בדיקת פעילות ציטוטוקסית עם : האפקט האנטי סרטני של
אוניברסיטת תל-אביב הפקולטה לרפואה ע"ש סאקלר המדרשה לתארים מתקדמים ע"ש מרים ושלדון ג' אדלסון החוג לביולוגיה תאית והתפתחותית האפקט האנטי סרטני של מוקסיפלוקסצין :בדיקת פעילות ציטוטוקסית עם תרופות אנטי -סרטניות אחרות חיבור לשם קבלת התואר "דוקטור לפילוסופיה" מאת דבי חיטה-ראובני הוגש לסנאט של אוניברסיטת תל-אביב נובמבר 2010 עבודה זו נעשתה בהדרכת פרופ' אינה פביאן המחלקה לביולוגיה תאית והתפתחותית ,הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת תל-אביב. פרופ' איתמר שליט מנהל היחידה למחלות זיהומיות ,מרכז שניידר לרפואת ילדים בישראל. תודות בתום תקופה ארוכה של עשייה וחשיבה אני רוצה להודות למספר אנשים שהיו שותפים לאורך כל הדרך ואפשרו לי להגיע עד הלום. לפרופ' אינה פביאן ,המנחה שלי לעבודה .אני רוצה להודות על העזרה ,ההקשבה ובעיקר על האמונה שלה בי .פרופ' פביאן חשפה אותי לעולם המדע וגרמה לי להתאהב בו .קידמה אותי בכל הזדמנות שהייתה. תמכה ונתנה לי את האפשרות לספוג ,ולו במעט ,מהידע הרחב שלה ומניסיונה הרב .הייתה מעבר למנחה לעבודה ,הייתה ממש חברה .אני מודה לך על השיחות הרבות ,המדעיות והלא מדעיות .אני מאחלת לכל סטודנט שתהייה לו האפשרות לפגוש מישהו כמוה .המוטיבציה שלך מדבקת והופכת את כל המחקר לכיף גדול. לפרופ' איתמר שליט ,המנחה שלי לעבודה .אני רוצה להודות על העזרה הרבה ברעיונות ,על התמיכה בעבודת המחקר וגם באמונה שלו בי .הידע הרב שיש לו הוא נדיר ונפלה בחלקי הזכות להיחשף אליו .אני מאוד מעריכה אותך ושמחה שהיית שותף בהנחיית עבודתי. לדרורה הלפרין ,על הקניית הרגלי עבודה נכונים ,יעוץ והנחייה לאורך כל הדרך .אני רוצה להודות על האוזן הקשבת ,על החברה התמיכה והעידוד .היית לי לחברה של ממש ,למדתי המון והרבה ישמש אותי הלאה בהמשך דרכי. לפרופ' אסתר פריאל ,על הייעוץ והעזרה בכל נושא אנזימי הטופואיזומראז. לד"ר נדיר אשכנזי ומעבדתו ,על שיתוף הפעולה בעבודה עם החיות. לד"ר גליה צרפתי וגב' דפנה שרייבר ,על העזרה הרבה בעבודה עם העכברים בביצוע ההדמייה. לגב' חסידה אורנשטיין ,על העזרה והייעוץ בכל נושא הכנת החתכים לצביעה אימונוהיסטוכימית. לד"ר גדעון הלפרין ,על עזרתו בחישובים הסטטיסטיים. לכל חברי המעבדה לאורך השנים שתמכו ,עזרו ועודדו לאורך כל הדרך. ואחרונים אך לא פחות חשובים ,למשפחתי: להוריי ,דניאל וברטה חיטה,על ההקשבה ההתעניינות והתמיכה הרבה. לבעלי ,חגי ,ללא העזרה שלך לא הייתי מצליחה .אני מודה לך על האהבה והדאגה ,על הסבלנות וההבנה, על המאמץ וההקרבה ,על חברתך והעצות החכמות .אני מודה לך על תמיכתך הבלתי מסויגת ועל אמונך בי ,אתה האור של חיי. לילדיי האהובים אשר ממלאים את חיי באושר גדול ובשמחה. תודה רבה!!! רשימת קיצורים APS: Ammonium Persulfate bFGF: basic Fibroblast Growth Factor BIRC: Baculoviral Inhibitor of apoptosis Repeat-Containing BSA: Bovine Serum Alb CD: Cluster of Differentiation CIP: Ciprofloxacin CPT: Campthotecin DAPI: 4',6-diaminido-2-phenylindole DMSO: Dimetthyl Sulphoxide DNA: Deoxyribonucleic Acid DTT: Dithiothreitol DDW: Double distilled water EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid ECL: Enhanced Chemiluminiscence ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EPCs: Endothelial Progenitor Cells FACS: Fluorescence Activated Cell Sorter FCS: Fetal Calf Serum GM-CSF: Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor HBSS: Hank's Balanced Salt Solution Hif: Hypoxia Inducible Factor HRP: Horseradish Peroxidase IAPs: Inhibitor of Apoptosis Ig: Immunoglobulin IL: Interleukin INF: Interferon MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase MTD: Maximal Tolerated Dose MTT: 3-[4,5-dimethylthiazole-2-y1]-2,5-diphenyltetrazolium bromide MXF: Moxifloxacin NF-κB: Nuclear Factor-kappaB PBS: Phosphate Buffered Saline PFA: Paraformaldehide PI: Propidium iodide PMSF: Phenylmethanesulfonyl Fluoride P/S: Penicillin/Streptomycin RNA: Ribonucleic Acid SCID: Severe Combined Immunodeficiency SDF-1: like Stromal cell-Derived Factor-1 SDS: Sodium Dodecyl Sulfate TBST: Tris Buffered Saline-Tween 20 TEMED: Tetramethyl Ethylenediamine TNF: Tumor Necrosis Factor UV: Ultra-Violet VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor VP-16: Etoposide WB: Western Blot רשימת איורים ,תמונות וגרפים איור מס' :1אופן הפעולה של טופואיזומראז IוII- עמוד 3 איור מס' :2מבנה המולקולות מוקסיפלוקסצין וציפרופלוקסצין עמוד 6 איור מס' :3תהליך האפופטוזיס עמוד 9 איור מס' :4קסקדת שפעול קספאזות עמוד 11 איור מס' :5תהליך האנגיוגנזה בגידול עמוד 15 איור מס' :6תהליך הפיכת תא לסרטני עמוד 18 איור מס' :7תהליך פירוק מולקולת MTT עמוד 38 איור מס' :8שלבים במחזור התא עמוד 40 תמונה מס' :1השפעת ריכוזים שונים של VP-16על פעילות טופואיזומראז II עמוד 46 תמונה מס' :2השפעת ריכוזים שונים של MXFו VP-16-על פעילות טופואיזומראז II עמוד 47 תמונה מס' :3אופן העיכוב של topo IIע"י MXFוVP-16- עמוד 49 תמונה מס' :4עיכוב בפעילות הדקטנציה של topo IIהמופק מתאי HT-29 עמוד 50 תמונה מס' :5השפעת MXFו VP-16-על פעילות topo IIבתאי HT-29 עמוד 52 תמונה מס' :6השפעת MXFו VP-16-על כמות topo IIחופשית בתא עמוד 54 תמונה מס' :7אפיון מחזור התא לאחר טיפול עם VP-16וMXF- עמוד 58 תמונה מס' :8השפעת MXFו VP-16-על ביטוי survivinבתא עמוד 60 תמונה מס' :9השפעת MXFו VP-16-על שיעור אפופטוזיס בתאי HT-29 עמוד 62 תמנוה מס' : 10השפעת ריכוזים שונים של MXF ,CPTו CIP-על פעילות טופואיזומראז Iמסחרי עמוד 67 תמונה מס' :11השפעת CIP/MXFעל פעילות טופואיזומראז Iבשילוב עם CPT עמוד 69 תמונה מס' :12אופן העיכוב של טופואיזומראז Iע"י CIP/MXFבשילוב עם CPT עמוד 71 תמונה מס' :13השפעת CIP ,MXFו CPT-על פעילות topo Iממיצוי גרעיני מתאי HT-29 עמוד 73 תמונה מס' :14השפעת CIP ,MXFו CPT-על פעילות טופואיזומראז של תאי HT-29 עמוד 75 תמונה מס' :15בדיקת שיעור אפופטוזיס בתאי HT-29 עמוד 80 תמונה מס' :16טיפול משולב של MXFוריכוזים עולים של CPT-11על התפתחות גידולים עמוד 84 בעכברי SCIDועל שינויים במשקלם. תמונה מס' :17השפעת MXFו CPT-11-על ביטוי החלבון הגרעיני Ki-67 עמוד 87 תמונה מס' :18השפעת MXFעל זרימת דם בגידול עמוד 89 תמונה מס' :19השפעת MXFו CPT-11-על ביטוי מולקולת CD-31בגידול עמוד 92 גרף מס' :1השפעת MXFו VP-16-על התרבות תאי HT-29 עמוד 56 גרף מס' :2שפעת MXFו VP-16-על שפעול קספאז 3 עמוד 64 גרף מס' :3השפעת MXFעל הפרשת פקטורים פרו-אנגיוגניים המושרית ע"י VP-16 עמוד 65 גרף מס' :4השפעת CIP ,MXFו CPT-על התרבות תאי HT-29 עמוד 77 גרף מס' :5השפעת CIP ,MXFעל הפרשת הפקטור הפרו-אנגיוגני IL-8המושרית ע"י CPT עמוד 82 גרף מס' :6ריכוז IL-8בהומוגנט של גידולי העכברים עמוד 94 תקציר DNAטופואיזומראזות הנם אנזימים האחראים על המצב הטופולוגי של ה DNA-בתא .מספר רב של תרופות המכוונות כנגד אנזימי הטופואיזומראז זוהו לאחרונה .רבות מהן גורמות לפגיעה ציטוטוקסית ע"י כך שהן לוכדות את האנזים בקשר קוולנטי עם ה .DNA-בין תרופות אלו המכונות "רעלים לטופואיזומראז" ישנן תרופות אנטימיקרוביאליות ותרופות כימו -תרפויטיות ,אשר חלקן נמצאות היום בשימוש קליני. הקווינולונים הנם תכשירים אנטימיקרוביאלים סינטטיים בעלי פעילות רחבת טווח .רוב הקווינולונים הנמצאים היום בשימוש קליני שייכים לקבוצת הפלואורוקווינולונים .קבוצה זו מאופיינית ע"י אטום פלואור על פחמן בעמדה 6של טבעת הקווינולון .הפלואורוקווינולונים פוגעים בחיידקים ע"י עיכוב האנזימים DNA gyraseו/או DNA topoisomerase 4החיוניים לשכפולם .התרופות מוקסיפלוקסצין ) (MXFוציפרופלוקסצין ) ,(CIPשייכות לקבוצת הפלואורוקווינולונים ,והן נמצאות בשימוש קליני נפוץ כתרופות אנטיבקטריאליות. למס' פלואורוקווינולונים )כמו ל CIP ,MXF-ו (trovafloxacin-הוכחה ,ע"י מס' קבוצות מחקר כמו גם ע"י מעבדתנו פעילות אנטי סרטנית במס' שורות תאים ובמודל .in-vivoפעילות זו הייתה בעיקר בשורת תאים מסוג סרטן המעי הגס ,שלפוחית השתן ותאי לאוקמיה .הפעילות האנטי סרטנית שנצפתה במחקרים אלה יוחסה לעובדה שלפלואורוקווינולונים פעילות כנגד האנזים טופואיזומראז ,IIאשר הוכחה בתאים אאוקריוטים כמו גם בתאי גידול . מחקר קודם במעבדתנו הראה כי טיפול עם MXFהגביר את הפעילות האנטי-פרוליפרטיבית והאפופטוטית של התרופה האנטי-סרטנית אתופוזיד ) (VP-16המושרית בשורות התאים THP-1ו- Jurkatובנוסף הפחית באופן משמעותי את השחרור המוגבר של הציטוקינים IL-1β ,IL-8וTNF-α- הנגרם ע"י .VP-16 המטרה העיקרית של המחקר הנוכחי הייתה לבדוק את ההשפעות הציטוטוקסיות של MXFהניתן כתרופה בודדת או בשילוב עם תרופות אנטי-סרטניות אחרות הפועלות על אנזימי טופואיזומראז Iו.II - העבודה התחלקה לשלושה חלקים בהם חקרתי את מנגנון הפעולה של MXFיחד עם שתי תרופות כימו- תרפויטיות שונות ) VP-16ו ( CPT-במודל in-vitroוחלק שלישי בו חקרתי את מנגנון הפעולה של MXFעם CPT-11במודל .in-vivo בבחינת ההשפעה של MXFעל פעילות אנזימי הטופואיזומראז ,נעשה שימוש במבחן טופואיזומראז )I ו ,(II-תערובת ריאקציה )תערובת שונה בין טופואיזומראז Iו (II-המכילה פלסמיד DNAמבוקע ע"י האנזים באופן אקראי .מבחן זה אפשר את בחינת ההשפעה של MXFעל פעילות האנזימים טופואיזומראז Iו II-כמו גם בדיקת אופן העיכוב :האם ברמת ה DNA-או ברמת האנזים .מבחנים אלו בוצעו הן באנזימים מנוקים והן באנזימים שהופקו מתאי ) HT-29תאים ממקור סרטן המעי הגס( .בנוסף נבדק מנגנון העיכוב של MXFעל האנזים טופואיזומראז IIבמבחן ה band depletion assay-הבודק את כמות תצמידי -DNAאנזים המצויים בתא .בבחינת ההשפעות הציטוטוקסיות של ,MXFשיטות המחקר כללו את מבחן הפרוליפרציה ,MTTבדיקת שפעול קספאז 3בשיטה הפלורימטרית ,בדיקת שיעור האפופטוזיס ע"י צביעת התאים לאחר טיפול עם Annexin Vאו .DAPIההשפעה של MXFוVP-16- על מחזור התא וביטוי החלבון Survivinנבדקה ע"י צביעת הגרעינים עם (PI) Propidium Iodide וצביעה עם נוגדן כנגד ,Survivinבהתאמה .לאחר הצביעה נעשתה קריאה במכשיר ה .FACS-כמו כן נבדקה השפעת התרופות על הפרשת ציטוקינים פרו-אנגיוגניים ) IL-8ו (VEGF-באמצעות מבחן ה- .ELISAבמודל in-vivoבו הושתלו תאי HT-29מתחת לעור של העכברות ,נעשה מעקב אחר משקל החיות .גודל הגידול נמדד מדי יומיים ע"י מדידה עם קליפר .בסוף הניסויים נבדקה זרימת הדם אל הגידולים באמצעות .Power Doppler Ultrasoundלאחר הקרבת החיות ,הגידולים הוסרו .חתכים היסטולוגיים הוכנו והם שימשו לצביעות אימונוהיסטוכימיות כנגד Ki-67ו .CD-31-בנוסף הוכן הומוגנט מהגידולים לבדיקת הימצאות הפקטור הפרו-אנגיוגני IL-8באמצעות .ELISA תוצאות המחקר מראות כי ל MXF-השפעה מועטה על פעילות אנזימי טופואיזומראז ) IוVP-16 .(II- ו CPT-מעכבות את הפעילות של האנזימים המסחריים טופואיזומראז Iו ,II-בהתאמה .הוספת MXF לתרופות גורמת לעיכוב גדול יותר ומשמעותי יותר בפעילות האנזימים .אופן העיכוב של האנזימים כנראה הוא ברמת האנזים ולא ברמת ה DNA-היות וניתן היה להתגבר על העיכוב רק ע"י העלאת כמות האנזים בריאקציה .הגברת העיכוב בפעילות האנזימים התקבלה גם כאשר נבחנה ההשפעה של MXF בשילוב עם VP-16או עם CPTעל פעילות אנזימי טופואיזומראז שהופקו מתאי HT-29או לאחר שהתאים עצמם טופלו בתרופות .בבחינת מנגנון הפעולה של MXFבמבחן ה,band depletion assay- הראיתי כי MXFבשילוב עם VP-16גורם לעלייה בתצמידי אנזים DNA-בתא לעומת טיפול עם VP- 16לבד .בניסויים אשר בוצעו בתרבית התאים ,HT-29מבחן MTTהראה כי ניתן להגביר את ההשפעה הציטוטוקסית של VP-16ו CPT-ע"י הוספת .MXFכמו-כן ,נצפתה עלייה בשיעור האפופטוזיס בשילוב MXFעם התרופות האנטי-סרטניות .בנוסף ,התרופות האנטי-סרטניות VP-16ו CPT-גרמו לעלייה בהפרשת הציטוקין IL-8בעוד ש ,MXF-הניתן לבד גרם לעיכוב בהפרשה הספונטאנית .כאשר MXFניתן בשילוב עם התרופות ,הוא גרם לעיכוב משמעותי בהפרשת הציטוקין .נבדקה גם הפרשת הפקטור הפרו-אנגיוגני VEGFונמצא כי לתרופות הציטוטוקסיות אין השפעה ואילו MXFעיכב את ההפרשה הספונטאנית המתבצעת ע"י התאים .תוצאות המחקר במודל in-vivoמראות כי ל MXF-יש השפעה אנטי-אנגיוגנית הבאה לידי ביטוי בהפחתת זרימת הדם אל הגידול באופן משמעותי כפי שנמדדה באמצעות השיטה Power Doppler Ultrasoundובצביעה האימונוהיסטוכימית כנגד סמן של תאי אנדותל .CD-31 :בנוסף ,מתן MXFהגביר את ההשפעה הציטוטוקסית של אירינוטקאן כפי שהתקבל ע"י מדידת גודל הגידול כמו גם ע"י צביעה אימונוהיסטוכימית כנגד הסמן .Ki-67לעומת זאתMXF , הגן מפני איבוד משקל ושלשולים ,תופעה שנצפתה בחיות שטופלו עם אירינוטקאן בלבד .בנוסף ,גרם MXFלירידה בכמות ה IL-8-בגידול אשר עלתה בעקבות הטיפול עם .CPT-11 המחקר הנוכחי מוכיח שלפלואורוקווינולון ,MXFמעבר להיותו אנטיביוטיקה בטוחה לשימוש ובעל השפעות אימונומודולטוריות אשר הוכחו בעבר ,הנו בעל השפעה אנטי-סרטנית והשפעה אנטי-אנגיוגנית. ההשפעה האנטי-סרטנית של MXFבאה לידי ביטוי בהגברה משמעותית של האפקטים הציטוטוקסיים הן של VP-16והן של MXF .CPTגרם להגברה בעיכוב התרבות התאים ,הגברת שפעול קספאז 3 ועלייה בשיעור האפופטוזיס .ניתן להסביר את התופעות האלו עפ"י התוצאות שהתקבלו בניסויים האנזימתיים בהם נראה כי MXFמשפיע על פעילות האנזימים טופואיזומראז Iו.II- למחקר הנוכחי משמעות קלינית בכך ש MXF-יכול להוות תוסף לתרופות כימו-תרפיות ובכך להגביר את הפעילות הציטוטוקסית מחד ,ולהקטין חלק מתופעות הלוואי המושרות ע"י תרופות אנטי-סרטניות מאידך. בנוסף MXF ,יכול להוות תוספת טובה בטיפול כנגד תהליכי אנגיוגנזה המתרחשים במחלת הסרטן. תוכן העניינים .1מבוא 1 ..................................................................................................................... DNA 1.1טופואיזומראזות 1 ....................................................................................... 1.1.1סיווג אנזימי הטופואיזומראז 2................................................................................. 1.1.2תפקיד הטופואיזומראז בתא האאוקריוטי 4 ................................................................ 1.1.3תרופות כימו-תרפויטיות המכוונות כנגד אנזימי הטופואיזומראז 4 .................................. 1.2קווינולונים 5 ........................................................................................................ 1.2.1פלואורוקווינולונים והשפעות אנטי סרטניות 7 ........................................................... 1.3אפופטוזיס 8 ......................................................................................................... 1.3.1קספאזות 10........................................................................................................ 11...................................................................................................... Survivin 1.3.2 1.4אנגיוגנזה 13......................................................................................................... 14 .............................................. vascular endothelial growth factor (VEGF) 1.4.1 1.4.2הציטוקין )15 .................................................................... interleukine-8 (IL-8 16 ........................................................................................................ CD-31 1.4.3 1.5סרטן 17 .............................................................................................................. 1.5.1סרטן המעי הגס 19 .............................................................................................. .2מטרות העבודה 22 ...................................................................................................... .3חומרים ושיטות המחקר 25 .......................................................................................... 3.1חומרים 25 ........................................................................................................... 3.1.1בופרים 28.......................................................................................................... 3.1.2נוגדנים 29 ......................................................................................................... 3.1.3ציוד מעבדתי 30 .................................................................................................. 3.2שיטות המחקר 32 ................................................................................................. 3.2.1מבחן טופואיזומראז 32 ...................................................................................... I 3.2.2מבחן טופואיזומראז 32 ..................................................................................... II 3.2.3בדיקת אופן העיכוב של האנזימים טופואיזומראז Iו II-ע"י MXFו33 .................. CIP- 3.2.4הכנת מיצוי גרעיני 33 .......................................................................................... 3.2.5בדיקת השפעת CIP/MXFלבד ובשילוב עם CPTעל טופואיזומראז Iתאי 34 ............... 3.2.6בדיקת השפעת MXFלבד ובשילוב עם VP-16על טופואיזומראז IIתאי 34 .................. 35 ................................................. Band depletion assay for topoisomerases 3.2.7 3.2.8גידול התאים בתרבית 36 ...................................................................................... 3.2.9קביעת ריכוז הפרשת פקטורים אנגיוגניים IL-8 :ו36 .................................... VEGF- 3.2.10אנליזת 37 .............................................................................................. MTT 3.2.11בדיקת פעילות קספאז 3בתאים שנחשפו ל MXF-ו38 ................................. VP-16- 3.2.12השפעת CIP /MXFו CPT-על שיעור האפופטוזיס בתאי 39 ........................ HT-29 3.2.13בדיקת השפעת MXFו VP-16-על שיעור האפופטוזיס באמצעות צביעת גרעינים עם 39 ............................................................ DAPI-sulforhodamine 3.2.14איפיון מעגל התא לאחר חשיפת התאים ל MXF-ו40 ................................... VP-16- 3.2.15השפעת MXFו VP-16-על כמות החלבון survivinהתוך תאי 41 ............................ 3.2.16יצירת גידולים ממקור הומני של סרטן המעי הגס בעכברים והערכת גודל הגידול 41 ........................................................................................................ 3.2.17ביצוע הדמייה באמצעות Power Doppler Ultrasound imaging לגידולים 42 ..................................................................................................... 3.2.18יצירת הומוגנט מהגידולים 43 .............................................................................. 3.2.19שיקוע רקמת הגידול לפרפין 43 ........................................................................... 3.2.20הכנת הסליידים לצביעה אימונוהיסטוכימית 43 ........................................................ 3.2.21צביעה אימונוהיסטוכימית ל44 .................................................................. Ki-67- 3.2.22צביעה אימונוהיסטוכימית ל45 ................................................................ CD-31- 3.2.23ניתוח תוצאות הצביעות האימונוהיסטוכימיות 45 ...................................................... 3.3סטטיסטיקה 45 ..................................................................................................... .4תוצאות 46 ................................................................................................................. 4.1בדיקת עיכוב פעילות האנזים טופואיזומראז IIמסחרי בנוכחות ריכוזים שונים של 46 ................................................................................................ VP-16 4.1.1השפעת MXFו VP-16-לבד או בשילוב על פעילות טופואיזומראז IIמסחרי 47 ............. 4.1.2בדיקת אופן העיכוב של topoisomerase IIע"י MXFבשילוב עם 48 .............. VP-16 4.1.3השפעת MXFהניתן לבד או בשילוב עם VP-16על פעילות topoisomerase II המופק מתאי HT-29כמו גם ההשפעה על הפעילות האנזימטית כאשר התאים טופלו בתרופות 50 ..................................................................................... 4.1.4השפעת MXFו VP-16-על פעילות הביקוע של 53 ....................... topoisomerase II 4.2השפעת MXFעל הפעילות האנטי-פרוליפרטיבית של 55 ............................... VP-16 4.2.1השפעת MXFו VP-16-על מחזור התא של תאי 57 ....................................... HT-29 4.2.2השפעת MXFו VP-16-על ביטוי החלבון 59 ............................................... survivin 4.2.3השפעת MXFו VP-16-על שינויים מורפולוגיים בתאי 61 .............................. HT-29 4.2.4שפעול קספאז 3לאחר חשיפת התאים ל VP-16-ו63 ....................................... MXF- 4.2.5השפעת VP-16ו MXF -על הפרשת ציטוקינים פרו-אנגיוגניים מתאי 65 ............ HT-29 4.3בדיקת עיכוב פעילות האנזים טופואיזומראז Iמסחרי בנוכחות ריכוזים שונים של MXF ,CPTו66 ........................................................................... CIP- 4.3.1השפעת CIP ,MXFבשילוב עם CPTעל פעילות האנזים טופואיזומראז 68 .................. I 4.3.2בדיקת אופן העיכוב של topo Iע"י CIP/MXFבשילוב עם 70 ............................ CPT 4.3.3השפעת CIP /MXFהניתנים לבד או בשילוב עם CPTעל פעילות טופואיזומראז Iהמופק מתאי 72 ........................................................ HT-29 4.3.4השפעת CIP /MXFהניתנים לבד או בשילוב עם CPT על הפעילות התוך תאית של טופואיזומראז Iבתאי 74 ....................................... HT-29 4.4בדיקת השפעת MXFו CIP-על הפעילות האנטי-פרוליפרטיבית של 76 ............... CPT 4.4.1בדיקת שיעור אפופטוזיס בתאי HT-29בעקבות טיפול עם CIP / MXF הניתנים לבד או בשילוב עם 79 ....................................................................... CPT 4.4.2השפעת CIP ,MXFו CPT-על הפרשת ציטוקינים פרו-אנגיוגניים מתאי 81 ................................................................................................. HT-29 4.5השפעת טיפול משולב של MXFוריכוזים עולים של CPT-11על התפתחות גידולים ( )xenograftבעכברי 83 ................................................... SCID MXF 4.5.1מגביר את העיכוב בהתרבות התאים המושרה ע"י CPT-11בגידולים 86 ............... Power Doppler Ultrasound imaging 4.5.2מראה כי טיפול עם MXF גורם לירידה בזרימת הדם בגידולים הקסנוגרפטים 88 .................................................. 4.5.3השפעת MXFעל ביטוי מולקולת הדבקה בתאי אנדותל 1- )91 .................................................................................... (PECAM-1/CD-31 MXF 4.5.4גורם לירידה ב IL-8-המושרה ע"י CPT-11בהומוגנט של גידולים 93 ................. .5דיון בתוצאות 95 ........................................................................................................ .6סיכום 107 ................................................................................................................. .7רשימת ספרות 108 ..................................................................................................... .8נספח א' רשימת פרסומים בעקבות עבודה זו125................................................................. 1 .1מבוא DNA 1.1טופואיזומראזות DNAטופואיזומראזות הנם אנזימים האחראים על המצב הטופולוגי של ה DNA-בתא .פעולתם נעשית ע"י העברת גדיל אחד של DNAדרך שבר בגדיל הנגדי )טופואיזומראז מסוג ,(Iאו ע"י העברת איזור כפול ממולקולה זהה או שונה דרך שבר דו-גדילי שנוצר ב) DNA-טופואיזומראז מסוג .(II הצורך הבסיסי באנזימי הטופואיזומראז נובע מהמבנה הדו-גדילי של ה .DNA-ברוב התהליכים הדורשים גישה למידע האגור ב ,DNA-יש צורך בהפרדת שני הגדילים ,אם באופן זמני ,כמו בשעתוק ורקומבינציה ,או באופן תמידי ,כמו בשכפול. בגלל המבנה המעגלי של ה DNA -הבקטריאלי והגודל העצום של מולקולות ה DNA-האאוקריוטי ,אין פתרון פשוט למקרים הטופולוגיים הרבים אשר מתרחשים ב DNA-בתוך התא ) (1אי לכך ,במהלך שכפול ה ,DNA-שני הגדילים מוכרחים להיות מופרדים לגמרי ע"י אנזימי הטופואיזומראז ,ובמהלך השעתוק ,ה RNA-פולימראז ,הנע על הגדילים ,גורם לליפוף יתר של הגדילים היוצר מתח שחייב להיות משוחרר ).(1,2 הקשר של ה DNA-עם היסטונים ,כמו גם עם חלבונים אחרים ,גורם לליפוף יתר של ה DNA-אשר דורש הרפיה של המתח הנוצר ,דבר המתבצע ע"י טופואיזומראזות .בנוסף ,שעתוק מחלק מהפרומוטורים בבקטריה דורש מידה מינימאלית של ליפוף שלילי של ה ,DNA-אך ליפוף יתר יהיה הרסני ).(3-6 על מנת שתא יוכל לעבור חלוקה תקינה ,כרומוזומים אשר עברו שכפול מלא חייבים להיות משוחררים ממתח ,דבר המתבצע ע"י DNAטופואיזומראזות בשלב שלפני הפרדת הכרומוזומים .דוגמאות אלו ממחישות שלא רק המבנה של ה DNA-מוביל לבעיות טופולוגיות קשות ,אלא שהמצב הטופולוגי של ה- DNAעצמו חייב להיות מכוון היטב על מנת לייעל את תפקוד ה.DNA- בשנים האחרונות יש עניין רב באנזימי הטופואיזומראז ,לא רק בגלל התפקיד שלהם בויסות המצב הטופולוגי של ה ,DNA-אלא גם בגלל שתי התפתחויות חשובות הקשורות לאנזימים אלה .ראשית -זוהו תרופות שונות המכוונות כנגד אנזימי הטופואיזומראז ,אשר רבות מהן גורמות לפגיעה ציטוטוקסית ע"י כך שהן לוכדות את האנזים בקשר קוולנטי עם ה .DNA-בין התרופות הללן ,המכונות "רעלים לטופואיזומראז" ,יש תרופות אנטימיקרוביאליות ותרופות כימו -תרפויטיות ,אשר חלקן נמצאות היום 2 בשימוש קליני .שנית -המבנה הקריסטלוגרפי של מספר טופואיזומראזות פורסם בשנים האחרונות ,כך שישנה השלמה לספרות הביוכימית הקיימת דבר מאפשר הבנה עמוקה יותר של אופן הפעולה של האנזימים ).(7 1.1.1סיווג אנזימי הטופואיזומראז: ביקוע של ה DNA-ע"י אנזימי הטופואיזומראז מלווה ביצירה של קשר פוספודיאסטרי זמני בין חומצת האמינו טירוזין על גבי החלבון לבין אחד הקצוות השבורים של גדיל ה .DNA-המצב הטופולוגי של ה- DNAיכול לעבור שינוי בזמן הקשר הקוולנטי הזמני ,והאנזים משתחרר ברגע שה DNA-עובר איחוי מחדש. אנזימים אשר מבקעים רק גדיל אחד של ה DNA-מכונים אנזימי טופואיזומראז מסוג .Iבנוסף ,ישנה חלוקה נוספת לתת משפחה מסוג :Iתת משפחה IAהם כאלו שנקשרים לפוספאט 50-ותת משפחה ,IB הנקשרים לפוספאט .30 אנזימי טופואיזומראז אשר מבקעים את שני גדילי ה DNA-ויוצרים שבר דו-גדילי מקובצים כולם תחת המשפחה מסוג .IIחלוקה נוספת לתתי משפחות מבוססת על שיקולים מבניים ).(7 3 Salceda et al. The EMBO Journal. 25:2575-83, 2006. איור מס' :1אופן הפעולה של טופואיזומראז IוII- 4 1.1.2תפקיד הטופואיזומראז בתא אאוקריוטי: בתאים אאוקריוטים ,כמו גם בפטריות ,קיים רק סוג אחד של טופואיזומראז מסוג Iאשר נוטל תפקיד מרכזי בתמיכת תנועת המזלג במהלך השכפול ובשחרור ליפופי יתר .טופואיזומראז Iחיוני במהלך ההתפתחות וסביר להניח שגם בחלוקה תאית ) .(8-9בשונה מהפטריות ,רוב היצורים האאוקריוטים )להוציא את הדרוזופילה( מכילים שני איזופורמים של תת המשפחה מסוג טופואיזומראז IIAאשר מכונים IIαו .IIβ-טופואיזומראז IIαהינו חיוני ומצוי בכל סוגי התאים ואחראי במהלך השכפול על התרה של הדופלקסים השזורים בתאי הבת .בנוסף ,הוא תורם לשחרור ה DNA-במהלך שעתוק ותהליכים תאיים נוספים .למרות שטופואיזומראז IIβאינו הכרחי לחלוקה תאית ) ,(10-11בבדיקת תפקידו של אנזים זה במערכת in-vivoנראה כי ,עכברים עם מוטציה הומוזיגוטית לגן המקודד לאנזים מתים בלידה עקב פגם נשימתי .