Ph.D. Fulltext - Weizmann Institute of Science
...J
7
7
I- -
סנעוה אנז<מט»ת של י׳ול»ר»בונומל<אוט<ד<ם
בר»קמות של חיות
חיבור לשם ק ב ל ת תואר דוקטור לפילוסופיה
מאת
ו»ולג\
גרוס-דנ»אל
הוגש ל ס י נ ט של ה א ו נ י ב ר ס י ט ה ה ע ב ר י ת
ירושלים,
תשביא
םנסזה
^ נ ז י פ ס י ת של פ ו ל י ר י ב ו נ ו ק ל י א ו ס י ד י ם
ברקמות של ח י ו ת
חיבור
לשם
קבלת
תואר
דוקטור
לפילוסופיה
פאת
ויולט
הוגש
ל ס י נ ס של
גרוס-דניאל
האוניברסיטה
ירושלים
תשכ״א
העברית
עבודה
בהדרכתו
במכון
זו
נעשתה
ס ל דייר . T . K
ויצמן
למדע,
לימודו־
רחובות
תודתי
על
נתונה
עזרתו
בבצוע
לד״ר
המתמדת
עבודה
זו.
«.ז.
ליטופו־
והדרכתו
היעילה
תודתי
על
כתובה
ל3רופ"
ה ע ד ו ד ה ר ב שבתן
לי
מ פ ר י ם קצילםקי
בבזגוע
עבודה
תכן
.
שיטות
וחסרים
בדיקת
.
.
.
חעניבים
.
.
1
..
6
6
המבזים
ה כ נ ת ה HNA
8
המסים
הבנת ח ו מ ר י ם
מסומנים
ביסוד
9
רדיואקטיבי
תו&3ות
14
. 1נקוי
14
האנזים
. 2תפקיד ה
RNA
18
.
. 3תכונות הריאקציה
א.
25
האנזימטית
הסובםטרט
25
ב.
תלות
האינקורפורציה
ברכוז
האנזים וזמן
ג.
תלות
האינקורפורציה
ברכוז
הסובםטרט
המיבקובציה
.
.
25
28
Mg.....
ה.
ה pHהאופטימלי
.
34
נ וקלימ וטי ד י ם ס י נ ת ט י י ם כ
ז.
ח.
ט.
נ ו כ ח ו ת שאר
מקום
.4
דיון
סכום
ספרות
אקטיבציה
.•.
י
טריפוםפטים
.
האינקורפורציה
.
.
40
אינקורפורציה
42
ואינקורפורציה של
.
.
.
.
.
.
.
nuciectide acceptor
.
ה נ ו ק ל י א ו ט י ד שעבר
שרשרת ה
.
36
הנוקליאוזיד
רברסיביליות ר י א ק צ י ת
.
.
.
28
בתוך
.
החומצה
.
.
RNA
האסינית
.
.
.
.
.
.
.
49
.
.
58
.
61
.
63,
ב ד
בשנים
הקשורים
הפוריבים
ברור
האחרונות
ב ם י נ ט ז ח של
כיצד
בשנת
נוצרות
1955
פולימרים
השרשרות
בודד
ואנזימטי
מיחידות
'-5מונונוקליאוטיד
דיאםטר
פוםפורוליטי
דיפוםפטים
מת
ב תנת
דורשת
חלקי
+ +
יוני
;עליהם.
ע״י
הריבונ וקליאית
החומצות
והיא
בקשר
הטבעית.
לא
הנוקליאיות
Grunberg-Manago and Ochoa
מבזים
תוך
הפוליריבונוקליאוטידית תוך
שחרור
זה
פוספט
פירוק
מרמה שהם
'3*-5
אנזים
זה מ סנט ז
הפיכה.
המתקבלים,
ביניהן
הבסיסים
ל מ ר ו ת ז&$ת,
דיפוםפטים
Mg
הםינתשיים
הקשורות
להוות
לפוליסכרידים
דרך
ביולוגיות.
למבזים
דהיינו,
האבזימנזיים
כימי
מורכבים
פוםפוריבוזה
לפרק
מסוגל
יצירת5*.
באופן
נוקליאוזיד
).(3)(5)(6
בדומה
עשויה
הקשורים
באופן
הפולינוקליאוטידים
השרשרת
ומרכיביהם,
מה-5'-נוקליאוזיד
של
כמו
בהבנת
; Azotobacter V i n e i a n d i i
הריאקציה
בחומצה
המנגנונים
ה פ ו ל י נ ו ק ל י א ו ט י ד י ו ת של
ונוקה
מולקולריים
איאורגבי).(1-4
התקדמות רבה
והסוכרים
מ ת מ צ י ת של ה ח י דק
גבה
8
המונונוקליאוטידים
והפירימידיניס,
היה
אנזים
הושגה
K
עיקרית
מסיבה
).(1
החדש
זו
אפשר
לסינטזה
היה
להניח
ופירוק
חפולינוקליאומידיס
ה ו צ ע השם
הריאקציה
בה
שהפופפורוליזה
ההפיכה
במערכות
p o l y n u c l e o t i d e phosphoryiase
משתתף
הפוליבוקליאוטיד
פוםפורילזה
ע"י:
)(1
- Rריבוזה,
±
±
Pפוספט
ג ואני ן,היפוקסנטין,
+ nP
n
nXRPP
)(XRP
א י א ו ר ג נ י PP ,פ י ר ו פ ו ם פ ט ,
אודציל,
ציטוזין.
ע״י
-Xמחד
הבסיסים
א י נ ק ו ב צ י ה של
אדבין,
פולינוקליאוטיד
-2-
פוספורילזה
משתחרר
מ נ ו ק ה עם
פוספט
נוקליאוזיד
איאורגני.
ויפוספפימ
מבחינה
בנוכחות
תרמודינמית,
יובי
מנוצלת
,
Mg
הקשר
אנרגית
v
הפירופוםפטי
רילזה
ש3
ליצירת
הריאקציה
הבדלים
' 3 - 5ו ק ל י ח ו ז י ד ד י פ ו ס פ ט ע יי י ה פ ו ל י 3ו ק ל י •יו ו ט י ד פ ו ס פ ו -
הקשר
מעידה על
גדולים
באנרגיה
הכימי).(7הבידוד,
פוספורילזה
אנזים
את
מ
דומה
הסינטזה
האנזים
t
ומ
ה ה פ י כ ה של
כן
פוםפורילזה
י
ממקורות
יוגי
פונומר,
ש3ייס
או
או
יותר
ספציפי
כיון
שנים או
לפולינוקליאוטידים
של
יותר־
מפרק
חומצה
פוםפורוליזה
עוברים
, P o l y AGUC
איטית.
וכן
היציבות
UNA
ע י י י ( G r u a b e r g - M a n a g o (12
במבנה
המכילים
פולינוקליאוטיד
נוקליאוזיד
ספציפיות
בפעילות
האנזים
טבעיים
ה י ח ס י ת של
יחידת
דיפוספט
מחקר
ממקורות
השואתי
שנעשה
וסינתטיים
מהירה.
שבודד
פוספו-
בתערובת
הטרופולימרים
ריבונוקליאית
פוספורוליזה
מספר
אחד
כן אין
הביוםיבתטיים.
ונגיפים.
Micrococcus
אחידים או
האנזים
פועל על
כמו
משמרים
מ ס ו ג א ח ד של
גם
. AGUC
פוליריבוגוקליאוטידים
שהומופולימריס
כגון
שהוא
ע״י
הפוליבוקליאוטיד
בנויים
הוכבו
או
המתקבלים
חקרו
ע י. ( B r u m m o n d(11
דיפוםפטים
ו .CDP
ש ו נ ו ת AU
הפוספורוליזה :הוא
פולימרים
הוסברה
.
.(Grtmberg
lyaodeikticus
א י נ ק ו ב צ י ה של
הומופולימרים,
יחידות
אינו
פוספורוליזה
הראה
ו
UDP, IDP, ADP
ת ע ר ו ב ת של
בכיוון
3וסף
Mg
הכ3ו מ
פוםפורילזה
על
שונים
+ +
גס מ
3-5וקליאוזיד
־
הקשר
( L i t t a u e rאשר
ריבונוקליאית
" 8 A l k a l i g e n e s
הוכן ע״י
סוגי
שאין
הפוליריבונוקליאוטיד
מולקולריים
חומצה
נוקה
ומכאן
ת ו א ר ו ע יי יManago e t a L(3
הגבה
ה פ ו ס פ ו ר ו ל י ז ה של
פ ו ל י ר י ב ו 3וקליאו ט י דים
בנוכחות
ו ה ת כ ו נ ו ת של
הפולימרים
החפשית;
ה ה י ד ר ו ל י ז ה של ש נ י
E . c o l iע ״ י a n d R o m b e r g (6
faecali
רילזה
החלקי
באנרגיה
Azotobacter V i n e l a n d i i
נוקה מ
וכמו
קטנים
הפולינוקליאוטידית.
בלבד
ה ח ו פ ש י ת של
הנקוי
הפולינוקליאוטיד
( B e e r s (8
הדיאסטרי
שינוים
בשרשרת
הפיכות
חומרים אלה
המולקולרי
לגבי
),(10,6
לעומת זאת,
משמרים או
שונים
הטרו-
מחידקיס,
כלפי
שלהם
-
עוברים
הפוספורוליזה
ההנחה
היא
-3-
שהפולימרים
״
קיימים
מ ה ו צ ר ו ת קשרי
ו ה ן במשקל
כ ק ו מ פ ל ק ח י ם א ו שהם
במולקולה־ .
מימן
המולקולרי ,ב י ן
מכילים
א ז ו ר י ם של ה ל י ק ס
בהרכב
הדמיון הרב ,הן
הריבופולינוקליאוטידים
כתוצאה
הנוקלי א ומידי ם
ה מ ס ו נ ט ז י ם ע יי י
v
הפולינוקליאוטיד
אוטיד
K
פוספורילזח וה
AGUCו ה UNA
אוטיד
פוםפורילזה
לציין
ש ה א פ י ב י ו ת של
(.
>11ט1השבעי
ובמיוחד ב י ן
5
ש ב ו ד ד מ , A. vineiandii
ל ס י נ ט ז ת ה UNA
אחראי
האנזים
2.7x10
בתאי
כ
=
ו כן אין
שחפולינוקלי-
החידקים.
י 3-5וקליאוזיד
לםובםטרט,
מ
תומך
בדעה
הפולינוקלי-
עם כ ל ז א ת
דיפוםפטיס
האנזים הזה
יש
היא
ז ק ו ק ל primer
m
להכובת
הפולימריזציה,
הנוקליאוזיד
והרכב
דיפוםפטים
הפולינוקליאוסיד
אארוביות
.
דומה
חלקי
משמרים
עם
),(13
א מ ו נ י ו ם ס ו ל פ ט של
ישנם
י
תמציות עלי תרד
עבודות על
ס ד ר י ם של
ישירות על
ק י ו ם מערכת
חידקים.
א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
הופיעו
מספר
דיפוםפטים
נוקה
בכמויות קטנות ע״י
א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
אכזימטית
פרקציונציה
נוקליאוטידים או
ל ת ו ך ה RNAב ר ק מ ו ת ש ל ח י ו ת ,א ך א י ן
דומה
באופן
).(11
לפו לי נ ו קלי אוטד
מסומנים
פרקורםורים
ת ו א ר ה ע ״ י and Le}minger (14
עבודות על
שליליים)(11־
אנזים
מנוקליאוזיד
א נ ז י ם אף התקבל
נוקליאוסידים
של כ ב ד ח ו ל ד ה
לדה ו
מםפר
מצוי
ב ת מ צ י ו ת של מ ס פ ר
בקטריות
חיוביים או גרם
פוליריבובוקליאוטידים
ואותו
נקבע רק ע ״ י
הריאקציה.
פוספורילזה
! *,נאארוביות ,גרם
המסנסז
הפולימרים
שבתערובת
המתקבלים
הרכב
פרקור-
הוכחות
פוםפורילזה
ל ת ו ך ה RNA
( F r i e d k i n־
ה א י כ ק ו ר פ ו ר צ י ה של א ד נ י ן ,ג ו א נ י ן ,
של
בהומוגכסים
במשך
חומצה
הזמן
אור וטי ת
e
r
y
t
h
r
o
i
d
R
N
A
חתכי
( G o l d w a s s e rבעבודה עם ה ו מ ו ג נ ט י ם
.(15-17) rabbit marrow (18,19
של כ ב ד י ו נ ה ח ק ר א ת ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ח של א ד נ י ן ו א ד נ ו ז י ן - 5 -פ ו ם פ ט ל ת ו ך
4
32
ה
/
. RNA
כ א ש ר ע ב ד ע ם AMP
ב ש ל מ ו ת ו ל ENAת ו ך ש מ י ר ת ה ק ש ר
אינקירפורציה
לשלד
מסומן ב
Pמ צ א ,ש ה AMPע ו ב ר
ריבוזה-פוםפט.
מ ו ל ק ו ל ת ה RNAב א ה מ ן
אינקורפורציה
ה ו כ ח ה כ י ה AMP
ה ע ו ב ד ה .שרוב
חפוםפט-
עבר
p
נמצא,
-4-
הידרוליזה
לאחר
( b e r g e r (20
החולדה
אלה
ס ל ה ,HNA
ו( C a n e i i a k i s(21
ומצאו
פורציה
שהפרקציה
ש ל ה AMP
עוברים
נעשתה
או
)"2
טרי פוספט
מאשרים
4
(
14
ATP
קושר
את
בקצה
ש ר ש ר ת ה. RNA(24)(23
האינקורפורציה
חסרת
נמצא
(
של
תאים
החולדה,
עם
לחומר
עבר
הפוספט
גסי דנות
או
הבאות:
2
עם
3
המערכת
שהוכנה
המשקע
מצא
מכבד
בעל
האחראית
לאיבקוד-
ת כ ו נ ו ת של
חומצה
קשור
1 4
עם
לחומצה
הקשורה
acid-6
ציטי-
^-8-0דנוזי ן
2
ט ר י פ ו ס פ ט )2 2)(AMP
ספציפית
ריבו-
,ולאחרון
כחוםצה
3
הציטידילית
-orotic
1 4
( P P -
והאבזים
( H e r b e r t ,
ב
בתנאים
ל ת ו ך ה UNA
בוצעו
ה א נ ז י מ ט י ת מאד
אחרים פרט
כבד
אוקסידטיבית־
הרדיואקטיבי
אדנוזין
לאדנין.
הופ וגנט
אינקורפורציה
P o t t e r and H e c h t
הרדיואקטיביות
היא
ד ו מ י ם אשר
P
AMPל נ ו ק ל י א ו ט י ד י ם
בעבודה
הומוגנט כבד
פםומן
~3פוספט.
העובדות
היחידה
ב
פ ר ק צ י ו נ צ י ה של
פוספורילציה
איבקורפורציה
P
השונים
המסיסה
ב ת נ א י ם של
אלקלית,
)8-C
מת
במערכת
UMP
כ א ש ר AMP
הידרוליזה
דילית
xשל
וה
ערכו
הציטופלסמטית
הםובםטרטים
נוקליאית.
בנוקליאוטידיס
נוסף
Heidei-
חקרו
c
אינו
הנמצאת
את
ל ת ו ך ה HNA
חולדה־
ה מ ת ק ב ל ב , pH 5
העליון
מהנוזל
(
(25
של
צנטריפו-
Z a m e c n i c kש י ו ת ר
14
שב
ATP-8
לאחר
כאדנוזין
C-AMP
!•ידרוליזה
נכנם
אלקלית.
ל ת ו ך ה UNA
בקצה
השרשרת
דומות
נעשו
ע״י
תצפיות
ומופיע
Paterson
( a n dאשר ע ב ד ו עם ה פ ר ק צ י ה ה צ י ט ו פ ל ם מ ט י ת של ה ו מ ו ג נ ט
L e Page (26
F l e x n e r - J o b l i n g c a r c i n o m aן ע יי י ( E d m o n d s and Abrams (27א ש ר
מ
פרקציות
מסוימות מ
המבדילה
המערכת
את
שבחידקיס
המאפינת
האנזים
המתוארת
את
הבקטריאלי.
האנימליות
ולא
על
המערכת
מצביעות
ס י נ ט ז ה של
. E h r i i c h ascetes carcinoma
האנזימטית
ב ר ק מ ו ת של
חיות
אחת
מהמערכת
ע ״ י, ( G r u n b e r g Manago & Ochoa(3
האנימלית
כמו
על
כן
לעומת
חוסר
נראה שרב
איבקורפורציה
הספציפיות
הריאקציות
ב ל ב ד של
פ ו ל י נ ו ק ל י א ו ט י ד חדש כמו
היא
הנקודות
הספציפיות
של
במערכות
הבוקליאוטי דים
במקרה של
המענינות
האבזימטית
לםובסטרט
שנחקרו
חקרו
האנזים
ל ת ו ך ה , RNA
מחידקים.
-5-
על
נשוב
עבודות
לדון
יותר
מאוחרות
בפרקים
משרת
של
הבאים־
עבודה
זו
היתה
אוטידים
ל RNA
ברקמות
מסומנים
ביסוד
רדיואקטיבי,
ועל
(101
(49 ) C a n e i i a k i s
(Herbert)50 ( Z a m e c n i c K i
של
גלוי
חיות.
נסינו
אנזים
ע״י
המביא
נקוי
לעמוד
על
לאינקורפורציה
האנזים
סיב
ושמוש
ריאקצית
של
נוקלי-
בםובםסרמים
האינקורפורציה
מנגנונה.
להלן
יובאו
התוצאות
הנסיוניות
והמסקנות
המתקבלות
ממחקר
זה.
-6-
שימרת רח8רים
.1
האנזים
בדיקת
רב
בלתי
בהן
הבדיקות
מםיס
השתמשנו
למדידת
ו
ה
ב
ח
צ
מ
הפעילות
1
4
האנזימטית
-
C
ה
8
היו
ו
ת
מבוססות
צ
ר
י
ו
החומצה
הוא
במבחינות
גליצין
,
2
בופר
הריבונוקליאית.
של
international centrifuge
תערובת
הריאקציה
2 . 0 9 . 5
pH
פרוטאין
הנפח
זמן
או
המטרה
שלשמה
5
כ מ ו ת י ת בעת
החומצה,
רחיצה
נעשתה
ח -RNAל ש ם
ב
בדיקת
זו.
ובופר
מצוי
7.4
ו ק ב ו ל של
5.0
מל.
2
0.250
,
בהתאם
מיקרומול
ר
הוסף
המתקבל
קוררו
א
ק
לאחר
פרק
)עבור
י
היה
c a r r i e r RNA
הו״ספת
תוצאות(־
עד
החומצה
בדיקת
ה
נמוך
והוספה
N
.
מכדי
לרכוז
לקבל
סופי
הפרכלורית
שבתערובת
הריאקציה.
פ ר כ ל ו ר י ת קרה
רכוז
בעלת
האנזים
המבחינות
צ
הריאקציה
הריאקציה
ה נ ק י ו ן של
האנזימטית
י
מדת
המוסף )ראה
לדרגת
האינקובציה
בתערובת
חומצה
בתנאים אלה,
הריאקציה
הריבונוקלאית
מל.2.0
ע ״ י e t a l (28.
יסוד
NaCI
המשקע
והחומצה
פעמים עם
נוספת
שפורסמה
המכילה
מבחינה.
הפרוטאין
שלש
הוספת
ב
1 MgC ,מ י ק ר ו מ ו ל , 1 £ 0 1
T
האנזים
ה
החומצה
מג.
כל
דקות
לאחר
הריבונוקליאית
בכל
ז
כמות
ל ה פ ס י ק את
רכוז
השקעה
10$
דקות
ה
.9.0
p
ל י נ א ר י ת של
אינקובציה(.
10
נ
Hהסופי
נערכה
בו
37c
X10
האינקובציה
כאשר
שיטת
וה
5
השתנה
0.35כ ד י
בשטף
הנה
פונקציה
בעלות
דופן
עבה
•
כלל:
י
בי ן 5
פעילות
2.0
היה
cpm^mole
0.45מ ל .
בוצעה
ע״י
מיקרומול
ל 60
שהשתמשנו
בדוד
)
הכללי
האנזימטית
את
הכילה
פירובט
ATP-8-C (3.0
פי
,
בדרך
ק
14
של
הריאקציה
אינקובציה
הזה
של
הכיל
המשקע
;N0.17
של
. 0.01NHC1
הרדיואקטיביות :
. ( H e r b e r t
ה RNA
מהמשקע
0.1
ה HNAב ו ד ד
מספר
חבלתי
pH
שנויים
מסים
M Tris,
והוכן
הוכנסו
בחומצה
שיטה
לפי
לשמוש
נעשה
לגבי
ע״י
,וזאת תוך
1.0
חמום
מל.
ב מ ש ך 30
כדי
להוציא
המצוי
ע״י
ד ק ו ת ב 100°־
הוספת 2
באופן
הוספת
ע״י
קוררו
המבחינה.
,
ב
הדמם
העצמית
י ד ו ע ה של
הבא
של
היא 2
מג.
ל'2
מג.
לשם
ע" י
ע״י
ב
פר
ב
ב
נקבע
1
גורם
ב
ת
ה
נסי וני
1.46כ א ש ר
.
1.0מ ל .
העלולים
צלחיות מתכת,
ם
בו
לשנוי
יש
המשקע
יובשה
שעבר
במספר
טפול
המניות
התוצאות.
שבתערובת
ברב המקרים
של
הבליעה
ל כ פ ו ל את
כ מ ו ת ה RNA
דופן
לשקוע.
י ד ו ע ה ש ל RNA
א
הושלמה על כ ן
מתערובת
ל ש י ט תet a i(28.
הוספת
הריאקציה
כ מ ו ת ה RNA
MgCi
בדיקת
הריאקציה,
( H e r b e r t
בקרת נ מ צ א כ י
ע ו ד ף המלח מורחק
מגיעה
הניצולת
ה ש ק ע ת ה RNA
להשקעה
לאחר
נעשית
עד
רק
כ מ ו ת י ת ש ל ה RNA
מכן,
ת ו ך ש ט י פ ת המשקע
0.01N HC1־
ה RNA
הוצאו
הסופית
N0.70
ונרח־ן ב
שוטחה על
הוספת כמות
4
ב ד ו ד RNA
.
קביעת
מג.
M
0.1
והנוקליאוטידים
ע״י
החשובים
הוספת כהל,
נדרשת
ו ה RNAה ו ש ק ע
.carrier
ז א ת של
בהתאם
נויטרלי
אוחדו
במסך
ג ז ).(windoviess flow counter
נ ס י ו נ י של
אך לאחר
גם
הפלח
ב מ ס ך 15
ז מ ן זח ש ו ק ע ה RNAע ל
נ א ס ף ה מ ש ק ע ש ל RNA
.
פשטות
הוספת ה
.85-90$
-10°־
ב מ ו נ ה של
ATP-C
נקבע
נשמר
ס ו פ י של
בפרק
4
תקון
ה pH
לריכוז
H 00.1 N NHו ה ת פ י ס ה
מ ה ו ס פ ת ה , RNA
בשיטה
כדי
דקות ב
ר ד י ו א ק ט י ב י ו ת נקבעה
כתוצאה
באופן
2
נבדקה
ס פ י ר ו ת של
כזה
MgC1
לשם ה ר ח ק ת ע ו ד ף
והרדי ואקטיבי ות
עד
צנטריפוגציה
של
מהמשקע.
מצוי
התמיסות המתקבלות מהמצוי
ב מ ש ך 30
1.0מ ל ־
צנטריפוגציה,
א ת ה RNA
בופר.
