1. No category

‫‪77‬‬
‫מ ח ק ר < ם בב<ולוג<ה מ ו ל ק ו ל ר י ת ש ל דוז<דרצ<ה‬
‫בעובד*‬
‫ח»בור‬
‫‪nv*n‬‬
‫לשם קבלת‬
‫דוקטור‬
‫התואר‬
‫לפ»לוקופיה‬
‫מ‪H‬ת‬
‫יי־'‪'.‬‬
‫דוד‬
‫חן‬
‫הוגש למועצה המדעית של מכון ויצמן למדע‪,‬‬
‫אדר תשכיח‬
‫רחובות‬
‫מ ח ק ר < ם בב<ולוג<ה מ ו ל ק ו ל ר י ת ש ל דה<דרצ<ה‬
‫בעובר*‬
‫זז»בור‬
‫לשם‬
‫דוקטור‬
‫ח<גוה‬
‫קבלת‬
‫התואר‬
‫לפ»לוסופ»ה‬
‫דוד‬
‫חן‬
‫הוגש למועצה המדעית של מכון ויצמן למדע‪,‬‬
‫אדר תשכיח‬
‫רחובות‬
SYSTEM NO.
‫מסי מערכת‬
‫עבודה זו נעשתה בהדרכתו של‬
‫פרופסור אפרים קצילםקי‬
‫במחלקה לביופיזיקה‬
‫רחובות‪.‬‬
‫במכון ויצמן‪.‬‬
‫ל א פ ר י ם ‪-‬‬
‫שהכניס חקלאי לגב הכימאים‬
‫ואפשר את ביצועה של העבודה‪,‬‬
‫הרבה תודות על האינדוקטרינציה‪,‬‬
‫העידוד והזמן שהוקדשו לי‪.‬‬
‫ת ו ד ת י‬
‫נ ת ו נ ה‬
‫לאברהם מרכוס ושרה שריד‬
‫שידעו להיות מדריכים וחברים נאמנים‪.‬‬
‫לידידי הצעירים‬
‫דב פ‪ ,.‬חגית ש‪,.‬‬
‫ודן כ‪ .‬שםיעו בידי במהלכה של עבודה זו‪,‬‬
‫ואחרון חביב ‪ -‬לתברי המחלקה לבי ופיזיקה‬
‫על האוירה‪ ,‬העזרה והידידות‪.‬‬
‫תכן‬
‫הענינים‬
‫׳‬
‫עמוד‬
‫מבוא‬
‫‪1‬‬
‫מטרת העבודה‬
‫‪8‬‬
‫תמרים‬
‫‪9‬‬
‫שיטות‬
‫גידול וסימון עוברי חיטה‬
‫‪10‬‬
‫הפקת ריבוזומים‬
‫‪11‬‬
‫שימור ריבוזומים‬
‫‪11‬‬
‫מפל םוכרוז‬
‫‪12‬‬
‫‪S‬‬
‫‪sENA‬‬
‫‪U‬‬
‫מערכת אנקורפורציה סטנדרטית‬
‫‪13‬‬
‫בדיקת אורך השרשרת של פוליפפטידים‬
‫‪14‬‬
‫מערכת האנקורפורציה ותכונותיה‬
‫‪15‬‬
‫הכנת‬
‫‪19‬‬
‫‪ RNA‬כללי‬
‫‪20‬‬
‫נקו י‬
‫‪Mak‬‬
‫‪DNA‬‬
‫‪ RNA‬ו ‪ DNA‬מחיטה‬
‫הברדיזציה בין‬
‫מיקרוםקופיה אלקטרונית‬
‫‪24‬‬
‫‪25‬‬
‫תוצאות‬
‫‪,‬‬
‫פרק אי ;‬
‫נביטת עובר החיטה‪.‬‬
‫‪.1‬‬
‫הנבטה וייבוש של עוברי חיטה‬
‫‪27‬‬
‫‪.2‬‬
‫מורפולוגיה וציטולוגיה של עובר החיטה הנובט‬
‫‪29‬‬
‫‪.3‬‬
‫ה‬
‫‪ DNA‬של עובר החיטה‬
‫‪35‬‬
‫א־ תכולה‬
‫ב‪ .‬םינתזת‬
‫‪.4‬‬
‫ה‬
‫‪?XDENA‬‬
‫‪,‬‬
‫‪ DNA‬עם הנביטה‬
‫עובר החיטה‬
‫א‪ .‬תכולה‬
‫ב‪ .‬סינתזה‬
‫‪37‬‬
‫‪ RNA‬בשלבי הנביטה הראשונים‬
‫ג‪ .‬יצירת ריבוזומים‬
‫ד‪.‬‬
‫‪36‬‬
‫‪ sRNA‬בעובר הנובט‬
‫‪37‬‬
‫‪41‬‬
‫‪44‬‬
‫&‪NA‬‬
‫עמוד‬
‫‪•5‬‬
‫‪.6‬‬
‫‪.7‬‬
‫‪.8‬‬
‫פרק ב‬
‫‪mRNA‬‬
‫בעובר הנובט‬
‫בשעות ה נ ב י ט ה ה ר א ש ו נ ו ת‬
‫א‪.‬‬
‫ה ס י נ ת ז ה של‬
‫ב‪.‬‬
‫ג ו ד ל ו של חלק ה ג נ ו ם ה פ ע י ל ב ט ר נ ס ק ר פ צ י ה של‬
‫ג‪.‬‬
‫ה ס פ צ י פ י ו ת של ר י א ק צ י ה ה ה ב ר י ד י ז צ י ה‬
‫‪mRNA‬‬
‫‪46‬‬
‫‪mRNA‬‬
‫ו‬
‫‪sRNA‬‬
‫‪47‬‬
‫‪48‬‬
‫ם י נ ת ז ת ה ח ל ב ו ן עם ה נ ב י ט ה של ע ו ב ר החיטה‬
‫א•‬
‫השפעת א ק ט י נ ו מ י צ י ן על א ח ו ז ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ ו‬
‫‪50‬‬
‫ב‪.‬‬
‫ב ע ו ב ר היבש‬
‫‪52‬‬
‫‪RNA‬‬
‫פ ע י ל ו ת טמפלט של‬
‫נ ס ו י י ם בקומפלקס ה פ ע י ל ב ס י נ ת ז ת ה ח ל ב ו ן של ע ו ב ר החיטה‬
‫ופעילות ב י ו ל ו ג י ת‬
‫א‪.‬‬
‫ת כ ו ל ה ‪ ,‬מבנה‬
‫ב‪.‬‬
‫חקירת הקשר מ ם נ ג י ר ר י ב ו ז ו מ י ם‬
‫‪53‬‬
‫‪58‬‬
‫פ ע י ל ו ת ה ג נ ו ם בשלבי ה נ ב י ט ה ה ר א ש ו נ י ם של ע ו ב ד החיטה‬
‫א‪.‬‬
‫מ ו ע ד תחלת ת ה ל י ך ה ם ר נ ם ק ר י פ צ י ה‬
‫‪61‬‬
‫ב‪.‬‬
‫הוכחה ל נ ו כ ח ו ת מ ם נ ג י ר ב ע ו ב ר היבש‬
‫‪63‬‬
‫ג‪.‬‬
‫ה ש י נ ו י י ם החלים ב א ו כ ל ו ם י ת ה מ ס ג ' עם ה נ ב י ט ה‬
‫‪64‬‬
‫השפעת ה ד ה י ד ר צ י ה על ע ו ב ר החיטה ה נ ו ב ט‬
‫‪.1‬‬
‫הסתכלות ב מ י ק ר ו ס ק ו פ ה א ל ק ט ר ו נ י בתאי ע ו ב ר י ם שעברו‬
‫‪.2‬‬
‫פעילות פרוטיאוליטית‬
‫‪.3‬‬
‫ה ש נ ו י י ם בתכולת ה ח ל ב ו ן‬
‫‪.4‬‬
‫הרכב ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ ו של ה ח ל ב ו ן ה צ י ט ו פ ל ס מ ת י ב ע ו ב ר י חיטה שעברו דהי; ר צ י ה ‪76‬‬
‫‪•5‬‬
‫‪.6‬‬
‫ב ע ו ב ר י חיטה שעברו‬
‫דהידרציה‬
‫ם י נ ת ז ת ה ח ל ב ו ן ב ע ו ב י חיטה שעברו‬
‫‪71‬‬
‫דהידרציה‬
‫הרכב ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ ו ב מ ם ו ג ר החפשי ב ע ו ב ר י חיטה שעברו‬
‫‪75‬‬
‫דהידרציה‬
‫‪78‬‬
‫דהדרציה‬
‫א‪.‬‬
‫כושר ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של ח ו מ צ ו ת א מ י נ ו‬
‫ב‪.‬‬
‫א י ת ו ר ה ג ו ר ם ה מ ג ב י ל את ם י נ ת ז ת ה ח ל ב ו ן כתוצאה מ ד ה ד ר צ י ה‬
‫ג־‬
‫‪.7‬‬
‫ו נ ו ק ל י א ו ל י ט י ת המושרית עייי‬
‫דהידרציה‬
‫‪66‬‬
‫‪81‬‬
‫התכולה‬
‫ה א נ ד ו ג נ י ת של‬
‫פעילות‬
‫אמינו אציל‬
‫פעילות‬
‫ג ו ר מ י " ה ט ר נ ס פ ר " במשפה ‪S - 1 0 0‬‬
‫‪85‬‬
‫פעילות‬
‫הריבוזומים‬
‫‪87‬‬
‫ש נ ו י י ם בהרכב א ו כ ל ו ם י ת ה ר י ב ו ז ו מ י ם‬
‫‪89‬‬
‫‪mRNA‬‬
‫ב ע ו ב ר י חיטה שעברו‬
‫א‪.‬אנקורפורציה‬
‫סל‬
‫נ ו צ ר ‪mRNA‬‬
‫‪P‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫‪83‬‬
‫סנטטז‬
‫‪84‬‬
‫דהדרציה‬
‫‪RNA‬‬
‫‪92‬‬
‫בתקופת מהרטבה המחודשת‬
‫‪93‬‬
‫‪32‬‬
‫ל‬
‫ב‪.‬‬
‫האם‬
‫ג‪.‬‬
‫‪mRNA‬‬
‫בעוברים עמידים לדהידרציה‬
‫ד‪.‬‬
‫‪mRNA‬‬
‫בעוברים רגישים לדהידרציה‬
‫‪94‬‬
‫י‬
‫‪96‬‬
‫עמוד‬
‫‪.8‬‬
‫די ו‬
‫ז‬
‫‪.‬‬
‫‪DNA‬‬
‫בעוברי חיטה שעברו דהידרציה‬
‫‪97‬‬
‫‪99‬‬
‫סכום‬
‫‪108‬‬
‫ספרות‬
‫‪111‬‬
‫תקציר אנגלי‬
‫‪115‬‬
‫בחיפוש אחרי קיומם ?סל םמני חיי• מחוץ לכדור הארץ היו תעלות המאדים המדומות אות‬
‫ותקוה כי אכן יתכנו חיים על פני אותו כוכב לכת רחוק‪ .‬תקוות אלו התבטםו על הנחת היםוד כי‬
‫המים הם תנאי הכרחי לקיומם של חיים עלי אדמות ‪.‬‬
‫בםמפוזיון על ראשית הווצרות החיים ‪ ,‬מסכמים אופרין וחבריו )‪ (1‬כי ראשיתן של צורות חיים‬
‫על פני כדור הארץ מותנית היתה בקיומה של ההידרוספרה‪ .‬נראה כי בעוד רבה היתה התענינות‬
‫החוקרים בחלקם של המים בצורות חיים על פני הכוכבים‪ ,‬או בהתהוות ארכאית של צורות חיים‬
‫פרימיטיביות‪ ,‬הרי כביטויו של גיוליאן הקםלי "שכחה הביולוגיה את המים כפי שהדג מתנכר‬
‫למים")‪ .(2‬חלקו של מרכיב זה בתא החי‪ ,‬בתהליכים המלוים את התפתחותו ובמערכות היחסים‬
‫המורכבות השוררות ביצורים רב תאיים‪ ,‬נחקר במידה רבה באקראי‪ ,‬על אף שלא ייתכנו חיים מבלעד‬
‫המים מהווים כ‪ 80-‬אחוז ממשקלו של האדם )‪ ,(3‬כ־‪ 90$‬ממשקלו של הצמח )‪ (4‬ונדירות‬
‫ביותר הרקמות בהן יורדת תכולת המים מתחת ל‪ 50-‬אחוז )זרעים‪ ,‬צפרניים‪ ,‬ספורות(‪ .‬מסתבר‪,‬‬
‫איפוא‪ ,‬כי כאשר במהלך האבולוציה חל המעבר מצורת החיים במים‪ ,‬לחיים בסביבה יבשתית‪ ,‬לא גרם‬
‫המעבר הזה לירידה בתכולת המים בגופם של יצורים יבשתיים‪ .‬היצור החי היבשתי נושא בתוכו את‬
‫סביבתו המימית ורמת המיום הגבוהה מתמידה עד השלמת מעגל החיים של הפרט‪.‬‬
‫המיחד את החיים על ?ני היבשה הוא המפל החריף של פוטנציאל המים בין האוגניזם החי‬
‫ובין סביבתו‪ .‬היצור החי ויהא זה מיקרואורגניזם‪ ,‬בעל חיים גבוה או צמח‪ ,‬נתון בתהליך‬
‫התיבשות מתמיד‪ .‬קיומו והתפתחותו של החי מותנים ביכולתו לפצות את אובדנם המתמיד י ז ל המים ע‬
‫קליטת מים מקבילה‪ .‬יכולת הומיאםטםית זו היא אולי מביטוייה הבולטים ביותר של מלחמת הקיום‪.‬‬
‫האוניברסליות שבהקשר תופעות החיים והמים עשתה הקשר זה למובן מאליו )‪ (5‬ורבים‬
‫החוקרים המתיחסים אל המיס כאל מדיום אנרטי אשר בתוכו מתרחשים התהליכים הביוכימיים‪ ,‬בניה‬
‫והרם של מולקולות וטנזרוקטורות‪ ,‬תהליכי טרנספורט והתחלקות אנרגיה‪ .‬נראה כי המחקר הביולוגי‬
‫המודרני הביא לשנוי בגיסה זו‪.‬‬
‫י י ש ו מ ו של ה י ד ע שהצטבר בחקר ה ת כ ו נ ו ת ה פ י ז י ק ל י ו ת ה מ י ו ח ד ו ת ט ל ה מ י ם ‪ ,‬אפשר את חקירהם‬
‫של ה י ח ס י ם ה ק י מ י ם ב י ן‬
‫נמטי‬
‫כן‬
‫מ ק ר ו מ ו ל ק ו ל ו ת ב י ו ל ו ג י ו ת ו ם ב י ב ת ן ה מ י מ י ת ‪ .‬ח ו ק ר י ם כאדםל )‪,(3‬‬
‫ק ל ו ץ )‪,(6‬‬
‫ושרגא )‪ ,(7‬ת י א ר ו את חלקן של מ ו ל ק ו ל ו ת המים ב י י צ ו ב ה ק ו נ פ ו ר מ צ י ה של מ ו ל ק ו ל ו ת ח ל ב ו ן ‪.‬‬
‫נמצא כ י מספר רב של א נ ז י מ י ם מ ש נ י ם את קצב פ ע י ל ו ת ם כתוצאה מ י ר י ד ה ב א ק ט י ב י ו ת ה מ י ם ‪.‬‬
‫שנויים‬
‫חלו‬
‫אלו‬
‫יוחסו‬
‫לשנויי‬
‫ק ו נ פ ו ר מ צ י ה מן הטיפוס‬
‫‪helix coil transition‬‬
‫ב מ ו ל ק ו ל ו ת ה א נ ז י מ י ם ת ו ך ע ר ע ו ר ה א נ ט ר ק צ י ו ת ה ה ד ר ו פ ו ב י ו ח )‪.(8‬‬
‫משתתפים ב י צ י ר ה‬
‫התא החי‬
‫א י פ ו א ‪ ,‬כ י המים‬
‫ו י י צ ו ב המבנה המרחבי של ה מ ק ר ו מ ו ל ק ו ל ו ת ה ב י ו ל ו ג י ו ת ‪.‬‬
‫ב נ ו י בדרגת א י ר ג ו ן ג ב ו ה ה ‪.‬‬
‫של דרגת א ר ג ו ן ג ב ו ה ה‬
‫ומערכות‬
‫נמצא‪,‬‬
‫ואשר‬
‫זו‪.‬‬
‫ה י י ח ו ד ו ה ת י א ו ם של ה פ ע י ל ו ת ה מ ט ב ו ל י ת ה ט ו נ ה מותנים ב ק י ו מ ה‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה ג נ ט י ת ממוקמת ב כ ר ו מ ו ז ו מ י ם ‪ ,‬מערכות ה ח י מ צ ו ן‬
‫‪ -‬במטוכונדריה‬
‫הפוטוסינתזה ב כ ל ו ר ו פ ל ם ט י ם ‪ .‬המבנה של ח ל ק י ק י ם תת ת א י י ם א ל ו נשמר ב מ י ד ה רבה ת ו ד ו ת‬
‫ל מ י ם באמצעותם של מערכת ה מ מ ב ר נ ו ת ו ה ל ח ץ ה א ו ם מ ו ט י ) ‪ . ( 9‬כ ל ש נ ו י במבנה ה ח ל ק י ק י ם ה ת ת ‪ -‬ת א י י ם‬
‫באמצעות ש נ ו י‬
‫אלו‬
‫א ק ט י ב י ו ת המים מ ב י א עמו ש נ ו י ב א ו פ י‬
‫ת ו א ר ו ב ע י ק ר ב מ י ט ו כ ו נ ד ר י ה שבהן הראו‬
‫מירידה‬
‫ידועה‬
‫חמצן‬
‫ב א ק ט י ב י ו ת המים )‪.(9‬‬
‫זה מ כ ב ר ‪.‬‬
‫לחומצה‬
‫ו פ ו ם פ ו ר י ל צ י ה כתוצאה‬
‫הפרת ה צ י מ ו ד ב י ן נשימה‬
‫השתתפות מ ט ב ו ל י ת י ש י ר ה של מ ו ל ק ו ל ו ת מ י ם ב ת ה ל י כ י ם ש ו נ י ם בתא‬
‫ב ר י א ק צ י ה ה י ל ) ‪ ( 1 0‬משמשים המים כםובסטרט לתהליך ה פ ו ט ו ל י ט י בו משתחררים‬
‫ו מ י מ ן ‪ .‬המים משתתפים ב ת ה ל י כ י‬
‫לחומצה פ ו ס פ ו‬
‫פ ע י ל ו ת ן של המערכות ה א נ ז י מ ת י ו ת ‪ .‬ת ו פ ע ו ת‬
‫ה ג ל י ק ו ל י ז ה ) ‪ , ( 1 0‬כ מ ו במעבר מחומצה פ ו ס פ ו‬
‫פ י ר ו ב י ת המתבצע ב ע ז ר ת א נ ו ל ז ‪,‬‬
‫ו ב פ ו ם פ ו ר י ל צ י ה של‪ATP‬‬
‫במעבר מ פ ו ם פ ו פ י ר ו ב י ת‬
‫פ י ר ו ב י ת ‪ .‬ב ת ה ל י כ י נשימה מתחמצן ה צ י ט ו כ ר ו ם ה מ ח ו ז ר ת ו ך י צ י ר ת מ ו ל ק ו ל ת מ י ם ) ‪. ( 1 1‬‬
‫כ ל ה ר י א ק צ י ו ת שבהן משתתפים א נ ז י מ י ם ה י ד ר ו ל י ט י י ם ד ו ר ש ו ת מ י ם כםובםטרט‬
‫כי‬
‫גליצרית‬
‫)‪.(5‬‬
‫א י ן א י פ ו א ספק‬
‫יש להתיחם אל המים גם כאל מ ט ב ו ל י ט ת י פ ק ו ד י ‪.‬‬
‫מ כ ל ו ל השטחים שבהם יש ח ש י ב ו ת למים בתא החי מ ח ד ‪,‬‬
‫נתון‬
‫ה א ו ר ג נ י ז ם היבשתי מ א י ד ך ‪ ,‬מ צ ב י ע י ם על ה ע נ י ן‬
‫מ י ם על ה מ ט ב ו ל י ז ם ו ד ר כ י‬
‫ו ת ה ל י ך ההתיבשות המתמיד ב ו‬
‫ה ב י ו ל ו ג י ה כ ל ל י ה ט מ ו ן בחקר השפעת מחסור‬
‫ה ר ג ו ל צ י ה ו ה ה ס ת ג ל ו ת של ה א ו ר ג נ י ז ם ל ת נ א י‬
‫י ו ב ש ‪ .‬חקר י ח ס י מ י ם ‪ -‬צ מ ח‬
‫התפתח ב מ י ו ח ד עקב החשיבות ה כ ל כ ל י ת הרבה שיש ל ת ו פ ע ו ת א ל ו ב ח ק ל א ו ת ‪.‬‬
‫סקירות נרחבות בשטח זה פורסמו על ידי מקסימוב )‪ ,(12‬םטוקר )‪ ,(13‬לויט )‪ ,(14‬קרמר )‪,(15‬‬
‫קרפט וקוריר )‪ ,(4‬ולאחרונה על ידי םלטיר )‪ .(16‬בעוד ידע רב הצטבר בתחום הפיסיקלי של קליטה'‪,‬‬
‫טרנספורט וטרנםפירציה )‪ ,(17‬או מורפולוגיה‬
‫של קרוםפיטים )‪ ,(18‬הרי יחסית רק מעט ידוע על הנעשה‬
‫במישור המטבולי ‪ -‬מולקולרי‪ ,‬בצמחים שגדלו בתנאי דהידרציה‪ .‬מיעוט ידע זה‪ ,‬הוא האחראי לריבוי‬
‫התיאוריות המנסות להסביר את פגיעת היובש בצמחים‪ .‬את התיאוריה המכניסטית פיתת אלין‬
‫)‪,(19‬‬
‫הטוען כי הדהידרציה גורמת לקריעה מכנית של הפדוטופלסמה והםמברנות ומכאן הנזק החמור לגידולו‬
‫של הצמח‪ .‬לוימ )‪ (14‬ניסה לישם את הידע המודרני לצרכי הגישה המכניםמית‪ .‬לויט הציע כי שיחלוף‬
‫ש‬
‫ל‬
‫ק‬
‫ש ר י‬
‫‪3-3‬‬
‫בזמן ההתיבשות גודם לדפורמציה של חלבונים ציטופלםמטיים בזמן הידדציה מחודשת‪.‬‬
‫לתאוריות אלו אין כל ביסוס נסיוני ומכלול שלם של תופעות הקשור באינטרקציה בין גידול והידרציה‬
‫אינו מוסבר על ידן‪ .‬במחזור החיים של רב הצמחים נמצא שלב הזרע שבו עובר הצמח דהידרציה כמעט‬
‫מוחלטת למצב הדומה לזה של חלבון גבישי עם תכולת מים של ‪ .8$‬העובר עובר את הדהידרציה ללא כל‬
‫נזק ודיה לקליטת מים שתניע מחדש את כל המנגנון הםינטטי )‪.(20‬‬
‫‪(21‬‬
‫במספר צמחים ^ ‪c e t e r a c h‬‬
‫‪ ( o f f i c i n a r u m‬חלה התיבשות מלאה של הצמח השלם ללא כל נזק‪.‬‬
‫כן ניתן כיום ליבש תאים‬
‫שלמים או מרכיביהם ככלורופלםטים‪ ,‬גרעינים‪ ,‬אנזימים וחי גרעין פונקציונליות‪ ,‬ללא פגיעה בפעילותם‬
‫הביולוגית‪ .‬מכאם אפשר לראות בי ההדרציה אינה תנאי הכרחי לסימור תכונות החיים‪ ,‬ואין זה מובן‬
‫מאליו שהדהידרציה גורמת לנזק בדרך מכנית בלבד‪.‬‬
‫מאידך ברור כי השמירה על החיוניות הפוטנציאלית במצב היבש‪ ,‬אין פירושה קיום הפעילויות‬
‫המאפינות את תהא החי כגון‪:‬‬
‫הכפלה‪ ,‬דפרנציאציה ופעילות מטבולית‪ .‬מכאן שאת הקשר בין ההידרציה‬
‫והאורגניזם יש לחפש בתחום הדינמי של תופעות החיים‪.‬‬
‫דומה כי אין חולק כיום על כך שלמחסור מים יש השפעה ניכרת על המטבוליזם בצמחים‪.‬‬
‫עבודותיהם של סטוקר )‪ (13‬ומוטם )‪ (22‬בגרמניה ומקםימוב )‪ (12‬וסםקיאן )‪ (23‬ברוסיה‪ ,‬הניחו‬
‫את היסוד לגישה המטבולית בשנות השלושים המוקדמות‪ .‬גישה זו ראתה את התחום הדינמי של הפעילות‬
‫המטבולית כתחום שבו פועל היובש על התאים‪ .‬מן התופעות הראשונות שתוארו יש לציין את הירידה‬
‫ביעילות הפוטוסינתזה והתגברות הנשימה )‪.(22 ,17 ,16‬‬
‫‪ 2‬תהליכים אלו גורמים להפחתה ביבולים‬
‫חקלאיים הנמדדת בירידה שבמשקל יבש ליחידת שמח‪ .‬נראה כי הפרח הצימוד בין הפוספורלציה לחמצון‬
‫הנגרמת ע״י מחסור המים אחראית לתופעות הללו ) ‪ . ( 2 4‬המעבר המטבולי של ^‪00‬‬
‫דרך המעגל המטבולי‬
‫אל תוך חומצות האמינו נחסם ) ‪ ( 2 5‬וחלה העדפה במעבר לפולימרים של דופן התא‪ .‬העליה בשעורם‬
‫היחסי של חומרי דופן כצלולוז‪ ,‬פקטין‪ ,‬לגנין ורזינים שונים היא אופינית לצמחים שגדלו במחסור‬
‫מים ) ‪ . ( 1 3 , 4‬מערכות אנזימטיות רבות נמצאו מושפעות על ידי יובש‪ .‬הסינתזה של טריפאופאן‪,‬‬
‫מזרין‪ ,‬ואנדול דוכאה בצמחי דלועיים ) ‪ . ( 2 6‬פעילותן ההידרוליטית של פוספסזות שונות הוגברה‬
‫) ‪ . ( 2 3‬קטלז ) ‪ , ( 2 7‬ריבונוקליאז ) ‪ . ( 2 8‬עמילז ) ‪ ( 2 9‬ואנורטז ) ‪ , ( 3 0‬הושפעו על ידי דהידרציה‬
‫ופעילותן גברה‪ .‬פעילות דהידרוגנז‪ ,‬פראוקםידז‪ ,‬םוכרז ופוםפטז ‪ -‬בעלי חיטה שנחשפו למחסור‬
‫מים ירדה בשיעור ניכר‪ .‬יקשה למצוא מכנה משוחף בין התגובות השונות של האנזימים בצמחים‬
‫שנפגעו ע״י יובש‪.‬‬
‫הידרוליזה של חלבון מתוארת תכופות ) ‪ ( 2 2 , 1 7 , 1 3‬כתגובה כללית של צמחים למחסור‬
‫מים‪ .‬כן תוארה עליה ניכרת בריכוז חומצות האמינו במאגר החופשי ) ‪ . ( 3 2 , 3 1‬בסקירה שערכנו‬
‫) ‪ ( 3 3‬נראה כי‪ ,‬רב ממצאי המחקר מצביעים דוקא על עליה ניכרת בשיעור החלבון בצמחים שגדלו‬
‫בתנאי מתםור מים‪ .‬עלית שיעור חומצות האמינו החופשיות אינה מעידה בהכרח על פרוק חלבון‪.‬‬
‫עליה כזו תיתכן גם ע״י מעבר תומצות אמינו מחלקי צמח אחרים אשר לא נבדקו‪ ,‬וגם על ידי‬
‫סינתזה נמרצת של החומצות עצמן ) ‪. ( 3 2‬‬
‫מבין השינויים שחלו בהרכב החומצות האמינו החופשיות בהשפעת מחסור מים בולטת‬
‫במיוחד העליה הפתאומית והגדולה בריכוזו של הפדולין ) ‪ . ( 3 9‬נמצא כי אמנם עליה זו היא‬
‫תוצאה של השראת םינתזת הפרולין ) ‪ . ( 3 4‬עליה בולמת נוספת היא זו של האמידים גלוממין‬
‫ואםפרגין והן ארגינין בנוסף לאמוניה חופשית ) ‪ . ( 3 2 , 2 2‬הירידה הדרסטית ברמת החומצה‬
‫הגלוטמית שתוארה על ידינו בנבטי הדרים ) ‪ ( 3 5‬תוארה לאחר מכן בצמחי אפונה כאינדוקציה של‬
‫דאמינציה אוקסידטיבית ) ‪. ( 3 6‬‬
‫‪-‬‬
‫‪•J‬‬
‫‪-‬‬
‫במספר עבודות תוארו גם שנויים בולמיס בהרכב ובמטבוליזט של החומצות הנוקלאיות‪.‬‬
‫גטם ובונר )‪ (37‬הראו ירידה בסינתזה נטו של ‪ RNA‬כללי כאשר נבטי עגבניה סבלו ממחסור מים‪.‬‬
‫הוכח כי האנקורפוראיה שקי*^־?‬
‫אל תוך ה‪RNA-‬‬
‫לא נפגעה ומכאן מסקנת המחברים כי הסיבה‬
‫^‪HNA-‬‬
‫לירידה ברמת ה‪ RNA -‬היא הדרוליזה מוגברת‪ .‬שן ולומים )‪ (38‬הראו ירידה ברמת‬
‫הכללי של עלי סלק אשר השקיתו הופסקה‪ .‬לא נמצא הבדל בולט בהרכב הבסיסים מלבד ירידה קלה‬
‫בתכולת ‪G-n‬‬
‫ועליה ב‪ . \]-‬וסט )‪ (39‬הראה כי כמות ‪RNA-n‬‬
‫מים והרכב הבסיסים היה שונה מזה של צמחי הבקורת בתכולת‪0‬‬
‫של נוקליאוטידים חופשיים הראתה ירידה ברמת ^‪ADP-‬‬
‫נכבה )‪ (40‬הראתה היעלמות ‪ UTP , GTP‬ו‪ATP -‬‬
‫צלניקר‬
‫ה ר א ן ;‬
‫כ י‬
‫ק י י ט‬
‫י ן ז ם‬
‫י ש ר ב י‬
‫ן‬
‫(‬
‫‪1‬‬
‫בנבמי תירס עלתה במחסור‬
‫י— ‪U‬‬
‫גבוהים יותר‪ .‬ברומטוגרפיה‬
‫ו‪ ATP -‬ועליה ברמת ‪UMP, AMP‬‬
‫ו‪CMP -‬‬
‫בצמחי חיטה שלא הושקו‪ ,‬תוך עליה ניכרת‬
‫‪4‬‬
‫במספר עצי יער‪ .‬גרדנר ונמן )‪ (42‬אף הם הראו כי רמת ^־‪DNA‬‬
‫_‪ DNA‬ורמת המים‬
‫)‬
‫‪nn‬‬
‫‪3a1‬‬
‫הכללית יורדת בנבטי צנון‬
‫שסבלו ממחסור מים‪ .‬לאחרונה מסרו םטורני ומרי )‪ (43‬על פגיעת הדהידרציה בהוליזומים סל‬
‫נבטי קקיון והופעה מחודשת של ריבוזומים פעילים לאחר הרטבה מחודשת‪.‬‬
‫מספר סיבות לכך שהעובדות הרבות על ההשעעה המטבולית שיש לדהידרציה בצמחים לא‬
‫הצטברו לתמונה כוללת יותר‪:‬‬
‫א‪ .‬היעדר השערת עבודה מתאימה לפיה ניתן לפרס את הנתונים הנםיוניים‪.‬‬
‫ב‪ .‬ריבוי הדרכים ליצירה נםיונית של מחסור המים‪ .‬לעיתים קרובות הושרה היובש‬
‫על ידי ניתוק האורגן מצמח האם‪ ,‬או על ידי העלאת הטמפרטורה‪ .‬אין אפשרות‬
‫להבדיל בין השפעת הניתוק או הטמפרטורה הגבוהה והשפעת הדהידרציה על התופעות‬
‫הנתקרות‪.‬‬
‫ג‪ .‬היעדר ביקורות מתאימות‪ .‬לעיתים הושוו זנים עמידים ליובש עם זנים רגישים‪,‬‬
‫אולם לרב לא נקבע עם העמידות היא אמיתית )‪ (12‬או מניעתית )‪.(14‬‬
