemisk eksponering f.eks. AUC0-60min.) ble forøket sammenliknbart for
25
alle rHuPH20-konsentrasjonene testet, sammenliket med når insulin ble administrert
alene. Glukoseinfusjonsrate (GIR) profiler for alle rHuPH20-konsentrasjonene var
forskjellige fra placebo (dvs. 0 Pg/mL) med en karakteristisk økning i tidlige rater, og
reduksjon i sen glukoseinfusjon. Over de testede dosene var alle rHuPH20konsentrasjonene like effektive, og en ikke-effektiv dose ble ikke observert.
30
Tabell 19d. Insulin PK-parametere for 12 U Humulin£ R insulin med
varierende doser av rHuPH20
Variable
Statistikk
enheter
Mengde av rHuPH20
0 Pg/mL
1,25
5 Pg/mL
10 Pg/mL
20 Pg/mL
80 Pg/mL
Pg/mL
Cmaks
N
4
4
4
4
4
4
(pmol/L)
Geo. gjen-
192,3
418,1
355,7
323,4
371,0
352,2
nomsnitt
174
CV %
22,9
33,2
23,7
45,6
32,4
35,5
Median
179,5
432,0
334,0
276,0
353,0
371,0
tmaks
N
4
4
4
4
4
4
(min.)
Arit.
121,5
108,8
71,3
93,8
75,0
101,3
Gjennom-
(125,42)
(33,26)
(14,36)
(39,45)
(21,21)
(41,31)
CV %
103
30,6
20,2
42,1
28,3
40,8
Median
90,0
105,0
67,5
82,5
82,5
97,5
Tidlig t50%
N
4
4
4
4
4
4
(min.)
Arit.
41,3
33,3
22,3
30,4
24,7
33,5
Gjennom-
(25,67)
(9,14)
(6,97)
(9,58)
(3,99)
(15,10)
snitt (std.)
snitt (std.)
CV %
62,2
27,4
31,2
31,5
16,2
45,1
Median
30,3
33,5
25,4
29,3
25,0
34,2
Sen tmaks
N
4
4
4
4
4
4
(min.)
Arit.
359,0
196,3
209,8
194,5
210,8
193,8
Gjennom-
(28,28)
(47,35)
(47,08)
(69,25)
(50,09)
(43,26)
CV %
7,9
24,1
22,4
35,6
23,8
22,3
Median
359,0
201,0
204,0
174,5
231,0
187,0
AUC0-60
N
4
4
4
4
4
4
(min.*
Geo. gjen-
4606,8
11299,9
11679,1
9078,3
12193,6
9514,5
pmol/L)
nomsnitt
51,8
38,6
27,6
63,2
44,1
67,0
snitt (std.)
CV %
Median
4635,0
10475,0
11865,0
7190,0
11425,0
9885,0
AUCsist
N
4
4
4
4
4
4
(min.*
Geo. gjen-
59362,0
76639,9
75575,6
64666,6
70945.2
65635,2
CV %
20,0
11,2
10,6
18,3
24,5
22,1
Median
57750,0
76550,0
76450,0
64100,0
68150,0
63100,0
pmol/L)
nomsnitt
B. Administrering av Humalog£ insulin lispro med eller uten varierende
doser av rHuPH20
5
Friske frivillige ble administrert 30 PL eller 120 PL av Humalog£ insulin lispro
(fortynnet til 50 U/mL) med en endelig konsentrasjon på enten 0 Pg/mL, 0,078 Pg/mL,
0,3 Pg/mL, 1,2 Pg/mL, 5 Pg/mL eller 20 Pg/mL rHuPH20 (omtrent henholdsvis 0 U/mL,
9,36 U/mL, 36 U/mL, 144 U/ml, 600 U/ml, eller 2400 U/mL). Følgelig ble de frivillige
administrert enten 30 PL inneholdende 1,5 U Homalog£ insulin lispro med omtrent 0,
10
0,28, 1,08, 4,32, 18 eller 72 enheter rHuPH20, eller 120 PL inneholdende 6 U
Humalog£ insulin lispro med omtrent 0, 1,12, 4,32, 17,28, 72 eller 288 enheter
rHuPH20. Tabell 19e angir de målte farmakokinetikkparameterne for individer som
175
mottar 6 U Humalog£ insulin lispro. Over dosene som ble testet, var alle rHuPH20kosentrasjonene høyere enn 0,3 Pg/mL likeledes effektive.
Tabell 19e. Insulin PK-parametere for 6 U Humalog£ insulin lispro med
5
varierende doser av rHuPH20
Variable
Statistikk
Mengde av rHuPH20
0 Pg/mL
enheter
1,25
5 Pg/mL
10 Pg/mL
20 Pg/mL
80 Pg/mL
Pg/mL
Cmaks
N
4
4
4
4
4
4
(pmol/L)
Geo. gjen-
381,8
355,9
435,1
483,7
579,5
463,6
CV %
13
21
26
23
29
32
Median
385
376
463
506
532
438,8
tmaks
N
4
4
4
4
4
4
(min.)
Arit.
67,5
36,3
33,8
41,3
33,8
40,0
Gjennom-
(8,7)
(10,3)
(7,5)
(14,4)
(7,5)
(15,8)
CV %
13
28
22
35
22
40
Median
67,5
37,5
30
37,5
30
37,5
Tidlig t50%
N
4
4
4
4
4
4
(min.)
Arit.
25,9
15,6
15,2
17,0
16,0
15,6
Gjennom-
(2,8)
(2,6)
(3,2)
(1,0)
(4,5)
(0,8)
11
17
21
6
28
5
nomsnitt
snitt (std.)
snitt (std.)
CV %
Median
26,1
16,4
14,8
16,5
15,7
15,8
Sen tmaks
N
4
4
4
4
4
4
(min.)
Arit.
120,0
85,6
92,8
85,4
80,4
77,1
Gjennom-
(10,5)
(17,4)
(23,5)
(20,9)
(11,6)
(21,8)
CV %
9
20
25
25
14
28
Median
120
79,8
88,0
82,2
83,1
77,2
AUC0-60
N
4
4
4
4
4
4
(min.*
Geo. gjen-
11658
14886
18299
19494
23424
18523
pmol/L)
nomsnitt
CV %
18
20
22
17
27
25
Median
11600
16150
19400
20050
22150
17650
AUCsist
N
4
4
4
4
4
4
(min.*
Geo. gjen-
38590
30890
41165
39504
47405
36705
pmol/L)
nomsnitt
CV %
9
10
33
14
17
12
Median
39200
30950
36350
38150
4610
35700
snitt (std.)
Eksempel 2
176
Dannelse av en oppløselig rHuPH20 – uttrykker cellelinje
HZ24-plasmid (angitt i SEKV. ID nr. 52) ble anvendt for å transfektere kinesisk
hamsterovarie (CHO-celler) (se f.eks. US patentsøknader nr. 10,795,095, 11/065,716
og 11/238,171). HZ24-plasmidvektoren for ekspresjon av oppløselig rHuPH20
5
inneholder et pCI-vektorskjelett (Promega), DNA kodende for aminosyrene 1-482 av
human PH20 hyaluronidase (SEKV. ID nr. 49), et indre ribosomalt inngangssete
(IRES) fra ECMV-virus (Clontech), og musedihydrofolatreduktase (DHFR) gen. pCIvektorskjelettet inkluderer også DNA kodende for beta-laktamaseresistensgen
(AmpR), et fl replikasjonsorigo, en cytomegalovirus immediate-early
10
enhancer/promoterregion (CMV), et kimerisk intron, og et SV40 late
polyadenyleringssignal (SV40). DNA kodende for oppløselig rHuPH20-konstruksjon
inneholder et NheI-sete og en Kozak konsensussekvens før DNA kodende for metinin i
aminosyreposisjon 1 av nativ 35 aminosyresignalsekvens til human PH20, og et
stoppkodon etter DNA kodende for tyrosin korresponderende med aminosyreposisjon
15
482 av human PH20 hyaluronidase angitt i SEKV. ID nr. 1), etterfulgt av et BamHI
restriksjonssete. Konstruksjonen pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24) resulterer
derfor i en enkelt mRNA-art drevet av CMV-promoteren som koder for aminosyrene 1482 av human PH20 (angitt i SEKV. ID nr. 3) og aminosyrene 1-186 av mus
dihydrofolatreduktase (angitt i SEKV. ID nr. 53), separert av indre ribosomalt
20
innføringssete (IRES).
Ikke-transfekterte DG44 CHO-celler som vokser i GIBCO-modifisert CD-CHO-media for
DHFR(-)-celler, supplementert med 4 mM glutamin og 18 mL/L Plurionic F68/L
(Gibco), ble utsådd med 0,5 x 106 celler/ml i en risteflaske ved preparering for
25
transfeksjon. Cellene ble dyrket ved 37oC i 5 % CO2 i en fuktinkubator, ristet ved 120
rpm. Eksponensielt voksende ikke-transfekterte DG44 CHO-celler ble testet for
levedyktighet før transfeksjonen.
Seksti millioner levedyktige celler av ikke-transfektert DG44 CHO-cellekultur ble
30
pelletert og resuspendert til en tetthet på 2 x 107 celler i 0,7 mL 2x
transfeksjonsbuffer (2x HeBS: 40 mM HEPES, pH 7,0, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4
mM Na2HPO4, 12 mM dekstrose). Til hver aliquot av resuspenderte celler ble 0,09 mL
(250 Pg) av lineært HZ24-plasmid (linearisert ved over natt fordøying med Cla 1 (New
England Biolabs) ble tilsatt, og celle/DNA-løsninger ble overført i 0,4 cm gap BTX
35
(Gentronics) elektroporasjonskuvetter ved romtemperatur. En negativ
kontrollelektroporasjon ble utført uten plasmid DNA blandet med cellene.
177
Celle/plasmidblandingene ble elektroporert med en kapasitorutladning på 330 V og
960 PF eller ved 350 V og 960 PF.
Cellene ble fjernet fra kuvetten etter elektroporasjon, og overført inn i 5 mL modifisert
5
CD-CHO-media for DHFR(-)-cellene, supplementert med 4 mM glutamin og 18 ml/L
Pluronic F68/L (Gibco), og latt vokse i en brønn i en 6-brønn vevskulturplate uten
seleksjon i 2 dager ved 37oC i 5 % CO2 i en fuktinkubator.
To dager etter elektroporasjon ble 0,5 mL vevskulturmedia fjernet fra hver brønn og
10
testet for tilstedeværelse av hyaluronidaseaktivitet, ved anvendelse av
mikroturbiditetsanalysen beskrevet i eksempel 5. Resultatene er vist i tabell 20.
Tabell 20. Opprinnelig hyaluronidaseaktivitet til HZ24-transfekterte DG44 CHO-celler
40 timer post-transfeksjon
15
Fortynning
Aktivitet enheter/ml
Transfeksjon 1 330 V
1 til 10
0,25
Transfeksjon 2 350 V
1 til 10
0,52
Negativ kontroll
1 til 10
0,015
Celler fra transfeksjon 2 (350 V) ble samlet fra vevskulturbrønnen, opptellet og
fortynnet til 1 x 104 til 2 x 104 levedyktige celler pr. mL. En 0,1 mL aliquot av
cellesuspensjonen ble overført til hver brønn av fem, 96-brønn rundbundne
vevskulturplater. Ett hundre mikroliger av CD-CHO-media (GIBCO) inneholdende 4
mM GlutaMAXTM-1 supplement (GIBCOTM, Invitrogen Corporation) og uten hypoxantin-
20
og tymidinsupplementer ble tilsatt til brønner inneholdende celler (sluttvolum 0,2 mL).
Ti kloner ble identifisert fra 5 plater dyrket uten metotreksat (tabell 21).
Tabell 21. Hyaluronidaseaktivitet av identifiserte kloner
Plate/brønn ID
Relativ hyaluronidase
1C3
261
2C2
261
3D3
261
3E5
243
3C6
174
2G8
103
178
1B9
304
2D9
273
4D10
302
Seks HZ24-kloner ble ekspandert i kultur og overført i risteflasker som
enkeltcellesuspensjoner. Klonene 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11, og 4D10 ble platet i 065
brønn rundbundne vevskulturplater ved anvendelse av en to-dimesjonal infinitt
fortynningsstrategi, hvor celler ble fortynnet 1:2 ned platen, og 1:3 over platene,
begynnende med 5000 celler i øverste venstre brønn. Fortynnende kloner ble dyrket i
en bakgrunn av 500 ikke-transfekterte DG44 CHO-celler pr. brønn, for å tilveiebringe
nødvendige vekstfaktorer for opprinnelige dager i kultur. Ti plater ble dannet pr.
10
subklon, med 5 plater inneholdende 50 nM metotreksat, og 5 plater uten metotreksat.
Klon 3D3 produserte 24 visuelle subkloner (13 fra ingen metotreksatbehandling, og 11
fra 50 nM metotreksatbehandling. Signifikant hyaluronidaseaktivitet ble målt i
supernatanter fra 8 av 24 subkloner (>50 enheter/mL), og disse 8 subklonene ble
15
ekspandert inn i T-25 vevskulturflasker. Kloner isolert fra
metotreksatbehandlingsprotokollen ble ekspandert i nærvær av 50 nM metotreksat.
Klon 3D35M ble ytterligere ekspandert i 500 nM metotreksat, som gir opphav til kloner
som produserer i overskudd av 1000 enheter/mL i risteflasker (klon 3D35M, eller
Gen1 3D35M). En mastercellebank (MCB) av 3D35M-celler ble deretter dannet.
20
Eksempel 3
Bestemmelse av hyaluronidaseaktivitet av oppløselig rHuPH20
Hyaluronidaseaktiviteten til oppløselig rHuPH20 i prøver så som cellekulturer,
rensingsfraksjoner og rensede løsninger, ble bestemt ved anvendelse av en
25
turbidometrianalyse, som er basert på dannelsen av et uoppløselig presipitat når
hyaluronsyre bindes med serumalbumin. Aktiviteten blir målt ved inkubering av
oppløselig rHuPH20 med natriumhyaluronat (hyaluronsyre) i en fast tidsperiode (10
minutter) og deretter presipitering av ufordøyd natriumhyaluronat med tilsetning av
surgjort serumalbumin. Turbiditeten til den resulterende prøven blir målt ved 640 nm
30
etter en 30 minutter utviklingsperiode. Reduksjon i turbiditet som resulterer fra
ezymaktiviteten på natriumhyaluronatsubstratet er et mål på den oppløselige rHuPH20
hyaluronidaseaktiviteten. Metoden blir utført ved anvendelse av en kalibreringskurve
dannet med fortynninger av en oppløselig rHuPH20-analyse arbeidsreferansestandard,
og prøveaktivitetsmålinger blir dannet i forhold til denne kalibreringskurven.
179
Fortynninger av prøven ble dannet i Enzyme Diluent Solution. Enzym Diluent Solution
ble dannet ved oppløsning av 33,0 + 0,05 mg av hydrolysert gelatin i 25,0 mL 50 mM
PIPES reaksjonsbuffer (140 mM NaCl, 50 mM PIPES, pH 5,5) og 25,0 mL av SWFI, og
5
fortynning av 0,2 mL 25 % buminatløsning inn i blandingen og vorteksbehandling i 30
sekunder. Dette ble utført i løpet av 2 timers bruk, og lagret på is helt til det var
nødvendig. Prøvene ble fortynnet til omtrent 1-2 U/mL. Generelt overskred den
maksimale fortynningen pr. trinn ikke 1:100, og den opprinnelige prøvestørrelsen for
første fortynning var ikke mindre enn 20 PL. De minimale prøvevolumer nødvendig for
10
å utføre analysen var: I-prosessprøver, FPLC-fraksjoner: 80 PL;
vevskultursupernatanter: 1 mL; konsentrert materiale 80 PL; renset eller endelig trinn
materiale: 80 PL. Fortynninger ble dannet i triplikat i en lav proteinbinding 96-brønn
plate, og 30 PL av hver fortynning ble overført til Optilux svart/klar bunnplater (BD
BioSciences).
15
Fortynninger av kjent oppløselig rHuPH20 med en konsentrasjon på 2,5 U/mL ble
dannet i enzymfortynningsløsning for å danne en standardkurve, og ble tilsatt til
Optilux-platen i triplikat. Fortynningene inkluderte 0 U/mL, 0,25 U/mL, 0,5 U/mL, 1,0
U/mL, 1,5 U/mL, 2,0 U/mL, og 2,5 U/mL. “Reagensblank” brønner som inneholdt 60
20
PL enzymfortynningsløsning ble inkludert i platen som en negativ kontroll. Platen ble
deretter tildekket, og varmet på en varmeblokk i 5 minutter ved 37oC. Dekket ble
fjernet, og platen ble ristet i 10 sekunder. Etter ristingen ble platen returnert til
varmeblokken, og MULTIDROP 384 Liquid Handling Device ble primet med varm 0,25
mg/mL natriumhyaluronatløsning (dannet ved oppløsning av 100 mg
25
natriumhyaluronat (LifeCore Biomedical) i 20,0 mL SWFI. Dette ble blandet ved
forsiktig rotering og/eller risting ved 2-8oC i 2-4 timer, eller helt til det var fullstendig
oppløst). Reaksjonsplaten ble overført til MULTIDROP 384, og reaksjonen ble initiert
ved pressing av startnøkkelen for å dispensere 30 PL natriumhyaluronat inn i hver
brønn. Platen ble deretter fjernet fra MULTIDROP 384, og ristet i 10 sekunder før den
30
ble overført til en varmeblokk med erstatning av platedekket. Platen ble inkubert ved
37oC i 10 minutter.
MULTIDROP 384 ble dannet for å stoppe reaksjonen ved priming av maskinen med
serum arbeidsløsning og skifte av voluminnstillingen til 240 PL. (25 mL
35
serumstokkløsning [1 volum av hesteserum (Sigma) ble fortynnet med 9 volumer 500
mM acetatbufferløsning, og pH ble justert til 3,1 med saltsyre] i 75 mL 500 mM
acetatbufferløsning). Platen ble fjernet fra varmeblokken og plassert på MULTIDROP
180
384 og 250 PL av serum arbeidsløsningen ble dispensert inn i brønnene. Platen ble
fjernet og ristet på en plateleser i 10 sekunder. Etter ytterligere 15 minutter ble
turbiditeten av prøvene målt ved 640 nM, og hyaluronidaseaktiviteten (i U/mL) av
hver prøve ble bestemt ved tilpassing til standardkurven.