לאדור
N HC1
כמות
כמותי
נ פ ח י ם כ ה ל ק ר 95$ו
הדוגמאות
0
למחר
נערך
נוסף
דקות
:
על מנת
ד ו ג מ א ו ת מהתמיסה
לפני
העברתה ע ל
חומצה
פרכלורית ב
האופטית
ב 260 01/1
coefficient
קביעות
ל ב ד ו ק את
extinction
מדויקות
ר כ ו ז ה RNAב ס ו ף
,
צ ל ו ח י ו ת המתכת.
3 0 1 0 0 °
בעזרת
של
ספקטרופוטופטר
~(29
32.4
ה ר י א ק צ י ה לשם
קביעת
RNA
לאמר
במשך
נמדדה
הצפיפות
דקות,
Beckman
2
1
mg
י ו ת ר ש ל כ מ ו ת ה RNAה ש ת מ ש נ ו
ה י ד ר ו ל י ז ה של
דוגפווות
.
בשיטת
ב ח ש ו ב ר כ ו ז ה HNA
m
c
(
האורצינול
לשם
.
של
-8-
(Drury(30־
בשיטה
יחידת
אנזים :
הגדרת
של
פ ו רצי ה
קביעת
a
של
:
פרוטאין
ה
ה
.
למצוי
מים
אחדים
ה
הוכנסו
2
זכוכית
.
5
.
של
זה
נאסף
)
ז ז
אינאקטיבציה
של
אלו;
חולדות
2
עם
בנות 3
במשך
ב מ ש ך שעה
ב
המימית
כל
הפעולות
הנמצאת
. pH
פעל
משלב
לפנול
EDTA
מבוססת
שה ת מ ש ו
ממין
הוספת M
סופי
ריבובוקליאזה
בטמפרטורת
החדר.
גזע
זכר
נפחים
albino
של
המיקרוזומיס
הופם
בתמיסה
ונבחשה
זה
הוצאה
4
10~ M
זו
4
והנוזל
לזמן.
נעשו
בזהירות
x
לאחר
ערבוב
M
הפרדת
R
בקור
בין
ולפזה
&
.
M0.25
ו
8
של
נפח
שוה
.
נשמרה
ה פ נ ו ל מהשכבה
3דקות
ב
לבין0°
.
הפנולית
8 . 0 ,ה ת מ י מ ו ת
ומשקע
צנטריפוגציה
הוסף
0
.
הציטופלםמטי,
ע״י
המתקבל
,
N
נעשתה
g
הורחקו
ש ל pH ~10
והלאה
שינויים
םוכרוזה.
ב ב ו פ ר 0.1M T r i s , ? ^ 4 .
העליון
A
,
M0.25
ח ו מ צ ה אזיטית.
מזמן
פנו ל
העבודה.
חדשים
המשקע
על
בתערובת
ב 000,loדקות 10ב מ ש ך
לרכוז
משך
ל ק ב ל ת ה RNAה ר י ב ו -
השיטה
שהאנזים
Kirby
פרטי
הנמצאים
20°
על
ב מ ש ך שעה
ש ע ו ת ל נ ו ז ל
(EDTAע ד
השיטת
).(33
ד ק ו ת עם
,
ב
לפי
Lowry
.
ו ( K i r b y (35
פנול
ה מ כ י ל את
המקרוזומים
התערובת
כן
צנטריפוגציה.
2
החולדה
הראה
3
משקע
.
מכבד
להלן
צנטריפוגציה
נוצר
ע י
ותפיסת
)
ע״י
דקות
.0°
ב
הפנול
(
מבוססת
( S-RNA
כמו
לשיטות
ע״י
סוכרוזח.
ב
בשיטת
3
( G i e r e r
0
30
xg105,000
E
במשך
הושקעו
2
(
. RNA
עובר
לכבד
שרידי
נקבע
ו ה RNA
ש לand Schramm(34
מפנקריאם
הרקמה
באופן
אינקובציה
.37°
כפותי
1
RNAה מ ס י ם
מC o l i(32
עבודתם
ציה
הגדרה
האנזים
הגורמת
לאינקור-
RNAה מ ס י ס
זומלי
בכלי
כמות
ב מ ש ך שעה
)
הכנת
עם
אנזים
ATPל RNA
et
הכנת
9
זו
כיחידת
umoie/1
הפרוטאין
ל א ה ו ס ף . c a r r i e r HNA
נערכו
xg0,000I
השכבה
שני
ה מ י מ י ו ת אוחדו
-9-
גו
במשך 20דקות ב
לתמיסה
.10,000
x
g
ה RNAהושקע בהוספת מתנול
הפיסית המכילה את ה ; RNAהוספו שני נפחים ש ל כהל 95$המכיל
2$אצטט האשלגן )מקורר ל
ה RNAשוקע במשך 30דקות ב
(-15°־
המשקע נאסף ע״י צנטריפוגציה במשך 10דקות ב
H
.
P
Tris
0.01M
I
וגציה ש ל
.0°
,±o,000xgוהופם בכמות
7 . 4 ,ע ק ב ו ת ש ל פרוטאינים אשר
. x g 0 , 0 0 0 2 0
דקות ב
ה RNAהושקע מחדש מהתמיסה ע״י הוספת שני נפחים ש ל כהל
95$המכיל
2$אצטט האשלגן; לאחר 30דקות נעשתה צנטריפוגציה ,והפסקע הפתקבל בשטף
ה
א ת נ ו ל R N Aששקע הומס בבופר18ע1
.
ליזה במשך 24שעות כבגד 2ליטרים ש ל
0.01pH
10
M7.4,
N NaCI
ש ל פרוטאינים אשר עברו דנטורציה שוקעות בדרך כלל בזמן
והתסיסה
ב
והתמיםה הצלולה ש ל ה HNA
צ ו ל ת ש ל ה HNA
ב • .4עקבות
הדיאליזה,
עכירות זו הורחקה ע״י צנטריפוגציה ש ל 20דקות
מעבירה.
xg20,000
ליאופיליזציההני.
יובשה עייי
(0.01
הדיאליזה בתמיסה קרה ש ל
ימים ת ו ך החלפות חוזרות ש ל ה
EDTA
.EDTAלפני
) pH 8 . 0
בתכונות (HNAn(32
M ,ב מ ש ך כמה
השפוש נשטפו שקיות הדיאליזה
,נתן לשמור ע ל הדוגמאות המיובשות של RNA
ממושך בתוך אקסיקטור מ ע ל
פרוטאינים
-
מגיעה כדי 50עד 60אחוז מכמות ה RNAההתחלתית.
כדי להרחיק עקבות ש ל מתכות כבדות העלולות לפגע
במים מזוקקים.
,ולתמיסה
1 CaC
2
.RNA4°
ב
במשך זמן
זה מכיל כמויות קטנות של
).(2-3$
הכנת חומרים מסומנים ביסוד רדיואקטיבי
יפוספט
4
14
1
ATP -C-8)-C
אנזימטית.
כשלב ראשון הוכן
( :
AMP- C-8
מ
להלן(.
ה
5משואה)r i b o s y lpyrophosphate
כתוצר
ATP
14
הוכן בדרך ש ל םינטזה
פעולתם של שני אנזימים:
ואצטיל פוספט )משואות 6ו . ( 7
14
-8-0אד-5ין
14
ו
phospho-3
14
ATP-8-Cהתקבל פ AMP- C-8
adenylate kinase
להלן פרטי ההכנה.
ו
acetate kinase
,
-10-
.
( :פוספט-'5הוכן מ ר י ב ו ז ה
p h o s p h o r i b o s y l pyrophosphate
יי' • '.׳
ואדנוזין
) ( P5R
)
+ R
האנזים
עה
ט ר י פ ו ם פ ט ) (ATP
הדרוש
ב
PRPP5ATP
זו
לריאקציה
AMP +
הוכן
יונה
P
א צ ט ו ן של כ ב ד
מאבקת
ע״י
יונה
עם
מצוי
. 5 p H » 4 T r i s
בדיקת
הוצרות ה
נקבעה
באופן
PRPP
פוםפש
)משואה
PRPP
,(2משר
P 0 5ש ה ו פ ך ,
=
*
4
ריאקציות
אנזים
=
בעזרת
בעזרת
3
ו
שימשה
ע״י
5
P
C
295
ן
בשלב
האורוטית
נוצר
)משואה 3
ו
(4
,
שמרים
כמותי
ל
Beckman
14
2
עם כ ה ל
הבליעה
-
ן
מתמציות
ריאקציה
הסולרית
הנוצר
s
P
).(38
בטמפרטורת
ו ז י
P05
זו
.(3950
בתערובת
שמרי
מלווה
הירידה
והיא
הריאקציה
אופה.
בירידה
בצפיפות
נקבעה
החדר.
o
p
h
r
o
y
p
-
P
M
A
):(39
4
1
-^adenine-8--PP+
מיובשים
גודל ב
;NH.).so)2.0ג ר י
Orotate + P
0 UMP
־
הוכן
השמד
.
החומצה
הראשון
(
PRPP
ה
ליזטיס
עם
R
)מקדם
-0 -8דנ
משמרים
)
של
דו-שלבית:
pyrophosphoryiase05
פרקציונציה
מודד
ו
P
ע״י
ספקרופוטומטר
-phorylase
השני
לריאקציה
^ + C
בוצעו
PRPP
(
(
ה א ו פ ט י ת ב !^ן
האופטית
בשלב
ריאקציה
דקרבוקםילציה
(
הוכן
בצפיפות
האנזיפמית
ע״י
האחראית
שבמשואה 2
פ ו ס פ ט ) : ( UMP
=
4
זה
מתחבר
למחר
)
3
:הפעילות
ספקטרופוטומטרי
לאורידין5*-
ו
)37בעזורתמכבד
(:
.
30°
P
ע״י
על
0
4
^
כ מ ו הP-pyrophosphorylase05AMP-pyrophosphorylaseמ א ו ט ו -
פ ר ק צ י ו נ צ י ה עם
קרקע
״
2
C
O
4
4
1
PRPP+
מזון
S
g
כהל־
המכיל
סינתטי
בליטר:
g ;KH0.25.M
4
2
;
4
-11-
ג
1 CaC
2
4
ר
גרי
30
;
תפצית ספרים
גלוקוזה־
יובשו
כ 8
גרם ספר
בטמפרטורת החדר.
התאים
תמציות
אנזימים
שעות
במשך 3
פ ע י ל י ם כאשר
רטוב התקבלו
המיובשים
מערבבים
בטמנזרטורת החדר
7.2
פלי
מכל
ליטר
עוברים
א ו ת ם עם
ס ו ד י ו ם לקטט
תמיסה.
אטוליזה
נפחים
3-5
התאים
חלקית
בופר
);(60$
ונותנים
קרבונט
).(40
4ו
ה ס י נ ט ז ה ש ל;C-AMP
משמרים
פוספט
deamin
;
בקבעה
)IMP
מתקבלת
()
עם
(acetate
ם פ ק ט ר ו פ ו ט ו מ ט ר י ת של
הבליעה ב
סולפט
e
265
האנזים
m/u
adenylic acid
משרירי
ובעזרת
l
y
אצטיל
פוספט:
e
n
).(42
phosphokinase
(
הוכן
מ א ו ט ו ל י ז ט שמרי
נמדדה
אופה
ב ע ז ר ת מ ע ר כ ת של ש נ י
ו d e h y d r o g e n a s e (43
6׳)
(8
הבליעה
ארנבת ע״י
d
ע״י
Sum.
פ ר ק צ י ו נ צ י ה עם
אנזימים
pyruvate
. ( l a c t i c
ADP2^ ATP + AMP
P
)
phosphopyruvate + A
D
+
+ DPN ( l a c t i c dehydrogenase*?— )9( )pyruvate + DPNH +
מידת
P
D
a
!==AMP+ Aג <
=^2ADP+ 2־ a c e t y l - P O
^ AMP + 2 a c e t y l - P O
ATP + 2 a c e t a t e
פעילותו
האינוזין
)מקדם
הוכן
'-5
).(41
a
T
==
קביעה
ע"י
ד י א מ י נ צ י ה ש ל ה AMPב ע ז ר ת
t
ה adenylate kinase
כהל
ע״י
acetate kinase
6
8
M
a d e n y l i c a c i d deaminase
אמוניום
P
)7
ע״י
ה
C
ו
שגרתי
בספקטרום
.(8700
פרקצינציה
14
:
kinase
(הנוצר
ירידה
הסולרית
מה
באופן
-
P
A
הase1sphory110pyrop
ה ו צ ר ו ת ה ADP
כ פ ו נ ק צ י ה של
כתוצאה
הופעת
מחמצון ה
lactate
הפירובט
.
נקבעה
לפי
הירידה
בצפיפות
-12-
ח
acetate kinase
ואמוניום
אצטון
:
הוכן
סולפט
ש י ט ת . ( A v i s o n (45
( , hydroxamate
46
בדיקת
(
האצטיל
פוספט
האצטיל
פוספט
במדד
הוכן ע״י ׳סינטזה
כמותית לפי
כימית
הוצרות ה
+
: ATP-8-C
ה
1 4
בקבע
ATP-8-C
באופן
כמותי
a c i d + TPNH + H
)dehydrogenase
הריאקציות
לפי
4
^(glucose-6-PO
ה ס פ ק ט ר ו פ ו ט ו מ ט ר י ת בקבע
שעור
העליה
של
.
ה
hexokinase
מרקצידנציה
ח ז ו ר ה TPN
עם
אמוניום
glucose-6-Pשל
שהתקבל
םולפט
).(47
dehydrogenase0
.
מהתערובת
x
שהכילה
i
האופטית
הוכן
תמצית
הדרוש
4
הופרד
10)ATP
-P0 6gluconic
בצפיפות
כתוצאה
לפי
acetyl
) + g l u c o s e — g l u c o s e - 6 - P O ^ + ADP ( h e x o k i n a s e
glucose-6־(11
בשיטה
).(44
E. c o l i
פרקציונציה
. (F.Lipmann
1 4
ה וצרות
מ ת מ צ י ת של
באמצעות
עם
m
ב ^ 3 4 0
מ ת מ צ י ת של E. c o l i
זאת
הכילה
כמויות
גם
4
ל ק ב י ע ת הATP-8-CATPה.
ג ם א ת ה AMPו ה , ADP
I
c
ע״י
םפיחה
C
עייי
קטנות
1
על
קולונה
N H
2
שהכילה
ע״י
םפיחה
כמויות
ע ל פחם
הפחם
הולכות
פעיל ב
מוצה
ו ע ו ל ו ת ש ל KCI
חומצי
ב ת מ י ס ת כ ה ל 50$
הפרקציה
.
ש ה כ י ל ה א ת הATP
. ( 2 . 0 p H ) p H
.H 03$NH
המכילה
4
.התמיסה
ה ATPה נ ס פ ח
רוכזה
נוקתה
על
בליאו.
פ י ל י ד צ י ה.
32
טריפוספטים המסומנים ב
הנוקליאוזיד
PP) P - C T P , ( A M P - P P ) P - A T P
3 2
32
P
3 2
חומרים
מספר
ריאגנטים
ב וקליא וזיד-מ ונ ו,
פוספו־פירובט,
די
ביוכימיים
הושגו
ממקורות
מסחריים־
.
ו ט ר י ־ פ ו ס פ ט י ם פ Sigma C h e m i c a l Company
ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת C a l i f o r n i a Corp. f o r Biochemical R e s e a r c h
B o v i n e serum a l b u m i n
Armour and C o .
-13qp
an
?-פוספט
14
ו
op
- p°*pפ י ר ו פ ו ס פ ט מ
Badiochemical Centre
-8-0אדנין
14
C
C-לא ו צ י ן
.SchwartzL a b o r a t o r i eמ
האנזימ10^86
אנזים
במים
אחוז
הוכן
משריר
האנזים
רוויה(
מזוקקים
e
ADP
pyruvate
. ( T i e t z - O c h o a (36
םולפט )40
(
ו
4
1
-
e
r
t
n
Radiochemical Cולין
ב .4°
פעמים.
נשמר
סל
זמן
לפני
ארנבת לפי
ממושך
השמוש
הסיטה
בתמיסה
נמהלה
ה מ ת ו א ר ת ע" י
המכילה
הכמות
אמוניוס
הדרושה
של
-14-
ת ו צ א ו ת
.1
כשלב
לתוך
ה , RNA
ההנחה
תהיה
ראשון
עמדה
שברקמות
פעילות
לפנינו
בעלי
של ח י ו ת
ההומוגנט
מכבד
כגון
חולדה
כבד החולדה.
מכינים
שימשו
םוכרוזה
0.25
M
נעשתה
ב י ן 0-4°
ה של
ההומוגנט ב
תאים
שבורים או
וגרעיני
ב
בתוך
במשך כ ל ז מ ן
ההכנה
הנוזל
הומוגנט
חדשים
במהירות
מסבה ז ו
בתפיסה
חתוך
שכולו
מגזע
המסומן.
נשטפו
של
בנוי
במשך
סונן דרך
העבודה
עם
לשיטה
זו
בהתאם
א י ז ו ט ו נ י ת של
להכנת
albino
והועבר
לתוך
.
הכבד עם
האנזים.
םוכרוזה,
האנזים
החיות
תמיסת
החתכים
זכוכית.
ו ה פ ר ק צ י ו נ צ י ה של
העליון
נעשתה
דיפרנציאלית.
הכבד
3הופוגניזציה
1 0 x g 1 0 , 0 0 0
ונמצא
ש י ט ת ; ( H o g e b o o m (48
שלשה
הומוגניזטור
שבין
כולם
פר מ גי
צנטריפוגציה
0 °ל א ח ר
הוסוגנטים
פרוטאין
כבד יונה
והכבד
UNA
מכבד
יחידות
0.0003
הוצא
במיוחד ב
אנזים
כ ב ד ארנבת
בנות
הונחה
ב א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ש ל ה ATP
0.0007
ל ה ר ח ק תה ד ם .
התאים.
ביותר
ואפרוח
כבד חולדה
ממין זכר
M25־0
העשירות
0.0016
התמציות
הגולגולת
באנזים.
לפיכך•,נבדקו
יונה ,פרה
נוקליאוטידים
הבאה:
הוכנו לפי
M0.25
פנקריאם
האנזים
מרכיבי התא ע ״ י
חולדות
ע ״ י שבירת
הפעיל
עשיר
ל א ל ו ש ל . ( G o l d w a s s e r (18
תמיסה ס ל
ומבודדים את
ארנבת,
ההשואתית
מקור
מימצא
למצוא
לאינקורפורציה סל
מקור
ג ב ו ה ה ש ל . RNA
מהטבלא
מתאים
הגורס
כגון כבד או
החולדה ה ו א
מסתבר
זה
הבעיה
חיים
משבולית
שונות
דברזה
במחקר
בקוי
האנזים
האנזים
םוכרוזה
פעמים
מ ס פ ר בתמיסת.
נפחים
םוכרוזה
.הטמפרטורה
ע״י
דקות
הורחקו
שכבה
כפולה של בד
הומתו
נשמרה
צנטרי-
שאריות
הרקמה
וצונטרפג
-15-
ב
xg150,000
במשך
ב א ו ל ט ר צ נ ט ר י פ S p i n e • Model L p r e p a r a t i v e u l t r a c e n t r i f u g e i U 1
שעתיים.
הפרקציה
בזהירות
ה-5
:
pH
הציטופלםטית
סף
ע״י
היה
בשם
הוספה
עד
pH 5 , 2
7.2
״אנזים
שלב
מיצין
םולפט.
םולפט
) ב ש ע ו ר של
מי
המשקע
השטיפה
המשקע
המופיע
תפיסה
שתי
1/10
מן
בחישה
בחישה
דקות
M
הסופי
פר מ ל .
לפרקציה
ב מ ש ך 30
0.05
P
פרוטאין
מתמדת
נוספת
; H 9 . 0ה pH
והמכיל
עד
בופר
של
פרקציה
הנוזל
התמיסה
זו
0-35$
הפרקציות
Tris0.05
הוספת
שהתקבלו
M
בעלת
לנוזל
:
ק
pH 7,6
תכונה
צ
י
ה
20
1$־
סטרפטומיצין.
המסיס
לאינקורפורציה
התקבלה
70$
התקבלה
לאחר
פר מ ל ,
נעשתה
אמוניום
הופרד
באמוניום
שלישית
במשך
דקות
ה כ י ל ר ב ה RNA
הנותר
רוויה
המתקבל
ס ו ל פ ט ע ד כדי
סטרפטומיצין
של
הסטרפטומיצין.
ההוספה
קבלת
ע״י
פרוטאין
.
10$
סטרפטו
סטרפטומיצין
הגורם
העליון
ש ל 35$
והמשקע
ההשקעה
) ( SP
סל
10-8מ ג י
פ ר ק צ י ה סניה,
ע״י
בהשקעה
האנזים
העליון
סופי
נוספות
באמוניום
פ
בנוזל
סולפט
רווי(.
ר
שנתקבל
במיסה
בתמיסת
הםטרפטומיצין
בדרך כלל כ
לקבלת
לאחד
ונרח-ן
הציטופלמפטי.
השקעה עם
מ נ ו ט ר ל ת של
ההתחלתי(.
העליון
רכוז
הורחק ע״י
תמיסה
צנטדיפוגציה
סולפט
דקות
הוספה
מהנפח
אמוניום
ב מ ש ך 30
רוויה
מ ה א נ ז י ם pH 5
ל RNAב ש א ר
אמוניום
ונמשכה
)פרקצית
:
העליון
עם
סטרפטומיצין
נמשכה
לאחר
בופר
20מ ג ?
ה UNA
שהתקבל ע ״ י
פרקציונציה
חזקה
בערך
המתהוה ע״י
הנוקליאוטידים
רוויה
זח
N0.2
.5.1
תוך כדי
נריי־ן פ ע ם א ח ת ע ם
ל א נ ז י ם pH 5
בנוזל
של
הציטופלסמטית
אצטית
בMTris0.01
א ו ח ד ו עם
הזה
הוצא
המבחינות
״ . 5
הסטרפטומיצין
נאסף
חומצה
משקע
הכילה
pH
או
ל ה ו ר ד ת ה pHל
והופס
והיא
הפרקציה
לאחר
והמכונה
פיפטה.
צנטריפוגציה.
אצטט
העליון
ה מ ס י ס ה של התא
בעזרת
שלב
המשקע
הנוזל
המתקבל
הצנטריפוגה
בשם
עייי
ע״י
סולפט
ע״י
תוך
תמיסה
בחישה
םוילפט.
הבחישה
צנטריפוגציה
הוספה
רווי
ההשקעה
מוספת
עם
נ ו ס פ ת של
) פ ר ק צ י ה 35-70$
הומסו
הוספה,
רווי(.
ב ב ו פ ר pH 7 . 4
תוך
בחישה
ש ל אמוניוס.
-16-
מוצק
םולפט
70-100$
במקרים
הקודמים
ת
בבופר
אשר
התקבלו
7
5
עם
ספיחה
על
פוספט
רווי
הסידן
כמות
את
שעה
מ י נ י מ ו ם של
הנוקליאושידים
נערכה
סולפט.
הדרושה
,
גיל
)חומר
הוספת
תמיסת
הגיל,
נערכה
תפיסת
האנזים
5
הגיל
ומוצא
הנפח
ההתחלתי
הספציפית
ע״י
בעזרת
טבלא
פי
.200
הוצרות
אמוניום
נמצאה,
(43
םולפט
יחידות
yumole
הוספה
מהלך
אנזימים
כדי
אנזים
.
במשך
האנזים
סל
ב
לא
נקוי
מצומצם,
נעשה
האנזימטית
0.4-0.5
לגרום
מג
) 7 . 6ש נ י
ובאותה
8
למהול
הגיל
המחושבת של
האנזים.