‫על מרבית הקשיים הנזכרים ניתן להתגבר במערכת העובר הנובט‪ .‬העובר היבש )שאינו במצב של‬
‫תרדמה( נמצא במצב לטנטי‪ .‬דיה לקליטת מים כדי להניע את מכלול המאורעות המולקולרייס‬
‫המביאים לגידולו ולהתפתחותו של הצמח הבוגר‪.‬‬
‫בשעות הנביטה הראשונות אפשר עדייז לחזור וליבש את הנבט ללא כל נזק‪ .‬לאחר מספר מסוים של‬
‫שעות נביטה אין יותר אפשרות ליבש את הנבט מבלי לגרום להפסקת גידול מחלטת ובלתי חוזרת‪.‬‬
‫מכיון שאותו צמח הוא שעבר‬
‫ממצב של עמידות מלאה למצב הרגיל של רגישות למחסור מים‪ ,‬הרי‬
‫אין הבדלי העמידות נובעים ממקור גנטי‪ .‬בגלל העמידות המלאה בשלב הנביטה הראשון אפשר‬
‫להגיע ליבוש מלא של הנבט מבלי לגרום לנזק וללא הסיבוכים המלווים שמירת מתח מים נמוך‬
‫בקרקע‪ .‬היעדר מערכת שרשים מפשט את גורם קליטת המים‪ ,‬והעדר פעילות פוטוסנטטית מאפשר‬
‫התרכזות בחקר תהליכי היסוד הקשורים בגידול‪ .‬כך יש לנו האפשרות לחקור במישרין את השפעת‬
‫ההידרציה על תהליכי הגידול‪ ,‬במערכת צמחית פשוטה באופן יחסי‪.‬‬
‫תקירה כזו דורשת ידיעה על התהליכים הביוכימיים המתרחשים בשלבי הנביטה הראשונים‪.‬‬
‫מרכוס )‪ (44‬ולאחר מכן אלנדה )‪ (45‬הראו כי עובר חיטה יבש מכיל את כל הדרוש לסינתזה‬
‫החלבון דהיינו‬
‫‪ ,.tRNA‬מערכות אנזימתיות לאקטיבציה של חומצות אמינו‪ ,‬טעינה של ‪tRNA‬‬
‫‪. mRNA‬‬
‫ופולימריזציה של חומצות אמינו וכן ריבוזומים אשר אינם פעילים ללא תוספת‬
‫נמצא‬
‫)‪ (46‬כי הרטבה אינה מסוגלת להפעיל מיד את סינתזת החלבון ורק לאחר שעה של נביטה מתחילה‬
‫סינתזה החלבון המגיעה ל‪ 80-‬אחוז מכושרה המלא אחרי ‪ 12‬שעות נביטה‪ .‬נמצא כי העובר היבש‬
‫מכיל רק מונוזומים והופעת הפוליזומים מתחילה רק עם תחילת ביוסינתזת החלבון בעובר הנובט‪.‬‬
‫מעבודות אלו לא ברור אם הופעת הפוליזומים לאחר הנביטה היא תוצאה של סינתזת מסנג׳ר‬
‫חדש בתקופה זו‪ ,‬או של אקטיבציה של ‪mRNA‬‬
‫אשר נבח העובר בצורה בלתי פעילה‪.‬‬
‫י‪ .‬חן ודגרוט )‪ (47‬הראו כי ניתן להפעיל ריבוזומיס בלתי פעילים שהופקו מעוברי חיטה יבשים‪,‬‬
‫בעזרת טיפול באנזימים‬
‫פרוטיאוליטים‪.‬‬
‫מצב דומה של חוסר פעילות הריבוזומים בזרעים יבשים נמצא גם בבוטנים קקיון )‪ .(48‬וכן‬
‫בעוברי אורז )‪ .(49‬לעומת זאת טוענים דיורס ו ו וטרם )‪ (50‬כי מםנגיר ‪RNA‬‬
‫חדש נוצר עם‬
‫הנביטה ‪ .‬נםיונות אלו לא אושרו ע״י מרי וקבוצתו )‪.(48‬‬
‫שורת אנזימים רחבה משתמרת בזרע היבש‪ .‬על אלו נמנות מערכות חמצן‪-‬חיזור‪ ,‬נשימה‪ ,‬גליקוליזה‬
‫ופוםפורילציה )‪ .(51‬חלק מן האנזימים עבור אינאקטיבציה בזרע היבש אך הנביטה מאפשרת הפעלה‬
‫מחודשת של אנזימים אלו‪ .‬לעומת זאת הוכחה גם סינתזה דה‪-‬נובו של ‪ 2‬אנזימים עם הנביטה‪ :‬עמילז‬
‫בזרעי שועל נובטים )‪ (52‬ואיזו ציטרט ליאז בקקיון )‪ .(48‬הופעת שני האנזימים היתה תלויה‬
‫בסינינזה של ‪RNA‬‬
‫‪ .‬מועדי ההופעה של הפעילויות האנזימתיות‪ ,‬בין אם על ידי אקטיבציה או‬
‫אינדוקציה‪ ,‬מתואמים ומותנים במועד קליטת המים‪ .‬גם תהליכי ההכפלה של‬
‫ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬וחלוקת התאים‬
‫מתחילים רק לאחר מספר שעות נביטה בשעה שסינתזה החלבון ותהליכי הנשימה נמצאים במלוא עוצמתם‬
‫בזרע הנובט )‪ .(48 ,51‬נראה‪ ,‬איפוא‪ ,‬כי בתאי העובד חיבת להיות מערכת בקרה השלטת בתאום של‬
‫תהליכי הנביטה אם באמצעות אקטיבציה של אנזימים )בקרה ברמת התפקוד(‪ ,‬אינדוקציה אנזימתית‬
‫)בקרה ברמת הטרנםקריפציה( ופקוח על בטוי הפםנגיר )בקרה בדמה של התרגום(‪ .‬קליטת המים היא‬
‫איפוא‪ ,‬המפעילה את התהליכים ומערבת הבקרה המורכבת שלהם‪ .‬בך אפשר באמצעות תהליך הנביטה‬
‫ללמוד על המיקום והדרך שבה משפיעים המים על הגדול‪ .‬מאידך‪ ,‬ניתן על ידי דהידרציה חוזרת של‬
‫הנבט ללמוד על האופן שבו פוגעת הדהידרציה בתהליכים ובמבנים אשר קודם לכן הופעלו על ידי‬
‫המים‪.‬‬
‫מטרת‬
‫_ה_ע ב ו ד_ה‬
‫בעבודה זו הצבנו לנו כמטרה ראשונה מציאתה של מערכת צמחית שבה ניתן יהיה לחקור‬
‫יחסי מים‪-‬צמח‪.‬‬
‫מערכת זו צריכה להיות פשוטה דיה כדי לאפשר חקירה ברמה המולקולרית ועם זאת עליה להיות‬
‫מספיק מורכבת כדי לדמות לצמח השלם‪.‬‬
‫בכל המחקרים של יחסי מים‪-‬צמת אין כל הבחנה בין תופעות שהן משניות ואינן קשורות ישירות‬
‫בנזקים הנגרמים על ידי מחסור מים‪ .‬על המערכת להתגבר על קושי זה באמצעות בקורות מתאימות‪.‬‬
‫כמטרה שניה היה עלינו לבחון במערכת הנידונה את נכונותן של התיאוריות העקריות‬
‫אודות התהליכים הביוכימיים המתחוללים בצמחים הנתונים למחסור מים‪.‬‬
‫הממרה השלישית היתה חקירתם של המאורעות המתרתשים ברמה תת‪-‬חאית בהשפעת המים‪.‬‬
‫מכיון שהמערכת שנחקרה היתה זו של עובר חיטה נובט‪ ,‬היה עלינו לחקור מחד את המאורעות‬
‫המולקולריים המתרחשים בעובר חיטה יבש עם בואו במגע עם המים בתחילת תהליך הנביטה ומאידך‬
‫היה עלינו לתקור את הקורה בעובר נובט כאשר הוא עובר דהידרציה‪.‬‬
‫בעבודה זו הגבלנו את עצמנו להתענינות בקשר שבין זמינות המים ותהליכי היסוד‬
‫הקשורים בתופעת הגידול וההתפתחות‪.‬‬
‫ח מ ר י ם‬
‫זרעי החיטה בכל הנםויים היו מזץ ״ ‪163‬‬
‫מתנת תחנת הנסיונות נוה יעד‬
‫‪Triticum Dur^ura Var. Nursite‬‬
‫וחברת הזרע‪ .‬הזרעים היו מנופים ובלתי מחוטים‪ .‬כל החמרים‬
‫הכימיים היו בדרגת נקיון אנליטית‪.‬‬
‫‪DNAase (Electrophoretically Pure, YJorthington Biochsn. Corp).‬‬
‫אנזימים‪:‬‬
‫‪RNAase, (5X cryst. Grade A., Cal. Biochem).‬‬
‫‪Phospho Enol. pyruvic kinase, (PEP), Sigma Chem. Corp.‬‬
‫‪Fronase, Grade B, C a l . Biochem.‬‬
‫נתקבל מיוסי קמחי‬
‫‪Poly Nucleotide phosphorylase‬‬
‫נתקבל מאורי ליטאור‬
‫‪Phenylalanile-tRNA synthetase‬‬
‫נוקליאוטידים ופולינוקליאוטידים נקנו בחברה‪:‬‬
‫חומצות אמינו מםומנות‪,‬ב‪-‬‬
‫‪2‬‬
‫קנה בחברת‬
‫אורידין ‪C ^ -‬‬
‫אקטינומיצין‬
‫‪3‬‬
‫‪a‬‬
‫‪m‬‬
‫)‪ (U.L.‬נקנו ב‪-:‬‬
‫‪New England Corp.‬‬
‫‪m‬‬
‫‪Radiochemical Center, A‬‬
‫‪s‬‬
‫‪h‬‬
‫דיפוםפט‪ ,‬טימידין )‬
‫‪D‬‬
‫‪ ,‬מנוקה על‬
‫‪•Q‬‬
‫‪na‬‬
‫מכילה‪-SM‬‬
‫‪5‬‬
‫סוכדוז‪,‬‬
‫‪X‬‬
‫‪r‬‬
‫‪e‬‬
‫או^״ס ( נקנו ב‪:‬־‬
‫‪Fisher, U.S.A.‬‬
‫‪2‬‬
‫ט ר י ס ‪1MKC102.5x7 . 8 1 0 ~ I 1‬‬
‫בופד‬
‫‪.~^10x5‬אתנול‪.‬‬
‫מכיל‬
‫‪f~^0xi‬‬
‫‪~10X‬‬
‫‬‫‪,‬‬
‫‪2‬‬
‫‪pH‬‬
‫מרקפתו‪-‬אתנול לבופד!־!‪^TMM.‬הופכתאותו‬
‫*‬
‫‪Tris‬‬
‫!‬
‫באדיבותו של מר יהושע רודיג‪.‬‬
‫‪Schwarz Bioresearch‬‬
‫היה מתנת דייר פ‪ .‬פרומגיוט הועדה לאנרגיה אטומית‪ ,‬צרפת‪.‬‬
‫פנול נוזלי וריאגנט פיליז היו תוצרת‬
‫‪,‬‬
‫‪Sigma Chan. Corp.‬‬
‫‪H‬‬
‫‪p‬‬
‫‪,‬‬
‫התמיסה עברה סטרליזציה לפניהשמוש‪-‬מרקפתו‪M‬‬
‫‪M‬‬
‫‪ .‬תוספת‬
‫‪10 -‬‬
‫‪1‬‬
‫‪,‬‬
‫‪1‬‬
‫‪C‬‬
‫‪g‬‬
‫‪M‬‬
‫‪-‬‬
‫‪2‬‬
‫^"‪,1X10‬‬
‫‪M T r i s , pH " :7.8 0.1MKC1‬‬
‫מכיל‬
‫‪saline‬‬
‫•‬
‫‪NaCl0.15,EDTA‬‬
‫‬‫‪Na c i t r a t e‬‬
‫‪NaCl,0.15M‬‬
‫תמיסת הנבטה‬
‫‪M‬‬
‫‪M‬‬
‫מכילה‪ 1$ :‬גלוקוז‪ 50 ,‬םיקרוגרם‪/‬מ״ל כלורמפניקול‪ 200 ,‬מיקרו גדם‪/‬מ״ל‬
‫‪-3‬‬
‫‪ 5x10‬בופר טריס‬
‫מיקוסטטין‪,‬‬
‫‪.7.8‬‬
‫ש י ט ו ת‬
‫גידול וםימוז עוברי חיטה‬
‫זרעים שלמים‪:‬‬
‫זרעי החיטה הונבטו בצלחות פטרי עם מ י ברז בטמפ׳ ש ל ^‪ 23‬בחושך‪.‬‬
‫בדוד עוברים‪:‬‬
‫עוברי החיטה הוכנו בשיטת ג'ונסטון‪-‬שטרן )‪ .(53‬הזרעים נטחנו עם קרח יבש‪,‬‬
‫ו והמקטע שנאסף על נפת‬
‫טטראכלוריד‪,‬‬
‫‪30‬‬
‫‪mesh‬‬
‫הופרד לפי הבדלי צפיפות בתמיסת ציקלו הקםן‪-‬קרבון‬
‫י ו ב ש והופרד בעזרת מפוח זרעים ל־‪ 3‬מקטעים‪ .‬המקטע שהכיל למעלה מ־״?‪ 95‬חלקיקים‬
‫נובטים על גבי אגר‪-‬גלוקוז ‪ ,1$‬שמש בעבודה ז ו כתכשיר ש ל עוברים מחיטה‪ .‬הנבטת העוברים נעשתה‬
‫ע ל ידי העברתם לצלחת הפטרי המכילה ‪ 3‬מייל תמיסת‬
‫והעוברים המנותקים‪ ,‬ב‪ 60-‬מייל‬
‫‪GM‬‬
‫בטמפ' החדר‪ ,‬לצרכי סימון נשטפו העוברים‬
‫תמיסת הנבטה והועברו לתמיסת‬
‫המכילה את החומר הרדיו­‬
‫אקטיבי הדרוש‪ .‬כמות הזרעים‪ ,‬כמות והרכב התמיסה ומשך זמן הסימון מתוארים בכל ניסוי‪.‬‬
‫הסימון הופסק ע ל ידי שטיפת העוברים ב‪ 20-‬מייל תמיסת הנבטה המכילה את האיזוטופ הקר המתאים‬
‫)לרב בריכוז‬
‫‪0.1‬‬
‫‪ , ( M‬וטחינת העובדים בטמפ' ש ל ^‪.0‬‬
‫בעבודה ז ו משמשים ‪ 3‬מדדים ש ל אינקורפורציה‪:‬‬
‫‪.1‬‬
‫פעילות ספציפית‪:‬‬
‫‪.2‬‬
‫אחוז אנקורפורציה‪:‬‬
‫ספירות לדקה חלקי כמות החומר המסומן )לדוגמא‪:‬‬
‫סכום הספירות לדקה בחומר המסומן חלקי סכום הספירות שנקלטו בעובר‬
‫כפול ב־‪.100‬‬
‫‪.3‬‬
‫קצה האנקורפורציה‪:‬‬
‫‪(cpm/ng‬‬
‫אחוז האנקודפורציה ביחידת זמן‪.‬‬
‫נערכה ב מ ו נ ה נ צ נ ו ץ פקרד בתמיסת מ נ י ה על בסים ט ו ל ו א ן ע ב ו ר מ ס נ נ י מ י ל י פ ו ר ‪,‬‬
‫המניח‬
‫א ו משקעים א ל ‪ -‬מ י מ י י ם ‪ ,‬א ו בתמיסת מ נ י ה על בסים ד י א ו ק ם ן ע ב ו ר ת מ י ס ו ת מ י מ י ו ת ‪ ,‬בכל נ ם ו י נ מ נ ת ה‬
‫ד ו ג מ א ה מ כ י ל ה את החומד ה נ מ נ ה‬
‫‪ -‬כאשד א י נ ו מ ס ו מ ן ‪ ,‬בתוספת כ מ ו ת י ד ו ע ה של א י ז ו ט ו פ ר ד י ו א ק ט י ב י‬
‫לבדיקת הבליעה ה ע צ מ י ת ‪.‬‬
‫הפקת ר י ב ו ז ו מ י ם‬
‫ההכנה נעשתה בעקבות מרקוס‬
‫)‪:(44‬‬
‫‪ 200-500‬מ ״ ג ע ו ב ר י ם נ ט ח נ ו ב ‪ 1 0 -‬מייל ‪S M‬‬
‫תמש פעמים בתמיסת‬
‫‪13,500‬‬
‫ל פ נ י ה ר י ס ו ק ‪ .‬ה ה ו מ ו ג נ ט ם ו ר כ ז ‪ 20‬דקות ב צ נ ט ר פ ו ג ת‬
‫‪GM‬‬
‫ולאתר הרתקת השכבה ה ל י פ י ד י ת ה ע ל י ו נ ה ה ו ע ב ר ה נ ו ז ל ה ע ל י ו ן‬
‫‪RPM‬‬
‫ראש ‪ , 4 0‬ב מ ה י ר ו ת‬
‫מייל ‪gM‬‬
‫‪,‬‬
‫ו ם ו ר כ ז ב ם ר ו ו ל במהירות‬
‫פסטר‬
‫בחדר קר‬
‫) ^ ‪ . ( 4‬ע ו ב ר י ם ש ה ו נ ב ט ו קודם ל ט ח י נ ה ‪ ,‬נשטפו‬
‫‪ 4 0 . 0 0 0‬למשך שעה‪.‬‬
‫‪10,000‬‬
‫שימור‬
‫זכוכית‪-‬‬
‫ה נ ו ז ל ה ע ל י ו ן ה ו צ א בעזרת פיפטת‬
‫ר ג י ל ‪ .‬המשקע נ ר ח ץ ב ‪ 1-2 -‬מייל‬
‫ה ע ל י ו ן צ ו ר ף ל ק ו ד מ ו ‪ .‬המשקע ה נ ו ת ר מ כ י ל בעיקר חלקי ר ט י ק ו ל ו ט ‪.‬‬
‫ריבוזומימ‬
‫הריבוזומים‬
‫ריבוזומים‬
‫שנועדו‬
‫ש נ ו ע ד ו להפקת‬
‫לבדיקות םדימנטציה‬
‫ובדיקות חלבון‬
‫ומערכות א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה נבדקו‬
‫ר י ב ו ז ו מ ל י הוקפאו ב א ו י ר‬
‫אפשר היה לשמור על ר י ב ו ז ו מ י ם למטרות בדיקת ק י ש ו ר‬
‫שנעשתה הקפאה מ י ד י ת ב א ו י ד‬
‫לשימור‬
‫מייל( בעזרת ה ו מ ו ג נ י ז ר‬
‫במשך ‪ 10‬ד ק ו ת ‪.‬‬
‫ו מ כ י ל את תרחיף ה ר י ב ו ז ו מ י ם ש י ק ר א ת כ ש י ר ‪ -‬ר י ב ו ז ו מ ל י‬
‫והנוזל‬
‫לסרכוז בםפינקו‪,‬‬
‫ה נ ו ז ל ה ע ל י ו ן ה ו ר ח ק ‪ ,‬והמשקע ה ר י ב ו ז ו מ ל י הורחף ב ‪1 0 -‬‬
‫והושקע שוב ב ס פ י נ ק ו ‪ .‬המשקע פ ו ז ר בתמיסת‪TM(1-2‬‬
‫‪RPM‬‬
‫ם ר ו ו ל במהירות‬
‫‪sRNA‬‬
‫נ ו ז ל ונשמרו ב‪. -20^-‬‬
‫ואף למערכת א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ‪ ,‬ב ת נ א י‬
‫נ ו ז ל והשמידה נעשתה אף ה י א ב א ו י ר‬
‫בהקפאה‪ ,‬ה ו ס פ נ ו ם ו כ ר ו ז ב ר י כ ו ז ס ו פ י של &?‪.5‬‬
‫ב י ו ם ההכנה‪.‬‬
‫נוזלי‪.‬‬
‫לריבוזומים שנועדו‬
‫‪-‬‬
‫מפל מוכרוז ‪-‬‬
‫‪12‬‬
‫מפל של ‪ 5 - 2 0 $‬סוכרוז בתוך בופר‬
‫‪-‬‬
‫^‬
‫הוכן מעל מצע של ‪ 0 . 8‬פ״ל ‪ 5 0 $‬םוכרוז‬
‫בתחתית המבחנה‪ .‬על מפל הםוכרוז שו‪0‬ת התכשיר‪) ,‬רבוזומים ‪D N A , R N A‬‬
‫‪/‬‬
‫‪ 0 . 3 0‬מייל )לרב ‪ 0 . 2‬מייל( וההרצה נערכה בראש ‪3 9‬‬
‫‪-‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫‪8-18‬‬
‫שעות‪,‬‬
‫‪rRNA‬‬
‫( בנפח מקסימלי של‬
‫־ ‪ SW‬בצנטריפוגה םפינקו מודל ‪ L -‬לפרק הזמן‬
‫‪7‬‬
‫שעות‪,‬‬
‫‪-‬‬
‫‪DNA‬‬
‫שעות(‪.‬‬
‫המבחנות נוקבו בתחתיתן ונאספו מקטעים המכילים » ‪ 5 -‬עד ‪ 3 0‬טיפות כל אחד‪ ,‬בהתאם לדרגת‬
‫ההפרדה הדרושה‪ .‬נפח המקטעים הושלם ל‪ 1-‬מייל והמקטעים נלקחו לאנליזה הדרושה‪ .‬במקרה סל‬
‫איגום )‬
‫‪ ( P o o l i n g‬מקטעים נאספו הללו בטמפ' של ^ ‪. 0‬‬
‫הכנה משפה ‪g - 1 0 0‬‬
‫עוברי חיטה נטחנו בעלי ומכתש בתמיםת ‪ , S M‬ביחסים‬
‫‪v/w^o/l‬‬
‫‪ .‬לאחר סרכוז בםרוול‬
‫במהירות ‪ 1 3 , 5 0 0‬סבוכים לדקה במשך ‪ 2 0‬דקות‪ ,‬נלקח המשפה וסורכז בספינקו‪ ,‬ראש ‪ , 4 0‬במהירות‬
‫‪ 4 0 , 0 0 0‬םבובים לדקה במשך ‪ 6 0‬דקות; המשפה נלקה לסרכוז חוזר בםפינקו‬
‫המשפה נלקחו לדיאליזה למשך לילה נגד ‪ 3‬ליטר בופר‬
‫ו ־ ‪ 2 / 3‬העליונים של‬
‫‪ . TM‬המשפה נלקח לסרכוז חוזר בםפינקו‪,‬‬
‫ראש ‪ , 4 0‬למשך ‪ 1 2 0‬דקות במהירות ‪ 4 0 , 0 0 0‬םבובים לדקה‪ .‬המשפה הנותר הוא המכונה‬
‫‪-100‬‬
‫תולק למנות של ‪ 1‬מייל והוקפא באויר נוזלי‪ .‬כושרו של כל תכשיר להפעיל את תהליך האנקורפודציה‬
‫נבחן באופן שגרתי על ידי הוספת כמויות הולכות ועולות של משפה למערכת אנקורפורציה סטנדרטית‪,‬‬
‫)ראה להלן( והכמות האופטימלית שמשה במהלך הנםויים ‪) .‬בדרך כלל ‪ 0 . 0 4‬מייל המכילים‬
‫‪500‬‬
‫‪l-ig‬‬
‫חלבון(‪.‬‬
‫הכנת‬
‫‪sRI^A‬‬
‫למשפה ‪S — 1 0 0‬‬
‫לפני הדיאליזה‪,‬הוסף‬
‫‪SDS‬‬
‫ברכוז סופי של ‪ 3?°‬למשך ‪ 10‬דקות תוך‬
‫בחישה‪ ,‬ולאחר מכן נפח שוה של ‪ 8 8 $‬פנול במים‪ .‬אחרי טלטול של ‪ 3 0‬דקות םורכז התחליב במשך ‪10‬‬
‫דקות במהירות ‪ 1 0 , 0 0 0‬םבובים לדקה בצנטדיפוגת םרוול ‪ ,‬המקטע המימי העליון נאסף וה‪-‬‬
‫הושקע על ידי תוספת שני נפחים של כהל אתילי ב ‪. - 2 0 ^ -‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫־ ‪1 3‬‬
‫בבופר!!!‬
‫המשקע‬
‫פ ו ז ר‬
‫ו מ צ ו י‬
‫הפנול‬
‫נערך‬
‫כ ה ל ק ר )‪(0°‬‬
‫^‬
‫ביצירת‬
‫צ נ ט ר י פ ו ג ה‬
‫ג מ ״ ל‬
‫אנליטית‬
‫ב ת מ י ס ת ‪TM‬‬
‫במערכת‬
‫מ ו ד ל‬
‫המכילה‬
‫הכנת‬
‫לאחר‬
‫השקעת‬
‫הכהל‪,‬‬
‫לעיל‪.‬‬
‫)‪5‬‬
‫‪.‬‬
‫מייל(‬
‫חומצות‬
‫כמות‬
‫א מ י נ ו‬
‫האנקורפורציה‪.‬‬
‫‪E‬‬
‫באופטיקת‬
‫‪,‬‬
‫‪0.15‬‬
‫‪M KC‬‬
‫מקדם‬
‫‪3‬‬
‫‪= 8‬‬
‫במערכת‬
‫ונמצא‬
‫כ ל ו ר ו פ ו ר ם‬
‫והשכבה‬
‫ב‬
‫ש‬
‫ו‬
‫כ נ ג ד‬
‫מערכת‬
‫‪-‬‬
‫‪M‬‬
‫ש נ י‬
‫הריאקציה‬
‫מייל‬
‫ו—‪0.1‬‬
‫הוצאה‬
‫בעזרת‬
‫להלן(‬
‫‪S‬‬
‫נבדק‬
‫) ר י כ ו ז‬
‫‪.‬‬
‫באורך‬
‫וכושר‬
‫ה ‪sRNA -‬‬
‫ה‬
‫‪50‬‬
‫גל‬
‫ההשתתפות‬
‫באולטרה‬
‫־‬
‫היה‬
‫‪sRNA‬‬
‫‪.‬‬
‫‪M‬‬
‫ליטר ב כ ל פעם‪,‬‬
‫עובדה‬
‫‪, pH‬‬
‫נ מ ס כ ה ‪20‬‬
‫מייל כ ה ל‬
‫טריס‬
‫‪8‬‬
‫כ ל ו ר י ד ‪,‬‬
‫‪.‬‬
‫'‪kpH=5x10‬‬
‫‪7‬‬
‫פיפטת‬
‫נערכה‬
‫א י ז ו‬
‫‪0‬‬
‫‪units‬‬
‫ע מ י ל י ‪.‬‬
‫ח ו ז ר י ם‬
‫‪,‬‬
‫ד י א ל י ז ה‬
‫פ ו ל י ‪ -‬נ ו ק ל י א ו ט י ד ‪ -‬פ ו ם פ ו ר י ל ז ‪,‬‬
‫ד ק ו ת ב־־‪37°‬‬
‫פסטר‪.‬‬
‫בופר‪-‬מריס‪,‬‬
‫האנקורפורציה‬
‫מ ו ל י ם‬
‫פעמים עם‬
‫מייל‬
‫ספקטרופוטומטרית‬
‫תכשיר‬
‫בופר‬
‫א נ ז י ם‬
‫מייל‪.‬‬
‫‪0.1‬‬
‫המימית‬
‫ל‬
‫המשקע שלש‬
‫טעינה )ראה‬
‫‪3.5‬‬
‫למייל‬
‫‪-4‬‬
‫‪-‬‬
‫סופי של ‪1‬‬
‫בנפח‬
‫נשטף‬
‫השקיעה של‬
‫שלירן‬
‫‪1‬‬
‫‪200‬‬
‫נקבעה‬
‫‪RNA-n‬‬
‫נבדק‬
‫(‬
‫של‬
‫מיקרוגם‬
‫במסר‬
‫שעתיים‬
‫‪U-‬‬
‫י‬
‫ח‬
‫פ ר ו נ ז‬
‫ב ר כ ו ז‬
‫סופי‬
‫ה כ י ל ה ‪M UDP:0.1jj, 0 . 1 7 5‬‬
‫הריאקציה‬
‫ורטן‬
‫כמתואר‬
‫הטעינה של‬
‫םפינקו‬
‫פולי‬
‫על‬
‫בבופר^‪1:‬‬
‫כושר‬
‫פוליפפטיד‬
‫‪,‬‬
‫שנית‬
‫והומם‬
‫‪,260‬‬
‫ע ו כ ל‬
‫י ד י‬
‫־‬
‫‪8‬‬
‫נ ג ד‬
‫התערובת‬
‫ע ל‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫והופסקה‬
‫טולטלה‬
‫המצוי‬
‫‪x‬‬
‫ע ל‬
‫ותמימת‬
‫י ד י‬
‫‪5‬‬
‫תוספת‬
‫דקות‬
‫הפולימר‬
‫‪10‬וורסן‪M,pH‬‬
‫מזוקקים‪,‬‬
‫ליטר מ י ם‬
‫‪.‬‬
‫)‪0.4‬‬
‫פ נ ו ל‬
‫מייל(‪,‬‬
‫בחדר‪,‬‬
‫סודכזה‬
‫עברה‬
‫ד י א ל י ז ה‬
‫אחרי שתי‬
‫נשמר‬
‫הפולימר‬
‫נ ג ד‬
‫תמיסה‬
‫ד י א ל י ז ו ת‬
‫בקר‪.‬‬
‫הסטנדרטית‬
‫בעקבות‬
‫מ ג נ ז י ו ם ‪ -‬כ ל ו ר י ד ‪,‬‬
‫מרכוס ) ‪( 4 4‬‬
‫‪2 2‬‬
‫והכילה‬
‫מ י ק ר ו מ ו ל י ם‬
‫בנפח של‬
‫אשלגן‬
‫‪0 , 5‬‬
‫כ ל ו ר י ד ‪,‬‬
‫מייל את‬
‫המרכיבים‬
‫‪3‬‬
‫מ י ק ר ו מ ו ל י ם ‪G T P ,1‬‬
‫‪,‬‬
‫מ י ק ר ו מ ו ל י ם‬
‫מ י ק ר ו ‪-‬‬
‫הבאים‪. 2 . 2 :‬‬
‫מ י ק ר ו מ ו ל‬
‫‪,ATP‬‬
‫ב ‪3‬ר‬
‫‪130‬‬
‫‪1 0‬‬
‫‪,‬‬
‫‪PEP Kinase‬‬
‫מ י ק ר ו מ ו ל י ם‬
‫ומשפה ‪S - 1 0 0‬‬
‫פעילות‬
‫ב ל י‬
‫לה‬
‫מיקרוגרם‬
‫מרקפתו‬
‫א ת נ ו ל ‪,‬‬
‫)לרוב ‪0 . 0 4‬‬
‫מייל(‪,‬‬
‫ספציפית של מ ע ל ל‪150-‬‬
‫ה ר י ב ו ז ו מ י ם‬
‫הוכנה‬
‫‪D‬‬
‫‪5 0‬‬
‫במבחנות‬
‫מיקרוגרם‬
‫‪1‬‬
‫מ י ק ר ו מ ו ל‬
‫מ י ל י ק י ר י‬
‫בקרח‪,‬‬
‫‪O‬‬
‫מחיטה‪,‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫חומצה‬
‫ל מ י ל י מ ו ל ( ‪.‬‬
‫והריאקציה‬
‫‪25‬‬
‫ר י ב ו ז ו מ י ם‬
‫י‬
‫החלה ע ל‬
‫‪.‬‬
‫המכילה את‬
‫י ד י‬
‫הוספת‬
‫ס‬
‫בכמות עד ‪100‬‬
‫אמינית‪-‬מסומנת ) ‪2 . 5‬‬
‫תערובת‬
‫ט‬
‫ר‬
‫י‬
‫‪8‬‬
‫כ ל‬
‫• ‪7‬‬
‫=‬
‫מיקרוגרם‬
‫מ י ל י מ י ק ר ו ק י ר י‬
‫מרכיבי‬
‫ה ר י ב ו ז ו מ י ם‬
‫‪» pH‬‬
‫עם‬
‫הריאקציה‪,‬‬
‫ו ה ע ב ר ה ל‪.30^-‬‬
‫בריאקציה סטנדרטית נמשכה הריאקציה ‪ 4 5‬דקות‪ .‬הריאקציה הופסקה על־ידי‬
‫‪,20$‬‬
‫‪5$‬‬
‫המכיל חומצה אמינית קרה מתאימה ברכוז‬
‫‪A‬‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫‪M0.1‬למשך‬
‫‪ ,‬נאסף המשקע אחרי סרכוז של ‪ 1 0‬דקות‬
‫סדוול המשקע עבר הידרוליזה ל ־ ‪ 1 5‬דקות ב ‪ 8 0 ° -‬ב־־‪ 3‬מ״ל‬
‫•‬
‫‪,‬‬
‫‪ 10‬דקות בקרח‪.‬‬
‫ב ‪5 0 0 0 -‬‬
‫‪$‬‬
‫ת‬
‫ו‬
‫ס‬
‫פ‬
‫ת‬
‫^•‬
‫‪0‬‬
‫מ‬
‫״‬
‫ל‬
‫‪TCA‬‬
‫‪5‬‬
‫‪A‬‬
‫‪C‬‬
‫‪RPM‬‬
‫‪R‬‬
‫בצנמריפוגת‬
‫לפרוק האמינו‪-‬אציל‪-‬‬
‫ההדרוליזט קורר ‪ 10‬דקות והועבר דרך מסנן מיליפור‪ .‬אחרי ‪ 4‬שטיפות ב ־ ‪ 5‬מ ״ ל ^ ^‬
‫‪sRNA‬‬
‫‪ 5 $‬כל אחת‬
‫יובש ניר המיליפור בתנור אינפרא אדום ונמנה בתערובת םנטלציה של טולואן במונה נצנץ פקוד‪.‬‬
‫בדיקת אורר השרשרת של פוליפניל אלניז ופולי ליזיז‬
‫הפוליפפטידים נוצרו במערכת האנקורפורציה סטנדרטית‪ .‬בפרקי זמן קבועים‪ .‬הריאקציה‬
‫‪5$‬‬
‫‪TCA‬‬
‫‪5$‬‬
‫)עבור פולי פניל אלנין( או על ידי טונגםטט‪-‬‬
‫הידרוליזה של אמינו‪-‬אציל‪-‬‬