5
Spesifikk aktivitet (enheter/mg) ble beregnet ved deling av hyaluronidaseaktiviteten
(U/ml) med proteinkonsentrasjonen (mg/mL).
Eksempel 4
10
Produksjon og rensing av Gen1 human sPH20
A. 5 L bioreaktorprosess
En beholder av 3D35M ble tint og ekspandert fra risteflaskene gjennom 1 L
spinnerflasker i CD-CHO-media (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) supplementert med 100
15
nM metotreksat og GlutaMAXTM-1 (Invitrogen). Cellene ble overført fra spinnerflasker
til en 5 L bioreaktor (Braun) med en inokuleringstetthet på 4 x 105 levedyktige celler
pr. mL. Parameterne var temperatur setpoint 37oC, pH 7,2 (utgangs setpoint) med
oppløst oksygen setpoint 25 % og et luftlag av 0-100 cc/min. Ved 168 timer ble 250
mL Feed #1 medium (CD CHO med 50 g/L glukose) tilsatt. Ved 216 timer, ble 250 mL
20
Feed #2 medium (CD CHO med 50 g/L glukose og 10 mM natriumbutyrat) tilsatt, og
ved 264 timer ble 250 mL Feed #2 medium tilsatt. Denne prosessen resulterte i en
endelig produktivitet på 1600 enheter pr. mL med en maksimal celletettet på 6 x 106
celler/mL. Addisjon av natriumbutyrat var for å dramatisk øke produksjonen av
oppløselig rHuPH20 i den endelige produksjonsfasen.
25
Kondisjonert media fra 3D35M-klonen ble klargjort ved dybdefiltrering og tangential
strøm diafiltrering inn i 10 mM HEPES pH 7,0. Oppløselig rHuPH20 ble deretter renset
ved sekvensiell kromatografi på Q-sefarose (Pharmacia) ionebytte, fenylsefarose
(Pharmacia) hydrofob interaksjonskromatografi, fenylboronat (Prometix) og
30
hydroksapatittkromatografi (Biorad, Richmond, CA).
Oppløselig rHuPH20 bundet til Q-sefarose og fortynnet med 400 mM NaCl i samme
buffer. Eluatet ble fortynnet med 2M ammoniumsulfat til en sluttkonsentrasjon på 500
mM ammoniumsulfat og sendt gjennom en fenylsefarose (lav sub) kolonne, etterfulgt
35
av binding under de samme betingelsene til en fenylboronatharpiks. Oppløselig
rHuPH20 ble fortynnet fra fenylsefaroseharpiksen i HEPES pH 6,9 etter vasking ved pH
9,0 i 50 mM bicin uten ammoniumsulfat. Eluatet ble applisert på en
181
keramikkhydroksyapatittharpiks ved pH 6,9 i 5 mM kaliumfosfat og 1 mM CaCl2 og
fortynnet med 80 mM kaliumfosfat, pH 7,4 med 0,1 mM CaCl2.
Den resulterende rensede oppløselige rHuPH20 hadde en spesifikk aktivitet i
5
overskudd av 65000 USP enheter/mg protein ved mikroturbiditetsanalysen (eksempel
3) ved anvendelse av USP-referansestandarden. Renset sPH20 eluerte som en enkelt
topp fra 24 til 26 minutter fra en Pharmacia 5RPC styrendivinylbenzenkolonne med en
gradient mellom 0,1 % TFA/H2O og 0,1 % TFA/90 % acetonitril/10 % H2O, og ble
oppløst som et enkelt brett 61 kDa-bånd ved SDS elektroforese som ble redusert til et
10
skarpt 51 kDa bånd ved behandling med PNGASE-F. N-terminal
aminosyresekvensering viste at lederpeptidet var blitt effektivt fjernet.
B. Oppstrøms cellekulturekspansjonsprosess inn i 100 L
bioreaktorcellekultur
15
En oppskallert prosess ble anvendt for å separat rense oppløselig rHuPH20 fra fire
forskjellige beholdere av 3D35M-celle for å produsere 4 separate batcher av sHuPH20,
HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C og HUA0420C. Hver beholder ble separat
ekspandert og dyrket gjennom en 125 L bioreaktor, og deretter renset ved anvendelse
av kolonnekromatografi. Prøver ble tatt i løpet av prosessen for å vurdere slike
20
parametere som enzymutbytte. Beskrivelse av prosessen angitt nedenfor angir
representative spesifikasjoner for slike ting som bioreaktorstart og fôrmediavolumer,
overføringscelletettheter og vask og elueringsvolumer. De nøyaktige tallene varierer
noe med hver batch, og er beskrevet i tabellene 24 til 30.
25
Fire beholdere med 3D35M-celler ble tint i et 37oC vannbad, CD CHO-inneholdende
100 nM metotreksat og 40 mL/L GlutaMAX ble tilsatt, og cellene ble sentrifugert.
Cellene ble resuspendert i en 125 mL risteflaske med 20 mL friskt media, og plassert i
en 37oC, 7 % CO2-inkubator. Cellene ble utvidet til 40 mL i en 125 mL risteflaske. Når
celletettheten nådde 1,5-2,5 x 106 celler/mL, ble kultiren utvidet i en 125 mL
30
spinneflaske i et 100 mL kulturvolum. Flasken ble inkubert ved 37oC, 7 % CO2. Når
celletettheten nådde 1,5-2,5 x 106 celler/mL, ble kulturen ekspandert inn i en 250 mL
spinneflaske i 200 mL kulturvolum, og flasken ble inkubert ved 37oC, 7 % CO2. Når
celletettheten nådde 1,5-2,5 x 106 celler/mL, ble kultiren ekspandert i en 1 L
spinneflaske i 800 mL kulturvolum, og inkubert ved 37oC, 7 % CO2. Når celletettheten
35
nådde 1,5-2,5 x 106 celler/mL, ble kulturen ekspandert inn i en 6 L spinneflaske i 5 L
kulturvolum og inkubert ved 37oC, 7 % CO2. Når celletettheten nådde 1,5-2,5 x 106
182
celler/mL, ble kultiren ekspandert inn i en 36 L spinneflaske i 20 L kulturvolum, og
inkubert ved 37oC, 7 % CO2.
En 125 L reaktor ble sterilisert med 121oC, 20 PSI og 65 L CD CHO-media ble tilsatt.
5
Før bruk ble reaktoren sjekket for kontaminasjon. Når celletettheten i 36 L
spinneflaskene nådde 1,8-2,5 x 106 celler/mL, ble 20 L cellekultur overført fra 36 L
spinneflaskene til 125 L bioreaktor (Braun), som resulterte i et sluttvolum på 85 L, og
en utsåingstetthet på omtrent 4 x 105 celler/mL. Parameterne var
temperatursettpunkter, 37oC; pH: 7,2; oppløst oksygen: 25 % + 10 %;
10
kompressorturtall 50 rpm; kartrykk 3 psi; luftspredning 1L/min.; luftbelegg: 1 L/min.
Reaktoren ble tatt prøve av daglig for celletellinger, pH-verifisering, mediaanalyse,
proteinproduksjon og retensjon. Næringsmiddeltilførsler ble tilsatt i løpet av kjøringen.
På dag 6 ble 3,4 L fôr #1 medium (CD CHO + 50 g/L glukose + 40 mL/L GlutaMAXTM1) tilsatt, og kulturtemperaturen ble endret til 36,5oC. På dag 9 ble 3,5 L f^r #2 (CD
15
CHO + 50 g/L glukose + 40 mL/L GlutaMAXTM-1 + 1,1 g/L natriumbutyrat) tilsatt, og
kulturtemperaturen ble endret til 36oC. På dag 11 ble 3,7 L fôr #3 (CD CHO + 50 g/L
glukose + 40 mL/L GlutaMAXTM-1 + 1,1 g/L natriumbutyrat) tilsatt, og
kulturtemperaturen ble endret til 35,5oC. Reaktoren ble høstet etter 14 dager, eller
når levedyktigheten til cellene ble holdt under 50 %. Prosessen resulterte i produksjon
20
av oppløselig rHuPH20 med en enzymatisk aktivitet på 1600 enheter/ml med en
maksimal celletetthet på 8 millioner celler/mL. Ved høstingen ble det tatt prøve av
kulturen for mykoplasma, bioburden, endotoksin og virus in vitro og in vivo,
transmisjonselektronmikroskopi (TEM) for virale partikler og enzymaktivitet.
25
Den ett hundre liter bioreaktor cellekulturen som ble høstet, ble filtrert gjennom en
serie engangskapselfiltre som har et polyetersulfonmedium (Sartorius): først gjennom
en 8,0 Pm dyp kapsel, en 0,65 Pm dyp kapsel, en 0,22 Pm kapsel, og til slutt gjennom
et 0,22 Pm Sartopore 2000 cm2 filter, og inn i en 100 L steril lagringsbagg. Kulturen
ble konsentrert 10x ved anvendelse av to TFF med spiralpolyetersulfon 30 kDa MWCO-
30
filtre (Millipore), etterfulgt av en 6x bufferutveksling med 10 mM HEPES, 25 mM
Na2SO4, pH 7,0 inntil et 0,22 Pm sluttfilter inn i en 20 L steril lagringsbagg. Tabell 22
tilveiebringer registreringsdata relatert til cellekultur, høsting, konsentrasjon og
bufferutvekslingstrinn.
35
Tabell 22. Registrering av data for cellekultur, høsting, konsentrasjon og
bufferutvekslingstrinn
Parameter
HUA0406C
HUA04010C
HUA0415C
HUA0420C
183
Tid fra tining til inokulat
21
19
17
18
0,45
0,33
0,44
0,46
29,8
27,3
29,2
23,5
5,65
8,70
6,07
9,70
Høstelevedyktighet (%)
41
48
41
41
Høstetiter (U/ml)
1964
1670
991
1319
Tid i 100-L bioreaktor
13
13
12
13
Klargjort høstevolum (mL)
81800
93300
91800
89100
Klargjort høsteenzym-
2385
1768
1039
1425
22954
17091
8561
17785
15829
11649
9915
8679
21550
10882
9471
8527
10699
13578
12727
20500
0,87
0,96
1,32
1,4
100 L bioreaktor (dager)
100 L inokulasjonstetthet
6
(x10 celler/mL
Doblingstid i logaritmisk
vekst (t)
Maks. celletetthet (x 1006
celler/mL)
(dager)
analyse (U/mL)
Konsentrat enzymanalyse
(U/mL)
Buffervekslingskonsentrat
enzymanalyse (U/mL)
Filtrert bufferutvekslingskonsentrat enzymanalyse
(U/mL)
Bufferutvekslingskonsentratvolum (mL)
Forhold enzymenheter
konsentrasjon/høsting
En Q-sefarose (Pharmacia) ioneutvekslingsvolum (3 L harpiks, høyde = 20 cm,
diameter = 14 cm) ble dannet. Vaskeprøvene ble samlet for en bestemmelse av pH,
5
ledningsevne og endotoksin (LAL) analyse. Kolonnen ble ekvilibrert med 5
kolonnevolumer av 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7,5. Det konsentrerte, diafiltrerte
høstematerialet ble applisert på Q-kolonnen ved en strømningsrate på 100 cm/t.
Kolonnen ble vasket med 5 kolonnevolum 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7,5 og 10
mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,0. Proteinet ble eluert med 10 mM HEPES, 400 mM
10
NaCl, pH 7,0, og filtrert gjennom et 0,22 Pm sluttfilter inn i en steril bagg.
184
Fenylsefarose (Pharmacia) hydrofob interaksjonskromatografi ble deretter utført. En
fenylsefarose (PS) kolonne (9,1 L harpiks, høyde = 29 cm, diameter = 20 cm) ble
dannet. Kolonnen ble ekvilibrert med 5 kolonnevolum 5 mM kaliumfosfat, 0,5 M
ammoniumsulfat, 0,1 mM CaCl2, pH 7,0. Proteineluatet fra ovenfor ble supplementert
5
med 2M ammoniumsulfat, 1 M kaliumfosfat, og 1 M CaCl2 stamløsninger til
sluttkonsentrasjoner på henholdsvis 5 mM, 0,5 M og 0,1 mM. Proteinet ble applisert
på PS-kolonnen med en strømningsrate på 100 cm/t. 5 mM kaliumfosfat, 0,5 M
ammoniumsulfat, og 0,1 mM CaCl2 pH 7,0 ble tilsatt ved 100 cm/t.
Gjennomstrømningen ble ført gjennom et 0,22 Pm sluttfilter inn i en steril bagg.
10
PS-renset protein var den applisert på en aminofenylboronatkolonne (ProMedics) (6,3
L harpiks, høyde = 20 cm, diameter = 20 cm) som var blitt ekvilibrert med 5
kolonnevolum 5 mM kaliumfosfat, 0,5 M ammoniumsulfat. Proteinet ble sendt
gjennom kolonnen ved en strømningsrate på 100 cm/t, og kolonnen ble vasket med 5
15
mM kaliumfosfat, 0,5 M ammoniumsulfat, pH 7,0. Kolonnen ble deretter vasket med
20 mM bicin, 100 mM NaCl, pH 9,0, og proteinet eluert med 50 mM HEPES, 100 mM
NaCl pH 6,9, gjennom et sterilt filter, og inn i en 20 L steril bagg. Eluatet ble testet for
biobelastning, proteinkonsentrasjon og enzymaktivitet.
20
En hydroksyapatitt (HAP) kolonne (BioRad) (1,6 L harpiks, høyde = 10 cm, diameter
= 14 cm) ble ekvilibrert med 5 mM kaliumfosfat, 100 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2 pH 7,0.
Vaskeprøvene ble samlet og testet for pH, ledningsevne og endotoksin (LAL-analyse).
Aminofenylboronat renset protein ble supplementert med kaliumfosfat og CaCl2 for å
tilveiebringe sluttkonsentrasjoner på 5 mM kaliumfosfat og 0,1 mM CaCl2 og applisert
25
på HAP-kolonnen med en strømningsrate på 100 cm/t. Kolonnen ble vasket med 5 mM
kaliumfosfat pH 7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2, deretter 10 mM kaliumfosfat pH
7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2 pH. Proteinet ble eluert med 70 mM kaliumfosfat pH
7,0, og filtrert gjennom et 0,22 Pm filter inn i en 5 L steril lagringsbagg. Eluatet ble
testet for biobelastning, proteinkonsentrasjon, og enzymaktivitet.
30
HAP-renset protein ble deretter pumpet gjennom et 20 nM viralt fjerningsfilter via en
trykktank. Proteinet ble tilsatt til DV20-trykktanken, og filter (Pall Corporation), sendt
gjennom et Ultipor DV20-filter med 20 nm porer (Pall Corporation) inn i en steril 20 L
lagringsbagg. Filtratet ble testet for proteinkonsentrasjon, enzymaktivitet,
35
oligosakkarid, monosakkarid og sialinsyreprofiling, og prosessrelaterte urenheter.
Proteinet i filtratet ble deretter konsentrert til 1 mg/ml ved anvendelse av et 10 kD
molekylvektavkutt (MWCO) Sartocon Slice tangentielt strømningsfiltrerings (TFF)
185
system (Sartorius). Filteret ble først dannet ved vasking med en
HEPES/saltvannsløsning (10 mM HEPES, 130 mM NaCl, pH 7,0), og permeatet ble tatt
prøver av for pH og ledningsevne. Etter konsentrasjon ble det konsentrerte proteinet
tatt prøve av og testet for proteinkonsentrasjon og enzymaktivitet. En 6x bufret
5
bufferutveksling ble utført på det konsentrerte proteinet inn i den endelige bufferen:
10 mM HEPES, 130 mM NaCl, pH 7,0. Det konsentrerte proteinet ble sendt igjennom
et 0,22 Pm filter inn i en 20 L steril lagringsbagg. Proteinet ble tatt prøve av og testet
for proteinkonsentrasjon, enzymaktivitet, frie sulfhydrylgrupper, oligosakkaridprofiling
og osmolaritet.
10
Tabellene 23 og 29 tilveiebringer registreringsdata som er relatert til hver av
rensingstrinnene beskrevet ovenfor, for hver 3D35M cellemasse.