נבדקה
0.15
o.Syumole
מכילות
יציב
שבפרקציה
פוספט
האנזים
והורחק
הסידן
פוספט
ו צ ו נ ט ר פ ג ה ה א נ ז י ם
האשלגן
נמצא ש
האנזימטית,
נמצאו
שהאנזים
השלישית
מידה
מ ו ק ד מ ת של
לכמות
אחרים.
להוצרות
הפרקציה
כי
שלושת
נספח
פ י צ ו י י ם עם
גיל
על
רבע
הםפיחה(.
פעילות
כמות
של מ ו נ ו נ ו ק ל י א ו ט י ד
נמצא,
יש
פרוטאין.
פוספט
לפני
ו AMP
מביאה
בחישה
הפרוטאין
הפעילות
התקבלה
פעילות
p h o s p h o k i n a s e - l a c t i c dehydrogenase
ADPמATP
באותה
1
לכל
התברר
בפרקציה
להשתמש
צנטריפוגציה
פ ם כ פ ת את
נוכחות
המערת
ה
M0.01
התמיסה
מס.
נבדקה
כי
.
של
״
בקנה
רוב
דקות
בופר
תוך
כ מ ו ת י ת של
עזר,
לםפיחת
הוברר
מג
קביעה
נסיון
מוצק(
במשך
סולפט
מופיע
גיל :
הגיל
1
נערכה
M Tris
דיאליזה
M
פר
הנוזל
pH
.
7
פרוטאין.
העליון.
נערכה
והמסקע
רווי.
באמוניום
כדי
0.15
.
רווי
צנטריפוגציה
0
אמוניום
70-100$
לקבוע
הסידן
במסך
עד
שעתים
Tris
םולפט
70-100$
עקב
0
ל א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
אמוניום
0
.
מה70$-
בחישה
pH0.01«4
הגורס
נבחשה
לאחר
4
המשקעים
כנגד
לבוזל
רווי(.
העליון
רווי
ל ק ב ל ת 100$
)פרקצית
מאוד,
סל
יחידות
סל
נמוכה
אנזים
המודדת
פהפרקציה
במשך שעה.
של
כמו
כן,
ס ל האנזים^86נ>^0נ. ^1
המשחררת
אינקובציה
לשמרו
adenylate
( p y r u v a t e
ribonuciease
במשך שעה
ואפשר
ADP
עליה
kinase
בפעילות
במסך
ע ם RNA
חודשים
פחות
מסמרים.
ב
-10°־
-17-
1
3זבל«
מם.
בקוי
המבזים
פעילות
סך
שלב
נוזל
יחידות
נוזל
פרוטאין
פגיפר
פל
;
פר
נקוי
א ק ט י ב צ י ה '280/ר
ע יי י RNA
פרוסאין
A 260
עלי ו ן
ציט ופלםמטי
אנזים
הכל
יחידות
ספציפית
מג
בליעה
5
182
31.0
0.0115
85
28.0
0.0330
17
0.65
עלי ו ן
פםטרפטומיצין
71
9.2
18
0.0725
1.09
א מ ו נ י ו ם ם ו לפט
70-100$
פוספט
הסידן
גיל
20
1.28
0.770
10
0.55
2.30
50
42
1.03
200
50
1.29
-18-
.2
הנוזל
אנזים
הגורם
נמוך..
מ כ ו נ ה "RNA
זה
הנמצא
ויריב
ע״י
במיקרוזומים.
משקע
ה
ה מ כ י ל מת
S-RNA
הוספת
ו RNA
כדי
משקל
בעל
להבדילו
הצנטריפוגציה
של
סטרפטומיצין
סולפט.
מולקולרי
הגבה
מ ה RNA
הדיפרנציאלית
ה ע ל י ו ן של
הםטרפטומיצין-חומצח
9
(.
4
בהוספת
כ
ל
ש
כמויות
ע
מ
צ
ש ו נ ו ת של
פ ס ו ס ה נ ס י ה של
ו
בהוספתו
ה
לנוזל
.
לחלוטין.
(,ניתן
גורם
) ( SP
רק
כקומפלקס
בנוזל
1 4
פעילות
העליון של
ל
אינקורפורציה
לתוך
הוספת
משקע
אנזיפטית
1 4
למינקורפורצית ה
לנוזל
העליון.
ATP-8-C
למחר
לגלות
. C-8-ATP
הסטרפטומיצין
עומדת
(.
ביחס
ישר
1
המשקע
1 4
ש ל ה RNAש ה ו כ ן
pH0.1
העליון
Tris
גרם
-C
זו
הוכן
מסיבה
יש
בדרך
היתח שוה
7.4M
המתוארת
אחרי
לשים
נמוכה ממד,
ה
S-RNA
ה ו ר ד ת pHiiל
לב
במיוחד
.5
לאופן
כנראה
ישירות
במקרה
ל פ ע י ל ו ת ה .SP -
ל א ק ט י ב צ י ה של
נערך
ה נ י צ ו ל ת ש ל ה RNA
זה.
זו
מםטרפטומיצין,
היתה
הציטופלספטי
אחוז.
אינו
המשקע
נשאר
מהאבזיס
״שיטות״.
פעילותו
משקע
והאבזים
מופרד
שוקע
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
הסטרפטופיצין
מ ה ק ו מ פ ל ק ססטרפטומיציןRNAמצויה
, SP
ג ד ו ל פ ה S-RNA
ר י ב ו נ ו ק ל י א י ת ) SP
R
בטרק
חלק
הנוקליאוטידים
ה S-RNA
הציטופלסמטי.
פסקה
העוברת
נעשה
ל א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
ר י ב ו נ ו ק ל י מ י ת ) ( SP
הםטרפטומיצין,
בנוזל
ח RNA.
האנזים
פכיל
אלהl.5pHRNA
הגורם
הנוזל
הוספת
אחרי
מצוי
)( S-RNA
בזמן
העליון
םטרפטופיצין-חומצה
N
מ ה ו מ ו ג נ ט סל כבד
נוקלימוטידיס,
מסים"
ל
)Sהמשקע
המתקבל
חולדה
.
מתקבל
A
הציטופלסמטי
ל א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
RNA
מולקולרי
לסמטי
העליון
ת פ ק י ד ה MA
זה
ה ו ר ד ת ה pH
מהמשקע של
בגלל
מהמשקע
הממיסות
המתקבל
הגיעה
של
האנזים
ולאינקור-
סטרפטומיצין
הקטנה
מהנוזל
של
העליון
ה נ י צ ו ל ת עד ל
הנוזל
50-60
הציטופלסמטי
-19-
ו
0.20
0.05
0.10
0.15
)ml (SP
ן
Aאינקורפורצית
:
ה
רכוז
)אנזים:
על
מ נ ת שתשמרנה
אוטידים.
רציה
שה pH
של
פרקציה
בזמן
ההשקעה
הולך
S-ENA
היה ה
S-RNA
).(49
לערך
ה ג ; :י ם של
לתערובת
הנקוי,
אמוניום
ה ת כ ו נ ו ת של ה
הבוקליאוטידים
בשלבים
דרגת
ם ט ר פ ט ו פ י צ י ן( SP ) UNA-
פ?נמים מ ס פ ר
ירד
S-RNA
C-81
משקע
כ פ ו נ ק צ י ה של
ומתבלט
בריאקציה
חסר
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
פעילות
נ ר א ה שיש ל י ח ס
נמוך פ
נקוי
הריאקציה
ם ו ל פ ט 70-100$
כדי
הצורך
רווי(
באקטיבצית
חוסר
הנוקלי-
האינקורפו-
פ ע י ל ו ת זה
לעובדה
.5.2
האנזים,
להוכיח
לאחר
הססרפטומיצי ן,
פעילות
יש
להוסיף
אנזיסטית.
כ כ ל שעולה
טור 5
מם.(1.
ב ה ו ס פ ת ) RNAר א ה
בטבלא
-20-
מציור
מם2.
נמצאת
ביחס
הגדלת
ר כ ו ז ה ENA
מדידת
באמצעות
ופרקציה
שהיא
קרוב
בראה כ י
ל 1
חומצה
אנזים,
ברוב
הפרקציות,
אנזים,
ביותר
עדיין
כ RNA 1 $־
הנקוי,
בשיטת
ה פ נ ו ל מכבד
פלסמטי
אשר משמש
העליון
שהנוזל
14
ATP-C
החולדה
אנזימטית
ה
ל 3
ATP-C
של 5
נסיונית.
הפרקציות
היא
האנזים
בוצעה
נמצא
הקטנה
ומגיעה
כדי
נ י כ ר ת של
בפרקציה
העליון
העליון
במערכת
היא
אחד
עבור
לקבלת
של
לאחר
עולה
לאחר
ה כ ל ל י ת של
ר ו ו י ה ב. RNA
האנזים
הציטו-
המתקבלות בראה
m/umoie2.16
הכפות
אנזים
s-RNAש ה ו כ ן
הציטופלםפמי,
ל
הנקיה
מכילה
ה ש ו נ ו ת של
לנוזל
מהתוצאות
ל ק ב ו ע את
השונות.
פי
גס
280:
מ ו כ י ח שהיא
S-RNA .ע״י ה ו ס פ ת מ ג י
ש ה א ק ט י ב צ י ה של
ביותר.
1.29
בפרקציות
הוספה
הנוזל
העבודה
האנזימטיות
260
כ מ ו י ו ת ש ו ו ת של
nyumoie
על מנת
)או
פרקציה
הנוקליאוטיד(
מכיל כמות
גיל,
זה,
260 1^1ש ל כ ל
מ כ י ל א ת כ מ ו ת ה RNAה נ ד ר ש ת
פ ר ו ט א י ן של
דקות.
מסוייפת,
האקסיבציה
נקוי
מגי
הסידן
האנזים״
14
0.12
אינקובציה
עבור
כמקור
יחס
כזו
יחם
אין
המערכת.
הבליעה
ה ב ל י ע ה של
ל כ ל אחת מ ה ן
להכנת
ו
מס,±.
האנזימטית
כמות
מ ק ס י מ ל י ת של
מ
נקבעה
הפעילות
החולדה.
בגלל
שהאנזים
מפוםפט
הציטופלסמסי ׳אינו
אינקורפורציה
בטבלא
המעידה
במצוי
הוספו
רווי
ב ק ר ו ב א ת כ מ ו ת ה RNA
עובדה
המתקבלת
מעל לתחום
m/u
נוקליאוטיד.
ל ה ש ו ו ת את
בזמן
280
להעריך
העוברת
הריאקציה.
האינקורפורציה
שרואים מטור 6
ר י ב ו נ ו ק ל א י ת או
המתקבלות
על
שבתערובת
הגל
אפשר
כפי
כדי
סל
באורכי
של
מכבד
משפיעה
הבליעה
מכילה.
מםויים
ל כ מ ו ת ה s-RNA
ישר
של
בתחום
כ מ ו ת ה c -ATP-8
אינקורפורציה
אנזים
כמות
זו
ה ו ס פ ת ה RNA
כמות
זמן
בתמצית
של
שונה
האנזים
ש ב פ ס ק ע ש ל ה , pH 5
בשני
סל
מקסימלית
השלבים
ב א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של ה
האחרונים
14
AIP-C50
בנוכחות
RNAהמוסף.
עובדה
מתרכז
זו
י ח ד עם חלק
מתאימה
מהאנזיס
ל מ מ צ א שה
S-RNA
ב מ ש ק ע ש ל , pH 5
מהנוזל
ובאופן
העליון
יחסי
הציטופלםמטי
עומדת לרשות
-22-
כמות
האנזים
שבפרקציות
יותר
האבזימטיות
(50.
et a l
ע״י
ה ו ס פ ת הRNA
שבמשקע
דורש
האפשרות
שהאנזים
העליון
הציטופלםמטי
מ ס ת ב ר שב
בעדנו
השימוש
נמוכה
בשיטה
מהנוזל
זו,
RNAד ו ר ש
שנמצא
S-RNA
ל ג ב י RNA
ש ל RNA
סל
.
האנזים
כזו
ולזהעדרר
היא
הביאו
$
נשארת
5
האנזים
9
בנוזל
ע ל אף
הנקוי.
הציטופלםמטי
כמה
לניקוי
הנוזל
והאבזים
שניתן
־ מ ה S-HNA
העליון.
ה פ ס ד של כ מ ו ת
האפור
מכיל
נסיונות
לגלותה
ורק
יוצא
נ י כ ר ת של
אנזים,
לעיל,
כמויות
לבקוי
הומסך
גדולות
האנזים
ניכר.
כי
הגורם
האנזים
היה
לפעילותו,
ממקורות
ל א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
ענין
בקטריליים או
מ י ו ח ד ש ל RNAד ר ו ש כ
acceptor
ה מ י צ ו י עם
מ ר ק מ ו ת של
לפי
סל
האדנוזין
וכן
,
ו RNA
נמצאו
מכבד
חסרי
פעילות.
עם
בודדו
ונבדקו
האנזי-
דוגמאות
תכונותיהן
ה נ ת ו נ י ם שבסבלא מ ם , 2 .
RNA
חולדה
פנול,
חיות
ר י ב ו ז ו מ ל י ת בעלת משקל מ ו ל ק ו ל ר י
הסלם
הנוקליאוטי דים
דרישות המערכת
גבוה
פ B. c e r e u s
החולדה,
לברר את
בשיטת
ל א י ג ק ו ר פ ו ר צ י ה ש ל ה ATPה מ ס ו מ ן .
כבד
פרקציה
נ כ ר ת של
5
להרחיקם.
ממקורות שונים.
ריבונוקליאית
UNA
כמות
העליון
יותר
לא
צ ו ר ך לברר את
ש ל ה RNA
לאחר
שונות
יתרת
שהנוזל
ז ר י ם שקשה
היה
הנוקליאו-
ז ה ,ה מ ת ק ב ל ל א ח ד ה ש ק ע ת ה KNA
ה ח ל מ ה ש ל ב ה ר א ש ו ן של
כיון
מאשר
איפוא
באנזים
פהפרקציות חסרות ׳הפעילות,
2
ה ע ל י ו ן ש ל pH 5
ספציפיות
שסוג
לפעילותו;
5 . 2מ צ ו י ה
האנזימטית;
הציטופלםמטי
ואמנם הסתבר כ י
עליון
האינקורפודציה
ל א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
ה ה ש ק ע ה ב , pH 5נ ג ר ם ל מ ע ש ה
פרוטיאינים
ביחס
בנוזל
המביא
באחת
מלגלותו.
, pH
שעייי
והנצולת
מטית
ע ל ו ל להמצא
מהפעילות
איפוא,
ל
ספציפי
ש ה א ק ט י ב צ י ה של
העליון
pHש ו ק ע י ם כ
כשליש
של
בנוזל
שהאנזים
באופן
של . p H 5
ב
גם הם מ צ א ו
יותר
כיון
S-RNA
RNAה ו א ש מ נ ע
. S-R
ניכרת
לאיבקודפודציה סל
האחרות־
( H e c h t
של . p H 5
טידים
זל
ג ד ו ל ה של&ט1
הנוקליאוטידיס מזו
נוקליאוטיד.
ש ה ו כ נ המc o l i(32
שהוכן
בדור
חומצה
, ( E .
פמיקרוזופים
ה י ו ת ה RNAמ מ י ק ד ו ז ו מ י ם ס ל
טבלא
ספציפיות
בתור
ה RNA
סס2.
acceptor
לאדנין
ATPש ע ב ר
מקור ה
RNA
מיקרוזומלי
RNA
0011ריבוזומלי
RNA
פסים מ
RNA
מ B. c e r e u s
RNA
מכבד
פ
נוקליאוטיד
אינקורפורציה
m o l e s / mg RNA
0.00
חולדה
0.04
E.
0.39
E. c o i i
0.00
RNA
מסים
מכבד
עגל
1.50
RNA
מסים
סכבד
חולדה
6.00
כבד
החולדה
חסר
איבו
גורם
לעכוב
ו
שבודד
ה
הציטופלסמטי
משקל
בעל
בהסואה
כדי
סונות
תכונות
p
וצע
דומה
מולקולרי
אותו
העליון
כבד
נמוך
מכבד
החולדה
הוכחות על
ה
ה
S-RNA
מכבד
החולדה
לגבי
נבדק
ב מ ק צ ת ב ע ל
M
ל ז ה של
זה
האחרון,
2
חושב
מולקולרי
E
היא
(
הנוקליאוטידים,
הסבילה
ביותר.
מראה
שסוג
בנוכחות ה
סוג
םדיפבטציה
(S-RNA
ממוצע
נמוכה
RNA
דרוש
ההבדלים
שהוכן
האולטראצנטריפוגה
p
של
S-RNA
מאד
סל
לפרות
S-HNA
הנוזל
ה
פעילות
מיוחד
.S-RNA
מכבד
חיות
החיה.
בעזרת
קבוע
את ה
ס ל5pHRNAס ל
אינקורפורציה.
H
; s
מסקל
.
אינקורפורציה
S-RNA
פוספט
ה ו א ה RNA
הפעיל
העוברים
מכבד
מורחב
או
המסקנה
ספציפיות
ריאקציה
פהמשקע
ש ה ו כ ן מc o i i(32
החולדה.
העוברות
לתערובת
הציטופלספטי
הנוקליאוטידים
אחד
בופר
לגבי
ה.חולדה
,
0.05
מהנוזל
ה ATP
אין
כשמוסיפים
מהומוגנט
לקבל את
בכמויות
כל
S-RNA
ל
פעילות
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
הוא
) E. c o l t
האנליטית.
.
s=3.9
20
הפדידה
) 6 . 8צ י ו ר
4.1
24,000-30,000
=
Q
מנתוני
מם.(.3
ע ב ו ר
הםדימנסצ
-24-
).(51
והויםקוזיות
המבנה
מ
E.coli
)(52
תוך
טורה
על
הסבי ו נ י
נחקר
ע״י
של
Cox & L i t t a u e r
ב ה ש פ ע ת ה pH
שמוש
הבליעה
S-RNA
והטמפר
באולטרה-םגול.
מציינים
שהמבנה
המשני
לשינויי
העוצמה
ה י ו נ י ת מאשר ה
מולקולרי.
דומות
הגבה
לו
לאחרונה
ה S-RNA
ע״י
מכבד
של
תוצאות
אותם
הם
S-RNA
החוקרים
יציב
ENA
התקב
עבוד
חולדה.
ציור
סל
: 3
S-RNA
עקומת
מכבד
הםדימנסצי
החולדה
-25-
.5
.s
האנזיפטית
ונכונות הריאקציה
הסובסטרמ
האדנוזין
זין
ד י פ ו ם פ ט ) ( ADP
ט ר י פ ו ם פ ס )( ATP
לראות מטבלא
ניתן
הריאקציה
ה ADPל
בריאקצית
מם3.־
המכילה ,ADP
.ATP
כן,
כמו
אינו
ה מ י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
הוספת
פוםפופידובט
מביאה
להחזרת
נמצא
שהאנזים
טבלא
סובםטרט
אינו
ATP-8-C5.8
הנוקליאוטיד.
ופירובט
הפעילות
.
פ ו ע ל ע ם AMP
הריאקציה
האנזימטית
yunoies ATP
שעבר
אינקורפורציה
1
14
C0.0
-Aפוםפופירובט
1 4
+
+
תלות
פירובט
האינקורפורציה
P
ה
בפערכת
רוויה
בחומצה
האנזים
)ציור
.(4
בשלבים
עולה
לתערובת
האנזימטית מתוך הפוך
ADP-8-
ב.
קיבזה
זאת
מם3 .
סובסשרט
4
י כ ו ל לשמש כ ם ו ב ם ט ר ס
במקום
עם
יורדת.
האדנו
הזמן עד
בפרקציה
תלויה
ישירות
)ציור
.(5
קינזה
ברכוז
A
נקוי
לערך מקסימלי
הנקיה
ביותר
וזמן
האינקובציה
4
-
ריבונוקליאית,
ה ה ת ח ל ת י ם של
בזמן
4.0
האנזים
T
8-C
1
נמצאה
האנזים
תלויה
נפצא,
במשך 10ד ק ו ת
)פוספט
הסידן
ה א י נ ק ו ב צ י ה ב מ ש ך 60
-
דקות
בתנאי
באופן
בדיקה
רגילה
לינארי
ברכוז
ש ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ס ל ATP
אינקובציה,
גיל(
-
נמצא,
ולאחר מכן
היא
שהאינקורפורציה
ואחד כך היא
נשארת קבועה
0.20
0.30
0.15
enzyne
צ י ו רAT?-אינקורפורצית.
האנזים.
protein
C-84
)האנזים:
0.10
פרקצית
0.05
mg.
כ פ ו נ ק צ י ה של ר כ ו ז
א מ ו נ י ו • םולפש 70-100$
רויח(
4 -
3 -
2 -
50
60
40
30
10
20
)Time (minutes
ינקודפורצית
14
•5 C-8-AIPכיבקוב8יה
»3וו־
יה!!נזי:0
_ ה־!נזי:0
של ז ה ן
3רק1יה
ה
8
ו
נ
« פ ו נ י ו 0פ1לי!ט 70-100$
פ ר ק ג י ה ס19ס 00ה ס י ד ן
גיל
ק
8
רויה
5
י
ה
-28-
ג.
האינקורפורציה
תלות
נמדדה
שונים
של
וכמות
ה
מהציור
+ +
Mg
ברכוז
14
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ש ל c -ATP-8
כמות
הםובםטרט
הםובסטרט
, ATP
נשמרה
כמתואר
ביחס
האינקורפורציה
בציור
ק ב ו ע של 2 : 1
מקסימלית
היא
.6
ל UNA
הבדיקה
כלפי
בנוכחות
נעשתה
ר כ ו ז ה .ATP
כשכמות ה
באנזים
כפי
ATPש ה ו ס פ נ ו
ל
היתה
ד.
ליוני
נמצא
יוני
. Mg
הריאקציה.
נקובציה
א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה שלn .
שלשם
הדרישה ל
במקרה של
+ +
לכל מ ג
Mg
המוסף
-8
הבדיקה
אינקורפורציה
קבוע.
היחס
ATPה מ ס ו מ ן
נמצמ
Mg/ATP
נחקרה
שאין
משתנה
לתערובת
c
כל
בין
ATP 2 . 0 - 2 . 5
ATPו ה RNAב ת ע ר ו ב ת
כ פ ו נ ק צ י ה של ה י ח ס
שינוי
3.0
בכמות ה
. ( m y u m o i e s
כנראה
S-RNA01
en ,
לבין
ATP
.7.4
ה ר י א ק צ י ה מתקשר ל
^0.250
,דרושים
)במשך
S-RNA
בדרך
.
כלל
הכילו
14
ה א י נ ק ו ר פ ו ד צ י ה של
ב ת ח ו ם ה pH
בין
6.0-10.0
14
ATP-CpH
נקבע
שהושגו ע״י
עייי
שמוש
הבאים:
השפעה
C
לריאקצית
השגרתית
ה א פ ש ר ו ת של השפעה
1 4
היא
ר כ ו ז RNA
האופטימלי
האנזיפטית
בכופרים
נמצאה
מגי
הא ו פ ט י מ ל י
ה
נבדקה
+ +
Mg
-ATP
6
ה .ה pH
0.650
ל ת ו ך ה S-RNA
פ ו נ ק צ י ה של ר כ ו ז ה
אינקודפורציה
שרוב ה
1
+ +
א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה כאשר
עוברים
שרואים
Mg
כ מ ו ת ה ATPה ע ו ב ר ת
Mg/ATP
שעבר
מנוקה,
M0.001RNA
דרישה
+ +
רכוזים
כזאת.
pH
בופר
7.4-9.0
pH
ב ו פר
Tris
9.0-10.0
pH
בופר
גליצין
ס פ צ י פ י ת של
לאחר
הוספת כל
מובא
הבופר
על
המרכיבים
תאור
גרפי
פוספט6.0-7.4
הפעילות
נ ק ב ע ה pH
של כ מ ו ת ה
האנזיפטית,
אך
ה ס ו פ י של
כל
ATP-7
העוברת
לא
i
m/4. moles
o
—
ATP- C
ro
incorporated
o!