ניתן לראות התפתחות לקויה של המערכת העצבית :נוירונים מוטוריים כשלו ביצירת קשרים עם שרירי השלד ונוירונים תחושתיים לא חדרו את חוט השדרה .פגמים אלו נצפו בשלבים מאוחרים של האמבריוגנזה ,כאשר תאים ממערכת העצבים כמו גם תאי שריר ממוינים היטב, לכן תוצאה זו מרמזת על כך כי לטופואיזומראז IIβתפקיד כללי בשחלוף או שעתוק ספציפי בהתפתחות המוקדמת של נוירונים ).(12 1.1.3תרופות כימו-תרפויטיות המכוונות כנגד אנזימי הטופואיזומראז מחלת הסרטן הנה היום בין הסיבות המובילות למוות .בישראל בלבד ,כ 27,000 -בני אדם מאובחנים בכל שנה כחולים בסרטן .הם מצטרפים ל 200,000 -חולי הסרטן החיים בישראל. מחלת הסרטן איננה מחלה אחת אלא קבוצת מחלות המורכבת מלמעלה מ 200 -סוגים שונים ,על כן קיים חיפוש מתמיד אחר תרופות וטיפולים שונים. תרופות המעכבות את האנזימים טופואיזומראז Iוטופואיזומראז ,IIהן בין התרופות האנטי סרטניות היעילות ביותר היום ).(13 קיימות תרופות הפועלות על טופואיזומראז Iוכאלו הפועלות על טופואיזומראז .II אחת התרופות הראשונות שהראתה פעילות אנטי-סרטנית ע"י עיכוב טופואיזומראז IIהנה אטופוזיד ) .(VP-16התרופה משמשת כתרופה מרכזית הניתנת בסוגי סרטן שונים כמו לאוקמיה ,לימפומה ועוד 5 ).(14-15 VP-16הנה תרופה השייכת לתרופות כימו תרפויטיות מסוג ,plant alkaloidsכלומר ,תרופות המופקות מצמחים VP-16 .שייכת ל podophylotoxins-והיא מופקת מצמח המייפל. (CPT) Campthotecinהיא בין התרופות המעכבות את הפעילות של טופואיזומראז ,Iונגזרות שלה כמו טופוטקאן ואירינוטקאן משמשות כיום לטיפול כנגד סרטן השחלות וסרטן המעי הגס ,בהתאמה ).(16 תרופה זו ונגזרותיה מופקים מהעץ Camptotheca acuminateוגם תרופות אלו משתייכים ל.plant alkaloids- בתאים סרטניים ,פעילות האנזימים טופואיזומראז Iו II-מוגברת עקב קצב חלוקה גבוה של התאים. במהלך פעילותם ,האנזימים נקשרים ל DNA-בקשר קוולנטי ונוצר שבר זמני .תרופות שמכוונות כנגד אנזימים אלו פועלות כך ,שהן מגבירות את הקשר הקוולנטי הנוצר בין האנזים למקטעי DNAשבורים הנוצרים באופן טבעי ,עקב כך לא נוצר איחוי לשבר ,נוצר נזק לתא ,והתא עובר אפופטוזיס ).(14,17 1.2קווינולונים הקווינולונים הנם תכשירים אנטימיקרוביאלים סינטטיים בעלי פעילות רחבת טווח ,אשר פרצו לשוק בשנות ה 80-ונמצאים בשימוש נרחב בקהילה ובבתי חולים כנגד מגוון זיהומים ).(18-19 קווינולונים הם אנלוגיים של החומצה הנלידיקטית שסונתזה כבר בשנת 1962במסגרת מחקר למציאת תרופה כנגד מלריה .המבנה של החומצה הנלידיקטית דומה למבנה הבסיסי של השלד המרכיב את הקווינולונים .כיום ,ידועים כבר למעלה מ 1000-קווינולונים המחולקים לתת קבוצות שונות לפי ההתמרות שבוצעו על השלד המקורי של החומצה הנלידיקטית ).(19 קבוצת הפלואורוקווינולונים מכילה אטום פלואור על פחמן בעמדה 6של טבעת הקווינולון .התמרה זו מגבירה משמעותית את טווח הפעילות האנטימיקרוביאלית של התרופה ,בהשוואה לחומצה הנלידיקטית ) .(20הפלואורוקווינולונים הנם בעלי פעילות טובה כנגד חיידקים גראם שליליים וחלק מחיידקים גראם חיוביים .הם נספגים היטב אוראלית במתן דרך הפה ,בעלי זמן מחצית חיים ארוך יחסית בסרום, חדירה טובה למספר רב של רקמות ויכולת חדירה טובה לתאים ,תכונה המאפשרת להם להתגבר על פתוגנים תוך תאיים ).(21 6 לפחות 18פלואורוקווינולונים נמצאים בשימוש ברחבי העולם כאשר מוקסיפלוקסצין) moxifloxacin (MXFוציפרופלוקסצין ) (ciprofloxacin CIPנמנים עליהם ).(20 MXFהנה דור רביעי בפיתוח הפלואורוקווינולונים והיא טוקסית לאחוז ניכר של חיידקים גראם חיוביים ולפתוגנים לא נפוצים ,כולל זנים עמידים ,וטווח פעילותה כולל פתוגנים של איברי הנשימה העליונים והתחתונים ).(21 התרופה מכילה התמרה ציקלופרופילית בעמדה N1של הטבעת הקווינולונית )תמונה מס' .(2בעבר הוכח במעבדתנו כי לקווינולונים בעלי מבנה זה יש פעילות אימונומודולטורית in vivoו.(22) in vitro- ציפרופלוקסצין מוקסיפלוקסצין http://www.jdosmp.org/lectures/rnd_fluoroquinolones.htm איור מס' :2מבנה המולקולות מוקסיפלוקסצין וציפרופלוקסצין CIPהוא דור שני בפיתוח הפלואורוקווינולונים ,גם הוא מכיל התמרה ציקלופרופילית בעמדה N1 ופלואור בעמדה מס' 6כמו ,MXFאנטיביוטיקה זו נמצאת בשימוש כנגד זיהומים חיידקיים במערכת השתן ,ריאות ,עצמות ,ועוד ).(23 הפלואורוקווינולונים פוגעים בחיידקים ע"י עיכוב האנזימים DNA gyraseו/או DNA topoisomerase 4החיוניים לשכפולם .עובדות אלו הוכחו כאשר הראו כי חיידקים בעלי מוטציות נקודתיות בגנים gyrAו gyrB-המקודדים ל DNA gyrase-ובגנים parCו ,parE-המקודדים ל- ,topoisomerase 4היו עמידים באופן מוחלט לקווינולונים ).(24-26 7 ה DNA gyrase-מכיל שתי תתי יחידות והוא אחראי על הסיבוב השלילי של ה DNA-הדו-גדילי בחיידקים .מנגנון סיבוב ה DNA-ע"י האנזים מאפשר מעבר של מקטע דרך שבר ב DNA-הדו-גדילי המוחזק פתוח ע"י האנזים כך שמתאפשר שכפול ושעתוק של גנים .טופואיזומראז 4הוא האנזים שמפריד בין כרומטידות אחיות הנוצרות לאחר הכפלת ה DNA-החיידקי .בדומה ל ,DNA gyrase-הוא מכיל גם שתי תתי יחידות בעלות הומולוגיה לאלו המרכיבות את ה .DNA gyrase-הוא מסוגל לזהות crossoversב DNA-ולהסיר אותם תוך יצירת שברים חולפים ב.DNA-תרופות ממשפחת הקווינולונים תופסות את שלב הביניים של חיתוך ה DNA-ויוצרות קומפלקס קווינולון-אנזים )גיראז או טופואיזומראז ,DNA-(4המכיל DNAשבור .לאחר יצירת קומפלקס זה התא נכנס לתהליך שבסופו הוא מת ).(27 עיכוב השכפול אינו הסיבה למוות התאי אלא הוא נגרם כנראה כתוצאה משחרור שברי DNAדו גדילי מהקומפלקס תרופה-אנזים DNA-שיתכן ויכולים לגרום לתהליכים שונים כמו תגובת SOSותגובת .(28-29) heat-shockבאמצע שנות ה 80-החלו לחקור את ההשפעות האימונומודולטוריות של הקווינולונים על תאים אאוקריוטים .למספר קווינולונים הוכח שיש פעילות אימונומודולטורית במודלים של חיות ובני אדם ) .(20 ,30-31קווינולונים כמו CIPו MXF-גורמים לעלייה ברמת הייצור של מספר ציטוקינים בלימפוציטים הומאניים מדם היקפי שעברו גירוי in vitroובמספר מודלים של חיות אימונוסופרסיביות .(32 ,31 ,18) in vivoהציטוקינים העיקריים שרמתם עלתה במודלים אלו היו: .(33 ,31 ,18) IL-2, IL-3, GM-CSF, IFN-השינויים ברמת ייצור הציטוקינים מושפעים מסוג הקווינולון ומריכוזו .כך למשל ,נמצא שקווינולונים מגבירים את יצירת הציטוקין IL-2בלימפוציטים הומאניים מגורים בטווח הריכוזים .(34) 5-80g/ml 1.2.1פלואורוקווינולונים והשפעות אנטי-סרטניות למס' פלואורוקווינולונים )כמו ל CIP ,MXF-ו (trovafloxacin-הוכחה ,ע"י מס' קבוצות מחקר כמו גם ע"י מעבדתנו ,פעילות אנטי סרטנית במס' שורות תאים ובמודל .in-vivoפעילות זו הייתה בעיקר בשורת תאים מסוג סרטן המעי הגס ,שלפוחית השתן ותאי לאוקמיה .הפעילות האנטי סרטנית שנצפתה במחקרים אלה יוחסה לעובדה שלפלואורוקווינולונים פעילות כנגד האנזים טופואיזומראז ,IIאשר הוכחה בתאים אאוקריוטים כמו גם בתאי גידול ).(35-42 8 מחקר קודם במעבדתנו הראה כי טיפול עם MXFהגביר את הפעילות האנטי-פרוליפרטיבית והאפופטוטית של VP-16המושרית בשורות תאי הגידול THP-1ו Jurkat-ובנוסף הפחית באופן משמעותי את השחרור המוגבר של הציטוקינים IL-1β ,IL-8ו TNF-α-הנגרם ע"י . (38) VP-16 1.3אפופטוזיס אפופטוזיס הנו מוות פיזיולוגי מתוכנן של תא המתרחש כאשר תא בתוך האורגניזם מת כתוצאה מפעילות של חלבונים שמקודדים ע"י הגנום שלו .המטרה של תהליך זה הנה לגרום למוות של תאים שאינם רצויים יותר .התהליך יוצא אל הפועל ב 3-מצבים .1 :במהלך התפתחות האורגניזם ושמירה על הומיאוסטאזיס, .2כמכניזם של הגנה ו .3 -בהזדקנות ).(43 קיימת צורה נוספת המובילה למוות תאי והיא הצורה הפתולוגית המתרחשת בעקבות חשיפת התא לתנאים קיצוניים ואיבוד הבקרה .תהליך זה נקרא מוות נקרוטי .בנקרוזיס ,מים ויונים ,שבצורה נורמאלית נשאבים החוצה ,חודרים אל תוך התא והתא מתנפח .האורגנלות הציטופלסמטיות נהרסות ,נוצרים שברים בממברנה ,תוכן התא משתחרר ודבר זה מלווה בד"כ בתגובה דלקתית מקומית ,שעלולה להשפיע על כל האורגניזם ).(44 באפופטוזיס לעומת זאת ,המוות התאי הנו מתוכנן ומתרחש בתנאים פיזיולוגיים ,תחת בקרת התא .נפח התא מופחת ,התא מתכווץ ,הרטיקולום האנדופלסמטי מתאחד עם ממברנת התא והאורגנלות הפנימיות שומרות על שלמותן .הכרומטין נדחס ואנדונוקלאזות מבקעות את ה DNA-ומתקבלים פרגמנטים במכפלות של 180-200זוגות בסיסים )" סולם ה "DNA-המאפיין אפופטוזיס( ) .(45תאים שעוברים אפופטוזיס שומרים על שלמות ממברנת הפלסמה ,אולם מבנה הממברנה משתנה .המבנה האסימטרי של הפוספוליפידים בקרום התא המאפיין תאים חיים אינו נשמר )לדוגמה -פוספטידיל סרין עובר flip- floppאל חוץ התא( ,וכך ישנה אפשרות של תאים פאגוציטריים לזהות תאים אפופטוטיים ,לבלוע אותם ולפרק אותם .תאים מתים שלא עוכלו עוברים שינויים נוספים כמו דחיסת הציטופלסמה כלפי הממברנה ויצירת "גופים אפופטוטים" ,זה מה שהשרה את השם "אפופטוזיס" שפירושו ביוונית נשירה ).(46 גופיפים אלו מכילים חלקי כרומטין ואורגנלות תאיות והם יעוכלו ע"י תאים פאגוציטרים סמוכים ובכך יש השלמה של תהליך הפירוק .חשיבות צורה זו של מוות היא בכך שאינה מלווה בתגובה דלקתית ונועדה להבטיח נזק מינימאלי לרקמה ).(44 9 http://www.microbiologybytes.com/virology/kalmakoff/baculo/baculohostinteract.html איור מס' :3תהליך האפופטוזיס תהליך האפופטוזיס נמצא תחת בקרה ומתחלק למס' שלבים ,בשלב הראשון ישנו גירוי המעורר את התגובה האפופטוטית ,הגירוי יכול להיות סיגנל חיצוני ,המועבר דרך הרצפטורים המצויים על פני התא, כמו ציטוקינים וגורמי גדילה או שהגירוי יכול להיות סיגנל המתקבל מתוך התא כתוצאה מנזק ל.DNA- חשוב לציין כי אותו גירוי יכול להשפיע בצורה שונה על התהליך וזה תלוי בסוג התא ושלבי ההתפתחות השונים .בשלב השני ,הגירוי עובר דרך מערכת העברת הסיגנלים למנגנון האפקטורי של המוות התאי. מנגנון זה כולל שפעול פרוטאזות ,המוציאות אל הפועל את המוות התאי והתא מחויב למות .בשלב זה מעורבים רגולטורים חיוביים ושליליים .בשלב הסופי התא מתפרק ומתקבלים השינויים המורפולוגיים והביוכימיים ).(47 ,43 11 1.3.1קספאזות הקספאזות הנן ציסטאין פרוטאזות המצויות בציטוזול כפרו-אנזים לא פעיל המורכב משרשרת פוליפפטידית אחת .לקספאזות בכללותן מבנה דומה :כל פרו-קספאז מכיל פרודומיין Nטרמינלי שגודלו שונה בין הקספאזות ) ,(2-25kDaתת יחידה גדולה ) ,(17-21kDaותת יחידה קטנה Cטרמינלית )10- .(48)(13kDaעל מנת לשפעל את הקספאזות יש צורך בשני ביקועים פרוטאוליטים בשיירי חומצה אספרטית ) .(Aspהביקוע הראשון מפריד בין תת היחידות הקטליטיות ,הגדולה והקטנה ,והביקוע השני מסיר את הפרו-דומיין ה N-טרמינלי .שתי תת היחידות מתחברות לטטראמר עם שני אתרי פעילות, כלומר האנזים הפעיל הנו הטרוטטראמר המורכב משתי תתי יחידות קטנות ושתיים גדולות עם שני אתרים קטליטיים למולקולת אנזים ).(48 כל אתר פעיל נוצר ע"י רצפים הנתרמים משתי תת היחידות הגדולה והקטנה )(49כאשר תת היחידה הגדולה והקטנה משתחררות מהפרו-קספאז דרך חיתוך של שיירי .Asp-Xשפעול הקספאזות יכול להתבצע ע"י חיתוך עצמי או דרך פעילות של פרוטאזות .הקספאזות חותכות את הסובסטרטים שלהם בשיירי Aspומשופעלות בעצמן ע"י חיתוך פרוטאוליטי בשיירי ,Aspדבר המעיד כי הן פועלות בקסקדה המאפשרת הגברה של הסיגנל האפופטוטי ).(50 עד כה זוהו כ 14-קספאזות ביונקים ,מתוכן 11בבני אדם .מספר הקספאז מעיד על הסדר שבו התגלה ).(51 ניתן לחלק את הקספאזות המצויות בבני אדם לשתי משפחות :אלה המעורבות במוות תאי )קספאזות (2,3,6,7,8,9,10ואלה המעורבות בעיקר בתהליכי דלקת )קספאזות .(52)(1,4,5,11 ניתן לסווג את הקספאזות המעורבות במוות תאי לפי דמיון ברצף חומצות האמינו או לפי ספציפיות הפרוטאזה שלהן .הספציפיות לחיתוך הסובסטרט נקבעת ע"י ארבע חומצות האמינו משמאל לאתר החיתוך ) .(53חלוקה מקובלת נוספת היא ל upstream (initiator) caspases-ולdownstream - ,(executioner) caspasesבהתאם למיקום הקספאז בקסקדה הפרוטאוליטית .לinitiator caspases- יש פרו-דומיינים ארוכים ,הפועלים כאמצעי לקישור חלבונים ,ומאפשרים להם להגיב עם חלבונים שונים המעוררים שפעול קספאזות .קספאזות אלו פועלות upstreamל executioner caspases-שהם בעלי פרו-דומיינים קצרים ושפעולם הוא שמביא למוות תאי מתוכנן ).(47 11 Deveraux. Et al. Nature 388: 300, 1997 איור מס' :4קסקדת שפעול קספאזות Survivin 1.3.2 תהליך האפופטוזיס מבוקר ע"י רגולטורים חיוביים ושליליים .קיימת משפחה של חלבונים המכונה (IAPs) inhibitor of apoptosisהמהווים רגולטורים שליליים של תהליך האפופטוזיס .החלבון Survivinמשתייך למשפחה זו. Survivinהנקרא גם ) baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5 (BIRC5הנו חלבון המקודד ע"י הגן .(55,56) BIRC5 החלבון מעכב את שפעול הקספאזות ובכך למעשה גורם לבקרה שלילית על מוות תאי מתוכנן או אפופטוזיס .פעילות זו הוכחה כאשר הייתה הפרעה בשפעול המסלולים של Survivinאשר גרמה לעלייה באפופטוזיס וירידה בהתפתחות גידולים ).(56 החלבון מבוטא ביתר ברקמות עובריות ובגידולים ,בעוד שביטויו בבוגר מוגבל לרקמות ספציפיות הכוללות את התימוס ,טחול ,שלייה ,אפיתל המעי ומח העצם .בתאים ממוינים סופית הוא לא מבוטא כלל ) .(57-59בסרטן ,ישנה עלייה חדה במספר ה transcripts-של החלבון עם טווח שונות בין סוגי סרטן שונים ) .(57,59עובדה זו הופכת את Survivinלמטרה טובה בטיפול בסרטן לאור העובדה שפגיעה 12 בחלבון זה תביא לפגיעה בתאי הסרטן בעוד שתאים בריאים יישארו ללא פגע . הבקרה על ביטוי Survivinתלויה גם במחזור התא והוא מבוטא רק בשלב ה .G2M-ידוע כי Survivin מצוי באזור כישור החלוקה והוא נמצא באינטראקציה עם טובולין במהלך המיטוזה ויתכן שהוא בעל תפקיד חשוב בבקרה על תהליך זה .המנגנון המולקולארי המבקר את החלבון Survivinאינו ידוע היטב עד היום אך ישנה סבירות שהוא קשור לחלבון .(60) p53 החלבונים הראשונים ממשפחת חלבוני ה IAP-שהתגלו היו מה Cp-IAP : baculovirus-וOp-IAP- אשר נקשרים ומעכבים קספאזות כחלק ממנגנון אשר תורם ליעילות ההדבקה והשכפול במאחסן .לאחר מכן התגלו 5חלבונים הומאניים נוספים המשתייכים למשפחת חלבוני ה IAPs-וביניהם ,XIAP NAIP ,c-IAP2 ,c-IAP1ו.(61) Survivin- ,Survivinכמו החלבונים האחרים ,התגלה ע"י ההומולוגיה שלו למשפחת חלבוני הIAP- ב .human B-cell lymphoma-בגידולים אלה הראו כי החלבונים c-IAP1 ,XIAPוc-IAP2- נקשרים לקספאז 3וקספאז ,7שהינן קספאזות אפקטוריות במסלול האפופטוזיס ) .(61עדיין לא ידוע אופן העיכוב של תהליך האפופטוזיס ברמה המולקולארית. אחד המאפיינים של מעכבים אלו הוא נוכחות של איזור של קרוב ל 70-חומצות אמינו המכונה (BIR) Baculovirus IAP repeatהחוזר על עצמו בין 1ל 3 -פעמים .קיימים IAPs 8הומאניים, ואנלוגיים להם זוהו במספר אורגניזמים .קבוצתו של (61) Tamm et alהראתה כי פגיעה )(knock out ב BIR2-בחלבון XIAPגרמה לאיבוד פעילות החלבון ,כלומר אי יכולת לעכב את הקספאז ,תופעה זו מלמדת אותנו כי הפעילות האנטי-אפופטוטית של חלבונים אלו מצויה ב .BIR motifs-לחלבון Survivinיש רק אזור BIRאחד וכאשר משווים את הרצף שלו ,מוצאים שהוא דומה מאוד לאלו המצויים בחלבון .(61) XIAP Survivinמהווה רגולטור הכרחי בתהליך חלוקת התא ) ,(62מווסת מוות תאי ,בין אם זהו מוות אפופטוטי או לא אפופטוטי ובנוסף הנו פקטור המגיב לתנאי עקה המבטיח את המשך חיות התא למרות היות הסביבה עוינת ) .(63בנוסף Survivin -הנו אנטגוניסט למוות אפופטוטי ) ,(64מקדם תהליכי אנגיוגנזה הקשורים לגידולים סרטניים ) (65ומשחק תפקיד חשוב בעמידות כנגד הרבה סוגים של טיפולים כנגד סרטן ).(66 13 1.4אנגיוגנזה אנגיוגנזה הנו תהליך של צמיחה של כלי דם חדשים מכלי דם קיימים ,לעומת תהליך הוסקולוגנזה שהוא יצירה של כלי דם חדשים הנוצרים ע"י גיוס של (EPCs) endothelial progenitor cellsממח העצם ) .(67תהליך האנגיוגנזה חיוני במהלך החיים העובריים ,בעוד שבבוגר הוא תהליך המתקיים בעיקר במערכת המין הנקבית במחזור החודשי או במהלך תנאים פתולוגיים הכוללים דלקת מפרקית שגרונית, ריפוי פצעים ,מחלות עיניים על רקע סוכרתי וצמיחת גידולים ).(68 במהלך תהליך האנגיוגנזה ,מפרקים תחילה תאי האנדותל את הממברנה הבזאלית של כלי הדם ,לאחר מכן תאים אלו נצמדים ,עוברים פרוליפרציה ונודדים לסטרומה הסמוכה .התאים מסנתזים מחדש ממברנה בזאלית חדשה על מנת ליצור תעלות פונקציונאליות להובלת דם וחומרי מזון. תהליך האנגיוגנזה דורש שינויים מתואמים הכוללים ביטוי פרוטאזות ,מולקולות הדבקה ,פקטורים מבקרים של מחזור התא כמו גם פקטורים האחראים על שינוי מורפולוגי מתאים של תאי האנדותל בסביבתם .גידולים והסטרומה של הגידול מייצרים מערך שלם של פקטורים פרו-אנגיוגניים אשר פועלים על תאי האנדותל הסמוכים על מנת לגרום לאנגיוגנזה .בנוסף לתאים הקבועים בסטרומה של הגידול, ישנה הסתננות של תאי מערכת החיסון )לויקוציטים( המגויסים אל הגידול על מנת לייצר פקטורים אנגיוגניים כמו גם תאים ממח העצם ,שהם למעשה EPCs,או תאים מיאלואידיים לא בשלים אשר יכולים להשתלב ישירות למערכת כלי הדם המתפתחת ).(67 במהלך אנגיוגנזה פיזיולוגית ,כאשר רקמת המטרה מסיימת את יצירת כלי הדם ,נפסק ביטויים של הפקטורים האנגיוגניים .נדידת תאי האנדותל ,ההתרבות והפרוטאוליזה נפסקים וכלי הדם החדשים שנוצרו עוברים הבשלה ,נוצרים מחדש קשרים בין תאיים ונוצרת ממברנה בזאלית רציפה .בנוסף, מגויסים תאים תומכים על מנת לחזק ולתחזק את כלי הדם החדשים שנוצרו .תהליך הבשלה זה לעיתים חסר או לא קיים באנגיוגנזה בגידולים .הביטוי המתמיד של פקטורים אנגיוגניים מונע את ההבשלה של הקפילרות הנוצרות וכך למעשה נוצרים כלי דם לא תקינים ,דולפים ומפותלים הדורשים כל הזמן עיצוב מחדש ).(69 14 vascular endothelial growth factor (VEGF) 1.4.1 VEGFהינו תת משפחה של פקטורי גידול אשר מעורבים בוסקולוגנזה ואנגיוגנזה והוא הפקטור הפרו- אנגיוגני המאופיין בצורה המקיפה ביותר VEGF .מיוצר ומופרש ע"י מספר סוגי תאים וביטויו עולה באופן משמעותי בתאים סרטניים כמו גם בסטרומה של הגידול ) .(70-75הגורם לביטוי של VEGFהנו מתח נמוך של חמצן או היפוקסיה אשר נגרמת ע"י מסת תאים צפופה המתרבה במהירות ואין לה גישה לאספקה מספקת של חומרי מזון .במיקרו-סביבה ההיפוקסית של הגידול ,פקטורי השעתוק הלא יציבים בדרך כלל הם (hypoxia inducible factor 1α) Hif1αוhypoxia inducible factor ) Hif2α- .(2αפקטורים אלה נקשרים ישירות לפרומוטור של ,VEGFעוברים למצב יציב ובכך גורמים לעלייה בשעתוק ).(76-77 המצאות רמות גבוהות של HIFsבמגוון רחב של גידולים נמצאה קשורה לפרוגנוזה גרועה ,עמידות לרדיותרפיה וכימותרפיה ,ועלייה בתמותת החולים ).(78-79 בנוסף להיפוקסיה ,גורמים נוספים במיקרו-סביבה של הגידול יכולים לגרום ליצירת VEGFכגוןpH : נמוך ,ציטוקינים פרו-אינפלמטורים )לדוג' ,(IL-6פקטורי גידול )כגון basic fibroblast growth (FGF - factorוכימוקינים )כגון .(73) (SDF-1 - stromal cell-derived factor-1 ביטויו של VEGFיכול להיות מושרה תחת תנאים נורמאליים כאשר ישנו שיבוש בארגון או בפולריות של תאי האנדותל ) .(71פרט לכך ,החלבון עצמו יכול להיקשר ולהיות מאוחסן במטריקס של רקמת גידול וכאשר יהיה צורך בכך ,יהיה שפעול של המטלופרוטאינזה MMP9אשר תשחרר את חלבון ה VEGF -וכך תתאפשר התחלה של תהליך האנגיוגנזה ).(70 כאמור VEGF -הנה תת משפחה של פקטורי גידול המעורבים בוסקולוגנזה ואנגיוגנזה .כל חברי המשפחה גורמים לתגובה תאית ע"י קישורם לרצפטור מסוג טירוזין קינאז ) (VEGFRsהמצויים על גבי שטח פני התא .קישור זה גורם לדימריזציה של הרצפטור ובכך לשפעולו ע"י זרחון מסוג ,transphosphorylationדבר המתרחש באזורים שונים במידה וזמנים שונים .המבנה של הרצפטורים ל VEGF-מורכב מחלק חוץ תאי המכיל 7אזורים דמויי אימונוגלובולין ) ,(Ig –likeחלק טרנסממברנלי וחלק תוך תאי המכיל אזור של טירוזין קינאז מפוצל VEGF-A .נקשר לרצפטור VEGFR-1ו- . VEGFR-2הרצפטור VEGFR-2אחראי כנראה על תיווך של כמעט כל התגובות התאיות בעקבות 15 קישור הליגנד .לעומת זאת ,תפקידו של VEGFR-1פחות מאופיין אך הוא מבקר כנראה את פעילותו של .VEGFR-2תפקיד נוסף שלו הוא להוות "רצפטור מלכודת" וכך לקשור את הליגנד במקום VEGFR- ) 2עובדה זו חשובה בעיקר במהלך החיים העובריים בתהליך הוסקולוגנזה( ).(80 http://www.gene.com/gene/research/focusareas/oncology/angiogenesis.html איור מס' :5תהליך האנגיוגנזה בגידול 1.4.2הציטוקין (IL-8) Interleukine -8 IL-8הידוע גם בשם CXCL8הנו כימוקין פרו-דלקתי .שעתוק של הגן המקודד ל 99-חומצות אמינו עובר לאחר מכן עיבוד ,אשר גורם להיווצרות של חלבון בעל 77חומצות אמינו בתאים שאינם שייכים למערכת החיסון ,או לחלבון בעל 72חומצות אמינו במקרופאגים ומונוציטים .הביטוי של IL-8מבוקר בעיקר ע"י חלבון משפעל ו/או (NFκb) nuclear factor κ –bלמרות שקיימים אלמנטים נוספים שאופיינו בפרומוטור של .IL-8לפיכך ,ביטויו של IL-8מבוקר ע"י מס' רב של מגרים הכוללים סיגנלים של דלקת )לדוגמה ,(tumor necrosis factor αעקה כימית או סביבתית )כמו כימו-תרפיה, היפוקסיה( והורמונים סטרואידים )כמו אנדרוגנים ,אסטרוגנים( ).(81 ההשפעות הביולוגיות של IL-8מתווכות ע"י קשירתו של החלבון ל 2-סוגי רצפטורים המבוטאים על פני 16 שטח התא .הרצפטורים הם מסוג G-protein-coupled receptorוהם מכונים CXCR1ו.CXCR2- מחקרים רבים הראו כי תאים סרטניים מבטאים ביתר IL-8כשביטוי זה הנו תוצאה של תגובה לטיפול הכימותרפי או תגובה לעקה במיקרו-סביבה של הגידול כגון היפוקסיה .לעלייה בסנתזה ובהפרשת IL-8 מתאי הגידול יש משמעות רבה לגידול וזה תלוי גם ברמת הביטוי של הרצפטורים CXCR1וCXCR2- על תאים סרטניים ,תאי אנדותל ונויטרופילים /מקרופאגים השייכים לגידול ) .(82ישנם מספר מסלולים אשר מופעלים כתוצאה משפעול הרצפטורים של IL-8אשר מחזקים את המשמעות של כימוקין זה בהגברת הממאירות והתקדמות הסרטן .כך לדוגמה -לאחר שפעולם של חלבוני ה ,G-ישנו שפעול של האפקטורים הראשוניים כמו phosphatidyl-inositol-3-kinaseאו phospholipase Cושפעול זה גורם לשפעול של הסובסטרטים ,PKC ,Aktניוד של סידן ו/או שפעול מסלולי סיגנל דרך .MAPK מסלולים אלו קשורים בתרגום של מספר חלבונים כמו גם בבקרה על מספר פקטורי שעתוק .בין פקטורי השעתוק המבוקרים בקרה חיובית ע"י IL-8נמנים AP-1 ,NF-ĸB ,HIF-1ו AR-אשר אחראים על אנגיוגנזה ,פלישה,התרבות והישרדות תאים ).(82 CD-31 1.4.3 המולקולה CD-31נוטלת תפקיד חשוב בתהליכי אנגיוגנזה ווסקולוגנזה CD-31.הנה מולקולה בעלת שרשרת אחת בעלת משקל מולקולארי של .130-kDaמולקולה זו הנה גליקופרוטאין המכילה 6אזורים חוץ תאיים מסוג ,Ig-likeאזור חוצה ממברנה וזנב ציטופלסמטי .ביטוי המולקולה CD-31מרוכז בגבולות הבין תאיים של תאי האנדותל והיא מבוטאת בצורה חלשה על פני טסיות דם ורוב הלויקוציטים. מחקרים שונים הראו כי המולקולה CD-31מסוגלת לתמוך בהיצמדות והידבקות בין תאים באמצעות אינטראקציה הומופילית או הטרופילית .אינטראקציות הדבקה בין תאים מתרחשת גם בתהליכי אנגיוגנזה כמו גם בתהליכי וסקולוגנזה ,בין תאי אנדותל בינם לבין עצמם ,ובינם לבין מרכיבים בחומר החוץ תאי. CD-31מבוטא בתאי אנדותל המצויים ברצף והראו כי מולקולה זו משחקת תפקיד חשוב במגע בין תאי האנדותל ,ביצירת צינור של תאי אנדותל ובאנגיוגנזה במודל עכברי .(83) in-vivo 17 1.5סרטן סרטן הוא שם כללי למחלות שונות ,שבהן מספר תאים בגוף מתחלקים בצורה לא מבוקרת .הצטברות של תאים כאלה יוצרת גידול ממאיר )ניאופלסיה( ,ובמקרים מסוימים חלק מתאים אלה נודד למקומות אחרים בגוף ויוצר גרורות. היווצרותו של הסרטן: גופנו שמורכב מסוגי תאים רבים איננו סטטי .בכל יום מתים תאים ותיקים ותאים חדשים נוצרים באמצעות מנגנון של התחלקות. בתהליך תקין ונורמאלי התאים מתחלקים רק כאשר יש חסר בתאים ,ואז הם נקראים לתפוס מקום של תאים ישנים .יכול להיווצר מצב ,שבו התאים ממשיכים להתחלק גם כאשר אין צורך בהם ואז הם יוצרים גידול. ישנם שני סוגי גידולים: שפיר -שאיננו הורס את הרקמה ממנה הוא נוצר ואינו מתפשט לרקמות מרוחקות. ממאיר -שהוא גידול סרטני .במקרה זה ,מדובר בתאים שאינם נורמאליים .הם מתחלקים ללא כל פיקוח וללא סדר ,משתלטים על האיברים הסמוכים להם ומפריעים להם בתפקוד .הם חוזרים לאחר שהוסרו והם עלולים לפלוש לרקמות מרוחקות באמצעות זרם הדם או הלימפה להתיישב שם ולגרום להם נזק .תהליך זה נקרא גרורה ,שאחד ממאפייניה הוא שיש לה תכונות כמו לגידול הראשוני ממנו התפתחה ).(84 18 http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f6/Cancer_progression_from_NIH.png איור מס' :6תהליך הפיכת תא לסרטני סרטן היא בעיקר מחלה של גנים .בדרך כלל נדרשת סדרה של שינויים בגנים )מוטציות( על מנת שהתא יהפוך לסרטני .מבדילים בין גנים הנקראים אונקוגנים ,שגורמים להתפתחות סרטן בתאים בעקבות שינויים בגן ,לבין גנים מעכבי סרטן ) ,(tumor suppressor genesשפגיעה בהם מורידה את מערך ההגנה של התא מפני הפיכתו לתא סרטני. מוטציות בגנים אלו יכולות להיגרם על ידי קרינה ,כימיקלים מסרטנים )קרצינוגנים( ,תורשה של גנים שעברו מוטציה ,וירוסים גורמי סרטן ופגיעה על ידי רדיקלים חופשיים .ברוב המקרים לא ניתן לדעת מהו האירוע הראשוני שגרם לתא להפוך לסרטני .עם זאת ,בביולוגיה מולקולרית ניתן לתאר את המוטציות בגידול ולצפות את התנהגותו ברמה מסוימת .כך לדוגמה ,כ 50% -מהגידולים מראים מחסור של גן מעכב סרטן p53שנקרא גם "שומר הגנום" .לאחר מספר מוטציות בגנום ,גן זה יורה לתא להיכנס לאפופטוזה, כדי לא לשמר את המוטציות .אי תיפקודו של גן זה מאפשר לתאים אלו להמשיך לחיות ולהתחלק וכך ליצור עוד תאים שלא מתים .מחסור בטלומרז אף הוא גורם לחלוקה אינסופית של התא .מוטציות אחרות מאפשרות לגידולים לפתח רשת כלי דם להספקת חמצן וחומרים מזינים לתא ,או להיפרד מהרקמה שהם נמצאים בה ולעבור לרקמה אחרת )גרורות( ).(84 19 ניתן לציין 6מאפיינים של תא ממאיר(85) (hallmark of cancer) : :Self sufficiency in growth signals .1לתאים תקינים יש רצפטורים לגורמי גדילה שונים. בתנאים נורמאליים ,אם התא לא יקבל גורמי גדילה הוא ימות .לעומת זאת ,תאים ממאירים לא זקוקים לגורמי גדילה מאחר והרצפטורים שלהם משופעלים באופן אוטונומי .כך למשל, במקרים של לויקמיה מיאלואידית נפוצה נוצר חלבון )כתוצאה מקיומו של כרומוזום פילדלפיה( אשר משמש כרצפטור טירוזין קינאז ומביא להתחלקות בלתי מבוקרת של התא .הרצפטור יכול להיות משופעל באופן אוטונומי כתוצאה מאונקוגן ששופעל או איבוד פעילות של tumor suppressor gene . :insensitivity to growth inhibitor signals .2למשל ,מוטציות ב .p53 -תפקידו באופן נורמאלי הינו לעצור את חלוקת התא אך כאשר יש בו מוטציה התא ממשיך להתחלק .מוטציה זו קיימת בכ 60% -מהממאירויות השונות. .3תא ממאיר עובר פחות אפופוטוזיס )מוות תאי מתוכנן( .רצפטורים שמטרתם באופן נורמאלי לעודד אפופטוזיס )כגון (TNF-R, FAS-Rעוברים אינאקטיבציה בהרבה ממאירויות . .4יכולת התחלקות בלתי מוגבלת -בעיקר על ידי הפעלה של טלומרז המאריך את הטלומרים . .5אנגיוגנזיס -יכולת ליצור כלי דם חדשים המזינים את הגידול ,על ידי ייצור של ) VEGFגורם גדילה להיווצרות כלי דם( . .6יכולת חדירה לרקמה ויצירת גרורות )מטסטזות( -על ידי אינאקטיבציה של . E-cadherin ירידה בביטוי או אינאקטיבציה של E-cadherinגורמת להיחלשות הקשרים הבין-תאיים בתוך הרקמה וכך להגברת היכולת התאית לנוע באופן ספונטני ועצמאי .כתוצאה מכך ,תאים סרטניים יכולים לחצות את הממברנה ולחדור לרקמות סמוכות. 1.5.1סרטן המעי הגס סרטן המעי הגס ) (Colorectal Cancerהוא מחלה הכוללת גידולים סרטניים במעי הגס ,בחלחולת ובתוספתן .זהו סוג הסרטן השלישי בשכיחותו ,והשני בגורמי המוות הסרטניים בעולם המערבי .הסברה היא כי גידולים סרטניים במעי הגס מקורם לרוב בפוליפים אדנומטוטיים במעי הגס .גידולים אלה שפירים 21 בדרך כלל ,אך כמה מהם עלולים להפוך לממאירים עם הזמן .אמצעי העזר היעיל לאבחון גידול זה הוא קולונוסקופיה ,שהינה בדיקה פולשנית של המעי הגס דרך החלחולת .הטיפול הוא בדרך כלל ניתוחי , ובמקרים רבים נדרשת גם כימותרפיה .יש להדגיש כי גילוי מוקדם של המחלה ותרופות חדשות שפותחו בשנים האחרונות מקטינים את סיכויי התמותה ותורמים להארכת חיים ).(86 תסמינים (87) - לעתים קרובות החולה לא ירגיש שום תסמין .זו אחת הסיבות לכך שארגונים רפואיים רבים ממליצים על סריקה תקופתית אחר המחלה על ידי ביצוע בדיקת דם סמוי בצואה וקולונוסקופיה .כאשר יש תסמינים, הם תלויים באזור הפגיעה .באופן כללי ,ככל שהגידול קרוב יותר לאזור פי הטבעת ,יש יותר תסמיני מעי כגון: א .