Tabell 23. Q-sefarosekolonnedata
Parameter
HUA0406C
HUA0410C
HUA0415C
HUA0420C
Appliseringsvolum (mL)
10647
13524
12852
20418
Belastningsvolum/harpiks
3,1
4,9
4,5
7,3
Kolonnevolum (mL)
2770
3840
2850
2880
Eluatvolum (mL)
6108
5923
5759
6284
Proteinkons. av eluat
2,8
3,05
2,80
2,86
Eluatenzymanalyse (U/mL)
24493
26683
18321
21052
Enzymutbytte (%)
65
107
87
76
volumforhold
(mg/mL)
15
Tabell 24. Fenylsefarosekolonnedata
Parameter
HUA0406C
HUA0410C
HUA0415C
HUA0420C
Volum før stokk
5670
5015
5694
6251
Belastningsvolum (mL)
7599
6693
7631
8360
Kolonnevolum (mL)
9106
9420
9340
9420
Belastningsvolum/harpiks
0,8
0,71
0,82
0,89
Eluatvolum (mL)
16144
18010
16960
17328
Proteinkons. av eluat
0,4
0,33
0,33
0,38
oppløsningstilsetning (mL)
volumforhold
(mg/mL)
186
Eluatenzymanalyse (U/mL)
8806
6585
4472
7509
Proteinutbytte (%)
41
40
36
37
Enzymutbytte (%)
102
88
82
96
Tabell 25. Aminofenylboronatkolonnedata
Parameter
HUA0406C
HUA0410C
HUA0415C
HUA0420C
Belastningsvolum (mL)
16136
17958
16931
17884
Belastningsvolum/harpiks
2,99
3,15
3,08
2,98
Kolonnevolum (mL)
5400
5700
5500
5300
Eluatvolum (mL)
17595
22084
20686
19145
Proteinkons. av eluat
0,0
0,03
0,03
0,04
Ikke testet
0,03
0,00
0,04
4050
2410
1523
4721
Proteinutbytte (%)
0
11
11
12
Enzymutbytte (%)
Ikke
41
40
69
volumforhold
(mg/mL)
Proteinkons. av filtrert
eluat (mg/mL)
Eluat enzymanalyse
(U/mL)
bestemt
5
Tabell 26. Hydroksyapatittkolonnedata
Parameter
HUA0406C
HUA0410C
HUA0415C
HUA0420C
Volum før stokkløsnings-
16345
20799
20640
19103
10,95
13,58
14,19
12,81
Kolonnevolum (mL)
1500
1540
1462
1500
Lastingsvolum (mL)
16429
20917
20746
19213
Eluatvolum (mL)
4100
2415
1936
2419
Proteinkons. av eluat
Ikke testet
0,24
0,17
0,23
NA
NA
0,17
NA
14051
29089
20424
29826
tilsetning (mL)
Appliseringsvolum/harpiks
volumforhold
(mg/mL)
Proteinkons. av filtrert
eluat (mg/mL)
Eluatenzymanalyse (U/mL)
187
Proteinutbytte (%)
Ikke testet
93
53
73
Enzymutbytte (%)
87
118
140
104
Tabell 27. DV20 filtreringsdata
Parameter
HUA0406C
HUA0410C
HUA0415C
HUA0420C
Startvolum (mL)
4077
2233
1917
2419
Filtratvolum (mL)
4602
3334
2963
3504
Proteinkons. av filtrat
0,1
NA
0,09
NA
NA
0,15
0,09
0,16
Ikke testet
93
82
101
(mg/mL)
Proteinkons. av filtrert
eluat (mg/mL)
Proteinutbytte (%)
5
Tabell 28. Endelig konsentrasjonsdata
Parameter
HUA0406C
HUA0410C
HUA0415C
HUA0420C
Startvolum (mL)
4575
3298
2963
3492
Konsentratvolum (mL)
562
407
237
316
Proteinkons. av konsentrat
0,9
1,24
1,16
1,73
111
102
103
98
(mg/mL)
Proteinutbytte (%)
Tabell 29. Bufferutveksling til endelig formuleringsdata
Parameter
HUA0406C
HUA0410C
HUA0415C
HUA0420C
Startvolum (mL)
562
407
237
316
Endelig volumbuffer
594
516
310
554
1,00
0,97
0,98
1,00
0,95
0,92
0,95
1,02
118
99
110
101
utvekslingskonsentrat
(mL)
Proteinkons. av konsentrat
(mg/mL)
Proteinkons. av filtrert
konsentrat (mg/mL)
Proteinutbytte (%)
10
188
Det rensede og konsentrerte oppløselige rHuPH20-proteinet ble aseptisk fylt inn i
sterile beholdere med 5 mL og 1 mL fyllvolumer. Proteinet ble sendt igjennom et 0,22
Pm filter til en operatorkontrollert pumpe som ble anvendt for å fylle beholderne ved
anvendelse av en gravimetrisk registrering. Beholderne ble lukket med lokk, og
5
forsikret med krympede lokk. De lukkede beholderne ble inspisert visuelt for
fremmedpartikler, og deretter merket. Etter merkingen ble beholderne flash-frosset
ved nedsenking i flytende nitrogen for ikke lenger enn 1 minutt, og lagret ved <-15o (20 + 5o)
10
Eksempel 5
Produksjon av Gen2-celler inneholdende oppløselig human PH20 (rHuPH20)
Gen1 3D35M-cellelinje beskrevet i eksempel 2 ble tilpasset til høyere
metotreksatnivåer for å produsere generasjon 2 (Gen2) kloner. 3D35M-cellene ble
utsådd fra etablerte metotreksatinneholdende kulturer inn i CD CHO-medium
15
inneholdende 4 mM GlutaMAX-1TM og 1,0 PM metotreksat. Cellene ble tilpasset til et
høyere metotreksatnivå ved dyrking og føring av disse 9 ganger over en periode på 46
dager i en 37oC, 7 % CO2 fuktinkubator. Den amplifiserte populasjonen av cellene ble
klonet ut ved begrenset fortynning i 96-brønn vevskulturplater inneholdende medium
med 2,0 PM metotreksat. Etter omtrent 4 uker ble kloner identifisert, og klon 3E10B
20
ble valgt for ekspansjon. 3E10B-celler ble dyrket i CD CHO-medium inneholdende 4
mM GlutaMAX-1TM og 2,0 PM metotreksat i 20 føringer. En mastercellebank (MCB) av
3E10B-cellelinjen ble dannet og frooset og anvendt i påfølgende studier.
Amplifikasjon av cellelinjen fortsatte ved dyrking av 3E10B-cellene i CD CHO-medium
25
inneholdende 4 mM GlutaMAX-1TM og 4,0 PM metotreksat. Etter den 12. føringen ble
cellene frosset i beholdere som en forskningscellebank (RCB). En beholder av RCB ble
tint og dyrket i medium inneholdende 8,0 PM metotreksat. Etter 5 dager ble
metotreksatkonsentrasjon i medium forøket til 16,0 PM, deretter 20,0 PM 18 dager
senere. Cellene fra den 8. føringen i medium inneholdende 20,0 PM metotreksat ble
30
klonet ut ved begrenset fortynning i 96-brønn vevskulturplater inneholdende CD CHOmedium inneholdende 4 mM GlutaMAX-1TM og 20,0 PM metotreksat. Kloner ble
identifisert 5-6 uker senere, og klon 2B2 ble valgt for ekspansjon i medium
inneholdende 20,0 PM metotreksat. Etter 11. føring ble 2B2-cellene frosset i beholdere
som en forskningscellebank (RCB).
35
De resulterende 2B2-cellene er dihydrofolatreduktasemanglende (dhfr-) DG44 CHOceller som uttrykker oppløselig rekombinant human PH20 (rHuPH20). Det oppløselige
189
PH20 er tilstede i 2B2-cellene i et kopiantall på omtrent 206 koper/celle. Southern blot
analyse av Spe I- og BamH I/Hind III-spaltet genomisk 2B2-celle DNA ved anvendelse
av en rHuPH20-spesifikk probe viste følgende restriksjonsspaltningsprofil: ett
hovedhybridiseringsbånd ved a7,7 kb og fire mindre hybridiseringsbånd (a13,9, a6,6,
5
a5,7 og a4,6 kb) med DNA spaltet med Spe I; ett hovedhybridiseringsbånd på a5,0 kb,
og to mindre hybridiseringsbånd (a13,9 og a6,5 kb) med DNA spaltet med Xba I; og
ett enkelt hybridiseringsbånd på a 1,4 kb observert ved anvendelse av 2B2 DNA
spaltet med BamH I/Hind III. Sekvensanalyse av mRNA-transkriptet indikerte at
oppnådd cDNA (SEKV. ID nr. 56) var identisk med referansesekvnsen (SEKV. ID nr.
10
49) med unntakelse av én baseparforskjell i posisjon 1131, som ble observert å være
et tymidin (T) istedenfor forventet cytosin (C). Dette er en stille mutasjon, uten effekt
på aminosyresekvensen.
Eksempel 6
15
A. Produksjon av Gen2-oppløselig rHuPH20 i 300 L bioreaktorcellekultur
En beholder av HZ24-2B2 ble tint og ekspandert fra risteflasker gjennom 36 L
spinneflasker i CD-CHO-media (Invitrogen, Carlsbad, CA) supplementert med 20 PM
metotreksat og GlutaMAX-1TM (Invitrogen). Forklart i korte trekk, ble beholderen av
cellene tint i et 37oC vannbad, media ble tilsatt, og cellene ble sentrifugert. Cellene ble
20
resuspendert i en 125 mL risteflaske med 20 mL friskt media, og plassert i en 37oC, 7
% CO2-inkubator. Cellene ble ekspandert opptil 40 mL i 125 mL risteflaske. Når
celletettheten nådde mer enn 1,5 x 106 celle/mL, ble kulturen ekspandert inn i en 125
mL spinneflaske i 100 mL kulturvolum. Flasken ble inkubert ved 37oC, 7 % CO2. Når
celletettheten nådde mer enn 1,5 x 106 celler/mL, ble kulturen ekspandert inn i en 250
25
mL spinneflaske i 200 mL kulturvolum, og flasken ble inkubert ved 37oC, 7 % CO2. Når
celletettheten nådde høyere enn 1,5 x 106 celler/mL, ble kultiren ekspandert inn i en 1
L spinneflaske i 800 mL kulturvolum, og inkubert ved 37oC, 7 % CO2. Når
celletettheten nådde mer enn 1,5 x 106 celler/mL, ble kulturen ekspandert i en 6 L
spinneflaske i 500 mL kulturvolum og inkubert ved 37oC, 7 % CO2. Når celletettheten
30
var høyere enn 1,5 x 106 celler/mL ble kulturen ekspandert inn i en 36 L spinneflaske
i 32 L kulturvolum, og inkubert ved 37oC, 7 % CO2.
En 400 L reaktor ble sterilisert, og 230 mL CD-CHO-medium ble tilsatt. Før bruk ble
eraktoren undersøkt for kontaminasjon. Omtrent 30 L celler ble overført fra 36 L
35
spinneflasker til 400 L bioreaktor (Braun) ved en inokulasjonstetthet på 4,0 x 105
levedyktige celler pr. mL, og et totalt volum på 260 L. Parametere var
temperatursettpunkt, 37oC, Impeller Speed 40-55 RPM; beholdertrykk: 3 psi;
190
luftspyling 0,5-1,5 L/min.; luftoverlegg: 3 L/min. Det ble tatt prøver av reaktoren
daglig for celletellinger, pH-verifikasjon, mediumanalyse, proteinproduksjon og
retensjon. I løpet av kjøringen ble næringsmiddeltilførsler også tilsatt. Etter 120 t (dag
5) ble 10,4 L fôr #1 medium (4x CD-CHO + 33 g/L glukose + 160 mL/L Glutamax-1TM
5
0 83 mL/L yeastolate + 33 mg/L rHuInsulin) tilsatt. Etter 168 timer (dag 7), ble 10,8 L
fôr #2 (2x CD-CHO + 33 g/L glukose + 80 mL/L Glutamax-1TM + 167 mL/L yeastolate
+ 0,92 g/L natriumbutyrat) tilsatt, og kulturtemperaturen ble forandret til 36,5oC.
Etter 216 timer (dag 9) ble 10,8 L fôr #3 (1x CD-CHO + 50 g/L glukose + 50 mL/L
Glutamax-1TM + 250 mL/L yeastolate + 1,80 g/L natriumbutyrat) tilsatt, og
10
kulturtemperaturen ble endret til 36oC. Etter 264 timer (dag 11) ble 10,8 L fôr #4 (1x
CD-CHO + 33 g/L glukose + 33 mL/L Glutamax-1TM + 250 mL/L yeastolate + 0,92 g/L
natriumbutyrat) tilsatt, og kulturtemperaturen ble endret til 35,5oC. Tilsetning av
fôrmedium ble observert å dramatisk forøke produksjonen av oppløselig rHuPH20 i de
endelige trinnene av produksjonen. Reaktoren ble høstet etter 14 eller 15 dager, eller
15
når levedyktigheten til cellene falt under 40 %. Prosessen resulterte i en
sluttproduktivitet på 17000 enheter pr. ml, med en maksimal celletetthet på 12
millioner celler/mL. Ved høsting ble kulturen tatt prøve av for mykoplasma,
biobelastning, endotoksin og viral in vitro og in vivo, transmisjonselektronmikroskopi
(TEM) og enzymaktivitet.
20
Kulturen ble pumpet med en peristaltisk pumpe gjennom fire Millistak
filtreringssystemmoduler (Millipore) parallelt, hver inneholdende et lag av diatomejord
gradert til 4-8 Pm, og et lag av diatomejord gradert til 1,4-1,1 Pm, etterfulgt av en
cellulosemembran, deretter gjennom et andre enkelt Millistak filtreringssystem
25
(Millipore) inneholdende et lag av diatomejord gradert til 0,4-0,11 Pm, og et lag av
diatomejord gradert til <0,1 Pm, etterfulgt av en cellulosemembran, og deretter
gjennom et 0,22 Pm sluttfilter inn i en steril enkeltbruk fleksibel bagg med en 350 L
kapasitet. Det høstede cellekulturfluidet ble supplementert med 10 mM EDTA og 10
mM Tris til en pH på 7,5. Kulturen ble konsentrert 10x med en tangentiell
30
strømningsfiltrerings- (TFF) apparatur ved anvendelse av fire Sartoslice TFF 30 kDa
molekylvektavkutt (MWCO) polyetersulfon (PES) filter (Sartorius), etterfulgt av en 10x
bufferutveksling med 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7,5 inn i et 0,22 Pm sluttfilter
inn i en 50 L steril lagringsbagg.
35
Den konsentrerte, diafiltrerte høstingen ble inaktivert for virus. Før viral inaktivering,
ble en løsning av 10 % Triton X-100, 3 % tri (n-butyl) fosfat (TNBP) dannet.
191
Konsentrert, diafiltrert høstet materiale ble eksponert for 1 % Triton X-100, 0,3 %
TNBP i 1 time i en 36 L glassreaksjonsbeholder rett før rensing på Q-kolonnen.
B. Rensing av Gen2-oppløselig rHuPH20
5
En Q sefarose (Pharmacia) ionebyttekolonne (9 L harpiks, H = 29 cm, D = 20 cm) ble
dannet. Vaskeprøver ble samlet for bestemmelse av pH, ledningsevne og endotoksin
(LAL) analyse. Kolonnen ble ekvilibrert med 5 kolonnevolum 10 mM Tris, 20 mM
Na2SO4, pH 7,5. Etter viral inaktivering, ble det konsentrerte, diafiltrerte
høstematerialet applisert på en Q-kolonne med en strømningsrate på 100 cm/t.
10
Kolonnen ble vasket med 5 kolonnevolum 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7,5 og 10
mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,0. Proteinet ble eluert med 10 mM HEPES, 400 mM
NaCol, pH 7,0 inn i et 0,22 Pm sluttfilter inn i steril bagg. Eluatprøven ble testet for
biobelastning, proteinkonsentrasjon og hyaluronidaseaktivitet. En280
absorbansavlesning ble tatt på begynnelsen og slutten av utvekslingen.
15
Fenyl-sefarose (Pharmacia) hydrofob interaksjonskromatografi ble deretter utført. En
fenyl-sefarose (PS) kolonne (19-21 L harpiks, H = 29 cm, D = 30 cm) ble dannet.
Vaskingen ble oppsamlet og tatt prøve av for pH, ledningsevne og endotoksin (LALanalyse). Kolonnen ble ekvilibrert med 5 kolonnevolum av 5 mM kaliumfosfat, 0,5 M
20
ammoniumsulfat, 0,1 mM CaCl2, pH 7,0. Proteineluatet fra Q-sefarosekolonnen ble
supplementert med 2M ammoniumsulfat, 1 M kaliumfosfat, og 1M CaCl2 stamløsninger
for å tilveiebringe endelige konsentrasjoner på henholdsvis 5 mM, 0,5 M og 0,1 mM.
Proteinet ble applisert på PS-kolonnen ved en strømningsrate på 100 cm/t, og det som
rant gjennom kolonnen ble samlet. Kolonnen ble vasket med 5 mM kaliumfosfat, 0,5
25
M ammoniumsulfat og 0,1 mM CaCl2 pH7,0 ved 100 cm/t, og vaskingen ble tilsatt til
det oppsamlede gjennomstrømte materialet. Kombinert med kolonnevaskingen, ble
det gjennomstrømmende ført gjennom et 0,22 Pm sluttfilter inn i en steril bagg. Det
gjennomstrømmende ble tatt prøve av for biobelastning, proteinkonsentrasjon og
enzymaktivitet.
30
En aminofenylboronatkolonne (Prometics) ble dannet. Vasken ble samlet og tatt prøve
av for pH, ledningsevne og endotoksin (LAL-analyse). Kolonnen ble ekvilibrert med 5
kolonnevolum av 5 mM kaliumfosfat, 0,5 M ammoniumsulfat. PS-gjennomstrømningen
inneholdende renset protein ble applisert på aminofenylboronatkolonnen med en
35
strømningsrate på 100 cm/t. Kolonnen ble vasket med 5 mM kaliumfosfat, 0,5 M
ammoniumsulfat, pH 7,0. Kolonnen ble vasket med 20 mM bicin, 0,5 M
ammoniumsulfat, pH 9,0. Kolonnen ble vasket med 20 mM bicin, 100 mM
192
natriumklorid, pH 9,0. Proteinet ble eluert med 50 mM HEPES; 100 mM NaCl, pH 6,9,
og sendt gjennom et sterilt filter inn i en steril bagg. Den eluerte prøven ble testet for
biobelastning, proteinkonsentrasjon og enzymaktivitet.
5
Hydroksyapatitt (HAP) kolonnen (Biorad) ble dannet. Vasken ble samlet og testet for
pH, ledningsevne og endotoksin (LAL-analyse). Kolonnen ble ekvilibrert med 5 mM
kaliumfosfat, 100 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2, pH 7,0. Aminofenylboronat renset protein
ble supplementert til sluttkonsentrasjoner på 5 mM kaliumfosfat og 0,1 mM CaCl2 og
applisert på HAP-kolonnen ved en strømningsrate på 100 cm/t. Kolonnen ble vasket
10
med 5 mM kaliumfosfat, pH 7, 100 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2. Kolonnen ble deretter
vasket med 10 mM kaliumfosfat, pH 7, 100 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2. Proteinet ble
eluert med 70 mM kaliumfosfat, pH 7,0 og sendt gjennom et 0,22 Pm sterilt filter inn i
en steril bagg. Den eluerte prøven ble testet for biobelastning, proteinkonsentrasjon
og enzymaktivitet.