‫ליזין(‪.‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫נעשתה על ידי חמום ב ‪ 9 0 ^ -‬במשך ‪ 15‬דקות‪.‬‬
‫רובת המקוררת הועברה על מסנן מיליפור‪ ,‬נשטפה עם ‪ 15‬מייל‬
‫לפילטר הועבר למנית‬
‫‪TCA‬‬
‫עבור פולי‪-‬‬
‫‪A‬‬
‫‪5$‬‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫‪ ,‬והפולימר הקשור‬
‫הרדיואקטיביות הכללית המבטאה את כמות הפולימר שנוצר בריאקציה‪.‬‬
‫המיליפור המכיל את הפולימר נשטף לאהד המניה ב ‪ 2 -‬מנות של טולואן אנליטי‪ ,‬יובש ונגזר‬
‫והועבר לאנליזה של הקבוצות הטרמינליות אשר בוצעה כדלקמן‪-:‬‬
‫למבחנה המכילה את הפולימר הקשור למיליפור פילטר הוספו‬
‫ו ‪ 0 . 0 2 -‬מייל תמיסה כהלית של ‪, 1 0 $‬‬
‫‪ 0 . 5‬מייל םודיום ביקרבונט ) ‪( 1 0 $‬‬
‫פלורו‪-‬דיניטרו‪-‬בנזן‪ .‬הריאקציה נמשכה ‪ 2 4‬שעות בחושך‬
‫בטמפ' החדר‪ .‬בתום הריאקציה הורחק הכהל על ידי חמום בואקום‪ .‬תמיסת הריאקציה הובאה לריכוז‬
‫של‪MHC6‬‬
‫‪1‬‬
‫‪ ,‬הוקפאה בתחתיתה ונחתמה בואקום‪.‬‬
‫בתום ההידרוליזה נמהלה התמיסה‬
‫^‬
‫‪-‬‬
‫‪2‬‬
‫ההידרוליזה נמשכה ‪ 1 5‬שעות ב ‪. - ^ 1 0 0‬‬
‫‪ , M HGl‬ומוצתה ‪ 4‬פעמים עם ‪ 2‬מייל אתר‪.‬‬
‫‪evaporator‬‬
‫חומצה אמינית עברה לפזה האתרית‪ ,‬אשר רוכזה ב‪-‬‬
‫ישירות בתערובת םינטילציה‪ .‬אורך השרשרת הממוצע ~‬
‫הפולימר ומספר החומצות‬
‫‪H-n‬‬
‫‪n‬‬
‫הדיניטרו‪-‬פניל‪-‬‬
‫‪ f l a s h‬והמשקע נמנה‬
‫‪ ,‬חושב מתוך היחס בין‬
‫‪-‬טרמינליות‪ 2 .‬הקביעות נעשו באותה דוגמא‪.‬‬
‫סך‬
‫כמות‬
‫־ ‪15‬‬
‫‪-‬‬
‫מדרכת האנסורפ ורציה ותכונותיה‬
‫התנהגות מערכת האנקורפורציה ותכונותיה מתוארות בנסויים הבאים‪ .‬היענות המערכת‬
‫לפולינו קליאוטיד‬
‫סינטםי כפולי‪ U -‬או פולי‪ A-‬מתוארת בתמונות ‪ 1‬ו‪ .2-‬ההיענות לפוליע‬
‫מתחילה מיד בריכוזים נמוכי‪ 9‬של הפולינוקליאוטיד ותחום האופטימום מצומצם בין ‪ 10‬ל‪15-‬‬
‫מיקרוגרם פוליט‬
‫הממריצים תוספת של למעלה מ‪ 400.000-‬ספירות לדקה של פניל אלנין‪^-‬יס‬
‫למ״ג ריבוזומים )קרוב ל‪ 60-‬מילימיקרומול (‪ .‬תוספת פולי‪11‬‬
‫מעל לריכוז האופטימלי מביאה‬
‫לדיכוי האנקורפורציה כשהתכשיד הריבוזומלי מנוקה היטב‪ .‬תוספת של ‪ 15‬מיקרוגרם פולי ‪A‬‬
‫‪r‬‬
‫)‪A(fj.gr.‬‬
‫‪Poly‬‬
‫«־‬
‫‪60‬‬
‫‪80 100‬‬
‫)‪PolyU (/tgr.‬‬
‫‪40‬‬
‫תמונה ‪ 1‬ו‪ :2-‬רכוזים אופטימליים של מסנגיר סינטטי במערכת האינקורפורציה‪.‬‬
‫במערכת אינקורפורציה סטנדרטית בנפת סל ‪ 0.5‬מייל הוספו לכל דוגמא‬
‫של ‪ 45‬מיקרוגרם ריבוזומים תשופים‪ ,‬כמויות הולכות ועולות של‬
‫‪m!a M‬‬
‫‪7.1‬‬
‫פולי‪ U -‬או^פולי ‪ . A‬במערכת המכילה פולי‪ U -‬הוכללו‬
‫‪ ,(mc/mM‬ובמעררת המכילה פולי‪A -‬‬
‫‪) G‬‬
‫‪320‬‬
‫פניל אלנין'‬
‫‪( ,mc/mM‬הריאקציה נמשכה‬
‫‪) G‬‬
‫‪251‬‬
‫ליזין‬
‫הוכללו‪m!a•M10.7‬‬
‫‪ 45‬דקות‪ ,‬מופלה ונמנתה כמתואר בשיטות‪.‬‬
‫התוצאות מבוטאות בספירות לדקה ל‪-‬מ״ג ‪ . rRNA‬בקורת ללא פולי‪U -‬‬
‫‪cpm/mg rlUIA A‬‬
‫‪2100‬‬
‫‪ ,cpm/mg rKHA 300‬בקורת ללא פולי‬
‫ ‪16‬‬‫ממריצה את ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של ל י ז י ן‬
‫‪100‬‬
‫‪!4‬‬
‫‪C‬‬
‫מ י ק ר ו מ י ק ר ו מ ו ל ( תוספת פ ו ל י ‪A‬‬
‫‪-‬‬
‫עד למעלה מ־־‪ 120.000‬ס פ י ר ו ת לדקה ל מ ״ ג ר ב ו ז ו מ י ם ) ע ד‬
‫א י נ ה ג ו ר מ ת ל ד י כ ו י ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ‪ .‬פ ע י ל ו ת מערכת ה א נ ק ו ‪-‬‬
‫ר ה ו ר צ י ה עם ה ז מ ן מתוארת ב נ ם ו י י ם מם' ‪ 3‬ו ‪ . 4 -‬במערכת א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ס ט נ ד ר ט י ת שהוסף‬
‫לה פ ו ל י ע‬
‫)‪ 10‬ם י ק ר ו ג ר ם ( נמשכת ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה בקצב ל י נ א ר י במשך ש ע ת י י ם ‪ .‬לאחר מ כ ן מואט הקצב‪ ,‬אך‬
‫האנקורפורציה‬
‫לוז פן־לי‬
‫‪A‬‬
‫נמשכת‪ .‬ל ע י ת י ם עד ‪ 12‬שעות ) ת מ ו נ ה ‪ . ( 3‬במערכת א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ס ט נ ד ר ט י ת שהוסף‬
‫ע ו ל ה ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה בקצב ל י נ א ר י ‪ .‬במשך שעה ולאחר מ כ ן ה י א מואטת אך נמשכת ע ו ד‬
‫'במטך ‪ 6‬שעות ) ת מ ו נ ה ‪. ( 4‬‬
‫ו‬
‫‪5‬‬
‫‪3‬‬
‫‪4‬‬
‫)‪(hrs‬‬
‫ת מ ו נ ו ת ‪:4 . 3‬‬
‫)‬
‫‪M‬‬
‫‪/‬‬
‫‪Time‬‬
‫ע ק ו מ ו ת ז מ ן של מערכת ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ‪.‬‬
‫מערכת ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה הסטנדרטית בנפח של ‪ 0 , 5‬ם ״ ל ה כ י ל ה ‪:‬‬
‫מ י ק ר ו ג ר ם ר י ב ו ז ו מ י ם חשופים‬
‫‪U‬‬
‫‪,‬‬
‫‪45‬‬
‫‪ 10‬מ י ק ר ו ג ר ם פ ו ל י ‪-‬‬
‫‪,‬‬
‫פניל אלנין‬
‫) ‪320mc/mM‬‬
‫^״‪c (7.1‬‬
‫(‪dDm,‬‬
‫מיקרוגרם ר י ב ו ז ו פ י ם‬
‫‪A,‬‬
‫‪45‬‬
‫‪ 15‬מ י ק ר ו ג ר ם פ ו ל ^‬
‫או‪:‬‬
‫‪ . ( m c / m M‬הריאקציה‬
‫‪251‬‬
‫‪) 0‬‬
‫חשופים ו ‪ 1 0 . 7 -‬ל י ז י ן‬
‫נמשכה פרקי ז מ ן ש ו נ י ם ‪ ,‬הופסקה ו ט ו פ ל ה כמתואר ב ש י ט ו ת ‪.‬‬
‫‪lif‬‬
‫השפעת תוספת‬
‫‪sRNA‬‬
‫על רמת ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה מתוארת ב נ י ס ו י ‪ . 5‬למערכת א נ ק ו ר פ ו ר א י ה‬
‫סטנדרטית הוספו כ מ ו י ו ת הולכות ו ע ו ל ו ת‬
‫‪sRNA‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1‬‬
‫‪0‬‬
‫‪ .‬ב ר י כ ו ז זה א י ן ה ‪sRNA -‬‬
‫ש‬
‫ל‬
‫‪. sRNA‬‬
‫מהוה י ו ת ר גורם‬
‫ה י ע נ ו ת המערכת נמשכת עד ל ‪ 5 0 -‬מ י ק ר ו ג ר ש‬
‫מגביל )תפונה ‪. ( 5‬‬
‫‪-‬‬
‫‪I00‬‬
‫‪80‬‬
‫‪60‬‬
‫‪RNA‬־‪S‬‬
‫‪:‬זמינה ‪:5‬‬
‫‪17‬‬
‫‪-‬‬
‫‪fMq‬‬
‫מיטרציה של מערכת אנקורפורציה עם‬
‫‪sRNA‬‬
‫למערכת אנקורפודציה סטנדרטית בנפח של ‪ 0.5‬מייל שהכילה ‪ 70‬מיקרו גרם‬
‫ריבוזומים ו‪ <00-‬מיקרוגרם חלבון בתוך משפה ‪ S -100‬הוספו כמויות‬
‫הולכות ועולות קל ‪ RNA5‬שהופק בשיטת הפנול ממשפה ‪ -S100‬של עוברים‬
‫&לא נבטו )ראה שיטות(‪.‬‬
‫ז‬
‫הקינטיקה של הווצרית הפוליפפטיד במערכת האנקורפורציה נתקרה בניסוי ‪ .6‬ב‪ 3-‬נסויים‬
‫מקבילים נבדקו מערכות אנקורפורציה של פניל אלנין המודרכות ע״י פולי ‪ U‬א( ללא ‪-100‬צ‬
‫י‬
‫_‬
‫‪ sRNA.‬ב( בתוספת משפה ‪ g-.tOO‬ג( במערכת שלפה בתוספת ‪S(500-100‬‬
‫תלבון( ו‪sHNA(50-‬‬
‫מיקרו גרם‬
‫מיקרוגרם(‪ .‬האורך הממוצע של הפוליפנילאלנין מתואר בציור ‪ 6‬כפונקציה‬
‫של הזמן‪ .‬במערכת השלמה התארכות הפוליפפטיד מהירה יותר ואורכי הממוצע גבוה יותר‬
‫)ב‪'( n =30-‬מאשר במערכות שבהן חסר‬
‫‪ . sRNA‬מכיון שהראינו בנסוי ‪ 3‬העליה באנקודםורציה‬
‫נמשכת עד ‪ 6‬שעות‪ ,‬ואורך הפפטיד הממוצע נשאר קבוע לאחר שעה‪ .‬מכאן יש להסיק כי התחלג‪1‬ן של‬
‫שרשרות חדשות נמצאת בשווי משקל עם התארבותן‪ ,‬החל מן השעה הראשונה לאנקורפורציה‪.‬‬
‫מיקום הסינתזה של הפוליפניל אלנין במערכת האנקורפורציה מתואר בנםוי ‪ •7‬כאשר‬
‫מונוזומים עושים אנקורפורציה של פניל אלנין באמצעות פולי ‪ , U‬ותערובת האנקורפורציה‬
‫כולה מופרדת על ידי צנטדפוגציה במפל םוכרוז כמתואר בתמונה ‪ .7‬נמצא שכל הפוליפניל‬
‫אלנין ^"‪C‬‬
‫קשור למונוזמים )כנראה כפולי פניל אלני<‬
‫חופשי ואין יצירה של פוליזומים )תמונה ‪.(7‬‬
‫‪ .( sRIJA‬אין שתרור של פפמיד‬
‫‪180‬‬
‫‪120‬‬
‫)‪Incorporation time (min.‬‬
‫תמונה ‪ ;6‬י התארכות הפוליפפטיד במערכת האנקורפורציה של עובר החיטה‪.‬‬
‫במערכת אנקורפורציה סטנדרטית של ‪ 0 . 5‬מייל הוכללה כמות‬
‫קבועה של רבוזומים ) ‪ 7 0‬מיקרוגרם( ומשפה‪S(100-500‬‬
‫מיקרוגרם חלבון(‪ .‬בנםיון מקביל הוכללו גם ‪ 5 0‬מיקרוגרם‬
‫‪«sRNA‬וסף למשפה ‪, S - 1 0 0‬ף כל מבחנה הכילה ‪1 2 . 1‬‬
‫‪. ( c / m M‬‬
‫מיליפיקרופולים פניל אלנין ‪) C^223‬‬
‫‪TCA‬‬
‫‪10$‬‬
‫הריאקציה נמסכה פרקי זמן שונים והופסק ע״י‬
‫כמתואר בשיטות‪.‬‬
‫האורך הממוצע של השרשרת הפוליפפטידית נקבע עי" י‬
‫דניטרופנילציה כמתואר בשיטות‪.‬‬
‫‪m‬‬
‫‪19‬‬
‫־‬
‫־‬
‫‪—r‬ו—‪—1‬ר‬
‫‪15‬‬
‫‪a‬‬
‫*‪c‬‬
‫‪'aE‬‬
‫‪o‬‬
‫‪10‬‬
‫‪a.‬‬
‫‪*0‬‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪ 5‬־‪°‬‬
‫יי‬
‫_‪1‬‬
‫‪I‬‬
‫‪J‬‬
‫‪1‬‬
‫‪8 10 12 14 16 18‬‬
‫‪Fraction N°‬‬
‫תמונה ‪: 7‬‬
‫^‬
‫‪1‬‬
‫‪2 4 6‬‬
‫מיקום הסינתזה של פולי מניל אלנין במערכת האנקורפורציה של‬
‫עובר התיטה‪.‬‬
‫במערכת אנקורפורציה םטנדרמית סל ‪ 0 . 5‬מייל הוכללו ‪ 7 0‬מיקרוגרם‬
‫ופניל אלניך ‪C‬‬
‫ריבוזומים חשופים‪ 10 ,‬מיקרוגרם פילי ‪U‬‬
‫‪ . ( m c / m M‬הריאקציה הופסקה בפרקי זמן‬
‫‪270‬‬
‫) ‪ 1 0 . 2‬מיליקרומולים‪,‬‬
‫שונים ע״י העברה לקרח והוספת ‪ 0 . 1‬מייל פניל אלנין קר בריכוז סל‬
‫‪ .‬אליקוומים של ‪ 0 . 2‬מייל נלקחו מכל מבחנה וחולקו על מפל סוכרוז‬
‫‪M‬‬
‫‪0.1‬‬
‫»‪207‬־־‪ 5‬כמתואר בפרק שיטות‪ .‬נאספו ‪ 18‬ממקעים ולכל מקטע הוסף ‪ 1‬מייל‬
‫‪ TCA‬יי‪1#‬מ"ג קזאין‪ ,‬לאחר הדרוליזה של ‪ 15‬דקות ב ‪ 9 0 ° -‬וקירור ל ‪, 0 ° -‬‬
‫הועברו המקמעים על מיליפור פילטר‪ ,‬נשטפו פעמים עם ‪ 3‬מייל‪, T C A«/5‬‬
‫יובשו ונמנו במונה נצנץ‪.‬‬
‫‪j‬‬
‫‪n‬‬
‫כללי‪n‬‬
‫‪RNA‬‬
‫‪3‬‬
‫נעשתה בשיטת הפנול‬
‫נסתנו‬
‫ב‪ 50-‬מייל בופר ‪T H‬‬
‫)‪ .(54‬הנקוי והטיפול האנזימתי עובדו כמחואר להלן‪ .‬העוברים‬
‫‪ .‬הוספו ‪ 5‬מייל תמיסת‪«257‬‬
‫‪S‬‬
‫‪D‬‬
‫‪S‬‬
‫ו ‪ 1 -‬מייל ‪ 10/£‬בנטוניט‪ .‬אחרי ‪10‬‬
‫דקות בטמפ* ‪ , 3 7 °‬הוספו ‪ 5 0‬מייל פגול ^ ‪ . 8 8‬אחרי ‪ 30‬דקות מצוי הופרדו השכבה המימית והפנול‬
‫על ידי מרכוז בםרוול במהירות של ‪ 1 4 , 0 0 0‬םבובים לדקה במשך ‪ 1 0‬דקות‪ .‬השכבה המימית נאספה‬
‫ע״י פפסת פסטר‪ .‬השכבה המימית מוצתה שנית על ידי ‪ 3 0‬מייל פנול‪ ,‬והשכבה העליונה הופרדה‬
‫כמתואר לעיל‪ .‬לשכבה המימית הוספו ‪ 3‬נפתים כהל אתילי בממפ* של ^ ‪ . - 2 0‬כדי לקבל השקעה‬
‫מלאה יש צורך ב ‪ 2 4 -‬שעות בטמפ* סל ^ ‪ . - 2 0‬התמיסה סורכזה בסרוול במהירות ‪ 14,000‬םבובים‬
‫לדקה במשך ‪ 10‬ד ק ו ת ‪ .‬המשקע נשטף פ ע מ י י ם עם ‪ 40‬מייל כ ה ל להרחקת ש א ר י ו ת ה פ נ ו ל ‪,‬‬
‫ע ל י ד י ד י א ל י ז ה נ ג ד ‪ 1‬ל י ט ר ‪TM‬‬
‫הורחקו‬
‫ו ש א ר י ו ת הכהל‬
‫במשך ‪ 3‬ש ע ו ת ב ־ ‪. 4 °‬‬
‫נקו י ה‪RNA -‬‬
‫טיפול‬
‫דינאז‪) :‬‬
‫בריכוז‬
‫‪DMAase E l e c t r o p h o r e t i c a l l y p u r i f i e d‬‬
‫)‬
‫ס ו פ י של ‪ 30‬מ י ק ר ו ג ר ם למייל‪.‬‬
‫פרונז‪:‬‬
‫טיפול‬
‫( ד י נ א ז הוסף‬
‫>‬
‫ה א י נ ק ו ב צ י ה נעשתה ב־־ " ‪ 30‬למשך ‪ 4‬ש ע ו ת ב ת ו ך ש ק י ת ד י א ל י ז ה ‪.‬‬
‫ת מ י ס ת פ ר ו נ ז שעברה א י נ ק ו ב צ י ה ע צ מ י ת מ ו ק ד מ ת במשך ש ע ת י י ם ב ‪ ,37 -‬ה ו ס פ ה ב ר י כ ו ז‬
‫<‬
‫>‬
‫ס ו פ י של ‪ 200‬מ י ק ר ו ג ר ם למייל‪ .‬א ח ר י ‪ 4‬ש ע ו ת ב‪ 37 " -‬ה ו ע ב ר ה ה ת מ י ס ה לשקית ד י א ל י ז ה ו ה ע כ ו ל נמשך ‪12‬‬
‫שעות ב מ מ פ ' החדר כ נ ג ד ‪ 2‬ל י ט ר ב ו פ ר ‪TM‬‬
‫ח ו ז ר י ם ש נ י ת על כ ל השלבים‪:‬‬
‫ועיכול‬
‫ל פי םאוקה‬
‫ל מתילי אנליטי‬
‫‪K‬‬
‫‪3‬‬
‫‪N‬‬
‫‪M‬‬
‫‪M‬‬
‫‪5‬‬
‫‪ ,‬נ ט ח ן לאבקה‬
‫‪:‬‬
‫(‬
‫מייל‬
‫י‬
‫נ ש מ ר‬
‫מ ע ‪ 7‬י‬
‫)‪ (1‬מ ת י ל צ י ה של א ל ב ו מ י ן ‪ .‬ל‪5-‬‬
‫‪1‬‬
‫י‬
‫ב‬
‫ר‬
‫ו פ ע מ י י ם עם אחר י ב ש ‪ .‬המשקע י ו ב ש ב א ו י ר ולאחר מ כ ן‬
‫‪CaCl‬‬
‫בדםיקטור‪.‬‬
‫מ‬
‫"ל‬
‫בופר פוספט‬
‫‪M0.05‬‬
‫םלקולונה‪.‬מייל מ ת מ י ס ת ה א ל ב ו מ י ן‬
‫ו מ ו ס י פ י ם א ח ר י השקיעה ע ו ד ‪ 1‬ג ר ם ק י ז ל ג ו ר ש פ ו ז ר ב־־‪ 10‬מייל‬
‫)‪(3‬‬
‫ג‬
‫י ם‬
‫‪B‬‬
‫‪ .‬ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה נבחשה ‪ 6‬י מ י ם ב ח ו ש ך ‪.‬‬
‫מ כ י נ י ם ת מ י ס ת ‪ 1$‬א ל ב ו מ י ן ב מ י ם ‪ 10 .‬גרם ק י ז ל ג ו ר מ ו ר ת ח י ם עם ‪50‬‬
‫י‬
‫בופר‪ ,‬עיכול דיאנז‬
‫ל נ ק ו י א ח ר ו ן ע ל ע מ ו ד ת ‪MAK‬‬
‫הושקע ו נ ש ט ף פ ע מ י י ם עם כ ה ל מ ת י ל י‬
‫על גבי‪1(011‬‬
‫מ‬
‫‪A‬‬
‫)‬
‫‪5‬‬
‫ו ‪1 2 M H C 4 . 2 -‬‬
‫האלבומין‬
‫ע‬
‫מ צ ו י פ נ ו ל ‪ ,‬השקעת כ ה ל ‪ ,‬ד י א ל י ז ה נ ג ד ^ ל‬
‫פ ר ו נ ז ‪ .‬ב ת ו ם ה ע י כ ו ל מ ו כ ן ה‪ENA -‬‬
‫‪-‬‬
‫)(‪2‬‬
‫‪ ,‬תוך ע ר ב ו ל מתמיד בעזרת מערבל מ ג נ ט י ‪ .‬בתום ה ר י א ק צ י ה‬
‫ה ע מ ו ד ה נשטפת עם ל י ט ר ת מ י ס ת ב ו פ ר פ ו ס פ ט ‪pjj=6.8‬‬
‫^ ‪ 0.05‬ב ו פ ר פ ו ס פ ט ‪pH 6.8‬‬
‫ו מ א ו כ ס נ ת בקר עד ל פ נ י ה ש י מ ו ש ‪.‬‬
‫הפרדת ה ‪ RNA -‬ע ל עמודת־>ז&ז\‪1‬‬
‫גרדיאנט‬
‫‪: NaCl‬‬
‫‪ ,‬נ ע ש י ת הפרדת‬
‫לאחר ט ע י נ ת ה ‪ RNA -‬ע ל ה ק ו ל ו נ ה ו ש ט י פ ה עם ב ו פ ר פ ו ס פ ט‬
‫ה‬
‫‪-RNA‬‬
‫ע ל י ד י מ פ ל ל י נ א ר י מ‪M -0.2‬‬
‫עד ‪M NaCl2‬‬
‫בתוך‬
‫‪ pH =6.8‬ה מ כ י ל‬
‫‪0.05‬‬
‫‪M‬‬
‫ב ו פ ר פ ו ס פ ט ‪ , pH 6.8‬ב נ פ ח כ ו ל ל של ‪ 600‬מייל‪ .‬הפרדה במפל מלח נעשתה ל צ ו ר ך ב ד ו ד ה מ ר כ י ב י ם‬
‫ה ש ו נ י ם של א ו כ ל ו ם י ת ‪RNA-n‬‬
‫‪A3Crystalline‬‬
‫‪- 21 -‬‬
‫‪n 3‬״‪RMAA‬‬
‫מצוי הדרגתי‪:‬‬
‫נסענו על הקולונה ונשטפו עם ‪ 100‬מייל‬
‫‪-mRNA0.3,mRNA, s R N A‬ו‪MNaCl‬‬
‫‪p H 6.8‬‬
‫המכיל‬
‫‪0.05‬‬
‫בופר‪-‬פוםפט ‪pH=6.8‬‬
‫‪M‬‬
‫יוצאים במקטע אחד ע״י שמיפה מן העמודה עם‬
‫‪NaCl‬‬
‫‪1.2‬‬
‫‪M‬‬
‫‪ .‬המצוי ההדרגתי שימש לנקוי‬
‫‪,‬‬
‫ה‪RNA-‬בעיקר‬
‫להכנתו לנםיונות והברידיזציה‪ .‬נקיון התכשירים המתקבלים ע״י הטיפול אנזימתי הכפול והעברה‬
‫מתואר בנםויים הבאים‪.‬‬
‫^!־‪MAK‬‬
‫בטבלה ‪ 1‬מתוארת רגישותו ש ל תכשיר ‪ RNA‬המיועד לנםוי הברידיזציה‪,‬‬
‫להדרוליזה אנזימתית על ידי ריבונוקליאז ודנאז‪.‬‬
‫ניתן לראות כ י בעוד שהתכשיר עמיד לגמרי‬
‫להדרוליזה ע״י דינאז‪ ,‬ניתן לפרק ‪ 99‬אחוז ממנו ע״י ריבונוקליאז‪.‬‬
‫טבלה ‪1‬‬
‫מבחנה‬
‫) ‪( 4 8‬‬
‫‪EHA‬‬
‫‪p32‬‬
‫דינאז‬
‫ר י ב ו נ ו ק ל י א ז מתוממח‬
‫‪-‬‬
‫‬‫‬‫‪-‬‬
‫‪ 2‬מיקרוגרם‬
‫‪1‬‬
‫ש‬
‫"‬
‫כ‬
‫־‬
‫' י‬
‫‪:‬‬
‫‪-‬‬
‫רגישות‬
‫‪RNAn^n‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪II‬‬
‫‪3‬‬
‫‪2‬‬
‫‪II‬‬
‫‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫‪II‬‬
‫‪5‬‬
‫‪2‬‬
‫‪II‬‬
‫לריבונוקליאז ודנאז‬
‫‪ 10‬מ י ק ר ו ג ר ם‬
‫‪10‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪CPJ‬‬
‫‪180,199‬‬
‫‪221,961‬‬
‫‪221,471‬‬
‫‪ 10‬מ י ק ר ו ג ד ם‬
‫‪2,439‬‬
‫‪ 10‬מ י ק ר ו ג ר ם‬
‫ל‬
‫ג‬
‫מ‬
‫ס‬
‫ק‬
‫ע‬
‫‪TCA‬‬
‫‪1987‬‬
‫‪5‬‬
‫‪HNA‬‬
‫‪1‬‬
‫לה כמות קבועה‬
‫‪TCA‬‬
‫‪5$‬‬
‫לפי הדרוש ‪ .‬לאתר ‪ 60‬דקות ב‪ 37^-‬הושקע ה‪ R N A -‬הנותר בעזרת‬
‫‪ 0.5‬מ ג ‪ r R H A‬הוסף כנושא והמשקע נשטף ע ל מסנן מיליפור עם ‪ 6‬מ ל ‪T C A‬‬
‫המסנן יובס ונמנה במונה נצנץ פקרד‪.‬‬
‫ואנזים‬
‫קר‪.‬‬
‫מ‪,5/‬‬
‫נ ים ו י ‪ 8‬נועד לבחון בדרך אחרת את יעילות הניקוי בעזרת אנזימים ס ל תכשיר ‪RNA‬‬
‫כאשר מפרידים תכשיר‬
‫עמודת^‬
‫‪RNA‬‬
‫‪.P‬‬
‫שעוכל אך פעם אחת על ידי דינאז‪-‬פרונז כמתואר לעיל‪ ,‬ע ל גבי‬
‫‪ ,‬ניתן לראות הופעתו ש ל מיקטע בעל משקל מולקולרי‬
‫בעזרת מפל ‪M NaCl0.2-0.714‬‬
‫נמוך ופעילות ספציפית גבוהה )תמונה ‪ 8‬מקטע ‪ .(8-12‬מיקטע זה נעלם לאחר הטיפול הסני בדינאז‪-‬‬
‫פרונז‪ .‬כאשר לוקתים‪RNA‬‬
‫ממיקטע ‪A‬‬
‫למערכת הברידיזציה )תמונה ‪ 8‬ציור פנימי( מקבלים תוספת‬
‫הבדיד ביתם ישר לתשומה ‪ -‬עדות לנוכחות זיהום ע״י ‪DNA‬‬
‫הברדיזציה בשיעור ש ל לא יותר מ־^‪. 0.03‬‬
‫‪-‬בתכשיר‪.‬‬
‫‪BMA‬‬
‫‪S‬‬
‫ממיקטע ‪g‬‬
‫נותן‬
‫‪- 22 -‬‬
‫לפיכך נראה כי תכשיר ה‪RNA -‬‬
‫נקי אמנם משרידי זיהום על ידי עקבווז ‪ . DNA‬באנליזה סדמנטציה‬
‫באולטרה צנטריפוגה אנליטית מודל‬
‫הבאות‪RNA‬נותן‬
‫‪E‬‬
‫במערכת אופטית שלידן )‪ 2‬מ״ג‪/‬מ״ל‪ ,‬בבופר‬
‫תכשיר כללי ומנוקה של‬
‫‪ TM‬המכיל‬
‫‪:‬‬
‫‪3 =28 , 24 ,18 ,3.5‬‬
‫‪Fraction No.‬‬
‫תמונה ‪ :8‬השפעת הטיפול החוזר של דינאז‪-‬פרונז על נקי ו ן•ה‪RNA-‬‬
‫‪32‬‬
‫תכשיר ׳‪ RNA‬מסומן ב‪ P -‬הוכן מעוברי תיטה שהונבטו‬
‫‪ 48‬שעות וםומנו בין השעות ‪ 24‬ל‪ 48-‬שעות‪ .‬הפרדה חלקית של‬
‫‪ MAK‬בעזרת &פל ‪NaCl‬‬
‫תכשיר ה‪ RNA -‬נעשתה על עמודת‬
‫‪P‬‬
‫^‪ .0,3-0,7‬תמונה )י ‪ (81‬מתארת הפרדת תכשיר ‪UNA .‬‬
‫שטופל פעם אחת ע״י דינאז פרונז כגעזואר בשיטות‪ .‬תמונה ) ‪(811‬‬
‫‪ P‬שעבר טיפול אנזימתי שני‪,‬‬
‫‪RNA‬‬
‫מתארת הפרדה דומה של תכשיר‬
‫מקטעים ‪ 8-13‬תמונה ‪ . 81‬מיצגים את האיזור הרגיש לדינאז‪.‬‬
‫הזיהום של מקטע ה‪ sJJNA• -‬עם^אנס מוצג בנםוי ההרוויה )עקום ‪A‬‬
‫?מטופל חד‪-‬פעמיר בפרונז‪-‬דיאז‪,‬‬
‫ציור פנימי(‪ ,‬שבו‪sRNA‬‬
‫הוסף בכמויות עולות לכמות קבועה של ‪ . DNA‬מיבריד‬
‫‪, P‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫נוצר ביתם ישר לתשומת ‪ . RNA-A‬באשר‬
‫מנוקה )מיקמע ‪ , 13‬תמונה ‪ (811‬עובר הברידיזציה כזו‪,‬‬
‫מקבלים הרויה ברמה של ‪) 0.03$‬עקום ‪ , B‬ציור פנימי(‪.‬‬
‫‪25 -‬‬
‫הכנת‬
‫‪DNA‬‬
‫ה‪DNA -‬‬
‫‪24‬‬
‫שעות ו נטחנו‬
‫עד ריכוז סל‬
‫‪-‬‬
‫הוכן בעקבות מרמור )‪ .(56‬ונקויו עובד על ידנו‪ 3 .‬גרם עוברים הונבטו‬
‫ב‪50-‬‬
‫‪. Saline EDTA‬‬
‫מייל‬
‫אתרי תוספת סל‬
‫‪ ,M1‬הוסף נפח סוה של כלורופרם‪/‬איזועפיל‬
‫‪ 8‬מייל‪SDS«/25‬‬
‫אלכוהול ביחס‬
‫במהירות ‪8000‬‬
‫במשך חצי שעה ‪,‬נ?פרידים על ידי ס ירכו ז בםרוול‬
‫‪.‬‬
‫ותוספת‬
‫^‪NaClO‬‬
‫‪24/1‬אחרי טלטול‬
‫למשך ‪10‬‬
‫םבובים לדקה‬
‫דקות‪ ,‬את‬
‫השכבה המימית העליונה וחוזרים על מצויה בעזרת מחצית הנפח כלורופורם ורבע הנפח תמיסת‬
‫‪ 88$‬פנול‪ .‬המצוי נערך מחצית השעה במטלטלת מכנית והשכבה המימית הופרדה שוב על ידי םרכוז‬
‫כמתואר לעיל‪ .‬לשכבה המימית הוספו ‪ 2‬נפחים כהל אתילי קר וה‪-‬‬
‫נכרך על מוט זכוכית‪ ,‬נשטף בכהל אתילי‬
‫והועבר ל‪-‬‬
‫‪DNA‬‬
‫השוקע בשכבת הביניים‬
‫‪.‬‬
‫מייל לתמיסת‪XSSG0.110‬‬
‫ההמסה נמשכת‬
‫כ‪ 24-‬שעות‪.‬‬
‫‪timescrystallized5)Cal.Biochem.‬‬
‫נוקלאז‬
‫מתוממת מוספת לתפיסת‬
‫^‪DNA‬‬
‫‪x‬‬