^
per
mg RNA
0>
ציור
.7
האנזים:
ATP-8אינקורפורציחנפרקציה
פוספט
C
הסידן
כ פ ו נ ק צ י ה של ה
גיל.
. H
P
-31-
איבקורפורציה
כפונקציה
לאינקורפורצית
רגילה
ז א ת של
פורציה
סל
ות
שנים
מהגורמים
באים
s_RNAnב ש ע ת
סינטזת
ה
של
טפול
מופיעה
קשר
שהחופצה
הוכח
הנמצא
זין
העוברים
אוטידים
אלו
מתבססת על
עם
,S-RNA
האסייניות
להסברת
.(9.0
תכונה
כזכור,
האינקור-
יוצאת
יחידות
וה
נוקליאוטי-
RNA-8הנם
להשפעה
השינוים
בלתי
ל פ ו ע ל רק
1
הנתונים
האסינית
בקצה
רוויה
פנול
כיון
ע״י
החלים
שינויים
במולקולת
בקצה
מריאקצית
הקשורות
אפשר
אמיניות
אמיניות
נרמה
לנקותה
אםטרי
R
.
(
האינקורפורציה
גס
גם
ע״י
'
או
היות .ועל
קבוצות
נוכחות
לצאת
לאחר
מולקולת
התהליכים
כל
האמיניות
השקעות
H0-'32
של
האמיניות
העובדה
)(59
קשו
חוזרות.
ה י ד ר ו ק ס י ל י ו ת של
לפועל.
בתהליך
האדנו-
הנוקליאוטידים
החומצות
י ו ר ד ו ת ב pHא ל ק ל י
משתתפת
).(53,54
שהחומצות
לקבוצה
להתקשר עם
שרשרת , m a n
ל RNA
חומצות
).(51,55
N
ל RNA
ס מ ו ל ק ו ל ת ה S-RNA
בחומצות
שאי
ש ר ש ר ת הA(51,57,58
הממצא
של
ק ש ו ר ה קשר
אינקורפורציה
מונעת
רב.
מתווספות
האנזים
חשמליים
אפשריות
""carrier
המצוי
הנמצאים
לקצותיו
בריאקציה,
במולקולה
ל
עני ן
ו
הפולינוקליאוסידית
אשר
מטענים
)בין
בעלת
9.5
ה pH
ה pH
אפשרות אחת
כימי
,
בחשבון שתי
בשיטת
האלקלי
לסרסרת
S-RNA
הפרוטאינים כ
S-RNA
תערובת
האנזיפטית הנה
בעלות
שינוי
א.
בתחום
המשתתפים
גדולות,
. pH
רות
המערכת
""primer
מולקולות
ב
נמצא
הנוקליאוסי דים
בנוכחות
חדשות.
ה ATP
ס ל ה pHש ל
הריאקציה.
האופסיפלי
עלולה
הנוקלי-
במקומות
שהחומצות
העליה
ל ה ס ב י ר את
14
באינקורפורציה
ש ל -ATP
c
בתחום
לבדוק
אשערה
זו,
במטרה
מקסימלית
ל מ כ ל אחת
של
חומצות
S-RNA
בנוכחות
תערובת
הריאקציה
מהחומצות
מול
אמיניות
ת ע ר ו ב ת של כ ל
הכילה
האמיני״׳ת;
פוספופירובט;
40
׳10/
בנפח
ז ה ש ל . pH
הוכן
).(56
-HNA
פעולה
החומצות
סופי
סל
אשר
זו
בוצעה
האמיניות,
3.8
מיקרומול
פרוטאין
s
אליו
פירובט
סל'
את
100
;
קינזה;
20
נסינו
ע״י
כמות
לקשור
אינקובציה
א נ ז י ם ש ל pH 5
המרכיבים
. ATP
הבאים:
ATP
מיקדופול
י
ו
של
מיקרו-
S
ri׳T
בופד
-32-
p
0
7.4
5
22
KCI
;
; S - R N A
ה S-RNA
שהוסף
״שיטות״.
הקשור
כהל,
לחומצות
הורחקו
שני
-
P
1
H
ב מ ש ך 30
-RNAחומצות
מצוי
ה ר י א ק צ י ה ע״י
RNA
ע״י
אצטט
התוצאה
בציור
עם
חולק
הושקע
בודד ה
RNA
פ נ ו ל - ,ה ש ק ע ה עם
לשתי
במנה
מנות:
מהתמיסה
הוספת
ע״י
פ ע ם א ח ת p%72$כ ה ל .
טפול,
כ פ ו נ ק צ י ה של ה
,8
מצוי
ונשטף
ללא
וממנו
פנול כפי
בפרק
א י נ ק ו ב צ י ה ע ם M0.2RNAם ו ד י ו ם
האשלגן
נשארה
שתואר
דקות ב ,37°
זה
ד ק ו ת ב ; 3 7 °ה RNA
אמיניות
מובאת
עם
ה ת ע ר ו ב ת במשך 10
ה א מ י נ י ו ת מה
p
ש ל . HNA
ע״י
ליאופיליזציה.
95$כ ה ל ה מ כ י ל
של ה
הוכן
האמיניות מתערובת
החומצות
2
.
הריאקציה
ע״י
; 1 MgCמ ל י
P
א י נ ק ו ב צ י ה של
pH 1 0 . 0
נפחים
השניה
T
לתערובת
לאחר
ביקרבונס
4
מגי
דיאליזה ,ויבוש
אחת
A
מיקרומול
H
1.0
א נ ז י ם , pH 5
נבדקה
לבקורת.
ב נ ו כ ח ו ת כ ל אחת משתי
למדים כי
חל כל
לא
המנה
האינ-
הדוגמאות
ב pH
שינוי
ו
האופטימלי
ש ל ATP
לאחר
שעבר
החומצות
הם
החלים
גדולה
חזקים
נתן,
יותר
ב נ ו כ ח ו ת ה RNAש מ מ נ ו
ב ^ י מ
איפוא
מולקולרי
ה?^1
אם
גבוהים,
הם
פ
בשינויים
1Q»-pH
מקשרים
תלוי
E. coli
ב , pH
להניח
עונים
שינויי
מבנה
השונים.
HNAח
הורדו
כן
הדרושים
אלה ב
החולדה
כפי
),(60
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
ה RNAל א ח ר ה ו ס פ ת ה .א ל ק ל י
משפד את
בתמיסה
הוא
קשרי
או
שהוכח
היתה
הנוקליאוטיד.
השינוים
האינקורפו-
ע״י
טיטור
ב מ ק ר ה ס ל ה RNA
תופעה
בו,
והטמפר
אלקלי,
זו
קשרי
וציטוזין
בריאקצית
המתקבלים
בעל מבנה
מימן.
גואנין
חומצי
לאנזים
,S-RNA
האופטימלי
ה י ו נ י ת סל התמיסה
י ו נ י ז צ י ה ב pH
באינ-
ה ש נ י ו נ י ש ל ה , RNAב ז מ ן
כגון
הבסיסים
בעוצמה
רברםיביליים,
או
בריאקציה
החלים
במבנה
ב ג ל ל שפע
וכמו
שע״י
מכבד
האלקלי
אינטרה-מולקולריים
לתנאים
בלתי
ל ה ס ב י ר א ת ה pH
הסינוים
ב מ י ו ח ד ב S-RNA
במבנה ^RNA
של
העלולה
המולקולה
כתוצאה
ז ה ש ל ה RNA
טורה.
גם
ה , ATP
מסודר
המימן
היא
מבוססת על
ה מ ט ע נ י ם עם
שניוני
ציה
אינקורפורציה
אפשרות שניה
קורפורצית
מבנה
הורדת
האמיניות.
זאת
האמיניות.
ב.
שינוי
החומצות
למרות
הכמות
המוחלטת
צריכה
אם
הגבה
להשתקף
ה מ ב נ ה של
ה א פ ש ר ו י ו ת לר-י-א-קצ-י-ד---,מ4;-נ-די-מטית,
חיינו
ציור . 8
,ATP-8
מינקורפורציתC-
בנוכחות RNA
€<-(<-־ בנוכחות RNA
רווי
כפונקציה ש ל pHn
בחומצות מסיביות
חפשי פחומצות ממיניות
-־-34
ה HNA
לאחר
מצפים
הוספת
נמוכים
),(7.0-8.5
לשם
הוספת
נעשו
ל
A
ב
נבדקה
R
נמצא
כל
קרוב
לודאי
ה
,
הקודמת
הטיטרציה
זו,לא
נוקליאית
על
לשינויים
בלתי
ה
,
ה ח ו ז ר ת של
ניתן
חוקרים
ל ב ד ו ק האם
מיחס
מסוים סל
ב
יותר
HCI
H 8.5
ל
.
P
בריאקציה
ש ו פ ל בה
10.5
ע״י
פעולות
אלה
האינקורפורציה
ז ו ל א
בצורה
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
הנם
8.5
10.5ל
רברסיביליים
חוזרת
ה?^1
בתחום
המולקולה
לצורתה
המטענים.
את
המבנה
השפעת
הנוקליאוטי דיס
במבנה
המשני
בטרם
להביא
דרך
""nucleotide acceptor
ה ס פ צ י פ י ו ת ש ל ה S-RNA
הנ וקליא ו ט י די ם
פולינוקליאוטיד
של
תמצא
החומצה
הריבו
זה־
סינתטיים כ
סינתטי
ה ד ר ו ש כ nucleotide
ב ש ר ש ר ת ד. H N A ,
יכול
בתפקיד
לשמש
נערך
זה
נםיון
במקום
. S-RNA
פולינוקליאוטידים
פוליציטידילית
לית,
)( Poiy-c
אורידילית,
המתאימים
תערובת
בעזרת
הריאקציה
מיקרומול
סינתטיים
ופולימר
ציטידילית
האנזים
כמו
מעורב )
וגומנילית
חומצה
( P o l y AGUC
הוכנו
פולינוקליאוטיד
פוליאדנילית )
המכיל
,(PolyA
אדני-
חומצה
מהנוקליאוטיד-דיפוםפטים
;
פ ו ס פ ו ר י ל ז ה מc o i i(6
. ( E .
הכילה:
מ י ק ר ו מ ו ל מכל אחד
2
ל
RNAב כ מ ו ת
להוכיח
את
המבוצעת
tr-pH
ת מ י ס ת S-RNA
כ ז א ת ש ל RNA
ה ח ז ר ת ה pHמ
רברםיבילים
לסדר
p
ב מ ב נ ה ה S-RNA
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
פ ו ל י נ ו קליא וט י די ם
מספר
החלים
לאחר
מסיבה
בפטרה
דוגמה
דוגמאות ה
שהשינויים
.7-10
acceptor
הוספת
של
שלא
ב י ן שתי
ץ
עקב
הועלה ה H
תוך
פעילות
האנזימטית,
ו ה ו ר ד ת ה . pH
זאת,
הורד
בריאקציה
.
הבד ל
-pHם
העלאת
השערה
ולאחר מכן
.37°
האפשרויות
פ ו ג ב ר ת ש ל ה ATP
לאחר
בדיקת
אלקלי
N
ו.
האלקלי
לאינקורפורציה
משפר את
לריאקציה
היינו
מארבעת
הנוקליאוי״יד
, pH7.4
ד י פ ו ם פ ט י ם 4
2
~
o
l
x
מ י ק ר ו מ ו ל , 1 MgC
2
A
T
D
E
,
-35-
80-2
קרומול
Tween
,
כהלית(.
)פרקציה
ב .37°
זפן
נםיוני
באמצעות
האינקובציה
נוקליאוזיד
דיפוספס
העוברת
דיפוספס
נעשה
בעזרת
הושקעו
די
בלתי
מסים
המוסף עד
מרוכז
מצומצם,
פוספטC--8
בחומצה.
תוצר
לרכוז
הפולימר ע״י
מספר
באולטרה-םגול
1 4
באופן
14
אינקורפורציה
מהפזה
המימית ע״י
המשקעים
2
הוספת שני
המתקבלים
למדת
.
הרדיו
המצוי
ס ו פ י של
45$
ב Poiy-A
אן
כהל95$
בבופר
.
M0.01^1
לבסוף,
יובשו
ליאופיליזציה.
תמיסות
פהפוליפרים
הסינתטיים,
בםפקטרופוטומטר.
ריאקציה
לא
נמוכה מאד
הומסו
34
-C
האנזים;
נפחים
ד י א ל י ז ה נ ג ד M NaCI M
פעילות
נבדקה
לתערובת
פורציח
האדנוזין
מידה
נקבע
פנול
ת מ י ס ת . 1 M MgC11/3
הוכנו
ל
פקםיפלית
ובקנה
נקבע
שעות
EDTA
1
,
-
נעשתה
בהתאם
לתוך
ועברו
הבליעה
מתאימים
בפשך 3
EDTA
נפח
תפיסות
Sכתחליף
העובר
אינקורפורציה
הריאקציה
P
~
לקבלת
מסומן אחד
8Hו ה פ ו ל י מ ר י ם
ו
פוליפריזציה
תערובות
אחוז
.
הדרוש
והאינקובציה
ריאקציה
הינוקליאוזיד
pH
3.4פ ל י
פולי נוקליאוטיד
ביחסים
כשהן
מתערובת
0
הנפח
מכילות
אקטיביות
יחידות
הכללי
אנזים
פוםפורילזה
הוספה
דומה
נתקבלה כל
התקבלה
בנוכחות
פולינוקליאוטיד
ורכוזם
נקבע
הפולימרים
בתערובת
ריאקציה
כ מ ו ת ש ו ה של
. S-RNA
באינקורפו-
רגילה
14
הפולימר
פולי נוקליאוטי ד
של
בשפוש
א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ש ל; ATP-CPoiy-c
המעורב
לפי
אינקור-
, : Poiy-AGUC
ATP-C ?:yuMש ע ב ר ו
אינקורפורציה
נראה,איפוא,
P o l y AGUC
1.48
0.20
s-RNA
1.50
5.00
כי ה
Poiy-AGUCה ו א
ה׳יקרוב״
ביותר
ל
; S-RNA
משקלו
המולקולרי
-36-
הוא
הנמוך
ארבעת
אם
אף
כי
נמוכה
היא
שיהיה
מעורב
כמו
מתאים,
.7
בהשואה
הנוקליאוסידים.
סינתטי
של
ביותר
ליתר
מאד,
ספולימר
נ ו ת נ ת פתח
פעילות
דומה
לזו
Poiy-AGUCב ע ל
הרכב
אסדר
היתה
בעל
הפולימרים
העובדה
להבנת
תורמת
הסינתטייס,
הוא
זה
לאפשרות
סל ה
מ כ י ל את
והוא
ה י ח י ד אשר
הכנת
פעילות,
פולינוקליאוטיד
S-RNA־
נוקליאוסידים
ה ס פ צ י פ י ו ת ש ל ה S-RNA
מראה
כל
הכנת
פולינוקליאוטיד
רצוי
מולקולרי
ומשקל
בריאקציה
האינקורפורציה
הנוקליאוסידים.
נ ו כ ח ו ת ש«ר
הנוקליאוזיד
הפרקציה
דפורציה
הנקיה
ב י ו ת ר של
מ ק ס י מ ל י ת של
פרוטאין-אנזים.
טריפוספטים
אנזים
14
מיקרומול
זו
תוצאה
)פוספט
ATP-C3
מתקבלת
גיל(
הסידן
גורמת
במשך שעה
אינקובציה
ריאקציה
כפי
בתערובת
רגילה
לאינקו-
פר
מגי
שתוארה
ב״שי ט ו ת״ .
נערך
פטים
ה ATP
)
ניסוי
(CTP,UTP,GTPעל
הפסופן
טריפוםפטים
לא
בפטרה
הוכחה
נבדקה
האינקורפורציה
בתערובת
הנוספים,
הגברת
לבדוק
השפעת
או
ריאקציה
ת ע ר ו ב ת של
האינקורפורציה
נוקליאוזיד
נ ו כ ח ו ת שאר
של
14
ATP-C
שהכילה
שלשתן
ס ל ה ATP
אחד
האינקורפורציה
פשלשת
הנוקליאוזיד
באף
שוות.
פקדה
njumoies ATP
שעברו
אינקורפורציה
CTP
11. 3
GTP
10.9
UTP
9.3
CTP,+ GTP + UTP
סל
עכובה:
טריפוםפס
שהוסף
.
בכפויות
או
הנוקליאוזיד
טריפוס-
10.9
11.1
כזכור
מצאה
קבוצת
Hecht-Zamecnik
) ש ע ב ד ה
עם
אנזים
ג ו ל מ י 50),
-37-
מהפרקציה
ס ל pH 5מ ת א י
רבה
את
באה
לידי
ע״י
אינקובציה
זו
האיבקורפורציה סל
ביטוי
בהניחם
לאחר
על
כסוי
ערכנו
משלבי
שה S-RNA
המוסף
)טבלא
לתערובת
להטות
דרוש
דות
לא
נםיון
לפני
עבור
קבלנו
CTP
א ך לא
על
ובמדה רבה
מסבירים
אלו
ה CTP
יותר
תופעה
ה א נ ז י ם מ פ ס י ד את
וציטוזין.
היחידות
דרוש אחרי
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
כן
אדנין
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של ה A T Pע ם
הוכחה
ה ס ו פ י ו ת של
עבר
דרישה
אפשר
1
? .civ
ציטוזין
על
כל
להניח
נוקליאוטיד,
אינקובציה
כ ל ה ש פ ע ה ש ל CTP
שווי
אינקובציה
וכיון
שתואר
מוקדמת כפי
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ח ש ל ה ATP
מ ו ק ד מ ת ש ל ה S-RNA
בפנול.
העבודה
הוספו
ג ם AMPו
PP
המשקל ס ל
הריאקציה
לצד
הורדת
החומצה
ה י ח י ד ו ת של ח ו מ צ ה
האהינית
אדנילית
RNA-CMP-AMP +
)(12
עוד
נוקליאוטיד.
ל ת ע ר ו ב ת לא
פיצויו
הריאקציה
את
הקבוצות
שהתופעה
א(«
נערך
ש ל , pH 5
האנזים,
חוקרים
S-RNAה נ מ צ א ע ם
אדנין
הם מ צ א ו
p
ה ס ו פ י ת ול&פשר את
ציטידין
בנפרד
ע ״ י, ( H e c h t(50
פם,5.
זאת,
של השפעת
נקוי
מ כ י ל את
שה S-RNA
ה
מגדילה
האנזים ב , H 5
ה א נ ז י ם ה «pH 5
היחידה
יחידת
,
נוקליאוטיד.
ח ו ז ר ו ת של
הטרמינליות סל
ל ב ב ו ת מחדש את
פרקציה
השקעות
שבאינקובציה
בוקליאוטיד
האדנוזין
מוקדמת סל
הנוקליאיטידיות
כדי
a s c i t e s tumor c e l l s
ש ה ו ס פ ת י CTP
בפדה
+ aminoacid
נעשתה
בנוכחות
וחומצה
בשיטה
)פירופוםפט
הפירוק
כשהוא
-
ל ש ל( H e c h t(51
איאורגב*()
משואה
הפירופוספט,
ציטידילית
מצוי
דומה
.12
)(13
RNA-CMP + ATP
)(14
RNA + CTP
;
(:
ה
ולאחר מכן
מהקצוות
כדי
AMP
יור
-משואות14,13
^==־ RNA-CMP-AMP-aminoacid + AMP + PP
+ ATP
בפרקציה
38-־
טבלא
השפעת
פס5.
.14
ATP-C
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
C1Pע ל
ATPש ע ב ר
UNA
סובסטרט
14
n!umoles/mg UNA
non-preincubated
ATP-8-C
אינקורפורציה
13.5
1 4
ATP-8-C +CTP
-5א
13.0
14
pH5 p r o i n o u b a t e d RNA
0.29
ATP-8-C
-5ב
6.6
1 4
ATP-8-C +CTP
14
preincubated
s-RNA
12.8
-5ג
ATP-8-C
10.0
1 4
ATP-8-C +CTP
ריאקצית
ד(
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
A
ב(
ה RNAש ה ו ס ף
5
0.
לאחר
קרור
הפסת
המשקע
נערכה
2
הוכן
בשיטה
.
0
MMgCl
.
ה ו ר ד ה pHל
ע״י
והשקעה
המשקע
0
.M0.025KF,P P , AMP
3
דקות ב
ה ו ס פ ת M0.25.2ח ו מ צ ה
אצטית.
מהטשקע
שנתקבל
נוספת
כנ״ל.
הפתקבל
ם ו כ ר ו ז ה , M
. KCl
1
אינקובציה
5
הבאה:
.
.37°
לאחר
נערך
p r e i n c u b a t e dRNA5pH
גולמי
5
בשיטת
ה RNAה ו כ ן
)(5pH
במשך
בשיטה
6
0
פיקרומול
50
דד
הזאת
2
התמיסה,
ג(
הכילה,
לתערובת
נמשכה
-
נזים
הריאקציה
,0.094 Tris
e / m 0 1ה א י נ ק ו ב צ י ה
R
H
p
N
5
ן
1 4
ATP-8-C
נבדקה
בשיטת
הבדיקה
הרגילה
°
הבאה:
7
ל HNA.
KF1,
2
,
ה
פ
מיקרופול
נ
ו
ל
A
דקות ב
.
3
1 MgC, 1מ י ק ר ו מ ו ל
pH
כבמדגם 1
נערכה
N
R
בופר
.
-
מיקרומול
אינקובציה
תערובת
,1
מוקדמת
הריאקציה
P Pמ י ק ר ו מ ו ל
Tris7.6 H^,25מ י ק ר ו -
-39-
האינקובציה
העבודה
אנזים
סל
נערכה מספר
נעשתה
ה 5
בתנאים
פעמים ת ו ך
הוספת חומצה
החולדה.
AMP
הוספת
אינקובציה
התמיסה
עד
המתקבל
הומם
מהפשקע
יכונה
לרכוז
בתערובת
לאחר
,
שנזכרה
לעיל.
ל ה ל ןpreincubatedRNApH5
ל
השואת
מהנתונים
0 . 0 2 5 Mו ל א ח ר
פ י ק ר ו מ ו ל פר מ ל י ,
נערכה
צנטריפוגציה
כולו
הפנול.
מזו
הוסף
לתערובת
1 4
ה פ ע י ל ו ת לערך
בריאקציה
l
e
כ מ ו ת ה CTP
מוקדמת מורד חלק
שרשרת ה ,RNAד ב ר
אינקורפורצית
)
פוספטים
ה CTP
o
אנזימטית
m
/
!
הריאקציה
נלים
בציה
מ ו ק ד מ ת של ה
אנזים
איבה
תערובת
P
העוברת
ATP-C
מושפעת
לשם
p
o
האפור
הציטוזין
ונערכה
בהרבה
בנסיון
נבדקה
A
N
לעיל,
מ נ ו כ ח ו ת שאר ש ל ו ש ת
פרוק
R
מכבד
הכילה1 ,
מיקרומול
שעבר
כפולה
ניתן
אינ
כמעט
להניח
כי
ה נ מ צ א ו ת בקצה
ע״י
האנזים־
הנוקליאוסיד
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה שלי,ATP :
חולדה לפי
הבקורת עם
הנוקליאוטידים
שיטת
כל
האינקורפורציה
נוקליאוטיד
ה א י נ ק ו ב צ י ה ש ל CTP
ב ד י ק ת השפעת
שהוכן
הריאקציה
/
המתקבל
דומה,
m
מתוך
מיחידות
הגולמי ,על
,S-RNA
נמוכה
א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ל RNAז ה
להעלאת ערך
. ( ATP,GTP,UTP
ע״י
זה.