15
HAP-renset protein ble deretter sendt gjennom et viralt fjerningsfilter. Sterilisert
Virosart-filter (Sartorius) ble først dannet ved vasking med 2 L 70 mM kaliumfosfat,
pH 7,0. Før bruk ble den filtrerte bufferen tatt prøve av for pH og ledningsevne. HAPrenset protein ble pumpet via en peristaltisk pumpe gjennom et 20 nM viralt
20
fjerningsfilter. Det filtrerte proteinet i 70 mM kaliumfosfat, pH 7,0, ble sendt gjennom
et 0,22 Pm sluttfilter inn i en steril bagg. Den viralt filtrerte prøven ble testet for
proteinkonsentrasjon, enzymaktivitet, oligosakkarid, monosakkarid og
sialinsyreprofiling. Prøven ble også testet for prosessrelaterte urenheter.
25
Proteinet i filtratet ble deretter konsentrert til 10 mg/mL ved anvendelse av en 10 kD
molekylvektavkutt (MWCO) Sartocon Slice tangential flow filration (TFF) system
(Sartorius). Filteret ble først preparert ved vasking med 10 mM histidin, 130 mM NaCl,
pH 6,0, og permeatet ble tatt prøve av for pH og ledningsevne. Etter konsentrasjon
ble det konsentrerte proteinet tatt prøve av og testet for proteinkonsentrasjon og
30
enzymaktivitet. En 6x bufferutveksling ble utført på det konsentrerte proteinet inn i
den endelige bufferen: 10 mM histidin, 130 mM NaCl, pH 6,0. Etter bufferutvekslingen
ble det konsentrerte proteinet sendt gjennom et 0,22 Pm filter inn i en 20 L steril
lagringsbagg. Det ble tatt prøve av protein og testet for proteinkonsentrasjon,
enzymaktivitet, frie sulfhydrylgrupper, oligosakkaridprofiling og osmolaritet.
35
193
Det sterilfiltrerte bulkproteinet ble deretter aseptisk dispansert ved 20 mL inn i 30 mL
sterile teflonbeholdere (Nalgene). Beholderne ble deretter flashfrosset og lagret
ved -20 + 5oC.
5
C. Sammenlikning av produksjon og rensing av Gen1-oppløselig rHuPH20
og Gen2-oppløselig rHuPH20
Produksjonen og rensing av Gen2-oppløselig rHuPH20 i en 300 L bioreaktorcellekultur
inneholdt noen forandringer i protokollene sammenliknet med produksjon og rensing
Gen1-oppløselig rHuPH20 i en 100 L bioreaktorcellekultur (beskrevet i eksempel 4B).
10
Tabell 30 angir eksempelvise forskjeller, i tillegg til enkle oppskalleringsforandringer,
mellom metodene.
194
Tabell 30
Prosessforskjell
Gen1-oppløselig rHuPH20
Gen2 –oppløselig rHuPH20
Cellelinje
3D35M
2B2
Medium anvendt for å
Inneholder 0,10 PM
Inneholder 20 PM
utvide celleinokulum
metotreksat (0,45 mg/L)
metotreksat (9 mg/L)
Medium i 6 L kulturer
Inneholder 0,10 PM
Inneholder ikke
deretter
metotreksat
metotreksat
36 L spinneflaske
Ingen instrumentering
Utstyrt med instrumentering som registrerer og
kontrollerer pH, oppløst
20 L driftsvolum
oksygen, spyling og
overlagt gasstrømningsrate
32 L driftsvolum
Endelig driftsvolum i
Omtrent 100 L i en 125 L
Omtrent 300 L i en 400 L
bioreaktor
bioreaktor (opprinnelig
bioreaktor (opprinnelig
kulturvolum + 65 L)
kulturvolum + 260 L)
Ingen rHuInsulin
5,0 mg/L rHuInsulin
Skallert ved 4 % av bio-
Skallert ved 4 % av bio-
reaktorcellekulturvolum,
reaktorcellekulturvolum,
dvs. 3,4, 3,5 og 3,7 L,
dvs. 10,4, 10,8, 11,2 og
resulterende i et mål-
11,7 L, resulterende i et
bioreaktorvolum på a92 L
målbioreaktorvolum på
Kulturmedium i sluttbioreaktor
Medium fôrvolum
a303 L
Medium fôr
Fôr #1 medium: CD CHO
Fôr #2 medium: 4x CD
+ 50 g/L glukose + 8 mM
CHO + 33 g/L glucose +
TM
GlutaMAX -1
32 mM Glutamax + 16,6
g/L yeastolate + 33 mg/L
Fôr #2 (CD CHO + 50 g/L
rHuInsulin
glukose + 8 mM GlutaMAX
+ 1,1 g/L natriumbutyrat
Fôr #2: 2x CD CHO + 33
g/L glucose + 16 mM
Glutamax 0 33,4 g/L
195
Fôr #3: CD CHO + 50 g/L
Yeastolate + 0,92 g/L
glukose + 1,1 g/L
Natriumbutyrat
natriumbutyrat
Fôr #3: 1x CD CHO + 50
g/l glucose + 10 mM
Glutamax + 50 g/L
Yeastolate + 1,80 g/L
Natriumbutyrat
Fôr #4:: 1x CD CHO + 33
g/L glucose + 6,6 mM
Glutamax + 50 g/L
Yeastolate + 0,92 g/L
Natriumbutyrat
Filtrering av
Fire polyetersulfonfiltre
1. trinn – fire moduler
bioreaktorcellekultur
(8,0 Pm, 0,65 Pm, 0,22
parallelt, hver med et lag
Pm og 0,22 Pm) I serie
av diatomejord gradert til
4-8 Pm, og et lag av
diatomejord grader til 1,41,1 Pm, etterfulgt av en
cellulosemembran.
2. trinn – en modul
inneholdende et lag av
diatomejord gradert til
0,4-0,11 Pm og et lag av
diatomejord grader til
<0,1 Pm, etterfulgt av en
cellulosemembran
100 L lagringsbagg
3. trinn – 0,22 Pm
polyetersulfonfilter
300 L lagringsbagg
Høstet cellekultur blir
supplementert med 10 mM
EDTA, 10 mM Tris til en
pH på 7,5.
196
Konsentrering og buffer-
Konsentrert med 2 TFF
Konsentrert ved
utveksling før
med Millipore Spiral
anvendelse av fire
kromatografi
Polyethersulfone 30K
Sartorius Sartoslice TFF
MWCO-filter
30K MWCO-filter
Bufferutveksling
Bufferutveksling
konsentrat 6x med 10 mM
konsentrat 10x med 10
HEPES, 25 mM NaCl, pH
mM Tris, 20 mM Na2SO4,
7,0
pH 7,5.
20 L steril lagringsbagg
50 L steril lagringsbagg
Ingen
Viral inaktivering utført
Viral inaktivering før
kromatografi
ved tilsetning av 1 %
Triton X-100, 0,3 %
tributylfosfat, pH 7,5
1. rensingstrinn (Q-
Ingen absorbansavlesning
sefarose)
Viral filtrering etter
A280-målinger ved
begynnelse og slutt
Pall DV-20 filter (20 nm)
kromatografi
Sartorius Virosart filter (20
nm)
Konsentrering og buffer-
HEPES/saltvann pH 7,0
Histidin/saltvann, pH 6,0
utveksling etter
buffer
buffer
Protein konsentrert til 1
Protein konsentrert til 10
mg/ml
mg/ml
kromatografi
Eksempel 7
Bestemmelse av sialinsyre og monosakkaridinnhold
5
Sialinsyre og monosakkaridinnholdet til oppløselig rHuPH20 kan bli vurdert ved revers
fase væskekromatografi (RPLC) etter hydrolyse med trifluoreddiksyre. I ett eksempel
ble sialinsyre og monosakkaridinnholdet til renset hyaluronidase emne # HUB0701E
(1,2 mg/mL; produsert og renset vesentlig som beskrevet i eksempel 6) bestemt.
Forklart i korte trekk ble 100 Pg prøve hydrolysert med 40 % (v/v) trifluoreddiksyre
10
ved 100oC i fire timer i duplikat. Etter hydrolyse ble prøvene tørket og resuspendert i
300 PL vann. En 45 PL aliquot fra hver resuspendert prøve ble overført til et nytt rør
og nedtørket, og 10 PL av en 10 mg/mL natriumacetatløsning ble tilsatt til hver. De
frigjorte monosakkaridene ble fluorescensmerket ved tilsetning av 50 PL av en løsning
197
inneholdende 30 mg/mL 2-aminobenzosyre, 20 mg/mL natriumcyanoborhydrid,
omtrent 40 mg/mL natriumacetat, og 20 mg/mL borsyre i methanol. Blandingen ble
inkubert i 30 minutter ved 80oC i mørket. Detivitiseringsreaksjonen ble quenchet ved
tilsetning av 440 PL mobil fase A (0,2 % (v/v) n-butylamin, 0,5 % (v/v) fosforsyre, 1
5
% (v/v) tetrahydrofuran). En matriks uten vann ble også hydrolysert og derivitisert
som beskrevet for hyaluronidaseprøven som en negativ kontroll. De frigjorte
monosakkaridene ble separert ved RPLC ved anvendelse av en oktadecyl (C18) revers
fasekolonne (4,6 x 250 mm, 5 Pm partikkelstørrelse; J. T. Baker) og registrert ved
fluorescensdeteksjon (360 nm eksitasjon, 425 nm emisjon). Kvantifisering av
10
monosakkaridinnholdet ble utført ved sammenlikning av kromatogrammene for
hyaluronidaseprøven med kromatogrammene av monosakkaridstandardene inkludert
N-D-glukosamin (GlcN), N-D-galaktosamin (GalN), galaktose, fukose og mannose.
Tabell 31 presenterer det molare forholdet mellom hvert monosakkarid pr.
hyaluronidasemolekyl.
15
Tabell 31. Monosakkaridinnhold av oppløselig rHuPH20
Emne
Replikat
GlcN
GalN
Galaktose
Mannose
Fukose
HUB0701E
1
14,28
0,07*
6,19
25,28
2,69
2
13,66
0,08*
6,00
24,34
2,61
Gjennom-
13,97
0,08*
6,10
24,81
2,65
snitt
*GalN-resultater var under deteksjonsgrensen
Eksempel 8
20
C-terminal heterogeniitet til oppløselig rHuPH20 fra 3D35M og 2B2-celler
C-terminal sekvensering ble utført på to emner av sHuPH20 produsert og renset fra
3D35M-celler i 100 L bioreaktorvolum (emne HUA0505MA) og 2B2-celler i et 300 L
bioreaktorvolum (emne HUB0701EB). Emnene ble separat spaltet med endoproteinase
Asp-N, som spesifikt spalter peptidbindingene N-terminalt ved asparaginsyre og
25
cysteinsyre. Dette frigjør den C-terminale delen av oppløselig rHuPH20 ved
asparaginsyren i posisjon 431 av SEKV. ID nr. 4. De C-terminale fragmentene ble
separert og karakterisert for å bestemme sekvensen og hyppigheten av hver
populasjon i emne HUA0505MA og emne HUB0701EB.
30
Det ble observert at de oppløselige rHuPH20-prepareringene fra 3D35M-cellene og
2B2-cellene utviste heterogenisitet, og inneholdt polypeptider som var forskjellige i
forhold til hverandre i deres C-terminale sekvens (tabellene 27 og 28).
198
Heterogenisiteten er sannsynligvis resultatet av C-terminal spalting av uttrykt 447
aminosyrepolypeptid (SEKV. ID nr. 4) av peptidaser tilstede i cellekulturmediet eller
andre løsninger i løpet av produksjons- og rensingsprosessen. Polypeptidene i de
oppløselige rHuPH20-prepareringene har aminosyresekvenser som korresponderer
5
med aminosyrene 1-447, 1-446, 1-445, 1-444 og 1-443 av oppløselig rHuPH20sekvensen angitt i SEKV. ID nr. 4. Full aminosyresekvens av hver av disse
polypeptidene er angitt i SEKV. ID nr. 4 til 8). Som angitt i tabellene 32 og 33, er
hyppigheten av hvert polypeptid i oppløselig rHuPH20-prepareringene fra 3D35Mcellene og 2B2-cellene forskjellige.
10
Tabell 32. Analyse av C-terminale fragmenter fra emne HUA0505MA
Fragmen
Amino-
t
syreposi
Sekvens
Teor. M
Eksp.
Feil
masse
masse
DAFKLPPMETEEPQIF
2053,9
2054,4
0,4
Y (SEKV. ID nr. 57
7
2
5
DAFKLPPMETEEPQIF
1890,9
1891,2
0,3
(SEKV. ID nr. 58)
1
8
7
DAFKLPPMETEEPQI
1743,8
1744,1
0,3
(SEKV. ID nr. 59)
4
7
3
DAFKLPPMETEEPQ
1630,7
1631,0
0,3
(SEKV. ID nr. 60)
0
7
2
DAFKLPPMETEEP
1502,7
1502,9
0,2
(SEKV. ID nr. 61)
0
8
8
DAFKLPPMETEE
1405,6
ND
N/A
(SEKV. ID nr. 62)
4
Eluerings
Mengd
-tid
e
99,87
0,2 %
97,02
18,4 %
86,4
11,8 %
75,15
56,1 %
77,36
13,6 %
N/A
0,0 %
-sjon
(relativ
til SEKV.
ID nr. 4)
D28a
D28b
D28c
D28d
D28e
D28f
431-447
431-446
431-445
431-444
431-443
431-442
Tabell 33. Analyse av C-terminale fragmenter fra emne HUB0701EB
Fragmen
Amino-
t
syreposi
-sjon
(relativ
til SEKV.
ID nr. 4)
Sekvens
Teor. M
Eksp.
masse
masse
Feil
Eluerings
Mengd
-tid
e
199
D28a
D28b
D28c
D28d
D28e
D28f
431-447
431-446
431-445
431-444
431-443
431-442
DAFKLPPMETEEPQIF
2053,9
2054,4
0,4
Y (SEKV. ID nr. 57
7
2
5
DAFKLPPMETEEPQIF
1890,9
1891,3
0,4
(SEKV. ID nr. 58)
1
6
5
DAFKLPPMETEEPQI
1743,8
1744,2
0,4
(SEKV. ID nr. 59)
4
4
0
DAFKLPPMETEEPQ
1630,7
1631,1
0,3
(SEKV. ID nr. 60)
0
4
9
DAFKLPPMETEEP
1502,7
1503,0
0,3
(SEKV. ID nr. 61)
0
3
3
DAFKLPPMETEE
1405,6
ND
N/A
(SEKV. ID nr. 62)
4
99,89
1,9 %
96,92
46,7 %
85,98
16,7 %
73,9
27,8 %
77,02
6,9 %
N/A
0,0 %
Eksempel 9
Sammenlikning av dispersjonsaktiviteten til forskjellige
5
hyaluronandegraderende enzymer
Evnen som forskjellige hyaluronandegraderende enzymer har til å virke som et
dispersjonsmiddel ble vurdert in vivo. En dispersjonsanalyse i mus ble anvendt for å
vurdere evnen til forskjellige hyaluronandegraderende enzymer har til å virke som
dispersjonsmidler av trypan blå, og også vurdere evnen som enzymene har til å forøke
10
effektiviteten av koadministrert insulin i reduserende blodglukosenivåer.
Hyaluronandegraderende enzymer analysert inkluderer rHuPH20, pegylert PH20 (PEG
PH20), Hyal 1, Chondroitinase ABC, Chondroitinase AC og Streptomyces hyalurolyticus
lyase. Disse ble blandet med trypan blå og Humulin£ insulin i en nøytral buffer (10 mM
natriumfosfat, pH 7,4, 145,5 mM NaCl, 1 mg/ml humant serumalbumin) og levert for
15
å bedøve mus. Både området for dispersjon av trypan blå og blodglukosenivåer ble
deretter målt. Nøytral pH-buffer alene og Humulin£ insulin alene ble anvendt som en
negativ kontroll. Evnen som en lav pH-buffer (pH 4,5) har til å virke som et
dispersjonsmiddel ble også undersøkt.
20
Ni grupper av NCr nu/nu homozygote mus, omtrent 10 uker gamle, og med
kroppsvekt på 21-25 g, med 3 mus pr. gruppe, ble bedøvd med intraperitoneal
injeksjon av ketamin/xylazin (10:1 blanding i saltvann). Deretter ble musene
administrert 40 PL av et hyaluronandegraderende enzym og 5 enheter/mL Humulin£
insulin med 0,4 % trypan blå fargestoff ved intradermal injeksjon ved midtlinjen over
25
kaudalenden av ribbene. Kontrollgrupper administrert Humulin£ insulin alene, buffer
alene, eller buffer og Humulin£ insulin ble også inkludert. Gruppe 1 mus var den
200
negative kontrollen, og mottok trypan blå med en nøytral pH-buffer; gruppe 2 mus
mottok trypan blå med 5 enheter/mL Humulin£ insulin i en lav pH-buffer; gruppe 3
mus mottok trypan blå med 5 enheter/mL Humulin£ insulin og 10 enheter/mL
rHuPH20; gruppe 4 mus mottok trypan blå med 5 enheter/mL Humulin£ insulin og 10
5
enheter/mL PEG PH20 (dannet som beskrevet i eksempel 10 nedenfor); gruppe 5 mus
mottok trypan blå med 5 enheter/mL Humulin£ insulin og 10 enheter/mL Hyal 1;
gruppe 6 mus mottok trypan blå med 5 enheter/mL Humulin£ insulin og 10
enheter/mL Chondroitinase ABC (Associates of Cape Cpd, E. Falmouth, MA); gruppe 7
mus mottok trypan blå med 5 enheter/mL Humulin£ insulin og 1 enhet/mL
10
Chondroitinase AC (Associates of Cape Cod, E. Falmouth, MA); gruppe 8 mus mottok
trypan blå med 5 enheter/mL Humulin£ insulin og 100 enheter/mL Streptomyces
hyalurolyticus lyase (Calbiochem); gruppe 9 mus mottok trypan blå med 5 enheter/mL
Humulin£ insulin. Dispersjon av trypan blå fargestoffet ble deretter målt med en
kaliper ved 2,5, 5, 10, 15 og 20 minutter etter injeksjon.
15
Fargestoffdispersjonsområdet (mm2) ble beregnet ved multiplisering av den lengste
aksen M1 (lengde av fargestoffront) og M2 (vidden av fargestoffront) med ¼ S (M1M2
x ¼ S). Blodglukosenivåene ble målt ved anvendelse av et glukometer ved 0, 5, 10,
15 og 20 minutter.