‫(‬
‫בריכוז סופי של ‪ 20‬מיקרוגרם למייל‪ ,‬למסך שעתיים בממפ' של‬
‫^‪ .37‬באותה מערכת אינקובציה מוספים את הפרונז לאחר עיכול הריבונוקלאז‪.‬‬
‫פרונז שעבר אינקובציה קודמת במששך שעתיים‪ ,‬מוסף בריכוז סופי של ‪ 200‬מ״ג‬
‫טיפול פרונז‪:‬‬
‫למייל למשך ‪ 4‬שעות בטמפ' של ‪.30°‬‬
‫‪2‬‬
‫־‬
‫‪n‬‬
‫‪D‬‬
‫‪E‬‬
‫לרכוז סופי‬
‫סל^‪MNaClO1‬‬
‫ותוזרים על מצוי‬
‫הפנול‪-‬כלורופורם‪ ,‬מצוי השכבה המימית עם כלודופורם‪/‬איזו‪-‬עמיל אלכוהול‪ ,‬הסקעה בכהל ובריכת‬
‫חוטי‬
‫‪n‬־‪DNA‬‬
‫•‬
‫בעזרת מוט הזכוכית ממיסים‬
‫ומרים את‪ .‬תמיסת ה‪-‬‬
‫ב־־‪60 - 50‬‬
‫‪A‬‬
‫‪N‬‬
‫^‬
‫־‬
‫‪D‬‬
‫‪0‬‬
‫‪O.lxSSC,2‬‬
‫‪.‬‬
‫מעל כ ל ו ר ו פ ו ר ם ה נ ק ו י האנזימתי מוריד את הנצולת‬
‫אחוזים‪ .‬שלמותו של ה‪-‬‬
‫‪DNA‬‬
‫ובאולטרצנטריפוגה אנליטית םפינקו מודל‬
‫‪9‬בפי סנקבע בנםוי‬
‫היא‪3‬‬
‫‪.39‬‬
‫פ״ל ואחרי‬
‫‪ 2‬דיאליזות ב־־‪4°‬‬
‫נגד‬
‫‪2‬‬
‫לימד‬
‫נבדקה על ידי אנליזה סדימנטציה במפל םוכרוז‪,‬‬
‫‪g‬‬
‫)נקודת ה‪-‬‬
‫)תמונה ‪.(9‬‬
‫‪Tm‬‬
‫של‬
‫‪DNA-n‬‬
‫קבוע הםדמנטציה של תכשיר‬
‫‪7‬‬
‫‪1‬‬
‫"‪DNA‬‬
‫מתכשירים שונים בתמים^‪XSSC0.1‬‬
‫ ‪- 24‬‬‫®‪ .78^-83‬מ ק ס י מ ו ם הבליעה ה ו א ב ‪-‬‬
‫היא ב י ן‬
‫ד ד על י ד י טטרציה א ל ק ל י ת ל‬
‫‪pH-13‬‬
‫‪1‬‬
‫עם‬
‫‪,25&%1‬‬
‫‪M NaOH‬‬
‫נ י ת ן ל ה ע ב י ר את‬
‫לפצב של ג ד י ל‬
‫‪DNA-n‬‬
‫וטטרציה ח ו ז ר ת ל‪7-‬‬
‫עם‬
‫‪pH‬‬
‫‪1M HC0.5‬‬
‫או ע ״ י חמום ל‪ 90^-‬ו ק י ר ו ר מ ה י ר ‪ .‬המעקב אחרי ה ש נ ו י ה ה י פ ו ו כ ר ו פ י נעשה באמצעות ס פ ק ט ר ו פ ו ט ו פ ט ר‬
‫‪.cariy‬‬
‫‪[v-V;:‬‬
‫‪I*. -V‬‬
‫ת מ ו נ ה ‪;9‬‬
‫‪0‬‬
‫‪A‬‬
‫‪5‬‬
‫‪N‬‬
‫םדימנטציה‬
‫‪D‬‬
‫ש‬
‫ל‬
‫מחיטה‪.‬‬
‫‪DNA‬‬
‫ש ה כ י ל ‪M0.15 1 « ! 1‬‬
‫ב ־ ‪ 1‬מייל ‪TM‬‬
‫מיקרוגרם‬
‫ה ו ר צ ו באולטרה צ נ ט ר י פ ו ג ה ם פ י נ ק ו מ ו ד ל ‪E‬‬
‫ב מ ה י ר ו ת ‪ 3 5 , 6 0 0‬ס ב ו ב י ם לדקה ו צ ו ל מ ו במערכת‬
‫? ‪SW = 3 9 x lO-‬אופטית‬
‫‪.‬‬
‫‪1‬‬
‫‪0‬‬
‫‪v‬‬
‫ה‬
‫י‬
‫ב‬
‫ר‬
‫ז‬
‫ד‬
‫י‬
‫ז‬
‫‪8‬‬
‫י‬
‫ה‬
‫ב‬
‫י‬
‫ז‬
‫‪RNA‬‬
‫ל ‪DNA -‬‬
‫מחיטה‬
‫שיטת ה ה ב ר י ד י ז צ י ה היתה ז ו של ש פ י ג ל מ ן‬
‫דנטורציה‬
‫ה‬
‫א ל ק ל י ת של‬
‫ת ו ז ר ת עם‪MHC10.5‬‬
‫ל‪=7-‬‬
‫צ י מ ו ד ה ־ ‪DNA‬‬
‫ה‪-DNA‬‬
‫‪3‬‬
‫‪1‬‬
‫‪SS‬‬
‫תוצרת ש ל י כ ר את ש ו ל ( ‪.‬‬
‫‪0,‬ן‪3‬ת ‪260‬‬
‫‪M‬‬
‫ם ו ד י ו פ הידרוקםיד‬
‫בהתאם ל ר י כ ו זהדרוש‪x G‬‬
‫ל פ י ל ט ר י ם נעשה ע ל י ד י העברת תמיסת ‪DNA‬‬
‫האופטית של ה ת ם נ י ן ב א ו ר ך ג ל‬
‫בתםנין‪.‬‬
‫וגילספי ) ‪.( 83‬‬
‫נעשתה ע ל י ד י ס י ט ר צ י ה עם‬
‫‪ . pH‬התפיסה נמהלה עם‬
‫של נ י ט ר ו צ ו ל ו ז )‪B -6‬‬
‫‪u‬‬
‫^‪3-14pH=l‬‬
‫‪2‬‬
‫‪.‬‬
‫‪.‬שעבר ד נ ט ו ר צ י ה א ל ק ל י ת דרך פ י ל ט ר י ם‬
‫י ע י ל ו ת ה צ י מ ו ד נבדקה ה ן ע ל י ד י בדיקת ה ב ל י ע ה‬
‫ו ה ן על י ד י ספירת‬
‫‪DNA‬‬
‫‪ H‬הצפוד לפילטר וספירת‬
‫‪3‬‬
‫‪H‬‬
‫־‪25‬־‬
‫הפילטר‬
‫שעות ולאתר מ כ ן במשך ש ע ת י י ם ב־־^‪,80‬‬
‫י ו ב ש בחדר ‪4‬‬
‫בהתאם ל ת כ ש י ר י ם ה ש ו נ י ם ‪,‬‬
‫פילטרים‬
‫ו כ מ ו ת ‪DNA-n‬‬
‫ההיברדיזציה‬
‫הוכתב רק פ א י ז ו ר‬
‫‪ ,‬א ו במקרים של ר ד י ו א ק ט י ב י ו ת ס פ צ י פ י ת נ מ ו כ ה של תכשיר ה‪RNA -‬‬
‫א י נ ו מ ו ת נ ה בכמות ‪DNA-n‬‬
‫ה ה י ב ר ד י ז צ י ה עם ‪DNA‬‬
‫‪32‬‬
‫‪.‬‬
‫ל פ י ל ט ר היתה ‪ 1-150‬מ י ק ר ו ג ר ם ‪ ,‬בהתאם ל נ ד ר ש ‪.‬‬
‫ע מ ו ס י ם ב כ ב ד ו ת שפשו במקרים אשר בהם ה י ה נ י ת ן ל צ פ ו ת ‪RNA-;ro‬‬
‫קטן של ה ‪PNA -‬‬
‫‪RNA‬‬
‫י ע י ל ו ת ה צ י מ ו ד נעה ב י ן ‪ 9 0 $‬־ ‪7 5 $‬‬
‫‪ .‬אחוז‬
‫לפילטר‪.‬‬
‫םפוח ל פ י ל ט ר נעשית על י ד י הטבלת ה פ י ל ט ר‬
‫ב ‪ 1 . 7 -‬מייל תמיסת‬
‫‪0‬‬
‫‪x2‬‬
‫‪ P‬בתוך‪330‬‬
‫ב‪-‬‬
‫ה פ י ל ט ר י ם ה ו צ א ו ‪ ,‬נשטפו עם‬
‫‪0‬‬
‫שעה בטמפ' החדר‪ ,‬נשטפו עם‬
‫מיקרוסקופית‬
‫‪.‬‬
‫‪ 6 5‬מ ק ס י מ ו ם ה ה י ב ר ד י ז צ י ה מ ו ש ג במשך כ ‪ 2 0 -‬שעות‬
‫‪5‬‬
‫‪2‬‬
‫פ ״ ל של ‪x SSC‬‬
‫מכל צ ד ‪ ,‬ט ו פ ל ו ב ‪ 2 0 -‬מ י ק ר ו ג ר ם‬
‫‪ 2‬ונמנו במונה נצנץ‬
‫פ‬
‫ק‬
‫ר‬
‫אלקטרונית‬
‫הכנת הפרפרטים ו צ ב י ע ת ם נעשו על פי פרםר ובדבק ) ‪( 5 7‬‬
‫הכנת הפרפרמים‬
‫לבדיקה‬
‫נ ל ק ח ו תלקי רקמה פ ר י מ ט מ ת י י ם מ ה א י ז ו ר ה מ ר כ ז י של ה ע ו ב ר ‪.‬‬
‫‪.1‬‬
‫פקסציה‪:‬‬
‫שעה אחת בתמיסת א ח ו ז אחד של ג ל ו ט ר א ל ד ה י ד ‪.‬‬
‫‪.2‬‬
‫שט י פה;‬
‫‪ 6‬פ ע מ י ם ב־־‪ 5‬מייל מ י ם מ ז ו ק ק י ם פ ע מ י י ם ‪.‬‬
‫‪.3‬‬
‫צביעת א ו ס מ י ו ם ;‬
‫חלקי‬
‫ואינו‬
‫י ו ר ד גם‬
‫בתמיסת ‪ 2$‬תומצה א ו ם מ י ת למשך ‪ 6 - 2‬ש ע ו ת ‪.‬‬
‫הרקמה נשטפו ‪ 4‬פעמים במים מ ז ו ק ק י ם אחרי צביעת ה א ו ם מ י ו ם ‪.‬‬
‫ד‬
‫‪C‬‬
‫‪S‬‬
‫‪S‬‬
‫‪x‬‬
‫‪.‬‬
‫ ‪- 26‬‬‫‪.4‬‬
‫ז מ ז המי פו ל‬
‫דהידרציה‬
‫‪: Embedding‬‬
‫ללילה‪.‬‬
‫‪5‬‬
‫‪/‬‬
‫‪1‬‬
‫‪ 30‬דקות‬
‫‪25$‬‬
‫‪ 30‬דקות‬
‫‪50$‬‬
‫‪ 20‬דקות‬
‫‪75°$‬‬
‫‪ 12‬שעות‬
‫‪95$‬‬
‫‪ 60‬דקות‬
‫‪100$‬‬
‫‪ 60‬דקות‬
‫‪100$‬‬
‫ל ו ס ט ו פ ל בתוך ‪ 2 5 $‬א צ ט ו ן‬
‫את ח ל ק י הרקמה מ ע ב י ר י ם פ ה א צ ט ו ן‬
‫ומשאירים‬
‫ה א צ ט ו ן מתרכז ואח ח ל ק י הרקמה מ ע ב י ר י ם ל ק פ ם ו ל צ י ה עם ו מ ט ו פ ל שהוספו ל ו א ק ט י ב ם ו ר‬
‫וא י נ י צ י א ט ו ר ‪.‬‬
‫(‬
‫רכוז‬
‫תמיסת ה א צ מ ו ז‬
‫ה פ ו ל י מ ר י ז צ י ה נעשית ב־־^‪ 55‬במשך ‪ 48‬שעות‬
‫אולטרמיקרוטום‪.‬‬
‫‪.6‬‬
‫חיתור‪:‬‬
‫ב ע ז ר ת ‪LKB‬‬
‫‪.7‬‬
‫צביעה‪:‬‬
‫ה י ד ר ו ק ם י ד ה ע ו פ ר ת ‪ ,‬החתכים ה ו ע ב ר ו למסך ‪ 30‬דקות לתמיסת ה י ד ר ו ק ם י ד העופרת‬
‫מתמיםה ר ו ו י ה ו נ ש ט פ ו היטב‪o‬־‪MNaOH0.02‬‬
‫ובמים מ ז ו ק ק י ם ‪.‬‬
‫־ ?‪- 2‬‬
‫ת ו צ א ו ת‬
‫פרק א׳ ‪ -‬נביטת עובר החיטה‬
‫‪.1‬‬
‫הנבטה ו י י ב ו ש של עובר_י_חיטה‬
‫ע ו ב ר החיטה ה נ ו ב ט נבחר כמערכת ה נ ם י ו נ י ת לחקירתם של י ח ם י מים צמח‪ .‬ה נ ב י ט ה של‬
‫ע ו ב ר החיטה מ ו ת נ י ת בקליטת מ י ם בלבד והמעבר מ ן המצב ה ל ט נ ט י סל ה ז ר ע ל פ ע י ל ו ת ב י ו ל ו ג י ת‬
‫מלאה מתרתס ת ו ך פרק ז מ ן ק צ ר ‪.‬‬
‫ת מ ו נ ה מ ם ' ‪ 10‬מתארת את א ו ר ח ג י ד ו ל ם של ה ע ו ב ר י ם במערכת ה נ ם י ו נ י ת ‪ 50 .‬ע ו ב ר י החיטה‬
‫)‪ 25‬ע ו ב ר י ם ‪ .‬בצלתת פטרי אתת( ה ו נ ב ט ו ב ‪ 2 4 ° -‬ב ח ו ש ך ‪ ,‬ב ת ו ך תמיסת הנבםה‬
‫למסך ‪ 24‬ש ע ו ת ‪.‬‬
‫ע ו ב ר י ם אלו‬
‫)מנותקים מן האנדומפרט(‬
‫)‪ 5‬מייל(;‬
‫י ק ר א ו )‪, (24‬אפשר ליבש ע ו ב ר י ם‬
‫ס נ ב ט ו ‪ 24‬שעות ע ״ י העברתם לתא של א ט מ ו ס פ י ר ה מבוקרת עם ‪ 15$‬לתות יחסית ב ‪ 2 8 ° -‬למשך‬
‫‪ 48‬ש ע ו ת ‪ ,‬מ ב ל י ל פ ג ו ע בכושר ג י ד ו ל ם ‪ .‬ע ו ב ר י ם אלה י ק ר א ו‬
‫עוברים‬
‫התקין‬
‫פרק‬
‫מיובסים אלו‬
‫)‪.(24-48‬‬
‫נ י ת ן ל ה נ ב י ט מחרס ת ו ך ‪ 24‬שעות ללא פ ג י ע ה והם י מ ש י כ ו את ג י ד ו ל ם‬
‫אחרי שהיה של כ ‪ 6 -‬ש ע ו ת ‪.‬‬
‫יקראו‬
‫ע ו ב ר י ם אלו‬
‫) ‪ . ( 2 4 - 4 8 - 2 4‬אם ה ו נ ב ט ו ה ע ו ב ר י ם‬
‫ז מ ן ממוסך י ו ת ר ה ר י אחרי ‪ 72‬שעות נ ב י ט ה י ג ר ו ם י ב ו ש ם להפסקת ג י ד ו ל של ‪100$‬‬
‫א ח ו ז י ם מן האוכלוםיה‪ .‬כלומר עובר בן‬
‫‪ 24‬שעות ) ‪( 7 2 - 4 8 - 2 4‬‬
‫)‪ (72‬ש י ו ב ש ‪ 48‬שעות )‪(72-48‬‬
‫א י נ נ ו ממשיך את ג י ד ו ל ו‬
‫עוברי‬
‫חיטה מ ט ו פ ל י ם ‪- :‬‬
‫)‪(1‬‬
‫עוברים עמידים ליבוש שגידולם תקין‬
‫י ו ת ר ‪ .‬בסיכום נ י ת ן להבחין‬
‫‪.(24) -‬‬
‫)‪(2‬‬
‫״‬
‫״‬
‫יי‬
‫לאחר‬
‫י י ב ו ש ‪,(24-48) -‬‬
‫)‪(3‬‬
‫״‬
‫יי‬
‫״‬
‫לאחר‬
‫י י ב ו ש ו הרטבה ) ‪. ( 2 4 - 4 8 - 2 4‬‬
‫)‪(4‬‬
‫עוברים רגישים ליבוש שגידולם תקין‬
‫)‪(5‬‬
‫״‬
‫״‬
‫״‬
‫)‪(6‬‬
‫יי‬
‫יי‬
‫״‬
‫‪. (72) -‬‬
‫לאחר י י ב ו ש ‪. ( 7 2 - 4 8 ) -‬‬
‫״‬
‫״‬
‫ו ה ו ר ט ב מחדש למשך‬
‫והרטבה‬
‫)‪.(72-48-24‬‬
‫ב ‪ 6 -‬מצבים של‬
‫תמונה ‪ :10‬מהדן גידולם של עוברי החיטה‪.‬‬
‫זרעי החיטה הונבטו בצלחות פטרי המכילות •‪ 5‬מייל תמיסת הנבםה‬
‫למשך פרקי זמן קצובים‪ ,‬בטמפ' של ‪ P&2‬ללא אור‪ .‬העוברים נותקו‬
‫מעל האנדוםפרם לפני בדיקת המסקל היבש כאשר כל ‪ 50‬עוברים‬
‫מהוים דוגמא אחת‪ .‬התיצים הכפולים מציינים הוצאתם של העוברים‬
‫אל תאי ייבוש למשך ‪ 48‬שעות ב‪ 15$-‬לחות יחסית‪ .‬תקופה זו אינה‬
‫נכללת במסך חיי העובר מאחר ולא חל כל גידול של ממש בפרק‬
‫זמן זה‪ .‬לאתר מכן הורטבו הזרעים מחדש בתמיסת הנבטה כדי לאפשר‬
‫המשך הצמיחה‪ .‬הגידול מבוטא במיליגרמים משקלם היבש של ‪50‬‬
‫עוברים‪ .‬המשקל היבש נמדד לאחר ליופיליזציה של העוברים במשך‬
‫‪ 48‬שעות‪ ,‬בליופיליזר וירטים‪ 0—0 .‬גידול תקין‪ • — * .‬המסך‬
‫הגידול לאחר ‪ 48‬שעות ייבוש של עובר בן ‪ 24‬שעות )‪.(24-48-24‬‬
‫של עובר בן‬
‫‪ p — D‬המסך הגידול לאחר ‪ 48‬שעות ייבוש‬
‫‪ 72‬סעות )‪.(72-48-24‬‬
‫הגידול התקין סל העוברים מאפשר מעקב אחר התהליכים השונים החלים בעת הנביטה‪.‬‬
‫ייבוש העוברים מאפשר חקירת ההשפעה של מחסור מים על הגידול תוך השוואת עוברי תיטה שאינם‬
‫ניזוקים עם אלו שגידולם נפסק‪ .‬ההרטבה המחודשת של עוברי החיטה שעבדו קודם לכן ייבוש במשך‬
‫‪ 48‬שעות מאפשרת את חקירתם של תהליכים מוסרי יובש שהם בלתי חוזרים‪.‬‬
‫בחלקו הראשון של פרק א* יובאו הנתונים שנלמדו באשר לתהליכי היסוד הקסודים בנביטתו‬
‫וגידולו סל עובר התיטה ואילו השפעות מחסור המים יתוארו בחלקו השני‪.‬‬
‫־ ‪- 29‬‬
‫מורפולוגיה וציטולוגיה של_עובר החיטה הנובט‬
‫הכרת העובר הנובט מבחינה מורפולוגית‪ ,‬ברמה התאית כברמה של האורגניזם השלם‪ ,‬היא‬
‫תנאי מוקדם להסתכלות בתהליכי הנביטה שברמה המולקולרית‪ .‬עם הרטבת הזרע תופת העובר‬
‫תוך זמן קצר וכעבור שעה הוא מלבין וניתן להפרדה קלה מן הםקוטלום המחברו אל האנדוספרם‪.‬‬
‫קליטת המים נמשכת עד ‪ 6‬שעות ולאחר עיכוב בעליה של אחוז המים במסך של כ‪ 4-‬שעות שוב‬
‫עולה אחוז המים בעובר עד ל‪ 24-‬שעות מתחילת הנביטה‪ .‬כעבור ‪ 24‬שעות אפשר להבחין בפריצת‬
‫‪ 3‬קדקדי שרשונים‪ .‬החותלת מתארכת מאוחר יותר ואחרי ‪ 48‬שעות אפשר להבחין בגבעול‪.‬‬
‫החתכים המיקרוםקופים המובאים בתמונה ‪ 11‬מתארים את השנויים התלים בעובר בתחילת נביטתו‪.‬‬
‫בעובר היבש )תמונה‬
‫)‪.(Rm‬‬
‫‪11‬‬
‫‪ ( a‬אפשר לראות דפרנציאציה תלקית לרקמות הגבעול ) ‪Sm‬‬
‫תוך ‪ 24‬שעות נביטה תלים שנויים בארגון הרקמות‪ .‬החותלת ) ‪C‬‬
‫להבחין באיזור ההתארכות )‬
‫‪r‬‬
‫‪D‬‬
‫( והשרש‬
‫( מתארכת ואפשר‬
‫(‪ ,‬בעלים ראשוניים ) ‪ ( L‬ושרש ) ‪ .( R‬העובר מן ‪24‬‬
‫שעות הוא בעל נתונים מורפולוגיים בעלי יסוד מגדר ‪ -‬ועדיין בעל עמידות מלאה לייבוש‪.‬‬
‫מבנה התא של עובר החיטה הנובט נבדק במיקרוסקופ •האלקטרוני בשלבי הנביטה הסונים לאחר‬
‫‪ 48 ,24 ,18 ,12 ,5 ,1‬ו‪ 72-‬שעות‪.‬‬
‫תמונות ‪ 13 ,12‬פיצגות תאי עובר בן שעה אחת ועובר בן ‪ 48‬שעות‪ .‬העיקוב אחרי תאים‬
‫מאיזור האפיקוטיל מראה כי בכל השלבים של הנביטה שנבדקו יקשה להבחין בשנויים‬
‫סטרוקטורליים בולמים החלים במהלך הנביטה‪.‬‬
‫העובר היבש‪ ,‬כעובר הנובמ‪ ,‬מכיל גרעין ) ‪ ( N‬התופש את מרבית נפחו של התא‪.‬‬
‫הגרעינון מגדר היטב‬
‫ופרופלסטידים ) ‪P‬‬
‫)‪ . ( Nu‬לממברנת הגרעים מבנה דו שכבתי ) ‪ .( j j‬מימוכונדריה)‪M‬‬
‫‪m‬‬
‫( נמצאים בכל תא‪ .‬דופן התא מכווץ מעט בעובר יבש ) ‪CW‬‬
‫(‬
‫( וקשרים‬
‫פלסמתיים‪ ,‬פלסמודסמה ) ‪^( P D‬נמצאים בכל הדפנות‪ .‬גופים כדוריים ) ‪ , ( D S‬כנראה םפרוזומים‬
‫)‪^(58‬מפוזרים בציטופםמה‪ .‬פסי רטיקולום‪ ,‬לרבות המבנה הטובולרי שלהם‪ ,‬ניתנים להבחנה ) ‪( E R‬‬
‫בתאים מעוברים צעירים‪ .‬פסי הרטוקולום מתרבים בתאים מעוברים מבוגרים יותר )תמונה ‪.(13‬‬
‫‪- 30‬‬‫הסברים‬
‫לתמונות‪:‬‬
‫ת מ ו נ ה ‪:11‬‬
‫תתכים מ י ק ר ו ס ק ו פ י י ם של ע ו ב ר י חיטה נ ו ב ט י ם ‪.‬‬
‫ה ע ו ב ר י ם ג ו ד ל ו על ג ב י ה א נ ד ו ם פ ר ם ב מ ו ך מ י ם מ ז ו ק ק י ם ב־־‪ ,24°‬נ ו ת ק ו‬
‫הכנת התת)־‪:‬‬
‫כהל א ת י ל י ‪ 2 $ ,‬פ ו ר מ ל ה י ד ‪ 2.5$ ,‬חומצה‬
‫‪FAA(50$‬‬
‫ל פ נ י הבדיקה ו ה ו ע ב ר ל פ י ם ק ט י ב‬
‫אצטית ק ר ת נ י ת ( ‪ .‬אתרי ד ה י ד ר צ י ה בסדרות א צ ט ו ן והתדרת פ ר פ י ן ‪ ,‬ה ו כ נ ו ס ר י ו ת תתכים‬
‫( חתך ב ע ו ב ר יבש• ) ‪ ( b‬חתך‬
‫במיקרוטום ונצבעו בהמוטוקםילין א א ו ז י ן ‪) .‬‬
‫ב ע ו ב ר חיטה שנבט ‪ 18‬ש ע ו ת ‪ ( c ) .‬ע ו ב ר ש ה ו נ ב ט על א ג ר ג ל ו ק ו ז )‪ 1$‬א ג ר ‪ 1$ ,‬ג ל ו ק ו ז‬
‫‪a‬‬
‫‪ -‬תותלת‪.‬‬
‫מיקרא‪c :‬‬
‫^‬
‫‪ - L‬עלים ר א ש ו נ י י ם ‪.‬‬
‫‪ -‬מריסטמת השורש‪.‬‬
‫ת מ ו נ ו ת ‪: 1 4 , 1 3 ,12‬‬
‫‪ - Sm‬מריםטמח ה ג ב ע ו ל ‪.‬‬
‫‪ -‬א י ז ו ר ה ג י ד ו ל של החותלת‪.‬‬
‫א ל ק ט ר ו ן מ י ק ר ו ג ר פ י ם מ י צ ג י ם סל ע ו ב ר י החיטה‪.‬‬
‫כל התכשירים נקבעו ב‪ 1$-‬ג ל ו ט ר א ל ד ה י ד ‪ ,‬ט ו פ ל ו ב ‪ 2 $ -‬א ו ס מ י ו ם ט ט ר א ו ק ם י ד ‪,‬‬
‫י ו ב ש ו בסדרות א צ ט ו ן ‪ ,‬ו נ ק ב ע ו ב ו ם ט ו פ ל ‪ .‬ה פ ו ל י מ ר י ז צ י ה של ה ו ס ט ו פ ו ל‬
‫נעשתה במשך ‪ 40‬שעות ב ‪. 5 5 & -‬‬
‫) ‪ - ( U‬צביעת מאוחרת עם א ו ר נ י ל א צ ט ט ‪ - ( 1 2 ) .‬תא א ו פ י נ י מ ע ו ב ר ב ן שעה‪.‬‬
‫‪, (15.700 )X‬‬
‫‪ 1 8 . 0 0 0‬א ‪ - ( u ) ()13‬תא א ו פ י נ י מ ע ו ב ר בן ‪ 48‬ש ע ו ת ‪.‬‬
‫) ‪ - ( 1 4‬הגדלה של תא ב ן ‪ 48‬שעות ‪.( U ) x 4 5 . 5 0 0‬‬
‫‪u‬‬
‫מיקרא‪:‬‬
‫‪ - C W‬ד ו פ ן התא‬
‫‪N‬‬
‫‪V‬‬
‫‪ -‬גרעין‬
‫וקאולה‬
‫עמילן‬
‫‪ -‬ממברנת ה ג ר ע י ן‬
‫גוף‬
‫‪R‬‬
‫‪ -‬ריבוזומים‬
‫רטיקולום‬
‫‪M‬‬
‫‪ -‬מטוכונדריה‬
‫‪P‬‬
‫‪ -‬פלםטיד‬
‫‪Nm‬‬
‫‪DM‬‬
‫‪Nu‬‬
‫צפיד‬
‫אנדופלםמתי‬
‫ממברנה כ פ ו ל ה‬
‫גרעינון‬
Fig. 2 WHEAT (triticum durrum, var. Nursite)
Fig. 2c
EXPLANTED EMBRYO (24 hrs.)
‫י״ •*•י־״*‪-..‬־‪*.‬־־״‪.‬‬
‫‪**•-• ^ V ' - • - r f‬יי‪:'?-.‬יי״״‬
‫‪1‬‬
‫‪r‬‬
‫‪• .‬י‬
‫‪•::,‬׳^^‪,V,‬‬
‫‪-.•.- .‬׳‪.‬יי‬
‫‪r‬‬
‫\<׳^•‬
‫^'^‬
‫י‪.-‬־‪..‬׳•*‪r £‬‬
‫ ‪35‬‬‫הגופים‬
‫הכדוריים‬
‫‪-‬‬
‫)‪ ( Ds‬מ ר ו כ ז י ם ל י ד ה ד ו פ ן ‪ ,‬אך לאתר ה נ ב י ט ה הם מ פ ו ז ר י ם י ו ת ר ־ הציטופלסמה‬
‫עשירה ב י ו ת ר ב ר י ב ו ז ו ם י ם ו צ פ י פ ו ת ם מ ו נ ע ת הבחנה ב ק י ו מ ן של ם ט ר ו ק ט ו ר ו ת פ ו ל י ז ו מ ל י ו ת ‪ .‬ת מ ו נ ה ‪14‬‬
‫מוסרת ב פ י ר ו ט יתר את ה א ר ג ו ן ה צ י ט ו פ ל ם מ ת י‬
‫והריבוזומים‬
‫על‬
‫‪ -‬צפיפות ה ר י ב ו ז ו מ י ם ‪ ,‬ר ט י ק ו ל ו ם ‪ ,‬מ י ט ו כ ו נ ד ר י ה‬
‫השיכים ל ה ‪ .‬פ ר ו פ ל ס ט י ד י ם ו ה מ מ ב ר נ ו ת ה כ פ ו ל ו ת ‪ ,‬התא שנלקח מ ע ו ב ר ב ן ‪ 48‬ס' מ א ו פ י ן‬
‫י ד י תחילתה של ו ק ו א ו ל ו ז צ י ה ‪ .‬ל ס י כ ו ם ה ת צ פ י ו ת ה צ י ט ו מ ו ר פ ו ל ו ג י ו ת ‪:‬‬
‫העובר ע ו ב ר ד פ ר נ צ י א צ י ה‬
‫•ברורה ע ו ד בטרם חלפו ‪ 24‬שעות נ ב י ט ה ‪ .‬ש נ ו י זה חל ב ע ו ד העובר ע מ י ד לדהדרציה‬
‫אינו‬
‫ג ו ר ם נ ז ק ‪ .‬ככל ש נ י ת ן לשפוט הרי לא תל ש נ ו י‬
‫ו י י ב ו ש ו המלא‬
‫נ י כ ר בדרגת ה א ר ג ו ן התת תאית של תאי ע ו ב ר‬
‫במהלך ה נ ב י ט ה כ פ י שנחקרה ברמה של ה מ י ק ר ו ס ק ו פ ה א ל ק ט ר ו נ י ‪.‬‬
‫‪.3‬‬
‫ה‪-‬‬
‫‪DNA‬‬
‫א־‬
‫של ע ו ב ר החיטה‬
‫ת כ ו ל ה ־‬
‫ריקמת ע ו ב ר החיטה מ צ ט י נ ת בתכולת‬
‫כי‬
‫‪DNA‬‬
‫ג ב ו ה ה ‪ .‬מ ת מ ו נ ו ת ‪ 12‬ו־־‪13‬‬
‫ה ג ר ע י ן תופש ל ע י ת י ם כ ‪ 4 0 - 3 0 -‬א ח ו ז מ נ פ ח התא‪ ,‬תכולת ה‪DNA-‬‬
‫נ י ת ן לראות‬
‫הממוצעת ב ע ו ב ר י ם אלו‬
‫ה י א ‪ 2 , 4 5‬מ ״ ג ל ג ר ם משקל יבש של ע ו ב ר י ם ) בממוצע ל ‪ 8 -‬הפקות י ש י ר ו ת ( ‪ .‬תכולת ‪DNA-n‬‬
‫נקבעה גם ב א ו פ ן ע ק י ף על י ד י הנבטת ע ו ב ר י ם בתמיסת נ ב י ט ה ר ד י ו א ק ט י ב י ת‬
‫טימידין‬
‫לפעולת‬
‫‪H‬‬
‫‪c3)^p32‬‬
‫‪B‬‬
‫או‬
‫( ‪ ,‬הפקת כ ל ל ה ח ו מ צ ו ת ה נ ו ק ל א י ו ת בשיטת ה פ נ ו ל ו ק ב י ע ת ג ו ד ל המקטע ה ר ג י ש‬
‫ד נ א ז )כמתואר ב ש י ט ו ת ‪,‬‬
‫נקוי‬
‫דנאז‪-‬פרונז(‪.‬‬
‫תכולת ה ‪DNA -‬‬
‫לגרם ע ו ב ר י ם ) בממוצע ל ‪ 3 -‬ה פ ק ו ת ( ־ ע ו ב ר חיטה מ מ ו צ ע שמשקלו‬
‫היא בשיטה ז ו ‪ 3.4‬מ ״ ג‬
‫‪ 0.7‬מ״ג מכיל‪ ,‬איפוא‪,‬‬
‫‪5‬‬
‫‪ 2.5‬מיקרוגרר!‬
‫היא‬
‫או‬
‫‪DNA‬‬
‫לכן־‬
‫‪T,2x.‬עוברכ ז ה מ כ י ל בממוצע‬
‫גרם ~ ‪x 1 0‬‬
‫‪5‬‬
‫‪10‬‬
‫' • ־תאים‬
‫=‪10X2.08‬‬
‫‪2 5X10 6‬‬
‫‪11‬‬
‫תאים‪ .‬תכולת הי ‪DNA‬‬
‫‪1.2‬‬
‫ג‬
‫י‬
‫בגרעין‬
‫ם‬
‫‪ 20.8‬פיקרוגרם‪.‬‬
‫משקלו‬
‫‪082‬‬
‫‪/‬‬
‫ה מ ו ל ק ו ל ר י של ג נ ו ם מלא ה ו א ל כ ן ‪) :‬דלטון‪10 (12.5x‬‬
‫‪-11‬‬
‫‪12XI‬‬
‫=‬
‫‪2 4‬‬
‫בכל ג ר ע י ן יש ‪ 48‬כ ר ו ם ו ז י ם ו ל כ ן משקלו ה מ ו ל ק ו ל ר י הממוצע סל ‪n‬־‪DNA‬‬
‫‪0‬‬
‫~‪10‬‬
‫‪1.67 x‬‬
‫ב כ ר ו מ ו ז ו ם הוא‬
‫ג ן ד ל‬
‫‪10‬בםדר‬
‫ס ל‬
‫) ז ל ט‬
‫וו‬
‫‪12‬‬
‫‪11‬‬
‫‪6x‬‬
‫(‬
‫__‪2‬ו_‪_12_.5_<5‬בל״‬
‫י‪= 2‬‬
‫‪48‬‬
‫כרומוזומים‬
‫עם ה נ ב י ט ה ‪.‬‬
‫םינתזי ‪DNA‬‬
‫‪r‬‬
‫בנםוי‬
‫באמצעות ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה‬
‫המתואר בתמונה ‪ 15‬ע ק ב נ ו אתרי קצב ה ס י נ ת ז ה של ‪DNA‬‬
‫‪3‬‬
‫סל‬
‫‪H‬‬
‫ט י מ ד י ן בתוך ע ו ב ר י חיטה נ ו ב ט י ם ‪ .‬ב ג ל ל ה ע ל י ה הנכרת ב ת ד י ר ו ת של ט י מ ד י ן‬
‫מ ס ו מ ן עם ה נ ב י ט ה ‪ ,‬ב ו ט א ו התוצאות כ א ח ו ז‬
‫מנסוי‬
‫נביטה‪.‬‬
‫‪15‬‬
‫נ י ת ן ללמוד כי‬
‫האנקורפורציה‪.‬‬
‫ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של ט י מ י ד י ן מ ס ו מ ן ‪ ,‬מ ת ח י ל ה רק לאתר ‪ 12‬שעות‬
‫הופעת מ י ט ו ז ו ת נ י ת נ ת ל א י ב ח ו ן מ י ק ר ו ס ק ו פ י רק בשעות ‪ 14-16‬מתחילת ה נ ב י ט ה ‪.‬‬
‫‪32‬‬
‫בנםויי‬
‫‪P‬‬