המביא
אנזים ה H 5
חומר
ה ר ג י ל שלא ע ב ר
ל RNAש ל א ע ב ר כ ל ט פ ו ל פ ו ק ד ם .
באינקובציה
זה
14
מ ח ז י ר ה את
) P
קובציה
נוספת.
מם-5.ב.
RL*Aש ל א ע ב ר כ ל ט פ ו ל .
מוקדמת.
והפשקע
ATP-C .נחקרהה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ש ל ה
preincubated RNA
טפול.
הוחמצה
נשבה פעם
&שיטת
נ ר א ה .ש ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
ה ו ס פ ת CTP
נערכה
ה ט מ פ ר ט ו ר ה ל ,0°
תהליך זה
.CTPpreincubatedRNA5pHז ה
ה ת ו צ א ו ת ~ טבלא
2
מ ו צ א ה &1ט1ל*
העליון
,
MgC1
הורדת
דקות
הציטופלםמטי
ב ת ע ר ו ב ת ש מ כ י ל ה )0.25M,(50
ס ו פ י של 1
ל א ח ר 30
ש ה ת ק ב ל ב ,5.2pH
לנוזל
הופם
0.005M
ד ק ו ת ב .37°
ל ק ב ל ת pH 5.2
האחרון
,0.05M
פירופוםפט עד
ב מ ש ך 30
אצטית
ה מ ש ק ע ש ל pH5
Tris pH8.0
ו
חוזרות סל
כדלהלן;
pHה ת ק ב ל ע ״ י
הומוגבט כבד
השקעות
ה ת ע ר ו ב ו ת ב «pH 5.2
נערכה
הפנול,
טרי-
הטרמי
אינקו
בנוכחות
AMP,1מ י ק ר ו מ ו ל
,PP
-40-
KP,5מ י ק ר ו מ ו ל
25
בופר3:נ^,7
וזמן
צ י ה של
-
P
נמצאה
לפי
פג'
s-RNA
T
שיטת
4
A
1
שלאנזיס
הפנול -
T
1 1מ , 8
א נ ז י ם . pH 5
דקות ב .37°
P
אינו
בגמר
האינקובציה,
היה
הכללי
פלי
0.8
ב ו ד ד ה RNAמ ת ע ר ו ב ת
p r e i n c u b a t e d RNA
C
מתפרק
הנווה
מיקרומול
שנערכה
ע״י
פס5.־ג.
האנזים.
נראה
תופעה
שבתוך
האנדוגני
בנוכחות
כי ח
זו
המוסף
S-RNA
ניתן
לא
ל ה ס ב י ר אס
ה א נ ז י ם קשר
חזק
לאנזים
נניח
את
ומונע
,
ה א נ ז י פ ט י ת ע ל ה RNAה מ ו ס ף מ ב ח ו ץ ־
רברסיביליות
ריאקצית
אינקורפורצית
נוכחות
האינקורפורציה
הריבונוקליאוטידים ל
הריבונוקליאוזיד
)(63)(50
חוקרים
)(15
עתי
ו
ה RNA , 5pHקשור ה
הפעילות
מספר
0.5פלי
כ ל השפעה של ה -CTPט ב ל א
ה pH 5מ ב ח ו ץ
ח.
MgC
ה א י נ ק ו ב צ י ה 60
הריאקציה
C
5
,
פ י ק ד ו פ ו ל
2
50
Tris
'
טריפוספטים
מתאר את
S-RNA
ויוצאת
הריאקציה
ב ר ק מ ו ת של
חיות
ל פ ו ע ל תוך שחרור
לפי
דורשת
פירופוםפט.
המשואה:
^ n u c l e o s i d e - P - R N A + PP־ ־ ^ n u c l e o s i d e - P P P + RNA
עובדות
מ ו כ י ח ו ת את
א.האינהיביציה
של
הריאקציה
ה ר ב ר ס י ב י ל י ו ת של
14
אינקורפורצית
ע״י
ATP-C
ו מ א ש ר ו ת את
פירופוספט
המשואה:
איאורגני.
32
ב.
ש ח ל ו ף עם
א.
כזה
באם
עכוב
n
+ +
הסכנה,
במקרה
אינקורפורצית
ואמנם
פירופוספט
. Mg
מסומן ב
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
פירופוספט.
נסיון
פירופוספט
מסוג
כזה,
ATPע ״ י
י ח י ד ו ת AMP
פירופוספט
התקבל
לתערובת
ריאקציה
רגילה.
יש
יש
לב
במיוחד
לתופעה
זה,
יוותרו
יכול
לשים
קושר
יוני
די
יוני
לחול
עכוב
+ +
Mg
+ +
א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
; Mg
כאן
מקום
בעבודה
בעודף
ח ו פ/זי י ם
מרכוז
נ מ ו ך של
היה
14
C -ATP
שינוי
. Mg
לעכוב
בשחרור
בהוספת
בזמן
רכוז
פירופוספט
לפעילות
+ +
לצפות
RNAקשורה
להעיר כי
מ ש נ י ת של
הדרושים
כתוצאה
:ניתן
ל ק צ ה שרשרת ה
ע כ ו ב של
פירופוםפס
שלא
p
ל ATPו .CTP
בצוע
יוני
קיימת
האנזים.
זו
הדרישה
-41-
+ +
Mg /ppי ח י ה
שהיחס
התברר
8
שעברו
יותר
סוה
כי
ATP-C
בעבודה
14
nyamd.es
אינקורפורציה
של
הנמוכה
פירופוספט
של
השפיע
שבה
1
פר
בנסיון
אינו
פירופוספט
על
ל 1
לפחות.
Mg /ppה י ה 2 : 1
+ +
יחם ה
מגי
S-RNA
ביקורת
מתאפשר
במשך
בתנאי
המגנזיום.
היתח
; 12.4זאת ל ה ש ו ו ת
30
דקות
הריאקציה
זאת,
לעומת
ב
אינקורפורציה
npmoies
ל
.37°
עקב
רכוז
מכפלת
מורטופוםפט
גבוה
המםיםות
לא
איאורגני
הריאקציה.
Op
שחלוף ה
ב.
פירופוספט
ש
קרומול
1 MgC
,
׳חומצה
מלי
עד
של
ג־י׳רופדספט
במים
פעמי־ים
מלי
צלוחיות
קרים;
פתכת
יחם
צורך
פחם
נערך
לקבל
שחלוף
מספיק
גדול
רברםיביליות
אקטיבי
הריאקציה
הפחות
גם
״
יכול
אם
p
היה
כי
לקבל
מת
השחלוף
אינקורפורצית
על
עם
P
פלי
פלי
ATP:PP
אותו.
למדוד
של
ע״י
50$
.
32
סלי.
70$
M0.001
הפחם
כהל
שלש
המכילה
נפצא
שוםחו
כי
),PPפירופוםפט(
בקשיים
יש
כדי
דומים
נתקלים
כגון
האנזים
אחרים
גבוהים
של
פירו-
טריפוםפטים.
הנוקליאוטיד .טריפוםפטים
32
5
הוספת
הסוםפנםיה
ברכוזים
הנוקליאוזיד
8.5pH 1
הנ ו ק ל י א ו ט י ד י ם
מן
אנזימים
שמוש
3
הכללי 2.0
שלהסוספנסיה
תפיסת
2
( ,
בופר
נרחץ•
של
עייי
2
)( Norite
ב פ ו נ ה Geiger
במקרה
, ( K e r n b e r(26ו ר ק
הריאקציה
של 0 . 2
נפדדה
3
המכילה
0.8
עם
יהיה
הנפח
Mס פ י ח ת
תנות
לכל
שאפשר
משואה
ריאקצית
:
גיל(.
הופסקה
.0.5
ליטר.
1:40
של
הסידן
צנטריפוגציה
הפחם
פר
,37°
והדדי ואקטיביות
לשמור
פוספט
מצוי
ב
תפיסת
3
.15
מיקרופול^8
KC1
)פפוםפט
של
לאחר
פרוכזת
על
של
ד
$
איאורגני.
אמוניה
בה ד כ ח ת
DNA-p
.
0
3
לאשור
2
P
האינקורפורציה
c p m / y u m o i e
,
דקות
סופי
3
A
2
-
) P
אנזים
15
רכוז
0
ה
T
40
במשך
לקבלת
P
2
מלי
1
על
ל
.
אינקובציה
פרכלורית
5
ה
י
S-RNA
לאחר
CTPמ ה ו ו ה
הוכחה
נוספת
מיקרומול
2
0.2
כ
0
, ATP
?-פירופוספט
לATP
ו CTP
ל ATPא ו
:
של
תלויה
ש ח ל ו ף ה p ,S-RNAה א י א ו ר ג נ י
ל
בנוכחות
ATPא ו
CTP
-42-
ד.
הגבוהה
האינקורפורציה
2.5
1
ב י ו ת ר של
י P Pל
זאת
ל
^ ; m n o i e s
בהשומה
ב
15
ATP
6
דקות
של
m/imoies
4ו
x
העוברים
ATP-C
התוצאות
אינקורפורציה
מרמזות על
ההשפעה
סל
הקטנה
פירופוספורוליזה,
ה HNAע ל
רכוז
כאשר
הפרקציות
הדבר
ש
HNAז ה
יכול
ה י ה ה HNAה נ מ צ א כ ב ר
כדי
המוסף.
בתנאים
הנקיות
ישתתף
לבדיקה
כזה
אנזים
ב י ו ת ר של
מכילות
בפירופוםפורוליזה;
להוכיח
באנזים
המסומן
לא
זו,
בנוכחות
נוצל
CTPו ל א
הסחלוף
אמיניות,
נערכה
מהטבלא
בין
הבדיקה.
רומים
העבודה
ע ק ב ו ת , HNA
אפשרי
מהירות
נמוכה,
ריאקציה
ה פ י ר ו פ ו ס פ ו ר ו ל י ז ה של ה
עובר
ש ח ל ו ף עם
HNA
נוקליאוזיד
ה פ ר ק צ י ה ה מ ס י ס ה של ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה
. ( 5 0 ) ( 6 3 ( g r a d i e n t elution
שיטת ה
פירופוםפט
וזאת
התוצאות
גם כאן
ו ,ATP
בנוכחות
שהפירופוספט
ב CDPמ ו . CMP
בגלל
שלנו,
^11 mole) p ^ ^ t a n d e
חומצות
בהן
ברורה
בתנאי
עדיין
בגלל
לכםות על
שהפירופוספט
בהן
דקות
הוכחה
השחלוף.
9.12-10
הפרקציות
ב
אך
ריאקצית
נ ע ר כ ה כ ר ו מ ס ו ג ר פ י ה של
טריפוםפש,
לפי
formate-1
-Dowex
על ק ו ל ו נ ה סל
5
דומים
אין
במשך 5
אינקובציה.
קיומו
א נ ז י ם אחר
מובאות
בטבלא
האיאורגני
קטנה
עקב
ההשפעה
m
p
של
שחלוף
המופיע
c
באותן
מס6.־
המסומן
סל ה
/
תמיד
מופיע
על
S-HNA
רק
האינקור-
י
פורציה
אינו
בבדיקת
הפירופוספס
עובר
32
שחלוף
pp
בתוך
שחלוף עם
,
פוספט.
ט.
32
סל
32
ה, CMP
1 4
32
?
לכך היא
היות
לעמוד
אורטופוספט
הנוקליאוטידים.
והם
הנוקליאוטיד
כדי
המסומן.
ובפרקצית ה
הסיבה
מקום
על
זהום
יוצאים
סעבר
) פ ר ק צ י ה של
רדיואקטיביות
P
C
ב ת ו ך ה CDP
סמוך מאד מחד
אינקורפורציה
שעבר
הסידן
לשני
בתוך
M
ושל
ע״י
עם
P
מופיעה
-
ו
א
פוספט
בהפרדה
על
גם
ר
ט
ו
איאורגני
הקולונה.
ש ר ש ר ת ה HNA
אינקורפורציה,
מכבד
גיל(.
מסומן
מועטה
פירופוםפט
מ ק ו ם ה ATP
פוספט
איאורגני
ב ב ד י ק ה עם
AMP-C
מנוקה
(
ה ח ו ל ד ה עם
מצוי
בודד
S-HNA
14
C -8-ATP
בפנול )ראה
מסומן
ואנזים
״שיטות״(.
-
-43-
פס6.
טבלא
32
אינקורפורצית
32
P
איאורגני
P
CTP
לתוך
נוקליאוטיד
אינקובציה
3 2
3 2
p
2
p
פסים
cpmפ ר
פרקציה
CMP
»CDP
25
557
1950
RNA
384
2487
RNA
65
82
0.004M
3
בחופצה
CTP
י
qp
2.5
x
א
MP0.004+
ו
מג354
,
p^p
(
(
בנוכחות 2
^moie
)
/
פיקרומול
)
0.4
ופר
,
2
S-RNA; KCIה ו ס ף
פול
סופי
של
הוספת
כ
4.0מ ל י ,
חומצה
. carrier
כפצוין
וזפן
CTP
1
0
בטבלא.
פרכלורית עד
הנוצר
הורחק
ע״י
העליון
נוטרל
ע״י
מיס,
f o r m a t e X2
אמוניום
מלי
;
לנוזל
לפי
העליון.
פ ו ר פ ט pH 5
ההפרדה
התקבלה
מבחנות
, CDP;22-35
מבחנות
.60-82
וה
,
אתנול
כל
שהכיל
פרקציה
נקבעה
כפי
;47-58
נספחו
) 5פ ל י
שהובא
בטבלא.
הריאקציה
עייי
עמ
ב 1$
ונשטף
. ( g r a d i e n t
ה
reservoir
פ ל י מים ".־ נ « ס פ ו
פירופוספט,
אקטיבי,
מרוכזת
חומצה
ב
כרופטוגרפיה
מבחנות
הוספו
bromothymol b l u e
על
;28-37
הופסקה
מ י ק ר ו מ ו ל CMP
ק ו ל ו נ ה של
על פחם
אמוניה
CDP
היתה
ונשטף
צנטריפוגציה
ה כ י ל 300
ה ב א ה , CMP :
הנ ו ק ל י א ו ט י ד י ם
אפוניה
mixer
מבחנות
ה ו ס פ ת KOH
מיקרו-
בעלת נפח .
-0.4
צנטריפוגציה
נערכה
,
ה
Tris8 pHמ י ק ר ו -
האינקובציה
של^.0.251
הורחק
י
,2
דקות ב .37°
ע״י
ש י ט ת ה e l u t i o n (63
צ
8
תערובת
האינקובציה 5
0
? -פ ו ס פ ט
ק
מיקרופול
הנוצר
שהוספו
פ
לרכוז
הנוזל
c p m /
י
סופי
המשקע
פרכלורית.
^moie
u
2
3
אי-
פוספט
מבחנות
נשטפו
בליטר(.
מלי
Dowex-iהכיל 1.0M
5.0
ס ב ו ת של
איאורגני,
;43-57
במים,
CTP
ומוצו
,
ב 50$
ה ר ד י ו א ק ט י ב י ו ת של
-44-
בערכה
זידים.
הידרוליזה
ההידרוליזה
בטמפרטורת
אלקלית של&ג8-8זה,
האלקלית
החדר.
קליאוטידים
ע״י
בתנאים אלה,
נוצרים
הנמצאים
בעסתה
והופרדו
NaOH0.1
N
e
5
עלולים
לעבור
l
u
של
'-(2נוקליאוטידים סהנו־
הידרוליזה,
לבסיס
או
י5
החופשי
.9
')3או
' AMP-(2או
לנוקליאוזיד
e1mo1/1א ד נ ו ז י ן ל א
ו
c m ) Dowex-1-format,e(, x 3
4
יוצא ב
0
.
2
מ נ ו ת סל 3מ ל .
.
.
0
פ
חופצה
עייי
לאפין
הרכיב.
הרמצה
הכתפיס
P
M
A
ר
$
פדת
י
N
ת
באופן
מדויק
כ ר ו פ ט ו ג ר פ י ה שמש
בעזרת אור
נקבע
9
5
בין
-
מהררי ואקטיביות
אקטיביות
כ
0
ה פ ר ק צ י ו ת של
נבדקה
יותר,
ניר
לגבי
נערכה
ב י ח ס של 6 6 : 1 : 3 3
)או
כל
במים.
'AMP-(2
אוחדו
ורוכזו
פרקציה.
כדי
וכממים
)בפח
ונוקליאוטיד
ניר
פקום
דיםטריבוצית
המתקבלות
,14
X
9
הקולונה
' ., A M P - ( 2
בראה
מופיעה
שהאדנין
ע״י
32
א ו 8-C
כמדנוזין
לכל
התערובת:
בנפח(.
ס ם 7 .מ ר א ה את
בוקליאוזיד
מסומנים.
כרופטוגרפיה על
a
טבלא
'3
שטיפה
פרקציה
w tman N o . i
אולסרה-סגול.
הנספחת על
')3או
.
ה ק ו ל ו נ ה ע״יי
הפבחינות פכל
כאינדי
1 . 1ו ב פ ר ק צ י ו נ צ י ה
פ ו ר פ י ת ו ה
הרדיואקטיביות
אי ז ו -ב ו ט י ר י ת :א מ ו נ י ה :מ י ם
הרדיואקטיביות
-
פ
נוקליאוטיד
כניר
י ו צ א את
חופצה
ליאופיליזציה.
כל
האדנוזין
,
ו
ה MAהידרו־
n
i^umoie
0
')3או
).(50
'r!MP-(2
משמש
שמש
N
מהקצוות,
כבםכמה:
base
׳^5
פחות פ 1$
bromothymoibכש,
נאספו
במסך
ונוקליאוזידים
ציור
פירוק
שעות
י .3
A
התנאים
1
)או
base
/
אלה של
8
'3
ב ת ו ך ש ר ש ר ת ה ,RNA
base
ה מ ו נ ו ב ו ק ל י א ו ט י ד י ם מהכד—
AMP.
ו ר ק 5$של
בוקל-יאןמיד
תופס
הרדיו-
בעיקר
מקום
-45-
טבלא
מקום
14
ה
3 2
cו
P
מס7.
בה»דרוליזטים
פיקציה
סובסטרט
ש ל RNA
אלקלים
מההידרוליזט
$
האלקלי
מהאקטיביות
של ה
הכללית
C
(1
AMP-('2)'3 5 - 7
1 4
81
8-C
(AMP-('2״3
3 2
* A M P
ATP
;-
c
׳
13-19
32
(3')2-
,
M
^
(PP- AMP(5.5
־
C
r-("^23)*3 7
5
B M P - (*2)'3+^1מ 3 ' ( 2 £ ) 4
תערוכת
4
מ י ק ר ו מ ו ל 1.3
כופר
ל
הריאקציה
5
ATP10
2.25
וזמן
CTP,GTP
0.5
9.5 ,
מגי
מלי
0.1
וזמן
מיקרומול, 581
פירובט,
נפח
5
כללי
שלשת
ה
מלי,
ע
זמן
של M A
ב
'
ם
פורמט
יצא
ה
P
M
M
G
יחידות
גליצין
קינזה,
עברו
P
הכפה
אנזים.
בופר
2.0
30
מגי
הידרוליזה
C
e
ביחד
מיקרומול
9.5
דקות ב
ה
M
אנזים.
,1 MnC
2
נפח
כללי
.37°
32
ו
lof
מיקרומול
2
PP- cpm/yumole
ד
n
מ י ק ר ו מ ו ל , MgC1 5
דקות ב
אינקובציה
ח
U
60
פרוטאין
37°־
S-HNA
פירובט
הדגמים
P
TrispH
מיקרומול
פרוטאין
0.8
90
) AMP
40
דקות ב
גלי צי ן
מ י ק ר ו מ ו ל , ( M ) A T B - c 1 ^ / c p m 1 0 x2.5
,
אינקובציה
מיקרומול
2
,
יחידות
S-BNA
cimng
בופר
פוםפופירובט,
2
האינקובציה
ל
מ י קר ו מ ו ל
1 MgC ,מ י ק ר ו פ ו ל
0.25
1.0):6י0תערובתר י א ק צ י ה
מיקרומול
C-8-cpm/ytimoie
25
K C I ,מ ג '
הכללי
ל , UTP,2
)
מיקרופול
מלי
19
הכילה:
()x2.5
, pH10 9 . 5
)3
t
)
עם ה
2
pH,20מ י ק ר ו מ ו ל
פוםפו-
S-HNA,0 . 1 1י ח י ד ו ת
אנזים.
.37°
אלקלית
'
1 MnC
,
ומפיחה
a
2
m
)
.
2
על
r
'
P
קולונה
o
M
A
f
(
,
-
,
-46-
טרמינלי,
ת
התוצאות
ן
עובדה
מתקבלות
נעשית
עה
בנוכחות
עבודה
המוכחת
כאשר
עייי
הופעת
האינקורפורציה
שלשת
יתר
של
אדנוזין-
על
UNAAMP-C
הנוקליאוטידים )
ש ל and M a h l e r (64
נקור
עודף
c
( C h u n g
מערכת
)או
4
ל
GTP,UTP,CTP
המתארת
'3
(.
1
לא
דומה
'-(2
מזמן
המביאה
הופי
אינקור-
.
לשרשרת
פורציה
הריאקציה.
-
הפולינוקליאוטידית
בעבודתם
הם
זו,
ע״י
השתמשו
הכנסת
בארבעת
שינויים
מסוימים
הנוקליאוזיד
בתערובת
טריפוספטיס
14
( GTP,UTP,CTP,ATP-C
)
.1:15
ייתכן
הגבוה
והרכוז
בתערובת
של
זו,
ניר
על
בנפח(.
ג
לחזור
של
Dowex
על
Chung
ולחלק
גרפיה
ל
עם
R
-
1
לפי
ניר
על
תוצאות
אינה
שמעט
מהאדנוזין
-
הועבר
e
שתואר
השרשרת.
w
o
לעיל,
אור
ב
שונות.
הידרוליזוז,
רק
ם
וחולק
לשני
כרו-
:מים
כל
י
מתערובת
בסעור
ע״י
:אמוניה
אולטרהםגול;
נ
בשימוש
השרשרת
נעשית
איזובוטירית
4
תוצאות
לתוך
בעבודתם,
בעזרת
0
נתקבלו
השיטה
שלהם.
הקולונה,
אלה
שההפרדה
בכרומטוגרפיה
נכנס
ריאקציה
כמות ה
ול 24-35$
פוכיחות
כשמשתמשים
בתערובת
x
נקבע
H
שלהם
חומצה
היא
כתם
ו
נחתך
ן
ריאקציה
חלקים;
):1:33
לחלק
שעשינו
לזו
דומה
אחד
כ ר ו מ ט ו - - 1 - f o r m a t e
14
חדה
ATP-C
הוא
הכתמים
ב ו ד ד ה ,RNA
בהפרדה
ניר.
14
אצלם
שלהם
ה י ח ס Mn:Mg
טריפוםפטים.
אינקורפורציה
ה י ד ר ו ל י ז ט ה HNA
ז
העבודה
של
Mgו Mn
התערובת
לנוקליאוזיד
השני
על
5$
Mgבהשואה
כשהמימיס
מקום
בנוכחות
הקריטיות
מתקבלת
פרקציונצית
פטוגרפיה
66
של
+ +
י וני
ריאקציה
.75$
נפח
שאחת
בכמויות
הנקודות
שוות
יוני
ב י ח ס Mn:Mg
ע״י
על
"הזדנבות"
סל
במקרה
בין
מתוך
כך
יש
)או -AMP-(2 .