20
1. Fargestoffdispersjon
Tabell 34 angir gjennomsnittlig fargestoffdispersjonsområde etter administrering av
hver av testgjenstandene. Trypan blå fargestoffet i nøytral pH-buffer og lav pH-buffer
utviste minimal spredning, idet dispersjonsområdet varierte fra et gjennomsnitt på
omtrent 36 mm2 ved 2,5 minutter etter injeksjon, til omtrent 51 mm2 ved 20 minutter
25
etter injeksjon. Når trypan blå fargestoffet ble blandet og levert med Humulin£ insulin,
Hyal 1, eller PEG PH20, var det ingen statistisk signifikant økning i dispersjonsområdet
sammenliknet med det observert når fargestoffet ble blandet kun med buffer. I
kontrast til dette, ble en signifikant økning i dispersjonen av fargestoffet observert når
blandet og levert med rHuPH20, Chondroitinase ABC, Chondroitinase AC eller
30
Streptomyces hyalurolyticus lyase. Det gjennomsnittlige dispersjonsområdet av trypan
blå fargestoff når blandet og levert med rHuPH20 var omtrent 45 mm2, 66 mm2, 80
mm2, 86 mm2 og 102 mm2 ved 2,5, 5, 10, 15 og 20 minutter injeksjon. Det
gjennomsnittlige dispersjonsområdet for trypan blå fargestoff når blandet og levert
med Chondroitinase AC var omtrent 76 mm2, 107 mm2, 107 mm2, 110 mm2 og 116
35
mm2 ved 2,5, 5, 10, 15 og 20 minutter injeksjon. Det gjennomsnittlige
dispersjonsområdet av trypan blå fargestoffet når blandet og levert med
Chondroitinase ABC var omtrent 57 mm2, 75 mm2, 79 mm2, 81 mm2 og 88 mm2 ved
201
2,5, 5, 10, 15 og 20 minutter injeksjon. Det gjennomsnittlige dispersjonsområdet av
trypan blå fargestoffet når blandet og levert med Sreptomyces hyalurolyticus lyase var
omtrent 74 mm2, 76 mm2, 101 mm2, 103 mm2 og 130 mm2 ved 2,5, 5, 10, 15 og 20
minutter injeksjon.
5
Tabell 34. Oppsummering av gruppegjennomsnitt av
fargestoffdispersjonsområde (mm2)
Gruppe
1
Fargestoffdispersjonsområder (mm2)
Testgjenstand
Nøytral pH-
2,5 min.
5 min.
10 min.
15 min.
20 min.
36,11
41,63
47,10
52,47
51,34
buffer
bærer/kontroll
2
Lav pH-buffer
33,34
34,47
41,88
44,91
51,18
3
PEG PH20 (10
37,28
47,08
52,40
54,94
58,17
44,58
66,02
79,46
86,24
101,90
31,53
36,27
39,60
46,41
48,21
56,85
75,06
78,60
81,44
87,85
75,67
106,56
106,49
110,43
115,82
73,97
75,58
101,03
102,69
129,56
38,22
43,94
50,76
52,49
58,41
U/mL)
4
rHuPH20 (10
U/ml)
5
Hyal 1 (10
U/mL)
6
Chondroitinase
ABC (10
U/mL)
7
Chondroitinase
AC (1 U/mL)
8
Strep lyase
(100 U/mL)
9
10
Humulin R
2. Blodglukosenivåer
Tabell 35 angir gjennomsnittlige blodglukosenivåer (mg/dL) etter administrering av
hver testgjenstand. Blodglukosenivåene i mus administrert fargestoff og kun buffer,
økte fra et gjennomsnitt på omtrent 212 mg/dL før injeksjon, til omtrent 332 mg/dL 5
minutter etter injeksjon. Deretter økte nivåene gradvis til omtrent 367 mg/dL 20
15
minutter etter injeksjon. Denne økningen av blodglukose i fravær av insulin skyldes en
velkjent effekt ved bedøvelsesmidler på blodglukose i gnagere (se f.eks. Saha et al.,
(2005) Exp. Biol. Med. 230:777-784). Når Humulin£ insulin ble administrert, økte
202
blodglukosenivåene litt til et gjennomsnitt på omtrent 292 mg/dL 5 minutter etter
injeksjon (fra et gjennomsnitt på omtrent 226 mg/dL før injeksjon) før fall til et
gjennomsnitt av omtrent 171 mg/dL, 122 mg/dL og 97 mg/dL 10, 15 og 20 minutter
etter injeksjon. Idet alle hyaluronandegraderende enzymer reduserte
5
blodglukosenivåene når administrert med Humulin£ insulin, reduserte koadministrering
av rHuPH20 PEG PH20, Chondroitinase ABC og Streptomyces hyalurolyticus lyase
nivåene hurtigere enn observert med kun Humulin£ insulin.
Tabell 35. Gruppegjennomsnitt oppsummering av blodglukosenivået (mg/dL)
Blodglukosenivå (mg/dL)
Gruppe
Testgjenstand
0 min.
5 min.
10 min.
15 min.
20 min.
1
Nøytral pH-
212,00
332,00
344,00
361,33
367,67
buffer
bærer/kontroll
2
Lav pH-buffer
196,67
259,67
249,33
231,33
220,67
3
PEG PH20 (10
170,00
196,67
110,00
68,33
46,67
165,67
173,00
96,00
63,67
39,00
155,67
201,33
144,33
77,00
52,67
129,67
123,67
65,00
44,67
21,00
174,33
248,67
204,67
165,33
133, 67
140,33
120,67
68,67
41,00
27,67
226,33
292,00
171,33
122,33
96,67
U/mL)
4
rHuPH20 (10
U/mL)
5
Hyal 1 (10
U/mL)
6
Chondroitinase
ABC (10
U/mL)
7
Chondroitinase
AC (1 U/mL)
8
Strep lyase
(100 U/mL)
9
Humulin R
10
Eksempel 10
PEGylering av rHuPH20
A. Konjugasjon av mPEG-SBA-30K til rHuPH20
15
For å danne en PEGylert oppløselig human hyaluronidase ble rHuPH20 (som er
omtrent 60 kDa i størrelse) kovalentlig konjugert til en lineær Nhydroksysuksinimidylester av metoksypoly(etylenglykol)butansyre (mPEG-SBA-
203
30K), som har en omtrentlig molekylvekt på 30 kDa. Strukturen av mPEG-SBA er
vist i skjema 2 nedenfor.
Skjema 2
5
Metoder anvendt for å danne mPEG-SBA-30K som ble anvendt for å PEGylere
rHuPH20 er beskrevet, f.eks., i US 5 672 662). Forklart i korte trekk blir mPEGSBA-30K dannet ifølge den følgende prosedyren:
10
En løsning av etylmalonat (2 ekvivalenter) oppløst i dioksan ble tilsatt dråpe for
dråpe til natriumhydrid (2 ekvivalenter) og toluen under en nitrogenatmosfære.
mPEG-metansulfonat (1 ekvivalent, MW 30 kDa, Shearwater) blir løst opp i toluen,
og tilsatt til overnevnte blanding. Den resulterende blandingen blir
15
tilbakestrømmet i omtrent 18 timer. Reaksjonsblandingen blir konsentrert til
halvparten av dets opprinnelige volum, ekstrahert med 10 % vandig NaCl-løsning,
ekstrahert med 1 % vandig saltsyre, og de vandige ekstraktene blir kombinert. De
oppsamlede vandige lagene blir ekstrahert med diklormetan (3s) og det organiske
laget blir tørket med magnesiumsulfat, filtrert og avdampet til tørrhet. Den
20
resulterende resten blir løst opp i 1N natriumhydroksid inneholdende
natriumklorid, og blandingen blir omrørt i 1 time. pH til blandingen blir justert til
omtrent 3 ved tilsetning av 6N saltsyre. Blandingen blir ekstrahert med
diklormetan (2x).
25
Det organiske laget blir tørket over magnesiumsulfat, filtrert, konsentrert, og hellet
inn i kald dietyleter. Presipitatet blir samlet ved filtrering, og tørket under vakuum.
Den resulterende forbindelsen blir løst opp i dioksan og tilbakestrømmet i 8 timer,
og deretter konsentrert til tørrhet. Den resulterende resten blir løst opp i vann og
ekstrahert med diklormetan (2x), tørket over magnesiumsulfat, og løsningen blir
30
konsentrert ved roterende avdampning, og deretter hellet i kald dietyleter.
Presipitatet blir samlet ved filtrering, og tørket under vakuum. Den resulterende
forbindelsen (1 ekvivalent) blir løst opp i diklormetan, og N-hydroksysuksinimid
204
(2,1 ekvivalenter) blir tilsatt. Løsningen blir avkjølt til 0oC, og en løsning av
disykloheksylkarbodiimid (2,1 ekvivalenter) i diklormetan blir dråpevis tilsatt.
Løsningen blir omrørt ved romtemperatur i omtrent 18 timer. Reaksjonsblandingen
blir filtrert, konsentrert og presipitert i dietyleter. Presipitatet blir samlet ved
5
filtrering og tørket under vakuum for å tilveiebringe mPEG-SBA-30K.
For å danne PEGylert rHuPH20 ble mPEG-SBA-30K koblet til aminogruppen(e) av
rHuPH20 ved koalent konjugasjon, for tilveiebringing av stabile amidbindinger
mellom rHuPH20 og mPEG, som vist i skjema 3.
10
Skjema 3
PEGylert rHuPH20
15
For konjugasjonen ble mPEG-SBA-30K tilsatt i pulverform til rHuPH20 (i en
konsentrasjon på 10 mg/mL i 130 mM NaCl/10 mM HEPES; pH 7). PEG:rHuPH20forholdet var 10:1 (molart forhold). Etter at PEG var blitt oppløst i buffer, ble
løsningen sterilfiltrert (Corning 50 mL rørtoppfilter, polystyren, celluloseacetat 0,22
Pm membran). Konjugasjonen ble utført over natt, med omrøring, ved 4oC i et kaldt
20
rom.
Etter konjugasjon ble løsningen konsentrert ved anvendelse av en 100000 MWCO TFFmembran, og bufferen utvekslet mot 130 mM NaCl/10 mM HEPES ved pH 6,8. Det
resulterende materialet, som ble testet for enzymaktivitet, som beskrevet i eksempel
25
2, ovenfor, ble fortynnet ved anvendelse av 130 mM NaCl/10 mM HEPES ved pH 6,8
for å oppnå en endelig enzymaktivitet på 100000 U/mL (korresponderende med
omtrent 2,5 mg peptid/mL). Dette PEGylerte rHuPH20-materialet ble fylt, i 1 mL
205
volumer, inn i en 13-mm type-1 glassbeholder med brombutylforsegling, og lagret i
frossen tilstand (frosset over natt i en -80oC fryser, deretter plassert i en -20oC fryser
for lenger lagring).
5
B. Analyse av PEGylert rHuPH20
Det PEGylerte rHuPH20-materialet ble analysert ved gelelektroforese. Tre batcher av
PEGylert rHuPH20, dannet som i eksempel 7A ovenfor, viser et identisk mønster med
multiple bånd, som representerer uragert PEG og multiple former av mPEG-rHuPH20konjugater, som migrerte ved forskjellige avstander. Basert på sammenlikning med
10
migrering av en moklekylvektmarkør, varierte båndene som representerer arten fra
omtrent 90 kDa til 300 kDa, med tre mørke bånd som migrerer over 240 kDamarkøren. Disse data indikerte at PEGylert rHuPH20, dannet ved kovalent konjugasjon
av mPEG-SBA-30K, inneholdt en heterogen blanding av PEGylerte rHuPH20-arter, som
sannsynlig inkluderer mono-, di- og tri-PEGylerte proteiner. Mangel på et synlig bånd
15
ved 60 kDa tydet på at alt protein hadde reagert med PEG, og at det ikke var noe
detekterbart nativt rHuPH20 tilstede i blandingen.
Eksempel 11
Effekt av rHuPH20 på farmakokinetikken til insulin etter subkutan
20
administrering i griser
For å bestemme om en grisemodell ville være egnet for å være modell for
farmakokinetikken til prandiale insuliner koadministrert med rekombinant
hyaluronidase (f.eks. rHuPH20) ble farmakokinetikken til Humalog£ insulin lispro og
Humulin£ R insulin etter subkutan injeksjon med eller uten rHuPH20 i griser vurdert.
25
Resultatene ble deretter sammenliknet med de observert i mennesker (se eksempel
1), for å bestemme om grisemodellen nøyaktig reflekterer det som ses i mennesker.
Forklart i korte trekk ble Humalog
£
insulin lispro og Humulin£ R insulin, med og uten
rHuPH20, administrert subkutant til seks griser i en randomisert, 4-veis
30
overkrysningsstudie. Hvert dyr mottok tre sykluser av behandling med alle fire
testgjenstander for å oppnå sammenlikning av reproduserbarheten av
insulinfarmakokinetikken over en serie av doseringssykluser. Blodprøver ble samlet,
og serum ble vurdert for å bestemme nivåene av immunoreaktiv insulin
(IRI). Forskjellige farmakokinetikkparametere, inkludert tmaks, Cmaks, tidlig t50%, sen
35
t50%, og AUCmaks ble deretter bestemt.
A. Dosering og prøvetaking
206
Doseringsløsningene (eller testgjenstandene) av 100 U/ml Humalog£ insulin lispro
eller Humulin£ R insulin, med og uten 4800 U/mL rHuPH20, ble dannet som følger.
100 Humalog£ insulin lispro alene og Humulin£ R insulin alene løsninger ble dannet fra
kommersielle emner av Humalog£ insulin lispro (100 U/mL; emne A418976, Eli Lilly)
5
og Humulin£ R insulin (100 U/mL; emne A393318, Eli Lilly, fortynnet 1:5 med sterilt
fortynningsmiddel (Eli Lilly). For å danne Humalog
£
insulin lispro/rHuPH20-løsning ble
910 PL av 100 U/mL Humalog£ insulin lispro (Eli Lilly, embe A418976), 44,6 mL
HYLENEX rekombinant (hyaluronidase human injeksjon) (Baxter, emne 903646) og
45,4 PL rHuPH20 API 1 mg/mL (Halozyme Therapeutics, emne HUA0703MA) blandet
10
for en endelig Humalog£ insulin lisprokonsentrasjon på 91 U/mL, og en
hyaluronidaseaktivitet på 5454 U/mL. For å danne Humulin£ R insulin/rHuPH20løsning, ble 200 PL 500 U/mL Humulin£ R insulin (Eli Lilly, emne A393318) og 800 PL
rHuPH20 Drug Product 6000 U/mL (Halozyme, emne 288004; rHuPH20 Drug Product
inneholdende 50 Pg rHuPH20 i 145 mM NaCl, 10 mM natriumfosfat dibasisk, 2,7 mM
15
kalsiumklorid, 2,7 mM EDTA-dinatriumsalt, 1 mg/mL human serumalbumin , pH 7,4)
blandet for en endelig insulinkonsentrasjon på 100 U/mL og rHuPH20
hyaluronidaseaktivitet på 4800 U/mL.
Løsningene inneholdnde rHuPH20 ble sterilfiltrert og fylt i 2 mL type-1 glass
20
(Wheaton) beholdere, og forseglet med 13 mm gummi (Stelmi) lokk. Løsningene
inneholdende rHuPH20 ble deretter splittet i to sett; ett ble holdt som en avkjølt
kontroll frem til testen, og den andre ble anvendt for administrering til dyrene i denne
studien. Alle doseringsløsningene ble holdt nedfryst ved alle tidspunktene, og deretter
returnert for testing. Hvert sett av løsninger ble testet for rHuPH20-enzymaktivitet på
25
samme dato, i løpet av 1-6 dager for formuleringen.
Seks voksne hann Yucatangriser (S&S Farms, Ramona, CA), hver med vekt mellom 21
og 25 kg ved begynnelse av studien, ble utstyrt med kirurgisk implantert jugularvene
eller karotidarteriekatetere med ytre vaskulære tilgangsporter installert for lett
30
blodprøvetaking i løpet av studien. Dyrene ble satt i karantene i 7 dager før
instrumentering og behandling. Seks dyr ble randomisert til to studiegrupper som vist
i tabell 36 nedenfor. Dyrene ble inndelt i én av to grupper hver inneholdende 3 dyr pr.
gruppe, og inndelingen ble opprettholdt i syklusene 1 og 2. I en tredje doseringssyklus
ble to dyr tatt ut grunnet ikke-åpning av kanylene, og de gjenværende fire dyrene ble
35
reinnstilt med kun 2 dyr pr. gruppe. Gruppe 1 dyr ID numre var 540, 541 og 542, for
syklusene 1 og 2; og 542 og 544 for syklus 3. Gruppe 2 dyr ID numre: 544, 545 og
546 for syklusene 1 og 2; 545 og 546 for syklus 3.
207
Doseringsløsningene ble administrert subkutant (SC) inn i venstre flanke til hver gris
bak midtlinjen av kroppen. Før administrering av testgjenstanden, ble en
forbehandlingsblodprøve oppnådd. Dyrene mottok en enkelt SC-dose av
5
hensiktsmessig testgjenstand (0,2 U/kg; med dyr målt før hver administrering for å
nøyaktig bestemme den korrekte dosen (i en annenhver dag protokoll. Hvert dyr
mottok en enkelt SC-bolusdose av indikert insulin (dvs. enten insulin eller lispro) med
0,2 U/kg i enten en bærer eller i en frisk koformulering av rHuPH20. Etter
administrering av testgjenstanden ble minst 0,7-1,0 mL blod tappet i srie etter 3, 6, 9,
10
12, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 180 og 240 minutter. En forbehandlingstapping
(pretapping) ble også tatt før administreringen. Blodprøver ble øyeblikkelig plassert
inn i serumrør ikke inneholdende anti-koagulant, basert på is i minimum 30 minutter,
og deretter sentrifugert ved 9500 x g i 5 minutter ved omgivelsestemperatur. Serumet
ble deretter overført i formerkede rør, frosset og lagret ved -80oC helt til alle prøvene
15
ble sendt til Millipore for bioanalyse for immunreaktive insulin (IRI) nivåer.