‫א נ ק ו ר ם ו ר צ י ה של‬
‫בשעות ה נ ב י ט ה ה ר א ש ו נ ו ת נמצא כ י הפוםפט ע ו ב ר א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה‬
‫ל ת ו ך מקטע של ה ח ו מ צ ו ת ה נ ו ק ל א י ו ת שקבוע‪ .‬הסדמנטציה שלו‬
‫)‪8‬כבנםוי‬
‫זו‬
‫‪ ,‬מקטע ‪( 8 - 1 2‬‬
‫נמוך מ ‪ -‬נ ‪ 2‬והנו רגיש לדנאז‬
‫ו ע מ י ד ל ה ד ר ו ל י ז ה אלקלית ב ‪M KOH0.3 -‬‬
‫משמעות א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה‬
‫לא ב ר ו ר ה ‪.‬‬
‫י‬
‫י‬
‫י‬
‫״‬
‫יי‬
‫י‬
‫‪*C‬‬
‫‪o‬‬
‫‪o‬‬
‫&‬
‫‪o‬‬
‫‪u‬‬
‫‪c‬‬
‫‪H5‬‬
‫‪e‬‬
‫‪to‬‬
‫‪hr‬‬
‫‪30‬‬
‫‪Hours of germinorion‬‬
‫במהלך ה נ ב י ט ה של ע ו ב ר ח י ט ה ‪.‬‬
‫!ו‬
‫קצב ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של ט י מ י ד י ן‬
‫ת מ ו נ ה ‪;15‬‬
‫מ נ ו ת ב נ ו ת ‪ 200‬פ ״ ג ע ו ב ר י חיטה נ ז ר ע ו לפרקי ז מ ן ש ו נ י ם בתוך ‪ 1.5‬פ ״ ל תמיסת ה נ ב י ט ה‬
‫‪ 1 1 M ) .‬א ח ר י ‪ 30‬דקות ס י מ ו ן ‪ .‬נ ט ח נ ו ה ע ו ב ר י ם‬
‫‪H‬‬
‫‪. m C / m‬‬
‫‪210‬‬
‫‪ .%‬א ל י ק ו ו ט של ‪ 0 / 1‬מ ״ ל נלקח ל מ נ י ח במות ה ט י מ י ד י ן ה כ ל ל י ת ש נ ק ל ט ה ‪,‬‬
‫‪TCA‬‬
‫ב ‪ 6‬מייל‬
‫‪ , T C A‬יובש ונמנה‬
‫‪5$‬‬
‫‪ 1‬ם ״ ל ה ו ע ל ה על מ י ל י פ ו ר פ י ל ט ר ‪ ,‬נשטף ‪ 3‬פעמים עם ‪ 3‬מייל‬
‫ב ט י ם י ד י ן שעבר א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ‪.‬‬
‫ג‬
‫‪3‬‬
‫ו‬
‫‪RNA‬‬
‫של עובר החיטה הנובט‬
‫‪RUA‬‬
‫א(‬
‫כללי־‬
‫חבולה‬
‫עובר החיטה היבש מכיל כמות גדולה של ‪ , R N A‬קרוב ל ‪ 2 -‬אחוזים ממשקלו בטרם‬
‫נבט‪ .‬כמות ה‪R N A -‬‬
‫הניתנת להפקה היא ‪ 1 8 . 4‬מ״ג‬
‫ל ‪ 7 8 -‬הפקות( ‪ .‬כמות ^ • ‪s R N A‬‬
‫לגרם חומר יבש‪.‬‬
‫‪RNA‬‬
‫מכיון שה‪-‬‬
‫‪RNA-n‬‬
‫לגרם חומר יבש של עוברים )בממוצע‬
‫היא כ ‪ 5 -‬״ ‪ 1‬מ״ג‬
‫הניתנת להפקה פתיר משפה ‪S - 1 0 0‬‬
‫הרבוזומלי פהוה‪ ,‬איפוא‪ ,‬כ ‪ 9 2 . 5 -‬אחוזים פכלל ה‪RNA -‬‬
‫הופק מהדיבוזומים הרי נתונים אלו אינם כולליג ‪RWA‬‬
‫הנמצא‬
‫בגרעין‪ ,‬במיטוכונדריה או בכלורופלםטים אשר הורתקו קודם לכן מהתכשיר הריבוזומלי‪.‬‬
‫ה‪R N A -‬‬
‫המופק מריבוזומים והמוגדר בהפקות הכמותיות ^ ‪R N A‬‬
‫בתוכו עדיין כ ־ ־ ‪ 4 . 5‬אחוז‬
‫ובלתי מדודה של‬
‫ב(‬
‫הסינתזה של ‪R N A‬‬
‫‪ s R N A‬כפי שנקבע בהפרדה על עמודות ‪M A K‬‬
‫בשלבי הנביטה הראשונים‪.‬‬
‫חיטה לפשך פרקי זפן שונים בתמיסת הנבטה‬
‫פוספט‬
‫‪2‬‬
‫וכמות נמוכה‬
‫‪.mRNA‬‬
‫על מנת לבחון מהוא מועד תחילתה של סינתזה ^ ‪H N A‬‬
‫?!‬
‫ריבו זומלי‪ ,‬מכיל‬
‫בעובר הנובט‪ ,‬הונבטו עובדי‬
‫רגילה והועברו לתמיסת הנבטה‬
‫לפשך ‪ 6 0‬דקות שלפני הוצאת העוברים‪ .‬העוברים נשטפו‬
‫המכילה‬
‫^־‪RNA‬‬
‫הופק‬
‫הרדיואקטיביות הספציפית של תכשירי ה־ ‪ RNA‬שהופקו בדרך‬
‫מהם כמתואר בפרק השיטות‪.‬‬
‫זו מתוארת בטבלה ‪ . 2‬מנתוני הטבלה אפשר לראות כי האנקורפורציה של הפוםפט המסומן‬
‫אל וזיו*‪RNA‬‬
‫נמשכת בשיעור נמוך עד השעה ה ‪ 2 4 -‬מתחילת הנביטה‪ .‬לאחר מכן עולה‬
‫האנקורפורציה באופן לינארי עם הזמן‪ .‬כדי לברר איזה הם סוגי ה ‪ R N A -‬הנוצרים‬
‫בשעות הנביטה הראשונות הונבטו העוברים למשך ‪ 6‬שעות בתמיסת הנבטה המכילה‬
‫‪500‬‬
‫‪32‬‬
‫מיקרוקירי לפ״ל פוספט‬
‫‪P‬‬
‫‪ .‬הריכוז הגבוה של הפוספט המה והן איפשר קבלת תכשיר‬
‫‪32‬‬
‫‪KNA‬‬
‫?‬
‫בעל פעילות רדיואקטיבית בעוצמה גבוהה יחסית ‪ -‬בתקופת נביטה סבה ק צ ב‬
‫‪38 -‬‬
‫טבלה ‪2‬‬
‫‪ -‬קצב הסינתזה‬
‫של^!?ז‬
‫מסך ה ס י פ ו ן‬
‫)שעות ה נ ב י ט ה (‬
‫‪-‬‬
‫במהלר הנביטה של עוברי חיטה‬
‫אחוז‬
‫האנקורפורציה‬
‫ספירות לדקה‪/‬‬
‫מ י קר ו גרם ‪HNA‬‬
‫‪ 1‬־ ‪0‬‬
‫‪8.2‬‬
‫‪5.0‬‬
‫‪2 - 3‬‬
‫‪9.9‬‬
‫‪5.4‬‬
‫‪4 - 5‬‬
‫‪10.7‬‬
‫‪7.0‬‬
‫‪11 - 12‬‬
‫‪11.5‬‬
‫‪22.0‬‬
‫‪ 24‬־ ‪23‬‬
‫‪46.3‬‬
‫‪102.0‬‬
‫‪ 36‬־ ‪35‬‬
‫‪61.3‬‬
‫‪285.0‬‬
‫‪47 - 48‬‬
‫‪61.0‬‬
‫‪670.0‬‬
‫פ נ ו ת ב נ ו ת ‪ 500‬מ ״ ג ע ו ב ר י חיטה ה ו נ ב ט ו בצלחות פטרי ב ‪ 2 -‬מייל תמיסת נ ב י ט ה‬
‫כפתואר ב ש י ט ו ת ‪ .‬ל צ ר כ י ם י פ ו ז ה ו ע ב ר ו ה ע ו ב ר י ם לתפיסת הנבטה ר ד י ו א ק ט י ב י ת‬
‫פ ו ם פ ^ ? ‪ Carrier free‬לפשך סעה‪ .‬לאחר ה ס י פ ו ן‬
‫‪ /‬מייל‬
‫‪p,c‬‬
‫‪50‬‬
‫הפכילה‬
‫פוספט בלתי מ ס ו מ ן ולאחר פ כ ן נ ט ח נ ו‬
‫‪M‬‬
‫‪0.05‬‬
‫נשטפו ה ע ו ב ר י ם בתמיסה ה מ כ י ל ה‬
‫אל ת ו ך ה ע ו ב ר י ם‬
‫^יף ‪ .‬ד ג י מ ה נלקחה ל פ נ י ת הקליטה של ^ ? ‪j‬‬
‫ב‪ " ^0-‬ל‬
‫ו ה ‪ RNA -‬ה ו כ ן ו נ ו ק ה כמתואר בפרק השיטות‪ .‬ה ר ד י ו א ק ט י ב י ו ת ס ל התכשירים נמדדה‬
‫ב פ ו נ ה נ צ נ ץ פקרד בתפיסת מ נ י ה של ד י א ו ק ם ן ‪.‬‬
‫‪2‬‬
‫מ‬
‫האנקורפורציה‬
‫מודת ‪MA.K‬‬
‫בעזרת‬
‫מ‬
‫פ‬
‫ב‬
‫ו‬
‫פ‬
‫ר‬
‫נ פ ו ך ב י ו ת ר ‪ .‬ה ־ ‪RNA‬‬
‫ה כ ל ל י הופק‬
‫ל ‪ M )NaCl0.2-1.2‬מ ת ו א ר ת ב ת פ ו נ ה‬
‫הדידואקטיביות‬
‫למיקרוגרם‪,‬‬
‫ו נ ו ק ה כמתואר בשיטות ותוצאת הפרדתו על‬
‫‪ .16‬פ נ ט ו י זה א נ ו ל פ ד י ם כ י‬
‫(‬
‫הספציפית ב א י ז ו ר ה ‪ ) sRNA -‬מ ב ח נ ו ת ‪ 2 8 - 3 8‬ת מ ו נ ה ‪ (16‬ה י א כ ‪ 7 9 0 -‬ס פ י ר ו ת לדקה‬
‫בעוד הרדיואקטיביות ב א י ז ו ר ה ‪-‬‬
‫קצב ה ס י מ ו ן ש ל ה מ ו ל ק ו ל ו ת באת ור ה‪sRNA-‬‬
‫‪RNA‬‬
‫ה ר י ב ו ז ו מ ל י ה י א ‪ 210‬ס פ י ר ו ת לדקה ל מ י ק ד ו ג ר נ ז ‪.‬‬
‫גבוה איפוא פי ‪ 4‬מזה סל ה־ ‪RNA‬‬
‫הריבוזומלי‬
‫במשך ‪ 6‬שעות ה נ ב י ט ה ה ר א ש ו נ ו ת ‪ .‬ב ג ל ל ה פ ע י ל ו ת ה ס פ צ י פ י ת ה נ מ ו כ ה א י ן ל ה ו צ י א מ כ ל ל אפשרות‬
‫ס י פ ו ן ‪ sRNA-n‬ע ״ י ש י ח ל ו ף א ו תוספת לקצות השרשרת של מ ו ל ק ו ל ת ה ‪ , sRNA -‬ו ל א ו ד ו ק א ס מ ו ן‬
‫ע ״ י ט ד נ ם ק ר י פ צ י ה ‪ .‬ע ל פי טבלה ‪ 2‬אפשר לראות כ י ם י נ ת ז ת ‪n‬־‪RNA‬‬
‫‪ 24‬שעות נ ב י ט ה ‪ .‬ב ד י לבדוק פ ה ו א ‪RNA-n‬‬
‫מתחילה ב א ו פ ן נ מ ר ץ רק לאחר‬
‫ה נ ו צ ר בשלב זה ה ו נ ב ט ו ע ו ב ר י חיטה למשך ‪ 24‬שעות‬
‫בתמיסת נ ב י ט ה ר ג י ל ה ו ה ו ע ב ר ו לתפיסת ה נ ב י ט ה ר ד י ו א ק ט י ב י ת המכילה‬
‫פוםטם^נ!‬
‫לפשך ‪ 24‬שעות‬
‫‪- 39 -‬‬
‫‪£‬‬
‫‪a‬‬
‫‪o‬‬
‫‪N‬‬
‫מ‬
‫‪a.‬‬
‫‪100‬‬
‫‪90‬‬
‫‪70‬‬
‫‪80‬‬
‫‪60‬‬
‫‪50‬‬
‫‪40‬‬
‫‪FRACTION No.‬‬
‫ה ‪ RNA‬המוקדם ה נ ו צ ר ב ‪ 6‬שעות ה נ ב י ט ה ה ר א ש ו נ ו ת ‪.‬‬
‫תמונה ‪:16‬‬
‫‪32‬‬
‫גרם ע ו ב ר י ם ה ו נ ב ט בתמיסת הנבםה המכילה‬
‫קירי‪/‬מ״ל‪.‬‬
‫לאחר ‪ 6‬שעות נשטפו ה ע ו ב ר י ם ב ‪ 100‬מייל תמיסת הנבטה ה מ כ י ל ה‬
‫פוספט בלתי מ ס ו מ ן‬
‫ת ‪MAK‬‬
‫‪P‬‬
‫אורתו‪-‬פוספט‪,‬‬
‫ו ה ו פ ר ד ו בעזרת מפל‬
‫צים באורך גל‬
‫^־‪RNA‬‬
‫‪.0.2-1.2‬‬
‫‪260‬‬
‫‪mp‬‬
‫‪3 2‬‬
‫ברכוז‬
‫‪ 500‬מ י ק ר ו‬
‫‪0.05‬‬
‫‪M‬‬
‫‪ P‬הופק כ מ ת ו א ר ב ש י ט ו ת ‪ .‬לאחר נ ק ו י ו ה ו ע ל ו ‪ 3‬מ ״ ג ‪ENA‬‬
‫‪N Cl‬‬
‫‪a‬‬
‫‪ M‬ה מ ק ט ע י ם נקראו‬
‫ומדגמים נלקחו למניה במונה נ צ נ ץ ‪.‬‬
‫‪3 2‬‬
‫‪P‬‬
‫בספקטר‪5‬פוטומסר‬
‫‪-‬‬
‫נוטפות‪ .‬ה_‬
‫יטה )נםיון‬
‫על עמודת‬
‫‪.(Pulse‬‬
‫‪MAK‬‬
‫‪RNA‬‬
‫‪40‬‬
‫‪-‬‬
‫המופק בשיטה זו יכיל בתוכו‬
‫‪mRNA‬‬
‫כזה המכונה )‪(48‬‬
‫‪RNA‬‬
‫בעזרת מפל‬
‫‪30.000‬‬
‫‪0.2-1.2‬‬
‫המתוארות בתמונה‬
‫שעבר טרנםקריפציה בין השעות ‪ 24‬ו‪48-‬‬
‫ותוצאות ההתפלגות ה‪-‬‬
‫‪M NaCl‬‬
‫‪ ,A17‬מצביעות על נוכתות‬
‫‪RNA‬‬
‫‪P‬‬
‫)‪/cpm‬מיקרוגר‪0‬‬
‫‪R!NA‬‬
‫‪) s R N A‬מבתנות ‪ (30-50‬ו‪rRNA) -‬מבחנות‬
‫)‪ .(80-110‬התפלגות הפוםפט המסומן מצביעה על נוכחות אוכלוםיה הטרוגנית של מולקולות‬
‫בעלות פעילות ספציפית גבוהה באיזור ה‪-‬‬
‫‪100‬‬
‫‪90‬‬
‫‪80‬‬
‫‪TO‬‬
‫‪60‬‬
‫‪40‬‬
‫‪50‬‬
‫‪50‬‬
‫‪20‬‬
‫‪10‬‬
‫‪ RNA‬הכבד‪.‬‬
‫‪B0‬‬
‫‪110‬‬
‫‪100‬‬
‫‪90‬‬
‫‪80‬‬
‫‪TUBE No.‬‬
‫תמונה ‪: 1 7‬‬
‫הפרדת תכשיר ‪R N A‬‬
‫‪70‬‬
‫‪60‬‬
‫‪90‬‬
‫‪40‬‬
‫‪80‬‬
‫‪20‬‬
‫‪10‬‬
‫‪TUBE No.‬‬
‫‪ P‬כללי מעוברי חיטה על עמודות ‪. M A K‬‬
‫‪ : A 1 7‬עוברי חיטה נובטים סומנו למשך ‪ 2 4‬שעות עם‬
‫‪ P‬כללי‬
‫מיקרוקירי‪/‬מ״ל( בין ‪ 2 4‬ו ‪ 4 8 -‬שעות נביטה‪R N A .‬‬
‫הוכן כמתואר בשיטות י‪ 3-‬מ״ג ‪ RNA‬הוטענו על העמודה‪.‬‬
‫‪ 0 . 0 5‬בופר פוספט ‪ p H 6 . 9‬ומפל‬
‫הפרדת ה‪ R N A -‬נעשתה עם‬
‫‪ .‬מקטעים בני ‪ 3‬מייל נאספו ונקראו‬
‫‪M‬‬
‫‪1.2‬‬
‫מ ‪ 0 . 2 -‬עד‬
‫‪NaCl‬‬
‫‪ . m j j‬הרידואקמיביות‬
‫בספקטרופוטומטר ציס באורך גל ‪2 6 0 .‬‬
‫נמנתה במונה נצנץ פקרד‪.‬‬
‫‪ ^ 2‬״‪( 100‬‬
‫‪q‬‬
‫‪11‬‬
‫לאחר ‪24‬‬
‫‪A‬‬
‫‪17‬‬
‫‪ : B 1 7‬עוברי החיטה סומנו כמתואר בנםיון בתמונה‬
‫שעות הסימון הועברו ל‪ c h a s e -‬בתמיסת הנבטה המכילה פוספט‬
‫‪MAK‬‬
‫קר למשך ‪ 2 4‬שעות נוספות‪ .‬ה‪ R N A -‬מוצה והופרד על‬
‫‪..A‬‬
‫כבנסוי ב ת מ ו נ ה ‪1 7‬‬
‫כאשר‪,‬‬
‫פוספט ^?‪j‬‬
‫סיין‬
‫ב נ ס ו י א ת ר ‪ ,‬ה ו נ ב ט ו ה ע ו ב ר י ם ‪ 24‬שעות בתפיסת הנבטה ר ג י ל ה ‪ ,‬ה ו ע ב ר ו לתפיסת ס י מ ו ן עם‬
‫למשך ‪24‬‬
‫שעות נ ו ס פ ו ת ‪,‬‬
‫ולאחד מ כ ן ה ו ע ב ר ו‬
‫‪ B 1 7‬ה ר י יש לצפות כ י מ ו ל ק ו ל ו ת‬
‫מהיר‪,‬יתפרקו‬
‫‪05‬‬
‫‪RNA‬‬
‫שיש ל ה ן ‪turn over‬‬
‫במשך ‪ 24‬השעות ה א ח ר ו נ ו ת של ה נ ם ו י ‪.‬‬
‫וחולק על‬
‫תפלגות ה ־‬
‫(‬
‫‪,‬‬
‫ה ‪RNA -‬‬
‫בחזרה לתמיסת הנבטה עם‬
‫‪ J J‬־ ‪0‬‬
‫ה ק ו ד ם ‪ ^ M A K r r r‬נ מ צ א כי‬
‫כבנסוי‬
‫בעל ה פ ע י ל ו ת ה ס פ צ י פ י ת הגבוהה נ ע ל ם ו ה ס י מ ו ן מחולק ב א ו פ ן א ח י ד ב י ן מקטעי ה ‪RNA -‬‬
‫כ פ י שנבדקה ע ״ י הבליעה‬
‫א‬
‫ה‬
‫ו‬
‫פ‬
‫ט‬
‫י‬
‫ת‬
‫‪A‬‬
‫ת ו צ א ו ת א ל ו מ צ ב י ע ו ת ע ל כ ך כ י ב י ן ‪ 24‬שעות ל ‪ 4 8 -‬שעות נ ב י ט ה נ ו צ ר י ם ב ע ו ב ר גם‬
‫קצב ה ס י נ ת ז ה של ה ‪sRNA -‬‬
‫‪N‬‬
‫‪R‬‬
‫‪.‬‬
‫‪ sRNA‬ו ג ם ‪rRNA‬‬
‫עלה פ י ‪ 250‬לעומת קצב ה ס י נ ת ז ה של מ ו ל ק ו א ז ז ו במשך ‪ 6‬שעות ה נ ב י ט ה‬
‫עלה פ י ‪ 14‬ב א ו ת ו פרק ז מ ן ו ז א ת כאשר קצב ה ס י נ ת ז ה חושב‬
‫ה ר א ש ו נ ו ת ‪ .‬קצב ה ס י נ ת ז ה של ‪sRNA‬‬
‫‪32‬‬
‫כ‪-‬‬
‫‪cpnyVg RNA/hr.‬‬
‫נ ם ו י ‪pulsed‬‬
‫מ צ י ע כ י ב י ן השעות ‪ 24‬ו ‪ 4 8 -‬מתחילת ה נ ב י ט ה נ ו צ ר ‪mRNA‬‬
‫‪P‬‬
‫חדש ה נ ע ל ם במהלך‬
‫ה ‪,chase -‬‬
‫ג(‬
‫יצירת ר י ב ו ז ו מ י ם ‪.‬‬
‫ה ס י נ ת ז ה נ ט ו של ‪rRNA‬‬
‫הנמצא ב ר ו ב ו ז ו מ י ם נבדקה ע ל י ד י הנבטת מ נ ו ת ב נ ו ת ‪ 50‬ז ר ע י ם‬
‫בתפיסת הנבטה )ראה ש י ט ו ת ( לפרקי ז מ ן ש ו נ י ם ‪,‬‬
‫ה כ מ ו ת י ת ע ל י ד י הבליעה ב א ו ר ך ג ל‬
‫‪260‬‬
‫נ י ת ו ק ה ע ו ב ר י ם ‪ ,‬הפקת ה ר י ב ו ז ו מ י ם וקביעתם‬
‫‪ . m j j t‬מ ת ו צ א ו ת ה נ ס ו י ה פ ו ב א ו ת ב ת פ ו נ ה ‪,18‬‬
‫עד ‪ 24‬שעות נ ב י ט ה לא פשתנה כ פ ו ת ה ‪rRNA -‬‬
‫נפצא כי‬
‫ב ר י ב ו ז ו פ י ם ‪ ,‬לאתר פ כ ן ע ו ל ה כמות ז ו ב ש י ע ו ר‬
‫ל י נ א ר י ב כ ל תחום ה ז פ ן ב ו נבדקה ) ע ד ‪ 28‬ש ע ו ת ( ‪.‬‬
‫‪-‬‬
‫‪42‬‬
‫‪-‬‬
‫‪—r‬ר—‪1‬‬
‫‪—r‬ר—‪1—1—1—1—1‬‬
‫‪1800‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪g‬‬
‫‪w‬‬
‫‪Uj 1200‬‬
‫‪O‬‬
‫‪m‬‬
‫‪900‬‬
‫<‬
‫‪z‬‬
‫‪600‬‬
‫‪1‬‬
‫‪a:‬‬
‫‪4.‬‬
‫‪300‬‬
‫‪70‬‬
‫‪1‬‬
‫‪60‬‬
‫‪I‬‬
‫‪50‬‬
‫‪I‬‬
‫‪J‬‬
‫‪L__L‬‬
‫‪30‬‬
‫‪40‬‬
‫‪L‬‬
‫‪20‬‬
‫‪I‬‬
‫‪10‬‬
‫‪J‬‬
‫‪Hours of germination‬‬
‫תמונה ‪:16‬‬
‫ה ש נ ו י בתכולת‬
‫ה ר י ב ו ז ו מ י ם עם ה נ ב י ט ה של ע ו ב ר י ח י ט ה ‪.‬‬
‫מ נ ו ת ב נ ו ת ‪ 50‬ז ר ע י חיטה ה ו נ ב מ ו בצלחות פטרי כמתואר בפרק ש י מ ו ת ‪.‬‬
‫בפרקי ז מ ן ש ו נ י ם נ ו ת ק ו ה ע ו ב ר י ם מן ה א נ ד ו ס פ ר ם ו ה ר י ב ו ז ו מ י ט‬
‫)תכשיר ר י ב ו ז ו מ ל י ר ג י ל ( ה ו פ ק ו כמתואר בפרק ה ש י ט ו ת ‪ ,‬כ מ ו ת‬
‫‪.1‬ן‪11‬ז‪.260‬‬
‫ה ר י ב ו ז ו מ י ם נקבעה ב ם פ ק ט ר ו פ ו ט ו מ ט ר צ״ט ב א ו ר ך ל‬
‫ג‬
‫השואת קצב‬
‫ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של א ו ר י ד י ן‬
‫ו ‪ 4 0 -‬שעות נ ב י ט ה מתוארת ב נ ס ו י ‪19‬‬
‫והועברו‬
‫כתכשיר‬
‫‪H‬‬
‫אל ת ו ך צ ו כ ל ו ס י ת ה ר י ב ו ז ו מ י מ של ע ו ב ר י ם ב נ י ‪18‬‬
‫) ת מ ו נ ה ‪.(19‬‬
‫ה ע ו ב ר י ם ה ו נ ב ט ו ‪17‬או־־‪ 47‬שעות בתמיסת ה נ ב י ט ה‬
‫למסך שעה נ ו ס פ ת לתמיסת ה נ ב י ט ה ר ד י ו א ק ט י ב י ת ה מ כ י ל ה א ו ר י ד י ן י ח ר י ב ו ז ו מ י ם ה ו פ ק ו‬
‫ר י ב ו ז ו פ ל י ר ג י ל ו מ ד ג מ י ם ת ו ל ק ו ע ל מפל ם ו כ ר ו ז ‪.‬‬
‫אוכלוסית ה ר ו ב ו ז ו מ י ם מעוברים בני‬
‫‪ 18‬שעות א י נ ה מ ס ו מ נ ת ‪ .‬מעט ה ר ד י ו א ק ט י ב י ו ת נמצא ב א י ז ו ר ה ‪sRNA -‬‬
‫מעוברים‬
‫ב נ י ‪ 48‬ס ע ו ת מ ס ו מ נ ת הן‬
‫ב א י ז ו ר ה פ ו ל י ז ו מ י ם והן‬
‫אוכלוםית הריבוזומיס‬
‫באיזור המונוזומים‪.‬‬
‫‪ 43 -‬־‬
‫‪•00‬‬
‫‪TOO‬‬
‫‪. «00‬‬
‫‪c‬‬
‫‪900‬‬
‫‪i‬‬
‫‪X‬‬
‫‪400‬״‬
‫‪a‬‬
‫‪u‬‬
‫‪• 300‬‬
‫‪12‬‬
‫‪to‬‬
‫‪a‬‬
‫‪4‬‬
‫•‬
‫‪2‬‬
‫‪F r a c t i o n No.‬‬
‫ת מ ו נ ה ‪;19‬‬
‫א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של א ו ר י ד י ן‬
‫‪W‬‬
‫ל ת ו ך ר י ב ו ז ו מ י ם של ע ו ב ר י חיטה נ ו ב ט י ם ‪.‬‬
‫מ נ ו ת ב נ ו ת ‪ 200‬מ ״ ג ע ו ב ר י חיטה ה ו נ ב ט ו ב ‪ 2 -‬מייל תמיסת הנבטה לנעזך י‬
‫‪ 18‬או ‪ 46‬ס ע ו ת ‪ .‬ה ע ו ב ר י ם ה ו ע ב ר ו לתמיסת הנבטה ה מ כ י ל ה א ו ר י ד י ן ^‬
‫‪ ( m c / m M‬למשך שעת ה נ ב י ט ה ה א ח ר ו נ ה ‪ ,‬נשטפו‬
‫‪120‬‬
‫)‪1‬םיקרוקירי‪/‬מ״ל‪,‬‬
‫א ו ר י ד י ן בלתי‪.‬מסומן‬
‫‪M‬‬
‫‪0.05‬‬
‫‪ ,‬ה י ט ב עם ‪ 20‬מייל תמיסת הנבטה המכילה‬
‫ו ה ר י ב ו ז ו מ י ם • ה ו כ נ ו כתכשיר ר י ב ו ז ו מ ל י ר ג י ל ‪ .‬ה ר י ב ו ז ו מ י ם פ ו ז ר ו‬
‫‪ TM‬ו ‪ 0 . 2 -‬מ ״ ל שוטחו על מפל ם ו כ ר ו ז ‪, 5 - 2 0 $‬‬
‫ב ‪ 0 . 7 -‬מייל תמיסת‬
‫ה ו פ ר ד ו ב ס פ י נ ק ו )ראה ש י ט ו ת ( ו ח ו ל ק ו ל‪ 10-‬מ ק ט ע י ם ‪ .‬ש נ מ נ ו י ש י ר ו ת ב מ ו נ ה‬
‫נ צ נ ץ פקרד‪.‬‬
‫כדי‬
‫הריבוזום‬
‫ל ה ב ח י ן ב י ן א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של א ו ר י ד י ן "‪IT‬‬
‫הנמצא על שטח ה פ נ י ם של ה ר י ב ו ז ו ם ) ‪ ,( mRNA IK.SRNA‬ת ו כ נ ן ה נ ם י ו ן‬
‫^‪RNA‬‬
‫המתואר ב ת מ ו נ ה ‪. 2 0‬‬
‫ש ‪RNA -‬‬
‫יהיה‬
‫התכשירים ה ר י ב ו ז ו מ ל י ם מ נ ס ו י ‪ 19‬נחשפו ל פ ע ו ל ת ר י ב ו נ ו ק ל י א ז בהנחה‬
‫הנמצא על שטח ה פ נ י ם של ה ר י ב ו ז ו ם יחתך ב ע ו ד‬
‫מ ו ג ן מפני הפעילות ה נ ו ק ל י א ו ל י ט י ת ‪.‬‬
‫הריבונוקליאז‬
‫וכמות ה ‪-‬‬
‫‪RNA‬‬
‫התכשיר ח ו ל ק על ג ב י מפל ס ו כ ר ו ז לאחר ט י פ ו ל‬
‫ואתרי‬
‫ה ט י פ ו ל ה א נ ז י מ ת י ‪ .‬ת ו צ א ו ת ה נ ם ו י מ ע י ד ו ת ע ל כך‬
‫ב א י ז ו ר ה מ ו נ ו ז מ י ם )מקטעים ‪ ( 1 2 - 1 3‬מ ע ו ב ר י ם ב נ י ‪ 48‬שעות א י נ ו ר ג י ש‬
‫‪RNA‬‬
‫לריבונוקליאז‪.‬‬
‫הפוליזומים‬
‫הפירוק‬
‫ש ה‬
‫_ ‪ RNA‬הנמצא בתוך ה ר י ב ו ז ו ם ‪,‬‬
‫ה ר ג י ש לפעולת ה ר י ב ו נ ו ק ל א ז ‪ ,‬חושבה בהפרש ב י ן ה ס פ י ר ו ת‬
‫לדקה ב א ו ת ו מקטע ר י ב ו ז ו מ ל י ל פ נ י‬
‫שה‪-‬‬
‫אל ת ו ך‬
‫‪RNA‬‬
‫הנמצא בתוך‬
‫ה‪ RNA-‬הרגיש ל ר י ב ו נ ו ק ל י א ז נמצא ב א י ז ו ר כבד ה ם ד מ נ ט צ י ה ‪,‬‬
‫)מקטעים ‪; ( 2 - 1 0‬‬
‫איזור‬
‫ו ב א י ז ו ר י ם ק ל ; ה ם ד י מ נ ט צ י ה ‪) -‬מקטעים ‪ . ( 1 4 - 1 5‬ת ו צ ר י‬
‫פ ו פ י ע י ם בחלקם הקטן ב א י ז ו ר ה מ ו נ ו ז מ י ם ו ב ר ו ב ם בחלקו ה ע ל י ו ן של מפל ה ס ו כ ר ו ז ‪.‬‬
‫הבחנה ב י ן ‪R j j A‬‬
‫ת מ ו נ ה ‪:20‬‬
‫‪r‬‬
‫ב‬
‫ת‬
‫ן‬
‫ך‬
‫ה‬
‫ר‬
‫י‬
‫ב‬
‫ן‬
‫ז‬
‫ו‬
‫ם‬
‫י‬
‫שעל פ נ י שטח ה ר י ב ו ז ו ם ‪.‬‬
‫_‬
‫התכשיר ה ר י ב י ז ו מ ל י ה ו ב ן כמתואר ב נ ס ו י ‪ . 1 9‬א ל י ק ו ו ט י מ ה מ כ י ל י ם‬
‫‪ 1‬מ ״ ג ר י ב ו ז ו מ י ט ע ב ר ו א נ ק ו ב צ י ה עם ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ב ר י כ ו ז ‪0 . 1‬‬
‫מ י ק ר ו ג ר ם ‪ /‬מ ״ ל ‪ ,‬למשך ‪ 5‬דקות ב ‪ , 3 0 ° -‬ו ח ו ל ק ו על מפל ם ו כ ר ו ז‬
‫‪) 5 - 2 0 $‬ראה ש י ט ו ת ( ‪ .‬ב מ ק ב י ל ח ו ל ק ו על מפל ס ו כ ר ו ז א ל י ק ו ו ט י ם‬
‫שעברו א נ ק ו ב צ י ה למשך ‪ 5‬דקות ב ‪ 3 0 ^ -‬ללא ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ‪ .‬מפל ה ם ו כ ר ו ז‬
‫ת ו ל ק ל ‪ 1 8 -‬מקטעים ש נ מ נ ו י ש י ר ו ת בתמיסת מ נ י ה של ד י א ו ק ם ן ב מ ו נ ה‬
‫נ צ נ ץ ‪ .‬ההפרש ב י ן ה ס פ י ר ו ת לדקה של המיקטעים ה מ ק ב י ל י ם בתכשיר‬
‫ר י ב ו ז ו מ ל י ר ג י ל לביז זה שטופל ב ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ‪ ,‬מ י צ ג את ה ‪-‬‬
‫הרגיש ל ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ‪.‬‬
‫בעובר ה נ ו ב ט ‪.‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫כמות ה ‪-‬‬
‫שהוכן‬
‫מ ע ו ב ר י ם ש נ ב ט ו ‪ 48 , 2 4 , 0‬ו ‪ 7 2 -‬שעות ב ת נ א י ם ס ט נ ד ר ט י י ם בתמיסת נ ב י ט ה כ מ ת ו א ר‬
‫בשיטות‪.‬‬
‫היבש‪.‬‬
‫זאת‬
‫‪ s M A‬ה כ ל ל י ת ב ע ו ב ר י ם נ ו ב ט י ם נמדדה ע ״ י הפקה כ מ ו ת י ת ממשפה ‪S - 1 0 0‬‬
‫ב ת מ ו נ ה ‪ 21‬נ י ת ן לדאות כ י כמות ה ‪-‬‬
‫כמות ה ‪-‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫פ ע י ל ו ת ו ה י ח ס י ת של פ נ י ל א ל נ י ן‬
‫‪sRNA‬‬
‫ה כ ל ל י ת גבוהה ב י ו ת ר ב ע ו ב ר‬
‫ה נ י ת נ ת להפקה כ ע ב ו ר ‪ 72‬שעות נ ב י ט ה י ו ר ד ת ב ‪ 8 5 -‬א ח ו ז י ם ‪ .‬לעומת‬
‫‪MA3‬‬
‫מתהילה ל ע ל ו ת ב ח ז ר ה לאחר‬
‫שעות‬
‫נ ב י ט ה ‪. 2 4‬‬
‫‪CO‬‬
‫‪o‬‬
‫י<‬
‫)‪X‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪E‬‬
‫‪•S‬‬
‫‪o‬‬
‫‪E‬‬
‫‪ 1000 -‬יס‬
‫<‬
‫־‪500‬‬
‫‪z‬‬
‫‪cr‬‬
‫‪I‬‬
‫‪CO‬‬
‫ים‬
‫‪72‬‬
‫‪48‬‬