של
ההפרדה
האדנוזין
ערך
tailing
ל א ז ו ר ה .AMP
להסיק
שהסיבה
יAMP-(2
לכך,
היא
בממון
s-RNA
ה נ ו ק ל י א ו - C h u n g
יותר פ
שהאנזים
'3
c
)או
ניר.
והפרדת
גבוה
ל
בכרופטוגרפיה
על
ייתכן
D
לא
'3
על
התקבל
1
הגיעה
רק
קולונה
13-19$של
הפנוקה
שלנו
,כפי
שformal
אינקורפורציה
גורס
בעיקר
בתוך
לאינקור-
-47-
פורציה
השרשרת.
לקצה
לאחר
לדעת
היה
קביעת
מה
הוא
2
(
זה
בודד
כך
שהפוספט
14
מ ק ו ם ה.HNA,AMP- Cא ש ר
השבי,
הנוקליאוטיד
עבר
אליו
אינקורפורציה
בקשר
3
שסומן
הידרוליזה
והועבר
קשור
נשאר
בשיטה
אלקלית.
לנוקליאוטיד
ל
ה .AMP
זו,
הסמוך),ציור
למשרה
בעזרת
נקרע
מענין
נוקליאוטיד
הקשר
.(9
זו,
הדיאםסרי
שיחידת
בהנחה
3 2
AMP
ה
אלקלית,
כ
נמצאת
לא
')3או
ב ש ר ש ר ת ה RNA
האדנוזין
יהיה
של
'-(2פוםפט
כנוקליאוטיד
המתקבל
טרמינלי,
מסומן,
הנוקליאוטיד
וכל
הסמוך.
אזי,
לאחר
הרדיואקטיביות
הידרוליזה
לאחר
הידרוליזה
תופיע
ופרקציו-
32
e
של ה
בטבלא
ה , RNA
'3
t
מס7.־
באחוזים,
היה
Heמאשרות
בכל
,CMP
קשור
תצפיות
מערכות
כות
'3
קםילית
של
מבטאות
את
רוב
המוכיחה
השרשרות
על
קיום
ה ,RNA
יכולים
מם,5.
לא
ה
CTP
ש ה AMP
אינקורפורציה
שעבר
ב י ח י ד ו ת .CMP
ו and H e i d e l b e r g e r (66
פנוקות.
הפועלות
י ח י ד ו ת CMP
וטוענים
חוקרים
in vitro
,
על
להסביר
הוםפת?01
את
בקיום
השפעת
מביאה
הCTP
לעליה
אינקורפורציה
h
היחידה
להמצא
י ח י ד ת . AMP
הצורך
t
לפני
שחייבות
של
אלו,
עובר
הרדיואקטיביות
נמצאה
הפרקצ-ה
לקצה
נםיונות
שרשרת
אלה
אלה
ה AMP
, ( H a r b e r s
מצאו,שבנוכחות
לקבוצה
מתקשר
אשר
המער
ההידרו-
הציטידין־
איגקורפורציה
מימצאים
הרדיואקטיביות
בתוך
של
Caneiiakis
e tai)66(Heideibager
שתי
דיסטריבוצית
שהםתימו
, ( P a t e r s o n
שלהם
ק
ל
התוצאות
של
אנזימטיות
האנזימטיות
-
נ
פרקציה.
עובדה
דומות
o
אלו
לאותן
) and L e Page(26, ( 6 5
חקרו
m
תוצאות
)או ' - ( 2
ה, RNA
a
r
f
ת
ב
ו
המתוארות
שתי
e
c
הטרמינלית
י ח י ד ו ת CMP
המבנה
על
המוצע
H
( ,
ש ל AMP
בקצה
ידם
על
האינקורפורציה
בא י נ ק ו ר 1ו ר צ י ת
כשארית
ציסידין
בקצה
הRNA
מתואר
י ח י ד ת CMPב ש ר ש ר ת הHNA
של
מביאים
ה.ATP
נוקליאוטיד
שרשרת
שתתאפשר
בציור
לפני
ATPל ת ו ך
כדי
הוכחות
.10
יחידת ה
AMP
כזכור
מטבלא
p r e i n c u b a t e d RNA
בקצה
השרשרת
-48-
הפולינוקליאוטידית
ש ל ה , RNA
ופכשירה
מותה
לקבלת
ס ל . AMP
ציור
.10
תאור
ק צ ו ו ת ה UNA-8
היחידה
הטרפינלית
-49-
אקטיבציה
.4
ה S-RNAש ק צ ה ו
לשתי
צמודה
ו מ י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של ה ח ו מ צ ה
בסדר
בנוי
י ח י ד ו ת, ( C M P(50
ספציפיים.
ביולוגיים
מיוחד,
מופיע
מגיעים
למסקנה
בתהליך
סינטזת
נראה,
הפרוטאינים.
נפרדים,
בהם
פפטידי
בתוך
ח ל ק י ק י ם של
.א.
ה א ק ס י ב צ י ה של
adenylate
כתרכובת
יחידה
בעלת
החופצה
פועלות כ
שקיימים
ה א פ י נ י ת פהמצב
ל פ ח ו ת שלושה
ריבונוקליאופרוטאין
החומצה
ומחרים
" " c a r r i e rשל
החופשי
האמינית
טרמינלית
ח ש י ב ו ת רבה
מ ע ב ו ד ו ת י ה ם של( H o a g l a n d(53
ש מ ו ל ק ו ל ו ת ה RNAה ז ה
עובדת
דהיינו,
הממינית
עד
AMP
בתהליכים
),(67-71)(54
חומצות
שלבים
להיותה
מפיניות
אנזימטים
ק ש ו ר ה קשר
):(72
תרכובת
ויצירת
amino-
ביניים
.-acyl
ו
ולבסוף,
מקום
שם
ב.
העברת החומצה
האמינית
ה מ ו פ ע ל ת ל , s-RNAת ו ך
ג.
תרכובת
הביניים
אמינית
העברת
נ ו צ ר הקשר
בשלב
האפיניות
תוארה
נוצר
גגי.
מהלך
חוקרים
)(16
אנזימים
רק
רב
מספר
מותם
ריאקציה
זאת,
היוצאת
adenylate
הריאקציה
קיימת
לפועל
בנוכחות
אנזימים
amino a c i d a c t i v a t i o n
תוך שחרור
enzyme-amino a c y l
כמתואר
ריאקציה יבין
במשואה
16ה ו כ ח
החומצות
ספציפים,
בריאקציה
.
פירופוספט
ב ע ב ו ד ו ת של כ מ ה
זו
מיאור-
קבוצות
):(73-79
^+ PP
עבור
סל
סינטזת
הפרוטאינים
ע ״ י ( H o a g l a n d(73)(74כ
קומפלקס
למיקרוזומים,
הפפטידי.
הראשון
ו .ATP
-s-RNAחומצה
י צ י ר ת קשר
קוול־טי
amino acyl-AMP-enzyme
ספציפיים
החומצות
קטן
הריאקציה
הממיניות
בלבד סל
האנזימים
בין
הגורמים
החומצה
ל א ק ט י ב צ י ה של
מחידקים,
אנזימים
הגורמים
־enzyme ^•5
חומצות
צמחים
ספציפיים
+ ATP + a c t i v a t i n g
ו ר ק מ ו ת של
לחומצה
ל א ק ט י ב צ י ה של ה ח ו מ צ ה
האמינית
המופעלת
וה
אמיניות
מסוימות
חיות
מ מ י נ י ת מחת
הממינית,
,(S-RNA(53
amino a c i d
בודדו
),(80-83
מך
נוקו).(84-86
מאפשרים
ג ם מת
אסר כתוצאה ממנה
-50-
מתקבלת
ה
)(17
aminoacyi-RNA
+ AMP + enzyme
הקשר
טיב
בין
).(58,57,51
האמינית
בציור
החומצה
קשר
,
==< a m i n o a c y l - R N A־^ + RNA
המסיבית
זה
מוגדר
ו ה ק ב ו צ ה '3
,11מתוארת
כ מ ת ו א ר במש 81ה
:17
והחומצה
כאסטר
) א ו '(2
החומצה
הריבונוקליאית
בין
הקבוצה
הידרוקסיל
האמינית
aminoacyl-AMP-enzyme
במספר
ה ק ר ב ו ק ם י ל י ת של
מהריבוזה
הקשורה
נחקר
בקצה
שבאדנין
השרשרת
מעבדות
החומצה
הטרמינלי.
הפולי3וקלימוטידי ת
ש ל ה : S-RNA
cytosine
I
RNA
cytosine
i
c
c
ן
?
?
c
1
t
C
C
ן
,
,
C
C
^׳׳׳P
י׳־׳• i
שבין
נראה
מ ו ל ק ו ל ו ת , s-RNAn
האמיניות.
בדיקת
שהאינקורפורציה
זו
התקבל
הוספת
ולין,
נקורפורציה
של
החומצה
דיות
החומצה
לאקטיבצית
ליאוצין
של ה
4
או
1
-0ליאוצין.
ספציפיות
המפינית
לחומצה
לתוך
האמינית
המופעלת־
מסומנות ב
ולין,
ע ו ב ד ו ת אלה
במטרה
אמינית
ספציפי
מהחומצות
העלתה
c
לאדיטיביות
ליזין;
«ו
הבימה
לאינהיביציה
הובילו
חוקרים
להפריד
מסוימת
1 4
אישור
טרימונין
מ ס ו מ נ י ם לא
,s
באופן
p
אדיטיבית.
ב ת ע ר ו ב ת עם
ליזין
NH
ס פ צ י פ י ו ת לכל אחת
אמיניות
פ ר ק צ י ו נ צ י ה ש ל ה S-RNA
החומצה
האמינית
שרשרות
חומצות
בלתי
m
11
ב ת ו ך ה S-RNAה י א
טרימונין
א פ ש ר ו ת של
נוקליאוטי
שלהן
ב ע ב ו ד ה עם
האינקורפורציה
לחפש
ת ע ר ו ב ו ת של
IUCH-C-0-°
I
ציור
קיימות
U
1
C
c
!c
^
adenine
I
מספר
מתוכו
).(88,87,68
-1ttMמשתתפים
והRNAהפקבל
שרשרות
פ ו ל י•
בריאקצית
האנזים
באופן
של
הגורס
ספציפי
את
-51-
העבודות
»ENA-7ו פ צ ה
פורצית
ש ל( H o a g l a n d(56
מ מ י נ י ת כמל
החומצה
תרכובת
לתוך
הממינית
ומחרים,
ביניים
ה פ ר ו ט א י נ י ם של
ATPל מ ק ר ו ׳ ז ו פ י ם
ציטופלממטי,
הוכחה
נוקלימופרוטמין
בציה
תוך
של ה ח ו מ צ ה
אחרים.
האמינית
ל RNAה י א
ל
תוצאת
ה י ח ס י ת של ה פ ע ל ת
קבועים
בדרגות
32
שנפרדה
לפי
מקבילה
ב פ ע י ל ו ת של ה ע ב ר ת
ל י ח י ד ת AMP
קשורה
תמיד
הממצא
שכמות
הנוצר
בהידרוליזה
החומצה
רווי
המפיניות
פוספט
מלה
פ ה RNA
ציטוזין
נוקליאוטיד
בים
מתקשרת
חומצה
עליון
השתתפות
החומצה
מתימונין,
האנזים.
לאקטי-
אנזימים
ה מ פ ע י ל את ה ח ו מ צ ה
האמינית
נקוי
הריבו-
הגורם
שהאינקורפורציה סל
הממינית
והעברתה
כל עליה
המקטיבציה(
האמינית
העוברת
היתה
ל ת ו ך ה .RNA
בפעילות
מלוה
החומצה
עובדה
מיינקורפורציה
ה ט ר י ה ש ל pH 5ש ל
היחידות
ה ס ו פ י ו ת של
ל ה ו ר י ד את
אינקובציה סל
שוה
שלבים
נפרדים
זו
בעליה
המפינית
הוכחה
לכמות
מתוך
חמדנוזין
לקצה
נוקליאוטיד ל
י ו צ א י ם מל
הפועל
בהעדר
העליון
ציטוזין
חומצות
הציטו-
ומדנין,
הנוקליאוטידים
בתהליך
בשלב .הראשון,
אינקורפורציה
הנוזל
ה פ ר ק צ י ח ש ל ,pH 5
ו ב ה ע ד ר ^ A T P ,CTP
.S-RNA
מדנוזין
הראשונים
שהאנזים
ללא
8TENA
החומצה
החומצה
ניתן
בשלושה
הממינית
נרםפת
חושבים
)ריאקצית
מהפרקציה
ע״י
לתוך ה
יחידת
p
האמינית
ו AMP
להבחין
כשהם
ה ח ל ק י ק י ם של
ט ר מ י נ ל י ת ש ל ש ר ש ר ת ה .RNA
מפיניות.
מיאורגני
אפשר
p
בדרך כ ל ל מת
בחופצות
לתוך
האנזים
ש ו נ ו ת של
הוסיפו
א ל ק ל י ת ש ל ה .RNA
ה RNAש ב ו ד ד
פלםפטי,
המק־רוזומים.
של
32
ה ש ח ל ו ף -ATP
מכיל
פפטידי.
פעילות אותו
הכללי
מינקור-
5
המסומן
מניחים
בתהליך
להתיחם
ב נ ו כ ח ו ת GTP S-RNAו נ ו ז ל
מ ג י ב ישר עם ה
ו( o f e n g a n d(69
והפעילות
BNAבשמרים
הלימוצין
ה ו צ ר ו ת קשר
האמינית
Berg
מאחר
העברת
מוכיחות
אמיתית,
שיש
לתרכובת
והחופצות
בנוכחות
אפיניות.
פירו-
בתנאים
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
עוברת
י ח י ד ה מחת מ ו
ה ש ר ש ר ת ש ל ה . RNA
המפינית.
מ מ י נ י ת פ ו פ ע ל ת ל( R N A - p C p C p A(96
החומצה
שעים
בשלב
RNA-pCpCב נ ו כ ח ו ת . ATP
החופצה
והנו
בשלב
של
שני
שני
השל
השלישי,
-52-
מכל
האמור
לעיל,
הכנת
ה S-RNA
בעזרת
אנזימים
בסדר
מיוחד־
כבד,
נמצאים
לתוך
ה :RNA
שלושת
ה S-RNA
.S-RNAבסדר
לשתי
ברודים
,
השלישית,
על
(80
חומצה
פעיל
אמינית
ההסבר
הוספת
הקבוצות
נקוי
הו&,
האנזים
קליאוטידים
של
ל s-RNA
ואינקורפורציה
א.
פיקרומול
-0 1ליאוצי
רב
של
.
ן-
היה
החופצה
תערובת
)
מטרתה
ל S-RNA
לא
בקשר
היו
אחראי
לפעילות
נתונים
בנוכחות
אף
אנזים
על
כן,
פי
שהוכנו
המפעיל
RNA
פפנקרימם
שהפעילו
במק ,ה
ייתכן,
באותו
זמן,
המערכת
כ א ש ר S-RNA.
אותו
זה
היתה
המחראי
בברור
היה
);(70
מ ת ה S-RNA
ע״י
שבתהליך
האנזיפטית
המביאה
אם
הן
אף
ל ת ו ך ה . S-RNA
להלן
והאינקורפורציה
שפוש
של
הנו-
ט ר מ י נ ל י ת של
הפרקציות
לגרום
תוך
הריאקציה
האינ׳קורפורציה
לאינקורפורציה
הבעיה,
האפינית
השונות
חקר
מסוגלות
האמיניות
היאנזימטיות
האנזים
.
עצמו
מנוקה
הורחקה
האנזים,
החומצות
של
.s-mkb
האנזים
נקוי
המקטיבציה
ה
14
ענין
של
MA-9
זו,
נוקליאוטי־דים
באחד
למיקרוסומים
הטדיפטופן,
משר
של
האפיניות
החומצות
מנםיוכותיו,
רקמה.
המתאימות.
נוקה
בזמן
בפרקציות
-0לתוך
,
רגיל
אנזימים
הנוקליאוטידיס
עבודה
שהתקבלו
מאותה
נוכחות
את
והעברתה
של
החומצות
שאותו
הנוקליאוטיד,
בלתי
הטריפטופן
הטרמינליות
נראה
לטריפסופן
הוכן
של
הומוגנט
נפרדת.
מצב
acceptor
ואשר
AMPל ק צ ו ו ת ה .RNA
נבדקו
מזכיר
שתתכן
במסגרת
0.11
אניזימטית
הציטופלםמטי
לאינקורפורציה
האמינית
של
נוקליאוטידים
ואינקורפורציה
קודם,
האינקורפורציה
המפעיל
לאינקורפורציה
השונות
החומצה
ב א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
לכך
1 4
כפי
משמש
זו,
שהוסבר
המפינית,
של
לאינקורפורציה
והאנזיפים
( L i p m a n n
מפנקריאס
מהנוזל
הדרושים
העליון
הגורמים
מערכת
אינו
לאינקורפורציה
הגורמים
אקטיבצית
קיום
pH5
קבלת
לאקטיבציה
המיוחד.
פעולות,
האנזיפטית
של
כי,
הגורמים
הגורמים
האנזימים
האמיניות,
ל
בפרקציה
נובע
לפני
החומצה
בדרשת
האנזיפטיות
לאקטיבציה
התוצאות
שלה
באינקורפורציה
של
ל
שהתקבלו.
S-RNA
ליאוצין-
הכילה:
0.5
6
cpm/ aM0 xl2.35),מ י ק ר ו מ ו ל , ATP
/
-53-
1 MgC, 5מ י ק ר ו מ ו ל
פוםפופירובט,
2
פירובט
טאין
)ה
האנזימטית
ציה
הבלתי
מלי
בחומצה
והידרוליזה
מורכב
חומצה
לנוזל
השקעת
ה RNAע ם
הסידן
הגורם
ציה
םפיחה
לתוך
של
על
ה
האנזים
נקבע
הגורם
רוויה,
בכל אחת
בעיקר
כל
גיל.
בנוזל
בפרקציה
אקטיבציה
ממ: 1.
נוזל
בגלל
״שישות״.
אי-יציבות
NaCIב Hח ו מ צ י
P
הוצאת
מהפרק-
ד ו ג מ א ו ת של
פ ר כ ל ו ר י ת במשך
1
ב א ו ל ט ר ה -ס ג ו ל ב . mA260
נתקבלה
א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
משקע
הנוקליאוטידים
סל 5
אפוניום
אסוניום
70-100$
סולפט
םולפט
ו ב י ן 70-100$
רוויה(,
האנזימטיות,
ואינקורפורציה סל
ליאוצין
)בין
על
כזכור
רוויה..
האנ
בפרק-
בשלב
נ ו ס ף של
החומצה
האמינית
שהפעילות
הםטרפטומיצי ן,
סולפס
ע״י
S-RNAמ ו פ י ע
ונוקה
נמצא
הוספת
ומפיחה
נתקבלו
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
אפוניום
pHת ו ך
סטרפטומיצין
כ י ח י ד ת AMPל ק צ ה ה
ה ע ל י ו ן של
ה ש נ י ה של
אמינית,
שתואר ב
חומצה
ע ל י ו ן של
,35-70$
בבדיקת
מהפרקציות
בחומצה
,
ל א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
פ ר ק צ י ו נ צ י ה עם
סולפט )
0.50מלי־
.
בטבלמ
בין
2-3
עייי
הבליעה
פ ר ק צ י ו נ צ י ה עם
אמוניוס
נעשתה
לפי
הפרקציה
ל מ ד ו ד א ת כ מ ו ת ה RNAב כ ל מ ד ג ם
של
הציטופלםפטי,
הסידן
זאת
הוספת
כפי
ע״י
ה א נ ז י ם ש ל , pH 5
שתואר
ע״י
יש
פ ג " RNA-9־
המםופן
בתחום
KCI,
הריאקציה ל
נעשה
1.0מ ל י 5$
ל א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ש ל ה ATP
פוספט
הריאקציה
חלקי,
פ ר מ ג י S-RNA
ב 0-35$
אנזים pH 5נותרת
נמצאה
כללי
סטרפטומיצין,
גיל.
S-RNA
ומתרכזת
לא
העליון
האחרונה סל
תערובת
ו מ צ ו י ה RNA
פעולה
בנוכחות
שלבים כפי
פרקציות,
זים
1 4
0
נקוי
מפםפר
שלש
בנפח
לי א וצי ן
תהליך
פוספט
מאחר
ר כ ו ז ה RNA
m^oies
של
למחר
ב ד ו ד ה, RNA
מתערובת
ה ו א רק
7.5pH2.0,
הפנול(.
הכללי
דקות ב .37°
נוטרלי.
דקות ב
בשמוש
הנפח
הרדיואקטיביות;
בליאוצין-
Tris
שיפת
בופר
ה ו ק פ ד ע ל ש מ י ר ת ה pH -
P
מפיסה
קביעת
0.05
10
הזה,
RNA-aaב H
לפני
הושלם
לפי
הרדיואקטיביות,
הטפול
הקשר
פכבד
1
מיקרומול
חולדה
נ מ ש כ ה 10
קביעת
במהלך
20
הנבדקת,
האינקובציה
לשם
קינזה,
הוכן
S-RNA
5
מיקרומול
פרו-
המקורית
ל א ח ר ה ר ח ק ת ה RNA
35-70$
בפרקציה
רוויה(.
שבין 70-100$
-54-
רוויה
מו
פורציה
במצוי
של
של
נית
במצמה
מות
דומות
בתקבלו
החומצה
לים
הסידן
הבוקלימושיד.
גם
של
פוספט
בפרקציה
תכשירים
( s c h w e e t (86
מינאקטיבציה
במשך
ב.
הרמשובה
שבין
רוויה
הממי-
החומצה
מפוביום ס ולפט.
במקרה
!-לימוצין.
הימ
במוכה
ההסבר
לתופעה
זו
מתבסס
של
המבזים
הגורם
יציבותו
תהליך
ו
הגורם
מינקורפורצית
0-35$
איבקורפורציה
פעילים.
חוסר
ה מ כ י ל מת
ב מ ו כ ה של
ב ! -ו ל י ן
העוברת
בלתי
על
פעילות
בשמוש
הממיגית
גיל,
המבזים
אויבקור-
סל
בהרבה
על
תוצ-
הכמות
הולין
מתקב
ולפעמים
ת צ פ י ו ת של
להפעלת
העובר
הולין,
ההכנה.
החומצה
ה מ ק ט י ב צ י ה של
נבדקה
הממינית
המבזימטיות
בפרקציות
32 32
הסונות
לפי
האמינית.
2
פיקרומול
השחלוף
תערובת
לימוצין!,-
ב ו פר
הריאקציה
1
,5
הושלם
10
דקות ב .37°
וית
שהכיל
הריאקציה
5מלי
מיצוי
אמוניה
למחר
10
ל
נעשתה
הוספת
0.4מ ל י .
הופסקה
ע״י
ע״י
ב
אנזים
נעשתה
2
הוספת
0.1מ ל י
30$
2
3
5$
במשך
חומצה
תמיסת פחם
0.2מלי
( ,
הנבדקת
אינקובציה
0.8מ ל י
ל י ט ר ,ו מ נ ו ת של
2
P
3
מהפרקציה
0.5מ ל י
.
מ ר ו כ ז ת פר
1 MgC ,מ י ק ר ו -
c p m / y u m o l e
הרימקציה
הנוקליאוטידים
פ י ר ו פ ו ס פ ט נ ע ר ך
l
מ י ק ר ו מ ו ל ^ .