Tabell 36. Doseringsprotokoll for validering av grisemodell
Syklus
1
Doseringsdag
1
Studiedag
0
Grupp #1
Gruppe #2
behandling
behandling
Humalog£ insulin
Humulin£ insulin
lispro
2
3
2
2
Humulin£ R
Humalog£ insulin
insulin/rHuPH20
lispro/rHuPH20
Humulin£ R insulin
Humalog£ insulin
lispro
4
6
Humalog£ insulin
Humulin£ R insulin
lispro/rHuPH20
5
8
Humalog£ insulin
Humulin£ R insulin
lispro
2
6
7
10
12
Humulin£ R
Humalog£ insulin
insulin/rHuPH20
lispro/rHuPH20
Humulin£ R insulin
Humalog£ insulin
lispro
8
14
Humalog£ insulin
Humulin£ R
lispro/rHuPH20
insulin/rHuPH20
208
9
Humalog£ insulin
26
Humulin£ R insulin
lispro
3
10
28
11
30
12
Humulin£ R
Humalog£ insulin
insulin/rHuPH20
lispro/rHuPH20
Humalog£ insulin
Humulin£ R
lispro/rHuPH20
insulin/rHuPH20
£
32
Humulin R insulin
Humalog£ insulin
lispro
B. Seruminsulinnivåer
Serum IRI-konsentrasjoner ble bestemt for hver serumprøve ved interpolering fra en
5
standardkurve ved anvendelse av StatLIA£-analyse analyseprogramvare (Brendan
Technologies, Carlsbad, CA). Tabell 37 tilveiebringer IRI-konsentrasjon etter
administrering av Humalog£ insulin lispro,
£
insulin lispro/rHuPH20, Humulin£ R insulin
eller Humulin£ R insulin/rHuPH20. Tabell 37 angir grunnlinje IRI-nivåer, som målt i
pre-blodtappede prøver. Disse grunnlinjene ble deretter subtrahert fra de virkelige
10
IRI-konsentrasjonene målt ved hvert tidspunkt for å bestemme grunnlinjejustert IRIkonsentrasjon.
Gjennomsnittlige serum IRI-konsentrasjon-tidsprofiler for hver behandling (som sett
når plottet på en graf med IRI-konsentrasjon på Y-aksen mot tid på X-aksen) var lik
15
over multiple sykluser. I alle doseringssykluser ble farmakokinetikken til Humalog£
insulin lispro og Humulin£ R insulin akselerert når koadministrert subkutant i rHuPH20formuleringen. Eventuelt observerte forskjeller mellom behandlinger var vesentlig den
samme blant behandlingssyklusene som indikerer at de observerte forskjellene
skyldtes behandlingen, og var stabile over syklusene, over omtrent testing i fem uker.
20
Tabell 37. Serum IRI-konsentrasjon-tidsprofiler
Gjennomsnittlig IRI-konsentrasjon (pM) og standardavvik (SD)
Humalog
Tid
(minutter)
0 (pre-
£
Humalog£ Insulin
Insulin lispro
Humulin£ R insulin
Humulin£ R
lispro/rHuPH20
insulin/rHuPH20
Gj.snitt
SD
Gj.snitt
SD
Gj.snitt
SD
Gj.snitt
SD
37,0
52,3
45,0
37,5
20,9
27,3
19,2
23,8
blodtappet
grunnlinje)
Grunnlinjejusterte IRI-konsentrasjoner
0
3
8,1
0
0
0
0
0
0
0
25,2
65,5
79,3
0,7
3,0
113,0
109,7
209
6
20,6
46,1
110,3
84,6
2,9
7,1
161,6
119,4
9
21,5
40,9
166,0
122,5
3,7
10,9
168,1
136,2
12
40,6
71,6
143,0
99,0
7,3
20,7
166,0
118,0
15
52,3
78,4
262,2
215,5
11,2
32,8
155,6
114,8
20
80,4
125,6
265,3
169,2
22,6
33,7
210,8
172,4
25
93,6
92,5
263,3
190,0
40,7
48,2
253,0
171,9
30
119,7
116,7
335,2
220,4
61,3
55,1
224,1
146,5
45
193,9
139,7
296,1
183,3
105,6
103,8
253,1
188,1
60
164,0
106,8
206,5
150,3
107,0
91,4
172,4
115,3
90
115,2
76,4
101,8
74,4
100,4
95,4
137,0
110,0
120
95,7
68,9
72,3
63,6
105,5
57,6
93,9
63,4
180
24,6
23,6
38,5
45,4
105,5
81,7
50,5
49,7
240
15,2
21,7
65,8
106,5
81,8
126,3
33,8
50,9
C. Insulinfarmakokinetikk
Insulinkonsentrasjon-tidprofil etter subtrahering av grunnlinjeinsulinkonsentrasjonen
5
(tabell 37, ovnfor) ble anvendt for å beregne følgende PK-parametere: inkludering av
tmaks, Cmaks, tidlig t50%, sen t50%, og AUCintervall PK-parametere ble oppnådd ved nonkompartmental analyse ved anvendelse av modell 200 i WinNonlin Professional
versjon 5.2 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). Beregninger av statistikken ble
utført ved anvendelse av SAS versjon 9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC). Alle analysene
10
ble utført ved anvendelse av en blandet modell med bestemte effekter for behandling.
Med forbindelse symmetrisk kovariansmatriks blant gjentatte observasjoner for hvert
dyr, ble antatt. Analyser for Cmaks og alle AUC-sluttpunkter ble utført ved anvendelse
av loggtransformerte verdier med verdier for null erstattet av 1 før loggtransformasjon
(null på loggskalaen). De tidsbaserte sluttpunktene ble analysert på opprinnelig lineær
15
skala.
En oppsummering av farmakokinetikken til insulin etter subkutan administrering av
Humalog£ insulin lispro eller Humulin£ R insulin, levert alene (kontroll) eller med
rHuPH20, er tilveiebrakt i tabell 38. De forskjellige PK-parameterne for hvert insulin
20
levert alene eller med rHuPH20 er vist som gjennomsnitt + SD. Prosent kontroll for
hver parameter (% kontroll beregnet ved [gjennomsnitt (geometrisk eller aritmetisk)
PK-verdi for insulin med rHuPH20]/[gjennomsnitt (geometrisk eller artimetisk) PKverdi for insulin alene] x 100) er også vist i tabellen. % kontrollberegninger var basert
på geometrisk gjennomsnitt, og P-verdien for loggtransformerte data for Cmaks og
25
AUC-parametere, mens basert på aritmetisk gjennomsnitt og utransformerte verdier
for tmaks og Early & Late t50%. N = 16 griser hvis ikke annet er angitt.
210
Tabell 39 angir en sammenlikning av PK-parametere for Humalog£ insulin lispro alene
til Humulin£ R insulin med rHuPH20. PK-verdiene er tilveiebrakt som gjennomsnitt +
SD. Også tilveiebrakt er % Humalog£ insulin lispro (dvs. [gjennomsnitt (geometrisk
eller aritmetisk) PK-verdi for Humalog£ insulin lispro med rHuPH20] / [gjennomsnitt
5
(geometrisk eller aritmetisk) PK-verdi for Humalog£ insulin lispro alene] x 100). %
kontrollberegningene var basert på geometrisk gjennomsnitt og p-verdien for
loggtransformert data for Cmaks og AUC-parametere, eller basert på aritmetisk
gjennomsnitt og utransformerte verdier for tmaks og Early & Late t50%. N = 16 dersom
ikke annet er angitt.
10
Tabell 38. Insulin PK-parametere etter subkutan administrering med eller
uten rHuPH20
Humalog£ insulin lispro
alene
Cmaks
Early t50%
med
%
rHuPH20
kontroll
250 +
417 +
163
140
229
58 +
11 + 6a
32
Humulin£ R insulin
P-verdi
med
%
rHuPH20
kontroll
214 +
360 +
165
0,0218
122
180
0,0182
61 + 49
10 + 8a
17
<0,0001
0,0251
alene
P-verdi
(min.)
20a
Tmaks
58 + 26
39 + 39
67
0,1963
94 + 61
38 + 41
40
0,0004
Late t50%
110 +
52 + 24a
47
0,0002
170 +
70 + 41a
42
<0,0001
(min.)
42a
2,06 +
43542
<0,0001
1429
0,0027
246
0,2003
116
0,5312
88
0,618
72
0,2259
22
0,1930
(min.)
49b
AUC-intervall (min. x nmol/L)
0-15
0,35 +
min.
0,64
1,24
0-30
1,65 +
5,84 +
min.
2,07
3,59
0-1 t
6,7 +
14,2 +
4,8
8,6
18,0 +
26,6 +
8,8
14,6
0-
24,3 +
32,2 +
uendelig
8,6c
17,1a
1-4 t
12,2 +
12,9 +
6,8
7,8
2-4 t
4,9 +
6,0 + 4,9
0-sist
3,2
a N = 15
15
1,77 +
bN=4
c N = 13
1961
0,0004
0,06 +
0,17
1,28
763
0,0198
0,56 +
5,33 +
0,73
3,30
3,4 +
12,1 +
2,5
7,3
21,3 +
26,9 +
12,1
16,0
45,0 +
32,6 +
41,2c
16,7a
15,0 +
214
146
117
0,2776
0,1195
0,5176
106
0,8410
18,2 +
10,3
10,1
215
0,3763
12,0 +
6,8 + 5,4
7,8
211
Tabell 39. Insulin PK-parametere etter subkutan administrering av Humalog£
insulin lispro alene eller Humulin£ R insulin med rHuPH20
Humalog£
Humulin£ R
% Humalog£
insulin lispro
insulin med
insulin lispro
P-verdi
rHuPH20
Cmaks (pmol/L)
250 + 140
360 + 180
143
0,0944
Early t50%
36 + 20a
10 + 8a29
0,0141
Tmaks (min.)
58 + 26
38 + 41
64
0,1631
Sen t50% (min.)
110 + 42a
70 + 41a
64
0,0092
(min.)
AUC-intervall (min. x nmol/L)
0-15 min.
0,35 + 0,64
2,06 + 1,28
2698
<0,0001
0-30 min.
1,65 + 2,07
5,33 + 3,32
744
0,0212
0-1 t
6,7 + 4,8
12,1 + 7,3
189
0,3646
0-sist
18,0 + 8,8
26,9 + 16,0
146
0,1196
0-uendelig
24,3 + 8,6b
32,6 + 16,6a
128
0,3179
1-4 t
12,2 + 6,8
15,0 + 10,1
121
0,4801
2-4 t
4,9 + 3,2
6,9 + 5,4
290
0,2203
a N = 15
5
b N = 13
D. Oppsummering
Koadministrering av Humulin£ R insulin eller Humalog£ insulin lispro med rHuPH20 i
griser endret signifikant spesifikke PK-parametere i forhold til kontrollinjeksjonene
10
(dvs. Humulin£ R insulin eller Humalog£ insulin lispro alene). Spesifikt ble maksimal
eksponering (Cmaks) øket 163 % for Humalog£ insulin lispro (p = 0,0251) og 165 % for
Humulin£ R insulin (p = 0,0218) når administrert med rHuPH20 i forhold til de
respektive kontrollene. Virkningsbegynnelsen (Early t50%) ble akselerert fra 36 til 11
minutter for Humalog£ insulin lispro (p = 0,0182) og fra 61 til 10 minutter for Humulin
15
£
R insulin (p < 0,0001). Tid for maksimal effekt (tmaks) ble akselerert fra 58 til 39
minutter for Humalog£ insulin lispro (p = 0,1963) og fra 94 til 38 minutter for
Humulin£ R insulin (p = 0,0004). Late t50% ble akselerert fra 110 til 52 minutter for
Humalog£ insulin lispro (p = 0,0002) og fra 170 til 70 minutter for Humulin£ R insulin
(p < 0,0001). Total eksponering (AUCinf) ble ikke meningsfylt endret for veken
20
Humalog£ insulin lispro (117 % kontroll; p = 0,5176) eller Humulin£ R insulin (88 %
kontroll; p = 0,6118). Den kumulative eksponeringen ble skiftet til tidligere
212
tidsvinduer for både Humalog£ insulin lispro (AUC0-30 økte 764 % sammenliknet med
når Humalog£ insulin lispro ble administrert alene; p = 0,0198) og Humulin£ R insulin
(AUC0-30 økte 1429 % sammenliknet med når Humulin£ R insulin ble administrert
alene; p = 0,0027). Koadministrering av enten Humulin£ R insulin med rHuPH20 eller
5
Humalog£ insulin lispro med rHuPH20 økte absorpsjonsraten av insulin til det
vaskulære rommet (“compartment”) (sammenliknet med når det respektive insulinet
ble levert alene) som sett ved en reduksjon i tid til maksimale serum IRIkonsentrasjoner (tmaks, Early t50%, Late t50%), og en økning i topp
eksponeringskonsentrasjoner (Cmaks) sammenliknet med Humulin£ R insulin eller
10
Humalog£ insulin lispro alene. I tillegg ble tidlig kumulativ eksponering (AUC0-30) øket
for både Humalog£ insulin lispro og Humulin£ R insulin når administrert med rHuPH20,
sammenliknet med når administrert alene.
Økning i toppeksponering og akselerasjon av eksponering ved administrering av enten
15
Humalog£ insulin lispro og Humulin£ R insulin med hyaluronidasekoadministrering ble
observert bredt uten betydningsfull innvirkning på dyr, sekvens, eller syklus, og
etterlikner nært de tidligere humane studiene (se eksempel 1). Derfor er grisen en
egnet modell for studering av effekten av hyaluronidase på absorpsjonen av prandial
insulinprepareringer.
20
Eksempel 12
Farmakokinetikk til vanlig insulin i to doser administrert med og uten
rHuPH20 subkutant
Farmakokinetikk (PK) til vanlig insulin, når administrert subkutant i to forskjellige
25
konsentrasjoner, både alene og koadministrert med rHuPH20, ble vurdert i
grisemodellen beskrevet i eksempel 10, ovenfor. En multippel dose 4-veis
overkrysningsdesignstudie ble utført for å sammenlikne PK til vanlig insulin ved
konsentrasjoner på 20 og 100 U/mL, når administrert alene, til de samme to
konsentrasjonene etter koadministrering med rHuPH20. I hvert tilfelle ble totalt 0,2
30
U/kg insulin administrert.
A. Dosering og prøvetaking
Fire testgjenstander ble preparert for dosering. To testgjenstander inneholdt 20 U/mL
og 100 U/mL vanlig insulin (Humulin£ R insulin; Eli Lilly), henholdsvis (betegnet insulin
35
U20 og insulin U100). De gjenværende to testgjenstandene inneholdt 20 U/mL og 100
U/mL vanlig insulin (Diosynth Biotechnologies (en avdeling i Schering-Plough), med 20
Pg/mL (omtrent 2400 U/mL) rHuPH20 (angitt insulin-PH20 U20 og insulin-PH20
213
U100). Insulin U20 testgjenstanden ble dannet ved fortynning av Humulin£ R insulin
(100 U/mL, emne A390566A; Eli Lilly) 1:5 med sterilt fortynningsmiddel (Eli Lilly).
Insulin U100 testgjenstanden var ufortynnet Humulin£ R insulin (100 U/mL; emne
A509721; Eli Lilly). Insulin-PH20 U20 forsøksgjenstanden inneholdt 0,74 mg/mL (20
5
U/mL) vanlig insulin (emne # SIHR107; Diosynth Biotechnologies) og 20 Pg/mL
(omtrent 2400 U/mL) rHuPH20 i 25 mM Tris, 120 mM NaCl, 0,01 % Polysorbat 80, pH
7,3. Insulin-PH20 U100 testgjenstand inneholdt 3,69 mg/mL (100 U/mL) vanlig insulin
(emne # SIHR107; Diosynth Biotechnologies ) og 20 Pg/mL (omtrent 2400 U/mL)
rHuPH20 i 25 mM Tris, 120 mM NaCl, 0,01 % Polysorbat 80, pH 7.3.
10
Seks voksne hann Yucutan minigriser (S&S Farms, Ramona, CA), hver med vekt
mellom 21 og 25 kg ved studiebegynnelsen, fikk et kateter kirurgisk implantert enten i
jugularvenen eller karotidarterien for å muliggjøre at serieblodprøver blir trukket i
løpet av varigheten av studien. Dyrene ble randomisert til to studiegrupper, hver
15
inneholdende tre dyr/gruppe som vist i tabell 40. Gruppeoppstillingen ble opprettholdt
i syklusene 1 og 2. Hvert dyr mottok to behandlingssykluser med alle fire
testgjenstandene for å lette sammenlikningen av reproduserbarheten av
insulinfarmakokinetikken over en serie av doseringssykluser.
20
Testgjenstandene ble administrert subkutant (SC) inn i venstre flanke til hver gris bak
midtlinjen av kroppen. Hvert dyr mottok en enkelt SC bolusdose av indikert insulin
ved 0,2 U/kg i en annenhver dag protokoll. For insulin U20 og insulin-PH20 U20
testgjenstandene ble 10,0 PL/kg administrert. For insulin U100 og insulin-PH20 U100
testgjenstandene ble 2,0 PL/kg administrert. Blodprøver (0,7-1,0 mL i volum) ble
25
samlet før administreringen (fortappet), deretter etter 3, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 30, 45,
60, 90, 120, 180 og 240 minutter etter administrering. Blodprøvene ble plassert i
serumrør ikke inneholdende antikoagulant, plassert på is i minimum 30 minutter,
deretter sentrifugert ved 9500 x g i 5 minutter ved omgivelsestemperatur. Serumet
ble deretter overført til formerkede rør, frosset, og lagret ved -80oC helt til prøvene
30
ble sendt til Millipore BioPharma Services (St. Charles, MO) for å bestemme nivåene
av immunoreaktivt insulin (IRI).