‫‪24‬‬
‫‪Hours of germirtation‬‬
‫תמונה ‪;21‬‬
‫השנוי בתכולת כלל ה‪-‬‬
‫‪.sRNA‬‬
‫פניל אלנין‬
‫‪ sRNA‬בעובר הנובט‪ ,‬ופעילותו היחסית של‬
‫מנות בנות ‪ 1‬גרם עוברי חיטה הונבטו לפרקי זמן שונים בתיו ‪ 5‬ם״ל‬
‫כמתואר בשיטות‪.‬‬
‫הופק מתוך משפה ‪00‬ן_‪3‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫תמיסת הנבטה‪.‬‬
‫שהתקבלה נמדדה במיקרוגרמים עבור גרם משקל יבש‬
‫כמות ה‪sRNA -‬‬
‫לקשור‬
‫‪sRNA‬‬
‫התתלתי של העוברים‪ .‬כושרם היחסי של תכשירי ה‪-‬‬
‫פנ־ל אלנין‪ ,‬נמדד ע״י העליה היתסית ברמת אנקורפורציה במערכת‬
‫מכל‬
‫‪sRNA‬‬
‫אני׳ורפורציה סטנדרטית תודות לתוספת ‪ 50‬מיקרוגרם‬
‫תכשיר‪ ,‬במשך ‪ 20‬דקות אנקובציה‪.‬‬
‫כדאי לציין כי היחס בין כמות הריבוזומים ל‪-‬‬
‫‪sHNA‬‬
‫משתנה מעט מאד ב‪ 24-‬שעות הנביטה‬
‫הראשונות‪ ,‬ועולה באופן ניכר לאחר מכן‪ .‬זאת‪ ,‬הן בגלל העליה בתכולת הריבוזומים והן בגלל‬
‫הירידה בתכולת ה‪-‬‬
‫‪.sRNA‬‬
‫מקדם הםדמנטציה בכל התכשירים של‬
‫‪sHNA‬‬
‫נשאר ^‬
‫‪ ,3.5‬כושר הטעינה הישיר של‬
‫מעובר יבש לגבי פניל אלנין הוא ‪ 1,82‬מול‪ 100/‬מיקרומול‪.‬‬
‫‪t‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫‪mRIJA‬‬
‫בעובר הנובט‪.‬‬
‫‪iiutNA‬‬
‫הסינתזה של‬
‫בשעות הנביטה הראשונות‪.‬‬
‫כפי שהראו תוצאות נסויי האנקורפורציה בפרק‬
‫רק לאחר‬
‫‪24‬‬
‫‪mRNA‬‬
‫שעות נביטה‪ .‬נסויי ה‪-‬‬
‫הנוצר בין‬
‫על מנת לאפין‬
‫‪ 24‬ל‪48-‬‬
‫‪3‬‬
‫מתחילה סינתזה אינטנסיבית של‬
‫‪Pulse-chase‬‬
‫‪raRNA‬‬
‫הצביעו על אפשרות נוכתותו של‬
‫שעות נביטה‪.‬‬
‫‪ RNA‬זה בנוסף להפרדה הכרומטוגרפית השתמשנו בשיטת ההברידיזציה‬
‫‪/‬‬
‫כמתואר בפרק השיטות‪.‬‬
‫‪.‬‬
‫‪,‬‬
‫‪,‬‬
‫‪I‬‬
‫‪I‬‬
‫‪L‬‬
‫‪:‬‬
‫‪,‬‬
‫•‪2.0‬‬
‫ס•‬
‫‪100‬‬
‫‪:‬‬
‫;‬
‫‪1‬‬
‫‪200‬‬
‫‪I‬‬
‫‪300‬‬
‫‪2 4 - 4 8 hr stage P -RNA/*g‬‬
‫‪3‬‬
‫‪22:‬תמונההרווית‬
‫מעובר תיטה עם )‪(48‬‬
‫‪DNA‬‬
‫הולכות ועולות של‬
‫‪i‬‬
‫כל דוגמה הכילה ‪ 29‬מיקרוגרם‬
‫‪11.500‬‬
‫? )‬
‫אסר עבר טרנםקריפציה בין ‪ 24‬ל‪ 48-‬שעות נביטה‪.‬‬
‫״‬
‫)‪RNA (48‬‬
‫‪V‬‬
‫‪2‬‬
‫‪RNA‬‬
‫‪ DNA‬וכמויות‬
‫‪( c p m / n g‬‬
‫כ‬
‫‪32‬‬
‫ההברידיזציה של )‪(48‬‬
‫מתוארת בתמונה ‪ .22‬ה‪-‬‬
‫‪RNA‬‬
‫‪P‬‬
‫שתורגם בין השעות ‪ 24‬ו‪ 48-‬מתחילת הנביטה‬
‫‪ RNA‬התדש שנוצר בתקופת נביטה זו קומפלמנטרי ל—‪1•45‬‬
‫ו‬
‫אחוז מן ה‪-‬‬
‫‪DNA‬‬
‫עובר טרנםקריפציה‬
‫סל עובר החיטה‪ .‬מכיון שרק גדיל אהד של ה‪DNA -‬‬
‫‪in vivo‬‬
‫הרי שניתן לומר כי‬
‫החיטה היה פעיל בין ‪ 24‬ל‪ 48-‬שעות נביטה‪. .‬‬
‫‪2.9‬‬
‫אחוז מן הגנום סל עובר‬
‫‪-‬‬
‫ב(‬
‫נוצר‬
‫ה‪-‬‬
‫‪mRNA‬‬
‫י ־ ‪sRNA‬‬
‫ברכוזים‬
‫ממושך ל פ ר ו ק ה ‪m R N A -‬‬
‫‪chase‬‬
‫‪N a C l05•0 . 9 5 - 1‬‬
‫‪3.2‬‬
‫צנטריפוגה‬
‫‪A‬‬
‫המכילה‬
‫ה ב ר י ד י ז צ י ה ע•‬
‫מציאת‬
‫מושגת‬
‫מן‬
‫‪T‬‬
‫‪C‬‬
‫‪K‬‬
‫רכוז‬
‫ההרוויה‪.‬‬
‫הגנום‬
‫‪rRNA‬‬
‫ה מ ס ו מ ן ‪ ,‬הופקו מתכשיר ‪R N A‬‬
‫שהוכן‬
‫‪M‬‬
‫‪1‬‬
‫‪RNAVa^D‬‬
‫‪.‬‬
‫‪S =17‬‬
‫מקדמי‬
‫הםדנמנטציה נבדקו‬
‫‪ ,‬במערכת א ו פ ט י ת‪u v(50‬‬
‫באולטרה‬
‫מיקרוגרס ‪RNA‬‬
‫‪rRNA‬‬
‫ה ה ר ו י ה מושגת ברמה של ‪ 0 . 2 8 $‬מ ן‬
‫היו‬
‫^‪sRNA‬‬
‫‪18+24‬‬
‫ב מ ר נ ס ק ר י פ צ י ה של‬
‫)‪(2.9 - 0.6‬‬
‫‪ .‬תכשיר‬
‫נ ת ן מקדם ט ד מ נ ט צ י ה‬
‫‪/‬מייל‪,‬‬
‫(‬
‫ברמה של ‪ 0 . 0 2 5 $‬ת מ ו נ ה‬
‫ה ג נ ו ם מועסקים‪,‬‬
‫כלומר‬
‫‪rRNA‬‬
‫ר כ ו ז י ם ע ו ל י ם של‬
‫הרוית ‪DNA-n‬‬
‫מן‬
‫נ ת ן ‪+ 24‬‬
‫י ‪sRNA -‬‬
‫•‬
‫במפל‬
‫‪M‬‬
‫אנליטית ספינקו מודל ‪E‬‬
‫‪i‬‬
‫ה ג נ ו ם הקומפלמנטרי‬
‫ל‪-‬‬
‫‪mRNA‬‬
‫‪rRNA‬‬
‫‪0.45-0.55 M N a C l M A K‬‬
‫ותכשיר ה ‪-‬‬
‫ז מ ן שבו‬
‫‪ .‬הערכת חלק ה ג נ ו ם של ע ו ב ר החיטה ה פ ע י ל ב ט ר נ ם ק ר י פ צ י ה של‬
‫אשר ע ב ר ו‬
‫‪B17.S N‬ה ו כ ן על י ד י הפרדה על עמודת‬
‫ו‪-‬‬
‫‪.sRNA‬‬
‫ע ו ב ר י ם ט ר נ ם ק ר י פ צ י ה ב א ו ת ו פרק‬
‫‪sRNA-o‬‬
‫דורשת מ ד י ד ת ג ו ד ל ו של א ו ת ו חלק מ ן‬
‫מתואר‬
‫‪*1‬‬
‫ג ו ד ל ו של חלק ה ג נ ו ם ה פ ע י ל ב ט ר נ ם ק ר י פ צ י ה של ‪r R N A‬‬
‫כ פ י שכבר צ ו י ן נראה כ י ‪r R N A‬‬
‫נסוי‬
‫‪-‬‬
‫)‬
‫‪sRNA‬‬
‫‪3‬‬
‫ו‪-‬‬
‫‪2‬‬
‫‪B‬‬
‫(‪.‬‬
‫‪DNA-n‬‬
‫נמצא‪,‬‬
‫‪ . r R N A‬מכאן‬
‫פ ע י ל י ם ב ט ר נ ס ק ר פ צ י ה של‬
‫)‬
‫‪S‬‬
‫‪ .‬עט תכשיר‬
‫א י פ ו א ‪ ,‬כ י רק‬
‫( ‪ ,‬לשם‬
‫‪sRNA-n‬‬
‫‪ 0.6‬אתוז‬
‫נ י ח ן לחשב כ י ‪ 2 . 3‬א ח ו ז‬
‫השונה מ‬
‫‪sRNA‬‬
‫ו‪rRNA-‬‬
‫‪- 48 -‬‬
‫‪30‬‬
‫‪60‬‬
‫תמונה ‪( A ). :23‬‬
‫כל דוגמא הכילה‬
‫)‬
‫‪18‬‬
‫‪S-RNA‬‬
‫‪ftq‬‬
‫גודלו של‪-‬קטע‬
‫מעובר חיטה‪.‬‬
‫ה‬
‫‪12‬‬
‫‪DMA -‬‬
‫המשלים ‪rHNA-V‬‬
‫מיקרוגרם‬
‫‪D N A g 1 5‬‬
‫‪ P‬שעבר ‪, chase‬‬
‫•עולות של ‪RNA‬־‪i‬‬
‫‪ . ( o p n y V g‬גודלו הממוצע ש ל המיקמע‬
‫‪3707‬‬
‫הוא ־״‪ 0.26-0.29‬עבור‬
‫המשלים ש ל ה‪DIJA -‬‬
‫‪ rRNA‬שהוכן במספר הפקות‪.‬‬
‫וכמויות‬
‫) ‪(B‬‬
‫‪Diik‬‬
‫גודלו סל חלק ה‪-‬‬
‫המשלים ‪sRNA-b‬‬
‫כל דוגמא הכילה ‪ 1^0‬מיקרוגרם ‪DNA‬‬
‫‪ P‬שעבר ‪chase‬‬
‫‪RNA‬‬
‫עולות של‬
‫)‪-i'MAcpm/fxg0 57‬גודלו הממוצע סל המיקטע המשלים סל ה(‪.‬‬
‫‪ sRI'JA‬שהוכן ממסמר‬
‫הוא ‪£‬״‪ 0.023 -0.026‬עבור‬
‫הפקות‪.‬‬
‫יות‬
‫וכמויו‬
‫‪Q‬‬
‫ג(‬
‫הספציפיות ש ל ריאקציה ההברידזציה‪.‬‬
‫מידת הספציפיות ס ל ריאקצית ההברידזציה נבדקה על ידנו תוך מדידת שיעור ההומולוגיה‬
‫‪RNA^nw‬‬
‫מאורגניזהים לסונים )הטרולוגי( ו‪DMA-‬‬
‫של עובר החיטה‪ .‬נםוי הברדיזציה עם‬
‫‪32‬‬
‫‪ RNA‬״ ‪P‬‬
‫כללי פחידק הקולי )תמונה ‪ (24‬הביא לרויה ברמה סל ‪ 0.02$‬פן‬
‫עובר החיטה‪ .‬רמה נמוכה זו נמצאת בתחום ה״רעס" הנסיוני סבנםוי זה‪.‬‬
‫‪ 2‬נסויי הברידיזציה תחרותית‪,‬שבהם כמויות הולכות ועולות ס ל‬
‫‪2‬‬
‫‪1‬‬
‫‪DNk-a‬‬
‫של‬
‫בתמונה ‪ 25‬מ ת ו א ר י ם‬
‫‪raW'IA‬אי‬
‫‪RNA‬‬
‫־ ‪ 4 9‬־‬
‫כללי מתאי אוגר‪ ,‬התחרו עם כמות קבועה טל ; ‪( 4 8‬‬
‫‪P ^ RNA‬‬
‫מחיטה‪.‬‬
‫ס־‬
‫ע>‬
‫‪M‬‬
‫ס־‬
‫י<‬
‫‪W‬‬
‫<‬
‫‪Z‬‬
‫‪o‬‬
‫‪c‬‬
‫>‪a‬‬
‫‪3‬‬
‫‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1‬‬
‫‪E Coli B . P ^ RNA‬‬
‫‪fig‬‬
‫‪2‬‬
‫תמונה ‪: 2 4‬‬
‫‪U‬‬
‫‪v.‬‬
‫ע>‬
‫‪0.‬‬
‫מידת הייהוד של ההברדיזציה‪-‬הרווית ‪°NA‬‬
‫עם ‪ RNA‬בקטריאלי‪.‬‬
‫מעובר חיטה‬
‫מעובר חיטה וכמויות‬
‫כל דוגמא הכילה ‪ 2 9‬מיקרוגבע ‪DNA‬‬
‫‪E. coli‬‬
‫כללי של‬
‫‪P‬‬
‫‪RNA‬‬
‫הולכות ועולוח של‬
‫)‬
‫‪( c p m / n g‬‬
‫‪75.000‬‬
‫נ‬
‫מ‬
‫צ‬
‫א‬
‫כ‬
‫י‬
‫‪n‬‬
‫_‪RNA‬‬
‫ההםרולוגי אינו מתחרה עם יותר מאשר‬
‫מקומות הקישור של‬
‫‪OUk‬‬
‫‪ 12‬מן ה‪ UMA -‬ההומולגי‪.‬‬
‫מעובר החיטה‪ ,‬וזאת גם כאשר‬
‫‪5-9$‬‬
‫‪RNA-n‬‬
‫של ה‪-‬‬
‫‪RNA‬‬
‫מחיטה על‬
‫ההטרולוגי היה בעודף סל‬
‫פי‬
‫‪- 50--‬‬
‫—‪-O‬‬
‫‪RNA‬‬
‫‪rr‬‬
‫‪j‬‬
‫‪85‬‬
‫‪12‬‬
‫‪-O Hamster cells‬‬
‫‪•o T2 m - RNA‬‬
‫‪±‬‬
‫‪8‬‬
‫‪10‬‬
‫‪- RNA‬‬
‫•תמונה ‪:25‬‬
‫‪3 2‬‬
‫‪to wheat P‬‬
‫־‪o‬‬
‫ם‬‫‪1‬‬
‫‪6‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪Ratio unLabelled RNA‬‬
‫‪c‬‬
‫>‪a‬‬
‫‪u‬‬
‫מידת הייחוד של הוזברידזציו‪..‬‬
‫א‪.‬‬
‫נםיון התרות עם ‪RNA‬‬
‫הטרולוגי‪.‬‬
‫‪ 0-0‬כמויות עולות ל^‪1‬ו‪ 1‬כללי מתאי אוגר התחרו‬
‫‪ P‬מעובר חיטה )‪(72‬‬
‫עם 'כמות קבועה סל )‪RNA (72‬‬
‫‪ ( c p i r i / V g‬על מקומות קישור משותפים‬
‫מעובר חימה‪.‬‬
‫המצויים ב‪DNA1C ug -‬‬
‫‪.‬‬
‫‪Q‬־־‪ a‬כמויות עולות של ‪ rnlliJA‬ל פג'‬
‫ס‬
‫‪11.700‬‬
‫מיקרוגרם‪,‬‬
‫ס‬
‫‪'JO‬‬
‫‪ P‬מעובר חיטה‬
‫התחרו עם כמות קבועה סל )‪RN/1(48‬‬
‫‪ ( c p n y V s‬על מקומות קישור משותפים‬
‫‪12.000‬‬
‫‪ DMA 29 |1‬מעובר חיטה‪.‬‬
‫ב־‬
‫) ‪,200 !*6‬‬
‫‪.6‬‬
‫‪C‬‬
‫סינתזת החלבון עם הנבימה של עובר החיטה‬
‫א‪.‬‬
‫השפעת אקטינומיצין על אתוז האנקורפורציה ש ל חומצות האמינו‪.‬‬
‫בניסויים הבאים נבחנה התלות של סינתזה החלבון שבעבר‬
‫מםנג׳ר^!‬
‫הנובמ בםינתזת‬
‫‪ .‬עוברי חיטה הונבטו בתמיסת נביטה למסך פרקי זמן שונים‪ 30 .‬דקות‬
‫לפני הוצאתם הועברו העוברים למשך ‪ 30‬דקות לתמיסת נביטה המכילה תערבת חומצות‬
‫אמינו רדיואקטיביות‪ ,‬בנםוי מקביל הונבטו העוברים בתמיסת נביטה המכילה‬
‫‪ 30‬מיקרוגרם‪/‬מ״ל אקטינומיצין‬
‫‪0‬‬
‫ותפיסת הסימון כללה אף היא אקמינומיציז‬
‫באותו רכוז‪ .‬תוצאות הנסוי המתוארות בתמונה ‪ 26‬פראות כי םינתזת החלבון‬
‫)המתוארת כאחוז האנקורפורציה( מתחילה לעלות כמחצית הסעה לאחר הנביטה‪ ,‬ותוך‬
‫ ‪- 51‬‬‫‪ 12‬סעות מגיעה לסיעוד סל ‪ 12‬אתוז לעומת ‪ 0.3‬בתחילת התהליך‪ .‬נוכחות האקטינוםיצין הידוע‬
‫כמעכב סינתזת המםנגיר‬
‫‪ , RNA‬ל‪.‬א השפיעה על קצב האנקורפורציה‪ .‬קליטת האקטינומיצין נבדקה‬
‫‪3‬‬
‫ע״י שימוש באקטינומיצין ‪H‬‬
‫ונמצא כי העובר קולט את המעכב‪ .‬נםוי זה‪ ,‬בצירוף הנםויים‬
‫הקודמים המעידים על היעדר טרנםקריפציה בשעות הנביטה הראשונות‪ ,‬מצביעים על תלותה של‬
‫מוקדמת בעובר הנובט ‪ -‬במםנג׳ר‬
‫‪R‬‬
‫הנשמר בעובר‬
‫ה י ב ש ‪. 1 M A‬‬
‫‪ r‬ו ו ו ו—ו—ו—ו—ו—ו—ו—ו‬
‫‪Hours of germination‬‬
‫תמונה ‪:26‬‬
‫םינתזת החלבון בשלבי הנביטה הראשונים ש ל עובר החיטה‪.‬‬
‫מנות עוברים ‪:.‬נות ‪ 200‬מ״ג כל אחת‪ ,‬הונבטו בתמיסת הנבטה‬
‫למסך פרקי זמן שונים‪ .‬קצב םינטזת החלבון נמדד ע ״ י העברת‬
‫העוברים למסך ‪ 30‬דקות לפני תוט מסך נביטתם לתמיסת הנבטה‬
‫רדיואקטיבית המכילה ‪ 1‬מיקרוקירי‪/‬מ״ל תערובת חומצות אמיניות‬
‫מסומנות )\ פיקרוקירי‪/‬מיקרוגרם(‪ ,‬ובמקביל‪-‬לתמיםת הנבטה‬
‫המכילה םנוף לחומצות האמינו המסומנות‪ 30 ,‬מיקרוגרם‬
‫אקטינומיצין ‪/ D‬מ״ל‪ .‬האנקורפורציה הופסקה ע ״ י סטיפת‬
‫העוברים בתמיסת הנבטה קרה המכילה הדרוליזט בלתי מסומן סל‬
‫‪A0T10$‬קר‪.‬‬
‫מ״ג‪1‬מ״ל( וטחינה ב־־‪ 5‬מייל סל‬
‫) ‪/‬‬
‫חומצות אמינו‬
‫מידגם סל ‪ 0.1‬מייל נלקת למנות הקליטה הכללית‪ ,‬מידגמים בני‬
‫‪TCA‬‬
‫‪ 0.2‬מייל הועלו על מילפור פילטר‪ ,‬נסטפו עם ‪ " 20‬ל‬
‫‪ 5$‬קר‪ ,‬יובשו ונספרו במונה נצנץ‪ .‬קליטת האקטינומצין נעסתה‬
‫ע ״ י הנבטת מנות עוברים בתמיסת הנבטה המכילה ‪ 100.000‬ספירות‬
‫‪(c/ug1!0.09‬‬
‫ב מ ר י ט י ו ם ‪) D‬‬
‫מסומן‬
‫לדקה‪/‬מ״ל אקמינומיצין‬
‫למסך פרקי זמן שונים‪ ,‬סטיפה וטחינה בהוך ‪ 5‬מייל !‪ . TI‬מידגמים‬
‫סל ‪ 0.1‬פ״יי נלקחו למניה במונה נצנץ‪.‬‬
‫מ‬
‫־ ‪ 5 2‬־‬
‫" ט פ פ ל ט " ‪RMAVw‬‬
‫פעילות‬
‫האפשרות‬
‫שהופק‬
‫מערכת‬
‫אמינו‬
‫כי‬
‫מעובר יבש‬
‫ז ו‬
‫היתה‬
‫הרבוזומלי‬
‫אולם‬
‫ג‬
‫להמריץ‬
‫אגקורפורציה של‬
‫רוויה ב ‪-‬‬
‫הכילה‬
‫להמרצת‬
‫הוספתי‬
‫כללי‬
‫‪RNA‬‬
‫עולות‬
‫היבש‬
‫חומצות‬
‫האנקורפורציה‪.‬‬
‫אמינו‬
‫ומנוקה )ראה‬
‫מ כ י ל כ‪90-‬‬
‫ה‬
‫נבדקה ע ״ י‬
‫ריבוזומים‬
‫) ת מ ו נ ה ‪ ,(27‬ת ל ה‬
‫פעובר‪.‬יבש‬
‫‪RNA‬‬
‫‪,‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫כאשר‬
‫בכמויות‬
‫שתכשיר‬
‫שמור‬
‫בעובר‬
‫החיטה‬
‫* ^ ^‬
‫רדיואקטיביוה‪.‬‬
‫אנקורפורציה‬
‫מכיון‬
‫מ‬
‫ס‬
‫הנמצא‬
‫בעובר‬
‫יבש‪.‬‬
‫אחוז‬
‫מריבוזומים‬
‫למערכת‬
‫תכשיר‬
‫המכילמ ס ג '‬
‫טבעי‬
‫שהוכן‬
‫‪30‬‬
‫‪40‬‬
‫מעובר יבש‬
‫"‪rRNA‬‬
‫האנקורפורציה לא‬
‫‪20‬‬
‫הוסף‬
‫נבדקה ‪.‬תרומתו של ה ‪-‬‬
‫גרמה‬
‫האנקורפורציה‬
‫חשופים )ראה‬
‫שיטות(‬
‫להלן(‬
‫מערכת‬
‫תשופים‬
‫האנקורפורציה‪.‬‬
‫מפוליזומים‬
‫סטנדרטית‪.‬‬
‫ותערובת‬
‫היענות‬
‫להמרצת‬
‫‪RNA‬‬
‫אנקורפורציה‬
‫מתאימה של‬
‫הוכן‬
‫‪rRNA -‬‬
‫בתינת‬
‫במערכת‬
‫כושרו סל‬
‫‪RNA‬‬
‫למערכת‬
‫האינקורפורציה‪.‬‬
‫‪UNA‬‬
‫ממסג' )ראה‬
‫כאשר‬
‫פעילים‬
‫תומצות‬
‫הוסף‬
‫טבלה‬
‫‪(5‬‬
‫למערכת‬
‫) ט ב ל ה ‪(5‬‬
‫‪10‬‬
‫‪f!.g E x o g e n o u s R N A‬‬
‫תמונה‬
‫‪1‬‬
‫‪: 27‬‬
‫היענות‬
‫מערבת‬
‫הריאקציה סל‬
‫‪'RPH‬‬
‫כ ל ל ה ‪24‬‬
‫‪,2,2 JJJ4 KG1 ,2.2 {M MgG12‬‬
‫ריבוזומים‬
‫חשופים‪.‬‬
‫מחיטה‬
‫קר‬
‫‪ 0.5‬מ י י ל‬
‫מיקרומולים‬
‫‪GTP‬‬
‫ו‪50-‬‬
‫ומשפה‬
‫)‬
‫מערכת‬
‫האנקורסורציה‬
‫לתוספת‬
‫‪RNA‬‬
‫מיקרוגרם‬
‫‪S-100‬‬
‫המכיל‬
‫חיצונ»‪.‬‬
‫‪ig)500‬ח ל ב ו ן ‪ .‬ה ‪-‬‬
‫בופר‬
‫‪, 31^-1‬‬
‫‪RNA‬‬
‫טדים‬
‫‪7.8‬‬
‫‪50|1g .sRNA‬‬
‫הוסף‪,‬הריאקציה‬
‫החיצוני‬
‫נ מ ש כ ה ‪ 45‬ד ק ו ת ב‪ .30°-‬ה ר י א ק צ י ה ה ו פ ס ק ה ע ם ‪ 1‬מ ״ ל ^ ‪ 20$‬ו‪0.5-‬‬
‫‪ m g / m l‬ה מ ש ק ע נ ש ט ף ע ם ‪ 9‬מ י י ל ‪ TCA5$‬ל‪ 15-‬ד ק ו ת‬
‫(‪.‬‬
‫ב‪ 90^-‬קורר‬
‫״‬
‫בסונה‬
‫נצנץ‬
‫והועבר דרך‬
‫פקרד‪.‬‬
‫ה ‪-‬‬
‫יבשים‪•.‬־־־•—‪RNA‬‬
‫שהופקו‬
‫מעוברים ב נ י‬
‫מיליפור‬
‫‪RNA‬‬
‫האקםוגני‪:‬‬
‫ממונוזומים‬
‫‪48‬‬
‫שי‪.‬‬
‫פילטר‪.‬‬
‫חשופים‪.‬‬
‫המיליפור‬
‫‪RNAO—O‬‬
‫‪x-x‬‬
‫נמנה‬
‫לאחר‬
‫כללי‬
‫‪RNA‬‬
‫מייל‬
‫ייבושו‬
‫מעוברים‬
‫מפוליזומים‬
‫הומרצה‬
‫‪1‬‬
‫‪K‬‬
‫ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של ח ו מ צ ו ת ה א מ י ג ו בהתאם לתוספת ה מ ס ג ' ‪ .‬מ כ י ו ן שהמערכת‬
‫ו ל א ה ג י ב ה לתוספת‪A1\-sRNA‬אפשר ל ה נ י ת כ י את ה פ ע י ל ו ת הממריצה‬
‫‪r‬‬
‫של תכשיר ‪RNA‬‬
‫נסויים‬
‫א‪.‬‬
‫מ ע ו ב ר שלא נ ב ט ‪ ,‬יש ליחס ל נ ו כ ח ו ת ‪ mRNA‬ב ע ו ב ר ה י ב ש ‪.‬‬
‫בקומפלקס ה פ ע י ל ב ס י נ ת ז ה ה ח ל ב ו ז של ע ו ב ר החיטה‬
‫תכולה מבנה ו פ ע י ל ו ת ב י ו ל ו ג י ת‬
‫ההסתכלות בחתכי ע ו ב ר י ם ב מ י ק ר ו ס ק ו פ ה א ל ק ט ר ו נ י‬
‫) ת מ ו נ ה ‪ ( 1 4‬מצביעה על נ ו כ ח ו ת ם‬
‫של ח ל ק י ק י ם בעלי ס מ י כ ו ת א ל ק ט ר ו נ י ת ב ג ו ד ל סל כ ‪ 250 ^ -‬ה נ צ ב ע י ם ב ה ד ר ו ק ם י ד ה ע ו פ ר ת ‪.‬‬
‫ב י ד ו ד ם של ה ר י ב ו ז ו מ י ם והסתכלות ב מ י ק ר ו ס ק ו פ ה א ל ק ט ר ו נ י מ צ ב י ע ה על זהותם על ה ח ל ק י ק י ם‬
‫הממלאים את ה צ י ט ו פ ו ל ם מ ה ‪ .‬ב א נ ל י ז ה באולטרה צ נ ט ר י פ ו ג ה א נ ל י ט י ת ם פ י נ ק ו מ ו ד ל‬
‫)באופםיקת‬
‫‪E‬‬
‫ש ל י י ז ‪ 3 ,‬מ ״ ג ‪ /‬מ ״ ל בתמיסה ‪ ( I ' M‬נמצא כ י א ו כ ל ו ם י ת ה ר י ב ו ז ו מ י ם ס ל ע ו ב ר‬
‫שלא נ ב ט מ כ י ל ה ב ע י ק ר מ ו נ ו ז ו מ י ם של ‪ S71‬ומעט ח ל ק י ק י ם סל‬
‫‪S55‬‬
‫ו־־ ‪.S34‬‬
‫)תמונה (‪,28‬‬
‫כ פ י שהראה מ ר כ ו מ ) ‪ ( 5 9‬מ ו פ י ע י ם ה פ ו ל י ז ו מ י ם רק לאחר ה נ ב י ט ה ‪ .‬את ה פ ו ל י ז ו מ י ם נ י ת ן‬
‫להפיק‬
‫ע ״ י הנבטת ע ו ב ר י ם בתמיסת נ ב י ט ה למשך ‪ 18‬ש ע ו ת ‪ ,‬הפקת ה ר י ב ו ז ו מ י ם כמתואר‬
‫בשיטות‪,‬‬
‫הפרדה על מפל ם ו כ ר ו ז‬
‫תמונה ‪:28‬‬
‫ו א י ג ו ם המקטע הכבד של המפל‪.‬‬
‫א נ ל י ז ת ם ד י מ נ ט צ י ה של ר י ב ו ז ו מ י ם מ ע ו ב ר י ם שלא נ ב ט ו ‪.‬‬
‫תכשיר ר י ב ו ז ו מ ל י ר ג י ל הופק מ ע ו ב ר י ם י ב ס י ם מתואר במרק ס י מ ו ת ‪.‬‬
‫‪ 1 0.15‬מ ״ ג ‪ /‬מ ״ ל נלקח‬
‫המכילה‬
‫ה ר י ב ו ז ו ם י ם פ ו ז ר ו בתמיסת‬
‫ל א נ ל י ז ה ס ד מ נ ט צ י ה באולמרה צ נ ס ר י פ ו ג ה ם פ י נ ק ו מ ו ד ל ‪, T.‬‬
‫אופטיקה ש ל י ד ן ‪.‬‬
‫־‪54‬־‬
‫באנליזה סדפנטציה של הפוליזופיס )תמונה ‪ (29‬באולטרה צנטריפוגה אנליטית נמצאו קבוצווז‬
‫‪,7‬‬
‫‪:350-350‬‬
‫‪3‬‬
‫‪0‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1‬‬
‫‪S‬‬
‫‪/‬‬
‫‪.‬‬
‫קבוצות אלו מתאימות לפונו‪ ,‬די‪ ,‬טרי‪ ,‬טטרה ופנט‪-‬פרים שנפצאו בכבד חולדה ורטיקולציטיס )‪,(60‬‬
‫הקבוצות הכבדות יותר לא אופינו‪ ,‬אולם קיופן של קבוצות ריבוזופים כבדות םדפנטציה אינו‬
‫הוכתה פםפקת לאופין הפוליזופלי‪.‬‬
‫תפונה ‪:29‬‬
‫אנליזת ;סדיפנטציה של פוליזופים מעוברי תיטה נובטים‬
‫תכשיר ריבוזופלי רגיל‪ ,‬הופ? מעוברים שנבטו ‪ 18‬שעות‪.‬הריבוזופים‬
‫חולקו על מפל םוכרוז כמתואר בשיטות ומקטע הפוליזומים נאסף‪,‬‬
‫‪ , Tw‬הושקע בראש ספינקו ‪ 40‬במהירות ‪ 4 0 . 0 0 0 .‬׳‬
‫פוזר ב‪ 10-‬מייל תמיסת‬
‫סבובים לדקה בפשך ‪ 50‬דקות‪ ,‬והמשקע הפוליזומלי פוזר בתמיסת‬
‫‪ 1‬פ״ל הפכיל ‪ 2‬פ״ג פוליזוםים נלקח לאנליזת םדמנטציה באולטרה‬
‫ש ל י ד ן ‪. ,‬‬
‫צנםריפוגה אנליטית מודל ‪ •S4‬אופםיקת‬
‫בנסוי הפתואר בתפונה ‪ 30‬חולק תכשיר רבוזופלי רגיל מעוברים בני ‪ 8‬שעות על גבי מפל םוכרוז‬
‫‪/‬‬
‫כפתואר בשיטות‪ .‬תכולת הפסג' האנדוגני של קבוצות הריבוזוםים השונות נבדקה על ידי בחינת‬
‫פעילותן בפערכח האנקורפורציה הסטנדרטית!‪ .‬פתוצאות הנםוי ניתן לראות כי הפקטעים הכבדים‬
‫ביותר )פקטעים ‪ (1,2‬אינם פכילים פםג"‪ .‬הפעילות הספציפית הגבוהה ביותר נמצאה במקטעים‬
‫‪1 2 4‬‬
‫עד‬
‫סל פפל הםוכרוז‪ .‬איזור זה‪ ,‬מכיל איפוא קבוצות ריביוזופים כבדונ! מ־י ‪ S77‬המכילות‬
‫פסג' אנדוגני פעיל‪ .‬קופפלקס זה פעיל ביצירת קשרים פפטטידיים ופתאים להגדרת הפוליזום‪.‬‬
‫‪- 55‬‬‫על‬
‫ע״י‬
‫פי‬
‫ההגדרה‬
‫המקובלת‬
‫ריבונוקליאז‬
‫בגוי‬
‫צ ר י ך לתת‬
‫הפוליזום‬
‫מפםנגיר‬
‫פי‬
‫מ ו נ ו ז ו מ י ם על‬
‫שעליו‬
‫הגדרה‬
‫‪15‬‬
‫‪20‬‬
‫יושבים‬
‫ז ו ‪.‬‬
‫הריבוזומים‪.‬‬
‫נםוי‬
‫‪10‬‬
‫מפורט‬
‫מסוג‬
‫חיתוך‬
‫זה‬
‫הפוליזומים‬
‫מתואר‬
‫בתמונה‬
‫‪.31‬‬
‫‪5‬‬
‫‪Fraction N °‬‬
‫תמונה‬
‫פיזור‬
‫‪;30‬‬
‫המםנגיר‬
‫תכשיר‬
‫ריבוזומלי‬
‫בתמיסת‬
‫תולקו‬
‫עם‬
‫‪-1‬‬
‫בופר‬
‫ל‪TM‬‬
‫אוכלוסית‬
‫רגיל‬
‫הנבטה‬
‫כמתואר‬
‫על מפל‬
‫סוכרוז‬
‫כמתואר‬
‫מייל‬
‫ורכוז‬
‫מכל‬
‫פולי‬
‫הריבוזומים‬
‫מקטע‬
‫‪.‬‬
‫‪U‬‬
‫הוספו‬
‫תכולת‬
‫מיקרוקירי‬
‫‪(l60!.1C/mM‬‬
‫‪a 14 16 18 2 0‬‬
‫‪8‬‬
‫‪10‬‬
‫‪6‬‬
‫‪4‬‬
‫תמונה‬
‫הסבר‬
‫בעמוד‬
‫בשיטות‪.‬‬
‫נקבע‬
‫למערכת‬
‫המםנגיר‬
‫הריבוזומים‬
‫‪2‬‬
‫< ‪D E « t‬‬
‫‪20‬‬
‫באורך‬
‫סהונבטו‬
‫האנדוגני‬
‫‪B‬‬
‫‪6‬‬
‫מ״ג‬
‫המיקטעים‬
‫גל‬
‫‪18‬‬
‫שנתקבלו‬
‫סטנדרטית‬
‫‪C‬‬
‫ע״י‬
‫הושלמו‬
‫‪, i | 1 r i‬‬
‫)ראה‬
‫כושרם‬
‫)בכל‬
‫» • ‪H K‬‬
‫שעות‬
‫ריבוזומים‬
‫‪260‬‬
‫נבד‪0.‬ה‬
‫לויצין‬
‫‪J 4‬‬
‫למשך‬
‫המכילים ‪1‬‬
‫אנקורפורציה‬
‫*‪FmcMn N‬‬
‫הבא‪(,‬‬
‫חיטה‬
‫‪ 0.2‬מ י י ל‬