שינויים בהרגלי היציאות: שינוי בתדירות )שלשול או עצירות ( שינוי באיכות הצואה שינוי בעקביות הצואה ב .דם בצואה או דימום מפי הטבעת ג .צואה עם מוקוס ד .צואה שחורה דמוית זפת )מלנה( ה .תחושה של התרוקנות חלקית ,או טחירה )טנסמוס( )בסרטן החלחולת( ו .ירידה בקליבר של הצואה )בסרטן החלחולת( ז .חסימה במעי הגס פתוגנזה - מקור המחלה הוא מתאי האנדותל המצפים את המעי הגס או את החלחולת כתוצאה ממוטציות במסלול העברת האותות " ."Wnt signaling pathwayחלק מהמוטציות מורשות ואילו אחרות נרכשות. המוטציה השכיחה ביותר בסרטן המעי הגס הנה בגן APCאשר מייצר את חלבון ה APC-אשר מהווה "תמרור עצור" לחלבון . β-cateninחוסר בחלבון APCמאפשר לחלבון β-cateninלחדור אל גרעין התא ,להיקשר אל ה DNA-ולשפעל חלבונים נוספים כך החלבון β-cateninמתפקד כאונקוגן .ישנן 21 מוטציות נוספות שמתרחשות לפני שהתאים הופכים לסרטניים .כך למשל מוטציה בגן p53גורמת לכך שהחלבון TP53לא יהיה פעיל .חלבון זה מבקר חלוקה של תאים ואחראי על מוות של תאים בעלי מוטציה במסלול העברת האותות Wnt signaling pathwayועיכוב פעילותו קשור למעבר מאדנומה לקרצינומה .לעיתים המוטציה היא לא בגן p53אלא בחלבון .בנוסף לכך -ישנם אונקוגנים אשר מבוטאים ביתר בסרטן המעי הגס .כך למשל ה RAF ,RAS-ו PI3K-אשר מעודדים חלוקה כתגובה לפקטורי גידול עלולים לעבור מוטאציה ולגרום לתגובת יתר בתא והפיכתו לתא סרטני ).(88 כימותרפיה- מטרת הכימותרפיה היא האטה בקצב התפתחות הגידול ,כווץ הגידול ומניעת היווצרות גרורות .לעיתים נותנים כימותרפיה כטיפול משלים לפני או אחרי הליך כירורגי או כטיפול שמטרתו להקל על תסמינים – ).(palliative treatment בסרטן המעי הגס ,טיפול כימותרפי לאחר הליך כירורגי ניתן לרוב כאשר הסרטן פלש אל מערכת הלימפה ).(87) (stage III 22 .2מטרות העבודה העבודה התחלקה לשלושה חלקים בהם חקרתי את מנגנון הפעולה של MXFיחד עם שתי תרופות כמו- תרפויטיות שונות ) VP-16ו ( CPT-במודל in-vitroוחלק שלישי בו חקרתי את מנגנון הפעולה של MXFעם CPT-11במודל .in-vivo כל הניסויים עם תרביות התאים במודל in-vitroבוצעו בשורת תאי ) HT-29תאים סרטניים ממקור סרטן המעי הגס(. המטרות הכלליות של עבודת המחקר הן: א .חקירת מנגנון הפעולה של MXFהניתן כתרופה בודדת או בשילוב עם התרופה הכימו תרפויטית ,VP-16כנגד האנזים טופואיזומראז IIומציאת הקשר בין עיכוב פעילות האנזים להשפעות הציטוטוקסיות של ) MXFהניתן לבד או בשילוב עם (VP-16על תאי HT-29בתרבית. ב .חקירת מנגנון הפעולה של MXFבשילוב עם התרופה הכימו תרפויטית CPTכנגד האנזים טופואיזומראז ,Iומציאת הקשר בין עיכוב פעילות האנזים להשפעות הציטוטוקסיות של MXFעל תאי HT-29בתרבית .בחלק זה של העבודה ,נבדקה השפעתו של פלואורוקווינולון נוסף ,CIP ,על האנזים טופואיזומראז Iכמו גם על ההשפעות הציטוטוקסיות שלו. ג .בדיקת ההשפעה של MXFהניתן בהזרקה לבד או בשילוב עם אירונוטקאן ) (CPT-11על התפתחות גידולים בעכברות שהוזרקו להן תאי ) HT-29מודל (Xenograft in-vivo המטרות הנגזרות מן המטרות הכלליות בעבודה הן: א .1.בדיקת השפעת MXFהניתן כתרופה בודדת או בשילוב עם VP-16על פעילות האנזים המנוקה טופואיזומראז .II א .2.בחינת אופן העיכוב של התרופות על פעילות טופואיזומראז - IIהאם מתרחש ברמת ה DNA-או ברמת האנזים. א .3.בדיקת השפעת MXFו/או VP-16על פעילות טופואיזומראז IIתוך תאי. א .4.בדיקת מנגנון הפעולה של MXFע"י מבחן ה :band depletion-בדיקת הכמות החופשית של 23 האנזים טופואיזומראז IIבתא לאחר טיפול עם MXFהניתן לבד או בשילוב עם .VP-16 א .5.בדיקת השפעת MXFעל הפעילות הציטוטוקסית המושרית בשורת תרבית התאים HT-29ע"י .VP-16 א .6.בדיקת שיעור האפופטוזיס ,דהיינו שפעול קספאז 3ו DAPI-בתאים .בדיקת מחזור התא וביטוי החלבון Survivinבעקבות טיפול עם MXFלבד או בשילוב עם .VP-16 א .7.בחינת ההשפעה של MXFהניתן לבד או בשילוב עם VP-16לתאי HT-29על הפרשת הפקטורים הפרו-אנגיוגניים IL-8ו.VEGF- ב .1.בדיקת השפעת MXFו CIP-הניתנים כתרופה בודדת או בשילוב עם CPTעל פעילות האנזים המנוקה טופואיזומראז .I ב .2.בחינת אופן העיכוב על פעילות האנזימים -האם ברמת ה DNA-או ברמת האנזים. ב .3.בדיקת השפעת MXFו CIP-על פעילות טופואיזומראז Iתוך תאי לבד ובשילוב עם .CPT ב .4.בדיקת השפעת MXFו CIP -על הפעילות הציטוטוקסית המושרית בשורת תרבית התאים HT-29 ע"י .CPT ב .5.בדיקת שיעור אפופטוזיס בעקבות טיפול עם MXFאו CIPהניתנים לבד או בשילוב עם .CPT ב .6.בחינת ההשפעה של MXFאו CIPהניתנים לבד או בשילוב עם CPTלתאי HT-29על הפרשת הפקטור הפרו-אנגיוגני ,IL-8והשפעת MXFבשילוב עם CPTעל הפרשת הפקטור .VEGF ג .1.בחינת השפעת MXFהניתן לבד או בשילוב עם אירינוטקאן על התפתחות גידולים ממקור הומאני )השתלת תאי (HT-29בעכברי .SCID ג .2.השפעת MXFואירינוטקאן הניתנים לבד או בשילוב על שינוי במשקל העכברים בעקבות הטיפולים השונים. ג .3.בחינת מידת התרבות תאי הגידול בעקבות טיפול עם MXFואירינוטקאן ,הניתנים לבד או בשילוב, בחתכים היסטולוגיים שהוכנו מהגידולים ,ע"י צביעה אימונוהיסטוכימית כנגד החלבון .Ki-67 ג .4.בדיקת השפעת MXFהניתן לבד או בשילוב עם אירינוטקאן על זרימת הדם לגידול באמצעות .Power Doppler Ultrasound ג .5.השפעת ,MXFהניתן לבד או בשילוב עם אירינוטקאן ,על פלישת כלי דם לגידול ע"י צביעה 24 אימוניהיסטוכימית של חתכי גידול כנגד הסמן .CD31 ג .6.השפעת MXFואירינוטקאן ,הניתנים לבד או בשילוב ,על הימצאות הפקטור הפרו-אנגיוגני IL-8 בהומוגנט שהוכן מהגידולים. 25 חומרים ושיטות המחקר.3 חומרים3.1 ABC-reagent- Vector Laboratories. Burlingame, CA. USA Ac-DEVD-AMC- ( caspase 3 substrate, Fluorogenic ) Biomol Research Lab, Inc. PA. USA Acrylamide- Bis Acrylamide 30%- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Agarose- Amersham Life Science. England Annexin-V- fluos- Roche, Penzberg. Germany Antipain- Roche, Mannheim, Germany Amonium Persulfate ( APS )- Bio-Rad Laboratories CA. USA Bovine Serum Albumin ( BSA ) fraction V- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Aprotinin- Roche, Mannheim, Germany ATP- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Boric Acid- Merck, Darmstadt. Germany Bromophenol blue- Merck, Darmstadt. Germany 3-[(3-Cholamidopropyl)Dimethyl-Amonio] (CHAPS)- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Ciprofloxacin- Bayer AG, Wuppertal, Germany CPT- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA DAPI- Vector Laboratories. Burlingame, CA. USA DMEM F/12- Biological industries. Kibutz Beit Haemek, Israel DMSO- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA DTT- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA 26 EDTA- Merck, Darmstadt. Germany ECL - Amersham Life Science. England Ethanol- Merck, Darmstadt. Germany Ethidium bromide- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Fetal Calf Serum ( FCS )- Biological industries. Kibutz Beit Haemek, Israel Film-Kodak, NY.USA Glycerol- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA HBSS- Biological industries. Kibutz Beit Haemek, Israel Hematoxilyn- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA HEPES- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA H2O2- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Irinotecan (CamptosarR)- Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI. USA KCl- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA kDNA- TopoGene Inc. Port Orange. FL. USA IL-8( human ) ELISA kit- R&D Systems, Inc. MN. USA Leupeptin- Roche, Mannheim, Germany L-glutamine- Biological industries. Kibutz Beit Haemek, Israel Luminol- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA β-mercaptoethanol- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Methanol- Frutarom Ltd. Haifa. Israel MgCl2- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Molecular Weight Standarts- Bio-Rad Laboratories CA. USA Moxifloxacin- Bayer AG, Wuppertal, Germany Mounting- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA MTT- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA 27 Nitrocellulose membrane- Schleicher and Schueli, Dassel. Germany Non fat milk- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Trypsin-EDTA- Biological industries. Kibutz Beit Haemek, Israel Parafin- Merck, Darmstadt. Germany Paraformaldehyde (PFA)- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Pepstatin- Roche, Mannheim, Germany p-Cumaric acid- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA P/S- Penicillin 10,000u/ml' Streptomycin 10mg/ml – Biological industries. Kibutz Beit Haemek, Israel Phenylmethanesulfonyl fluoride ( PMSF )- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Ponceau S (x10 ) - Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Protease Inhibitor Cocktail- Boehringer Mannheim, GmbH, Germany Propidium Iodide- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA PUC-19- MBI Fermentas. Hanover. MD. USA Saponin- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Sodium Chloride ( NaCl )- Merck, Darmstadt. Germany SDS - Boehringer Mannheim, GmbH, Germany Substrate Solution- R&D Systems, Inc. MN. USA Sucrose- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA TEMED- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Topo I- - MBI Fermentas. Hanover. MD. USA Topo II- TopoGene Inc. Port Orange. FL. USA Tris –HCl- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Triton X-100- Merck, Darmstadt. Germany 28 Trypan blue- Fluka, Switzerland. 0.5% Trypan blue in 162mM NH4Cl Tween-20- Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA VEGF ( human ) ELISA kit- R&D Systems, Inc. MN. USA VP-16 ( Etoposide ) - Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis. MO. USA Z-DEVD-FMK- ( caspase 3 inhibitor, Fluorogenic )- R&D Systems, Inc. MN. USA Xylene- Merck, Darmstadt. Germany בופרים3.1.1 Assay Buffer for caspase 3 activity- HEPES 0.5M (pH=7.4 ), NaCl 1M, CHAPS 1%, DTT 1M, EDTA 10mM, Glycerol. Blocking Buffer ( for ELISA )-1% BSA, 5% Sucrose, 0.05% NaN3 in PBS-. Blocking Buffer ( for W.B )- 3% BSA or non-fat milk in TBST. Buffer A (topoisomerase assay)- 10mM Tris –HCl, pH 7.4, 10mM NaCl, 1mM EDTA and a mixture of protease inhibitors: 2µg/ml aprotinin, 2µg/ml leupeptin, 2µg/ml pepstatin A, 2µg/ml antipain and 100µg/ml PMSF-phenylmethylsulfonyl fluoride. Buffer B (topoisomerase assay)- 10mM Tris-HCl, pH 7.4, 10mM NaCl, 1.5mM MgCl2 and a mixture of protease inhibitors: 2µg/ml aprotinin, 2µg/ml leupeptin, 2µg/ml pepstatin A, 2µg/ml antipain and 100µg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride Denaturing buffer (band depletion)- 62.5mM Tris-HCL pH 6.8, 1mM EDTA, 2% SDS Greenburger lysis buffer- 300 mmol/L NaCl, 15 mmol/L Tris, 2 mmol/L MgCl2, 2 mmol/L Triton X-100 Lysis Buffer ( caspase-3 fluorimeter )-HEPES pH=7.4 50mM, 0.1% CHAPS, DTT 5mM, EDTA 0.1mM Phosphate Buffered Saline- ( PBS- )-NaCl 139.9mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 29 8.1mM, KH2 1.5mM, pH=7.4 SAP buffer (survivin) - 0.1% (w/v) saponin, 0.05% (w/v) NaN3 in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Running Buffer- Tris-base 25mM, Glycine 192mM, SDS 0.1%. 4XSDS loading buffer for protein electrophoresis- pH=6.8, Tris-HCl 200mM, SDS 8%, Bromophenol blue 0.4%, Glycerol 40%, β-Mercaptoethanol 20%. Stopping buffer- 50mM EDTA pH 8, 1% SDS, 15% glycerol, 0.5% bromophenol blue. TBE- 89mM Tris-HCl ,89mM boric acid, 62mM EDTA. TBST- Tris-HCl 10mM ( pH=7.4 ) , NaCl 150mM, 0.05% Tween-20 Transfer Buffer- Tris-base 25mM, Glycine 192mM, Methanol 20% ( v/v ) Washing Buffer ( for ELISA ) – 0.05% Tween-20 in PBS נוגדנים3.1.2 anti Actin- Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz. CA. USA Peroxidase-conjugated goat anti rabbit IgG- Jackson Irnmuno. Research. West Grove. PA. USA Horseradish peroxidase-linked anti-Goat IgG- Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA, USA. anti Topo II-α- Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA, USA α Ki-67- Lab Vision, Fremont, CA, USA α CD31- Abcam, Cambridge, MA, USA α Survivin- R&D Systems, Inc. MN. USA 31 ציוד מעבדתי3.1.3 דנסיטומטר Densitometer- Bio Imaging System 202D, Rhenium. Israel TINA software- version 2.07d, GmbH, Germany מכשיר להרצת ג'לים Hoefer mighty small SE250 - Amersham Life Science. England מכשיר טרנספר Hoefer Transphor electrophoresis unit TE22- Amersham Life Science. England מכשיר פיתוח פילם M35 X-OMAT processor- Kodak, NY. USA מכשיר לייבוש ג'לים Gel dryer Model 583- Bio-Rad Laboratories CA. USA סוניקטור Sonicator ultrasonic Processor Misionix MIXL2020- MISONIX INCORPORATED, USA מכשיר לאלקטרופורזה Thermo Scientific Owl B1A EasyCast Mini Gel- Ornat Biochemicals & Laboratory Equipment Ltd, Israel פלואורימטר Spectraflour Plus F129005- Trading AG, Switzerland צנטריפוגה Centrifuge Joune CR422- Cedex, France 31 ציטוספין Cytospin Centrifuge- Shandon, USA ELISA ELISA reader- Spectra MAX 190, using SofiMAX pro. Version 2.6, Molecular devices corp. USA FACS FACScan- Becton Dickenson 32 3.2שיטות המחקר 3.2.1מבחן טופואיזומראז I יחידה 1של טופואיזומראז Iמנוקה ממקור calf thymusהוספה לתוך תערובת ריאקציה המכילה בנפח סופי של 10mM ,20mM KCl ,1mM dithiothreitol (DTT) ,20mM Tris-HCl pH 8 :20µl 30µg/ml bovine serum albumin (BSA) ,1mM EDTA ,MgCl2 ו.250ng pUC19 supercoiled DNA- ריכוזים שונים של (20-40µg/ml) MXF ,(0.1-1µM) CPTו (10-40µg/ml) CIP-הוספו לריאקציה ,בנפרד או בשילובים שונים .לאחר הדגרה של 10דקות ב ,370C-הריאקציה נעצרה ע"י הוספת ) 5µl stopping bufferריכוז סופי1% SDS, 15% glycerol, 0.5% bromophenol blue : ו .( 50mM EDTA pH 8-תוצרי הריאקציה הופרדו ע"י אלקטרופורזה בג'ל המכיל 1%אגרוז עם בופר הרצה TBEהמכיל 89mM boric acid ,89mM Tris-HClו .62mM EDTA-בתום ההרצה, הג'ל הושרה ב TBE-בנוכחות Ethidium bromideבריכוז סופי של 1µg/mlלמשך 20דקות ולאחר מכן הג'ל צולם בעזרת אור .(Bio Imaging System 202D ) UV 3.2.2מבחן טופואיזומראז II יחידה 1של טופואיזומראז IIממקור הומאני הוספה לתוך תערובת ריאקציה המכילה בנפח סופי של 0.5mM ,0.5mM DTT ,10mM MgCl2 ,120mM KCl ,50mM Tris-HCl pH 8 :20µl 1mM ATP ,25µg/ml BSA ,EDTAו.250ng pUC19 supercoiled DNA- ריכוזים שונים של (5-10µg/ml) VP-16ו (20-40µg/ml) MXF -הוספו לריאקציה ,בנפרד או בשילוב .לאחר הדגרה של 10דקות ב ,370C-הריאקציה נעצרה ע"י הוספת 5µl stopping buffer תוצרי הריאקציה הופרדו ע"י אלקטרופורזה בג'ל והג'ל צולם כפי שהוזכר קודם. 33 3.2.3בדיקת אופן העיכוב של האנזימים טופואיזומראז Iו II-ע"י MXFוCIP- העיכוב המוגבר של פעילות האנזימים בנוכחות שילוב של התרופות האנטי-סרטניות עם CIP/MXF אפשרי בשתי רמות :רמת ה DNA-או רמת האנזימים .על כן ,אופן העיכוב נבדק ע"י מבחן טופואיזומראז II/Iכפי שתואר ,עם כמה שינויים :לתערובות הריאקציה השונות הוספו בניסוי אחד כמויות שונות של pUC19 supercoiled DNAבנוכחות יחידת אנזים קבועה ,על מנת לראות האם הגברת העיכוב בפעילות האנזימים היא ברמת ה .DNA-בניסוי השני הוספו כמויות עולות של יחידות אנזים בנוכחות קבועה של הפלסמיד על מנת לראות האם העיכוב הוא ברמת האנזימים. 3.2.4הכנת מיצוי גרעיני תאי HT-29נשטפו פעמיים עם PBS-קר ולאחר קילופם מהצלוחיות באמצעות cell scraperהתאים נאספו למבחנות וסורכזו בקור למשך 5דקות ב .1200rpm-משקע התאים הורחף עם בופר היפוטוני A ) 10mM Tris –HCl, pH 7.4, 10mM NaCl, 1mM EDTA and a mixture of protease inhibitors: 2µg/ml aprotinin, 2µg/ml leupeptin, 2µg/ml pepstatin A, 2µg/ml antipain (and 100µg/ml PMSF-phenylmethylsulfonyl fluorideוהודגר בקרח למשך 15דקות .הליזט הוכן ע"י העברת תרחיף התאים דרך מחט 21Gכ 15-פעמים וסרכוז בקור למשך 10דקות ב- .13,000rpmהנוזל העליון )המכיל את הפרקציה הציטוזולית( נשפה והמשקע המכיל גרעינים שלמים הורחף עם בופר 10mM Tris-HCl, pH 7.4, 10mM NaCl, 1.5mM MgCl2 and a mixture [ B of protease inhibitors: 2µg/ml aprotinin, 2µg/ml leupeptin, 2µg/ml pepstatin A, ) ]2µg/ml antipain and 100µg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSFלתרחיף הוסף ) 1mM NaClבריכוז סופי( להדגרה בקרח למשך 30דקות .לאחר סרכוז בקור למשך 20דקות ב- ,13,000rpmנאסף הנוזל העליון כמיצוי הגרעיני. קביעת ריכוז החלבון במיצוי הגרעיני נעשה באמצעות שיטת :Bradffordלאחר מיהול הדוגמאות באמצעות , DDWמוסיפים לכל 20lדוגמא 180lשל ריאגנט Bradffordבמיהול של 1:5 34 מולקולת BSAמשמשת כסטנדרט .את ערכי ריכוזי החלבון בדוגמאות השונות מודדים באמצעות מכשיר ה ELISA-באורך גל של .600nm 3.2.5בדיקת השפעת CIP/MXFלבד ובשילוב עם CPTעל טופואיזומראז Iתאי. השפעת CIP ,MXFו CPT-על פעילות טופואיזומראז Iתאי נבדקה באמצעות מבחן טופואיזומראז I כפי שתואר קודם .תחילה נבדקה השפעת התרופות על מיצוי גרעיני שהוכן מתאי .HT-29לתוך תערובת הריאקציה הוספו 6-10ngחלבון מהמיצוי הגרעיני )המכיל טופואיזומראז Iתוך תאי( .ריכוזים שונים של (10-20µg/ml) CIP , (0.25-1µM) CPTו (40µg/ml) MXF-הוספו לריאקציה ,בנפרד או בשילוב. בבדיקת השפעת התרופות על האנזים טופואיזומראז Iבתוך התא ,תאי HT-29הודגרו עם 20-) CIP (40µg/mlאו (20µg/ml) MXFלמשך 3שעות ,עם (2.5µM) CPTלמשך שעה או שילוב של CIP/MXFלמשך שעתיים ובשעה האחרונה הוסף .CPTלאחר הפקת המיצוי הגרעיני ,הוכנה תערובת ריאקציה המכילה 6ngמהמיצוי הגרעיני .לאחר הדגרה של 10דקות ב ,370C-הריאקציה נעצרה ע"י הוספת 5µl stopping bufferתוצרי הריאקציה הופרדו ע"י אלקטרופורזה בג'ל והג'ל צולם כפי שהוזכר קודם. 3.2.6בדיקת השפעת MXFלבד ובשילוב עם VP-16על טופואיזומראז IIתאי. השפעת MXFו VP-16-על פעילות טופואיזומראז IIתוך תאי נבדקה ע"י מבחן דקטנציה של קינטופלסט ) .(kDNAזוהי ריאקציה ספציפית לאנזים טופואיזומראז ,IIלכן ניתן לבצע אותה עם מיצוי גרעיני המכיל גם טופואיזומראז . Iה kDNA-הנה רשת של פלסמידים ,שמקורה מTrypanosome - .Crithidia fasiculataבשל המבנה של הקינטופלסט ,בהרצתו על ג'ל אגרוז אין ביכולתו לחדור אל תוך הג'ל .במידה ויש פירוק )דקטנציה( של ה kDNA-ע"י טופואיזומראז ,IIנוצרים מונומרים קטנים של DNAהמסוגלים לחדור אל תוך הג'ל. תחילה נבדקה השפעתם של (40µg/ml) MXFו (2.5-10µg/ml) VP-16-לבד או בשילוב על המיצוי הגרעיני .בבדיקת השפעת (40µg/ml) MXFו (35-50µg/ml) VP-16-על האנזים התוך תאי ,תאי 35 HT-29הודגרו עם MXFלמשך 3שעות או עם VP-16למשך שעה או שילוב של MXFלמשך שעתיים ובשעה האחרונה הוסף .VP-16 1.2µgחלבון מהמיצוי הגרעיני הוספו אל תוך תערובת ריאקציה המכילה בנפח סופי של :25µl 50mM Tris-HCl, pH 8, 120mM KCl, 10mM MgCl2, 0.5mM DTT, 0.5mM EDTA, .25µg/ml BSA, 1mM ATP and 80ng kDNA לאחר הדגרה של 10דקות ב ,370C-הריאקציה נעצרה ע"י הוספת 5µl stopping bufferתוצרי הריאקציה הופרדו ע"י אלקטרופורזה בג'ל והג'ל צולם כפי שהוזכר קודם. Band depletion assay for topoisomerases 3.2.7 מבחן זה מאפשר לבדוק את כמות האנזים החופשית הקיימת בתוך התא .תאי HT-29נזרעו בריכוז של .1*106cells/mlהתאים נחשפו ל (40µg/ml) MXF-ו (8-24µg/ml) VP-16-למשך 3שעות או שעה ,בהתאמה או שילוב של שתי התרופות .הוכן ליזט מהתאים עם בופר דנטורציה )ריכוז סופי: (62.5mM Tris-HCL pH 6.8, 1mM EDTA, 2% SDSוסוניקציה ) 40התפרצויות של 2שניות כל אחת( .לליזט הוסף 200mM Tris-HCl (pH 6.8), 8% SDS, [ 4XSDS loading buffer .]0.4% Bromophenol blue, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol 50µlמהליזט הוטענו על ג'ל פוליאקרילאמיד 10%המכיל SDS 0.1% ,APS 0.1%, Temed 0.1% ו.3M Tris (pH=8.8) - הדוגמאות הורצו באלקטרופורזה והועברו לממברנת ניטרוצלולוז .בנוסף לדוגמאות הוטענה על הג'ל תערובת חלבונים בעלי משקלים מולקולריים ידועים המשמשים כסמן למשקלי חלבונים בדוגמאות. בתום העברת החלבונים ,הממברנה נצבעה בתמיסת Ponceau Sונשטפה ,זאת על מנת לוודא שאכן העברת החלבונים הייתה מוצלחת ושדוגמאות החלבון הוטענו בכמויות שוות על הג'ל. לאחר חשיפת הממברנה למשך שעה לתמיסת חסימה ) 6% non fat milkב ,(PBS-הממברנה הוגבה עם נוגדן ראשוני ב 40C-למשך הלילה בטלטלה עם נוגדן כנגד ) topo II-αמהול .(1:2500כביקורת הממברנה הוגבה כנגד נוגדן לאקטין למשך שעה .בתום חשיפה זו הממברנה נשטפה 3פעמים למשך 10 דקות עם 0.1% PBSTוהוגבה עם נוגדן שניוני מתאים ,הקשור לHorseradish Peroxidase (HRP)- 36 למשך שעה נוספת .בתום ההדגרה הממברנה נשטפה שוב 3פעמים למשך 10דקות עם ,0.1% PBST הודגרה למשך 2דקות עם תמיסת ECLונחשפה לפילם שפותח במכונת פיתוח. כמות האנזים החופשית בתא נקבעה ע"י ביצוע דנציטומטריה לבנד המתאים באמצעות תוכנת .TINA 3.2.8גידול התאים בתרבית המחקר בוצע על שורת תאי .HT-29תאים אלו מקורם מסרטן המעי הגס )אדנוקרצינומה( אשר הופקו מאישה בת .44התאים התקבלו מ.American Type Culture Collection, Manassas, Va- תאי HT-29הודגרו במדיום ) DMEM F:12 (HAMהמועשר ב,(FCS) 10% Fetal Calf Serum- 1% L-Glutamineו . (P/S ) 0.1% Penicillin/Streptomycin-מדי יומיים הוחלף מדיום הגידול. תאי HT-29הם תאים נצמדים וכאשר כיסו כ 85%-מהשטח ,התאים הורדו בעזרת Trypsin-EDTA מדיום הגידול הוחלף והתאים פוצלו ונזרעו .ההדגרה נעשתה באינקובאטור ב ,370C-באוויר לח המכיל .5% CO2 ריכוז וחיות התאים נקבעו ע"י ספירת התאים בתאי ספירה Neubauerבמיקרוסקופ אור בהגדלה .X200 חיות התאים נמדדה לאחר צביעה ב) .trypan blue-ממברנת התאים מונעת חדירה של הצבע בתאים החיים ,בעוד שבתאים המתים הצבע חודר את הממברנה וצובע את התא בכחול(. 3.2.9קביעת ריכוז הפרשת פקטורים אנגיוגניים IL-8 :וVEGF- ריכוז ה IL-8-ו VEGF-שהופרשו מהתאים למדיום הגידול נמדד ע"י ערכת ELISAעפ"י הפרוטוקול הבא :יום לפני ביצוע הבדיקה נעשתה זריעה של capture antibodyבפלטת Nunc immuno plate .96 wellsביום הבדיקה ,הפלטה נשטפה 3פעמים עם Washing bufferונחסמה ע"י Blocking ( 1% BSA, 0.05% NaN3 in PBS-) bufferלמשך שעה ורבע .הפלטה נשטפה 3פעמים ע"י ,Washing bufferהדוגמאות לבדיקה נטענו בנפח של 100lבנוסף נטענו דוגמאות סטנדרט לקביעת כמות הפקטור הנבדק .הפלטה הודגרה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר ,נשטפה 3פעמים ע"י .Washing bufferלאחר מכן הוסף Detection antibodyוהפלטה הודגרה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר .הפלטה נשטפה 3פעמים עם Washing bufferוהוסף Streptavidin-HRPלמשך 37 20דקות בחושך .הפלטה נשטפה 3פעמים והוסף סובסטרט ) 1:1 mixture of Color reagent A (H2O2 and Color reagent B Tetramethylbenzidineשהגיב עם ה .Streptavidin-HRP-נעשתה הדגרה נוספת למשך 20דקות בחושך ,במהלך הדגרה זו התפתח צבע בהתאם לכמות הפקטור שנוכח בדוגמא .בתום ההדגרה הוסף (2N H2SO4) Stop Solutionעוצמת הצבע נקראה בשני אורכי גל: .L1 450nm, L2 570nm לכל ערכה רגישות: 10pg/ml IL-8 31.2pg/ml > VEGF תאי HT-29נזרעו בריכוז של 1*106cells/mlבצלחות .35mm culture dishהתאים נחשפו לריכוזים שונים של (10-20µg/ml) MXF (5-10µg/ml) VP-16 ,(5-10µM) CPTו(20-40µg/ml) CIP- למשך 48שעות .בתום ההדגרה נאסף הנוזל העליון מהדוגמאות ,סורכז ,חולק למנות ונשמר ב -200C-עד לבדיקה ).(25 3.2.10אנליזת MTT תאים במצב חלוקה הנם תאים פעילים יותר מבחינה מטבולית מאשר תאים שאינם מתרבים .במבדק זה משתמשים במלח (MTT) 3-[4,5-dimethylthiazole-2-y1]-2,5-diphenyltetrazolium bromide לקביעת חיות התאים והציטוטוקסיות המתווכת ע"י תרופות שונות ,וגם לקביעה של שפעול והתרבות התאים. עקרון המבדק הנו חיזור של מולקולת MTTע"י תאים חיים למלח formazanבעל צבע שאינו מסיס במים .ע"י הוספת ,2N HCl 0.04Mה formazan-שנוצר מומס וכך ניתן לקבוע את כמותו בELISA - readerבאורך גל של . 560 nm תאי HT-29הובאו לריכוז ,5*104cells/mlונזרעו 100µl/wellבפלטת 96בארות .הפלטה הודגרה למשך 24שעות לצורך היצמדות התאים .ביום הניסוי הוחלף המדיום עם מדיום המכיל תרופות בריכוזים שונים ,והפלטות הודגרו לפרקי זמן שונים 48 :ו 72-שעות 3 .שעות לפני תום ההדגרה הוסף לדוגמאות 38 .10µl MTT 5mg/mlבתום שלוש השעות ,הריאקציה נעצרה ע"י הוספת 100µl 2N HCl 0.04M לבאריות ,עוצמת הצבע נבדקה ב ELISA reader-באורך גל של .560nm http://www.genycell.com/images/productos/imagenes/cqmt-500__90.jpg איור מס' :7תהליך פירוק מולקולת MTT 3.2.11בדיקת פעילות קספאז 3בתאים שנחשפו ל MXF-וVP-16- פעילות קספאז 3נבדקה באמצעות השיטה הפלורימטרית .בשיטה זו ניתן למדוד את עוצמת החומר הפלואורסנטי העומדת ביחס ישר לפעילות הקספאז. סובסטרט סינטטי ) ( DEVD-AMCהקשור לחומר הפלואורסנטי מתפרק /עובר ביקוע בעת פעילות הקספאז הספציפי והחומר פלואורסנטי משתחרר .הסובסטרט הנו ספציפי לקספאז 3והוא מחקה את אתר הביקוע של .PARP תאי HT-29נזרעו בריכוז 1*106cells/1ml/sampleבמדיום מלא המכיל 10% FBSבצלחות פטרי. הדוגמאות נחשפו לריכוזים שונים של (5-10µg/ml) VP-16ו (10-20µg/ml) MXF-לבד או בשילוב והצלחות הודגרו באינקובטור במשך 24שעות .בחלק מהניסויים התאים הודגרו למשך שעה עם מעכב לקספאז Z-DEVD-FMK (50 M) 3לפני חשיפתם לטיפול .התאים נאספו ונשטפו פעמיים בPBS - קר .משקע התאים הורחף בבופר ליזיס ) Hepes 50 mM pH 7.4, CHAPS 0.1%, DTT 5 mM, (EDTA 0.1 mMוהודגר בקרח במשך 15דקות .ליזאט התאים עבר 3מחזורי הקפאה/הפשרה בחנקן נוזלי וב .37ºC -ליזאט התאים סורכז למשך 15דקות ב 14000 rpm -בקור והנוזל העליון נשמר 39 ב .-200C -נקבעה כמות החלבון בדוגמה בשיטת ברדפורד .מכל דוגמה נלקחו 25 µgחלבון אשר הודגרו עם 30µMסובסטרט סינטטי ) ac-DEVD-AMCלזיהוי פעילות קספאז (3במשך שעה באינקובטור .הסובסטרט הסינטטי מהול בבופר הדגרה המורכב מ: HEPES 0.5M pH 7.4, NaCl 1M, 1% CHAPS, DTT 1M, EDTA 10mM, 10% Glycerol שיעור ה AMC-הפלואורסנטי נבדק באורכי גל .emission 460nm, excitation 360nm 3.2.12השפעת CIP /MXFו CPT-על שיעור האפופטוזיס בתאי HT-29 שעור האפופטוזיס בתאי HT-29נמדד בשיטת ה Flow cytometry -תוך כדי ביצוע צביעת PIו- Annexin-V .Annexin-Vנקשר לתאים שמבטאים פוספוטדיל-סרין טעון שלילית ,בממברנה החיצונית של התא ,לעומת זאת PIצובע DNAתוך תאי של תאים עם ממברנה פגומה .השיטה מאפשרת להבחין בין תאים חיים )שאינם נצבעים( לבין תאים אפופטוטיים )הנצבעים ע"י Annexin-Vבלבד( ותאים בשלב אפופטוזיס מאוחר ו/או נקרוטיים שנצבעים גם ע"י Annexin-Vוגם ע"י . PI תאי HT-29נזרעו בריכוז 1*106cells/mlבמדיום מלא המכיל 10% FBSבצלחות פטרי .הדוגמאות נחשפו ל (CIP )40µg/ml ,(5nM) CPT-ו (20µg/ml) MXF-לבד או בשילוב .הצלחות הודגרו באינקובטור במשך 24שעות .התאים נאספו ונשטפו פעמיים ב .PBS -משקע התאים הורחף בבופר צביעה ) 140mM NaCl ,10mM HEPES pH 7.4ו PI .(2.5mM CaCl2-ו Annexin V-הוספו לתאים ,לאחר הדגרה של 15דקות בטמפרטורת החדר בחושך ,התאים יעברו אנליזה ב(89) FACS- 3.2.13בדיקת השפעת MXFו VP-16-על שיעור האפופטוזיס באמצעות צביעת גרעינים עם DAPI-sulforhodamine השפעת MXFו VP-16-על שיעור האפופטוזיס בתאי HT-29נבדקה באמצעות צביעת גרעיני התאים עם הצבע 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI)-sulforhodamineהנקשר ל.DNA- תאי HT-29הודגרו למשך 48שעות עם (5-10µg/ml) VP-16 ,(10-20µg/ml) MXFלבד או בשילוב .