ה נ פ ח של
מיקרומול
)
5
תערובת
היוצא
בנוכחות
הכילה:
P
KC1
וםפיחת
P
מ י ק ר ו מ ו ל ,ATP
xlo1.2
פיקרומול
M0.00
סיסת
-ATP
P
ל פ ו ע ל רק
החומצה
מן
פרכלו-
אקטיבי
כהל
50$
הםוםפנסיה
o p
שוטהו
על
מתכת
צלוחיות
ATP
ו ה ד ד י ו א ק ט י ב י ו ת של ה
הנוצר
במונה
נבדקה
.Geiger
המתקבלות
התוצאות
בהפעלת
ה מ ס י ב י ת עייי
החומצה
הפרקציות
Qp
מטיות
השונות
הלימוצין
יוצא
מטית
זאת,
קציה
ה ש נ י ה של
האקסיבציה
מאשרות את
לפועל תוך
נותרה
של
התוצאות
גם
בנוזל
מסוניום
ולין
שמוס
הרבה
הקודמות.
באנזים סל
העליון
סולפט
יותר
)בין
של
השחלוף
5H
p
נמוכה משל
Op
P
P
ה ג ו ל מ י פ ע י ל ו ת
סטרפטומיצין
35-70$
-ATP
רוויה(.
הלימוצין.
המנזי-
ו ה ת ר כ ז ה מף
בנוכחות
מבזי.
היא
בבדיקות אלו
בפר-
היתה
-55-
ג.
החופצח
ה ר ב ר ם י ב י ל י ו ת של
האפינית
)(18
פת
7
הוכן
ריאקציה
כפי
מתערובת
בנוכחות
השקעה
עם
AMPו
כהל
שתוארה
MgC
הרדיואקטיביות.
שלא
הרכוז
1 4
.
של
עקב
AMPו
לתערובת
;
הפדקציות
הקודפים
פתוך
לפני
זמן
נציה
של ה 5
קצר
בדיקת
א
בשלבי
הסונות,
האינקורפורציה
י
נ
pHא נ ז י ם
בפרקציה
באמוניום
כאשר
םולפט,
בגלל
ש ל pH5
בנוכחות
א ו AMPלא
הוספו
ת
י
P
A
T
על
סל
-
2
המיסצאים
הליאוצין-
3
P
האנזים.
ובנוזל
נותרת
ת
הידרוקסיל-אפאטיט
שתי
העליון
הפערכת
ו
צ
שהובאו
1 4
א
ו
s-RNA
דופות
כאסר
םפיחה
מ
ת
על
N
A
האנזימסיות
סטרפטומיצין.
הגורפת
ת
הסעיפים
התקבלו
פרקצי ו
ערכו
פוספט
סידן
פיר ו פ ו ס פ ור ו לי ז ת
הפעילויות
סל
או
בשני
לתוך ה
0
ו , ( s c i w e e t (86
ה ת ו צ א ו ת של
בנוכחות
1 4
ה
ש ל pH 5
הריאקציה
אינקובציה
IP
פדת
הגלפי
L-1eucine-c -RNA
מ א ש ר ו ת את
ע ״ י ( H e r b e r t (101
נקוי
תערובת
האנזים
ע״י
סל ה
מהפרקציות
קבלות
בבדיקת
התקבל
ונבדקה
הרדיואקטיביות
RNA-80$
הפירופוספורוליזה
פ
הומס,
שארית
ה ע צ מ י ת של
בלבד
,
\
מובאות
ע״י
גם של
נםיוני.
סל 30-40$
האנזיפטיות
ה
כ ל אחת
הבליעה
ה
נרח־ז,
הריאקציה.
תוצאות
א י נ ק ו ב צ י ה של.116נ0גו1-16
הנבדקתRNAבודד
מה
אולם
.RNA
אפינית
א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
לאחר
1ה מ ש ק ע
תקון
1eucine-c
PP
מגי
נתקבלה
הרדיואקטיביות
נקבע
ערך
התרכובת -S-RNAחומצה
הפנול.
2
הכהל.
מלח,
א(.
האכזימטית
נבדקה
בהוספת
הגבוה
ל
L-leucine-RNA
ב א נ ז י ם של
)סעיף
10
סל
האנזיפטיות:
^ + PP +. AMP
שפוש
בשיטת
ס
PPו ה פ ר ק צ י ה
בנוכחות
שקעה
1 4
ע״י
קודם
הריאקציה
ליאוצין-
m/umoie
-RNA
אחת
האקטיבציה
פהפרקציות
L - l e u c i n e + RNA + ATP
בודדה
י
בבדקה
pH5
בת
בכל
ריאקציה
והאינקור&ורציה
•
להפעלה
ע״י
לל.
14
RNA- .8
H
-
מופיעות
S
גם
פרקציונציה
ולאינקורפורציה
של
יחד
-56מם8.
טבלא
1 4
השואה ב י ן ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ^ A T P - Cל
של
והפירופוספורוליזה
- C HNAל י א ו צ י ן
ב ש ל ב י ם ה ש ו נ י ם של נ ק ו י ה א נ ז י ם
s-BNA
14
*
!ינקורפורצית
14
A T P - Cל s-HNA
cpm/mg
פרקציהיאנזימטית
א נ ז י ם pH 5
נוזל
סטרפטומיצין
עליון
א מ ו נ י ום ס ו לפט
ה
י
ך :־.״
** פ י ר ו פ ו ם פ ו ר ו ל י ז ה
של l e u c i n e - C - H N A
.־
1 4
cpm/mgפ ר ו שא י ן
פרוטאין
270
560
700
850
!־
( 0 - 3 0 $
450
א מ ו נ י ו ם ם ו לפט
י
ו
( 3 0 - 7 0 $
אמוניום
ר
0
םולפט
ויה( 7 0 - 1 0 0 $.
פוספט
1230
הסידן
גיל
21,000
0
63,500
0
4
מ י ק ר ו מ ו לc p m / y t i m o l e )ATP-C :0.250
5
2
מיקרומול
,
5
מיקרומול
גליצין
מיקרופול
0.10מ ל י
אינקובציה
ב .37°
ביות
נעשתה כ פ י
פ ו ס פ ו פ י ר ו ב ט , K C I
בופר
מהפרקציה
1
( ,
B-WA'ZB
,20
האנזימטית
בידוד ה
שתואר ב
הנדבקת.
1
נפח
^.שבתערובת
H
,
י1
,
p
כ ל ל י ה י ה 0.45מ ל י ,
ה ר י א ק צ י ה לשם
בדיקת
זמן
הרדיואקטי
״שיטות".
14
*תערובת
הריאקציה:
מיקרומול
ו מ ו ל KF
0.5מ ג י
,
-s-RNA
AMP
-£ליאוצין
מיקרומול
מ י קר ו מ ו ל ב ו פר
האנזימטית
1.0
נפח
הנבדקת.
כ ה לקר75$מ ל י
על
,
צ ל ו ח י ו ת מתכת,
ההשקעה' עם כ ה ל ,
05וד
חבק -יעה
אקטיביות
התערובת
;
כהל-פלח.
הRNA
pH
ו ה RNA
השוקע
ה ת ו צ א ו ת של
1 4
2
Tris7.0
.H 0O.INNH
4
מנוזל
-RNA-Cליא ו צ י ן
ד ק ו ת ב .37°
אינה
ה ו ס פ ת 0.1
התמיסה
העליון
הפירופוםפורוליזה
פהפרקציה
צנסריפוגציה,
והרדי ואקטיבי ות
ואשר
מלי
הושקע ע ״ י
נאסף ע ״ י
נקבעה;גם
צ ל ו ח י ו ת מתכת
מ י ק ר ו מ ו ל , 1 MgC
א י נ ק ו ב צ י ה 10
ו ה ו ה ס ב 1.0מ ל י
שוטח על
המשתחררת מה
זמן
carrier
והרדיואקטיביות
העצמית.
,
כ ל ל י ,0.50
,ו 0.70ס ל ' 95$כ ה ל .
800
פ י ר ו פ ו ם פ ט 2.0 ,
0.10
מ ג י HNAפ E . c o l iה ו ס פ ו כ
Mgc^iM
המכיל
, c p m
הנשאר
נקבעה
נשטף
שוטחה
לאחר
ל8חףייתקון
מתארות את
שוקעת ע ״ י
מלי
הרדיו
הוספת
-57-
החומצה
רוויה(,
מתרכזת
האמינית
בעוד
בפרקציה
שהמערכת
בפרקציה
שבין
שבין
35-70$
האנזימטית
70-100$
רוויה
האחראית
רוויה
)עקבות
בפרקציה
לאינקורפורציה
באמוביום
םולפט.
של
שבין
0-35$
נוקליאוטיד
-58-
ד י ו ן
הנוזל
xg05,000Iמכיל סוג
מסקל
הציטופלםמטי
מיוחד סל
מולקולרי
ז ו ס ל התא
נמוך,
מכילה
( ,
סונה מזה
אנזים
ה ; S-RNAכ מ ו כ ן ,ה י א
פ ו ר צ י ה של
ו ת את
מהומוגנסים סל כבד
החומצות
האנזים
הגורם
בעיקר
פורציה
הנמצא
להוספה
ס פ צ י פ י ת של
נוקליאוטידים
האנזימים
יימצא
?01על מ נ ת לקבל
הצלחנו
ש י ח י ד ת AMP
ממצא ז ה
ציטידינית
א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ס ל ה .AMP
חומצה
המםונטזים הוא
ולמינקוד-
לבודד
מסומן
ולנק
מתקשרת
נ ו ב ע ש א ם AMPע ו ב ר
פ ו ל י נ ו ק ל י א ו ט י ד י ת ס ל , RNAמ ן
ויחידה
לסרסרת
הנוקליאוטידים.
מצאנו
ציטוזין'נוקליאוסיד.
צימידין.
דים הסופיים
P
האחראים
פרקציה
לאקטיבציה
בעבודה ז ו
לאינקורפורציה סל
במידה
N
במקרוזומים
מכילה את
ט ר מ י נ ל י ת לסרסרת
Rבעל
).(89)(53
ב ע ב ו ד ה ע ם ATPמ ס ו מ ן ב
ליחידת
חולדה,
A
ה א מ י נ י ו ת ל . S-RNA
הגורם
המתקבל למחר
ההכרח
אינה
מופיעה
נראה
סהסדר של
חומצה
ציטידילית,
אינקור-
שבקצה
בקצה ,יש
זה
להוסיף
חנוקליאוטי-
אדנילית
המתקסרים
ל ס ר ש ר ת ה . S-RNA
האינקורפורציה
ויוצאת
כםובםסרט,
ל .ATP
באופן
דילית.
ריאקצית
הטרמינלית סל
לפועל תוך
ד ו מ ה CTPה ו א
דה
נמצא
ביותר.
ממקרוזומים סל כבד
נבדק
בערך
באולטרהצנטריפוגה
30,000
הנמוך
נמצאו
אנליטית,
ברקמות סל
באופן
החומצה
העליון סל
החול
פעילות.
הנמצא
הופוגנט כבד
שהוכנו
ה
מחידקים
S-RNAמ כ ב ד
מולקולרי
או
החולדה
ממוצע
של
בפקרוזופים.
האינקורפורציה סל
הספציפיות
הציטי-
ספציפי
ו נ מ צ א ב ע ל משקל
המאמינות את
היות היא
ADP
מסמס
תחליף
נ ו כ ח ו ת RNAם ם ו י ם .
ריבונוקליאיות
בלתי
אינו
באינקורפורציה סל
מהנוזל
ב ה ר ב ה מ ז ה ש ל ה RNA
אחת העובדות
ל ת ו ך ה RNA
חומצות
החולדה
דורסת
המתקבל
ה א ד נ י ל י ת ל ENAדורסת
פירופוםפט.
הםובםטרט
האינקורפורציה
ה RNA.ש ה ו כ ן מ ה pH 5א נ ז י ם
כפעיל
סהרור
החומצה
ATP
ה ג ב ו ה ה של
הנוקליאוטידים
הריאקציה
האנזיעטית.
-59-
ספציפיות
זאת מ ו צ א ת את
לםובםטרט
שני
מסוגל
-
את המקום
האנזיפטית
להוספה
הנוכחית,
פולימרים
לבעית
מתברר
בכך,
שהאנזים
-
דברים,
מצד אחד
סדר
הריאקציה.
זאת
לשרשרת
בחידקים,
ריבונוקליאוטידיס
קצרה ע ל ק י ו ם
מ כ ב ד של
חזיר
יותר,
חיות
ים
ואין
לדבר על
פינטזה
פוספורילזה
דיפוספטים,
מיצר
ומביא
כאן
גרעין
פתרון
התא
הםובסטרט הוא
הנוקליאוזיד
טריפוספטים,
ד ו מ ה ל ( D N A - p o i y m e r a s e (92
טים
לסם
אנזים
הדורש
דומות
הנוקליאוזיד
נמצאו
ו מ כ י ל DNAאשר
ה
ציטידיני
ו ( S t e v e n s (95
כחיוני
נמצא,
העובר
בגרעיני
טריפוםפ-
אינקורפורציה
מערכות
אנזימטיות
ב נ ו כ ח ו ת כל ארבעת
קסרים
אינטר-נוקליאוטידיים(,
ב . E. c o l i
לאינקורפורציה סל
e
(
הם
.
או
הוכיחו
החומצה
S-HNAב ק ש ר
'2
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ש ל AMP
ב ק צ ו ו ת של שרשרת ה , M A
מתקשרת
הקבוצה
מכך
והמערכת
ה א נ ז י ם סלהם
אינו
הריבונוקליאוטידים
.MA
משמעות
t
נראה
ה ו כ ח שה CTP
לתוך
MAברקמות
הריבונוקליאוזיד
ריבונוקליאוטיד
)וכמסקנה
ע ״ י ( H u r w i t z (94
כן
א י נ ט ר -נ ו ק ל י א ו ט י ד י י ם.
לאינקורפורציה סל
סריפוםפטים
ה מ ם נ ט ז .DNA
נ ו כ ח ו ת שלושת
ל ת ו ך ס ר ש ר ת ה RNAב ק ס ר י ס
הגורמות
. ( H e p p e i
בגרעיני
מחקרים
כמקום אפשרי
א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ש ל CTPל . M A
נקשר
פוספורילזה
לסינטזת ה
תאי
ל
קיימת,
ע ״ י and H i i m o e (90
כבד
נים,
ה פ ו ל י נ ו ק ל י א ו ט י ד י ת מצטמצמת
פולינוקליאוטיד
החולדה,
a l (50.
ומצד
ה ת כ ו נ ו ת של המערכת
מהנוקליאוטיד
מערכת
פורסמה
מרמזים על
);(93,91
האנזימטית
לתוך
הנוקליאוטידים,
הפולינוקליאוטיד
חדשים,
בהיותו
ה ס י נ ט ז ה ש ל ה . UNA
מאוחרים
נקי
ממחקר
שהארכת השרשרת
נוקליאוטידים
לעומת
הודעה
של
שני
ל ס י י ם את
ס פ צ י פ י ת של
ש ל UNA
תאים
לקבוע
עליו
חדש.
ביטויה
לבד מו
קשור
אססרי
'3
שבמשך
האמינית
בין
הידרוקםי
לא
היתה
השלבים
המופעלת
הקבוצה
כיחידה
ט ר מ י נ ל י ת קשורה
ידועה
עד
ה ה ת ח ל ת י י ם של
בצורת
הקרבוקםילית סל
ס ל ה . ( A M P (57
לשייר
ל מ ח ק ר י ם ש ל Hecht
סינטזת
הפרוטאי
amino a c y l a d e n y l a t e
החומצה
האמינית
לבין
-60-
עבודות
הראו
שהחומצה
של RNAמ ו
להעבירה
פ ר ו ט מ י ן בתא.
לפרוסמין
מלמ שמף
בדרך
עייי
למחר
מקרוזומלי
קשור
מ י מ צ א זה
הביוסינתסית
הממיבית
S-RNA
בתקבל
צה ה א מ י נ י ת
ואחר
הקושר
המרכיב
ה ש ל י ש י של
החומצה
ה א מ י נ י ת המופעלת
הבוזל
בעבודה
זו
נ י ת ן היה
פ ו ר צ י ה של החומצה
בצורה
ז ו שלמעשה
ריאקציות
אלה.
הבפצמים
לתוך
מיבקורפורציה
בבוזל
הפרוטמין
לתוך
המקרו
החלקיקים
ש ס ו מ ן עם
S-RNA
הציטופלסמטי
א נ ז י מ י ם ; מחד
נ ו ק ל י א ו ט י ד י ם לפי סדר
,S-RNA
לחלקיקים
הושגו תוך
יסוד
רדיו
ממלא
ת פ ק י ד של
להפעלת ה ח ו מ
ל ק צ ו ו ת ה . S-HNA
carrier
בהעברת
עבודת
נקוי
ה א נ ז י ם מ ה פ ר ק צ י ה של . pH 5
הפעילויות
ו ה מ י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של
קיימים שני
למיבקורפורצית
הגורם
מיוחד
החולדה,
המקרוז ו פ ל י ים.
ל ה פ ר י ד ב י ן שתי
האמינית
מהומוגבט כבד
ה מ ר כ י ב י ם האחרמים
ש נ י ם מהם הם
הריאקציה ,ה
מ ס ק נ ו ת אלה
נכנסת
ב ב ם י ו ב ו ת עם
בתקבל משקע של pH 5ה מ כ י ל מת כ ל שלשת
החומצה
ואנזימים
ביתן
).(98,99,100
השקעה ב pH 5של
ה א מ י נ י ת ל .RNA
פ ר ק צ י ה מחרת
ה מ מ י נ י ת ל , S-RNA
ATP ,CTP
עובר
) (97א ו
שמופיעה בכל
החומצה
בבוכחות
ל פ ח ו ת חלק מה
לפני
S-RNA
ברמה שלמ רק החומצה
המיקרוזומליים.
מקטיבי
במערכות
ה א מ י נ י ת מתקשרת ל
הציטופלסמטי.
זומלי,
i n vivo
מ נ ז י מ ט י ו ת מחידקים
מחיות
אנזימים
סונים
המנזימטיות:
הנוקלימוטיד,
שבעזרתם
יוצאות
האינקור-
ולהוכיח
ל פ ו ע ל שתי
-61-
סכום
עבודה
נוקליאוטידים
זו
הוקדשה
לחומצה
ריבונוקליאית,
כבד החולדה הוה
פ ו ר צ י ה ש ל ATP
מסומן ב
נעשתה
c
פ ו ר צ י ה של
י
200
לערך
R N A
הומוגנט כבד
האמוניום,
מאבד את
מחדש של
הוספה
ספציפי.
הוא
להחלפה ע ״ י
גורם
פורציה.
.9.0-9.5
הופוגנט כבד
האנזים
אפשר
האנזימטית
המסים
)S-RNA
האנ
סטרפטומיצין,
הפעילות
הםטרפטומיצין ,מו
החולדה.
המנוקה,
ה ח ו ל ד ה ,א ו KNA
+ +
המנוקה
אינו
יכול
ל ה ח ל י ף א ת ה ATP
הריאקציה לפי
המשואה
ניתן
)E. coli.
האופטימלי
בריאקצית
המתקבל
מאד
,40ו ל א
בקטרימלי
ו ה pH
מוח
RNA
RNAז ה ה ו א
בערך פי
,
(.
הסידן,
דורש
מהלך
דיפרנציאלית,
הגורמת
פוספט
^!
אינקור-
הציטופלםמטי
ה ר ח ק ת ה . S-RNA
המתקבל ע ״ י
זה.
למיבקור-
RNAע י י י
לאחר
אנזים
התבססה ע ל
הנוזל
יוני
ADP
לתמר את
המערכת
ו ם פ י ח ה ע ל ג י ל של
לאקטיבצית
האנזים
והתקבל
,
המשקע
ה פ ע ו ל ה של
צנטריפוגציה
ו כ מ ו כ ן א ת ה RNA
n ^ ^ R N Aו מ ל י של כ ב ד
. ( B . cereus
הנו
החולדה
למינקורפורציה
הפעילות
בעזרת
הכילה את
פעילותו
ה צ י ט ו פ ל ם מ ט י ת של
מנגנון
ובדיקת
.
5 p Hה ר ח ק ת ה
םולפט
מהפרקציה
ל
אנזים
ולברור
לאנזים
הריבונוקליאוטידים,
האנזים
זרת ע״י
מקור
פרקציה ז ו
השקעה ב
השקעה ע ם
לותו
1
פרקציונציה סל
חסר החלקיקים.
עייי
4
ביםודה
לבדוד
הגורם
של
לפעי
המיבקור-
הבאה:
-^ RNA-AMP + PP־ATP + RNA 4
ה ר ב ר ס י ב י ל י ו ת של
הריאקציה
הוכחה
בעזרת
שחלוף
פירופוםפט
רדיואקטיבי
32 3 2
)
P
י ו ; RNA
( P
לתוך
הנוקליאוזיד
טריפוםפטים
מ ו ר תו פ ו ס פ ט מ י -מ ו ר ג נ י לא ה י ה
אחרי
פעיל
אינקובציה
ברי מקצית
בנוכחות
השחלו ף.
האנזים
- 6 2 -
ה א י נ ק ו ד פ ו ר צ י ה של ה A T P
מקום
אלקלית
כמו
כן,
של
עם A T P
בעבודה
ליחידת
HNA
CMP
בעבודה
של
מסומן
הנמצאת
הנוזל
האנזימים
שסופן
זו,
החומצה
המסיבית
בקצה
,
הציטופלסמטי
להפריד
ל
2
S-RNA
נמצא
3
סהאינקורפורציה
נ פ צ א
ע״י
היא
ש י ח י ד ת הAMP
טרמינלית.
פתקשרת
בעיקר
ש ר ש ר ת ה UNA״
לאקטיבציה
הצלחנו
הנוקליאוטידים
1
P
ב
העליון
הגורמים
ב
4
ATP-C
;
לשרשרת ה RNA
נקבע
הידרוליזה
ואינקורפורציה
בין
לבין
-!,ליאוצין.
מה,ומוגנס כבד
המערכת
זו
של
החומצות
האנזימטית
הגורפת
החולדה,
הגורמת
למקטיבציה
מכיל
גם
האמיניות
את
^S-HNA
לאינקורפורציה
ואינקורפורגיה
של
.
-6 3-
ספרות
REFERENCES
1. G r u n b e r g - M a n a g o ,
M . , and O c h o a ,
2. Grunberg-Manago,M.,
S . , J . Am. Chem. S o c , 7J7, 3165 (1955)
and O r t i z , P . J . , C c h o a , S . ,
3. Grunberg-Manago,M.,Ortiz,?.J.,and
Science,90Xcil955)
Ochoa,S.,Biochim.Biophys.Acta,
3־
2 0 , 269 (1956)
4. Ochoa,S.,
Federation ? r o c ,
5. B e e r s , R . F . , J r . , N a t u r e ,
1 5 , 832 (1956)
1 7 9 , 630 (1957)
6. L i t t a u e r , U . , Z . , and K o r n b e r g , A . ,
7. Ochoa,S. ,Heppel , L . 4 - . ,
J . B i o l . C h e m . , 2 2 6 , 1077 (1957)
The C h e m i c a l B a s i s o f H e r e d i t y , M c E l r o y . , W . D . . ,
and G l a s s , B . , e d s . , B a l t i m o r e , p615 (1957)
8. Beers,R.F..,Jr..-, N a t u r e , 1 1 1 9 5 6 )
9. B e e r s , R . F . , J r . ,
Biochem. J . ,
686 (1957)
10. Ochoa,S.., A r c h . Biochem. B i o p h y s . ,
11.
BrummondjD.O.,
Staehelin,M.,
790
6 9 , 119 (1957)
0choa,S.,
J. Biol.
Chem.,
12. Grunberg-Manago,M.,
J . Mol.Biol.,
13. Grunberg-Manago,M.,
and W i s n i e w s k i , J . , C o m p t . r e n d . ,
1, 240 (1959)
1 4 . F r i e d k i n , M . , and L e h n i n g e r , A . L . , J . B i o l .