‫א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של‬
‫•‪Ffoetion N‬‬
‫‪:31‬‬
‫הוכן‬
‫להמריץ‬
‫)ראה‬
‫מעוברי‬
‫בשיטות‪.‬‬
‫‪'0.3‬מייל‬
‫ללא‬
‫בין‬
‫הריבוזומים‪.‬‬
‫שיטות(‬
‫סל‬
‫דוגמא‬
‫‪e‬ו‬
‫‪n S‬‬
‫*‪Fractal N‬‬
‫‪0.25‬‬
‫‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫התפלגות אופינית של תכשיר ריבוזומלי רגיל מעוברי חיטה בני ‪ 18‬שעות על גבי‬
‫מפל סוכרוז‪.‬‬
‫עוברי תיטה הונבטו ‪ 18‬שעות והריבוזומים הופקו כמתואר בפרק שיטות‪.‬‬
‫המשקע הריבוזומלי הורחף בתמיסת ‪ , TM‬םורכז במהירות של ‪ 10.000‬סיבובים‬
‫לדקה בצנטריפוגת םרוול והנוזל העליון המכיל ‪2‬־־‪ 1‬מ״ג ריבוזומים‪ ,‬חולק על‬
‫גבי מפל םוכרוז ‪) 5-20$‬ראה שיטות(‪ .‬לאחר ההרצה בםפינקו חולק המפל למקטעים‬
‫שנפחם הושלם על ידי ‪ T M‬ל‪ 1-‬מייל‪ .‬המקטעים נקראו בספקטרופוטומטר גיס באורך‬
‫גל ‪1‬ן‪1‬ת ‪.260‬‬
‫‪ - p‬פוליזומים‬
‫!!‪-‬מונוזומים‪.‬‬
‫התפלגות פוליזופים מעוברי חיטה בני ‪ 18‬שעות על גבי מפל סוכרוז )הרצה חוזרת(‬
‫המיקטע הפוליזומלי )מבחנות ‪ ,2-5‬נםוי בתמונה ‪ (38‬נאסף מאיזור הםדימנטציה‬
‫הכבד של מפל הסוכרוז‪ ,‬פוזר ב‪ 10-‬מייל בופר ‪ TM‬והושקע בראש םפינקו ‪40‬‬
‫מ"‬
‫‪TMo‬‬
‫‪0.7‬‬
‫במהירות ‪ 40.000‬סבוכים לדקה במשך ‪ 30‬דקות‪ .‬המשקע הורחף בעדינות‬
‫ואליקווט המכיל ‪ 2‬מ״ג דיבוזומים נשטח על גבי מפל סוכרוז‪) ,5-20$ ,‬ראה שיטות‬
‫לאחר ההרצה בםפינקו חולק המפל למקטעים שנפחם הושלם ל‪ 1-‬מייל עם בופר^ף‬
‫‪.‬‬
‫‪260‬‬
‫רכוז הפוליזומים נקרא בסקפטרופוםומטר ציס באורך גל‬
‫‪a‬‬
‫)‬
‫‪j‬‬
‫‪r‬‬
‫התפלגות מונוזמים מעובדי חיטה גני ‪ 18‬שעות על גבי מפל םוכרוז )הרצה חוזרת(‬
‫‪ (A31‬נאסף מאיזור הםדמנטציה‬
‫‪,‬‬
‫המקטע המונוזמלי )מבחנות ‪11-15‬נםוי בתמונה‬
‫הקל של מפל הסוכרוז‪ ,‬פוזר בבופר ‪ TH‬ולאתר ‪ 2‬שעות דיאליזה נגד ‪ 1‬ליטר בופר‪,‬‬
‫נלקח אליקווט המכיל ‪ 2‬מ״ג ריבוזופים וחולק על גבי מפל ס וכר ו ז ‪(5-20$‬‬
‫)ראה שיטות(‪ .‬לאחר ההרצה בםפינקו חולק המפל למקטעים שנפחם הושלם ל‪ 1-‬מייל‬
‫עם בופר ‪ . TM‬רכוז המונוזופים נקרא בםפקטורופוטומטר ציס באורך גל^ןמן ‪.260‬‬
‫מקדם הםדמנטציה של הפונוזופים הוא ‪•77S‬‬
‫הפרדה כמותית של מונוזומים ‪ PM‬שהופקו מפוליזומים ע״י טיפול בריבונוקליאז‬
‫בלתי מסים‪.‬‬
‫‪ 10‬מייל תמיסת אינקובציה הכילו‪1 :‬מ"ג פוליזומים שהופרדו קודם לכן על גבי‬
‫מפל סוכרוז‪ 6 ,‬מ״ג ריבונוקליאז בלתי מסים )שווים לפעילות סל ‪ 4‬םיקרוגרם‬
‫ריבו נוקליאז(‪ .‬אחרי שעה ב‪ 4^-‬הועברה התערובת דרך ניר ווטמן מספ' ‪ 1‬להרחקת‬
‫האנזים‪ ,‬וםורכזה בםפינקו ראס ‪ 40‬במהירות ‪ 40.000‬םבובים לדקה במסך סעה •‬
‫‪ T‬נסטח על ‪ 3‬מבחנות‬
‫להשקעת הריבוזוםים‪ .‬המשקע הריבוזומלי הורחף ב‪ 1-‬מייל ‪, M‬‬
‫מפל םוכרוז ‪ ,5-20$‬לאחר ההפרדה )ראה‪.‬שיטות( בםפינקו‪ ,‬חולק המפל למקטעים‪,‬‬
‫הושלם ל‪ 1-‬מייל עם ‪ , TM‬המקטעים נקראו בספקטרופוטופטר צים באורך גל ‪260‬‬
‫פילימיקרון‪.‬‬
‫כאשר‬
‫תכשיר‬
‫מונוזומים‬
‫בהפרדה‬
‫הפוליזומלי‬
‫כאשר‬
‫^‬
‫על ידי‬
‫השומר ע ל‬
‫ש‬
‫ע‬
‫‪,‬‬
‫‪4‬‬
‫האנדוגני‬
‫הםנטטי‪.‬‬
‫אפשר‬
‫רגיש‬
‫סוכרוז של‬
‫במהלך כ ל‬
‫הניסוי‬
‫המנוקים‬
‫י‬
‫ם‬
‫האנדוגני‬
‫בתכשיר‬
‫ותוצר‬
‫מתאים‬
‫‪C‬‬
‫(‬
‫ניתנת‬
‫אמנם‬
‫מידת‬
‫םנטטי‬
‫מתוארת‬
‫עלתה רק פ י‬
‫מאפשר ל ה ם‬
‫לעשות‬
‫אנקורפורציה‬
‫מאשר‬
‫אנדוגני‬
‫מבנה‬
‫כושר‬
‫ההיענות‬
‫אנדוגני לא‬
‫ז ו של‬
‫מידת‬
‫האנקורפורציה‬
‫הישירה‪.‬‬
‫מסים‬
‫בטמפ'‬
‫‪• s 7 7‬‬
‫האנקורפורציה‬
‫‪- U‬‬
‫למסגי‬
‫בטבלה ‪3‬‬
‫של‬
‫זה‪.‬‬
‫לפולי‬
‫יגיבו‬
‫בעוד‬
‫האנקורפורציה‬
‫ל ילין(‬
‫היעדר‬
‫ברמה‬
‫‪3‬‬
‫לפוליס‬
‫המסג'‬
‫םנטטי‪.‬‬
‫המונוזומים‪ ,‬הרי‬
‫כתגובה‬
‫ההיענות‬
‫המקטע‬
‫המונוזומלי‪.‬‬
‫בלתי‬
‫הקלטית של‬
‫שניים‬
‫נראה‪,‬‬
‫המקטע‬
‫והקלים‪.‬‬
‫מ ו נ ו ז ו מ י ם של‬
‫לבחינה ע ״ י‬
‫ל ב ח ו ן את‬
‫איפוא‪ ,‬כ י‬
‫ת‬
‫הכבדים‬
‫^ ‪ (31‬א ת‬
‫ריבונוקליאז‬
‫להגדרה‬
‫למסג'‬
‫א‬
‫מקטעי‬
‫המקטעים‬
‫בתמונה )‬
‫הפירוק הוא‬
‫המכילים מסג'‬
‫ופוליזומים‬
‫הפוליזומים‪.‬‬
‫לתכולת‬
‫‪D‬‬
‫הריבוזופלי‬
‫ומאידך‬
‫לראות‬
‫‪(31‬‬
‫‪31‬‬
‫ניתן‬
‫ל‬
‫ש‬
‫^‪ 4‬ש ל‬
‫וחצי על‬
‫המונוזומים‬
‫מסגי‬
‫אפשר‬
‫וב־־)‬
‫מהצמת‬
‫ריבוזומים‬
‫הפוליזומים‬
‫ז ו של‬
‫המקטעים‪,‬‬
‫הפוליזומים‬
‫מונוזומים‬
‫בנפרד^בממפ'‬
‫)תמונה‬
‫הפוליזומים‬
‫להניח כי‬
‫אוכלוםית‬
‫יותר‬
‫‪2‬‬
‫ה ר י ב ו ז ו מ י ם מתד‬
‫של‬
‫‪ 10‬ע ל‬
‫כ‬
‫מבנה‬
‫ההיענות של‬
‫האנדוגנית‬
‫פי‬
‫נ‬
‫ת‬
‫המסג'‬
‫של‬
‫בקרב‬
‫ח‬
‫איפוא כי‬
‫תכולת‬
‫מידת‬
‫יציבותו‬
‫המקטעים‬
‫‪2‬‬
‫הפוליזומים‬
‫ה‬
‫נראה‪,‬‬
‫רגיל‬
‫א י ג ו ם של‬
‫חוזרת על מפל‬
‫מפעילים על‬
‫למשך ח צ י‬
‫ריבוזומלי‬
‫מחולק על מפל‬
‫סוכרוז )‬
‫אפשר‬
‫‪.(31A‬‬
‫לקבל‬
‫פוליזומית‬
‫מהווה‬
‫מסגי‬
‫העולה‬
‫קריטריון‬
‫‪14‬‬
‫טבלה‬
‫‪C‬‬
‫‪ - 3‬אנקורפוו־ציה של פניל אלנין‬
‫)ספירות‬
‫במערכת‬
‫תכשיר‬
‫פעילות‬
‫פוליזומים‬
‫‪18.000‬‬
‫‪25.300‬‬
‫רובוזומים‬
‫חולקו על גבי מפל‬
‫קריאת‬
‫םבובים‬
‫של כ ‪-‬‬
‫מעוברי‬
‫לדקה‬
‫באורך‬
‫גל‬
‫‪100‬‬
‫הופסקה‬
‫‪45‬‬
‫שנבטו‬
‫םוכרוז‬
‫‪.‬‬
‫שעות‬
‫כמתואר‬
‫בראש‬
‫הםוכרוז‬
‫כמתואר‬
‫בשיטות‪.‬‬
‫בפרק‬
‫‪-39‬‬
‫ל‪18-‬‬
‫המקטעים‬
‫מונוזומים‬
‫סטנדרטית )ראה‬
‫שיטות‪,‬‬
‫םפינקו‬
‫חולק‬
‫רוכזו‬
‫הפוליזומים‪.‬‬
‫אנקודפורציה‬
‫ונמנתה‬
‫‪207.300‬‬
‫)‪(5-20$‬‬
‫‪up‬‬
‫ה מ כ י ל י ם את‬
‫טופלה‬
‫‪24‬‬
‫דקות‪ .‬מפל‬
‫‪260‬‬
‫למערכת‬
‫‪p.g‬‬
‫חיטה‬
‫במשך‬
‫והמקטעים‬
‫הריאקציה‬
‫‪U‬‬
‫פעילות‬
‫ו פ ו ל י ז ו מ י ם ‪10.200‬‬
‫ריבוזומים‬
‫הצפיפות‬
‫פולי‬
‫מונוזומים‬
‫הוכנו‬
‫המונוזומים‬
‫סטנדרטית(‬
‫‪7800‬‬
‫הבדל ב י ן‬
‫‪36.000‬‬
‫בדקה‬
‫‪232.000‬‬
‫מונוזומים‬
‫האופטית‬
‫אנדוגנית‬
‫‪+‬‬
‫למ״ג‬
‫ריבוזומים‬
‫ש‪-‬יטות(‬
‫מ״ג‬
‫‪6‬‬
‫‪SW‬‬
‫מקטעים‬
‫המכילים‬
‫במהירות‬
‫ולאחר‬
‫את‬
‫ופוליזומים‬
‫ולאחר‬
‫‪45‬‬
‫הוספו‬
‫דקות‬
‫בכמות‬
‫אנקובציה‬
‫־ ‪ 58‬־‬
‫ב‪.‬‬
‫חקירת הקשר מםנגיר ‪ -‬ריבוזומיס‪.‬‬
‫על אף שמקובל כי הקשר מםנגיר ריבוזום אינו קוולנטי‪ ,‬הרי יקשה בתנאי מעבדה לנקות את‬
‫הריבוזומים ממםנגיר הספוח אליהם‪ .‬הנסוייס הבאים מטרתם כפולה‪:‬‬
‫בין המסג' והריבוזומים )חשיפה(‪.‬‬
‫א(‬
‫מציאת תנאים להפרדה ‪i n vitro‬‬
‫ב(‬
‫הכנת מונוזומים שהיו פעילים קודם לכן בםינתזח החלבון ובדיקת כושר פעילותם‬
‫במערכת אנקורפורציה‪.‬‬
‫בטבלה ‪ 4‬מסוכמת הדרך להכנת ריבוזומים חשופים ממםנג'ר^‪11‬‬
‫‪.‬לאחר הפרדת המונוזומים‬
‫מן הפוליזומים )ראה נסיי ‪ ( 3 1‬מטפלים במונוזומים‪,‬בריבונוקליאז בלתי מםים‪,‬ברכוז של‬
‫‪ 6‬מ״ג אנזים ל‪ 1-‬מ״ג ריבוזומים‪ .‬כמות אנזים זו שווה בפעילותה ל‪ 4-‬מיקרוגרם רבונוקליאז‪.‬‬
‫לאחר ‪ 50‬דקות ב‪,4°-‬מרחיקים את האנזים ע״י סינון דרך ניר ווטמן מספר ‪ .1‬האנזים הקשור‬
‫נשאר על ניד הסינון ואילו הריבוזומים עוברים אותו בניצולת סל ‪ 100‬אחוז‪ .‬את הריבוזומים‬
‫המתקבלים מפרקים לתת‪-‬יחידות ע״י דיאליזה נגד "בופר דםוצאציה" חסר מגנזיום המכיל‬
‫כרוז י־‬
‫‪NaCl‬‬
‫בופר טריס ־‪ 7pH8‬הדיאליזה נמשכת סעתיים ב‪4°-‬‬
‫‪M0.01M‬‬
‫תוך בחישה מתמדת‪ .‬לאחר הדיסוצאציה סל הריבוזומים‪ ,‬מעלים את רכוז המגנזיום ל‪-‬‬
‫וזרת על מפל םוכרוז‪ .‬את המיקטע של‬
‫‪7‬‬
‫‪7‬‬
‫‪S‬‬
‫•‬
‫‪10‬‬
‫‪, M‬‬
‫סופרים כתכשיר יזל ריבוזוהים‬
‫מעוכלים וחסופים‪.‬‬
‫טבלה ‪ 5‬א' ו‪-‬ב' מתארת את פעילותם הביולוגית של הריבוזומים במהלך הטיפולים השונים‬
‫שנוסו‪ .‬נראה כי יחד עם ירידת פה בכושר האנקורפורציה של הריבוזופים‪ ,‬נחשפים הריבוזומים‬
‫ממסג' אנדוגני‪ ,‬ובנםיונות פאוחרים יותר הגיעו הריבוזופימ החשופים לפעילות ?סל ‪%‬‬
‫מילימיקרומולים חומצה אמינית שעברה אנקורפורציה ל‪ 1-‬מ"ג ‪rRNA‬‬
‫פולי ‪U‬‬
‫במשך שעה בנוכחות‬
‫‪ .‬פעילות זו שוה ברמתה לזו של מערכות אנקורפורציה יעילות של חידקים‪.‬‬
‫־ ‪ 5 9‬־‬
‫טבלה‬
‫‪ - 4‬הכנת נ?ונוזומים מפוליזומים‬
‫הפקת ריבוזומים )ראה שימות(‬
‫מעוברי תיטה בני ‪ 2 4‬שעות‪.‬‬
‫הפרדה על מפל סוכר ו ז ‪ 5 - 2 0 $‬בראש‬
‫‪ 36.000 ,‬סבובים לדקה‬
‫ספינקו ‪-39‬‬
‫במשך ‪ 4 5‬דקות‪.‬‬
‫חלוקה ל‪ -18‬מקטעיט ואיסוף‪) .‬המונה ‪(A31‬‬
‫‪,‬‬
‫")בקורת לחשיפה ממסג םנטטי(‬
‫מונוזומיס‪1‬ז‪1‬‬
‫^ \‬
‫‪+‬‬
‫‪.£‬גן‪ 75‬פולי‬
‫^‬
‫;ע‪/‬מל ) ןך(‪.‬‬
‫פולי זומים‬
‫מקטע ‪3 - 1‬‬
‫מונוזומים‬
‫מקטע ‪1 1 - 1 5‬‬
‫‪i‬‬
‫השקעה בספינקו‬
‫טיפול בריבונוקליאז בלתי מטים )ם (‬
‫המשקע ‪mg‬‬
‫‪6‬‬
‫פיזור‬
‫בבופר‬
‫אנזימ‪/‬מ״ג ריבוזומים‪ -4°‬דקות ב‪,30‬‬
‫=‪p.gRNAase4‬‬
‫םינו? דרך ניר ווטמן ‪1‬‬
‫להרחקת האנזים וםרכוז )‪(5'x3000 RPM‬‬
‫להרחקת תלקיקים זעירים שעברו את ניר הסינון‪,‬‬
‫*‬
‫_‬
‫דיאליזה התםנין כנגד ‪ 1‬ל‪" .‬בופר דיסוציאציה" ) ‪ ( d‬מכיל‬
‫‪M N a C l0.5,1‬‬
‫‪,‬‬
‫מילימולר טרים בופר‬
‫_*‬
‫‪++‬‬
‫אסוציאציה על ידי אינקובציה‬
‫הפרדה על מפל םוכרוז ‪RPM 5 - 2 0 $‬‬
‫_‬
‫מונוזומים‬
‫עם פולי‪U -‬‬
‫]‪CUM‬‬
‫‪ ' x 3 6 , 0 0 0‬׳‬
‫ש‬
‫לש‬
‫ב‬
‫ר‬
‫ה‬
‫‪1‬‬
‫ם‬
‫ע ע ‪M mp0.01‬‬
‫א‬
‫ש‬
‫מ‬
‫פ‬
‫י‬
‫נ‬
‫ק‬
‫‪t‬‬
‫מונוזומים‬
‫מעוכלים וחשופים‬
‫)בקורת(‬
‫] ‪D M‬‬
‫‪7.8‬‬
‫‪ p H‬ו ‪ 1 $ -‬םכרוז‪,‬‬
‫‪fd‬‬
‫מונוזומים‬
‫מעוכלים י‬
‫וחשופים‬
‫]‪fd Dm‬‬
‫ו‬
‫« ‪SW 3 9 4 5‬‬
‫‪T‬‬
‫מונוזומים שמקור•‬
‫בפוליזומים‬
‫נ‬
‫‪[Pm‬‬
‫‪ 60 -‬־‬
‫טבלה ‪5‬‬
‫ השפעת הטיפולים השונים על התכשירים הריכוזומיליים‬‫א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של פ נ י ל א ל נ י ן‬
‫)מערכת ס ט נ ד ר ט (‬
‫כ‬
‫ת‬
‫א‪.‬‬
‫ש‬
‫י‬
‫‪14‬‬
‫)‪rRNA‬‬
‫‪C‬‬
‫פעילות‬
‫אנדוגנית‬
‫ר‬
‫מ ו נ ו ז ו מ י ם מ ו פ ר ד י ם על מפל ס ו כ ר ו ז‬
‫)לאחר ד י א ל י ז ה נ ג ד ‪( TM‬‬
‫מונוזומים‬
‫מ ו נ ו ז ו מ י ם ‪) m‬אחדי פ ר א י נ ק ו ב צ י ה (‬
‫מ ו נ ו ז ו מ י ם אחרי ד י א ל י ז ה נ ג ד גופר()‪1111‬‬
‫דיםוציאציה(‬
‫‪m‬‬
‫ב‪.‬‬
‫‪Dm‬‬
‫מ ו נ ו ז ומים מעוכלים‬
‫מ ו נ ו ז ו מ י ם ‪ Em‬שעברו פ ר א י נ ק ו ב צ י ה‬
‫מ ו נ ו ז ו מ י ם ‪ ) dDm‬א ח ד י ד י א ל י ז ה נ ג ד ב ו פ ר‬
‫דיםוציאציה(‬
‫ג‪.‬‬
‫מונוזומים‬
‫ןתסשעברו‬
‫מ ו נ וזומים‪?111‬ט‪0‬‬
‫‪5340‬‬
‫‪301‬‬
‫‪23,200‬‬
‫‪4300‬‬
‫‪568‬‬
‫‪13,000‬‬
‫‪14,250‬‬
‫‪300‬‬
‫‪23,550‬‬
‫פ ר א י נ ק ו ב צ י ה עם‬
‫מ ו נ ו ז ו מ י ם מ פ ו ל י ז ו מ י ם ‪Pm‬‬
‫מ ו נ ו ז ו מ י ם ‪ Pia‬אחרי פ ר א י נ ק ו ב צ י ה‬
‫אחרי‬
‫‪ +‬פולי ‪U‬‬
‫‪17,900‬‬
‫‪30,150‬‬
‫‪21,200‬‬
‫‪759‬‬
‫‪387‬‬
‫פולי־ס‬
‫מונוזומים‬
‫‪1‬תט‪(1‬אחרי ד י א ל י ז ה נ ג ד ג ו פ ר‬
‫ד י ס ו צ י א צ י ה ללא ע י כ ו ל ״‬
‫פ ו נ ו ז ו מ י ם ‪1‬זגגזע&אחרי ע כ ו ל ו ד ס ו צ י א צ י ה‬
‫ד‪.‬‬
‫‪(cpm/mg‬‬
‫דיסוציאציה‬
‫‪28,200‬‬
‫‪27,700‬‬
‫‪670‬‬
‫‪300‬‬
‫‪4,950‬‬
‫‪14,250‬‬
‫‪8150‬‬
‫‪3910‬‬
‫‪4500‬‬
‫‪9550‬‬
‫‪5170‬‬
‫‪17,200‬‬
‫א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של ל י ז י ן ‪) H‬י‬
‫‪ C‬י‬
‫ה‪.‬‬
‫מ ו נ ו ז ו מ י ם ‪1‬ז!ג>שעברו ד י א ל י ז ה נ ג ד ג ו פ ר‬
‫דיםוציאציה‬
‫מ ו נ ו ז ו מ י ם ‪ dDm‬שעברו ע כ ו ל ל פ נ י‬
‫הדיסוציאציה‬
‫‪p‬‬
‫מונוזומים מופליזומים‬
‫מ ו נ ו ז ו פ י ם ‪ Pm‬שעברו ד י ם ו צ י א צ י ה‬
‫‪m‬‬
‫‪(cpm/mg rRNA‬‬
‫‪5620‬‬
‫‪10,520‬‬
‫‪5600‬‬
‫‪4650‬‬
‫‪4,500‬‬
‫‪12,700‬‬
‫‪4650‬‬
‫‪10,900‬‬
‫התכשירים ה ר ב ו נ ו מ ל י ם ה ו כ נ ו כ מ ת ו א ר בטבלה ‪ 4‬ו כ ‪ 1 0 0 -‬מ י ק ר ו ג ר ם ר י ב ו ז ו מ י ם ה ו ס פ ו למערכת‬
‫א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ס ט נ ד ר ט י ת כמתואר בפרק ש י ט ו ת ‪ .‬תערובת ה ר י א ק צ י ה ט ו פ ל ה לאחר ה א י נ ק ו ב צ י ה‬
‫כמתואר בפרק ש י ט ו ת ו ת ו צ א ו ת ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ב ו ט א ו ב ס פ י ר ו ת לדקה ע ב ו ר מ ״ ג ‪rRNA‬‬
‫‪ - d‬טיפול דיאליזה‪.‬‬
‫‪ - D‬עיכול דיבונוקליאז‪U .‬‬
‫‪ -‬תוספת פ ו ל י ‪U‬‬
‫הדרך להכנת מ ו נ ו ז ו מ י ם מ פ ו ל י ז ו מ י ם מתוארת בטבלה ‪, 4‬‬
‫‪31‬‬
‫בנסיון‬
‫‪, B‬‬
‫פוליזומים‪.‬‬
‫ניר‬
‫אוגמו‬
‫וטופלו‬
‫ב ר י ב ו נ ו ק ל י א ז בלתי מסים ב ר כ ו ז של ‪ 6‬מ ״ ג ל מ ״ ג‬
‫לאחר ‪ 30‬דקות ב ‪ 4 ° -‬ה ו פ ר ד ה תערובת ה ר י א ק צ י ה מ ן ה א נ ז י ם ע ״ י‬
‫ווטמן מם' ‪1‬‬
‫לתמונה‬
‫הפוליזומים‬
‫ס נ ו ן דרך‬
‫ו ה ר י ב ו ז ו פ י ם ר ו כ ז ו על י ד י הרצה ב ס פ י נ ק ו ראש ‪ 40‬במסך ‪ 45‬דקות‬
‫ב מ ה י ר ו ת ‪ 4 0 , 0 0 0‬ס ב ו ב י ם לדקה‪.‬‬
‫‪.31‬‬
‫פ ו ל י ז ו מ י ם ה ו כ נ ו כמתואר‬
‫פ ו ז ר ו ב ב ו פ ר ‪ TM‬ו ח ו ל ק ו על מפל ס ו ב ר ו ז כמתואר בהסבר‬
‫ה מ ו נ ו ז ו מ י ם שנחתכו ע ״ י‬
‫ו נ ס מ ר ו כתכשיר!!!?‬
‫ר י ב ו נ ו ק ל י א ז מן ה פ ו ל י ז ו מ י ם ‪ ,‬הופרדו משרידי‬
‫) מ ו נ ו ז ו מ י ם סמקורם ב פ ו ל י ז ו מ י ם ( ‪ .‬ה פ ע י ל ו ת ה ב י ו ל ו ג י ת‬
‫סל תכסיר זה נ ב ח נ ה במערכת א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ס ט נ ד ר ט י ת )טבלה ‪ 5‬ד י ( ‪ .‬ה ת ו צ א ו ת מראות כ י‬
‫המסג'‬
‫האנדוגני‬
‫בריבונוקליאז‬
‫המונוזומים‬
‫יורדת‪.‬‬
‫אינו‬
‫יורד מן‬
‫ה מ ו נ ו ז ו מ י ם שמקורם ב פ ו ל י ז ו מ י ם ו ל מ ר ו ת ה ט י פ ו ל הקודם‬
‫ו ז א ת גם לאתר פ ר א י נ ק ו ב צ י ה ‪ .‬רק לאחר ט י פ ו ל ה ד י ם ו צ י א צ י ה מ ג י ב י ם‬
‫למסגי‬
‫סנטטי‪ ,‬אולם ב נ ג ו ד‬
‫ל מ ו נ ו ז ו מ י ם ה ר ג י ל י ם א י ן הפעילות ה א נ ד ו ג נ י ת‬
‫דבר זה מ ר מ ז כ י ט י פ ו ל ה ד ם ו צ י א צ י ה תשף אתר חדש ל צ י מ ו ד ו ס ל ה מ ס ג ' הםנטטי מ ב ל י‬
‫האנדוגני‬
‫שהמסג'‬
‫ישתתרר‪ .‬גם ב נ ם ו י י ם עם פ ו ל י‬
‫‪U‬‬
‫‪A‬‬
‫)טבלה ‪5‬‬
‫( נמצא כ י‬
‫טיפול‬
‫םאפשר ע ל י ה ב א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ת ו ד ו ת ל נ ו כ ת ו ת פ ו ל י‬
‫העיכול‬
‫פעילות‬
‫א‪.‬‬
‫ב ר י ב ו נ ו ק ל י א ז בלבד א י נ ו מספיק להסיר את ה מ ס ג '‬
‫האנדוגני‪.‬‬
‫ה ג נ ו ם בשלבי ה נ ב י ט ה ה ר א ש ו נ י ם של ע ו ב ר החיטה‬
‫מ ו ע ד תתילת ת ה ל י ך ה ט ר נ ם ק ר י פ צ י ה עם ה נ ב י ט ה ‪.‬‬
‫מן‬
‫ה נ ם ו י י ם ה ק ו ד מ י ם התברר כ י ב ע ו ד שהעובר מתתיל ל ם נ מ ז ח ל ב ו ן מ י ד בתחילת‬
‫הנביטה‪,‬‬
‫הרי כנראה שםינתזה‬
‫ז ו א י נ ה מ ו ת נ י ת ב ס י נ ת ז ה של ‪mRNA‬‬
‫‪ 26‬על אפשרות ק י ו מ ו של מ ס ג י ב ע ו ב ר שלא נ ב ט ‪ .‬כ ד י‬
‫פ ע י ל ו ת ו של ה ג נ ו ם עם ה נ ב י ט ה ‪,‬‬
‫לפרקי‬
‫ז מ ן ש ו נ י ם בתמיסת הנבטה‪.‬‬
‫ת ו כ נ ן ה נ ם י ו ן הבא‪:‬‬
‫חדש‪ .‬כך מ צ ב י ע נ ם ו י‬
‫ל ע נ ו ת לשאלה מתי‬
‫ל ר א ש ו נ ה מתחילה‬
‫מ נ ו ת ב נ ו ת ‪ 1‬גייר ע ו ב ר י ם ה ו נ ב ס ו‬
‫שעה ל פ נ י הוצאתם‪ ,‬ה ו ע ב ר ו ה ע ו ב ר י ם למשך שעה‬
‫־‪62‬־‬
‫לתמיסת‬
‫הופק‬
‫פציפית‬
‫נ ב י ט ה ר ד י ו א ק ט י ב י ת ה מ כ י ל ה ‪ 500‬מ י ק ר ו ק י ר י ‪ /‬מ ״ ל פוספט‬
‫ו נ ו ק ה כמתואר ב ש י ט ו ת ‪ .‬בשעות ה נ ב י ט ה ה ר א ש ו נ ו ת מתקבל‬
‫נ מ ו כ ה ‪ ,‬כ ד י לאפשר הבתנה ב ה ב ר י ד י ם של‬
‫הוכנו‬
‫‪P ^ D N A‬‬
‫פ י ל ט ר י ם עם ‪ 190‬מ י ק ר ו ג ר ם ‪DNA‬‬
‫‪ P•^ RNA‬ב ע ל פ ע י ל ו ת‬
‫‪2‬‬
‫עם ‪ § N A‬ב ע ל פ ע י ל ו ת ס‪.‬פציפית נ מ ו כ ה ‪,‬‬
‫ו נ ו כ ת ו ת ה&םג'‬
‫נבדקה ע ״ י‬
‫מ ו ב א ו ת ת ו צ א ו ת נ ם ו י ה ה ר ו ו י ה ‪ .‬נ מ צ א כ י עד ‪ 6‬שעות נ ב י ט ה לא‬
‫ל ‪DNA -‬‬
‫‪2‬‬
‫^‪carrier freeP‬‬
‫‪RNA-n‬‬
‫ה ב ר י ד ז צ י ה ‪ .‬ב ת מ ו נ ה ‪32‬‬
‫נוצר‬
‫שהוא ק ו מ פ ל מ נ ט ר י‬
‫‪RNA‬‬
‫ב ש י ע ו ר שלמעלה מ־‪ 0.3‬א ח ו ז ‪ .‬החל מ ן השעה ה‪ 12-‬ע ו ל ה ש י ע ו ר ה ה ב ר י ד ז צ י ה בבת אחת‬
‫ל‪ 2-‬אחוז‪ ,‬ע ד ו ת ל ה ו פ ע ת ו של ‪ .. jnRNA‬גם בשעות ‪ 25-24‬ו‪ 36-35-‬ל נ ב י ט ה מ ה ו ו ה חלק ה ג נ ו ם‬
‫ה פ ע י ל כ‪ 2-‬אחוז מכלל ה ‪DNA -‬‬
‫הגנוס‬
‫הגנום‬
‫‪ .‬אפשר לומר‪ ,‬איפוא‪ ,‬כ י במסך ‪ 12‬שעות ה נ ב י ט ה ה ר א ש ו נ ו ת‬
‫א י נ ו פ ע י ל ב ט ד ג ס ק ר י פ צ י ה של ‪. mRNA‬לאחר מ כ ן חלה הפעלה מלאה של ‪ 3.4‬א ח ו ז י ם מ כ ל ל‬
‫‪"vivo‬‬
‫‪1‬‬
‫) ל פ י החישוב ‪.(2x2 - 0.6$‬‬
‫כד‬
‫)‪0‬‬
‫»>‬
‫‪.c‬‬
‫<‬
‫‪Z‬‬
‫‪Q‬‬
‫‪c‬‬
‫‪u‬‬
‫‪01‬‬
‫‪QL‬‬
‫‪800‬‬
‫‪400‬‬
‫‪600‬‬
‫‪RNA‬‬
‫ת מ ו נ ה ‪;32‬‬
‫‪.Zi5p‬‬
‫‪200‬‬
‫‪P.32‬‬
‫•‬
‫מ ו ע ד תחילת ה ו ו צ ר ו ת‬
‫‪oe‬‬
‫‪mRNA‬‬
‫בעוברים נ ו ב ט י ם ‪.‬‬
‫ל כ מ ו ת י ^ ו ע ה של ‪ DNA‬ה ו ס פ ו כ מ ו י ו ת ה ו ל כ ו ת ו ע ו ל ו ת של‬
‫‪ P‬שעבר ט ר נ ס ק ר י פ צ י ה במשך שעת נ ב י ט ה אחת ב ל ב ד ‪,‬‬
‫‪RNA‬‬
‫ל פ נ י הכנת ה ‪. RNA -‬כיל ד ו ג מ ה ה כ י ל ה ‪ 190‬מ י ק ר ו ג ר ם ‪£<NA‬‬
‫‪|ag(/cpm‬‬
‫שעה‪RNA‬‬
‫מעובר בן‬
‫)‬
‫‪B-0‬‬
‫ש ע ו ת) ‪(cpm/ug105‬‬
‫» ‪12‬מעוברים ב נ י‬
‫‪II‬‬
‫‪(cpm/ug250 ) 1 8‬‬
‫שעות‬
‫‪- A‬מ‪A‬ע ו ב ר י ם ב נ י‬
‫»ו‬
‫‪ug ) 2 4‬׳‪(Qcpny31‬‬
‫שעות‬
‫‪- A‬מ‪A‬ע ו ב ר י ם ב נ י‬
‫‪32‬‬
‫מעוברים ב נ י‬
‫שעות‬
‫‪4‬‬
‫)‬
‫‪(cpm/ug55‬‬
‫מעוברים ב נ י‬
‫שעות‬
‫‪6‬‬
‫)‬
‫‪(cpm/ug52‬‬
‫ ‪- 62‬‬‫לנוכחותו‬
‫הוכחה‬
‫מכיו‪.‬ן‬
‫ן‪-‬‬
‫במידה‬
‫ע״י‬
‫שאין‬
‫של מסנג*ר^י‪&1‬‬
‫אפשרות‬
‫כזה‬
‫‪mRNA‬‬
‫נםוי‬
‫לבדוק‬
‫הברדיזציה‬
‫בעובר‬
‫ישירות‬
‫קייםוהינו‬
‫תחרותית‪.‬‬
‫היבש‪.‬‬
‫נוכתות‬
‫זהה‬
‫מםנגיד‬
‫למםנגיר‬
‫נםוי‬
‫תוצאות‬
‫הנוצר‬
‫כזה‬
‫בעובר‬
‫‪RNA‬‬
‫לאחר‬
‫מובאות‬
‫היבש‬
‫הנביטה‬
‫בתמונה‬
‫הרויה‪,‬‬
‫ע״י‬
‫ניתן׳יהיה‬
‫‪,35‬‬
‫כאשר‬
‫ד‪!,‬‬
‫לגלותו‬
‫כמויות‬
‫הולכות‬
‫ו‬
‫‪32‬‬
‫ועולות‬
‫שעבר‬
‫של‬
‫ל‪-‬‬
‫‪RNA‬‬
‫טרנםקליפציה‬
‫התוצאה‬
‫‪24‬‬
‫קר‬
‫מצביעה‬
‫שעות‪.‬‬
‫ל‪48-‬‬
‫‪'liNn‬‬
‫בי ן‬
‫‪24‬‬
‫בבירור‬