בתום ההדגרה התאים נאספו וכ 30,000-הוצמדו על זכוכיות נושא ע"י .cytospinלאחר קיבוע התאים עם ) 4% paraformaldehide (PFAלמשך 10דקות ,התאים נשטפו עם PBSונצבעו עם 10µl 41 מהצבע ) .VECTASHIELD mounting medium with DAPI (1.5µg/mlמורפולוגית התאים נבחנה באמצעות מיקרוסקופ פלורוסנטי בפילטר .excitation 360nm, emission 460nm: UV הקריטריונים לקביעת אפופטוזיס היו) :א( התכווצות הציטופלסמה והגרעין; )ב( דחיסה של הכרומטין; ו- )ג( יצירת גופים אפופטוטיים תוך כדי שמירה על שלמות ממברנת התא. 3.2.14איפיון מעגל התא לאחר חשיפת התאים ל MXF-וVP-16- השיטה מתבססת על כימות ה DNA-התאי .כמות ה DNA-במחזור התא מוכפלת מאזור ה G0/G1-לאזור ה .G2/M-את הכימות בודקים באמצעות מכשיר FACScanלאחר שגרעיני התאים נצבעים ע"י החומר ) .Propidium Iodide (PIזהו חומר בעל משקל מולקולרי נמוך המסוגל לחדור אל תאים מתים או תאים שעברו טיפול עם דטרגנט לחירור הממברנה. תאי HT-29נזרעו בריכוז 0.5*106cells/mlבמדיום המכיל 10%FBSב.35mm culture dishes- לתאים הוסף (0.1-5µg/ml) VP-16ו (20µg/ml) MXF -ושילובים ביניהם .התאים הודגרו למשך 48 שעות ובתום ההדגרה ,התאים נאספו ונשטפו פעמיים עם PBS-ולאחר קיבוע עם 70%אתנול ,התאים נצבעו עם .PIמעגל התא נקבע עפ"י הצביעה הפלואורסצנטית שנמדדה בFluorescence activated - ) .(89) cell sorter (FACSניתוח התוצאות התבצע ע"י שימוש בתוכנה .WinMdi http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laurates/2001/press.htm איור מס' :8שלבים במחזור התא 41 3.2.15השפעת MXFו VP-16-על כמות החלבון survivinהתוך תאי כמות החלבון survivinהתוך תאית נקבעה ע"י נוגדן מונוקלונלי כנגד human-survivinעפ"י הוראות היצרן .תאי HT-29נזרעו בריכוז של 1*106cells/mlבמדיום מלא .לאחר היצמדות התאים ,הוחלף מדיום הגידול במדיום ללא סרום לצורך הרעבת התאים ) (90למשך 24שעות .לאחר מכן התאים הודגרו למשך 24שעות עם (20µg/ml) MXFלפני הוספת (0.1-9µg/ml) VP-16ל 24-שעות נוספות. בתום ההדגרה ,התאים נאספו ועברו קיבוע עם 4% PFAקר למשך 10דקות .התאים נשטפו פעמיים עם PBSוהורחפו עם בופר 0.1% (w/v) saponin, 0.05% (w/v) NaN3 in Hank's Balanced :SAP ).Salt Solution (HBSS התאים סורכזו 7דקות 200g ,בטמפרטורת החדר ,הנוזל העליון נשפה כך שנשארו בכל מבחנה קרוב ל- 200µlבופר .SAPמשקע התאים הורחף בעדינות ולכל מבחנה הוספו 10µlמהנוגדן .התאים הודגרו למשך 45דקות בחושך .בתום ההדגרה התאים נשטפו פעמיים עם בופר SAPוהורחפו ב PBS-לפני אנליזה במכשיר ה .FACS-ניתוח התוצאות נעשה בעזרת תוכנת ה. WinMDI- 3.2.16יצירת גידולים ממקור הומנאי של סרטן המעי הגס בעכברים והערכת גודל הגידול עכברים מסוג (NOD.CB17-Prkdcsid/J mice) NOD-SCIDממין נקבה בגילאי 5-6שבועות הוחזקו וטופלו בסביבה סטרילית. לכל עכברה הושתלו 5*106תאי HT-29מתחת לעור בצד הגוף .סה"כ שני סטים של 42עכברות. לאחר השתלת התאים ,העכברות חולקו ל 7-קבוצות טיפול שונות: קבוצה :1קבוצת ביקורת ,העכברות קיבלו 3זריקות ליום של salineאל תוך חלל הבטן ). (i.p. קבוצה :2טיפול עם :MXFהעכברות קיבלו 3זריקות ליום i.p.של 15mg/kg MXFכל אחת ).(91 הזריקות החלו יום לאחר השתלת תאי .HT-29 קבוצות 4 ,3ו :5-טיפול עם אירינוטקאן ) :(CPT-11העכברות קיבלו ביום 14 ,7ו 21-לאחר השתלת התאים זריקה i.p.של 30mg/kg ,20mg/kg CPT-11או - 50mg/kgבהתאמה ).(92 קבוצות 6ו :7-טיפול משולב של MXFו :CPT-11-העכברות קיבלו זריקות יומיות של MXFכמו קבוצה 2ובימים 14 ,7ו 21-זריקה של 20mg/kgאו 35mg/kgשל CPT-11בהתאמה ,כמו בקבוצות 42 3ו.4- משקל החיות נמדד ונעשה מעקב אחר גודל הגידול .המעקב נעשה ע"י מדידת הגידולים בשני מימדים ניצבים לגידול אחת לשלושה ימים ,החל מיום .1נפח הגידול חושב עפ"י הנוסחא הבאה: , V= (a2 x b)/2כאשר aמייצג את קוטר הרוחב ו b-מייצג את קוטר האורך. 3.2.17ביצוע הדמייה באמצעות Power Doppler Ultrasound imagingלגידולים ביצוע ה Power Doppler Ultrasound imaging-נעשה עפ"י שיטה שפורסמה ).(93-94 עכברות הנושאות גידולים ) 6עכברות לקבוצה( הורדמו ע"י זריקת i.p.עם 2.25mg/kg ketamineו- ,0.15mg/kg xylazineעל מנת למנוע ולהפחית למינימום תזוזות העכברות היכולות לגרום ל- .echogenicity השיער סביב הגידול הוסר ע"י משחת גילוח והעכברות המורדמות הונחו על משטח חמים לשמירה על חום גופן ולמניעת שינויים בזרימת הדם המושפעים משינויי טמפרטורה. על הגידולים הונח ג'ל ) (imaging gelלביצוע אולטרה סאונד .מדידות האולטרה סאונד בוצעו בתנאים הבאים. 15L8s, linear transducer (Acuson Sequoia 512 Siemens): הגדרות ההדמיה עברו סטנדרטיזציה ולא שונו במהלך כל הניסוי .בנוסף לא נצפו ארטיפקטים קרוב לשטח ההדמיה. האולטרה סאונד בוצע בבית החולים שיבא ,בתל השומר ,ע"י סונוגרפרים מנוסים אשר לא ידעו איזה טיפול קיבלו העכברות במהלך הניסוי. כימות התוצאות נעשה ע"י שימוש בתוכנת .MICAתמונות האולטרה סאונד הומרו לפורמט JPEG לצרך ניתוח התוצאות .פיקסלים צבעוניים המייצגים את זרימת הדם ,כמו גם פיקסלים אפורים המייצגים את שטח הגידול הופרדו מהרקע .זרימת הדם בגידול חושבה כיחס בין פיקסלים אפורים לפיקסלים הצבעוניים. 43 3.2.18יצירת הומוגנט מהגידולים הומוגנטים מהגידולים התקבלו ע"י שימוש בהומוגנייזר .אל רקמות הגידול הוסף בופר גרינבורגר ) 300mmol/L NaCl, 15mmol/L Tris, 2mmol/L MgCl2, 2mmol/L Triton X-100, .(95) (pepstatin A, leupeptin and aprotinin, pH 7.4לאחר ביצוע ההומוגנציה ,הדוגמאות הודגרו בקרח למשך 30דקות .בתום ההדגרה ,הדוגמאות סורכזו פעמיים בקור למשך 10דקות ב- .14,000rpmההומוגנט חולק למנות והוקפא ב -200C-עד לשימוש .כמות ה IL-8-בהומוגנטים נבדקה כפי שתואר קודם. 3.2.19שיקוע רקמת הגידול לפרפין הגידולים הוסרו והוכנסו מיד לתמיסת 4% PFAקר .הגידולים נשמרו בקירור למשך 24שעות .בתום זמן זה ,הגידולים נשטפו פעמיים עם PBSועברו תהליך של דהידרציה )הוצאת מים מהרקמה(: הגידולים הוכנסו לתמיסת אתנול בריכוז של ) 50%מהול ב (0.9% saline-למשך 30דקות והועברו לתמיסת אתנול ) 70%מהול ב (0.9% saline-למשך הלילה במקרר. למחרת הגידולים הוכנסו לתמיסת אתנול ) 96%מהול ב (0.9% saline-למשך שעה וחצי ושוב לתמיסת אתנול ) 96%מהול ב (0.9% saline-לשעה וחצי נוספות. הגידולים הוכנסו לתמיסת אתנול אבסולוטי למשך שעה וחצי ובתום ההדגרה יש חזרה על שלב זה . הגידולים הודגרו עם קסילן למשך שעה וחצי )או עד שהרקמה התבהרה( במנדף כימי .בתום ההדגרה הגידולים הוכנסו לפרפין 1למשך לילה ב .600C-למחרת הגידולים הועברו לפרפין 2למשך 4hובוצע בלוקינג. הבלוקים עברו חיתוך במיקרוטום בעובי של 5µmוהחתכים הודבקו על זכוכיות נושאת )סליידים(. 3.2.20הכנת הסליידים לצביעה אימונוהיסטוכימית לפני צביעת הסליידים בצביעה אינומוהיסטוכימית ,הסליידים עברו הכנה: תחילה ,הסליידים הוכנסו לתנור בטמפרטורה של 600Cלמשך חצי שעה ולאחר מכן עברו תהליך של דפרפניזציה ע"י שטיפתם עם קסילן פעמיים .הסליידים עברו תהליך של הידרציה )החזרת מים לרקמה( 44 ע"י העברתם בתמיסות אתנול מהול עם 0.9% salineבריכוזים יורדים ) (75% ,95% ,100%ושטיפה עם מים מזוקקים. חשיפת האנטיגן ) (antigen retrivalנעשתה בשתי שיטות: ) (1בצביעה כנגד Ki-67הסליידים הוכנסו ל 10mM Sodium citrate buffer pH 6-שחומם מראש לטמפרטורה של 1000Cלמשך דקה ,לאחר מכן הוסף בופר קר כך שהטמפרטורה ירדה ל 600C-והודגרו למשך 9דקות ולבסוף הועברו למיכל עם קרח להצטננות למשך 20דקות .בתום ההדגרה הסליידים נשטפו עם מים מזוקקים. ) (2בצביעה כנגד CD31הסליידים הודגרו עם Histo/Zime solutionמסחרי למשך 5דקות ונשטפו עם מים מזוקקים. ניטרול הפרוקסידאז האנדוגני :הסליידים הודגרו עם מי חמצן 3%למשך 10דקות .בתום ההדגרה הסליידים נשטפו עם מים מזוקקים. 3.2.21צביעה אימונוהיסטוכימית לKi-67- חתכי הגידול נחסמו למשך שעה עם ,5% BSA in cold PBSבתום שעה זו ,החתכים נחסמו לavidin - – biotinעפ"י הוראות היצרן. הסליידים הודגרו עם הנוגדן כנגד ) Ki-67מהול (1:300למשך הלילה ב .40C-בתום ההדגרה ,הסליידים נשטפו עם PBSוהודגרו למשך 30דקות עם הנוגדן השניוני )מהול .(1:300 הסליידים הודגרו עם ABC reagentלמשך 30דקות ולאחר מכן נצבעו עם DAB Chromagen substrateלמשך 5דקות בחושך .בוצעה צביעת רקע של .Hematoxylin לסיום הצביעה ,בוצעה דהידרציה ע"י העברת הסליידים בריכוזים עולים של אתנול ולבסוף ,הסליידים הוטבלו בקסילן וכוסו עם .mounting 45 3.2.22צביעה אימונוהיסטוכימית לCD-31- הצביעה כנגד CD-31בוצעה עם הקיט המסחרי Biocare ) rat on mouse HRP polymer kit (Medical, Pike Lane, Concord, CA, USAעפ"י הוראות היצרן עם כמה שינויים :כאמור שלב חשיפת האנטיגן בוצעה עם תמיסת ה , Histo/Zime solution-הנוגדן הראשוני של חברת .Abcam בקצרה ,הסליידים נחסמו עם Rodent block Mלמשך 20דקות ונשטפו עם .TBSלאחר מכן הודגרו עם הנוגדן כנגד ) CD-31מהול (1:100למשך שעתיים בטמפרטורת החדר .בתום ההדגרה הסליידים נשטפו והודגרו למשך 15דקות עם .Rat probe הסליידים הודגרו עם Rat polymer-HRPלמשך 20דקות ,ולאחר מכן נשטפו .סיום הצביעה בוצע באותו אופן בו בוצעה הצביעה כנגד .Ki-67 3.2.23ניתוח תוצאות הצביעות האימונוהיסטוכימיות הסליידים נבחנו תחת מיקרוסקופ אור ) .(Olympus BX52צולמו תמונות עם מצלמה דיגיטלית מסוג .Olympus DP50 הסליידים נסרקו בהגדלה קטנה ) (X10על מנת לזהות אזורים עם תאים במצב חלוקה או בעלי אזורים עם וסקולריות גבוהה. 32שדות אקראיים נבחרו לאנליזה בהגדלה גבוהה ) 4) (X20עכברים לקבוצה 4 ,שדות לעכבר ,שני ניסויים( .הסליידים צולמו ותאים בחלוקה או כלי דם נספרו ע"י שני אנשים שלא היו מודעים לטיפולים השונים. 3.3סטטיסטיקה תוצאות הניסויים נבדקו סטטיסטית ע"י מבחן.Student t-test : תוצאות נחשבו לבעלות מובהקות סטטיסטית כאשר .p-value<0.05 46 .4תוצאות 4.1בדיקת עיכוב פעילות האנזים טופואיזומראז IIמסחרי בנוכחות ריכוזים שונים של VP-16 עיכוב האנזים טופואיזומראז IIע"י ריכוזים שונים של התרופה הכימו-תרפויטית VP-16נבדק ע"י מבחן טופואיזומראז .IIמטרת בדיקה זו הייתה לקבוע את ריכוז VP-16לעבודה. תמונה מס' :1השפעת ריכוזים שונים של VP-16על פעילות 1 20 1 10 1 5 250 1 2.5 6 5 4 1 - 1 1 טופואיזומראז II )pUC19 (ng )Topo II (U )VP-16 (µg ml-1 - →R →S 7 3 2 1 Lane תמונה מס' :1לתוך תערובת ריאקציה המכילה יחידת אנזים 250ng ,של פלסמיד pUC19ו ATP-הוספו ריכוזים שונים של .(1-20µg/ml) VP-16לאחר הדגרה של 10דקות ב 370C-הריאקציה נעצרה והתוצרים הופרדו בג'ל של 1%אגרוז .בתום ההרצה הג'ל נצבע עם אתידיום ברומיד בריכוז סופי של , R= Relaxed DNA) .1µg/ml (U=units, S= Supercoiled DNA האנזים טופואיזומראז IIחותך את הפלסמיד pUC19באופן אקראי ולכן מתקבלים מקטעי DNA במשקלים שונים ,זוהי הסיבה להופעת "סולם בנדים" בג'ל .ככל שפעילות האנזים נמוכה יותר כך מתקבלים מקטעים כבדים יותר אשר ניתן לראותם בתחתית הג'ל ,בדומה לפלסמיד לבד ).(Lane 1 כפי שניתן לראות VP-16גורם לעיכוב בפעילות האנזים טופואיזומראז IIבאופן שתלוי בריכוז. 47 ל VP-16-השפעה על פעילות האנזים החל מריכוז של 10µg/mlכאשר העיכוב המרבי בפעילות האנזים הינו ב.20µg/ml- 4.1.1השפעת MXFו VP-16-לבד או בשילוב על פעילות טופואיזומראז IIמסחרי עיכוב פעילותו של האנזים טופואיזומראז IIנבדק ע"י הוספת ריכוזים שונים של (20-40µg/ml) MXF ו (5-10µg/ml) VP-16-לתערובת ריאקציה בנוכחות 250ng pUC19 ,ATPויחידת אנזים .לאחר הדגרה של 10דקות ב 370C-הריאקציה נעצרה ע"י הוספת stopping bufferותוצרי הריאקציה הופרדו על ג'ל של 1%אגרוז .בתום ההרצה ,הג'ל נצבע עם אתידיום ברומיד בריכוז סופי של .1 µg/ml תמונה מס' :2השפעת ריכוזים שונים של MXFו VP-16-על פעילות טופואיזומראז II 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Lane תמונה מס' :2תמונה מייצגת של שלושה ניסויים .תערובת הריאקציה מכילה יחידת אנזים 250ng ,של פלסמיד pUC19ו .ATP-אל תוך התערובת הוספו התרופות MXFו VP-16-לבד או בשילוב :Lane 1 .תערובת ריאקציה ללא תרופות וללא אנזים :Lane 2 .תערובת ריאקציה ללא תרופות :Lanes 3 & 4 .תערובת ריאקציה בנוכחות ,20-40µg/ml MXFבהתאמה :Lanes 5 & 6 .תערובת ריאקציה בנוכחות ,5-10µg/ml VP-16 בהתאמה :Lanes 7 & 8 .שילוב של 20µg/ml MXFעם :Lanes 9 & 10 .5-10µg/ml VP-16שילוב של 40µg/ml MXFעם ,5-10µg/ml VP-16בהתאמה .לאחר הדגרה של 10דקות ב 370C-הריאקציה נעצרה והתוצרים הופרדו בג'ל של 1%אגרוז .בתום ההרצה הג'ל נצבע עם אתידיום ברומיד בריכוז סופי של .1µg/ml )(U=units, S= Supercoiled DNA , R= Relaxed DNA 48 כפי שניתן לראות בתמונה מס' MXF ,2בריכוזים של 20-40µg/mlגרם ל 5-6%-עיכוב בפעילות האנזים ) VP-16 .(Lanes 3 & 4גרם לעיכוב של 10%בריכוז של (Lane 6) 10µg/mlובריכוז של (Lane 5) 5µg/mlכמעט ולא השפיע על פעילות האנזים .לעומת זאת שילוב של 20µg/ml MXFעם 5µg/mlאו VP-16 10µg/mlעיכב בצורה נכרת את פעילות האנזים ב (Lane 7) 20%-ו67%- ) (Lane 8בהתאמה .שילוב של VP-16עם ריכוזים גבוהים של MXFעיכב במידה רבה יותר את פעילות האנזים ,עד .(Lane 10) 73%ה Optical Density (OD)-נמדד ע"י ניתוח באמצעות תוכנת טינה .אחוז עיכוב האנזים מחושב עפ"י הנוסחא הבאה1 - (OD sample / OD control) X 100 : ביקורת היא דוגמת הפלסמיד לבד. 4.1.2בדיקת אופן העיכוב של topoisomerase IIע"י MXFבשילוב עם VP-16 העיכוב המוגבר שנצפה בשילוב התרופות יכול להתרחש מכמה סיבות (1) :אפקט ישיר של MXFעל האנזים topo IIבאופן כזה שהאנזים הופך להיות יותר רגיש לטיפול עם MXF (2) .VP-16משפיע על ה) DNA-לדוגמה -אינטרקלציה( כך שה ―cleavable complex" -שנוצר בין האנזים ,ה DNA-ו- topo IIיציב יותר מאשר בטיפול עם VP-16לבד .על מנת לענות על שאלות אלה נעשתה בחינת אופן העיכוב של topo IIע"י שני ניסויים ביוכימיים המבוססים על תחרות .תחילה בוצעה ריאקציה עם כמויות סובסטרט קבועות וכמויות הולכות וגוברות של האנזים ולאחר מכן ריאקציה עם כמויות הולכות וגוברות של סובסטרט וכמות אנזים קבועה .ניסויים אלו תוכננו כדי לענות על השאלה האם ההשפעה של MXFהיא ברמת האנזים או ברמת ה.DNA- 49 תמונה מס' :3אופן העיכוב של topo IIע"י MXFוVP-16- A B תמונה מס' :3 .Aכמויות שונות של יחידות אנזים מסחרי הוספו אל תוך ריאקציה המכילה כמויות קבועות של הסובסטרט 40µg/ml MXF ,(250ng) pUC19ו :Lane 1 .10µg/ml VP-16-תערובת ריאקציה ללא אנזים ובהעדר תרופות 0.5 units :Lanes 2-5 .של אנזים מסחרי 1 units :Lanes 6-9 .של אנזים מסחרי:Lanes 10-13 . 2 unitsשל אנזים מסחרי. .Bאל תוך תערובת ריאקציה המכילה יחידת אנזים אחת 40µg/ml MXF ,ו 10µg/ml VP-16-הוספו ריכוזים שונים של הסובסטרט .750ng :Lanes 4-6 .500ng :Lanes 1-3 . pUC19התמונה היא של ג'ל אגרוז המייצג ניסוי אחד מתוך 3ניסויים זהים שבוצעוu=units, R=Relaxed, S=Supercoiled . התוצאות מראות כי רק כאשר מעלים את כמויות האנזים בתערובת הריאקציה ניתן להתגבר על ההשפעה המעכבת של ) MXF/VP-16תמונה 3Aלעומת .(3Bעפ"י תוצאות אלו ניתן לשער כי קיימת אינטראקציה בין MXFל ,topo II-אינטראקציה שטיבה לא ברור. 51 4.1.3השפעת MXFהניתן לבד או בשילוב עם VP-16על פעילות topoisomerase IIהמופק מתאי HT-29וההשפעה על הפעילות האנזימטית כאשר התאים טופלו בתרופות. הפעילות של topo IIשהופק מתאי HT-29נבדקה בריאקצית דקטנציה .בריאקציה זו בוחנים את יכולת האנזים לשחרר מונומרים מקינטופלסט .DNAהקינטופלסט הנו רשת של פלסמידים ).( kDNA ריאקציה זו היא ספציפית ל ,topo II-ל topo I-אין יכולת לחתוך את ה.kDNA- תמונה מס' :4עיכוב בפעילות הדקטנציה של topo IIהמופק מתאי HT-29 תמונה :4השפעת MXFו VP-16-על פעילות topo IIממיצוי גרעיני. Aתמונה של ג'ל אגרוז המייצגת ניסוי אחד מתוך 3ניסויים זהים שבוצעו 1.2µg .מיצוי גרעיני הוסף לתערובת ריאקציה המכילה kDNA 80ngכסובסטרט kDNA :Lane 1.בלבד :Lane 2 .חלבונים גרעיניים ותערובת ריאקציה בהעדר תרופות :Lane 3 .חלבונים גרעיניים ,תערובת ריאקציה בנוכחות 40µg/ml MXFהמוסף 51 כתרופה בודדת :Lanes 4 & 5 .חלבונים גרעיניים ,תערובת ריאקציה בנוכחות ריכוזים שונים של 5-) VP-16 ,10µg/mlבהתאמה( המוסף כתרופה בודדת :Lanes 6 & 7 .חלבונים גרעיניים ,תערובת ריאקציה בנוכחות 40µg/ml MXFוריכוזים שונים של ,5-10µg/ml) VP-16בהתאמה( B .NP=Nuclear proteins .ממוצע SE±של 3ניסויים *p<0.05 .עבור תאים מטופלים לעומת דוגמת הביקורת **p<0.05 ,עבור תאים מטופלים עם VP-16+MXFלעומת תאים המטופלים עם VP-16לבד. ניתן לראות בתמונה 4כי קיימת פעילות של דקטנציה ע"י topo IIהמצוי במיצוי גרעיני שהופק מתאי Lane 2) HT-29לעומת .(Lane 1 VP-16בריכוזים של 5-10µg/mlעיכב את פעילות האנזים ב 29 ± 3% -ו 46 ± 4% -בהתאמה ) .(p<0.05הוספת 40µg/ml MXFגרמה להגברת העיכוב עד ) 60 ± 9%תמונה :4Aהשווה Lane 7 ל Lane 6 ,Lane 5-ל ,Lane 4-ו-תמונה MXF .(4Bלבד לא השפיע על פעילות האנזים )Lane 3 לעומת .(Lane 2תוצאות אלו מצביעות כי הוספת MXFל VP-16-מגבירה את העיכוב על פעילות הדקטנציה של topo IIכאשר משתמשים במיצוי גרעיני. על מנת לבחון את היכולת של תרופות אלו להשפיע על פעילות topo IIבתוך התא ,טופלו תאי HT-29 למשך 3שעות עם 40µg/ml MXFאו למשך שעה עם .35-50µg/ml VP-16הוכן מיצוי גרעיני מהתאים ו 1.2µg-חלבון מהמיצוי הוסף לתערובת ריאקציה. 52 תמונה מס' :5השפעת MXFו VP-16-על פעילות topo IIבתאי HT-29 תמונה :5עיכוב פעילות הדקטנציה של topo IIבתאים המטופלים עם MXFו.VP-16- Aתמונה של ג'ל אגרוז המייצגת ניסוי אחד מתוך 3ניסויים זהים שבוצעו kDNA :Lane 1 .בלבד. :Lane 2חלבונים גרעיניים שהופקו מתאי HT-29ללא טיפול :Lane 3 .תאי HT-29טופלו עם 40µg/ml MXFלמשך 3שעות :Lanes 4 & 6 .תאי HT-29טופלו עם ריכוזים שונים של (35-50µg/ml) VP-16למשך שעה :Lanes 5 & 7 .תאי HT-29טופלו עם 40µg/ml MXFלמשך 3שעות כאשר בשעה האחרונה הוסף VP-16בריכוזים שונים ) .(35-50µg/mlהוכן מיצוי גרעיני ו 1.2µg-מהמיצוי הוספו לתערובת הריאקציה. תוצרי הריאקציה הופרדו על ג'ל אגרוז .B .NP=nuclear proteins .ממוצע SE±של 3ניסויים *p<0.05 .עבור תאים מטופלים לעומת דוגמת הביקורת **p<0.05 ,עבור תאים מטופלים עם VP-16+MXFלעומת תאים המטופלים עם VP-16לבד. 53 התוצאות המוצגות בתמונה מס' 5A&Bמראות כי פעילות topo IIבתאים המטופלים עם 35µg/ml VP-16או 50µg/ml VP-16מעוכבת ב 40 ± 8%-ו ,45 ± 5%-בהתאמה )תמונה 5A השווה Lanes 4 & 6ל Lane 2-ו .(5B-טיפול תאי HT-29עם 40µg/ml MXFלבד השפיע בצורה מועטה על פעילות הדקטנציה של ) topo IIעיכוב של ) ,(16 ± 2%תמונה 5Aהשווה Lane 3לLane - .(2לעומת זאת ,נצפה עיכוב של עד 76 ± 17%ו 70 ± 21%-כאשר התאים טופלו עם שילוב של 35µg/ml VP-16או 50µg/ml VP-16יחד עם ,40µg/ml MXFבהתאמה )תמונה 5Aהשווה Lane 5ל Lane 4-ו Lane 7-ל Lane 6-ותמונה .(5B 4.1.4השפעת MXFו VP-16-על פעילות הביקוע של topoisomerase II התרופה VP-16ידועה כאמור ביכולתה לגרום לחיזוק הקשר הקוולנטי הנוצר בין topo IIלDNA- המכונה " ,"cleavable complexוע"י כך לגרום ליצירת שברים ב.DNA- תוצאות קודמות הראו כי התוספת של MXFמגבירה השפעה זו ,הן בניסויים בהם היה אנזים מנוקה ,והן בניסויים בהן השתמשנו במיצוי גרעיני. ניסויים ביוכימיים הראו כי השפעת MXFהיא ברמת האנזים ולא ברמת ה .DNA-על מנת לבחון את השפעת שתי התרופות על כמות יצירת ה cleavable complex -בתאים ,השתמשנו במבחן הband - .depletionמבחן זה מאפשר לזהות את הקומפלקסים הנוצרים בין topo IIל.DNA- Topo IIהקשור ל DNA-בקשר קוולנטי ,יוצרים קומפלקס גדול וכבד המנוע מלחדור לג'ל אקריל- אמיד ,וכך למעשה נוצרת "העלמות" של בנד ) .(band depletionלעומת זאת topo IIהחופשי בתא חודר לג'ל בקלות. תאי HT-29נחשפו ל 8µg/ml VP-16-למשך שעה ,או עם 40µg/ml MXFלמשך 3שעות או שילוב של 40µg/ml MXFלמשך 3שעות כאשר בשעה האחרונה הוסף .8µg/ml VP-16לאחר איסוף התאים והכנת ליזט ,החלבונים הוטענו על ג'ל אקריל אמיד והועברו לממברנת ניטרוצלולוז .ממברנה זו הוגבה כנגד נוגדן ל topo II α-וכנגד actinעל מנת לוודא כי הוטענו כמויות זהות של חלבונים. 54 תמונה מס' :6השפעת MXFו VP-16-על כמות topo IIחופשית בתא תמונה מס' :6מבחן band depletionל :Lane 1 A .topo II-תאי HT-29ללא טיפול :Lane 2 .תאים שטופלו עם 40µg/ml MXFלמשך 3שעות :Lane 3 .תאי HT-29טופלו למשך שעה עם :Lane 4 .8µg/ml VP-16 תאי HT-29טופלו עם 40µg/ml MXFלמשך 3שעות כאשר בשעה האחרונה הוסף .8µg/ml VP-16תמונה המייצגת 4ניסויים זהים B .ניתוח דנציטומטרי יחסי לתאים לא מטופלים .ממוצע SE±של 4ניסויים*p<0.05 . עבור תאים מטופלים לעומת דוגמת הביקורת **p<0.05 ,עבור תאים מטופלים עם VP-16+MXFלעומת תאים המטופלים עם VP-16לבד. 55 בתמונה 6Aניתן לראות כי חשיפת תאי HT-29ל MXF-בלבד כמעט ולא השפיעה על העלמות הבנד של .topo IIטיפול התאים עם 8µg/ml VP-16גרם ל 27 ± 1%-העלמות הבנד של topo II ) ,(p<0.01בעוד שבתאים אשר טופלו עם שילוב של שתי התרופות נראתה הפחתה של 45 ± 7%בבנד ) .(p<0.03ממצא זה מציע כי שילוב התרופות גורם להגברת יצירת cleavable complexבין topo II ל) DNA-תמונה .(6A & B 4.2השפעת MXFעל הפעילות האנטי-פרוליפרטיבית של VP-16 התוצאות שהוזכרו לעיל ,מציעות כי טיפול בתאי HT-29עם MXFמגביר את העיכוב בפעילות של האנזים טופואיזומראז IIהתוך תאי הנגרם ע"י התרופה .VP-16על מנת לבחון את המשמעות הביולוגית של תוצאות אלו ,נבדקה ההשפעה של שילוב MXFעם VP-16על התרבות תאים .תחילה נבדקו ריכוזים שונים של (1-10µg/ml) VP-16על התרבות תאי HT-29לזמנים שונים ) (48h & 72hולאחר מכן נבדקה ההשפעה של שילוב VP-16עם .MXF 56 גרף מס' :1השפעת MXFו VP-16-על התרבות תאי HT-29 A 72h 48h * * * * 80 * 60 40 * 20 10 2.5 5 MXF 10 MXF 20 0 1 B * * ** ** 100 ** 80 60 ** * ** ** ** 10 5 0 VP-16 µg/ml No MXF * % Proliferation * * 100 40 20 2.5 1 - 0 VP-16µg/ml גרף מס' MXF :1מגביר את ההשפעה האנטי-פרוליפרטיבית של (A) .VP-16תאי HT-29בריכוז של 5*104/mlהודגרו למשך 48או 72שעות בנוכחות ריכוזים עולים של (B).VP-16תאי HT-29הודגרו למשך 72שעות בנוכחות VP-16 ,MXFאו שילוב של שתי התרופות .התרבות התאים נקבעה באמצעות מבחן .MTTהתוצאות מבוטאות כממוצע SE ±של חמישה ניסויים שבוצעו בטריפליקט *p<0.05 .עבור תאים מטופלים לעומת דוגמת הביקורת **p<0.05 ,עבור תאים מטופלים עם VP-16+MXFלעומת תאים המטופלים עם VP-16לבד. 57 גרף 1מראה כי VP-16גורם לירידה בהתרבות התאים באופן שתלוי בריכוז ובזמן )גרף .(1Aהעיכוב הגדול ביותר נצפה לאחר הדגרת התאים למשך 72שעות עם 72 ± 7%) 10µg/ml VP-16עיכוב(. בניסויים הבאים בהם נבדק השילוב של MXFו VP-16-התאים הודגרו עם התרופות למשך 72שעות. גרף 1Bמראה כי מתן MXFלבד בריכוז של 20µg/mlמשפיע במעט על התרבות התאים ) .(11 ± 0.02%לעומת זאת ,שילוב של VP-16עם MXFגרם לירידה ניכרת בהתרבות התאים. חשיפת התאים ל 5µg/ml VP-16-עם MXFגרמה לירידה של עד 66 ± 6%בהתרבות התאים לעומת 46 ± 4%כאשר התאים נחשפו ל 5µg/ml VP-16-לבד ) ,(p<0.001בנוסף ראוי לציין כי הירידה בהתרבות התאים שנצפתה הייתה דומה לירידה שנגרמה ע"י חשיפת התאים ל 10µg/ml VP-16-לבד ) 72 ± 7%עיכוב(. 4.2.1השפעת MXFו VP-16-על מחזור התא של תאי HT-29 תאי HT-29שנחשפו לשילוב של MXFו VP-16-הראו ירידה משמעותית ביכולת ההתרבות שלהם לעומת טיפול עם VP-16לבד .לאור תוצאות אלו ,נבחנה האפשרות כי השילוב של MXFעם VP-16 משפיעה על פרופיל מחזור התא. תאי HT-29נחשפו לריכוזים שונים של (0.1-5µg/ml) VP-16בנוכחות או העדר MXFלמשך 48 שעות .בתום ההדגרה התאים עברו אנליזה ב FACS-לאחר צביעת ה .DNA-התוצאות מוצגות בתמונה מס' .7 58 תמונה מס' :7אפיון מחזור התא לאחר טיפול עם VP-16וMXF- תמונה מס' : 7אנליזת FACSשל תאי .HT-29תאי HT-29בריכוז של 1*106/mlטופלו למשך 48שעות עם ריכוזים שונים של VP-16בנוכחות או העדר ,MXFמחזור התא נקבע לאחר צביעת התאים עם .PIהאזורים המסומנים מייצגים את איזור ה) sub-G1-אופייני לתאים אפופטוטיים( ואת איזור ה .G2M-ניסוי מייצג מתוך 4 ניסויים זהים מוצג ב .A-ממוצע SE ±של 4ניסויים מוצגים ב .B-עבור תאים מטופלים לעומת דוגמת הביקורת. *p<0.05עבור תאים מטופלים לעומת דוגמת הביקורת **p<0.05 ,עבור תאים מטופלים עם VP-16+MXF לעומת תאים המטופלים עם VP-16לבד. התרופה הכימו-תרפויטית VP-16גורמת לעצירת התאים בשלב ה G2M-במחזור התא )כאשר היא ניתנת בריכוזים של עד (2.5µg/mlולהופעת תאים המצטברים ב) sub-G1-תמונה ,(7A & Bשלב האופייני לתאים אפופטוטיים .אחוז התאים שהצטברו ב sub-G1-עלה עם עליית הריכוזים של VP-16 והגיע למקסימום של ,26.3%כאשר התאים נחשפו ל) 5µg/ml VP-16-תמונה .(7A תמונה 7A & Bמראה כי חשיפת התאים ל MXF-בריכוז של 20µg/mlבלבד איננה משפיעה כלל על 59 מחזור התא .לעומת זאת שילוב של MXFעם 0.1µg/ml VP-16גרם לעלייה של פי 2-באחוז התאים שהצטברו ב sub-G1-לעומת טיפול עם 0.1µg/ml VP-16לבד .ראוי לציין כי אותו אחוז של תאים ב- sub-G1נצפה כאשר התאים טופלו עם 0.5µg/ml VP-16לבד .תוצאות אלו מראות כי MXFמגביר באופן משמעותי את ההשפעה הציטוטוקסית של .VP-16 שילוב של MXFעם ריכוזים נמוכים של (0.1-0.5µg/ml) VP-16גרם לעלייה נוספת בתאים העצורים בשלב ה ,G2M-בעוד שבריכוזים גבוהים יותר של VP-16בשילוב עם MXFנצפתה ירידה לעומת טיפול עם VP-16לבד. 4.2.2השפעת MXFו VP-16-על ביטוי החלבון survivin החלבון survivinשייך למשפחה של חלבונים המכונה ) .Inhibitors of apoptosis (IAPלמשפחה זו יש תפקיד כפול ,הכולל עיכוב אפופטוזיס כמו גם בקרה על חלוקה תאית ) .(58ביטויו של חלבון זה תלוי במחזור התא ,עם עלייה ניכרת בשלב ה .G2M-התוצאות שהוזכרו לעיל מראות כי הייתה עלייה ניכרת של תאים העצורים בשלב ה G2M -עם חשיפת התאים ל .VP-16 -שילוב של MXFעם ריכוזים גבוהים של (2.5-5µg/ml) VP-16גרם לירידה באחוז התאים בשלב זה של מחזור התא לעומת טיפול עם VP-16לבד .לאור תוצאות אלו נבדקה ההשפעה של MXFו VP-16-על ביטוי החלבון survivinבתוך התאים ע"י אנליזה ב FACS-עם נוגדן ספציפי כפי שתואר בשיטות המחקר .תאי HT- 29בריכוז של 1*106/mlהודגרו עם מדיום ללא סרום )תנאי הרעבה( למשך 24שעות ,בתום ההדגרה הוסף 20µg/ml MXFלמשך 24שעות ,לפני הוספת ריכוזים שונים של (0.1-9µg/ml) VP-16 למשך 24שעות נוספות. 61 תמונה מס' :8השפעת MXFו VP-16-על ביטוי survivinבתא תמונה מס' :8אנליזת FACSשל ביטוי החלבון survivinבתאים שטופלו עם MXFו .VP-16-תאי HT-29 הורעבו במדיום ללא סרום למשך 24שעות ,לאחר מכן הוסף 20µg/ml MXFוהתאים הודגרו 24שעות. VP-16בריכוזים שונים הוסף לחלק מהדוגמאות בתום ההדגרה למשך 24שעות נוספות .התאים נאספו והוגבו עם הנוגדן .anti-human surviving-fluorescein monoclonal antibodyניסוי מייצג מוצג ב .A-ממוצע ± SEשל 4ניסויים מוצגים ב .B-אחוז התאים החיוביים חושב כך: %התאים הצבועים שטופלו עם תרופות % -התאים הצבועים ללא טיפול *p<0.05 .עבור תאים מטופלים לעומת דוגמת הביקורת **p<0.05 ,עבור תאים מטופלים עם VP-16+MXFלעומת תאים המטופלים עם VP- 16לבד. התוצאות שהתקבלו הן בהלימה עם מחקרים אחרים המראים כי VP-16גורם לעלייה בביטוי החלבון .(96) survivin ביטוי החלבון survivinעלה פי 5-20בתאי HT-29שנחשפו לריכוזים שונים של . VP-16טיפול 61 התאים עם MXFבלבד לא השפיע על ביטויו של החלבון .הוספת 20µg/ml MXFל1.5-9µg/ml - VP-16עיכבה את ביטוי החלבון ב 22-32%-בהתאמה .תוצאות אלו מחזקות את התוצאות שהתקבלו במבחני התרבות התאים ,בהם התוספת של MXFל VP-16-גרמה לירידה בהתרבות התאים .בנוסף הן מחזקות את התוצאות שהתקבלו במחזור התא ,בהם MXFגרם לעלייה נוספת באחוז התאים ב- sub-G1כתוצאה מטיפול עם .VP-16 4.2.3השפעת MXFו VP-16-על שינויים מורפולוגיים בתאי HT-29 הצבע (DAPI )4',6-diamidino-2-phenylindoleהנו צבע פלורוסנטי הנקשר חזק ל .DNA-הצבע מסוגל לחדור את ממברנת התאים )בין אם התאים חיים או בין אם הם עברו קיבוע( .באמצעות שיטה זו נבדקה ההשפעה של MXFו VP-16-על עיבוי )קונדנסציה( של הכרומטין .תאי HT-29הודגרו עם ריכוזים שונים של (5-10µg/ml) VP-16ו (10-20µg/ml) MXF-למשך 48שעות ,לאחר צביעת התאים עם הצבע ,DAPIהתאים נסרקו תחת מיקרוסקופ פלורוסנטי. 62 תמונה מס' :9השפעת MXFו VP-16-על שיעור אפופטוזיס בתאי HT-29 תמונה מס' :9צביעת DAPIשל תאי HT-29לאחר טיפול עם VP-16ו .MXF-תאי HT-29בריכוז של 1*106/mlטופלו למשך 48שעות עם (5-10µg/ml)VP-16בנוכחות או העדר .