15. K e r r , S . E . , Seraidarian,K.,
245., 750 ( 1 9 5 7 )
C h e m . , 1 7 7 , 775 (1949)
Brown,G.B., J . B i o l .
16. ¥ e e d , C . L . , V7ilson,D.W. , J . B i o l .
2 2 5 , 835 (1957)
C h e m . , 1 8 8 , 207 ( 1 9 5 1 )
C h e m . , 1 8 9 , 435 ( 1 9 5 1 )
1 7 . Abrams,R., G o l d i n g e r , J . M . , A r c h . B i o c h e m . , 3 0 , 261 (1951)
18.
Goldwasser,E.,
J. Biol.
19.
Goldwasser,E.,
J . Am. Chem. S o c , 7 7 ,
20. H e i d e l b e r g e r , C . ,
Chem.,
Harbers,E.,
2 0 2 , 751 (1953)
(1955) •
Leibman,K.C., Takagi,Y.,
Potter,V.R.,
B i o c h e m . B i o p y h s . A c t a , 2 0 , 445 (1956)
21.
C a n e l l a k i s , E . S . , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 2 3 , 217 ( 1 9 5 7 )
2 2 . C a n e l l a k i s , E . S . , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 2 5 , 217 (1957)
-64-
23.
Potter,V.R., Hecht,L.J., Herbert,E., Biochim. Biophys. Acta,20,439 (1956)
24.
Herbert,E., Potter,V.R., Hecht,L.J., J.Biol.Chem.,
25.
Zamechik,P.C., Stephenson,M.L., Scott,J.F., Hoagland,M.B.,
225, 659 (1957)
Federation Proc. 16, 275 (1957)
26.
Paterson, A.R.P., Le Page,G.A., Cancer Reasearch, 1_7, 409 (1957)
27.
Edmonds,M., and Abrams, R., Biochim. Biophys .Acta, 2j>, 226 (1957)
28.
Herbert,E., Potter,V.R., Hecht,L.I., J . Biol.Chem., 225, 659 (1957)
29.
Scott,J.F., Fraccastoro,A.P., and Taft,E.B., J . Histochem. and Cytochem.
4, 1 (1956)
30.
Drury,H.F., Arch, of Biochom., 19, 455 (1948)
31.
Lowry,0.H., Rosebrough,N.J., Farr,A.L., and Randall, R.J.,
J. B i o l . Chem., 193, 265 (1951)
32.
Littauer,U.Z., Eisenberg,H., Biochim. Biophys. Acta, 3J2, 320 (1959)
33.
Laskov,R., Margoliash,E., Littauer,U.Z., Eizenberg,H.,
Biochim. Biophys. Acta, 33, 247 (1959)
34.
Gierer, A., and Schramm,G., Nature, 177, 702 (1956)
35.
Kirby,K.S., Biochem.J.,
36.
Tietz,A., Ochoa,S., Arch, of Biochem. Biophys., 1 8 , 477 (1958)
37.
Kornberg,A., Lieberman,I., and Simms,E.S., J.Biol.Chem.,
38.
Liberman,I., Kornberg,A., and Simms,E.S., J . B i o l . Chem.,215, 403 (1955)
39.
Romberg,A. Lieberman,I. , and Simms,E.S., J . Biol.Chem. , 215, 417 (1955)
40.
Gunsalus,I.C. , Mothods i n Enzymology, V jL, p.51 (1955)
41.
Kalckar,H.M., J . B i o l . Chem., 167, 429,461 (1947)
42.
Lieberman,I., Kornberg,A.,
43.
Kornberg,A., and Pricer,¥.E.,Jr.,
44.
Rose,J.A., Methods i n Enzymology I, p.591 (1955)
64, 405 (1956)
215, 889 (1955)
Simms,E.S., J . B i o l . Chem., 2 1 5 4 2 9 (1955)
J . B i o l . Chem., 193, 481 (1951)
-65-
4 5 . A v i s o n , A . W . D . , J ; Chem. S o c ,
46. Jones,M.E.,
p.732
(1955)
B l a c k , S . , Flynn,R.M.,Lipmann,F., Biochim.Biophys. Acta,
י
4 7 . W e i B m e y e r , H . , and C o h n , M . , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 3 9 ,
4 8 . H o g e b o o m , G . H . , Methods
i n Enzymology,
49. C a n e l l a k i s , E . S . , Herbert,E.,
50. H e c h t , L . I . , Zamecnik,P.C.,
51. H e c h t , L . I . ,
Proc
I,
12,
141
417
(1960)
.16 (1955)
N a t l . A c a d . S c i . U . S . , 46,
Stephenson,M.L.,
Scott,J.F.,
1701
(1960)
J . B i o l . Chem.
233, 954 (1958)
Stephenson,M. L . , Z a m e c n i k , P . C . , P r o c N a t l . A c a d . S c i • U . S. ,
4 5 , 405
51b.Scheraga,H.A.,
52. C o x , R . A . ,
(1953)
and M a n d e l k e r n , L . ,
Littauer,U.Z.,
J . Am.Chem.Soc,
J. Mol.Biol.,
53. Hoagland,M.B., Zamecnik,P.C.,
2,
125
Stephenson,M.L.,
75,
179
Nohara,H.,
(1953)
(1960)
Biochim. Biophys. Acta,
24,
54. O g a t a , K . , a n d
(1959)
B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 2 5 , 659
215
(1957)
(1957)
5 5 . H o a g l a n d , M . B . , Z a m e c n i k , P . C . , S t e p h e n s o n , M . L . , Symposium on M o l e c u l a r
B i o l o g y , U n i v . of Chicago Press,pl_05,
(1959)
56. Hoagland,M.B., Stephenson,M.L.,
Scott,J.F.,
J.
57.
Zachau,H.G., A c s , G . ,
58. P r e i s s , J . ,
Berg,P.,
Ofengand,E.J.,
59. Hoagland,M.B., i n 4th I n t e r n .
Cox,R.A.,
Bergman,F.H.,
231,
241
(1958)
811,
A n n . N . Y . A c a d . S c i . , 81,
6 2 . B e s s m a n , M . J . , Lehman, I . R . ,
Biochem., Vienna, V I I I ,
818 (1959)
679
885
(1958)
and. D i e c k a n n , M . ,
N a t l . A c a d . S c i . U . S . , 45,
Congr.
L i t t a u e r , U . Z . , Nature,
61. Herbert,E.,
Chem.,
Zamecnik,P.C.,
and L i p m a n n , F . , P r o c N a t l . A c a d . U . S . , 4 4 ,
Proc
60.
Biol.
Hecht,L.I.,
319
(19,59)
(1958)
!
(1959)
S i m m s , E . S . , and R o m b e r g , A . ,
J . B i o l . Chem.,
233, 171 ( 1 9 5 8 )
-66-
63.
H u l b e r t , R . B . , Sch1nitz,H.,
Brumm,A.F., and P o t t e r , V . R . ,
209,
J . B i o l . Chem.,
23 (1954)
64.
Chung,C.W., M a h l e r , H . R . , Biochem. Biophys. Research Com.,1,
65.
H e r b e r t , E . , J . B i o l . Chem., 231, 975 (1958)
66.
Harbers,E., Heidelberger,C.,
67. Komingsberger,V.V.,
68.
Biochim.
Biophys. A c t a , 35, 381 (1959)
Van der G r i n t o n , C . 0 . , O v e r b e c k , J . T . G . , Biochim.
Biophys. A c t a , 26, 483 (1957)
Schweet,R.S., B o v a r d , F . C , A l l e n , E . , Glassman,E.,
Proc . N a t l .Acad. S c i . U . S . ,
44,
69.
Berg,P.,
0fengand,E.J.,Proc.
70.
Weiss,S.B.,
71.
W e b s t e r , G . C . , J . B i o l . Chem., 229, 535 (1957)
72.
Z a m e c n i k , P . C . , Stephenson,M.L.,
Acs,G.,
232 (1959)
Natl.Acad.
173 (1958)
S c i . U . S . , 44, 78 (1958)
Lipmann,F., P r o c . N a t l . A c a d . S c i .
Hecht,L.I.,
U.S., 4 4 1 9 5 8 )
Proc.Natl.Acad.Sci. U . S . ,
44,
73 (1958)
73. Hoagland,M.B., Biochim. Biophys. A c t a , 16, 288 (1955)
74.
Hoagland,M.B., K e l l e r , E . B . , Z a m e c n i k , P . C . , J . B i o l . Chem.,218, 345 (1956)
75.
De M o s s , J . A . , G e n u t h , S . M . , and N o v e l l i , G . D . ,
Proc.Natl.Acad.Sci. U . S . ,
42,
3
76.
B e r g , P . , J . Am.Chem.Soc'.,
77.
Berg,P.,
78.
Hoagland,M.B.,Zamecnik,P.C.,
ד
י.1
6 3
(1955); ׳׳77. r-iol .
325 (1956)
י
€ 19מז.,
J . B i o l . Chem., 222, 1025 (1956)
Sharon,N.,
and B o y e r , P . D . ,
9
Lipmann,F.,
Biochim.
Stulberg,M.P.,
Biophys.Acta,26,215
Kingdon,H.S., Webster,L.T., Davie,E.W., P r o c . N a t l . A c a d . S c i . ,
80.
Lipmann,F., P r o c . N a t l . A c a d . S c i .
81. Nismannn,B.,
Clark,J.M.,Jr.,
83.
Novelli,G.D.,
44, 757 (1958)
U . S . , 44, 67 (1958)
Bergman,F.H., and B e r g , P . ,
82.
(1957)
Biochim.Biophys.Acta,26,639
J . B i o l . Chem., 233, 421 (1958)
Proc. N a t l . Acad. S c i . U . S . , 44, 86 (1958)
(1957)
י
-67-
84.
Davie,E.W., Roningsberger,V.V.,
and L i p m a n n , F . , A r c h , of Biochem.Biophys.
65,
85.
Schweet,R.S., and A l l { ) n , E . H . , J . B i o l . C h e m . ,
86. A l l e n , E . H . ,
87.
Glassman,E.,
Smith,K.C., Cordes,E.,
21 (1956)
233, 1104 (1958)
Schweet,R.S., J . B i o l . C h e m . ,
and Schweet,R.S.,
Biochim.Biophys,Acta,
33,
Stephenson,M.L.,
235, 1061 (1960)
Scott,J.F.,
286 (1959)
88.
Zamecnik,P.C.,
P r o c • N a t l . A c a d . , 4 6 , 8 1 1 (1960)
89.
Doty, P . , Boedtkerj.fi., F r e s c o , J . R . , H a l l , B . D . , and H a s e l k o r n , R . ,
Ann. N . Y . Acad. S c i . , 81, 693 (1959)
90.
H i l m o e , R . J . , H e p p e l , L . A . , J . Am. Chem. S o c , T9, 4810 (1957)
91.
Edmonds,M., Abrams,R. , J . B i o l . Chem.,
235, 1142 (i960)
92.
Lehman, I . R . , Bessman,M. I . , Simms,E.S.,
and Romberg, A . , J . B i o l .
233,
163 (1958)
93.
Weiss,S.B.,
Gladstone, J . Am. Chem. S o c , 81, 4118 (1959)
94.
Hurwitz,J.,
Biochem. Biophys. Research Comm., 3, 15 (1960)
95.
S t e v e n s , A . , Biochem. Biophys. Reaseareh Comm. ,13, 92 (1960)
96.
Hecht,L.I.,
97.
Gale,E.F.,
Stephenson,M.L.,
Chem.,
Zamecnik,P.C.,
Biochim. Biophys. A c t a ,
29, 460 (1958)
Symposium on Morphogenesis, 4th I n t e r n . Congr. Biochem.,
Vienna,
98.
Decken,A.V.D. , and H u l t i n , E x p t l . C e l l .
99.
Bosch,L.,
BloemendalJJ.,
Sluyser,M.,
V
i n Brc^khaven
1958.
Research, 1 5 , 254 (1958)
Biochim.
Biophys. A c t a ,
34, 272 (1959)
100.
Hoagland,M.B.,
Symposium i n B i o l o g y 12, 40,
101.
H e r b e r t , E . , A n n . N . Y . Acad. S c i . U . S . , 81, 679 (1959)
(.1959)
-iv-
adenine n u c l e o t i d e .
By a l k a l i n e h y d r o l y s i s of an AMP
l a b e l e d RNA, 15% of
the r a d i o a c t i v i t y was recovered as c y t i d y l i c a c i d (3• or 2 ' phosphate).
It
was concluded that the major part of the incorporated a d e n y l i c a c i d i s
attached to end chains of the s-HNA which contain a terminal c y t i d y l i c a c i d
unit.
JHino a c i d i n c o r p o r a t i o n i n t o the s-RNA . Each enzyme f r a c t i o n , obtained
during the p u r i f i c a t i o n of the nucleotide i n c o r p o r a t i n g enzyme was t e s t e d f o r
amino a c i d a c t i v a t i o n and i n c o r p o r a t i o n .
a c t i v a t i n g enzyme was separated,
from the enzyme which catalyzes
I t was found that the
by the ammonium sulphate
fractionation,
the terminal a d d i t i o n of AMP to RNA.
cine was a c t i v a t e d and incorporated into the s-HNA by a f r a c t i o n
between
30-70
L-leu-
separated
per cent ammonium sulphate s a t u r a t i o n ; t h i s f r a c t i o n was devoid
of any nucleotide
of L - l e u c i n e - C
leucine
14
incorporating a c t i v i t y .
The a c t i v i t y was studied by means
32 3 2
i n c o r p o r a t i o n i n t o s-RNA, P
P
-ATP amino a c i d dependent
14
exchange and pyrophosphorolysis of L - l e u c i n e - C
It i s
natant,
-RNA.
concluded that the pH-5 p r e c i p i t a t e from the cytoplasmic
super-
contains the three components responsible f o r the i n c o r p o r a t i o n of
the amino a c i d s into the s-RNA.
Two of these are enzymatic; one a c t i v a t e s
the amino a c i d s and the other attaches a s p e c i f i c
sequence of nucleotides
to
the s-RNA.
The s-RNA so modified i s the t h i r d component that a c t u a l l y takes
part i n the
reaction.
-XXX-
f u n c t i o n of time and optimal a c t i v i t y was observed at pH 9.5.
r e q u i r e s Mg
ions.
3. Synthetic p o l y n u c l e o t i d e s ,
prepared by E . c o l i polynucleotide
r y l a s e from the corresoonding nucleoside
t i d e acceptor i n the enzyme .system.
. י־יa c t i v i t y ,
The r e a c t i o n
diphosphates,were
tested as
phosphonucleo-
Polyadenylic and p o l y c y t i d y l i c a c i d had
by a low i n c o r p o r a t i o n seems to be obtained i n the presence of
the mixed polymer AGUC, containing the four bases.
4. The presence of the other nucleoside
triphosphates
(CTP, UTP, GTP)
14
d i d not stimulate
the i n c o r p o r a t i o n of ATP-8-C
i n t o the s-HNA.
5. Preincubated RNA prepared by phenol e x t r a c t i o n from a pH-5 p r e i n c u bated f r a c t i o n l o s t i t s
capacity to incorporate adenine nucleotides
incubated with ATP i n the presence of the p u r i f i e d enzyme.
CTP the i n c o r p o r a t i o n of adenine nucleotides
32
32
the i n c o r p o r a t i o n of CTP
when
By .addition of
was p a r t i a l l y r e s t o r e d .
Also,
(CMP -PP) was doubled, when the preincubated RNA
was used.
14
6.
by i t s
The r e v e r s i b i l i t y of ATP-C
i n c o r p o r a t i o n i n t o the RNA, was proved
i n h i b i t i o n of inorganic pyrophosphate a d d i t i o n and by the i n c o r p o r a -
32
t i o n of P
pyrophosphate i n t o ATP and CTP. In the presence of the p u r i f i e d
enzyme and CTP, the l a b e l e d inorganic pyrophosphate was incorporated mainly
32
i n t o CTP and not i n CDP or CMP. P -orthophosphate was not i n c o r p o r a t e d .
7. The l o c a t i o n of the incorporated AMP was determined by a l k a l i n e
degradation of the AMP-C
14
labeled RNA.
.
A^out 95^ of the r a d i o a c t i v i t y was
recovered i n the adenosine f r a c t i o n , suggesting that the i n c o r p o r a t i o n of
a d e n y l i c a c i d u n i t was t e r m i n a l .
triphosphates
The a d d i t i o n of the other three
the
nucleoside
GTP, UTP and CTP d i d not influence the p o s i t i o n of the added
-11-
The pH was adjusted to 5.2,
and the "pH5 p r e c i p i t a t e " obtained was
i n 0.01M T r i s b u f f e r pH7.4.
The HNA was removed by streptomycin
dissolved
sulphate
p r e c i p i t a t i o n and the supernatant was was f r a c t i o n a t e d by ammonium sulphate
addition.
Two f r a c t i o n s were obtained by the a d d i t i o n of a n e u t r a l saturated
s o l u t i o n of ammonium sulphate: between 0-35 and between 35-70 per cent s a t u ration.
A t h i r d f r a c t i o n between 70-100 per cent s a t u r a t i o n was obtained by
the a d d i t i o n of s o l i d ammonium sulphate.
The nucleotide i n c o r p o r a t i n g enzyme
was found i n t h i s t h i r d f r a c t i o n and f u r t h e r p u r i f i c a t i o n was achieved by
adsorption on calcium phosphate g e l .
A 200-fold increase i n s p e c i f i c
was obtained.
s t a b l e and can be stored f o r months at
The p u r i f i e d enzyme i s
- 1 0 ° without l o s s of
Role of UNA .
activity
activity.
A f t e r the removal of the RNA by streptomycin p r e c i p i t a t i o n ,
the enzyme f r a c t i o n s were found i n a c t i v e unless the streptomycin p r e c i p i t a t e d
RNA, or a phenol extracted RNA from the pH 5 pre.cipitate was added.
specificity
studied.
The
f o r the type of RNA r e q u i r e d as adenine n u c l e o t i d e acceptor was
Rat l i v e r microsomal RNA, E . c o i i ribosomal RNA and B.cereus RNA
were i n a c t i v e .
E . c o i i soluble RNA had a low a c t i v i t y , while s-RNA from r a t
l i v e r was found to be the most a c t i v e .
centrifuge,
When studied by the a n a l y t i c a l u l t r a -
the r a t l i v e r s-RNA showed a sedimentation constant S^^s 3 . 9 .
From t h « . sedimentation and v i s c o s i t y data, the molecular weight of
this
s-RNA was c a l c u l a t e d to be about 30,000.
Enzymatic c h a r a c t e r i s t i c s of the
reaction
1. ATP was found to be the substrate while ADP could not replace
it.
Maximal i n c o r p o r a t i o n was obtained at an ATP concentration of 0.001M.
2. In the p u r i f i e d enzyme preparation the ATP i n c o r p o r a t i o n was a l i n e a r
S U M M A R Y
The p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n was c a r r i e d o u t w i t h t h e p u r p o s e o f
e l u c i d a t i n g t h e mode o f i n c o r p o r a t i o n o f r i b o n u c l e o t i d e s i n t o r i b o n u c l e i c
a c i d i n animal t i s s u e s .
The t r a c e r
t e c h n i q u e was u s e d and l a b e l e d s u b - ־
14
s t r a t e s s u c h as A T P - 8 - C
were p r e p a r e d .
A n enzyme w h i c h
incorporates
14
the C
l a b e l e d ATP i n t o a n a c i d i n s o l u b l e m a t e r i a l was f o u n d i n t h e homo-
genates of l i v e r s of d i f f e r e n t
a n i m a l s s u c h as r a t ,
pigeon, chicken,
T h i s a c i d i n s o l u b l e m a t e r i a l was p r o v e d t o be RNA.
The a c t i v i t y o f
n u c l e o t i d e i n c o r p o r a t i n g enzyme was f o u n d t o be h i g h e r i n t h e
of rat
l i v e r and f u r t h e r
this tissue.
s t u d y on t h e
etc.
the
homogenates
enzyme r e a c t i o n was p e r f o r m e d u s i n g
The enzyme a c t i v i t y was d e t e r m i n e d b y t h e i n c o r p o r a t i o n o f
labeled nucleoside triphosphates
i n t o t h e RNA i n a n i n c u b a t i o n m i x t u r e
+ +
containing Mg
i o n s and a t r i p h o s p h a t e r e g e n e r a t i n g s y s t e m ( p h o s p h o p y r u \
14
v a t e and p y r u v a t e k i n a s e ) .
The amount o f 8-C
ATP i n c o r p o r a t e d u n d e r
t h e s e c o n d i t i o n s was f o u n d t o be p r o p o r t i o n a l t o t h e enzyme c o n c e n t r a t i o n .
A n enzyme u n i t was d e f i n e d as t h a t amount o f enzyme w h i c h w i l l
1 yUmole o f A T P - C
14
i n t o t h e RNA i n 1 h o u r i n c u b a t i o n a t
P u r i f i c a t i o n o f enzyme
u s e d as t h e
incorporate
o
37 .
L i v e r s o f t h r e e months o l d a l b i n o male r a t s
source of the
enzyme.
A homogenate was p r e p a r e d
s u c r o s e and t h e n u c l e i and c e l l d e b r i s w e r e removed b y
were
i n 0.25M
centrifugation.
The c y t o p l a s m i c s u p e r n a t a n t was o b t a i n e d b y c e n t r i f u g i n g a t
105,000xg.
Contents
ir-aeDucnoN
.
•
1
MATERIALS AND METHODS
Enzyme assay
.
6
.
.
.
.
Preparation of s o l u b l e RNA
.
.
.
.
Preparation of l a b e l e d compounds
.
.
.
.
.
.
.
.
6
.
.
.
8
.
.
.
9
.
RESULTS
14
1. Enzyme p u r i f i c a t i o n
2. Role of RNA
.
.
.
.
.
3. Enzymatic c h a r a c t e r i s t i c s
a. The substrate
b.
.
.
.
.
.
.
.
14
.
.
.
.
.
18
of r e a c t i o n
.
.
.
:
.
.
.
.
Dependence of i n c o r p o r a t i o n on enzyme
.
.
. 2 5
.
25
concentration
and time of i n c u b a t i o n
.
25
c. Dependence of i n c o r p o r a t i o n on concentration of substrate28
+
d . Mg+ requirement
e. Optimal oH
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
28
.
.
28
f.
Synthetic T>olynucleotides as n u c l e o t i d e acceptors
.
34
g.
Presence of other n u c l e o t i d e triphosphates
.
36
h.
R e v e r s i b i l i t y of the n u c l e o t i d e
incorporation reaction
40
.
i . . L o c a t i o n of the incorporated n u c l e o t i d e w i t h i n
ץ
the
RNA Chain
4. Amino a c i d a c t i v a t i o n and i n c o r p o r a t i o n
42
49
DISCUSSION
58
SUMMARY
61
REFERENCES
.
.
.
.
.
.
.
63
The work described i n t h i s
Thesis
was c a r r i e d out under the s u p e r v i s i o n of
D r . U . Z . L i t t a u e r a t the Weizmann I n s t i t u t e
of Science,
Rehovot
ENZYMATIC SYNTHESIS OF POLYRIBONUCLEOTIDES
IN ANIMAL TISSUES
Thesis f o r the Ph.D.Degree
V i o l e t Gross-Daniel
Submitted to the Senate of
Hebrew U n i v e r s i t y , Jerusalem
the
1960
INSTITUTE
OF s a e N G e
81195-10
ENZYMATIC SYNTHESIS OF POLYRIBONUCLEOTIDES
IN ANIMAL TISSUES
Thesis for the Ph.D. Degree
by
VIOLET £ROSS)DANIEL
Submitted to the Senate of the Hebrew University
Jerusalem, 1960
\?e1ZMANN
INSTITUTE
OF SCIENCE
81195-10
© Copyright 2024