Tabell 40. Doseringsprotokoll
Syklus
Dose
Dag
Grupp1
Gruppe 2
1
1
0
Insulin-PH20 U100
Insulin U20
2
2
Insulin-PH20 U20
Insulin U100
3
4
Insulin U100
Insuln-PH U20
214
2
4
6
Insulin U20
Insulin-PH20 U100
5
8
Insulin-PH20 U20
Insulin U100
6
10
Insulin U20
Insulin-PH20 U100
7
12
Insulin-PH20 U100
Insulin U20
8
14
Insulin U100
Insulin-PH U20
B. Seruminsulinnivåer
Serum IRI-konsentrasjoner ble bestemt for hver serumprøve ved interpolasjon fra en
5
standardkurve ved anvendelse av StatLIA£-assayanalyseprogramvare (Brendan
Technologies, Carlsbad, CA). Tabell 41 tilveiebringer gjennomsnittlig serum IRIkonsentrasjon etter administrering av Insulin U20, Insulin U100, Insulin-PH20 U20 og
Insulin-PH20 U100. Tabell 41 angir grunnlinje IRI-nivåer, som målt i forblodtappede
prøver. Disse grunnlinjene ble deretter subtrahert fra de virkelige IRI-
10
konsentrasjonene målt ved hvert tidspunkt for å bestemme grunnlinjejustert IRIkonsentrasjon.
Insulinkonsentrasjon-tidprofilene etter hver doseringssyklus ble sammenliknet for hver
behandlingsgruppe. Gjennomsnittlige serum IRI-konsentrasjon-tidprofiler for hver
15
testgjenstand, som observert når plottet på en graf med IRI-konsentrasjon på Y-aksen
mot tid på X-aksen) var lik over begge syklusene. I begge doseringssykluser ble PK til
insulin akselerert når koadministrert subkutant med rHuPH20-formuleringen for begge
konsentrasjonene. Ytterligere statistiske modeller som inkluderte fiks-effekter for
behandling, sekvens, syklus, behandling-ved-syklusinteraksjon, og dyr med sekvens
20
for data fra syklusene 1 og 2 ble konstruert for primære og sekundære PK-parametere
(primære PK-parametere inkluderte: område under kurven (AUC) for tildelt
tidsvinduer, Cmaks, tmaks, Early t50% og Late t50%; sekundære PK-parametere inkluderte
mer detaljerte tidsvinduer for AUC, MRT (sist og uendelig), Labda z, HL Lambda z,
fjerning og distribusjonsvolum), og viste at det er ikke noen systematisk effekt
25
avsekvens, syklus eller dyr, det er heller ikke en interaksjon mellom syklus og
behandling for noen av disse variablene.
Tabell 41. Serum IRI-konsentrasjon-tidprofil
Tid
(minutter)
Gjennomsnitt IRI-konsentrasjon (pM) og standardavvik (SD)
Insulin U20
Gj.snitt
SD
Insulin U100
Gj.snitt
SD
Insulin-PH20 U20
Gj.snitt
SD
Insulin-PH20 U100
Gj.snitt
SD
215
0 (pre-
91,6
53,0
89,0
49,6
114,3
55,8
71,8
48,4
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
blodtappegrunnlinje
Grunnlinjejusterte IRI-konsentrasjoner
0
0,0
0,0
0,0
3
139,7
472,2
63,1
73,4
2,2
5,6
49,4
41,3
6
74,2
234,6
178,7
269,3
8,1
17,6
88,8
73,7
9
206,3
594,2
122,0
101,3
12,9
30,9
144,5
85,0
12
93,0
166,7
181,5
150,5
36,9
58,0
182,1
138,6
15
83,1
116,2
214,4
151,5
58,6
76,9
225,3
165,6
20
136,3
180,8
367,1
590,3
85,1
109,6
251,8
133,3
25
139,1
147,7
247,3
161,1
174,5
262,2
285,7
142,8
30
238,0
292,2
294,1
183,9
169,2
224,9
357,3
199,9
45
203,3
117,5
249,0
133,5
134,3
147,6
234,7
115,8
60
185,5
127,6
174,8
101,8
102,5
65,1
252,1
169,1
90
106,1
67,7
131,2
128,1
85,4
87,8
222,7
144,7
120
70,8
71,9
73,0
47,0
70,9
61,7
153,7
54,8
180
78,0
92,3
64,2
119,3
87,4
101,3
69,4
59,1
240
25,7
32,2
26,0
44,7
23,0
36,9
23,3
26,5
C. Insulinfarmakokinetikk
Insulinkonsentrasjon-tidprofil etter subtrahering av grunnlinjeinsulinkonsentrasjonen
5
(tabell 41, ovenfor) ble anvendt for å beregne følgende PK-parametere: inkludert tmaks,
Early t50%, Late t50% og AUCintervall. Serum IRI mot tidsdata ble etterliknet ved ikkekompartmental analyse ved anvendelse av WinNonLin Professional modell 200
(versjon 5.2, Pharsight Corp., Mountain View, CA) og PK-parametere ble beregnet.
Beregninger av statistikk og statistiske sammenlikninger mellom grupper ble utført
10
ved anvendelse av SAS versjon 9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC). Alle analysene ble
utført ved anvendelse av en blandet modell med bestemte effekter for behandling. En
forbindelse symmetrisk kovariansmatriks blant gjentatte observasjoner for hvert dyr
ble antatt. Analyser for Cmaks og alle AUC-sluttpunkter ble utført ved anvendelse av
loggtransformerte verdier med verdier på null erstattet med 1 før
15
loggtransformasjonen (null på loggskalaen). De tidsbaserte sluttpunktene ble
analysert på den opprinnelige lineære skalaen.
En oppsummering av farmakokinetikk til insulin etter subkutan administrering av
Insulin U20, Insulin U100, Insulin-PH20 U20 og Insulin-PH20 U100 er tilveiebrakt i
20
tabell 42. De forskjellige PK-parameterne for hver insulin levert alene eller med
rHuPH20 er vist som gjennomsnitt + SD. Prosent kontroll for hver parameter (%
kontroll = [PK-verdi for insulin med rHuPH20] / [PK-verdi f or insulin alene] x 100) er
216
også gitt i tabellen. % kontrollberegningene var basert på geometrisk gjennomsnitt og
p-verdien for loggtransformerte data for Cmaks og AUC-parametere, idet %
kontrollberegningene var basert på aritmetisk gjennomsnitt og utransformerte verdier
for tmaks og Early & Late t50%. N = 16 griser hvis ikke annet er angitt.
5
Tabell 42. Insulin PK-parametrene etter sukutan administrering med eller
uten rHuPH20
Insulin 20 U/mL
Insulin
Insulin-
%
20U
rHuPH20
kontroll
Insulin 100 U/mL
P-verdi
Insulin
Insulin-
%
100U
rHuPH20
kontroll
20U
P-verdi
100U
Cmaks
429 +
462 +
(pmol/L)
508
567
Early t50%
23 +
12 + 5
52
(min.)
14b
Taks
57 + 42
39 + 21
Late t50%
84 +
77 + 45
(min.)
38b
106
0,8439
238 +
420 +
237
208
237
0,0095
0,1622
35 + 38c
12 + 7
34
0,0063
68
0,2462
64 + 49
47 + 29
74
0,2775
92
0,7689
109 +
112 + 53
103
0,9315
0,27 +
1,75 +
7104
<0,0001
0,40
1,02
2400
0,0015
489
0,0012
354
0,0038
214
0,0161
270
0,0204
398
0,1832
(min.)
64c
AUC-intervall (min. = nmol/L)
0-15
1,61 +
1,95 +
min.
4,37
1,73
0-30
0,79 +
6,35 +
min.
6,24
5,90
0-1 t
10,02 +
13,75 +
8,60
8,92
0-sist
24,4 +
27,5 +
11,6
20,5
0-
30,1 +
29,8 +
uendelig
10,3d
22,1
1-4 t
14,6 +
14,3 +
9,6
12,2
7,6 +
6,5 + 9,1
2-4 t
6,5
1920
623
0,0045
0,0567
2,14 +
5,89 +
2,83
2,89
179
0,2073
6,19 +
13,98 +
6,78
6,0
107
0,8777
18,5 +
34,7 +
16,0
14,6
89
97
104
0,7027
0,9436
0,9720
27,8 +
44,8 +
19,1c
13,2c
13,2 +
22,2 +
11,3
11,2
8,1 +
9,5 + 5,4
8,2
b N = 11 dyr
c N = 10 dyr
10
d N = 8 dyr
e N = 9 dyr
D. Oppsummering
Denne studien undersøkte effekten av subkutan administrering av den samme totale
15
insulindosen ved forskjellige konsentrasjoner, med og uten rHuPH20.
217
I fravær av koadministrering med rHuPH20 resulterte reduksjonen i
insulinkonsentrasjon fra 100 U/mL til 20 U/mL i hurtigere insulinabsorpsjon med en
økning i toppinsulinkonsentrasjon og høyere kumulativ insulineksponering både tidlig
5
og, i minder grad, totalt. Relativt til kontroll 100 U/mL injeksjonene, redusering av
konsentrasjonen til 20 U/mL 1) økte Cmaks 91 % fra et geometrisk gjennomsnitt på
158 til 302 pmol/L; 2) reduserte gjennomsnittlig early t50% fra 35 til 23 minutter, tmaks
fra 64 til 57 minutter, og Late t50 % fra 109 til 84 minutter; og 3) økte geomerisk
gjennomsnitt AUC0-15 300 % fra 20 til 80, AUC0-30 256 % fra 222 til 791, og AUCsist
10
131 % fra 9,021 til 20,820 alle i enhetene pmol x min./L.
Koadministrering av vanlig insulin ved hvilken som helst konsentrasjon med rHuPH20
resulterte også i hurtigere absorpsjon etter subkutan injeksjon i forhold til insulin
alene. Derimot, ved en lavere insulinkonsentrasjon på 20 U/mL, var de relative
15
økningene over insulin administrert alene ikke så dramatisk, siden insulinet som
allerede var absorbert hurtigere ved 20 U/mL når levert alene (som beskrevet
ovenfor).
Ved 100 U/mL konsentrasjon, som mer typisk blir anvendt av diabetiske pasienter,
20
konjeksjon med rHuPH20 1) økte Cmaks 137 % fra et geometrisk gjennomsnitt på 158
til 375 pmol/L (p=0,0095); 2) reduserte gjennomsnittlig early t50% fra 35 til 12
minutter (p=0,0063), mens tmaks og Late T50% ikke ble signifikant forandret; og 3) økte
geometrisk gjennomsnitt AUC0-15 70 ganger fra 20 til 1438 (p<0,0001), AUC0-30 23
ganger fra 222 til 5337 (p=0,0015), og AUCsist 250 % fra 9,021 til 31,905 (p=0,0038)
25
alle i enheter av pmol x min./L, sammenliknet med administrering av insulin alene ved
100 U/mK-konsentrasjonen.
Ved den lavere insulinkonsentrasjonen på 20 U/mL, resulterte koadministrering med
rHuPH20 i følgende effekter på insulin PK, sammenliknet med administrering av insulin
30
alene: 1) Cmaks ble ikke signifikant endret met geometriske gjennomsnitt på 302 og
322 pmol/L (p=0,84); 2) gjennomsnittlig early t50% var lavere fra 23 til 12 minutter
(p=0,16), mens tmaks og Late t50% ikke ble signifikant forandret; og 3) geometrisk
gjennomsnitt AUC0-15 økte 18 ganger fra 80 til 1533 (p=0,0045), UAC0-30 5 ganger fra
791 til 4934 (p=0,0567), og AUCsist var uforandret ved 20,820 og 22,184 (p=0,88)
35
alle i enheter av pmol x min./L.
218
Økningen i toppeksponeringen og akselerering av eksponeringen ved administrering
av rHuPH20 og vanlig insulin ved 100 U/mL i forhold til kontrollinsulininjeksjon uten
rHuPH20 etterlikner de foregående humane studiene (eksempel 1) grisestudien
(eksempel 10). Disse resultatene demonstrerer videre at insulinkinetikk også kan bli
5
akselerert ved administrering ved en lavere konsentrasjon, som er i samsvar med et
ratebegrensende insulin heksamerdissosiasjonstrinn som er konsentrasjonsavhengig
(dvs. når insulin blir administrert subkutant alene, er det absorbert når det dissosierer
fra en heksamer til monomer, en prosess som oppstår ved lavere konsentrasjoner av
insulin). Når koadministrert med rHuPH20, er denne avhengigheten av
10
insulinkonsentrasjonen betydelig redusert eller til og med eliminert. Følgelig kan
hyaluronidasedispergerende effekt av koadministrering av rHuPH20 med insulin
redusere den uønskede reduseringen i insulinfarmakokinetikk som blir observert ved
injeksjon av insulin i høyere konsentrasjoner.
15
Eksempel 13
Effekt av saltkonsentrasjon på rHuPH20 i nævær av metylparaben
Effekten av NaCl på stabiliteten av rHuPH20 med og uten konserveringsmidlet
metylparaben, ved akselerert temperatur (40oC) ble vurdert. Tolv forskjellige
formuleringer ble dannet ved kombinering av rHuPH20 (10 mg/ml i histidin/HCl, pH
20
6,5, 130 mM NaCl) med seks forskjellige konsentrasjoner av NaCl, med eller uten
metylparaben (Fluka). Hver formulering inneholdt 10 Pg/mL rHuPH20, 25 mM Tris, pH
7,3, 0,01 % Tween 80 og enten 0,50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM eller 250 mM
NaCl med eller uten 0,2 % metylparaben. Løsningene ble aliquotet i 2 ml type 1
glassbeholdere med gummiproppper, og forseglet med aluminiumoksidlokk i løpet av
25
studien. Ett sett av beholdere ble lagret ved 40oC i fire dager, og det andre settet ble
oppbevart i kjøler ved 2-8oC for å virke som positiv kontroll. Prøvene ble deretter
testet for hyaluronidase (enzymatisk) aktivitet. For å vurdere nivået av aggregater,
ble størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) utført ved anvendelse av en G2000
SWXL-kolonne (Tosoh Bioscience) med betingelsene 1 x PBS som løpebuffer og en
30
strømningsrate satt på 1 ml/min.
Tabell 43 angir resultatene av studien, inkludert hyaluronidase (enzymatisk) aktivitet,
% hovedtopp (dvs. prosentandel rHuPH20 som var innbefattet i hovedtoppen) og %
aggregattop (dvs. prosentandel rHuPH20 som var innbefattet i toppen som skyldes
35
aggregater). Det ble observert at stabiliteten av rHuPH20 var sensitiv overfor
konsentrasjonen av NaCl. Generelt, når formuleringene ble inkubert ved 40oC, når
NaCl-konsentrasjonen ble redusert, ble den enzymatiske aktiviteten til rHuPH20
219
redusert. Derimot, når lagret i kjøler ved 2-8oC, beholdt rHuPH20 den enzymatiske
aktiviteten uansett formulering. Ved forhøyet temperatur, når NaCl var fullstendig
eliminert fra løsningen, ble hele aktiviteten av rHuPH20 tapt, uansett om det var
metylparaben eller ikke. Tap av enzymatisk aktivitet ble redusert når NaCl5
konsentrasjonen ble forøket. Det var betydelig forskjell i enzymatisk aktivitet (paret ttest, P=0,0228) mellom prøver med og uten tilsatt metylparaben.
En liknende korrelasjon av NaCl-konsentrasjon og aggregatnivåer av rHuPH20 ble
observert. Aggregatnivåene økte med reduserende NaCl-konsentrasjon når prøver ble
10
lagret ved forhøyet temperatur. Det var essensielt ingen forandringer med eller uten
tilsatt metylparaben når lagret ved 2-8oC. Formuleringer lagret ved -40oC
inneholdende metylparaben dannet betydelig mer aggregat enn de formuleringene
som ikke inneholdt metylparaben (paret t-test, P=0,0058).
15
Følgelig, både den enzymatiske aktiviteten og prosent monomer av rHuPH20 som
vurdert ved SEC, ble betydelig redusert i formuleringer inneholdende metylparaben
sammenliknet med de formuleringene som ikke inneholdt metylparaben. Videre,
innenfor NaCl-konsentrasjonsområdet som ble testet (0-250 mM), var det et direkte
forhold mellom NaCl-konsentrasjonen og øket rHuPH20-stabilitet.
20
Tabell 43. Enzymatiske aktiviteter og SEC-resultater av prøver lagret i 4
dager ved 40oC og 4oC
Formulering
Enzymatisk aktivitet
% hovedtopp
% aggregattopp
(U/mL)
Uten NaCl
4oC
40oC
4oC
40oC
4oC
40oC
12410
<LOD
99,65
0
0,35
100
12470
2990
99,22
2,86
0,78
97,14
12380
3530
100
13,32
0
86,68
13510
6200
100
26,31
0
73,69
0,2 % MP
50 mM
NaCl, 0,2 %
MP
100 mM
NaCl, 0,2 %
MP
150 mM
NaCl, 0,2 %
MP
220
200 mM
11250
6220
99,49
51,84
0,51
48,16
10740
7340
100
65,55
0
34,45
10430
<LOD
99,4
0
0,6
100
12370
3070
99,34
22,05
0,66
77,95
12580
9930
99,47
72,81
0,53
27,19
12750
11180
99,48
88,16
0,52
11,84
13660
13340
99,64
96,22
0,36
3,78
11370
11090
100
98,5
0
1,95
NaCl, 0,2 %
MP
250 mM
NaCl 0,2 %
MP
Uten NaCl,
uten MP
50 mM
NaCl, uten
MP
100 mM
NaCl, uten
MP
150 mM
NaCl, uten
MP
200 mM
NaCl, uten
MP
250 mM
NaCl, uten
MP
LOD = deteksjonsgrense
Eksempel 14
Koformulering av insulin og rHyPH20
5
En serie av studier ble utført for å vurdere stabilitetenav rHuPH20 og insulin under
forskjellige betingelser, så som forskjellige temperaturer og pH, og formuleringer.
1. Effekt av osmolaritet og pH på rHuPH20
I den første studien ble effekten av osmolaritet og pH på stabiliteten av rHuPH20
10
(formulert som Hylenex rekombinant (Hyaluronidase human injeksjon) vurdert ved å
danne formuleringer med varierende saltkonsentrasjoner og pH-verdier, og vurdering
av eventuelt tap av aktivitet etter lagring og avkjøling (5oC), akselerert (25oC), og
stress (25oC, 35oC og 40oC)-betingelser i opptil 3 måneder. Hylenex rekombinant
(Hyaluronidase human injeksjon) inneholder 150 U/mL rHuPH20, 144 nM NaCl, 10 mM
221
natriumfosfatdibasisk, 1 mg/mL human albumin human, 2,7 mM edetatdinatrium, 2,7
mM CaCl, og har et osmolaritetsområde på 290 til 350 mOsm og en pH på 7,4. Denne
formuleringen ble justert for å preparere de åtte formuleringene (og kontroll Hylenex)
angitt i tabell 44. Den enzymatiske aktiviteten (dvs. hyaluronidaseaktivitet) ble
5
bestemt som beskrevet ovenfor. rHuPH20-innholdet ble også bestemt ved RP-HPLC.