(10-20µg/ml) MXFבתום ההדגרה התאים נאספו,הודבקו לזכוכית נושאת ולאחר קיבוע ,בוצעה צביעת A .DAPIתמונות מניסוי מייצג ממיקרוסקופ פלורוסנטי B .ממוצע SE ±של 3ניסויים *p<0.05 .עבור תאים מטופלים לעומת דוגמת הביקורת **p<0.05 ,עבור תאים מטופלים עם VP-16+MXFלעומת תאים המטופלים עם VP-16לבד. 63 תמונה 9Aמראה כי טיפול התאים עם VP-16לבד למשך 48שעות גרם לדחיסת הכרומטין ,הקטנה של גרעיני התאים ועלייה בעוצמת הפלורוסנציה .תוספת של MXFגרמה להגברת התופעה ,כלומר, נצפו יותר תאים עם גרעינים קטנים בעלי כרומטין דחוס המצביעים על אפופטוזיס .טיפול התאים עם 5-10µg/ml VP-16גרם לעלייה באחוז התאים האפופטוטיים מ 1 ± 0.5%-בדוגמת הביקורת ל15.5 - ± 0.6%ו , 19.7 ± 2.2-בהתאמה .עלייה משמעותית נוספת באחוז התאים האפופטוטיים נצפתה לאחר שהתאים הודגרו עם שילוב של 5µg/ml VP-16או 10µg/ml VP-16עם ) 20µg/ml MXFעד 22.2 ± 1.7%ו ,26 ± 2.6%-בהתאמה) (p<0.05 ,תמונה .(9B 4.2.4שפעול קספאז 3לאחר חשיפת התאים ל VP-16-וMXF- מסלול האפופטוזיס בתאים כולל שפעול של פרוטאזות ,הקרויות קספאזות ,המוציאות את תהליך המוות התאי המתוכנן לפועל .בשלב הסופי התא מתפרק ומתקבלים שינויים מורפולוגיים וביוכימיים אופייניים .שפעול קספאז 3נבדק באמצעות השיטה הפלורימטרית. DEVD-AMCהנו סובסטרט ספציפי לפרוטאז קספאז ,3אשר מחקה את אתר הביקוע של .PARP תאי HT-29הודגרו למשך 48שעות עם ריכוזים שונים של (5-10µg/ml) VP-16בנוכחות או העדר ריכוזים שונים של .(10-20µg/ml) MXFבתום ההדגרה ,הוכן ליזט מהתאים ונעשתה קביעת חלבון באמצעות שיטת ברדפורד על מנת לוודא כי כמות החלבון הנבדקת זהה בין הדוגמאות השונות .ליזט התאים הודגר עם הסובטרט .עוצמת הפלורוסנציה ,הודות לפעילות הביקוע של האנזים בליזט ,נמדדה באמצעות פלורימטר .על מנת לוודא כי הפעילות שנמדדה הנה ספציפית ,נעשה שימוש עם מעכב ספציפי לקספאז .3לשם כך ,חלק מהדוגמאות טופלו תחילה עם המעכב Z-DEVD-FMK )בריכוז של (50µMלמשך 30דקות ורק לאחר מכן הוסף 20µg/ml VP-16לתרבית התאים למשך 48שעות. 64 גרף מס' :2השפעת MXFו VP-16-על שפעול קספאז 3 גרף מס' MXF :2מגביר את שפעול קספאז 3הנגרם ע"י .VP-16תאי HT-29בריכוז של 1*106/mlהודגרו עם 5-10µg/ml VP-16בנוכחות או העדר 10-20µg/ml MXFלמשך 48שעות .פעילות קספאז 3נמדדה ע"י שימוש בסובסטרט ספציפי .DEVD-AMCהגרף מייצג ממוצע SE ±של 3ניסויים .ההשפעה של המעכב הספציפי Z-DEVD-FMKמוצגת בגרף המוחדר Z-DEVD-FMK .הוסף לתרבית התאים 30דקות לפני הוספת *p<0.05 . 20µg/ml VP-16עבור תאים מטופלים לעומת דוגמת הביקורת **p<0.05 ,עבור תאים מטופלים עם VP-16+MXFלעומת תאים המטופלים עם VP-16לבד. בגרף 2ניתן לראות כי טיפול תאי HT-29עם 5µg/ml VP-16או 10µg/ml VP-16גורם לעלייה משמעותית בשפעול קספאז p<0.02) 3ו ,p< 0.03-בהתאמה( .הוספת MXFבריכוז של 20µg/ml לריכוזי VP-16גרמה לעלייה נוספת בשפעול האנזים ,כך למשל ,בנוכחות 5µg/ml VP-16נצפתה עלייה נוספת של פי (p<0.03) 1.8ועלייה של פי 1.7בנוכחות .(p<0.04) 10µg/ml VP-16טיפול 65 התאים עם המעכב Z-DEVD-FMKלפני הוספת 20µg/ml VP-16גרם לירידה בשפעול האנזים לרמת שפעול כמו בתאים לא מטופלים )גרף מוחדר(. 4.2.5השפעת VP-16ו MXF -על הפרשת ציטוקינים פרו-אנגיוגניים מתאי HT-29 נבדקה השפעת MXFו VP-16-על הפרשת הפקטורים הפרו-אנגיוגניים IL-8ו VEGF-מתאי HT- .29תאי HT-29נזרעו בצלחות 35mmבריכוז של .1*106cells/mlהתאים נחשפו למשך 48שעות לריכוזים שונים של (10-20µg/ml) MXFו (5-10µg/ml) VP-16-לבד או בשילוב .בתום ההדגרה, נאסף הנוזל העליון לבדיקת נוכחות IL-8ו VEGF-בשיטת ה ELISA-כפי שתואר בשיטות המחקר. גרף מס' :3השפעת MXFעל הפרשת פקטורים פרו-אנגיוגניים המושרית ע"י VP-16 66 גרף מס' :3השפעת MXFעל הפרשת פקטורים פרו-אנגיוגניים .תאי HT-29הודגרו למשך 48שעות עם ריכוזים עולים של VP-16בהעדר או נוכחות .MXFריכוזי (A) IL-8נקבעו באמצעות .ELISAהתאים הודגרו למשך 48שעות בנוכחות או העדר MXFוריכוז ה (B) VEGF-נקבע ע"י .ELISAהערכים המוצגים הם ממוצע SE ±של ארבעה ניסויים שבוצעו בדופליקט *p<0.05 .עבור תאים מטופלים לעומת דוגמת הביקורת **p<0.05 ,עבור תאים מטופלים עם VP-16+MXFלעומת תאים המטופלים עם VP-16לבד. גרף 3Aמראה כי MXFבריכוזים של 10-20µg/mlמוריד באופן משמעותי את ההפרשה הבסיסית של IL-8מתאי .(p<0.05) HT-29הדגרת התאים למשך 48שעות עם VP-16בריכוזים של 5- 10µg/mlגרמה לעלייה תלוית ריכוז בהפרשת .IL-8בדוגמאות בהן הוסף MXFבריכוזים השונים נצפתה ירידה משמעותית בהפרשת IL-8שנגרמה כתוצאה מהטיפול עם .VP-16עיכוב של 25% בהפרשת IL-8נצפה בתאים שטופלו עם VP-16בריכוז של 10µg/mlבנוכחות MXFבריכוז של .(p<0.05) 20µg/ml רמת ההפרשה הבסיסית של VEGFמתאי HT-29לאחר הדגרה למשך 48שעות הייתה 4059± 354 .pg/mlהוספת MXFבריכוזים של 10-20µg/mlגרמה לירידה משמעותית בהפרשת VEGFב- 17%ו ,33%-בהתאמה )גרף .(3Bטיפול התאים עם ריכוזים שונים של VP-16לא השפיע כלל על הפרשת VEGFמהתאים. 4.3בדיקת עיכוב פעילות האנזים טופואיזומראז Iמסחרי בנוכחות ריכוזים שונים של ,CPT MXFוCIP- CPTהנה תרופה כימו-תרפויטית המעכבת את פעילות האנזים טופואיזומראז .I מעט ידוע ,אם בכלל ,על מעורבות של קווינולונים עם אנזים זה .על כן בחלק זה של העבודה נבחנה ההשפעה של שני פלואורוקווינולונים על פעילות האנזים טופואיזומראז MXF : Iו ,CIP-לבד או בשילוב עם .CPT ההשפעה על פעילות האנזים האאוקריוטי טופואיזומראז Iע"י ריכוזים שונים של CIP ,MXFוCPT- 67 נבחנה באמצעות מבחן טופואיזומראז ,Iבו הוסף לתוך תערובת הריאקציה אנזים מסחרי ופלסמיד pUC19כסובסטרט .תוצרי הריאקציה הופרדו בג'ל אגרוז ,ולאחר ביצוע דנציטומטריה חושב אחוז הפעילות של האנזים .מטרת בדיקה זו הייתה לקבוע את ריכוזי התרופות להמשך העבודה. תמונה מס' : 10השפעת ריכוזים שונים של MXF ,CPTו CIP-על פעילות טופואיזומראז Iמסחרי A B תמונה מס' :10השפעת ריכוזים עולים של CIP ,MXFו CPT-על פעילות האנזים טופואיזומראז .Iתמונה מייצגת של ג'ל אגרוז בה ניתן לראות את תוצרי הריאקציה של טופואיזומראז (A) .Iהשפעת ריכוזים עולים של MXFו- 68 (B) ,CPTהשפעת ריכוזים עולים של .CIPניתן לראות את הפלסמיד pUC19וצורתו הרפויהRelaxed =R) . .(u=units, Supercoiled DNA=S , DNA כפי שניתן לראות בתמונה MXF ,10Aבריכוזים של 20-40µg/mlגרם לעיכוב של 9-14%-בפעילות האנזים ) ,Lanes 3 & 4בהתאמה( CPT .גרם לעיכוב בפעילות האנזים באופן שתלוי בריכוז,32% : 62% ,37%ו 85% -בריכוזים של 0.5µM ,0.25µM ,0.1µMו ,1µM-בהתאמה ).(Lanes 5-8 בתמונה 10Bניתן לראות כי CIPבריכוזים של 10, 20 & 40µg/mlגרם לעיכוב בפעילות האנזים באופן תלוי ריכוז 30% ,18% :ו ,68%-בהתאמה ).(Lanes 4-6 4.3.1השפעת CIP/ MXFבשילוב עם CPTעל פעילות האנזים טופואיזומראז I ההשפעה המשולבת של CPTעם הפלואורוקווינולונים נבדקה ע"י מבחן טופואיזומראז .Iבבחינת ההשפעה של MXFו CPT-על פעילות האנזים נבדקו הריכוזים 0.5µMעבור CPTו20-40µg/ml- עבור .MXFבבחינת ההשפעה של CIPו CPT-על פעילות האנזים נבדקו הריכוזים 0.1-0.2µMעבור CPTו 10-20µg/ml-עבור .CIP 69 תמונה מס' :11השפעת CIP/MXFעל פעילות טופואיזומראז Iבשילוב עם CPT B A 100 ** * 60 40 * + + + 20 % Inhibition 80 0 MXF40 µg/ml CPT 0.5 µM + - D 100 ** 60 40 * 20 + + * * 20 - 10 - % Inhibition 80 20 0 CIP µg/ml CPT 0.2µM תמונה מס' :11השפעת CIP/MXFעל פעילות טופואיזומראז Iבשילוב עם .CPTג'ל אגרוז מייצג של תוצרי הריאקציה של מבחן טופואיזומראז Iשהתקבלו עם MXFו CPT-שהוספו לתערובת הריאקציה לבד או בשילוב ) (Aועם CIPו CPT-שהוספו לבד או בשילוב ) .(Cניתוח דנציטומטרי בוצע ואחוז העיכוב בפעילות האנזים ע"י MXFו (B) CPT-או CIPו (D) CPT-חושב .התוצאות הן ממוצע SE ±של 4ניסויים, Relaxed DNA=R) . צמיח *p<0.05 .( u=units ,Supercoiled DNA=Sעבור תאים מטופלים לעומת דוגמת הביקורת **p<0.05 ,עבור תאים מטופלים עם הפלואורוקווינולונים עם CPTלעומת תאים המטופלים עם CPTלבד. לגבלגחבלגחבגל תמונה 11Aהינה תמונה מייצגת בה ניתן לראות את ההשפעה של (40µg/ml) MXFאו (5µM) CPT שהוספו לתערובת ריאקציה בנפרד על עיכוב הפעילות של טופואיזומראז 14% ,Iו62%- C 71 ) ,(Lanes 3&4בהתאמה .שילוב התרופות גרם לעלייה נוספת בעיכוב פעילות האנזים עד ל82% - ) .(Lane 6עיכוב דומה נצפה עם CIPו) CPT-תמונה .(11Cהוספת (20µg/ml) CIPאו CPT ) (0.2µMלבד לתוך תערובת הריאקציה המכילה יחידת אנזים גרמה ל 12%-ו 30%-עיכוב בפעילות טופואיזומראז ,Lanes 4 & 8) Iבהתאמה( ,לעומת זאת שילוב התרופות גרם לעיכוב של Lane ) 64% .(10ניתוח דנציטומטרי בוצע וחושב אחוז העיכוב בפעילות טופואיזומראז .Iתמונות 11B & Dמראות ממוצע SE ±של 4ניסויים .ניתן לראות כי ישנה הגברה משמעותית בעיכוב פעילות האנזים כאשר מוסף שילוב של MXFו) CPT-תמונה (11Bאו CIPו) CPT-תמונה (11Dלעומת ההשפעה המעכבת של כל תרופה לחוד. 4.3.2בדיקת אופן העיכוב של topo Iע"י CIP/MXFבשילוב עם CPT במטרה לחקור את אופן העיכוב של פעילות האנזים טופואיזומראז Iבוצעו שני ניסויים ביוכימיים: ריאקציה עם כמויות סובסטרט קבועות וכמויות הולכות וגוברות של האנזים ולאחר מכן ריאקציה עם כמויות הולכות וגוברות של סובסטרט וכמות אנזים קבועה .ניסויים אלו תוכננו כדי לענות על השאלה האם האפקט המוגבר שנצפה בשילוב התרופות הינו ברמת האנזים או ברמת ה ,DNA-בהתאמה. 71 תמונה מס' :12אופן העיכוב של טופואיזומראז Iע"י CIP/MXFבשילוב עם CPT B תמונה מס' :12בדיקת אופן העיכוב של טופואיזומראז Iע"י CIP/MXFו .CPT-ג'ל אגרוז מייצג שהתקבל עם תוצרי הריאקציה של מבחן טופואיזומראז Iעם כמויות הולכות וגוברות של טופואיזומראז 0.5-4) Iיחידות אנזים( וכמויות קבועות של הסובסטרט (250ng) pUC19בתוספת MXFבריכוז של 40µg/mlו(A) 0.5µM CPT- או בתוספת CIPבריכוז של 20µg/mlו C .(B) 0.2µM CPT-ו :D-כמויות עולות של סובסטרט )(250-750ng הוספו לתערובת ריאקציה המכילה כמות קבועה של אנזים )יחידה אחת( ו MXF -בריכוז של 40µg/mlו- 0.5µM CPTאו CIPבריכוז של 20µg/mlו ,0.2µM CPT-בהתאמה,R=Relaxed, S=Supercoiled . .u=units 72 בתמונה 12ניתן לראות כי רק כאשר מעלים את כמויות האנזים בריאקציה ) (B & Aניתן להתגבר על ההשפעה המעכבת של CPTבשילוב עם MXFאו .CIPכאשר מעלים את כמות הסובסטרט ) (D & C עד פי (750ng) 3אך כמות האנזים בריאקציה נשארת קבועה )יחידה אחת( פעילותו של האנזים טופואיזומראז Iעדיין מעוכבת ע"י התרופות .לאור זאת עולה שגם במקרה של טופואיזומראז ) Iכמו במקרה של טופואיזומראז ,(IIסביר להניח כי השפעת התרופות היא ברמת האנזים ולא ברמת ה.DNA- 4.3.3השפעת CIP /MXFהניתנים לבד או בשילוב עם CPTעל פעילות טופואיזומראז Iהמופק מתאי HT-29 הפעילות של האנזים טופואיזומראז Iממיצוי גרעיני שהוכן מתאי HT-29נבדקה בריאקציה בה סופק לאנזים סובסטרט .pUC19לריאקציה זו לא סופק ATPהדרוש לפעילות האנזים טופואיזומראז ,IIלכן ריאקציה זו הנה ספציפית לטופואיזומראז .I 6-10ngמהמיצוי הגרעיני הוספו לתערובת הריאקציה המכילה (0.25-1µM) CPT (250ng) DNAו- MXFאו .CIPלאחר הדגרה ב 370C-תוצרי הריאקציה הופרדו בג'ל אגרוז ובתום ההרצה הג'ל נצבע עם אתידיום ברומיד בריכוז סופי של .1µg/ml 73 תמונה מס' :13השפעת CIP ,MXFו CPT-על פעילות topo Iממיצוי גרעיני מתאי HT-29 תמונה מס' :13השפעת CIP ,MXFו CPT-על פעילות topo Iממיצוי גרעיני שהוכן מתאי 6-10ng .HT-29 מיצוי גרעיני הוספו לתערובת ריאקציה ספציפית ל topo I-בנוכחות (0.25-1µM) CPTו MXF (A)-או(B)- .u=unit ,prot=protein ,Nucl=Nuclear ,S=Supercoiled DNA ,R=Relaxed DNA .CIP בתמונה זו ניתן לראות כי MXFו CIP-מגבירים את ההשפעה המעכבת שיש ל CPT-על פעילותו של טופואיזומראז Iממיצוי גרעיני .בתמונה 13Aניתן לראות כי הוספת (40µg/ml) MXFל0.5µM - CPTהגבירה את ההשפעה שיש ל CPT -לבד )השווה Lane 6ל .(Lane 5-כמו כן השפעה זו נצפתה גם כאשר לתוך תערובת הריאקציה הוספו 10ngמיצוי גרעיני )השווה Lane 11ל Lane 9-וLane12 - ל .(Lane 10-השפעה דומה ניתן לראות בתמונה :13Bהוספת 20µg/ml CIPל0.25µM CPT- הגבירה את ההשפעה של ) CPTהשווה Lane 7ל.(Lane 5- 74 4.3.4השפעת CIP /MXFהניתנים לבד או בשילוב עם CPTעל הפעילות התוך תאית של טופואיזומראז Iבתאי HT-29 התוצאות שהוצגו מציעות כי הפלואורוקווינולונים MXFו CIP-מעכבים את פעילות האנזים טופואיזומראז ,Iהן כאשר לתערובת הריאקציה מוסף אנזים מסחרי והן כאשר מוסף מיצוי גרעיני המכיל טופואיזומראז תאי .על מנת לחקור את יכולת התרופות לעכב את פעילות האנזים בתוך התא ,טופלו תאי HT-29תחילה עם MXFבריכוז של CIP , 20µg/mlבריכוז של 20µg/mlאו CPTבריכוז של 2.5µMלמשך זמנים שונים .בהמשך הוכן מיצוי גרעיני ו 6ng-מהמיצוי הוסף לתערובת הריאקציה. בשלב מאוחר יותר נבדקה ההשפעה של שילוב התרופות המוזכרות. 75 תמונה מס' :14השפעת CIP ,MXFו CPT-על פעילות טופואיזומראז של תאי HT-29 תמונה מס' :14עיכוב פעילות טופואיזומראז Iבתאי HT-29שטופלו עם CIP ,MXFו .CPT-תאי HT-29 הודגרו לזמנים שונים עם (A) 20µg/ml MXFאו עם (B) 20µg/ml CIPו .2.5µM CPT-הוכן מיצוי גרעיני ו 6ng-מהמיצוי הוספו לתערובת ריאקציה (C) .תאי HT-29הודגרו למשך שעתיים עם MXFאו ,CIPלחלק מהדוגמאות הוסף CPTותרביות התאים הודגרו למשך שעה נוספת .הוכן מיצוי גרעיני ו 6ng-הוספו לתערובת הריאקציה .תוצרי הריאקציה הופרדו על ג'ל אגרוז,S=Supercoiled DNA ,R=Relaxed DNA . Nucl prot = Nuclear protein התוצאות המוצגות בתמונה (A & B) 14מראות כי ההשפעה המעכבת של הפלואורוקווינולונים על פעילות טופואיזומראז Iגוברת ככל שזמן חשיפת התאים לתרופות ארוך יותר )תמונה 14Aהשווה 76 Lanes 3-5ותמונה 14Bהשווה .(Lanes 3-5 הדגרת התאים עם (14A) 20µg/ml MXFאו עם (14B) 20µg/ml CIPלמשך 1-5שעות גורם לירידה בשיעור של 11-23%ו 24-43%-בפעילות האנזים ,בהתאמה. ירידה משמעותית בפעילות טופואיזומראז Iנצפתה כאשר התאים נחשפו ל 23%) 2.5µM CPT-ו56%- עיכוב בהדגרת התאים למשך שעה ושעתיים ,בהתאמה( .על מנת לבחון את ההשערה כי פלואורוקווינולונים מגבירים את ההשפעה המעכבת של ,CPTתאי HT-29הודגרו עם הפלואורוקווינולונים למשך שעתיים ושעה נוספת עם ) CPTהתאים נחשפו לפלואורוקווינולונים למשך 3שעות ולשעה האחרונה הוסף .(CPTתמונה 14Cמראה כי ) MXFהשווה Lanes 3 & 6לעומת (Lane 7ו) CIP-השווה Lanes 4 & 6לעומת (Lane 9מגבירים את ההשפעה המעכבת של .CPT 4.4בדיקת השפעת MXFו CIP-על הפעילות האנטי-פרוליפרטיבית של CPT לאור התוצאות שהתקבלו בניסויים בהם נבדקה השפעת התרופות על פעילות האנזים טופואיזומראז ,I נבדקה ההשפעה הביולוגית של תרופות אלו .תחילה נבדקה התרבות התאים באמצעות מבחן .MTT תחילה נבדקה ההשפעה של CPTבריכוזים שונים )(1-50nMלזמנים שונים ולאחר מכן נבדקה ההשפעה המשולבת של CPTעם MXFאו .CIP 77 גרף מס' :4השפעת CIP ,MXFו CPT-על התרבות תאי HT-29 72h 24h 48h 100 * * 80 * 60 40 20 50 MXF 20µg/ml 20 10 MXF 10µg/ml B 100 * ** 60 40 20 1 5 No CIP CIP 10µg/ml CIP 20µg/ml CIP 40µg/ml * 0 CPT nM 0 C ** ** ** * * * 100 80 60 40 20 5 1 0 )Proliferation (% **** ** )Proliferation (% 80 ** ** 0 CPTnM - No MXF * ** 5 )Proliferation (% * * * ** * A 0 CPT nM גרף מס' :4תאי HT-29נזרעו בריכוז 5*104cells/mlבפלטת 96בארות .התאים נזרעו בנפח של 100µl/well בטריפליקט בנוכחות מינונים שונים של CIP ,MXFו 10-20µg/ml) CPT-ו 10-40µg/ml-ו,5-50nM - בהתאמה( .והודגרו באינקובאטור ב .A .370C-הדגרה עם ריכוזים שונים של CPTלמשך 24-72שעות .התרבות התאים נבדקה במבחן .MTTההשפעה של (B) MXFאו (C) CIPעל התרבות התאים נבדקה לאחר 72שעות 78 הדגרה בנוכחות או העדר *p<0.05 .CPTתאים שטופלו עם CPTבהשוואה לביקורת ** p<0.05 .תאים שטופלו עם CPTו MXF-או CIPבהשוואה לתאים שטופלו עם .CPT גרף 4Aמראה כי CPTגורם לירידה בהתרבות התאים באופן שתלוי בזמן ובריכוז .העיכוב הגדול ביותר בהתרבות התאים ) (45±2.1%התקבל כאשר התאים טופלו למשך 72שעות עם .50nM CPT טיפול משולב של MXFאו CIPעם CPTנבדק לאחר 72שעות הדגרה. בגרף 4Bניתן לראות כי 10µg/ml) MXFאו (20µg/mlהניתן לבד כמעט ולא משפיע על התרבות התאים ) 8±0.2%ו ,14±0.5%-בהתאמה( .לעומת זאת ,שילוב של CPTעם MXFגרם לירידה משמעותית בהתרבותם .שילוב של 1nM CPTעם 20µg/ml) MXFו (10µg/ml-גרם לעיכוב בהתרבות התאים ב 44±2% -ו ,33±0.1% -בהתאמה ,בהשוואה ל 14±0.5%-עיכוב לאחר טיפול עם 1nM CPTלבד ) .(p<0.003ראוי לציין כי שילוב של ריכוז נמוך של (1nM) CPTעם 20µg/ml ) MXFגרף (4Bגורם לעיכוב בהתרבות התאים בדומה למתן ריכוז גבוה פי 50של (50nM) CPT לבד 44±0.2% :לעומת 45±2.1%בהתאמה) ,גרף .(p<0.001 ;4Aההשפעה המוגברת שנצפתה בשילוב התרופות אינה מתרחשת כאשר ריכוזי CPTעולים ל .10nM-עובדה זו מרמזת על כך כי ההשפעה האדיטיבית או הסינרגיסטית מתרחשת כאשר משתמשים בריכוזים סב-אינהיביטוריים של .CPT גרף 4Cמראה כי מתן CIPלבד מעכב את התרבות תאי HT-29בשיעור של 5.5±0.25%, 21±0.5%, 30±1%בריכוזים של ,10, 20 & 40µg/mlבהתאמה ).(p<0.0001 כאשר משווים את היכולת של CIPלהגביר את ההשפעה הציטוטוקסית של CPTניתן לראות כי ההשפעה של CIPפחותה בהשוואה ל .MXF-הוספת 40µg/ml CIPל 1nM CPT-גרמה ל36±1%- עיכוב בהתרבות התאים ,עיכוב דומה נצפה בהוספת 10µg/ml MXFלאותו ריכוז של CPT ).(33±1% 79 4.4.1בדיקת שיעור אפופטוזיס בתאי HT-29בעקבות טיפול עם CIP/MXFהניתנים לבד או בשילוב עם .CPT מבחן Annexin Vהיה השלב הבא על מנת לבדוק האם הירידה בהתרבות התאים שהתקבלה במבחן MTTהיא תוצאה של תהליך אפופטוזיס. תאי HT-29נחשפו ל 10-20µg/ml MXF ,5nM CPT-ו 20-40µg/ml CIP-לבד או בשילוב למשך 24שעות .בתום ההדגרה נצבעו תאי HT-29עם Annexin Vו.Propidium Iodide (PI)- 81 HT-29 בדיקת שיעור אפופטוזיס בתאי:15 'תמונה מס A MXF 20µg/ml Control CIP 40µg/ml 7.7% 8.9% 1.8% 2% 10% 2.2% 16% CPT 5nM CPT 5nM +MXF 20µg/ml 10.7% CPT 5nM + CIP 40µg/ml 17.5% % + MXF 20µg/ml 3.4% 2.3% + CIP 40µg/ml 2.8% B % Late apoptotic cells 20 ** ** ** 15 * 10 * * ** * * 5 0 MXF µg/ml CIP µg/ml CPT 5nM - 10 20 - - 20 40 - - + 10 + 20 - 20 40 + + + 24 הודגרו למשךHT-29 תאי.CPT מגבירים את ההשפעה הציטוטוקסית שלCIP- וMXF :15 'תמונה מס אנליזת פקס נעשתה לאחר.20-40µg/ml CIP או10-20µg/ml MXF לבד או בנוכחות5nM CPT שעות עם 81 קישור Annexin Vוקליטת . PIניסוי לדוגמא מוצג ב .A-אחוז התאים בשלבים המוקדמים של אפופטוזיס מצויים בצדו הימני התחתון של המרובע )צביעה חיובית ל Annexin V-ושלילית ל .(PI-אחוז התאים בשלבים המאוחרים של אפופטוזיס מצויים בחלקו הימני העליון של המרובע ) צביעה חיובית הן ל Annexin V-והן ל.(PI- ציר ה X-מראה את עוצמת הפלורוסנציה של Annexin Vוציר ה Y-מראה את עוצמת הפלורוסנציה של .PI ממוצע של 3ניסויים SE ±מוצג ב .B-מלבן מקוקו מייצג תאים ללא טיפול ,מלבן שחור מייצג תאים שטופלו עם ,MXFמלבן מנוקד מייצג תאים שטופלו עם CIPומלבן ללא מילוי מייצג תאים שטופלו עם *p<0.05.CPTתאים שטופלו עם CPTבהשוואה לביקורת ** p<0.05 .תאים שטופלו עם CPTו MXF-או CIPבהשוואה לתאים שטופלו עם .CPT חשיפת תאי HT-29ל MXF-בריכוז של 20µg/mlאו ל CIP-בריכוז של 40µg/mlכמעט ולא השפיעה על אחוז התאים המצויים בשלבים המאוחרים של אפופטוזיס )תמונה .(15 A & Bטיפול התאים עם CPTבריכוז של 5nMגרם לעלייה של פי 1.5באחוז התאים האפופטוטיים .שילוב של CPTעם MXFאו CIPגרם לעלייה נוספת באחוז התאים המצויים בשלבים המאוחרים של תהליך האפופטוזיס פי 1.5ו ,1.6-בהתאמה )) .(p<0.05זה פי 1.5-1.6ביחס לעליה של CPTלבד – שאף היא פי ?1.5אם כן כדאי להבהיר כי זה לא לחלוטין ברור( 4.4.2השפעת CIP ,MXFו CPT-על הפרשת ציטוקינים פרו-אנגיוגניים מתאי HT-29 תאי HT-29נזרעו בצלחות 35mmבריכוז של .1*106cells/mlהתאים נחשפו למשך 48שעות לריכוזים שונים של (20-40µg/ml) CIP ,(10-20µg/ml) MXFאו (1-20nM) CPTלבד או בשילוב .בתום ההדגרה ,נאסף הנוזל העליון לבדיקת נוכחות IL-8ו VEGF-בשיטת ה ELISA-כפי שתואר בשיטות המחקר. 82 גרף מס' :5השפעת CIP ,MXFעל הפרשת הפקטור הפרו-אנגיוגני IL-8המושרית ע"י CPT A No MXF MXF 10ug/ml 1200 MXF 20ug/ml * 800 * 600 ** ** ** **** ** ** ** ** 20 1 0 400 200 5 10 IL-8 Secretion pg/ml * 1000 0 CPT nM B No CIP CIP 40µg/ml 1000 800 * ** ** ** * ** 20 10 ** ** 5 600 * ** ** 1 400 * 200 0 IL-8 secretion pg/ml CIP 20µg/ml 1200 0 CPT nM גרף מס' :5השפעת MXFו CIP-על הפרשת IL-8מתאי .HT-29תאי HT-29בריכוז של 1*106/mlהודגרו למשך 48שעות עם ריכוזים עולים של CPTבהעדר או נוכחות (A) MXFאו .(B) CIPריכוז ה IL-8-נקבע באמצעות .ELISAהערכים המוצגים הם ממוצע SE ±של ארבעה ניסויים שבוצעו בדופליקט *p<0.05 .עבור תאים מטופלים לעומת דוגמת הביקורת **p<0.05 ,עבור תאים מטופלים עם CPT+MXFאו CPT + CIP לעומת תאים המטופלים עם CPTלבד. גרף 5 A & Bמראה כי MXFבריכוזים של 10-20µg/mlו CIP-בריכוזים של 20-40µg/ml גורמים לירידה משמעותית בהפרשה הספונטנית של הפקטור הפרו-אנגיוגני IL-8מתאי HT-29 ) .(p<0.01הדגרת התאים עם ריכוזים עולים של (1-20nM) CPTלמשך 48שעות גרמה לעלייה 83 משמעותית תלוית ריכוז בהפרשת ) IL-8עד פי .(p<0.01 ,1.85הוספת MXFבריכוז של 20µg/ml גרמה לירידה משמעותית בהפרשת IL-8שנגרמה עקב ההשפעה של CPTבריכוז של 48%) 20nM עיכוב .(p<0.01 ,עיכוב דומה ) 26%עיכוב (p<0.01 ,התקבל כאשר התאים טופלו עם CIPבריכוז של 40µg/mlו CPT-בריכוז של .20nMבנוסף -נבדקה גם ההשפעה של CIP ,MXFו CPT-על הפרשת VEGFמתאי .HT-29תוצאות קודמות הראו כי MXFגורם לירידה בהפרשה הספונטנית של CPT .VEGFו CIP -לא השפיעו כלל על הפרשת VEGFמתאי .HT-29 4.5השפעת טיפול משולב של MXFוריכוזים עולים של CPT-11על התפתחות גידולים ( )xenograftsבעכברי SCID לאור התוצאות שהתקבלו בניסויים ,in-vitroבהם נראה כי MXFמגביר את ההשפעה הציטוטוקסית של CPTמחד ,ומפחית את ההפרשה של פקטורים פרו-אנגיוגניים מאידך גיסא ,בוצעה סדרת ניסויים .in-vivoתאי HT-29הושתלו מתחת לעור עכברים מסוג ,SCIDלאחר מכן העכברים חולקו לקבוצות טיפול שונות כפי שתואר בשיטות המחקר ונעשה מעקב אחר התפתחות הגידולים ומשקל העכברים. 84 תמונה מס' :16טיפול משולב של MXFוריכוזים עולים של CPT-11על התפתחות גידולים בעכברי SCIDועל שינויים במשקלם. 85 תמונה מס' :16השפעת טיפול משולב של MXFוריכוזים עולים של CPT-11על התפתחות גידולים בעכברי SCIDועל שינויים במשקלם .עכברי SCIDהנושאים גידול הומאני חולקו ל 7-קבוצות .קבוצה :1קבוצת ביקורת ,לעכברים אלו הוזרק סליין .קבוצה :2העכברים קיבלו 3זריקות ליום אל חלל הבטן ) (i.p.של MXF במינון של .15mg/kgקבוצות :3-5העכברים קיבלו בימים 14 ,7ו 21-לאחר השתלת תאי HT-29זריקה לחלל הבטן של CPT-11במינונים של 35 ,20או ,50mg/kgבהתאמה .קבוצות :6-7העכברים קיבלו זריקות של MXFכמו קבוצה 2ובימים 14 ,7ו 21-זריקה של CPT-11במינונים של 20mg/kgאו ,35mg/kg בהתאמה (A) .גודל הגידול נמדד באמצעות קליפר 3פעמים בשבוע והנפח הממוצע של הגידול בעכברים שטופלו עם סליין (20-35mg/kg) CPT-11 ,MXF ,לבד או בשילוב מוצג כתלות בזמן לאחר השתלת תאי (B) .HT-29נפח הגידול ביום 23בעכברים שטופלו עם CPT-11במינונים של עד (C) .50mg/kgשינויים במשקל גוף העכברים חושבו ביום .23התוצאות המוצגות הן ממוצע * .SE ±מציין הבדל משמעותי לעומת קבוצת הביקורת ** .מציין הבדל משמעותי בין MXF + CPT-11לעומת n=10) .CPT-11עכברים לקבוצה(. התוצאות המוצגות הן צירוף התוצאות שהתקבלו משני ניסויים. התאים שהושתלו בעכברים התפתחו לגידול אשר גדל בצורה מהירה ,כך ש 7-ימים לאחר ההשתלה היה ניתן למשש גידול .הגידולים בקבוצת הביקורת התפתחו באופן פרוגרסיבי והראו גדילה אקספוננציאלית .נפח ממוצע של 1665 ± 142mm3הושג ביום ה 23-שהינו יום הקרבת החיות )תמונה .(16 A & Bטיפול עם CPT-11במינון של 20mg/kgעיכב את התפתחות הגידול בהשוואה לקבוצת הביקורת .ההשפעה המעכבת של CPT-11נראית החל מיום 15ומגיעה לעיכוב משמעותי ביום ה 23-בו נראה כי נפח הגידול קטן למימדים של 26.8 ± 3% ) 1219 ± 151mm3עיכוב, ) (p<0.02תמונה MXF .(16 A & Bהניתן כטיפול בודד גרם לעיכוב בהתפתחות הגידול למימדים של 31 ± 2% ) 1149 ± 154mm3עיכוב ( p<0.025 ,ביום 23בעוד שטיפול משולב של MXFעם CPT-11במינון של 20mg/kgגרם עיכוב משמעותי נוסף בנפח הגידול עד ל779 ± 112mm3 - ) (p<0.05 ,53 ± 3%בהשוואה לקבוצת הביקורת )תמונה .(16 A & Bעיכוב דומה בהתפתחות הגידול נצפה כאשר העכברים טופלו עם MXFבשילוב עם CPT-11במינון של 35mg/kgעד ל- 55 ± 3%) 754 ± 54mm3עיכוב (p< 0.005 ,בהשוואה לירידה לנפח גידול של 1192 ± 131mm3 ) 28 ± 2%עיכוב (p<0.025 ,בעכברים אשר טופלו עם CPT-11לבד) .תמונה .(16 A & B ראוי לציין כי טיפול משולב עם מינונים נמוכים של (20mg/kg) CPT-11ו MXF-גרם לעיכוב גדול 86 יותר בהתפתחות הגידול מאשר מינון גבוה פי 2.5של (50mg/kg) CPT-11הניתן לבד )(p<0.018 )תמונה .(16B כפי שתואר ע"י חוקרים אחרים ) (20,21גם בניסויים אלו כל העכברים שטופלו עם CPT-11סבלו משלשולים חמורים המלווים בירידה במשקל גופם .לעומת זאת ,עכברים מקבוצת הביקורת כמו גם העכברים שטופלו עם MXFהראו עלייה במשקל גופם ביום 4.1 ± 0.06%) 23ו,5.7 ± 0.03%- בהתאמה( )תמונה .(16Cתוספת של MXFלטיפול עם CPT-11מנע באופן משמעותי את הירידה במשקל לעומת עכברים שטופלו עם CPT-11לבד )תמונה (16C MXF 4.5.1מגביר את העיכוב בהתרבות התאים המושרה ע"י CPT-11בגידולים Ki-67הנו חלבון גרעיני הקשור בהתרבות תאים סומטיים .חלבון זה משמש כסמן אימונוהיסטולוגי להערכת התרבות תאים סרטניים .ירידה בביטוי החלבון Ki-67תואמת לתגובה לטיפול כימותרפי ).(22,23 87 תמונה מס' :17השפעת MXFו CPT-11-על ביטוי החלבון הגרעיני Ki-67 88 תמונה מס' :17השפעת MXFו CPT-11-על ביטוי החלבון הגרעיני .Ki-67חתכים מגידולים של עכברים המטופלים ב (A) -סליין CPT-11 (C) ,MXF (B) ,במינון של (D) ,20mg/kgשילוב של MXFעם 20mg/kg CPT-11 (E) ,CPT-11במינון של 35mg/kgאו ) (Fשילוב של MXFו ,35mg/kg CPT-11-נצבעו עם נוגדן כנגד Ki-67ולאחר מכן עם הצבע DABוצבע רקע עם המטוקסילין .ההגדלות בתמונות המוחדרות הן של X100ו- .X400הסליידים נבחנו תחת מיקרוסקופ אור Olympus Bx52והתמונות צולמו עם מצלמה דיגיטלית Olympus (G) .DP50כימות של תאים חיוביים לצביעה כנגד .Ki-67ארבעה שדות שונים בכל קבוצת ניסוי ) 4עכברים לקבוצה ,שני ניסויים( נלקחו לאנליזה והממוצע SE ±חושב * .מציין הבדל משמעותי לעומת קבוצת הביקורת** , מציין הבדל משמעותי בין CPT-11 + MXFלעומת CPT-11לבד ) n=8עכברים לקבוצה(. מספר התאים החיוביים לצביעה כנגד ) Ki-67בשטח ספירה של (0.8mm2היה באופן משמעותי גבוה יותר בחתכי הגידולים של העכברים ללא טיפול ) ,32 ± 2תמונה (17 Aלעומת חתכי הגידולים של העכברים שטופלו עם CPT-11במינון של ) 20mg/kgתמונה (17 Cאו עם CPT-11במינון של 35mg/kg )תמונה 22.3 ± 1.4) (17 Eו ,17.2 ± 1.7-בהתאמה( .ירידה משמעותית בתאים החיוביים נצפתה בחתכי הגידולים של העכברים שטופלו עם MXFלבד ) ,14.1 ± 1.2תמונה (17 B & Gאו בחתכי הגידולים של העכברים שטופלו עם שילוב של MXFעם ) 20mg/kg CPT-11תמונה (17 D & Gאו 35mg/kg )תמונה 11.4 ± 0.9 ) (17 F & Gו ,7.4 ± 0.9-בהתאמה.(p< 0.045 , התוצאות מראות כי MXFמגביר באופן משמעותי את ההשפעה המעכבת שיש ל CPT-11-על התרבות תאי ,HT-29שהם תאי הגידול הקסנוגרפטי בעכברים. Power Doppler Ultrasound imaging 4.5.2מראה כי טיפול עם MXFגורם לירידה בזרימת הדם בגידולים הקסנוגרפטים ההשפעה של MXFעל זרימת הדם נבדקה בסט אחד של ניסויים ) 6עכברים לקבוצה( באמצעות Power Doppler Ultrasound imagingכפי שתואר ).(16,17 89 תמונה מס' :18השפעת MXFעל זרימת דם בגידול 91 תמונה מס' :18מדידת זרימת הדם באמצעות Power Doppler Ultrasound imagingמראה כי MXFגורם לירידה בזרימת הדם בגידול הקסוגרפטי (A) .השוואה בתמונות האולטרה-סאונד שנלקחו מגידולים של עכברים הנושאים גידול קסנוגרפטי אשר טופלו עם סליין ,MXF ,או CPT-11במינונים של 20/35mg/kgלבד או בשילוב עם .MXFזרימת הדם מיוצגת ע"י הימצאות אזורים אדומים (B) .כימות של אנליזת הDoppler - * .Ultrasoundמציין הבדל משמעותי לעומת קבוצת הביקורת ** ,מציין הבדל משמעותי בין טיפול משולב של CPT-11 + MXFלבין טיפול עם CPT-11לבד ) 6עכברים לקבוצה(. אנליזת ה Power Doppler Ultrasound imaging-נעשתה ביום ה 23-לאחר השתלת תאי .HT-29 ניתן לראות בתמונה 18 Aאזורים בהם יש צבע בגידול ,אלו אזורים המציינים זרימת דם. תמונות 18A & Bמראות כי טיפול עם MXFלבד גרם לירידה דרסטית בזרימת הדם בגידול ל 15% ±6%-בלבד .הזרימה הקיימת בגידולים שטופלו עם סליין הייתה 11.2 ±1.7בעוד שבטיפול עם MXFהזרימה הייתה .(p<0.004) 1.9 ±0.7עכברים אשר טופלו עם CPT-11לא הראו שינויים בזרימת הדם המוגברת )במינון של (20mg/kgאו הראו עלייה קטנה אך משמעותית בזרימה )במינון של ) (35mg/kgתמונה .(18 Bטיפול משולב של MXFעם 20mg/kg CPT-11או עם 35mg/kg CPT- ,11הראה ירידה באזורים הצבעוניים עד ל 11.1± -ו ,16.2 ± 5.2 -בהתאמה ,לעומת טיפול עם CPT-11לבד ,במינונים השונים ) ,p< 0.001תמונה .(18 A & Bעל מנת לחשב את שיעור ההשפעה של ,MXFהשתמשתי בתוכנה ) (MICAהמאפשרת כימות של ה.Power Doppler signals- באמצעות תוכנה זו נבחנו בין 5-6עכברים לקבוצה .התוצאות מראות כי ל MXF-השפעה מעכבת משמעותית על זרימת הדם בגידול )תמונה .(18 A & B 91 4.5.3השפעת MXFעל ביטוי מולקולת הדבקה בתאי אנדותל)PECAM-1/CD-31( 1- מולקולת ההדבקה בתאי אנדותל (PECAM, CD-31) 1-הנה מולקולה השייכת למשפחת ה.Ig- מולקולה זו מבוטאת ביתר בחיבור שבין תאי האנדותל ,בטסיות דם וברוב הלויקוציטים. CD-31נחשבת למולקולה הנוטלת תפקיד ביצירת כלי דם חדשים ואנגיוגנזה )יצירה של כלי דם על כלי דם קיימים( ) .(83ניתן לזהות תאי אנדותל בכלי דם בגידולים ע"י צביעת חתכי הגידול עם נוגדן מונוקלונלי מסוג .rat anti-mouse mAb 92 תמונה מס' :19השפעת MXFו CPT-11-על ביטוי מולקולת CD-31בגידול תמונה מס' :19השפעת MXFו CPT-11-על ביטוי סמן אנגיוגני בגידולים ממקור תאי .HT-29תמונות מייצגות מצביעה אימונוהיסטוכימית של חתכי גידול שטופלו עם ) (Aסליין,20mg/kg CPT-11 (C) ,MXF (B) , ) 35mg/kg CPT-11 (E) ,20mg/kg CPT-11 + MXF (Dאו ).35mg/kg CPT-11 + MXF (F חתכי הגידולים נצבעו עם נוגדן כנגד PECAM/CD-31ולאחר מכן עם DABובצבע הרקע המטוקסילין כפי שצוין 93 בשיטות המחקר .ההגדלות של התמונות הן X100ו .X400-כימות של צפיפות הקפילרות נעשה ע"י ספירת כלי דם חיוביים ל CD-31-מארבעה שדות שונים בכל קבוצת ניסוי ) 4עכברים לקבוצה ,שני ניסויים( .הממוצע SE ±חושב ומוצג ב * .G-מציין הבדל משמעותי לעומת קבוצת הביקורת ** ,מציין הבדל משמעותי בין CPT-11 + MXF לעומת CPT-11לבד ) n=8עכברים לקבוצה(. צפיפות הקפילרות בחתכי הגידול של קבוצת הביקורת היה ) 30.3 ± 1.7תמונה .(19 A & Gבחתכי הגידול של העכברים שטופלו עם CPT-11צפיפות הקפילרות הייתה נמוכה יותר הן במינון של 20mg/kgבו הצפיפות הייתה ) 25.9 ± 0.8תמונה (19 C& Gאו עם מינון של 35mg/kgבו הצפיפות הייתה ) 27.8 ± 1.9תמונה .(19 E & Gטיפול העכברים עם MXFלבד גרם לירידה משמעותית בצפיפות הקפילרות לרמה של ) 9.3 ± 1.4תמונה (19 B & Gאו כאשר העכברים טופלו עם שילוב של MXFעם CPT-11במינונים של 20 / 35mg/kgבהם הצפיפות הייתה ,9.6 ± 0.7 / 12.7 ± 0.8 בהתאמה )תמונה .(p<0.05) (19 D , F & G MXF 4.5.4גורם לירידה ב IL-8-המושרה ע"י CPT-11בהומוגנט של גידולים ביום ה ,23-יום הקרבת העכברים ,הגידולים הוסרו וחתיכה מהגידול נלקחה לבדיקת נוכחות .IL-8 IL-8בהומוגנט נבדק באמצעות שיטת ה ,ELISA-כפי שתואר בשיטות המחקר. 94 גרף מס' :6ריכוז IL-8בהומוגנט של גידולי העכברים גרף מס' :6ריכוז IL-8בהומוגנט של גידולי העכברים .התוצאות המוצגות הן ממוצע n=9 ,SE ±עכברים לקבוצה * .מציין הבדל משמעותי לעומת קבוצת הביקורת ** ,מציין הבדל משמעותי בין CPT-11 + MXF לעומת CPT-11לבד. התוצאות בגרף מייצגות את ממוצע התוצאות של שני הניסויים .ניתן לראות כי טיפול העכברים עם CPT-11במינון של 20mg/kgגרם לעלייה משמעותית בריכוז הפקטור הפרו-אנגיוגני IL-8לריכוז של ) 1229 ± 257 pg/mlעלייה של פי 1.8לעומת הביקורת .(p<0.05 ,688 ± 81 pg/mlטיפול משולב של MXFעם CPT-11במינון של 20mg/kgמנע את העלייה בריכוזי ה IL-8-בהומוגנט .ריכוז ה- IL-8הגיע לרמה של ) 653 ± 62 pg/mlכמו קבוצת הביקורת.(p<0.05 , *הערה :להלן פירוט של התמונות והגרפים אשר פורסמו בעקבות עבודה זו: Fabian I. et al. Br. J. Cancer 2006; 95: 1038–1046. – Figs. 2 & 3. Reuveni D. et al. Int. J. Oncol. 2010; 37:463-471. Figs. 4-9 &Graphs 1-3. Reuveni D. et al. Biochem. Pharmacol. 2008; 75:1272-1281. Figs.10-15& Graphs 4-5. Reuveni D. et al. Biochem. Pharmacol. 2010; 79:1100-1107. Figs.16-19 & Graph 6. 95 .5דיון בתוצאות מחלת הסרטן מתפתחת במספר רב של חולים מדי שנה ומהווה למעשה היום את אחד הגורמים העיקריים לתמותה .קיים חיפוש מתמיד אחר תרופות וטיפולים חדשים על מנת לרפא ו/או להאריך ולשפר את איכות חייהם של חולים אשר לקו במחלה. טיפול משולב של מספר תרופות כימותרפיות נפוץ היום בטיפולים כנגד סוגי סרטן רבים ויש לו יתרונות רבים בהשוואה לטיפול עם תרופה אחת בלבד. אנזימי הטופואיזומראז ) Iו (II-מהווים אתר מטרה מצוין לתרופות כימותרפיות מאחר ובתאים סרטניים פעילות האנזימים מוגברת עקב קצב חלוקה גבוה של התאים ).(13 עבודת המחקר הנוכחית התמקדה בבחינת ההשפעות האנטי-סרטניות של הפלואורוקווינולון MXF בשילוב עם תרופות אנטי-סרטניות אחרות הפועלות כמעכבות של אנזימי הטופואיזומראז. העבודה התחלקה לשלושה חלקים בהם בחנתי את ההשפעות של MXFלבד או בשילוב עם VP-16 )מעכב של טופואיזומראז ,(IIאו עם CPTואירינוטקאן )) (CPT-11מעכבי טופואיזומראז .(Iההשפעה של MXFנבדקה הן בניסויים in-vitroוהן במודל עכברי .in-vivo בחלק א' של העבודה המטרה הייתה לחקור את מנגנון הפעולה של MXFהניתן כתרופה בודדת או בשילוב עם התרופה הכימותרפית VP-16כנגד האנזים טופואיזומראז ,IIומציאת הקשר בין עיכוב פעילות האנזים להשפעות הציטוטוקסיות של ,MXFהניתן לבד או בשילוב עם ,VP-16על תאים בתרבית. מחקר קודם שבוצע במעבדתנו הראה כי שילוב של MXFעם התרופה הכימותרפית VP-16הגביר את ההשפעות הציטוטוקסיות של התרופה ,אשר באו לידי ביטוי בעיכוב התרבות שורות תאי הגידול THP-1 ו ,Jurkat-עלייה בשיעור האפופטוזיס ועליה בשפעול קספאז .(97) 3 המחקר הנוכחי בוצע על שורת תאים ממקור סרטן המעי הגס ,תאי .HT-29שורת תאים זו מהווה מודל מחקרי יותר רלוונטי מבחינה קלינית המאפשר לחקור לעומק את ההשפעות התוך תאיות של MXFו- VP-16על האנזים טופואיזומראז ,IIכמו גם לבצע ספקטרום רחב של ניסויים על התרבות ,אפופטוזיס, מחזור התא ,שרשרת מעבר סיגנלים וביטוי של ציטוקינים פרו-אנגיוגניים בשורת תאים זו. תחילה נבדקה ההשפעה של MXFהניתן כתרופה בודדת או בשילוב עם VP-16על פעילות האנזים 96 טופואיזומראז IIמנוקה ממקור הומאני .פעילות האנזים נבדקה בריאקציה הבודקת את יכולת האנזים להתיר את הפלסמיד pUC19הנמצא במצב של ליפוף יתר .התוצאות שהתקבלו מראות כי היכולת של MXFלהשפיע על פעילותו של טופואיזומראז IIכאשר הוא ניתן כתרופה בודדת )בריכוז של 20- (40µg/mlהנה מוגבלת .לעומת זאת ,שילוב של MXFעם VP-16גרם לעלייה משמעותית בעיכוב פעילות האנזים .בנוסף ,ניסויים ביוכימיים הראו כי ניתן להתגבר על העיכוב הנצפה עם הוספת MXFרק ע"י העלאת ריכוז האנזים בתערובת הריאקציה ולא ע"י עלייה בריכוזי הסובסטרט .ממצא זה מרמז על כך ש MXF-גורם להגברת ההשפעות המעכבות של VP-16על טופואיזומראז IIע"י השפעתו על האנזים בצורה כזו שהאנזים "הופך להיות" רגיש /פגיע יותר לתרופה (98) Perrone et al .VP-16חקרו את העיכוב של טופואיזומראז IIע"י ארבעה קווינולונים וקרינה אולטרה-סגולה מסוג .(UVA) Aמחקרם הראה ש MXF -בריכוזים שונים עד לריכוז של ) 10mMריכוז השקול ל (4µg/ml-לא עיכב את האנזים בהעדר או נוכחות של הקרינה .UVAניתן להסביר אי התאמה זו ע"י כך שהחוקרים השתמשו בריכוזים שונים ונמוכים יותר של MXFמאשר בניסוי הנוכחי . בשלב הבא בעבודתנו בדקנו את ההשפעה של MXFהניתן כתרופה בודדת או בשילוב עם VP-16על הפעילות של טופואיזומראז IIהמופק מתאי .HT-29לשם כך הוכן מיצוי גרעיני מתאי ,HT-29מאחר ומיצוי זה מכיל הן את טופואיזומראז Iוהן את טופואיזומראז ,IIנבדקה השפעת התרופות ע"י מבחן דקטנציה ,מבחן הספציפי לטופואיזומראז .(99) IIגם בניסוי זה התוצאות הראו ש MXF -מגביר את ההשפעה המעכבת של .VP-16 היכולת של MXFלעכב את הפעילות של טופואיזומראז IIמנוקה ,בניסויים אשר נערכו ,in-vitro ולהגביר את ההשפעה המעכבת של ,VP-16אינה מעידה בהכרח על כך שהאנזים טופואיזומראז IIהוא אתר המטרה של MXFבתוך התא .על כן ,נבדקה השפעת 40µg/ml MXFעל פעילות האנזים התוך תאי של תאי HT-29כשהוא מוסף לתרבית התאים כתרופה בודדת או בשילוב עם ריכוזים עולים של .35-50µg/ml VP-16 עפ"י התוצאות שהתקבלו ניתן לראות כי MXFהגביר באופן משמעותי את העיכוב בפעילות טופואיזומראז IIהנגרם ע"י .VP-16על מנת לבדוק את אופן הפעולה בו טיפול משולב של MXFו- VP-16גורם לעיכוב בפעילות טופואיזומראז IIבתאים המטופלים ,בדקתי את היצירה של תצמידי 97 אנזים .(cleavage complexes) DNA-בזמן הרפיית ה DNA-ע"י טופואיזומראז ,IIהאנזים יוצר קשרים קוולנטיים זמניים עם ה .DNA-טיפול עם VP-16גורם לייצוב של אותם cleavage ,complexesלא מתאפשר תהליך של איחוי ה (relegation processes) DNA-וכך למעשה נוצרים שברים דו-גדילים ב ,DNA-אשר מכניסים את התא לתהליך של מוות אפופטוטי .בעזרת מבחן ה band depletion-ניתן לקבוע את כמות ה cleavage complexes-בין האנזים ל .DNA-התוצאות מראות כי כאשר התאים טופלו עם MXFלבד ,הייתה עלייה מועטה בכמות הcleavage complexes - לעומת דוגמת הביקורת .כאשר התאים טופלו עם MXFו VP-16-נצפתה הצטברות גדולה של תצמידי טופואיזומראז DNA-IIבהשוואה לטיפול עם VP-16כתרופה בודדת .הסבר אפשרי לעלייה בתצמידים אלו הוא היכולת של MXFלהגביר )ולו גם במעט( את תצמידי האנזים .DNA-ההגברה הנצפית במתן המשולב של התרופות יכולה לנבוע על כן מההשפעות האדיטיביות של שתי התרופות או לחלופין ,עקב שינויים בתצורה /מבנה האנזים בהשפעת ,MXFאשר מאפשרים או גורמים ליצירה מוגברת של cleavage complexesבנוכחות של .VP-16 חשוב לציין כי הצטברות של cleavage complexesבין טופואיזומראז DNA– IIתגרום להגברת הרעילות של טיפול משולב של MXFעם .VP-16לכן ,בחנתי גם את תפקוד האינטראקציה בין שתי התרופות ע"י בדיקת השפעתן על הפעילות הציטוטוקסית בתאי .HT-29 במבחן MTTהבודק את התרבות התאים ,מצאתי כי טיפול התאים עם 20µg/ml MXFגורם לעיכוב מתון בהתרבות התאים ) .(11% ± 0.02%לעומת זאת ,כאשר הפלואורוקווינולון הוסף לטיפול עם ,VP-16הייתה ירידה משמעותית בהתרבות התאים .סביר להניח כי ההשפעה האנטי-פרוליפרטיבית של MXFבשילוב עם VP-16היא תוצאה של השפעה משולבת של התרופות על האנזים טופואיזומראז כפי שנצפה בניסויים הקודמים. מחקרים שונים מראים כי תאים הנחשפים לטיפול עם VP-16נעצרים בשלב ה G2M-במחזור התא )בריכוזים של .(96) (0.1-0.5µg/mlבניסויים בהם בדקתי את השפעת MXFבשילוב עם VP-16על מחזור התא ,מצאתי כי טיפול תאי HT-29עם VP-16גרם לעצירת התאים ב G2M-במחזור התא כמו גם לעלייה באחוז התאים הנמצאים ב ,Sub G1-הוספת MXFלריכוזים גבוהים יותר של 2.5-) VP-16 (5µg/mlגורמת לירידה באחוז התאים המצויים בשלב ה .G2M-תוצאה זו תואמת את התוצאות 98 שהתקבלו במחקר של (96) Jahnke et alאשר מראה כי חשיפת תאי K562לריכוז של VP-16 1µg/mlגרם לעצירה בשלב G2Mבמחזור התא ,בעוד שחשיפה לריכוזים גבוהים יותר ) (20µg/mlלא נצפתה עצירה במחזור התא. במחקר הנוכחי בדקתי את ביטויו של החלבון Survivinבתאים אשר טופלו בתרופות MXFו.VP-16- חשיפת התאים ל VP-16-גרמה לעלייה בביטוי החלבון ,לעומת זאת הוספת MXFגרמה לירידה בביטויו .ברקמות ממוינות Survivinכמעט ולא ניתן לגילוי .ישנם מחקרים שמראים כי Survivin מבוטא במספר סוגי סרטן ,בניהם סרטן המעי הגס ) .(57,100-102בדומה לממצאים שקיבלתי ,מחקרים מראים שישנו ביטוי יתר של החלבון Survivinבתאים סרטניים שנחשפו למגוון של תרופות אנטי- נאופלסטיות ,כמו אדריאמיצין וטקסול ).(102 הביטוי של החלבון Survivinמבוקר בתלות במחזור התא ,עם עלייה בולטת בשלב ה.(99,103) G2M- ניתן להסביר את העלייה בביטויו של החלבון Survivinבעקבות טיפול עם VP-16בגלל העובדה ש- VP-16גורם לתאים להעצר בשלב ה G2M-במחזור התא. הסבר אפשרי לירידה בביטוי החלבון ,שנצפתה בניסויים שערכתי לאחר חשיפת תאי HT-29לשילוב של VP-16ו ,MXF-יכול להיות ירידת אחוז התאים העצורים בשלב ה G2M-ועלייה באחוז התאים בשלב ה sub-G1-הנגרם ע"י שימוש משולב בתרופות. לבסוף ,בחלק זה של העבודה ,בדקתי את שיעור האפופטוזיס לאחר חשיפת התאים לטיפול משולב של MXFו .VP-16-בניסויים בהם בדקתי את שפעול קספאז ,3מרכיב חשוב בתגובת התא לאי יציבות גנומית הנגרמת ע"י שילוב התרופות ,נמצא כי תאים שטופלו עם MXFו VP-16-הראו עלייה בפעילות האנזים .ניתן להסביר את התוצאות ע"י כך שמופעלים מנגנוני פעולה שונים כנגד האנזים טופואיזומראז .IIכל למשל (104) Bromberg et alהראו כי VP-16מעכב את היכולת של טופואיזומראז IIלבצע איחוי )ליגציה( למולקולות DNAשעברו ביקוע ,בעוד שקווינולונים כמעט ולא משפיעים על ליגציה אך מעודדים את טופואיזומראז IIלבקע .DNAשני מנגנונים שונים אלו יכולים לעבוד במקביל וכך לגרום לאדיטיביות /סינרגיסטיות בהשפעות הציטוטוקסיות של VP-16ו.MXF- מחקרים מראים כי טיפול עם VP-16כתרופה בודדת כנגד סרטן המעי הגס הינו טיפול לא יעיל )105- (106אך שילובו עם מיטומיצין Cהניב תוצאות טובות כנגד שלבים מתקדמים של סרטן המעי הגס 99 ) (107ובגידולים של הקיבה והמעיים ) ,(108-109גידולים מטסטטיים של השד ) (110ובקרצינומות מטסטטיות ממקור לא ידוע ) .(111מחקרים קליניים בסרטן המעי הגס הראו כי טיפול משולב של VP-16עם תרופות נוספות ,בעיקר ציספלטין ,הניב תגובה קלינית חלקית אשר האריכה במעט את חיי החולים או ייצב את מצב מחלתם ).(112-113 במחקר הנוכחי הראינו כי חשיפת תאי HT-29ל VP-16-גורמת לעלייה בהפרשת הציטוקין הפרו-דלקתי והפרו-אנגיוגני MXF .IL-8גרם לעיכוב משמעותי בהפרשה המוגברת שנצפתה לאחר טיפול ב.VP-16- ממצא זה מאמת מחקרים קודמים שבוצעו במעבדתנו אשר הראו כי MXFגרם לעיכוב משמעותי בהפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים בתאי THP-1ובמונוציטים מדם פריפרי שעברו גירוי עם LPS- (114) phorbolmyristateאו עם נבג הפטרייה .(115) Aspergillus fumigatesלהשפעה המשולבת של MXFבעיכוב הפרשת IL-8עקב טיפול עם VP-16כמו גם בעיכוב ההפרשה הספונטנית של VEGFמתאי HT-29הבט חשוב בפעילות IL-8 .MXFו VEGF-הנם פקטורים פרו-אנגיוגניים אשר נמצאו קשורים להתפתחות גידולים עם נטייה גדולה יותר לפתח גרורות ,ואילו עיכובם הראה השפעה חיובית בשני הפרמטרים ).(116-117 לסיכום ,חלק זה של המחקר מראה כי ל MXF-תפקיד חשוב בהגברת ההשפעות הציטוטוקסיות של VP-16בשורת תאי .HT-29העובדה ש MXF-גורם לירידה משמעותית בהפרשת הציטוקין IL-8אשר עולה בטיפול עם VP-16חשובה במיוחד כיוון שהפרשה מוגברת זו יכולה להזיק במהלך טיפול כימותרפי .עלייה בביטוי החלבון IL-8יכולה להוביל לעמידות בפני טיפול כימותרפי .עמידות זו מתפתחת הודות לעובדה שביטוי יתר של IL-8גורם לתגבור בפעילות פקטור השעתוק .NF-κBכתוצאה מכך ישנו ביטוי יתר של חלבונים המשתייכים למשפחה של חלבונים אנטי-אפופטוטים הגורמים לעמידות מפני טיפול כימותרפי ,בין החלבונים נמנים BCl-2ו.Survivin- בעבודתנו חקרנו בנוסף למתואר עד כה ,את מנגנון הפעולה של MXFבשילוב עם התרופה הכימו- תרפויטית ,CPTכנגד האנזים טופואיזומראז Iומציאת הקשר בין עיכוב פעילות האנזים להשפעות הציטוטוקסיות של MXFעל תרבית תאים .חשוב לציין שמנגנון הפעולה של CPTהוא ע"י עיכוב של האנזים טופואיזומראז .Iמעט ידוע ,אם בכלל ,על מעורבות של קווינולונים עם אנזים זה .לכן היה חשוב לבדוק פלואורוקווינולון נוסף ,CIP ,על השפעתו על האנזים טופואיזומראז Iכמו גם על ההשפעות 111 הציטוטוקסיות שלו. הממצא העיקרי של חלק זה הוא ,ששני פלואורוקווינולונים MXF ,ו ,CIP-אשר ידועים בספציפיות שלהם לפעול כנגד טופואיזומראז IIופעילים גם כנגד טופואיזומראז IIהאאוקריוטי ,כפי שהראיתי בחלקו הראשון של המחקר ,יכולים גם לעכב במעט את פעילות האנזים טופואיזומראז Iהאאוקריוטי, ובאותה עת להגביר באופן משמעותי את ההשפעות הציטוטוקסיות של .CPT התוצאות מראות כי MXFאו CIPהניתנים כתרופות בודדות )בריכוזים של (20-40µg/mlמעכבים במעט את פעילותו של טופואיזומראז Iבריאקציה הבודקת את יכולת האנזים להתיר את הפלסמיד .pUC19שילוב הפלואורוקווינולונים עם CPTגרם להגברה בהשפעה המעכבת של תרופה אנטי- סרטנית זו על פעילות טופואיזומראז .Iבנוסף ,מצאתנו גם במקרה זה ,שניתן להתגבר על ההשפעה המעכבת רק כאשר מעלים את ריכוז האנזים בריאקציה ולא כאשר מעלים את ריכוז הסובסטרט .תוצאה זו מחזקת את הטענה כי השפעת הפלואורוקווינולונים היא ברמת האנזים ,כלומר ,התרופות משפיעות כך שהן "גורמות" לאנזימים להיות יותר רגישים לתרופות הכימו-תרפויטיות .עם זאת ,מכיוון שידוע כי קווינולונים נקשרים ל (118) DNA-ישנה אפשרות כי עצם קישורם אל ה" DNA-מקל" על הקישור של CPTאל הקומפלקס טופואיזומראז . DNA-I השלב הבא בעבודתנו היה לבדוק האם גם במקרה זה ,כמו במקרה של טופואיזומראז ,IIההשפעה המעכבת של הפלואורוקווינולונים מתקיימת כאשר האנזים המופק מהתאים נחשף לתרופות או כאשר התאים נחשפים לפלואורוקווינולונים כתרופה בודדת או בשילוב עם .CPTהתוצאות מראות כי הן MXF והן CIPמעכבים במעט את פעילותו של טופואיזומראז Iהמצוי במיצוי הגרעיני של תאי ,HT-29בעוד ששילובם עם CPTגרם להגברת השפעתו המעכבת .חשיפת תאי HT-29ל 20µg/ml MXF -או 20µg/ml CIPלא גרמה לעיכוב בפעילות האנזים .טיפול עם 2.5mM CPTגרם לעיכוב מועט ,אך שילוב של MXFאו CIPעם CPTגרם להגברת העיכוב בפעילות האנזים) ,עד 82±6%עיכוב בשילוב עם MXFועד ל 50±7%-לעיכוב בשילוב עם CIPלעומת CPTלבד(. בדקנו את האינטראקציה הפונקציונאלית של התרופות ע"י בחינת הציטוטוקסיות שלהם בתאי HT-29 באמצעות מבחן ה ,MTT-ומצאנו ש MXF-או CIPהניתנים לבד )בריכוז של (20µg/mlגורמים לעיכוב בהתרבות התאים בשיעור של 14% ± 0.1%ו 21% ± 0.5%-בהתאמה .לעומת זאת ,כאשר 111 הפלואורוקווינולונים הוספו ל ,CPT-הייתה ירידה משמעותית בהתרבות התאים .לאור זאת -סביר להניח כי ההשפעה האנטי-פרוליפרטיבית של הפלואורוקווינולונים בשילוב עם CPTהנה תוצאה של השפעת התרופות על טופואיזומראז .I CPTונגזרותיו נמצאים היום בשימוש במספר רב של סוגי סרטן ,בניהם סרטן ריאות ,מעי גס ,שחלה, שלפוחית השתן וסרטן הקיבה ) .(119-120למרות זאת ,ל CPT-רעילות גבוהה ולכן יש מגבלה של מתן מינונים גבוהים ,על כן מחפשים היום מודולטורים אשר יאפשרו תגובה למינונים נמוכים של .CPT מחקרים מראים כי טיפול משולב של אירינוטקאן ) ,(CPT-11שהנו נגזרת של ,CPTבמינונים נמוכים עם ציספלטין היה יעיל מאוד בחולים עם סרטן מטסטטי של המעי הגס ,קיבה וכיס מרה ).(121-123 תגובה של עד 50%נצפתה בחולים עם סרטן מטסטטי של המעי הגס לאחר טיפול משולב של CPT-11 עם 5-FUואוקסליפלטין ).(115-116 אנטיביוטיקות מסוג פלואורוקווינולונים נחשבות לתרופות בטוחות ולא רעילות והן ניתנות לבליעה דרך הפה .לאור זאת ,כל שילוב שלהן עם תרופות כימו-תרפויטיות כגון ,CPTשיאפשר אדיטיביות או סינרגיזם כנגד הגידול ,הינו בעל יתרון מאחר ואין בו תוספת רעילות כפי שקיים בשילובים בין תכשירים כימו-תרפויטים שונים כגון אלה שצוינו לעיל ) CPTבשילוב עם ציספלטין ונגזרותיו(. מחקרים שבוצעו לאחרונה מראים כי ישנם מספר פלואורוקווינולונים אשר מעכבים גדילה של מספר סוגי תאים סרטניים כמו תאי לאוקמיה ,osteoblast –like MG-63 human osteosarcoma ,תאי סרטן משלפוחית השתן והערמונית ותאי סרטן המעי הגס ) .(127-131 ,37המחקר הנוכחי ,למיטב ידיעתי ,הנו המחקר הראשון הבוחן את האינטראקציה של MXFו CIP-עם הפעילות הציטוטוקסית של ,CPT והראשון להראות את ההשפעה המשולבת על עיכוב האנזים טופואיזומראז .Iבנוסף ,עפ"י התוצאות שהתקבלו ,ניתן לאמת את ההשפעות האנטי-פרוליפרטיביות ע"י כך שנצפתה הגברה משמעותית בשיעור האפופטוזיס ע"י שילוב התרופות בתאי .HT-29ממצא חשוב ,שראוי לציין ,הוא העובדה ששילוב של ) 1nM CPTריכוז נמוך( עם 20µg/ml MXFאו 40µg/ml CIPגרם לעיכוב בהתרבות התאים בשיעור דומה לזה שגרם ) 50nM CPTריכוז שבוה פי (50הניתן לבד .ממצא זה יכול לרמז כי הפלואורוקווינולונים יכולים להפחית את הציטוטוקסיות של .CPTהביטוי של תופעה זו בקליניקה הוא האפשרות לא להעלות את מינון התרופה הציטוטוקסית ,המלווה בתופעות לוואי קשות ,וכך לאפשר מתן 112 מינון נמוך יותר של התרופה הציטוטוקסית בשילוב עם אחת מהאנטיביוטיקות MXFאו , CIPשלהן מקדם בטיחות גבוה ,ולקבל את אותה ההשפעה האנטי-סרטנית עם תופעות לוואי מופחתות ורעילות נמוכה יותר )" .(cytotoxic-drug "sparing effectחשוב להדגיש את העובדה שהריכוזים של MXF ו CIP -אשר נבדקו במחקר הנוכחי הנם ריכוזים ברי השגה במספר רקמות כמו המעי הגס ,שלפוחית השתן ,ערמונית וריאה לאחר טיפול במתן דרך הפה של MXFאו .CIP בבחינת השפעת התרופה ,CPTהראינו שכאשר תאי HT-29טופלו עמה ,הייתה הפרשה גבוהה יותר של הציטוקין הפרו-דלקתי והפרו-אנגיוגני IL-8ושטיפול עם MXFאו CIPעיכב הפרשה מוגברת זו. תוצאה זו תואמת את התוצאות שהתקבלו הן בחלק הראשון של המחקר הנוכחי והן בתוצאות של מחקרים קודמים במעבדתנו בהם נמצא ש MXF-גרם לעיכוב בשפעול של Nuclear Factor-κBוmitogen-- ) activated protein kinase (MAPKבתאי THP-1ובשורת תאים אפיתליאלים של מערכת הנשימה אשר הוביל בין השאר גם לעיכוב בהפרשת .(114,91) IL-8 ממצא תומך נוסף הוא מחקר in vivoבעכברים שבוצע בעבר במעבדתנו ,ובו נמצא כי טיפול אימונוסופרסיבי בעכברים ע"י cyclophosphamideוהדבקה עם הפטרייה Candida albicansגרם להתפתחות של דלקת ריאות חריפה בעוד שקבוצת העכברים שטופלה בנוסף עם ,MXFשמרה על אחוז תמותה נמוך ,משקל תקין והעכברים לא פיתחו דלקת ריאות .כאשר נבדק ריכוז הציטוקינים הפרו- אינפלמטוריים ברקמת הריאות של החיות המטופלות ,נמצא כי ריכוז ה IL-8 -ו TNF-α -היה נמוך בהשוואה לחיות המודבקות שלא טופלו ב .MXF-בבדיקה אימונוהיסטוכימית של רקמת הריאה נמצא כי הייתה ירידה במעבר פקטור השעתוק NF-κBאל הגרעין של תאי הריאה האפיתליאלים ),114-115 .(91 לסיכום ,בחלק זה של העבודה הנוכחית ניתן לראות כי MXFו ,CIP-שני פלואורוקווינולונים בטוחים לשימוש ,מגבירים את ההשפעה הציטוטוקסית של CPTויחד עם זאת מפחיתים את ההפרשה של ציטוקין פרו-דלקתי מהתאים ,אשר יכול להפריע במהלך טיפול כימותרפי .התוצאות מראות שמתן MXFאו CIP מגבירים את הפעילות הציטוטוקסית ומפחיתים תופעות לוואי .בנוסף ,מתן מינונים נמוכים יותר של כימותרפיה יהיה אפשרי כאשר יינתנו בשילוב עם MXFאו .CIP בחלק השלישי של העבודה הייתה מטרתנו העיקרית לבדוק במודל in-vivoאת ההשפעה של MXF 113 הניתן לבד או בשילוב עם אירינוטקאן ) (CPT-11על התפתחות גידולים בעכברות שהוזרקו להן תאי ) HT-29מודל .(Xenograft התוצאות מראות של MXF-עצמו יש השפעה אנטי-פרוליפרטיבית ואנטי-אנגיוגנית על הגידולים שהתפתחו בעברי ה .SCID-בנוסף MXF ,הגביר באופן משמעותי את ההשפעה האנטי-סרטנית של CPT-11כפי שנצפה במדידות של גודל הגידול כמו גם בצביעה האימונוהיסטוכימית כנגד החלבון הגרעיני .Ki-67יתר על כן ,נצפתה השפעה קלינית חשובה כאשר MXFהניתן כתרופה בודדת או בשילוב עם CPT-11ביטל או שיפר את איבוד משקל הגוף המשמעותי של החיות שטופלו עם CPT-11 בלבד. אם מעריכים את השפעת הפלואורוקווינולון בסוף הטיפול רואים ששילוב של MXFו CPT-11-גרמו לירידה של פי 2-בגודל הגידול ,לירידה של 68-81%בזרימת הדם אל הגידול ועלייה במשקל בהשוואה לטיפול עם CPT-11לבד .יתרה מזו ,טיפול עם MXFלבד הראה ירידה משמעותית בהתפתחות הגידולים כמו גם להשפעה דרסטית )ירידה של (85%בזרימת הדם אל הגידול כפי שנמדד באמצעות .Power Doppler מחקרים קודמים שבוצעו על ההשפעות האנטי-פרוליפרטיביות של פלואורוקווינולנים בסרטן התרכזו בעיקר בהשפעות in-vitroבמספר שורות תאים .הפלואורוקווינולונים MXF ,CIPוTrovafloxacin- עיכבו in-vitroאת התרבות תאי סרטן משלפוחית השתן ,סרטן המעי הגס ,ערמונית ובשורת תאים סרטניים THP-1ו(38-40 ,36 ,126) Jurkat- מחקר יחיד שבוצע in-vivoהראה פעילות אנטי-סרטנית של Trovafloxacinבעכברים עם נויטרופניה החולים בדלקת ריאות ושהוזרקו להם תאים סרטניים מסוג לאוקמיה ממקור עכברי .התרופה הראתה יעילות במניעת התפתחות של גרורות למספר איברים ובהארכת חיות העכברים ).(39 קבוצות מחקר סנתזו אנלוגיים לקווינולונים עם פעילות יותר חזקה כנגד האנזים טופואיזומראז IIכמו ,(134) piperazynil quinolones ,(133) tricyclic quinolonesותרכובות מורכבות יותר )135- .(136תרכובות אלו הראו פעילות אנטי-סרטנית במספר שורות תאים וחלק הראה פעילות אנטי- פרוליפרטיבית במודלים של חיות ) .(41יש לציין שאותן תרכובות הן תרכובות ניסיוניות בניגוד לפלואורוקווינולונים MXFו ,CIP -הנמצאים בשימוש קליני רחב. 114 ממצאים בחלק זה של עבודת המחקר מאמתים את הממצאים שהתקבלו בעבודה in-vitroבה הראינו פעילות אנטי-סרטנית של MXFלבד או בשילוב עם תרופות כימותרפיות שונות. ניתן לראות כי יש הגברה בהשפעה הציטוטוקסית של שילוב MXFעם ,CPT-11המודגמת בירידה במימדיי הגידול בעכברים המטופלים עם שתי התרופות ,לעומת כל תרופה הניתנת בנפרד .בנוסף ,צביעה של החלבון הגרעיני Ki-67מראה ירידה משמעותית במספר התאים החיוביים בחיות שטופלו בשילוב התרופות בהשוואה לכל תרופה לבד ,וכך למעשה ניתן להסיק כי MXFמגביר באופן יעיל את העיכוב בהתרבות התאים בתוך הגידול הנגרם ע"י .CPT-11ראוי לציין שההשפעה של מתן MXFעם מינון נמוך של (20mg/kg) CPT-11הייתה דומה ואפילו טובה יותר מההשפעה של מתן 50mg/kg CPT-11לבד .תוצאה זו ממחישה את הפוטנציאל של "חסכון ברעילות השפעת התרופה הציטוטוקסית" כאשר ניתן .MXFלמעשה אותו "חסכון" הודגם בתוצאות שהתקבלו .העכברים שטופלו עם CPT-11לבד סבלו משלשולים חמורים והראו איבוד משמעותי במשקל .לעומת זאת ,עכברים אשר טופלו עם MXFלבד או שילב של MXFעם CPT-11לא סבלו משלשולים כלל ומשקלם היה זהה לזה של קבוצת הביקורת. הממצא החשוב ביותר בחלק זה של העבודה הוא ההשפעה האנטי-אנגיוגנית הבולטת של MXFהן כאשר ניתן לבד והן כאשר ניתן בשילוב עם .CPT-11בחרנו בשיטת ה Power Doppler Ultrasound-על מנת להמחיש ולכמת את השפעת MXFעל זרימת הדם אל הגידול ולנטר במדויק על ההשפעה האנטי- אנגיוגנית .קבוצות החוקרים (94) Gee et alו (137) Donnelly et al-השתמשו בשיטה זו על מנת לכמת את זרימת הדם בגידול במודלים עכבריים עם השתלה מסוג xenograftשל מלנומה ,קרצינומה של הכליה וגליובלסטומה .היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לכמת באופן מדויק את זרימת הדם בגידול ואת פיזור כלי דם בפאזות שונות של הגידול .בנוסף ,המחקרים הראו קורלציה חזקה בין התוצאות שהתקבלו ב Power Doppler Ultrasound-לבין הממצאים שהתקבלו בשיטות משלימות הכוללות מדידת גודל גידול ,הסתכלות על כלי דם in vivoשנצבעו עם לקטין המחובר לחומר פלואורוסנטי באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ,וצביעות אימונוהיסטוכימיות .במחקר הנוכחי השלמנו את הממצאים שהתקבלו בשיטת ה Power Doppler Ultrasound-ע"י צביעה אימונוהיסטוכימית של חתכי גידול עם נוגדן כנגד הסמן ,CD31סמן המאפשר לזהות תאי אנדותל המצפים כלי דם .התוצאות מראות קורלציה 115 חזקה בין שתי השיטות שהוזכרו לעיל .נמצאה ירידה משמעותית של 85%בזרימת הדם בגידול בחיות שטופלו עם MXFלבד בהשוואה לקבוצת הביקורת שטופלה עם סליין .חיות שטופלו עם CPT-11בלבד לא הראו ירידה בזרימת הדם ,לעומת זאת ,תוספת של MXFגרמה לירידה משמעותית בזרימת הדם ) .(68-81%השפעה זו הייתה צפויה לאור התוצאות שהתקבלו בניסויים in-vitroבהם הראינו שMXF- גרם לירידה משמעותית בהפרשת הפקטור הפרו-אנגיוגני IL-8כמו גם VEGFמתאי .HT-29חשוב לציין שטיפול עם 20mg/kg CPT-11גרם לעלייה בכמות ה IL-8-כפי שנמדדה באמצעות ELISA בהומוגנט של הגידולים ותוספת של 45mg/kg MXFגרם לעיכוב בעלייה זו )גרף מס' .(6 ההשפעה האנטי-אנגיוגנית שנצפתה היא בעלת משמעות קלינית רבה כהשלמה להשפעה האנטי-סרטנית במהלך טיפול עם שילוב התרופות .למיטב ידיעתנו ,זו הפעם הראשונה בה מראים השפעה אנטי-אנגיוגנית של הפלואורוקווינולון MXFאו פלואורוקווינולונים אחרים במודל גידול .in-vivo מספר חוקרים חקרו את ההשפעות האנטי-אנגיוגניות של CPT-11לבד או בשילוב עם תרופות אחרות. (138) Bocci et alחקרו את ההשפעה של מתן ריכוז גבוה של 100mg/kg=maximal ) CPT-11 (tolerated dose-MTDהניתן כל 7ימים בהשוואה לטיפול יומי עם ) CPT-11סה"כ מינון של 28% מהמינון ,(MTDאו מתן ריכוז גבוה של 100mg/kg CPT-11באופן חד פעמי ולאחר מכן טיפול יומי עם מינונים נמוכים יותר בעכברים הנושאים גידול xenograftשמקורו מהשתלת תאי .HT-29ניתוח התוצאות שהתקבלו מצביעת הסמן CD-31מראות כי הייתה ירידה לא משמעותית בכל שלושת הקבוצות בעוד שמימדי הגידול קטנו בכל שלושת סוגי הטיפולים .