Ingen betydningsfulle forandringer ble observert ved anbefalt (5oC) eller akselerert
(25oC eller 30oC) lagringsbetingelser for de fire løsningene dannet ved pH og
osmolaritetsspesifikasjonsgrensene eller kontrolløsningen ved anbefalte
10
lagringsbetingelser. rHuPH20 ble observert å være stabil ved pH 7,4, og generelt mer
stabil under sure istedenfor basiske betingelser, som vurdert ved tap av
enzymaktivitet og tap av rHuPH20-innhold. Effekten av ionestyrken var mer moderat.
Ved forhøyede temperaturer så det ut som om formuleringer inneholdende høyere
ionestyrker var noe mer stabile enn de med lavere ionestyrke. Det var en signifikant
15
reduksjon i stabiliteten mellom 35oC og 40oC.
Tabell 44. Formulinger av rHuPH20
Formulering
NaCl
% Hylenex
Osmolaritet
pH
(mOsm/kg)
(tilpasning
mM
mg/mL
120
7,0
83
267
7,5
132
7,7
91
290
7,5
164
9,6
100
350
7,4
236
13,8
98
450
7,3
Kontroll
145
8,5
100
325
7,4
Pluss 5 mM
150
8,8
100
328
6,5
153
8,9
99
331
5,5
145
8,5
100
324
8,6
utført)
Pluss 21 %
volum H2O
Pluss 10 %
volum H2O
Pluss 19 mM
NaCl
Pluss 91 mM
NaCl
HCl
Pluss 8 mM
HCl
Pluss 1,9
mM NaOH
222
Pluss 2,2
145
8,5
100
323
9,5
mM NaOH
2. Effekt av pH på rHuPH20
Effekten av varierende pH til buffersystemet på stabiliteten av rHuPH20 ble vurdert.
5
rHuPH20 (1200000 U/mL, 10 mg/mL) ble formulert i 130 mM NaCl, 10 mM histidin,
med en pH på 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 eller 7,0. Formuleringene ble deretter lagret ved 5oC i
0, 3, 6, 9 og 12 måneder; 25oC i 60 % relativ fuktighet i 0, 3, 6, 9 og 12 måneder, og
35oC i 0, 1, 2, 3 og 6 måneder. Ved avkjølte temperaturer var alle formuleringene
stabile over alle tidsperiodene. rHuPH20 forble innenfor trendgrensene i 12 måneder
10
ved 5oC, 6 måneder ved 25oC, og 3 måneder ved 35oC for testgjenstander med pH
6,0, 6,5 og 7,0. Formuleringer dannet ved pH 5,0 og 5,5 var mer sensitive overfor
forhøyet temperatur, og resulterte i en betydelig reduksjon i enzymatisk aktivitet.
3. Effekt av pH og konserveringsmiddel på rHuPH20 formulert med
15
insulinanaloger
For å vurdere innvirkning av pH og konserveringsmiddel på rHuPH20-stabilitet
formulert med insulinanaloger ved avkjølte (5oC), akselererte (30oC og 35oC), og
agitasjon (25oC) lagringsbetingelser i opptil 4 uker, rHuPH20 ble kombinert med
Humalog£ insulin lispro eller Novolog£ insulin aspart og enzymaktiviteten og
20
stabiliteten ble vurdert. Insulinstabiliteten ble vurdert ved RP-HPLC. Testgjenstandene
ble dannet med 10 Pg/mL rHuPH20, 100 U/mL insulinanalog, 140 mM NaCl, 20 mM
Tris HCl med enten 0,2 % fenol; 0,2 % m-kresol; 0,2 % paraben; 0,2 % fenol og 0,1
% F68; eller 0,2 % fenol og 1 mM benzoat. Hver av disse formuleringene ble dannet
ved pH 7, 7,25 og 7,5, resulterende i totalt 30 testgjenstander (15
25
£
insulin
£
lispro/rHuPH20 og 15 Novolog insulin aspart/rHuPH20 testgjenstander).
Testgjenstandene ble deretter lagret ved 5oC, 30oC, 35oC og 25oC med agitasjon i 4
uker. rHuPH20 enzymatisk aktivitet ble vurdert under alle betingelsene.
Insulinoppløseligheten blir vurdert ved RP-HPLC for testgjenstandene lagret ved 5oC
og 25oC med agitasjon.
30
Det ble observert at rHuPH20-aktiviteten ikke var påvirket av verken
konserveringsmiddel eller pH etter 4 uker ved 5oC. Under agitasjonsstressbetingelsene
(20oC) ble aktiviteten av rHuPH20 ikke påvirket når koformulert med Novolog£ insulin
aspart, og hvilke som helst av konserveringsmidlene ved hvilken som helst testet pH.
35
I kontrast til dette, ble i noen formuleringer med Humalog£ insulin lispro, så som når
223
formulert med 0,02 % fenol, m-kresol eller fenol/benzoat, aktiviteten av rHuPH20
etter 6 timer redusert med opptil 75 %, mest typisk når pH ble forøket. Dette tap av
aktivitet korrelerte med presipitasjonen av Humalog£ insulin lispro.
5
Tabell 45 angir rHuPH20-aktiviteten som var igjen i hver av testgjenstandene etter
inkubasjon ved 30oC og 35oC. Et lite tap av rHuPH20-aktivitet til et gjennomsnitt på
omtrent 85 % av opprinnelig aktivitet ble observert ved 30oC. Et høyere tap ble
observert ved 35oC, spesielt, for eksempel i testgjenstandene inneholdende 0,2 % mkresol eller 0,2 % paraben når pH økte.
10
Novolog£ insulin aspart forble stabil og oppløselig i alle formuleringene under alle
lagringsbetingelsene. Til tross for at oppløseligheten av Humalog£ insulin lispro ble
beholdt ved pH 7,5 etter 4 uker ved 5oC, presipiterte Humalog£ insulin lispro ved
lavere pH (7,0 og 7,25) ved denne temperaturen. Presipitasjon ble også observert
15
under agitasjonsstressbetingelser etter 6 timer.
Tabell 45. rHuPH20-aktivitet gjenværende etter 4 uker ved 30oC og 35oC i
insulinanalog/rHuPH20-formuleringer
Formulering
pH
rHuPH20 gjenværende aktivitet (%)
30oC
35oC
Humalog£
Novolog£
Humalog£
Novolog£
insulin
insulin
insulin
insulin
lispro
aspart
lispro
aspart
7,0
92
92
77
74
7,25
89
92
71
69
7,5
91
92
69
60
7,0
82
78
40
20
7,25
85
81
29
21
7,5
77
71
11
9
7,0
90
89
29
34
7,25
90
89
20
22
7,5
81
79
8
10
7,0
93
94
81
68
7,25
91
92
75
61
7,5
90
73
63
13
Fenol/
7,0
90
88
73
67
benzoat
7,25
91
87
71
63
Fenol
m-kresol
Paraben
Fenol/F68
224
7,5
88
86
64
58
På grunn av at modifikasjonene ville være innlysende for fagfolk innenfor dette
området, er det ment at denne oppfinnelsen kun er begrenset av omfanget av
5
kravene.
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
NO/EP 2300046
1
PATENTKRAV
1.
Superhurtigvirkende insulinsammensetning, omfattende:
en terapeutisk effektiv konsentrasjon av en hurtigvirkende insulinanalog for
5
opprettholdelse av normale blodglukosenivåer, hvor:
den hurtigvirkende insulinanalogen er insulin glulisin eller insulin aspart;
blodglukosenivåene er postprandial blodglukosenivåer; og
en konsentrasjon av et hyaluronandegraderende enzym tilstrekkelig for å gjøre
sammensetningen til superhurtigvirkende insulinsammensetning ved administrering,
10
hvori
den superhurtigvirkende insulinsammensetningen har en begynnende virkning
som nært etterlikner den endogene postprandiale insulinfrigjøringen til et individ uten
diabetes; og
den superhurtigvirkende insulinsammensetningen blir formulert for en
15
administreringsvei valgt fra blant subkutan, intramuskulær, intradermal og
intraperitoneal administrering.
2.
Sammensetning ifølge krav 1, idet mengden av hyaluronandegraderende enzym
er funksjonelt ekvivalent med 10 enheter, 20 enheter, 30 enheter, 40 enheter, 50
20
enheter, 100 enheter, 150 enheter, 200 enheter, 250 enheter, 300 enheter, 350 enheter,
400 enheter, 450 enheter, 500 enheter, 600 enheter, 700 enheter, 800 enheter, 900
enheter, 1000 enheter, 2000 enheter, 3000 enheter, 4000 enheter, eller mer av
hyaluronidaseaktivitet.
25
3.
Sammensetning ifølge krav 1 eller krav 2, hvori mengden av
hyaluronandegraderende enzym til insulin i sammensetningen er 1 hyaluronidase
U/insulin U (1:1) til 50:1, eller er 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1,
12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1.
30
4.
Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, som er formulert for
enkeltdoseadministrering, hvor mengden av hyaluronandegraderende enzym er formulert
for å administrere til individet en prandial dosering for et enkelt måltid, og er 1 U, 2 U, 3
U, 4 U, 5 U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U,
400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2000 U, 3000 U, 4000 U,
35
5000 U, eller mer.
5.
Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4 som er formulert for
multippel doseadministrering eller enkeltdoseadministrering.
2
6.
Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, som er formulert for
levering av et lukket løkkesystem, en insulinpenn eller en insulinpumpe.
5
7.
Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, hvor, når
sammensetningen er formulert for enkeltdoseadministrering, er mengden av insulin for
en enkeltdose fra 0,05 enheter, 0,06 enheter, 0,07 enheter, 0,08 enheter, 0,09 enheter,
0,1 enheter, 0,2 enheter, 0,3 enheter, 0,4 enheter, 0,5 enheter, 0,6 enheter, 0,7
enheter, 0,8 enheter, 0,9 enheter, 1 enhet, 2 enheter, 5 enheter, 10 enheter, 15
10
enheter, 20 enheter, 25 enheter, 30 enheter, 35 enheter, 40 enheter, eller 50 enheter,
8.
Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, som videre omfatter
én eller flere eventuelle ingredienser valgt blant: et gelateringsmiddel, sink, et
stabiliseringsmiddel, et konserveringsmiddel, og en oksygenoppfanger.
15
9.
Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, hvor insulinanalogen
er valgt blant et insulin som har en A-kjede med en sekvens av aminosyrer angitt i SEKV.
ID nr. 103, og en B-kjede som har en sekvens av aminosyrer angitt i SEKV. ID nr. 147
eller 149.
20
10.
Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-9, hvor det
hyaluronandegraderende enzymet er en hyaluronidase eller en kondroitinase.
11.
25
Sammensetning ifølge krav 10, idet hyaluronidasen er en PH20, eller en forkortet
form derav, for å fjerne alle eller en del av et glykosylfosfatidylinositol (GPI) anker.
12.
Sammensetning ifølge krav 11, hvor PH20 er valgt fra et ovin, bovin, eller
forkortet humant PH20.
30
13.
Sammensetning ifølge krav 12, idet den forkortede humane PH20 er valgt fra
blant polypeptider som har en sekvens av aminosyrer angitt i hvilke som helst av SEKV.
ID nr. 4-9, eller varianter derav som har 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %,
94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, eller 99 % sekvensidentitet med polypeptidene angitt i
hvilke som helst av SEKV. ID nr. 4-9, og som beholder hyaluronidaseaktivitet.
35
14.
Sammensetning ifølge krav 1, hvor en superhurtigvirkende insulinsammensetning,
som har en begynnende virkning som er hurtigere enn analogen alene, og en
virkningsvarighet som er kortere enn analogen alene, hvorved, ved administrering,
3
sammensetningen etterlikner nært den fysiologiske postprandiale insulinresponsen til et
individ uten diabetes for å oppnå glykemisk kontroll.
15.
5
En sprøyte eller beholder, omfattende sammensetningen ifølge et hvilket som
helst av kravene 1-14.
16.
Et lukket løkkesystem, omfattende sammensetningen ifølge et hvilket som helst
av kravene 1-14.
10
17.
En insulinpumpe, omfattende sammensetningen ifølge et hvilket som helst av
kravene 1-14.
18.
En insulinpenn, omfattende sammensetningen ifølge et hvilket som helst av
kravene 1-14.
15
19.
Et lukket løkkesystem for kontrollering av blodglukosenivåene i et individ,
omfattende:
en hurtigvirkende insulinanalog, hvor den hurtigvirkende insulinanalogen er insulin
glulisin eller insulin aspart, og et hyaluronandegraderende enzym;
20
den hurtigvirkende insulinanalogen og hyaluronandegraderende enzym er i
samme eller forskjellige beholdere, hvor det lukket løkkesystemet nært etterlikner den
endogene insulinresponsen til et individ uten diabetes.
20.
25
Lukket løkkesystem ifølge krav 19, videre omfattende én eller flere av en
glukosesensor, et leveringssystem for å levere hyaluronandegraderende enzym, og
hurtigvirkende insulin, og programvare programmert for å integrere pumpe og
registreringsfunksjonene, hvorved hyaluronandegraderende enzym og hurtigvirkende
insulin blir levert for å oppnå glykemisk kontroll, og etterlikner glykemisk kontroll i et
individ uten diabetes.
30
21.
Lukket løkkesystem ifølge krav 20, hvor insulinanalogen blir valgt fra blant et
insulin med en A-kjede med en sekvens av aminosyrer angitt i SEKV. ID nr. 103, og en
B-kjede med en sekvens av aminosyrer angitt i SEKV. ID nr. 147 eller 159.
35
22.
Lukket løkkesystem ifølge et hvilket som helst av kravene 19-21, hvor reservoaret
inneholdende det hurtigvirkende insulinet inneholder 0,1 enheter, 0,2 enheter, 0,3
enheter, 0,4 enheter, 0,5 enheter, 0,6 enheter, 0,7 enheter, 0,8 enheter, 0,9 enheter, 1
enhet, 2 enheter, 5 enheter, 10 enheter, 15 enheter, 20 enheter, 25 enheter, 30
4
enheter, 35 enheter, 40 enheter, 50 enheter, 100 enheter, 200 enheter, 300 enheter,
400 enheter, 500 enheter, 600 enheter, 700 enheter, 800 enheter, 900 enheter, 1000
enheter, 2000 enheter, 5000 enheter, 6000 enheter, 7000 enheter, eller mer insulin.
5
23.
Lukket løkkesystem ifølge et hvilket som helst av kravene 19-21, hvor systemet
har evne til å levere det hurtigvirkende insulinet i individuelle dosedeler med 0,1 enheter,
0,2 enheter, 0,3 enheter,0,4 enheter, 0,5 enheter, 0,6 enheter, 0,7 enheter, 0,8 enheter,
0,9 enheter, 1 enhet, 2 enheter, 3 enheter, 5 enheter, 10 enheter, 15 enheter, 20
enheter, 25 enheter, 30 enheter, 35 enheter, 40 enheter, 50 enheter, eller mer insulin.
10
24.
Lukket løkkesystem ifølge et hvilket som helst av kravene 19-23, hvor reservoaret
inneholdende det hyaluronandegraderende enzymet inneholder en mengde av
hyaluronandegraderende enzym som er funksjonelt ekvivalent med 0,3 enheter, 0,5
enheter, 1 enhet, 2 enheter, 5 enheter, 10 enheter, 20 enheter, 30 enheter, 40 enheter,
15
50 enheter, 100 enheter, 150 enheter, 200 enheter, 250 enheter, 300 enheter, 350
enheter, 400 enheter, 450 enheter, 500 enheter, 600 enheter, 700 enheter, 800 enheter,
900 enheter, 1000 enheter, 2000 enheter, 3000 enheter, 4000 enheter, 5000 enheter,
6000 enheter, 7000 enheter, 8000 enheter, 9000 enheter, 10000 enheter, 20000
enheter, eller mer hyaluronidaseaktivitet.
20
25.
Lukket løkkesystem ifølge et hvilket som helst av kravene 19-24, hvor systemet
har evne til å levere hyaluronandegraderende enzym i individuelle dosedeler av en
mengde av hyaluronandegraderende enzym som er funksjonelt ekvivalent med 0,3
enheter, 0,5 enheter, 1 enhet, 2 enheter, 3 enheter, 5 enheter, 10 enheter, 20 enheter,
25
30 enheter, 40 enheter, 50 enheter, 100 enheter, 150 enheter, eller mer av
hyaluronidaseaktivitet.
26.
En fremgangsmåte for å danne en superhurtigvirkende insulinsammensetning
ifølge et hvilket som helst av kravene 1-14, omfattende:
30
velge en hurtigvirkende insulinanalog, hvor den hurtigvirkende insulinanalogen er
insulin glulisin eller insulin aspart; og
kombinering derav med en tilstrekkelig mengde av hyaluronandegraderende
enzym for å gjøre sammensetningen til en superhurtigvirkende insulinsammensetning,
hvor en superhurtigvirkende insulinsammensetning har en begynnende virkning som
35
nært etterlikner den endogene postprandiale insulinfrigjøringen til et individ uten
diabetes.
5
27.
Anvendelse av en sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-14 for
fremstilling av et medikament for opprettholdelse av normale blodglukosenivåer i et
individ.
5
28.
Anvendelse av en sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-14, for
fremstilling av et medikament for administrering til en diabetiker mindre enn 15 minutter
før et måltid, opptil 10 minutter etter et måltid, eller med et måltid, for å kontrollere
postprandial blodglukosenivåene i individet.
10
29.
Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-14 for anvendelse for
administrering til en diabetiker mindre enn 15 minutter før et måltid, opptil 10 minutter
etter et måltid, eller med et måltid for å kontrollere postprandial blodglukosenivåene i et
individ.