ראוי לציין כי במחקר הנוכחי ,השתמשתי בריכוזים נמוכים יותר של ,CPT-11שניתן כל 7ימים ) (20 & 35mg/kgובדומה ל Bocci et al-לא נראתה השפעה על ביטוי CD-31בקבוצות שטופלו עם CPT-11לבד .השימוש בריכוזים נמוכים של CPT-11יכול להסביר את חוסר ההשפעה של התרופה על זרימת הדם בגידול כפי שקיבלתי במדידות באמצעות ה .Power Doppler Ultrasound-מחקר חשוב נוסף הוא מחקרם של Wildiers et al ) ,(139אשר חקרו את מידת הספיגה של CPT-11בגידול ,לאחר מתן מנה בודדת של 100mg/kg בהזרקה , i.pבחיות הנושאות גידול שמקורו מהשתלת תאי HT-29ואשר קיבלו טיפול מקדים עם . anti VEGF-mAbכטיפול אנטי-אנגיוגני .למרות הירידה המשמעותית בצפיפות כלי הדם בגידול לאחר טיפול עם ,anti-VEGF mAbלא נצפתה ירידה ואפילו הייתה עלייה קטנה במידת הספיגה של CPT-11 116 ע"י הגידול .נראה לכן ,שירידה בזרימת הדם הנגרמת ע"י מתן תרופות /חומרים אנטי-אנגיוגניים אינו פוגע בזמינות /נגישות וריכוז התרופה האנטי-סרטנית CPT-11בגידול. שילובים של CPT-11יחד עם תרופות אנטי-אנגיוגניות נחקרו והם משמשים כיום כטיפול בסרטן המעי הגס הנמצא בשלב מתקדם ובמספר ממאירויות אחרות ) .(143-144 ,140-141הטיפול הנפוץ ביותר הוא שילוב של ) bevacizumab (Avastin 1ו CPT-11-בסרטן גרורתי של המעי הגס וטיפולים אלו הראו תוצאות טובות יותר באופן משמעותי בהשוואה לטיפולים ללא .(141-142) bevacizumabתוצאות מבטיחות התקבלו גם בטיפול של גידולי גליומה עם שילוב של CPT-11עם .(143) bevacizumab בעבודה הנוכחית הראינו ,שניתן להשיג את אותם יתרונות ע"י שילוב של MXFעם CPT-11 המבוססים על ההשפעה האנטי-אנגיוגנית הבולטת של טיפול הכולל בתוכו את ,MXFוההשפעה הציטוטוקסית המשמעותית של שילוב התרופות בהפחתת גודל הגידול. לאור העבדה שיש בקליניקה ניסיון רב עם הפלואורוקווינולון ,MXFבנוסף לבטיחות שלה ,יחד עם ההשפעה המשמעותית שלה בהפחתת הרעילות של ) CPT-11מניעה של שלשולים ואיבוד משקל( יש צורך בהמשך חקירת השימוש שלה כתוספת יעילה בטיפול של סרטן המעי הגס וממאירויות אחרות. 117 .6סיכום עבודת המחקר התמקדה בהשפעות האנטי-סרטניות והאנטי-אנגיוגנית של MXFהניתן בשילוב עם תרופות אנטי-סרטניות אחרות. המחקר הנוכחי מוכיח שלפלואורוקווינולון ,MXFמעבר להיותו אנטיביוטיקה בטוחה לשימוש ובעל השפעות אימונומודולטוריות אשר הוכחו בעבר ,יש לו השפעה אנטי-סרטנית והשפעה אנטי-אנגיוגנית. ההשפעה האנטי-סרטנית של MXFבאה לידי ביטוי בהגברה משמעותית של האפקטים הציטוטוקסיים הן של VP-16והן של MXF .CPTגרם להגברה בעיכוב התרבות התאים ,הגברת שפעול קספאז 3ועלייה בשיעור האפופטוזיס .ניתן להסביר את התופעות האלו עפ"י התוצאות שהתקבלו בניסויים האנזימתיים בהם הראינו ש MXF-משפיע על פעילות האנזימים טופואיזומראז Iו .II-תוספת של MXFלטיפול עם תרופות כימותרפיות חשובה היות וכך יהיה ניתן להשיג את אותן השפעות ציטוטוקסיות אך עם מתן מינונים נמוכים יותר של התרופות האנטי-סרטניות .מינונים גבוהים של תרופות אנטי-סרטניות מהווה מגבלה קשה בטיפול כנגד סרטן בגלל הרעילות הגבוהה שלהן. ההשפעה האנטי-אנגיוגנית של MXFנצפתה בניסויים ,in-vitroבהם הייתה הפחתה/מניעה של הפרשת ציטוקינים פרו-אנגיוגנים כמו IL-8ו .VEGF-השפעה זו נבחנה גם בניסויים .in-vivoטיפול החיות עם ) MXFלבד או בשילוב עם (CPT-11הפחית באופן בולט מאד את זרימת הדם בגידול וגרם גם לירידה משמעותית בביטוי הסמן CD-31ברקמה .בנוסף ,גרם MXFלירידה בכמות ה IL-8-בגידול אשר עלתה בעקבות הטיפול עם .CPT-11יש להדגיש שהשפעה אנטי-אנגיוגנית הינה בעלת ערך רב בטיפול בסרטן. אחת הבעיות הקשות במחלת הסרטן היא היכולת שרוכש הגידול הסרטני לשגשג ע"י כך שמתפתחים אליו כלי דם המזינים אותו .בעיה קשה נוספת היא העובדה שאותם כלי דם המתפתחים אל הגידול משמשים את הגידול כאמצעי להתפשטותו בגוף ויצירת גרורות תופעה המקשה עד מאד על הטיפול ומקטינה מאד את סיכויי הריפוי. למחקר הנוכחי יש משמעות קלינית בכך ש MXF-יכול להוות תוסף לתרופות כימותרפיות ובכך להגביר את הפעילות הציטוטוקסית מחד ,ולהקטין חלק מתופעות הלוואי המושרות ע"י תרופות אנטי-סרטניות מאידך .בנוסף MXF ,יכול להוות תוספת טובה בטיפול כנגד תהליכי אנגיוגנזה המתרחשים במחלת הסרטן. 118 רשימת ספרות.7 1. Wang JC. Moving one DNA double helix through another by a type II DNA topoisomerase: the story of a simple molecular machine.Q. Rev. Biophys. 1998; 31:107–144. 2. Wu HY, Shyy SH,Wang JC, Liu LF. Transcription generates positively and negatively supercoiled domains in the template. Cell. 1988; 53:433–440. 3. Kaguni JM, Kornberg A. Topoisomerase I confers specificity in enzymatic replication of the Escherichia coli chromosomal origin. J. Biol. Chem. 1984; 259:8578–8583. 4. Masse E, Drolet M. Escherichia coli DNA topoisomerase I inhibits R-loop formation by relaxing transcription-induced negative supercoiling. J. Biol. Chem. 1999; 274:16659–16664. 5. Wallis JW, Chrebet G, Brodsky G, Rolfe M, Rothstein R. A hyper-recombination mutation in S. cerevisiae identifies a novel eukaryotic topoisomerase. Cell. 1989; 58:409–419. 6. Wang JC, Caron PR, Kim RA. The role of DNA topoisomerases in recombination and genome stability: a double-edged sword? Cell. 1990; 62:403–406. 7. Champoux J. DNA TOPOISOMERASES: Structure, Function, andMechanism. Annu. Rev. Biochem. 2001; 70:369–413. 8. Lee MP, Brown SD, Chen A, Hsieh TS. DNA topoisomerase I is essential in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; 90:6656– 6660. 9. Morham SG, Kluckman KD, Voulomanos N, Smithies O. Targeted disruption of the mouse topoisomerase I gene by camptothecin selection. Mol. Cell. Biol. 1996; 16:6804–6809. 10. Chen M, Beck WT. DNA topoisomerase II expression, stability, and phosphorylation 119 in two VM-26-resistant human leukemic CEM sublines. Oncol. Res.1995;7:103–111. 11. Dereuddre S, Frey S, Delaporte C, Jacquemin-Sablon A. Cloning and characterization of full-length cDNAs coding for the DNA topoisomerase II beta from Chinese hamster lung cells sensitive and resistant 9-OH-ellipticine. Biochim. Biophys. Acta. 1995; 1264:178–182. 12. Yang X, Li W, Prescott ED, Burden SJ, Wang JC. DNA topoisomerase IIbeta and neural development. Science. 2000; 287:131–134. 13. Azarova AM, Lyu L, Lin CP, Tsai YC, Yiu-Nam Lau J, Wang JC, Liu F. Roles of DNA topoisomerase II isozymes in chemotherapy and secondary malignancies. PNAS. 2007; 104:11014-11019. 14. Van Hille B, Perrin D and Hill B T. Differential in vitro interactions of a series of clinically useful topoisomerase-interacting compounds with the cleavage/religation activity of the human topoisomerase II alpha and II beta isoforms. Anti Cancer Drugs. 1999; 10: 551-560. 15. Fry A M, Chresta C M, Davies S M, Walker MC, Harris AL, Hartley J A., Masters J R, Hickson I D. Relationship between topoisomerase-II level and chemosensitivity in human tumor-cell lines. Cancer Res. 1991; 51: 6592-6595. 16. Mathijssen R, Loos W, Verweij J, Sparreboom A. Pharmacology of topoisomerase I inhibitors irinitecan (CPT-11) and topotecan. Curr. Cancer Drug Targets. 2002; 2:103-123. 17. Burden D A, Osheroff N. Mechanism of action of eukaryotic topoisomerase II and drugs targeted to the enzyme. Biochim. Biophys. Acta. 1998; 1400:139-154. 18. Shalit I, Kletter Y, Halperin D, Waldman D, Vasserman E, Nagler A, Fabian I. Immunomodulatory effevts of moxifloxacin in comparison to ciprofloxacin and G-CSF in a murine model of cyclophosphamide-induced 111 leucopenia. Eur. J. Hematol. 2001; 66:287-296. 19. Wolfson JS, Hooper DC, Swartz MN. Mechanisms of action and resistance to quinolone antimicrobial agents. In "Quinolone Antimicrobial Agents" 1st edition (J.S. Wolfson and D.C. Hooper, Eds.), pp.5-35, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1989. 20. Litt JZ. Fluoroquinolones. South. Med. J. 2000; 93:525-526. 21. Barman-Balfour JA, Lamb HM. Moxifloxacin: a review of its clinical potential in the management of community-acquired respiratory tract infections. Drugs. 2000; 59:115-139. 22. Dalhoff A, Shalit I. Immunomodulatory effects of quinolones. Lancet Infec. Dis. 2003; 3:359-371. 23. Cipro (ciprofloxacin) package insert. Bayer 24. Janoir C, Zeller V, Kitzis MD, Moreau NJ, Gutmann L. High-level fluoroquinolone resistance in Streptococcus pneumoniae requires mutations in parC and gyrA. Antimicrob. Agents Chemother. 1996; 40:2760-2764. 25. Ferrero L, Cameron B, Crouzet J. Analysis of gyrA and grlA mutations in stepwise-selected ciprofloxacin-resistant mutants of Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 1995; 39:1554-1558. 26. Gootz TD, Zaniewski R, Haskell S, Schmieder B, Tankovic J, Girard D, Courvalin P., Polzer R.J. Activity of the new fluoroquinolone trovafloxacin (CP-99,219) against DNA gyrase and topoisomerase 4 mutants of Streptococcus pneumoniae selected in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 1996; 40:16911697. 27. Schmitz FJ, Higgins PG, Mayer S, Fluit AC, Dalhoff A. Activity of quinolones against gram-positive cocci: mechanisms of drug action and bacterial 111 resistance. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2002; 21:647-659. 28. Drlica K, Zhao X. DNA gyrase, topoisomerase 4, and the 4-quinolones. Micobiol. Mol. Biol. Rev. 1997; 61:377-392. 29. Chen CR, Malik M, Snyder M, Drlica K. DNA gyrase and topoisomerase 4 on the bacterial chromosome: quinolone-induced DNA cleavage. J. Mol. Biol. 1996; 258:627-637. 30. Blank M, George J, Fishman P, Levy Y, Toder V, Savion S, Barak V, Koike T, Shoenfeld Y. Ciprofloxacin immunomodulation of experimental antiphospholipid syndrome associated with elevation of interleukin-3 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor expression. Arthritis Rheum. 1998; 41:224-232. 31. Kletter Y, Riklis I, Shalit I, Fabian, I. Enhanced repopulation of murine hematopoietic organs in sublethally irradiated mice after treatment with ciprofloxacin. Blood. 1991; 78:1685-1691. 32. Riesbeck K, Forsgren, A. Increased interleukin 2 transcription in murine lymphocytes by ciprofloxacin. Immunopharmacology. 1994; 27:155-164. 33. Shalit I, Kletter Y, Gruss T, Fabian I. Enhanced hematopoiesis in sublethally irradiated mice treated with various quinolones. Eur. J. Haematol. 1997; 58:92-98. 34. Riesbeck K, Forsgern A. Selective enhancement of synthesis of interleukin 2 in lymphocytes in the presence of ciprofloxacin. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1990; 9:409-413. 35. Shalit I, Nasrallah N, Bar-On S, Rabau M. In vitro effect of ciprofloxacin and ofloxacin on murine and human colon carcinoma cell lines. Drugs. 1995; 49:296– 297. 112 36. Herold C, Ocker M, Ganslmayer M, Gerauer H, Hahn EG, Schuppan D. Ciprofloxacin induces apoptosis and inhibits proliferation of human colorectal carcinoma cells. Br. J. Cancer. 2002; 86:443–448. 37. Aranha O, Grignon R, Fernandes N, McDonnell TJ, Wood Jr DP, Sarkar FH. Suppression of human prostate cancer cell growth by ciprofloxacin is associated with cell cycle arrest and apoptosis. Int. J. Oncol. 2003; 22:787–794. 38. Fabian I, Haite D, Levitov A, Halperin D, Shalit I. Moxifloxacin enhances the antiproliferative and apoptotic effects of etoposide but inhibits its proinflammatory effects in THP-1 and Jurkat cells. Br. J. Cance.r 2006; 95: 1038–1046. 39. Thadepalli H, Salem F, Chuah SK, Gollapudi S. Antitumor activity of trovafloxacin in an animal model. In Vivo. 2005; 19:269–276. 40. Zehavi-Willner T, Shalit I. The inhibitory effect of ciprofloxacin on proliferation of a murine bladder carcinoma cell line. J. Antimicrob. Chemother. 1992; 29:323– 328. 41. Anderson VA, Osheroff N. Type II topoisomerases as targets for quinolone antibacterials: turning Dr. Jekyll into Mr. Hyde. Curr. Des. Pharmacol. 2001; 7:339– 355. 42. Bromberg KD, Burgin AB, Osheroff N. Quinolone action against human topoisomerase II alpha: stimulation of enzyme-mediated double-stranded DNA cleavage. Biochemistry. 2003; 42:3393–3398. 43. Vaux DL, Strasser A. The molecular biology of apoptosis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996; 93:2239-2244. 44. Cotter TG, Al-Rubeai M. Cell death (apoptosis) in cell culture systems. Trends in biotechnology. 1995; 13:150-155. 45. Wyllie AH. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with 113 endogenous endonuclease activation. Nature. 1980; 284:555-556. 46. Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer. 1972; 26:239–257. 47. Reed JC. Mechanisms of apoptosis. American J. of Pathol. 2000; 157: 14151430. 48. Wolf BB, Green DR. Suicidal Tendencies: Apoptotic Cell Death by Caspase Family Proteinases. The Journal of Biological Chemistry. 1999; 274:20049-20052. 49. Nunez G, Benedict MA, Hu Y, Inohara N. Caspases: The proteases of the apoptotic pathway. Oncogene. 1998; 17:3237-3245. 50. Green DR. Apoptotic pathways: The roads to ruin. Cell. 1998; 6:695-698. 51. Polverino AJ, Patterson SD. Selective activation of caspase during apoptotic induction in HL-60 cells. Effects of a tetrapeptide inhubitor. J. Biol. Chem. 1997; 11:7013-7021. 52. Slee EA, Harte MT, Kluck RM, Wolf BB, Casiano CA, Newmeyer DD, Wang HG, Reed JC, Nicholson DW, Alnemri ES, Green DR, Martin SJ. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspase-2, -3, -6, -7, -8 and -10 in a caspase-8-9 dependent manner. J. Cell. Biol. 1999; 2:281-292. 53. Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature. 2000; 407:770-776. 54. Altieri DC. Molecular cloning of effector cell protease receptor-1, a novel cell surface receptor for the protease factor XA. J. Biol. Chem. 1994; 269:3139-3142. 55. Altieri DC . Splicing of effector cell protease receptor-1 m-RNA is modulated by an unusual retained intron. Biochemistry. 1994; 33:13848–13855. 56. Sah NK, Khan Z, Khan GJ, Bisen PS. Structural, functional and therapeutic biology 114 of survivin. Cancer Lett. 2006; 244:164–171. 57. Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nat Med. 1997; 3:917-921. 58. Altieri DC, Marchisio PC. Survivin apoptosis: an interloper between cell death and cell proliferation in cancer. Lab Invest. 1999; 11:1327–1333. 59. Li F. Survivin study: what is the next wave?. J Cell Physiol. 2003; 197:8–29. 60. Olie RA, Simões-Wüst AP, Baumann B, Leech SH, Fabbro D, Stahel RA, Zangemeister-Wittke U. A Novel Antisense Oligonucleotide Targeting Survivin Expression Induces Apoptosis and Sensitizes Lung Cancer Cells to Chemotherapy. Cancer Res. 2000; 60: 2805–2809. 61. Tamm I, Wang Y, Sausville E, Scudiero DA, Vigna N, Oltersdorf T, Reed JC. IAPFamily Protein Survivin Inhibits Caspase Activity and Apoptosis Induced by Fas (CD95), Bax, Caspases, and Anticancer Drugs Cancer Res. 1998; 58:5315–5320. 62. Connell CM, Wheatley SP, McNeish IA. Nuclear surviving abrogates multiple cell cycle checkpoints and enhances viral oncolysis. Cancer Res. 2008; 68:7923–7931. 63. Altieri DC. T cell expansion: the survivin interface between cell proliferation and cell death. Immunity. 2005; 22:534–535. 64. Obexer P, Hagenbuchner J, Unterkircher T, Sachsenmaier N, Seifarth C, Bock G, Porto V, Geiger K, Ausserlechner M. Repression of BIRC5/Survivin by FOXO/FKHRL1 sensitizes human neuroblastoma cells to DNA-damageinduced apoptosis. Mol Biol Cell. 2009; 20:2041–2048. 65. Zhen HN, Li LW, Zhang W, Fei Z, Shi CH, Yang TT, Bai WT, Zhang X. Short hairpin RNA targeting surviving inhibits growth and angiogenesis of glioma U251 cells. Int. J. Oncol. 2007; 31:1111–1117. 66. Wu YH, You Y, Chen ZC, Zou P. Reversal of drug resistance by silencing Survivn 115 gene expression in acute myeloid leukemia cells. Acta Biochim. Pol. 2008; 55: 673– 680. 67. Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat. Med. 2000; 6: 389–395. 68. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat. Med. 2003; 9:653–660. 69. Hashizume H, Baluk P, Morikawa S, McLean JW, Thurston G, Roberge S, Jain R K, McDonald D M. Openings between defective endothelial cells explain tumor vessel leakiness. Am. J. Pathol. 2000; 156:1363–1380. 70. Bergers G, Brekken R, McMahon G, Vu T H, Itoh T, Tamaki K, Tanzawa K, Thorpe P, Itohara S, Werb Z, Hanahan D. Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. Nat. Cell Biol. 2000; 2:737–744. 71. Chen A, Cuevas I, Kenny P, Miyake H, Mace K, Ghajar C, Boudreau A, Bissell M J, Boudreau N J. Endothelial cell migration and VEGF expression are the result of loss of breast tissue polarity. Cancer Res. 2009; 69:6721–6729. 72. Coussens L M, Raymond W W, Bergers G, Laig-Webster M, Behrendsten O, Werb Z, Caughey G H, Hanahan D. Inflammatory mast cells up-regulate angiogenesis during squamous epithelial carcinogenesis. Genes Dev. 1999; 13:1382– 1397. 73. Kerbel R S. Tumor angiogenesis. N. Engl. J. Med. 2008; 358:2039–2049. 74. Lin E. Y, Li J. F, Bricard G,Wang W, Deng Y, Sellers R, Porcelli S A, Pollard JW. VEGF restores delayed tumor progression in tumors depleted of macrophages. Mol. Oncol. 2007; 1:288–302. 75. Murdoch C, Muthana M, Coffelt S B, Lewis C E. The role of myeloid cells in the promotion of tumour angiogenesis. Nat. Rev. Cancer. 2008; 8:618–631. 76. Forsythe J A, Jiang B H, Iyer N V, Agani F, Leung SW, Koos R D, Semenza 116 G L. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxiainducible factor 1. Mol. Cell. Biol. 1996; 16:4604–4613. 77. Gerber H P, Condorelli F, Park J, Ferrara N. Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes. Flt-1, but not Flk1/KDR, is up-regulated by hypoxia. J. Biol. Chem. 1997; 272:23659–23667. 78. Harris A L. Hypoxia—a key regulator factor in tumor growth. Nat. Rev. Cancer. 2002; 2:38–47. 79. Unruh A, Ressel A, Mohamed H G, Johnson R S, Nadrowitz R, Richter E, Katschinski D M, Wenger R H. The hypoxia-inducible factor-1 alpha is a negative factor for tumor therapy. Oncogene. 2003; 22:3213–3220. 80. Holmes K, Roberts OL, Thomas AM, Cross MJ. Vascular endothelial growth factor receptor-2: structure, function, intracellular signalling and therapeutic inhibition. Cell Signal. 2007; 19:2003–2012. 81. Brat DJ, Bellail AC,Van Meir EG. The role of Interleukin- 8 and its receptors in gliomagenesis and tumoral angiogenesis. Neuro-oncol. 2005; 7:122-133. 82. Waugh D J, Wilson C. The Interleukin-8 Pathway in Cancer. Clin. Cancer Res. 2008; 14: 6735-6741. 83. Duncan GS, Andrew DP, Takimoto H, Kaufman SA, Yoshida H, Spellberg J, Luis de la Pompa, Elia A, Wakeham A, Karan-Tamir B, Muller WA, Senaldi G, Zukowski MM, Mak TW. Genetic evidence for functional redundancy of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1): CD31-deficient mice reveal PECAM-1dependent and PECAM-1-independent functions. J Immunol 1999;162:3022–30. 84. Kinzler, Kenneth W.; Vogelstein, Bert. "Introduction". The genetic basis of human cancer. (2nd, illustrated, revised ed.). 2002, New York: McGraw-Hill, Medical Pub. Division. p. 5 117 85. Hanahan D, Weinberg RA. The Hallmarks of Cancer. Cell. 2000; 100: 57–70. 86. Ortega J,Vigil CE,Chodkiewicz C. Current progress in targeted therapy for colorectal cancer. Cancer Control. 2010; 17:7-15. 87. Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR, Bast Jr. RC, Gansler TS. Cancer Medicine, 6th edition. Textbook. American Cancer Society. Section13. 88. Markowitz SD, Bertagnolli MM . Molecular basis of colorectal cancer. . N. Engl. J. Med. 2009; 361:2449–2460. 89. Cheong JW, Chong SY, Kim JY, Eom JI, Jeung HK, Maeng HW, Lee ST, Min YH. Induction of Apoptosis by Apicidin, a Histone Deacetylase Inhibitor, via the Activation of Mitochondria- Dependent Caspase Cascades in Human Bcr-AblPositive Leukemia Cells. Clin. Cancer Res.2003; 9:5018-5027. 90. Jung YD, Nakano K, Liu W, Gallick GE ,Ellis LM. Extracellular signalregulated kinase activation is required for up-regulation of vascular endothelial growth factor by serum starvation in human colon carcinoma cells. Cancer Res. 1999; 59:4804-4807. 91. Shalit I, Horev-Azaria L, Fabian I, Blau H, Kariv N, Shechtman I, Alteraz H, Kletter Y. Immunomodulatory and protective effects of moxifloxacin against Candida albicans-induced bronchopneumonia in mice injected with cyclophosphamide. Antimicrob. Agents Chemother. 2002; 46:442-2449. 92. Britten CD, Hilsenbeck SG, Eckhardt SG, Marty J, Mangold G, MacDonald JR, Rowinsky EK, Von Hoff DD, Weitman S. Enhanced antitumour activity of 6droxymethylacylfulvene in combination with irinotecan and 5-fluorouracil in the HT29 human colon tumour xenograft model. Cancer Res. 1999; 59:1049–1053. 93. Tsarfaty G, Stein GY, Moshitch-Moshkovitz S, Kaufman DW, Cao B, Resau JH, Vande Woude GF, Tsarfaty I. HGF/SF increases tumour blood volume: a novel tool 118 for the in vivo functional molecular imaging of met. Neoplasia. 2006; 8:344–352. 94. Gee MS, Saunders HM, Lee JC, Sanzo JF, Jenkins WT, Evans SM, Trinchieri G, Sehgal CM, Feldman MD, Lee WM. Doppler ultrasound imaging detects changes in tumor perfusion during antivascular therapy associated with vascular anatomic alterations. Cancer Res. 2001; 61:2974–2982. 95. Lahat G, Halperin D, Barazovsky E, Shalit I, Rabau M, Fabian I. The Immunomodulatory effects of ciprofloxacin in TNBS induced colitis in mice. Inflamm. Bowel Disease. 2007; 13:557–565. 96. Jahnke U, Higginbottom K, Newland AC, Cotter FE, Allen PD. Cell death in leukemia: Passenger protein regulation by topoisomerase Inhibitors. Bioch.Biophys. Res. Com. 2007; 361:928-933. 97. Fabian I, Reuveni D, Levitov A, Halperin D, Priel E , Shalit I. Moxifloxacin enhances the antiproliferative and apoptotic effects of etoposide but inhibits its proinflammatory effects in THP-1 and Jurkat cells. Brit. J. Cancer. 2006; 95:10381046. 98. Perrone CE, Takahashi KC, Williams GM. Inhibition of human topoisomerase II alpha by fluoroquinolones and ultraviolet A irradiation. Toxicol. Sci. 2002; 69: 6–22. 99. Har-Vardi I, Mali R, Breietman M, Sonin Y, Albotiano S, Levitas E, Potashnik G, Priel E. DNA topoisomerases I and II in human mature sperm cells: characterization and unique properties. Hum Reprod 2007; 22:2183- 2189. 100. Gianani R, Jarboe E, Orlicky D, Frost M, Bobak J, Lehner J, Shroyer KR. Expression of survivin in normal, hyperplastic, and neoplastic colonicmucosa. Hum. Pathol. 2001; 32:119–125. 101. Grossman D, McNiff JM, Li F, Altieri DC. Expression and targeting of the apoptosis inhibitor, survivin, in human melanoma. J. Invest. Dermatol. 1999; 119 113:1076–1081. 102. Wall NR, O'Connor DS, Plescia J, Pommier Y, Altieri DC.Suppression of survivin phosphorylation on Thr(34) by flavopiridol enhances tumor cell apoptosis. Cancer Res. 2003; 3:230-235. 103. Li F, Altieri DC. The cancer anti-apoptosis mouse survivin gene: characterization of locus and transcriptional requirements of basal and cell cycle- dependent expression. Cancer Res. 1999; 59:3143-3151. 104. Bromberg KD, Burgin AB , Osheroff N. A two-drug model for etoposide action against human topoisomerase II alpha. J. Biol. Chem. 2003; 278:7406-7412. 105. Zaniboni A, Labianca R, Pancera G, Barni S, Frontini L, Marini G, Leporini G. Oral etoposide as second-line chemotherapy for colorectal cancer: a GISCAD study. J Chemotherapy. 1995; 7:246-248. 106. Hande KR. Etoposide: four decades of development of a topoisomerase II inhibitor. Eur. J. Cancer. 1998; 10:1514-1521. 107. Seminara P, Pastore C, Iascone C, Cicconetti F , Nigita G , Ielapi T , Franchi F. Mitomycin C and etoposide in advanced colorectal carcinoma - A clinical in vitro experience that focuses the problem of schedule dependence in combination therapy Chemotherapy. 2007; 53:218-225. 108. Tomirotti M, Lombardi F, Biasioli R, Riundi R, Scanni A. Combination of mitomycin C + etoposide in advanced gastric carcinoma. Tumori. 1985; 71:371373. 109. Braybrooke JP, O'Byrne KJ, Saunders MP, Propper DJ, Salisbury AJ, Boardman P, Taylor M, Ganesan TS, Talbot DC, Harris AL. A phase II study of mitomycin C and oral etoposide for advanced adenocarcinoma of the upper gastrointestinal tract. Ann. Oncol. 1997; 8:294-296. 121 110. Menichetti ET, Silva RR, Tummarello D, Miseria S, Torre U, Celerino R. Etoposide and mitomycin C in pretreated metastatic breast cancer. Tumori. 1989; 75:473-474. 111. Voog E, Merrouche Y, Trillet-Lenoir V, Lasset C, Peaud PY, Rebattu P, Negrier S. Multicentric phase II study of cisplatin and etoposide in patients with metastatic carcinoma of unknown primary. Am. J. Clin. Oncol. 2000; 23:614616. 112. Planting AS, van der Burg ME, van der Bent MJ, de Boer-Dennert M, State G, Verweij J. Phase II study of a short course of weekly high dose cisplatin combined with long-term oral etoposide in metastatic colorectal cancer. Br. J. Cancer. 1996; 73:1265-1267. 113. Posner M, Slapak CA, Browne MJ, Clark JW, Curt G, Weitberg A, Calabresi P, Cummings FJ, Wiemann M, Urba S. A phase I-II trial of continuous-infusion cisplatin, continuous-infusion 5-fluorouracil, and VP-16 in colorectal carcinoma. Am. J. Cli.n Oncol. 1990; 13:455-458. 114. Weiss T, Shalit I, Blau H, Werber S, Halperin D, Levitov A, Fabian I. Antiinflammatory effects of moxifloxacin on activated human monocytic cells: inhibition of NFkB and MAPK activation and synthesis of proinflammatory cytokines. Anti Microb. Agents Chem. 1982; 48:1974-1982. 115. Shalit I, Halperin D, Haite D, Levitov A, Romano J, Osherov N, Fabian I. Antiinflammatory effects of moxifloxacin on IL-8, IL-1β, and TNF-α secretion and NFkB and MAP-kinase activation in human monocytes stimulated with Aspergillus fumigatus. J. Antimic. Chemother. 2006; 57:230-235. 116. Rolny C, Capparuccia L, Casazza A, Mazzone M, Vallario A, Ciqnetti A, Medico E, Carmeliet P, Comoglio PM, Tamaqone L. The tumor suppressor semaphorin 121 3B triggers a prometastatic program mediated by interleukin 8 and the tumor microenvironment. J. Exp. Med. 2008; 205:1155-1171. 117. Amin DN, Bielenberg DR, Lifshits E, Heymach JV, Klagsbrun M. Targeting EGFR activity in blood vessels is sufficient to inhibit tumor growth and is accompanied by an increase in VEGFR-2 dependence in tumor endothelial cells. Microvascular Res. 2008; 76: 15-22. 118. Bailly C, Colson P, Houssier C. The orientation of norfloxacin bound to double-s stranded DNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998; 243: 844–848. 119. Bleiberg H. CPT-11 in gastrointestinal cancer. Eur. J. Cancer. 1999; 35:371–379. 120. Ajani JA, Baker J, Pisters PW, Ho L, Mansfield PF, Feig BW. CPT-11 plus cisplatin in patients with advanced, untreated gastric or gastroesophagus junction carcinoma. Cancer. 2001; 94:641–646. 121. Shimada S, Yagy Y, Kuramoto m, Aoki N, Ogawa M. Secondline chemotherapy with combined irinotecan and low-dose cisplatin for patients with metastatic gastric carcinoma resistant to 5-fluorouracil. Oncol. Rep. 2003; 10:687–691. 122. Shimada S, Yagi Y, Shimori K, Kuramoto M, Aoki N, Ogawa M. Outpatient therapy with irinotecan and low-dose cisplatin for metastatic colorectal cancer resistant to 5- fluorouracil. Oncol. Rep. 2002; 9:783–787. 123. Shimada S, Hayashi N, Marutsuka T, Baba Y, Yokoyama S, Iyama KI, Ogawa M. Inotecan plus low-dose cisplatin for alphafetoprotein-producing gastric carcinoma with multiple liver metastases: report of two cases. Surg. Today. 2002; 32:1075–1080. 124. Saltz LB, Cox JV, Blanke C, Rosen LS, Fehrenbacher L, Moore MJ, Maroun JA, Ackland SP, Locker PK, Pirotta N, Elfring GL, Miller LL. Irinotecan plus Fluorouracil and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N. Engl. J. Med. 122 2000; 343:905–914. 125. Streit M, Velasco P, Brown L F, Skobe M, Richard L Riccardi L, Lawler J, Detmar M. Expression of thrombospondin-1 decreases angiogenesis and inhibits the growth of human cutaneous squamous cell carcinomas. Am. J. Pathol. 1999; 155:441–452. 126. Vanhoefer U, Harstrick A, Köhne C H, Achterrath W, Rustum Y M, Seeber S, Wilke H. Phase I study of a weekly schedule of irinotecan, high-dose leucovorin, And infusional fluorouracil as first-line chemotherapy in patients with advanced colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 1999; 17:907–913. 127. Somekh E, Douer D, Shaked N, Rubinstein E. In vitro effects of ciprofloxacin and pefloxacin on growth of normal human hematopoietic progenitor cells and on leukemic cell lines. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1989; 248:415–418. 128. Miclau T, Edin ML, Lester GE, Lindsey RW, Dahners LE. Effect of ciprofloxacin on the proliferation of osteoblast-like MG-63 human osteosarcoma cells in vitro. J. Orthop. Res. 1998; 16:509–512. 129. Ebisuno S, Inagaki T, Kohjimoto Y, Ohkawa T. The cytotoxic effects of f leroxacin and ciprofloxacin on transitional cell carcinoma in vitro. Cancer. 1997; 80:2263–2267. 130. Yamakuchi M, Nakata M, Kawahara K, Kitajima I, Maruyama I. New quinolones, ofloxacin and levofloxacin, inhibit telomerase activity in transitional cell carcinoma cell lines. Cancer Lett. 1997; 119:213–219. 131. Aranha O, Wood DP, Sarkar FH. Ciprofloxacin mediated cell growth inhibition, S/G(2)-M cell cycle arrest, and apoptosis in a human transitional cell carcinoma of the bladder cell line. Clin. Cancer Res. 2000; 6:891–900. 132. Werber S, Shalit I, Fabian I, Steuer G, Weiss T, Blau H. Moxifloxacin inhibits 123 cytokine-induced nitric oxide production and down-regulates expression of Inos, NFkB and MAP kinases in human respiratory epithelial cells. J. Antimic. Chemother. 2005; 55:293–300. 133. Tabarrini O, Cecchetti V, Fravolini A, Nocentini G, Barzi A, Sabatini S, Miao H, Sissi C. Design and synthesis of modified quinolones as antitumoral acridones. J. Med. Chem. 1999; 42:2136–2144. 134. Rajabalian S, Foroumadi A, Shafiee A, Emami S. Functionalized N(2oxyiminoethyl) piperazinyl quinolones as new cytotoxic agents. J. Pharm. Sci. 2007; 10:153–158. 135. Chu DT, Hallas R, Tanaka SK, Alder J, Balli D, Plattner JJ. Synthesis and antitumor activities of tetracyclic quinolone antineoplastic agents. Drugs Exp. Clin. Res. 1994; 20:177–183. 136. Sissi C, Palumbo M. The quinolone family: from antibacterial to anticancer agents. Curr. Med. Chem. Anticancer Agents. 2003; 3:439–450. 137. Donnelly EF, Geng L, Wojcicki WE, Fleischer AC, Hallahan DE. Quantified Power Doppler US of tumour blood flow correlates with microscopic quantification of tumor blood vessels. Radiology. 2001; 219:166–170. 138. Bocci G, Falcone A, Fioravanti A, Orlandi P, Di Paolo A, Fanelli G, Viacava P, Naccarato AG, Kerbel RS, Danesi R, Del Tacca M, Allegrini G. Antiangiogenic and anticolorectal cancer effects of metronomic irinotecan chemotherapy alone and in combination with semaxinib. Br. J. Cancer. 2008; 98:1619–1629. 139. Wildiers H, Guetens G, De Boeck G, Verbeken E, Landuyt B, Landuyt W, de Bruijn EA, van Oosterom AT. Effect of antivascular endothelial growth factor treatment on the intratumoral uptake of CPT-11. Br. J. Cancer. 2003; 88:1979– 1986. 124 140. Tappenden P, Jones R, Paisley S, Carroll C. Systematic review and economic evaluation of bevacizumab and cetuximab for the treatment of metastatic colorectal cancer. Health Technol. Assess. 2007; 11:1–128. 141. Popov I, Milicevic´ M, Radosevic´ -Jelic´ Lj. The addition of bevacizumab to fluoropyrimidine, irinotecan and oxaliplatin-based therapy improves survival for patients with metastatic colorectal cancer (CRC): combined analysis of efficacy. Acta Chir. Iugosl. 2008; 55:11–16. 142. McCormack PL, Keam SJ. Bevacizumab: a review of its use in metastatic colorectal cancer. Drugs. 2008; 68:487–506. 143. Dietrich J, Norden AD, Wen PY. Emerging antiangiogenic treatments for gliomas-efficacy and safety issues. Curr. Opin. Neurol. 2008; 21:736–744. 144. Gartner EM, Griffith KA, Pan Q, Brewer GJ, Henja GF, Merajver SD, Zalupski MM. A pilot trial of the anti-angiogenic copper lowering agent tetrathiomolybdate in combination with irinotecan, 5-flurouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. Inves.t New Drugs. 2009; 27:159–165. 125 רשימת פרסומים בעקבות עבודה זו:'נספח א 1. Reuveni D, Halperin D, Shalit I, Priel E, Fabian I. Quinolones as enhancers of camptothecin- induced cytotoxic and anti-topoisomerase I effects. Biochem. Pharmacol. 75 (6), 1272-1281, 2008. 2. Reuveni D, Halperin D, Fabian I, Tsarfaty G, Askenasy N and Shalit I. Moxifloxacin increases anti-tumor and anti- angiogenic activity of irinotecan in human xenograft tumors.Biochem. Pharmacol. 79 (8), 1100-1107, 2010. 3. Reuveni D, Halperin D, Shalit I, Priel E, Fabian I. In-vitro effects of moxifloxacin in combination with etoposide on topoisomerase II activity, cytotoxicity, apoptosis and pro-angiogenic factors in colorectal cancer. Int. J. Oncol. 37 (2), 463-471, 2010. Table of contents 1. Introduction ............................................................................................................1 1.1DNA topoisomerases ……………………………………………........…........1 1.1.1 Classification of topoisomerases enzymes …………………….....................2 1.1.2 Cellular roles of topoisomerase in eukaryotic cell …………….....................4 1.1.3 Chemotherapeutic drugs targeted towards topoisomerases ….................…...4 1.2 Quinolones ………………………………………………………...….............5 1.2.1 Fluoroquinolones and anti-tumor effects ……………………...…................7 1.3 Apoptosis ……………………………………………………….......….......…8 1.3.1 Caspases ……………………………………………………….......….........10 1.3.2 Survivin ………………………………………………………...........…......11 1.4 Angigenesis ………………………………………………………..................13 1.4.1 Vascular endothelial growth factor (VEGF) ………………..….............…..14 1.4.2 The cytokine interleukine-8 (IL-8) …………………………...............…....15 1.4.3 CD-31 …………………………………………………………....…............16 1.5 Cancer …………………………………………………………..…..........…..17 1.5.1 Colorectal cancer ……………………………………….……….....…..........19 2. Research goals ......................................................................................................22 3. Materials and research methods .........................................................................25 3.1.Materials ..........................................................................................................25 3.1.1 Buffers ............................................................................................................28 3.1.2 Antibodies ......................................................................................................29 3.1.3 Laboratory equipment ....................................................................................30 3.2 Research methods ...........................................................................................32 3.2.1 Topoisomerase I assay ...................................................................................32 3.2.2 Topoisomerase II assay .................................................................................32 3.2.3 Examination of mode of topoisomerases I and II inhibition by MXF and CIP ...........................................................................................33 3.2.4 Nuclear extract preparation ...........................................................................33 3.2.5 Examination of the effect of MXF/CIP given alone or in combination with CPT on cellular topoisomerase I .....................................34 3.2.6 Examination of the effect of MXF given alone or in combination with VP-16 on cellular topoisomerase II .................................34 3.2.7 Band depletion assay for topoisomerases .....................................................35 3.2.8 Cell culture ...................................................................................................36 3.2.9 Evaluation of the secretion of pro-angiogenic factors: IL-8 and VEGF ......36 3.2.10 MTT assay ..................................................................................................37 3.2.11 Examination of caspase 3 activity in cells exposed to MXF and VP-16 ..........................................................................................................38 3.2.12 Effect of MXF/CIP on apoptosis rate in HT-29 cells .................................39 3.2.13 Examination of the effect of MXF and VP-16 on apoptosis rate evaluated by DAPI staining ........................................................................39 3.2.14 Cell cycle characterization after cell exposure to MXF and VP-16 ............40 3.2.15 Effect of MXF and VP-16 on surviving expression ....................................41 3.2.16 Generation of human colon cancer xenografts and evaluation of tumor growth ..............................................................................................41 3.2.17 Power Doppler Ultrasound imaging of tumors ...........................................42 3.2.18 Tumor homogenates ....................................................................................43 3.2.19 Fixing and embedding the tissue in paraffin ...............................................43 3.2.20 Slides preparation for immunohysochemical staining .................................43 3.2.21 Immunohysochemical staining for Ki-67 ....................................................44 3.2.22 Immunohysochemical staining for CD-31 ..................................................45 3.2.23 Evaluation of immunohystochemical results ...............................................45 3.3 Statistical analysis ...........................................................................................45 4. Results ....................................................................................................................46 4.1 Examination of the inhibitory effect of different concentrations of VP-16 on purified topoisomerase II............................................................46 4.1.1 Effect of MXF and VP-16 given alone or in combination on purified topoisomerase II activity ............................................................................. 47 4.1.2 Examination of the mode of inhibition on topoisomerase II activity by MXF combined with VP-16 ..........................................................................48 4.1.3 The effect of MXF given alone or in combination with VP-16 on cellular topoisomerase II derived from HT-29 cells as well as in drug treated cells ..........................................................................................50 4.1.4 Effect of MXF and VP-16 on topo II cleavage activity ...............................53 4.2 Effect of MXF on the anti-proliferative activity of VP-16 ..........................55 4.2.1 Cell cycle arrest ..............................................................................................57 4.2.2 Effect of MXF and VP-16 on survivin expression.........................................59 4.2.3 Effect of MXF and VP-16 on morphological changes in HT-29 cells ..........61 4.2.4 Caspase-3 activation after treatment with MXF and VP-16 ..........................63 4.2.5 Effect of MXF on the secretion of pro-angiogenic factors induced by VP-16.........................................................................................................65 4.3 Examination of the inhibitory effect of different concentrations of CPT, MXF and CIP on purified topoisomerase ...................................66 4.3.1 The effect of MXF, CIP in combination with CPT on topoisomerase I activity ...................................................................................68 4.3.2 Examination of the mode of inhibition on topoisomerase I activity by MXF/ CIP combined with CPT ....................................................................70 4.3.3 The effect of MXF/CIP given alone or in combination with CPT on cellular topoisomerase I derived from HT-29 cells ......................................72 4.3.4 The effect of MXF/CIP given alone or in combination with CPT on topoisomerase Iactivity in drug treated cells ................................................74 4.4 Effect of MXF and CIP on the anti-proliferative activity of CPT .............76 4.4.1 Effect of MXF and CIP on CPT-induced apoptosis ......................................79 4.4.2 Effect of MXF and CIP on the secretion of proangiogenic factors induced by CPT .............................................................................................81 4.5 Effect of combined treatment with MXF and increasing doses of irinotecan on the growth of human xenograft tumors in SCID mice .......83 4.5.1 MXF enhances the inhibition of cellular proliferation in human colon xenografts induced by irinotecan ........................................................86 4.5.2 MXF treatment reduces blood flow in xenograft tumors as measured by Power Doppler Ultrasound imaging .......................................88 4.5.3 MXF treatment reduces the expression of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1/CD-31) .....................................................91 4.5.4 MXF treatment reduces the enhanced IL-8 levels in tumor homogenates, induced by irinotecan ....................................................................................93 5. Discussion .............................................................................................................. 95 6. Summary ..............................................................................................................107 7. Bibliography ........................................................................................................108 8. Appendix A ..........................................................................................................125 Abstract DNA topoisomerases are enzymes who are responsible for the topological state of the DNA. Recently, many drugs targeted towards topoisomerases were defined. The cytotoxic effect caused by these drugs is due to the fact that the enzyme is trapped in a covalent bond with the DNA. Among these drugs, known as "topoisomerases poisons", are antimicrobial agents and chemotherapeutic drugs. Quinolones are synthetic potent, broad-spectrum antimicrobial agents. The majority of quinolones in clinical use belong to the subset of fluoroquinolones, which have a fluorine atom attached to the central ring system, typically at the 6-position. Fluoroquinolones inhibit bacterial DNA gyrase and topoisomerase IV, thereby causing bacterial cell death. The fluoroquinolones moxifloxacin (MXF) and ciprofloxacin (CIP) are in common clinical use. Certain members of this family (i.e. MXF, CIP and trovafloxacin) were shown by us and other groups to exert anti-tumor activity in several cancer cell lines and in an in vivo animal model. Activity was shown mainly against colon cancer, bladder cancer and leukemia cell lines. The anti-tumor activity was linked in several studies to the anti-topoisomerase II activity of the quinolones which was demonstrated in eukaryotic and tumor cells. In a previous study we have shown that MXF enhanced the anti-proliferative activity and apoptotic effects of etoposide (VP-16) in THP-1 and Jurkat tumor derived cell lines and inhibited the enhanced release of IL-8, IL-1β and TNF-α exerted by VP-16. The main purpose of this study was to examine the cytotoxic effects of MXF given alone or in combination with anti-tumor drugs targeted towards topoisomerases I and II . The research was divided into three parts where the mechanism of action of MXF was investigated in combination with chemotherapeutic drugs (VP-16 and CPT) in an in-vitro model and in a third part the mechanism of action of MXF in combination with CPT-11was examined in an in-vivo model. Topoisomerases assay (I and II) was used to examine the effect of MXF on topoisomerases activity, the reaction mixture (different for each topoisomerase) contains a DNA plasmid which is cleaved by the enzymes randomly. This assay allows examining the effect of MXF on topoisomerases activity as well as examining the mode of action: whether it is at a DNA level or at the enzyme level. These assays were performed with purified enzymes as well as with nuclear extracts from HT-29 cells (colorectal cancer cells), and in cells treated with the drugs. In addition, to determine the mechanism of action of topoisomerase II, the band depletion assay was explored. Band depletion assays allow detection of enzyme complexes with DNA within the cell. The cytotoxic effects of MXF were examined by MTT proliferation assay, fluorogenic assay for caspase-3 activity; apoptosis was evaluated by staining cells with Annexin V or DAPI. Flow cytometric studies were performed to explore the combined effect of MXF and VP-16 on cell cycle and survivin expression. Nuclear staining with propidium iodide (PI) and an antibody against survivin were used, respectively. Likewise, the effect of the drugs was examined on the secretion of pro-angiogenic cytokines (IL-8 and VEGF) using the ELISA method. To determine the effect of the combined treatment of irinotecan and MXF on the in-vivo growth of human tumor, SCID mice were inoculated s.c.with HT-29 cells. Animal weight was monitored and tumor dimensions were measured by caliper. At the end of the experiments, the blood flow to the tumor was assessed by Power Doppler Ultrasound. After the animals were sacrificed, tumors were removed and histological sections were prepared for immunohystochemical staining with Ki-67 and CD-31 antibodies. IL-8 was evaluated in tumors homogenate using ELISA. The results show that MXF slightly affected topoisomerases activity (I and II). VP- 16 and CPT inhibit purified topoisomerase I and II, respectively. The addition of MXF to the drugs increases the inhibitory effect mentioned. The inhibitory effect could be overcome only by increasing the amount of enzyme, suggesting that the mode of action is probably at the enzyme level. The enhanced inhibitory effect was obtained also when the effect of MXF was examined in combination with VP-16 and CPT in nuclear extracts from HT-29 cells or in drug treated cells. Band depletion assays showed that the addition of MXF to VP-16 enhanced the accumulation of DNA-topoisomerase II adducts compared to VP-16 alone. MTT proliferation assay showed that the addition of MXF increases the cytotoxic effects induced by VP-16 or CPT. Moreover, the apoptotic rate was increased by combination of MXF with the chemotherapeutic drugs. In addition, VP-16 and CPT induced an increase in IL-8 secretion while MXF, given alone, inhibited the spontaneous release. Combination of MXF with the drugs caused a marked inhibition on IL-8 secretion. The chemotherapeutic drugs had no influence on VEGF secretion, while MXF inhibited the spontaneous release from the cells. The in vivo results show that MXF has antiangiogenc effects. MXF reduces blood flow to the tumor as demonstrated by Power Doppler Ultrasound measurements and immunohistochemistry analysis of CD-31. In addition, MXF significantly enhanced the anti-proliferative effects of irinotecan as demonstrated by tumor growth measurements and immunohistochemical analysis of Ki-67 nuclear protein. On the other hand MXF abolished or ameliorated the significant weight loss and diarrhea observed in animals treated with irinotecan alone. Irinotecan increased IL-8 levels in the tumor while MXF inhibited this increase. The present study confirms that MXF is a safe antibiotic and beyond its immunomodulatory effects, which were demonstrated in the past, has anti-tumor and anti-angiogenic effects. The anti-tumor effects are demonstrated by increasing the cytotoxic effects of VP-16 and CPT. MXF enhanced the antiproliferative effects of the drugs, activation of caspase 3 activity and increasing of apoptotic rate. These results may be explained by the inhibition of topoisomerases activity caused by MXF. The present study has clinical importance as MXF may be a valuable new addition to chemotherapeutic armamentarium, simultaneously improving the cytotoxic activity, and reducing the side effects chemotherapeutic agents. In addition, MXF may be a good valuable addition to anti-angiogenic treatment given to patients suffering of cancer. This work was carried out under the supervision of Prof. Ina Fabian Department of Cell and Developmental Biology, Faculty of Medicine, Tel-Aviv University Prof. Itamar Shalit Director of Infectious Diseases clinic, Schneider Children's Medical Center of Israel Tel Aviv University Sackler Faculty Of Medicine The Dr. Miriam and Sheldon G. Adelson Department of Cell and Developmental Biology Anti-tumor effects of Moxifloxacin: examination of its cytotoxic activity in combination with other anti-tumor drugs Thesis submitted for the degree "Doctor of Philosophy" By Debby Jaite-Reuveni Submitted to the senate of Tel Aviv University November 2010
© Copyright 2024