‫כי‬
‫איין‬
‫החדש‬
‫בל‬
‫‪RNA‬וכמויות‬
‫דוגמא‬
‫הולכות‬
‫הכילה‬
‫ועולות‬
‫הנסוי‬
‫הנוצר‬
‫‪RNA‬‬
‫תמונה‬
‫שהופק‬
‫‪3 2‬‬
‫מעוברים‬
‫ל‪48-‬‬
‫ה‪. -‬‬
‫לאחר‬
‫שעות‪.‬נביטה‪,‬‬
‫הנמצא‬
‫‪RNA‬‬
‫מאפשר‬
‫שלא‬
‫נבטו‪,‬‬
‫לדעת‬
‫אם‬
‫‪:53‬‬
‫בעובר‬
‫העובר‬
‫היבש‬
‫היבש‬
‫קומפלמנטריים‬
‫מכיל‬
‫מכיל‬
‫מםנגיר‬
‫סוגי‬
‫זהה‬
‫מסג׳‬
‫לזה‬
‫נוספים‬
‫הנוצר‬
‫שאינם‬
‫הנביטה‪.‬‬
‫לקיומו‬
‫‪40‬‬
‫מיקרוגרם‬
‫ש ל מם נ ג י ר‬
‫‪RNA‬‬
‫‪134‬‬
‫של‬
‫‪,‬‬
‫מעוברים‬
‫•מעוברים‬
‫שלא‬
‫בני‬
‫בעובר‬
‫שלא‬
‫נבט‪.‬‬
‫מיקרוגרם‬
‫‪DNA‬‬
‫‪,‬‬
‫‪RNA‬‬
‫איזורים‬
‫של‬
‫)‪^RNA(48‬־‪P‬‬
‫בלתי‬
‫(‪j.g‬‬
‫נבטו‪,‬‬
‫‪48‬‬
‫או‬
‫שעות‪.‬‬
‫‪RNA‬‬
‫מעוברים‬
‫בני‬
‫‪,24‬‬
‫או‬
‫‪P‬‬
‫הגנוס‪.‬‬
‫‪Ratio unlabelled RNA to 48 hr stage P‬‬
‫הוכחה‬
‫מסומן‬
‫התחרו‬
‫על‬
‫בכמות‬
‫קבועה‬
‫של‬
‫)‪(48‬‬
‫‪RNA‬‬
‫י‬
‫בין‬
‫זהים‬
‫• ‪ 6 4‬־‬
‫השנויים החלים באוכלוסית המסג* עם הנביטה‪.‬‬
‫ג‪.‬‬
‫ןזהברידיזציה התתרותית מאפשרת את האבתנה בין אוכלוסיות מסג' שונות המופיעות‬
‫במהלך הנביטה‪.‬‬
‫בנםוי המתואר בתמונה ‪ 33‬הושוותה אוכלוסית המסג' הקימת בעובר עד ל‪-‬־‪ 24‬שעות נביטה‬
‫עם ז ו הנוצרת ב י ן ‪ 24‬ל ‪ 4 8 -‬שעות נביטה‪ .‬נמצא כ י כמויות עולות ש ל ‪ RNA‬י‬
‫מעוברים בני ‪24‬‬
‫ס <‬
‫ה ו ‪ 1‬ח ר ו‬
‫ע‬
‫ם‬
‫) (‬
‫‪^RNA 43‬‬
‫בלתי מסומן‬
‫שעבר טרנםקריפציה בין ‪ 24‬ל ‪ 4 6 -‬שעות‪,‬‬
‫‪2‬‬
‫והתחרות היה דומה לזו הצפויה עם ‪ mRNA‬יזהה‪ .‬כלומר אוכלוסית המסג' הנמצאת בעובר עד‬
‫ג י ל ‪ 24‬ש‪ /‬זהה עם ז ו הנוצרת ב ו בין ‪ 24‬ל ‪ 4 8 -‬ש י ‪ .‬בנסוי ‪ 34‬הוספו כמויות עולות ש ל‬
‫‪RNA P‬שעבר טרנםקריפציה בין‪-7248‬ל‬
‫)‪(72‬‬
‫‪32‬‬
‫ההרוויה מוסגת כאסר‬
‫‪-7‬ל‬
‫; ‪4‬‬
‫ל‬
‫)‬
‫כ‬
‫‪8‬‬
‫ל‬
‫‪3‬‬
‫‪4‬‬
‫‪3‬‬
‫‪22.400‬‬
‫דוגמא הכילה‬
‫‪.‬‬
‫‪A‬‬
‫לכמות קבועה ס ל‬
‫‪ 1,45‬אחוז מן ה‪ DNA -‬עברו הברידיזציה‪ ,,‬כלומר בתקופה הנידונה‬
‫‪ 2‬אחוזים מן הגנום פעילים‬
‫‪N‬‬
‫שעות נביטה‬
‫‪.DNA‬‬
‫‪ D‬י מעובר חיטה עם‬
‫‪-0.6x1.45‬‬
‫)‪(72‬‬
‫‪nvivo)2‬‬
‫‪P‬‬
‫‪2‬‬
‫‪3‬‬
‫‪i‬‬
‫(‬
‫‪. R N A‬‬
‫‪ DNA‬וכמויות הולכות וערלות‬
‫כ ל ד ^ ־ א הכילה ‪ 10‬מיקרוגרם‬
‫)‪(0—0‬‬
‫שעבר טרנםקריפציה בין ‪ 48‬ל ‪ 7 2 -‬שעות נביטה‬
‫ס ל )‪RNA (72‬‬
‫‪.(cpnyVg‬‬
‫(‬
‫‪x‬‬
‫)‬
‫—‬
‫‪x‬‬
‫‪cpn/‬‬
‫‪9‬‬
‫‪ 2‬מיקרוגרם‬
‫‪.(g^6.700‬‬
‫‪ DNA‬וכמויות עולות ש ל‬
‫)‪{12‬‬
‫‪RNA P‬‬
‫‪32‬‬
‫‪- 65 -‬‬
‫בנסרי‬
‫‪35‬‬
‫בעובר‬
‫הבלתי‬
‫ה ו ש ו ו ‪ Ytf‬כ ל ו ס י ׳ ו ת • י ה מ ס ג‬
‫בן‬
‫יבש‪,‬‬
‫מעוברים‬
‫בני‬
‫שסוגי‬
‫מםנגיר‬
‫המסג'‬
‫סהיתה‬
‫הפםקנה‬
‫וחלק‬
‫‪,24‬‬
‫מ ס ו מ ן ‪.‬העובר‬
‫בן‬
‫‪24,0‬‬
‫קימת‬
‫פקביל‬
‫שעוח־נ־ביטה‪.‬‬
‫ו‪72-‬‬
‫מן‬
‫‪ !72‬כ‪.‬־‪80$‬‬
‫ו‪48-‬‬
‫תרשים‬
‫פתבקשת‬
‫חדש‬
‫‪48‬‬
‫שעות‬
‫הופיעו‬
‫קודם‬
‫כ י חלק‬
‫לגדלו‬
‫בין‬
‫התל‬
‫‪48‬‬
‫בפעולתו‬
‫ב‪50-‬‬
‫שגודל‬
‫שהיה‬
‫)‬
‫ההברידיזציה‬
‫הפםופן של‬
‫אחוז‬
‫ל‪ 72-‬ש ע ו ת‬
‫מכיון‬
‫הגנום‬
‫ב י נ ם ו י'‬
‫ההבריד‬
‫הרחיק רק‬
‫לכן‪.‬‬
‫פן‬
‫הקיפוח‪.‬‬
‫)‪RNA (72‬‬
‫מאותו‬
‫נביטה‬
‫התחרותית‬
‫ההבריד‪.‬‬
‫וסוגים‬
‫אינם‬
‫אלו‬
‫י‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫ה‪-‬‬
‫הגנום‬
‫ה פ ע י ל ג?א‬
‫‪48‬‬
‫שעות פסק‬
‫מלפעול )‬
‫עד‬
‫שעות‬
‫‪72‬‬
‫הקר‬
‫על‬
‫ז ה י ם עם חלק‬
‫פ־־‪24‬‬
‫הרי‬
‫‪(switch off‬‬
‫_‬
‫‪F.‬‬
‫‪I‬‬
‫‪L‬‬
‫‪1‬‬
‫>‪a‬‬
‫‪a.‬‬
‫‪I‬‬
‫‪1‬‬
‫‪I‬‬
‫‪2‬‬
‫‪3‬‬
‫‪4‬‬
‫‪5‬‬
‫‪6‬‬
‫‪7‬‬
‫‪Ratio u n l a b e l l e d R N A t 0 7 2 h stage P ^ R N A‬‬
‫תפונה‬
‫‪35‬־‪:‬‬
‫הסואת‬
‫פיקרוגרס‬
‫)‬
‫אוכלוםיות‬
‫הפםנגיר‬
‫‪10‬‬
‫‪( c p m / n g‬‬
‫‪11.730‬‬
‫מסומן‬
‫הנוצרות‬
‫‪ NA° ,‬פ י ק ר ו ג ר ם )‪(72‬‬
‫ו כ פ ו י ו ת ה ו ל כ ו ת ו ע ו ל ו ת של‪RNA‬‬
‫שהוכן‬
‫מעוברים‬
‫יבשים‪,‬‬
‫בני‬
‫שעות‬
‫נביטה‪.‬‬
‫מעוברים‬
‫‪72‬‬
‫בשלבי‬
‫נביטה‬
‫ש ו נ י ם של‬
‫מעוברים‬
‫בני‬
‫‪,24‬‬
‫מעוברים‬
‫ענברי‬
‫‪P‬‬
‫כללי‬
‫בני‬
‫‪48‬‬
‫החיטה‪.‬‬
‫‪RNA‬‬
‫‪32‬‬
‫בלתי‬
‫או‬
‫כך‬
‫פאוכלוםית‬
‫‪(switch on‬‬
‫‬‫‪I‬‬
‫‪RNA‬‬
‫התוצאות‪,‬מצביעות‬
‫השתנה‬
‫פעיל עד‬
‫הרחיק‬
‫?בעוד‬
‫ה‪-‬‬
‫‪BMk‬‬
‫‪-‬‬
‫פרק‬
‫כל‬
‫‪:‬‬
‫‪ 66‬־‬
‫השפעת הדהידרציה על עובר החיטה הנובט‬
‫ה נ ס ו י י ם ה מ ת ו א ר י ם בפרק זה נעשו ב ע ו ב ר י ם ש נ ב ט ו צ מ ו ד י ם אל ה א נ ד ו ם פ ר ם‬
‫וניתקו‬
‫בעזרת מלקט ל פ נ י בדיקתם ה ס ו פ י ת ‪ .‬ט י פ ו ל י ה י י ב ו ש וההרטבה המחודשת נעשו אף הם ב ז ר ע י ם השלמים‪.‬‬
‫כדי‬
‫ל מ נ ו ע הבדלים ש ו נ י ם שמקודם באלה ה ק י י מ י ם ב י ן פרטים ש ו נ י ם ב א ו כ ל ו ם י ה ‪ ,‬נעשו‬
‫ביחידות‬
‫נ ס י ו נ י ו ת של לא פחות פ ‪ 5 0 -‬ע ו ב ר י ם ‪ .‬ה ת ו צ א ו ת חושבו ברב ה נ ם ו י י ם ע ב ו ר ‪ 50‬ע ו ב ר ‪ .‬כמתואר‬
‫בהקדמה‪ ,‬עברו‬
‫)‪(1‬‬
‫הבדיקות‬
‫ה ע ו ב ר י ם ט פ ו ל י הרטבה‬
‫ו י י ב ו ש ש ו נ י ם שיצרו ‪ 3‬מצבים‪:‬‬
‫ע ו ב ר י ם ש ג י ד ו ל ם ת ק י ן והם ב נ י ‪ 24‬שעות או ‪ 72‬ש ע ו ת ‪.‬‬
‫ה נ ת ו נ י ם המתארים את ה מ א ו ר ע ו ת‬
‫המתרחשים בעת נ ב י ט ת ה ע ו ב ר י ם ה ל ל ו נ א ס פ ו בפרק א י ‪.‬‬
‫)‪(2‬‬
‫ע ו ב ר י ם שעברו‬
‫י י ב ו ש במשך ‪ 48‬שעות ב ש ו ו י משקל עם אטמוספירה בלחות יחסית ס ל ‪. 1 5 $‬‬
‫בקרת שגרתית של מהלך ההתיבשות נעשתה בעזרת ה י ג ר ו ג ר ף מתוצרת‬
‫)‪(3‬‬
‫עוברים שנבטו‪,‬‬
‫יובשו‬
‫‪J,‬‬
‫‪Asa‬‬
‫ו ה ו ר ט ב ו מחדש לפשר ‪ 24‬ש ע ו ת ‪ .‬ההרטבה המחודשת נעשתה ב ת נ א י‬
‫הנבטה ר ג י ל י ם כמתואר בפרק ה ש י ט ו ת ‪.‬‬
‫‪.1‬‬
‫ו‬
‫הסתכלות ב מ י ק ר ו ס ק ו פ א ל ק ט ר ו נ י בתאי ע ו ב ר י ם שעברו ד ה ד ר צ י ה‬
‫האם ה י י ב ו ש של ע ו ב ר י החיטה ג ו ר ם להדם מ כ נ י של ה מ ב נ י ם התת ת א י י ם ?‬
‫מ ה ו ה א ל ק ט ר ו ן פ י ק ר ו ג ר ף פ י צ ג של תא מ ע ו ב ד ; ‪. ( 2 4 - 4 8‬‬
‫מכווץ‪,‬‬
‫החלבון‬
‫ממברנת ג ר ע י ן )‪Nm‬‬
‫הן‬
‫וכמוהו‬
‫‪,12‬‬
‫( מ כ ו ו צ ת ; ה מ מ ב ר נ ו ת של ה מ ט ו כ ו נ ד ר י ה ) ‪M‬‬
‫מ ו פ י ע י ם א י ז ו ר י ם ם מ י כ י ‪ -‬א ל ק ט ר ו נ י ם ו כ ה י ם ) ‪, ( ED‬‬
‫ה ג ר ע י נ ו ן ‪ .‬ב ת פ ו נ ה ‪,b 36‬‬
‫האיזורים‬
‫ה ת ו פ ע ו ת ה א ו פ י נ י ו ת ה ן ‪ :‬ד ו פ ן תא)‪(CW‬‬
‫א ‪ -‬ט ו נ י ו ת ‪ .‬בולטת ב מ י ו ח ד הופעה ה ר ט י ק ו ל ו ם ה א נ ד ו פ ל ם מ ת י )‬
‫הציטופלםפה‬
‫הכהים ב צ י ט ו פ ל ס מ ה ) ‪(ED‬‬
‫‪ . (13‬ת מ ו נ ה ‪c 36‬‬
‫הנראים ב‪a 36-‬‬
‫‪.‬‬
‫פראה כ ל ל י של תאי‬
‫ת מ ו נ ה ‪36‬‬
‫‪a‬‬
‫(‬
‫וגופיפי‬
‫‪ , ( ER‬ב ת ו ך‬
‫ה ג ר ע י ן נשאר שלם ו ב ה י ר‬
‫ע ו ב ר ) ‪ . ( 2 4 - 4 8 - 2 4‬בולטת הופעת‬
‫ו נ ו כ ח ו ת ה ר ם י ק ו ל ו ם בהשואה לתאי הבקרת‬
‫)תמונות‬
‫מ י צ ג ת תא של ע ו ב ר ב ן ) ‪ . ( 7 2 - 4 8‬התאים ד ו מ י ם בהופעתם ל א ל ו‬
‫ה ג ר ע י נ י ם נ ר א י ם שלמים‬
‫ומכווצים‪.‬‬
‫ד ו פ ן התא )‬
‫‪ (CW‬מ כ ו ו ץ אך‬
‫ ‪- 67‬‬‫לא‬
‫הציטופלסמה‬
‫ריבוזוםים‬
‫דופה‬
‫רטיקולום‬
‫הבולטות‬
‫וברב‬
‫נקרעה‬
‫ומיטוכונדריה‪.‬‬
‫אנדופלסמתי‬
‫התאים‬
‫)‪ER‬‬
‫(‪.‬‬
‫הפראה‬
‫לזה‬
‫ביותר;‬
‫אופיני‬
‫גם‬
‫שבו‬
‫כאן‬
‫גופי‬
‫‪36‬‬
‫‪56‬‬
‫שלא‬
‫‪,‬‬
‫הכהים‬
‫סל‬
‫עובר‬
‫בן‬
‫חלקו‬
‫פגיע‬
‫למצב‬
‫סל‬
‫וקרופי‬
‫בעצפה‬
‫פופיעים‬
‫בגרעין‬
‫)‬
‫כזו‬
‫ותוכנם‬
‫‪(Nm‬‬
‫הגרעין‬
‫ממברנת‬
‫ספוך‬
‫הדו‬
‫אל‬
‫שכבתית‬
‫ציטופלסמה‬
‫בציטופלסמה‬
‫ורטיקולום‬
‫שנפגעו‪,‬‬
‫)‪.(72-48-24‬‬
‫פיטוכונדריה‬
‫הגרעין‬
‫לראות‬
‫האיזורים‬
‫תאים‬
‫אולם‬
‫(‬
‫לעיתים‬
‫פשפסים‬
‫נזקו‬
‫את‬
‫)‬
‫הופעת‬
‫מיצגת‬
‫‪a‬‬
‫חלבון‬
‫ממברנת‬
‫ניתן‬
‫בולטת‬
‫‪,‬‬
‫שבתפונה‬
‫בתאים‬
‫קרועה‬
‫בתוך‬
‫גם‬
‫תפונה‬
‫וריבוזומים‪,‬‬
‫הגרעינים‬
‫גרעין‬
‫ממנו‪.‬‬
‫הוקואולה‬
‫‪V‬‬
‫מופיעים‬
‫קרעי‬
‫ציטופלסמה‬
‫בערבוביה‪.‬‬
‫איזורים‬
‫שלמה‬
‫תופעות‬
‫כהים‬
‫בחלקו‬
‫בחלק‬
‫שהתפוררה‬
‫‪2‬‬
‫הציטופלסמה‪.‬‬
‫עם‬
‫בלתי‬
‫תפונה‬
‫האתר‬
‫מן‬
‫קרעי‬
‫‪-‬‬
‫הן‬
‫רגולריים‪,‬‬
‫פתארת‬
‫‪e 56‬‬
‫וקרועה‬
‫בחלקו‬
‫השני‪.‬‬
‫התצפית‬
‫בסיכום‬
‫הייבוש‬
‫בעוברים‬
‫הדופן‬
‫לאחר‬
‫דרגות‬
‫עצמו‬
‫בני‬
‫הרם‬
‫אינו‬
‫והופעת‬
‫המחודסת‬
‫*זונות‬
‫גורם‬
‫האלקטרוני‬
‫לשנויים‬
‫השנויים‬
‫)‪.(72-48‬‬
‫והקרומים‬
‫ההרטבה‬
‫במיקרוסקופ‬
‫שאפשר‬
‫רטיקולום‪.‬‬
‫חוזרים‬
‫שהבולטת‬
‫תאי‬
‫ביניהם‬
‫כל‬
‫סטרוקטורלים‬
‫לציינם‬
‫זאת‬
‫העובר‬
‫היא‬
‫ניתן‬
‫לומר‪:‬‬
‫בולטים‪,‬‬
‫הן‬
‫בעוברים‬
‫הם‬
‫הופעת‬
‫איזורים‬
‫בעובר‬
‫העמיד‬
‫לדהידרציה‬
‫העמיד‬
‫קריעת‬
‫למצבם‬
‫ממברנת‬
‫הרגיל‪,‬‬
‫הגרעין‬
‫בעוד‬
‫כהים‬
‫בני‬
‫בציטופלסמה‬
‫כבעובר‬
‫סתאי‬
‫ושפיכת‬
‫)‪(24-48‬‬
‫התכוצות‬
‫הרגיש‪,‬‬
‫לעומת‬
‫רגיש‬
‫מראים‬
‫עובר‬
‫תוכנו‪.‬‬
‫והן‬
‫זאת‬
‫ ‪- 68‬‬‫תמונה ‪36‬‬
‫ ‪- 69‬‬‫תמונה ‪36‬‬
‫ ‪- 70‬‬‫ת מ ו נ ה ‪ :36‬א ל ק ט ר ו ן מ י ק ר ו ג ר פ י ם של תאי ע ו ב ר י חיטה מ ט ו פ ל י ם ‪.‬‬
‫ולאחר מ כ ן ה ו כ נ ו לתצפית ב מ י ק ר ו ס ק ו פ‬
‫העוברים עברו ט י פ ו ל י ם ש ו נ י ם ‪,‬‬
‫האלקטרוני‪.‬‬
‫כ ל התכשירים נקבעו ב־‪ 1$‬ג ל ו ט ר א ל ד ה י ד ‪ ,‬ט ו פ ל ו ב‪ 2$-‬א ו ס מ י ו ם ט ס ר א ו ק ם י ד ‪,‬‬
‫י ו ב ש ו בסדרות א צ ט ו ן ו נ ק ב ע ו ב ו ם ט ו פ ל שעבר פ ו ל י מ ר י ז צ י ה במשך ‪ 40‬שעות‬
‫ב‪.50°-‬‬
‫‪ d‬ת א י‬
‫עובר בן‬
‫‪-‬‬
‫‪ - a‬תאי ע ו ב ר ב ן‬
‫‪ - b‬תאי ע ו ב ר ב ן‬
‫‪ - c‬תאי ע ו ב ר ב ן‬
‫‬‫‪ e‬ת א י עובר ב ן‬
‫‪CW‬‬
‫‪N‬‬
‫‪Nm‬‬
‫‪R‬‬
‫‪M‬‬
‫‪ER‬‬
‫‪x 32,600‬‬
‫הגדלה‪:‬‬
‫)‪(24-48‬‬
‫)‪ (24-48-24‬ה ג ד ל ה ‪x 48.000 :‬‬
‫)‪ (72-48‬ה ג ד ל ה ‪x 42.000 :‬‬
‫‪8000X‬‬
‫)‪ (72-48-24‬הגדלה‪:‬‬
‫)‪ (72-48-24‬ה ג ד ל ה ‪42.000X :‬‬
‫‪P‬‬
‫‪V‬‬
‫ ד ו פ ן התא‬‫ גרעין‬‫‪Ds‬‬
‫ממברנת ה ג ר ע י ן‬
‫‪Nu‬‬
‫ ריבוזומים‬‫‪ED‬‬
‫ מיטוכונדריה‬‫‪ -‬ר ט י ק ו ל ו ם אנדופלםמתי‬
‫‬‫‬‫‬‫‬‫‪-‬‬
‫פלםטיד‬
‫וקואולה‬
‫גוף צפיד‬
‫גרעינון‬
‫א י ז ו ר כהה‬
‫‪1‬‬
‫ ‪- 71‬‬‫פעילות‬
‫‪.2‬‬
‫פרוטיאוליטית‬
‫האם‬
‫•‬
‫חיוניות‬
‫דהדרציה‬
‫עוברים‬
‫לאנדוקציה‬
‫סנזקו‬
‫של‬
‫על‬
‫אנזיפים‬
‫ידי‬
‫לגבי‬
‫פעילות‬
‫לאחר‬
‫ההנבטה‬
‫נערך‬
‫והייבוש‬
‫הפרוטיאוליטית‬
‫הפעילות‬
‫כל‬
‫כנ״ל‬
‫פתוך‬
‫הבדל‬
‫בפעילות‬
‫יותר‬
‫דהדרציה‪.‬‬
‫בעוברים‬
‫על‬
‫קזאין‬
‫הפרוטיאוליטית‬
‫במיצוי‬
‫מפורטת‬
‫אנזימיים‬
‫פעילות‬
‫נראה‬
‫בני‬
‫נמצא‬
‫א‪-‬יפוא‬
‫תקין‬
‫ואלו‬
‫‪24‬‬
‫כי‬
‫כי‬
‫שניזקו‬
‫כל‬
‫על‬
‫תפצית‬
‫פצוי‬
‫הדרוליטיים‬
‫ב‪2-‬‬
‫הפוגעים‬
‫נמצאה‬
‫הבדל‬
‫ידי‬
‫פעילות‬
‫בפעילות‬
‫יובס‪.‬‬
‫רב‬
‫גבוהה‬
‫טעט‬
‫נבחנה‬
‫בםמרוקטורות‬
‫סוגי‬
‫מזו‬
‫פרוטיאוליםית‬
‫חוץ‬
‫‪38‬‬
‫העוברים‪.‬‬
‫עוברים‬
‫שבמצוי‬
‫בני‬
‫ופעילותו‬
‫מלמדת‬
‫פעילות‬
‫)‪.(72-48-24‬‬
‫רגילים‬
‫‪39‬‬
‫מעוברים‬
‫ונוקליאוליטית‬
‫ובני‬
‫בני‬
‫בין‬
‫כי‬
‫ריבונוקליאז‬
‫גם‬
‫נבדקה‬
‫ועוברים‬
‫)‪(72‬‬
‫‪,37‬‬
‫)‪.(72-48-24‬‬
‫הנסוי‬
‫בתמונה‬
‫בתוך‬
‫בתמונה‬
‫פדפנות‪,‬‬
‫נבחנה‬
‫דהדרציה‬
‫מוגברת‪,‬‬
‫הפתואר‬
‫בני‬
‫תוצאות‬
‫‪.37‬‬
‫מעוברים‬
‫ביין‬
‫בנםוי‬
‫התא‬
‫בתמונה‬
‫ע״י‬
‫אנזיפתית‬
‫ועוברים‬
‫פרכיבי‬
‫לתמונה‬
‫במצוי‬
‫דנאז‬
‫פירוק‬
‫ב נ י )‪(72‬‬
‫סנפגעו‬
‫במצוי'מ‪2-‬‬
‫בפעילות‬
‫זו‬
‫הטיפולים‪.‬‬
‫ריבונוקליאז‬
‫הבדל‬
‫את‬
‫בהסבר‬
‫ועוברים‬
‫ריבונוקליאז‬
‫כל‬
‫שהכיל‬
‫כפתואד‬
‫‪72‬‬
‫סל‬
‫בפעילות‬
‫הסערה‬
‫פעוברים‬
‫גם‬
‫כמעט‬
‫בני‬
‫דיאוקםי‬
‫שעות‬
‫אין‬
‫של‬
‫שווה‬
‫תתבטא‬
‫נכונותה‬
‫נבחנה‬
‫עוברים‬
‫אין‬
‫הדרוליטיים‬
‫דהדרציה‪.‬‬
‫פרוטיאולוטית‬
‫אין‬
‫של‬
‫ע״י‬
‫לגידול?‬
‫אנדוקציה‬
‫י‬
‫ונוקליאוליטית‬
‫גורפת‬
‫המוסרית‬
‫דהידרציה‪.‬‬
‫כאן‬
‫בצורה‬
‫סעברו‬
‫)‪.(72-48-24‬‬
‫)‪(24-48‬‬
‫עוברים‬
‫שגידולם‬
‫‪- 72 -‬‬
‫)‪Timetmin.‬‬
‫ת מ ו נ ה ‪:37‬‬
‫פ ע י ל ו ת פ ר ו ט י א ו ל י ט י ת של‬
‫פ*ז‪.‬יי מ ע ו ב ר י ח י ט ה ‪.‬‬
‫‪ 50‬ע ו ב ר י ם פ כ ל נ י ס ו י נ ט ת נ ו בתוך ‪ 10‬פ ״ ל ב ו פ ר ‪ TK‬ב ק ר ‪.‬‬
‫‪ x 5 0 0 0 g (10‬ב צ נ ט ר י פ ו ג ה מ ר ו ו ל ‪.‬‬
‫ההופוגנט םורכז )‬
‫'‪g5000x-10‬ו ה ת ם נ י ן המתקבל‬
‫ב‬
‫התסנין םורכז שנית‬
‫שימש כ מ ק ו ר לבדיקת ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ת י ת ‪ -‬ל ה ל ן " מ צ ו י ‪.‬‬
‫תערובח ה ר י א ק צ י ה בנפח של ‪ 2‬מייל הכילה‪ 1$ :‬ק ז א י ן ‪,‬‬
‫‪ 0.05‬ב ו פ ר ט ר י פ ‪ -11 M KC0.1 - 7.8‬ו‪ pH‬מ ״ ל " מ צ ו י " ‪.‬‬
‫קר‪.‬‬
‫‪TCA‬‬
‫ה ר י א ק צ י ה נערכה ב־‪ 25°‬ו ה ו פ ס ק ה ע ל י ד י ‪ 3‬מ י י ל ‪1 0 $‬‬
‫התערובת ם ו ר כ ז ה ב מ ה י ר ו ת ‪ 5000‬ס ב ו כ י ם לדקה למשך‪ 8.‬דקות‬
‫ו ה ת ם נ י ן ה מ כ י ל ת ו צ ר י ה פ י ר ו ק נקרא ב ס פ ק ט ר ו ט ו ט ו מ ט ר ב א ו ר ך‬
‫‪, ,‬‬
‫גל‬
‫‪.mp.280‬‬
‫‪( 0 — 0‬‬
‫‪ 2‬נ ס ו י י ם עם מ צ ו י מ ע ו ב ר י ם ב נ י ‪ 72‬ש ע ו ת ‪.‬‬
‫‪- A‬‬
‫‪{ A - A‬‬
‫‪2‬‬
‫נ ם ו י י ם עם מ צ ו י מ ע ו ב ר י ם ב נ י‬
‫‪72-48-24‬‬
‫‪.‬שעות‪.‬‬
‫‪- 73 -‬‬
‫‪600‬‬
‫)‪Time (mia‬‬
‫תמונה‬
‫‪:?8‬‬
‫פעילות‬
‫המצוי‬
‫ריבונוקליאוליטית‬
‫הוכן‬
‫כמתואר‬
‫בנםוי‬
‫של‬
‫מצוי‬
‫לבדיקת‬
‫מייל‬
‫בופר‬
‫טרים‬
‫תערובת ה ר י א ק צ י ה בנפח של ‪2‬‬
‫‪M K c l , pH‬‬
‫‪0 . 1 = 7 . 8‬‬
‫נ ת ב צ ע ה ב‪ 25°-‬ו ה ו פ ס ק ה‬
‫הריאקציה‬
‫‪2‬‬
‫‪HC‬‬
‫‪1N‬‬
‫בתיר‬
‫‪50$‬‬
‫כהל‬
‫סורכזה‬
‫באייר‬
‫אתילי‪.‬‬
‫התערובת‬
‫ג ל‬
‫לאחר‬
‫ותוצרי‬
‫‪.280mn‬‬
‫‪0‬‬
‫‪2‬‬
‫הפירוק‬
‫מעוברי‬
‫חיטה‪.‬‬
‫פרוטיאוליזה‪.‬‬
‫הכילה‬
‫‪rRNA‬‬
‫ו‪1-‬‬
‫מייל‬
‫על‬
‫ידי‬
‫‬‫נקבעו‬
‫"מצוי"‬
‫תוספת‬
‫דקות‬
‫‪3‬‬
‫מייל‬
‫ב‪0°‬‬
‫בםקפהרופוטומטר‬
‫תמונה‬
‫‪:59‬‬
‫בדיקת‬
‫‪50‬‬
‫פעילות‬
‫עוברים מכל‬
‫הועבר‬
‫דרך בד‬
‫האנזימתית‪,‬‬
‫גופר‬
‫גליצין‬
‫‪=9.6‬‬
‫סינון‬
‫תערובת‬
‫‪32‬‬
‫עברה‬
‫לתערובת‬
‫בתוך ‪5‬‬
‫ו ה ת ם נ י ן שמש‬
‫הריאקציה‬
‫בנפח‬
‫‪Mg‬‬
‫‪pH‬‬
‫"מצוי"‬
‫מייל‬
‫אינקובציה‬
‫‪ 5‬מייל‬
‫המכיל‬
‫ב‪,37°-‬‬
‫‪10$‬‬
‫קר‪.‬‬
‫‪(10‬‬
‫כפול‬
‫מייל‬
‫‪lmm‬‬
‫מעוברי‬
‫בופר‬
‫כמקור‬
‫‪ 0.3‬מייל‬
‫‪M,‬‬
‫‪.‬‬
‫‪TK‬‬
‫הרסק‬
‫לבדיקת‬
‫הכילה‪:‬‬
‫מרקפתו‬
‫הפעילות‬
‫‪M• 0 . 0 6‬‬
‫אתנול‪,‬‬
‫‪6000cpm/ng()'ng0.5DNA‬פעילותס פ צ י פ י ת‬
‫ו‪0.1-‬‬
‫)‬
‫טיפול‬
‫‪0.3‬‬
‫‪P‬‬
‫הוספו‬
‫דיאוקסיריבונוקליאז‬
‫נטתנו‬
‫במצוי‬
‫חיטה‪.‬‬
‫התמיסה‬
‫‪g‬‬
‫במונה‬
‫נסנזרה‬
‫גז‬
‫לפרקי‬
‫זמן‬
‫‪TCA‬‬
‫‪10‬‬
‫דקות‬
‫‪ x 1 0 , 0 0 0‬ו ה ת ם נ י ן‬
‫נוקליאר‬
‫כ‪70-‬‬
‫מיקרוגרם‬
‫הועבר‬
‫צ׳יקגו‪.‬‬
‫קצובים‬
‫קר‪,‬‬
‫בקור‪,‬‬
‫תלבון‪.‬‬
‫ובתום‬
‫ו‪100-‬‬
‫םורכזה‬
‫לצלוחיות‬
‫התערובת‬
‫הריאקציה‬
‫מיקרוגרם‬
‫פעמיים‬
‫מניה‪,‬‬
‫‪DNA‬‬
‫בסרוול‬
‫יובש‬
‫ונמנה‬
‫ ‪ 75‬־‬‫השנויים‬
‫החלים בתכולת ח ל ב י ז ב ע ו ב ר י חיטה שעברו ד ה ד ר צ י ה‬
‫התיאוריה‬
‫כי‬
‫ה ד ר ו ל י ז ה של ת ל ב ו נ י ם ה י א תופעה כ ל ל י ת בצמחים ה נ ת ו נ י ם למחסור מ י מ‬
‫קנתה לה שביתה בספרות ה פ י ז י ו ל ו ג י ת ) ‪ . ( 2 2 , 1 6‬היש פ י ר ו ק של ח ל ב ו נ י ם ב ע ו ב ר י חיטה‬
‫ב נ ם ו י המסוכם בטבלה ‪ 6‬נ ב ח ן מ א ז ן ה ח ל ב ו ן ב ע ו ב ר י ם‬
‫שעברו‬
‫דהדרציה?‬
‫עוברי‬
‫התיטה ה ו נ ב ט ו בתמיסת ה נ ב י ט ה ו ע ב ר ו‬
‫לאחר ט ח י נ ה בתמיסת ‪TM‬‬
‫החלבון‬
‫יובש‬
‫הופרדו‬
‫הדפנות‪,‬‬
‫הנמצא בהם ה ו ג ד ר ב ח ל ב ו ן משקע‪.‬‬
‫שעברו‬
‫ט י פ ו ל י י ב ו ש והרטבה מחדש כמתואר ב ש י ט ו ת ‪.‬‬
‫ה ג ר ע י נ י ם ‪ ,‬פלםטידים‬
‫ו מ י ט ו כ ו נ ד ר י ה בצנטרפוגה‪.‬‬
‫ה ח ל ב ו ן ה נ ו ה ר ב ת ם נ י ן הושקע עם ה ו מ צ ה ם ו ל פ ו ם ל י צ י ל י ת ‪,‬‬
‫ו נ ק ר א ח ל ב ו ן מ ס י ם ‪ .‬ה ת ם נ י ן ש נ ו ת ר ה כ י ל אה מקטע ה ח נ ק ן המסים‪ .‬בחלק מ ן‬
‫ה ח ל ב ו ן בשיטת ק ל ד ה ל ‪,‬‬
‫ובתלקו‬
‫ב ע ו ב ר י ם אסר ה ו נ ב ט ו ‪ 24‬שעות‬
‫דהידרציה‪.‬‬
‫ה נ ם ו י י ם נקבע‬
‫נבדק גם ב א נ ל י ז ה ח נ ק ן ‪ .‬התוצאה ה ח ו ז ר ת ה י א כמסוכם בטבלה ‪:6‬‬
‫) ע ו ב ר י ם ע מ י ד י ם ( לא חל ש נ ו י בכמות ה ח ל ב ו נ י ם במקטעים‬
‫ה ש ו נ י ם גם לאחר י י ב ו ש ם והרטבתם המחודשת‪ .‬ב ע ו ב ר י ם ב נ י ‪ 72‬שעות ) ע ו ב ר י ם ר ג י ש י ם ( לא גרמה‬
‫הדהידרציה‬
‫ל ש ו ם ' פ י ר ו ק של ח ל ב ו ן‬
‫ו ר ק לאחר הרטבה מחודשת חל פ י ר ו ק ח ל ק י של ה ח ל ב ו ן המסים‪.‬‬
‫ו‬
‫כמות ה ח ל ב ו ן במקטע המשקע אף עלתה מ ע ט ‪,‬‬
‫בניגוד‬
‫כ נ ר א ה כתוצאה מ א ר ג ר ג צ י ה ‪.‬‬
‫ל ת י א ו ר י ו ת לא נמצא א י פ ו א פ י ר ו ק ח ל ב ו נ י ם ב ע ו ב ר י תיטה שעברו ד ה ד ר צ י ה ‪.‬‬
‫‪- 76 -‬‬
‫טבלה‬
‫‪ - 6‬השינויים החלים בבמות החלבון בעוברי חימה שעברו דהידרציה‬
‫חלבוני‬
‫נם ו י‬
‫מ ״ ג ‪/‬‬
‫עובר‬
‫עובר‬
‫‪50‬‬
‫מ״ג‬
‫ש'‬
‫‪4.46‬‬
‫‪6.05‬‬
‫‪23.52‬‬
‫‪ 24-48‬ש ׳‬
‫‪4.50‬‬
‫‪6.20‬‬
‫‪23.48‬‬
‫‪ 24-48-72‬ש '‬
‫‪4.'45‬‬
‫‪6.70‬‬
‫‪23.95‬‬
‫‪24.‬‬
‫ש'‬
‫‪24.5‬‬
‫‪19.4‬‬
‫‪72.10‬‬
‫‪ 72-48‬ש '‬
‫‪23.6‬‬
‫‪22.6‬‬
‫‪85.0‬‬
‫‪ 72-48-24‬ש ׳‬
‫‪25.1‬‬
‫‪12.8‬‬
‫‪71,4‬‬
‫‪72‬‬
‫עוברים מכל‬
‫‪50‬‬
‫דקות‬
‫‪20‬‬
‫ונשמר‬
‫הנותר‬
‫סורכז‬
‫טיפול‬
‫דקות‬
‫‪10‬‬
‫מקטע‬
‫הובא‬
‫זה‬
‫הכיל‬
‫ל ר כ ו ז של‬
‫במהירות‬
‫בחלבון‬
‫מסים‪.‬‬
‫התםנין‬
‫שנותר‬
‫נשמר‬
‫ב‪-20°-‬‬
‫נמוכים‬
‫והרכבות‬
‫התנקן‬
‫ניר‪,‬‬
‫הרכב‬
‫בנוסף‬
‫תומצות‬
‫הרכב‬
‫תנקניות‬
‫החלבון‬
‫המסים‬
‫חומצות‬
‫במשקע‬
‫הוערך‬
‫בתלק‬
‫לבדיקת‬
‫האמינו‬
‫הנשארים‬
‫של‬
‫המשקע‬
‫נשטף‬
‫חומצית‬
‫של‬
‫התוצאות‬
‫‪S -100‬‬
‫ארגינין‬
‫אחרות‪.‬‬
‫מן‬
‫המשקע‬
‫גרעינים‪,‬‬
‫םבובים‬
‫ומכיל‬
‫נשטף‬
‫לדקה‪.‬‬
‫החלבון‬
‫המסים‬
‫הדוגמאות‬
‫יובש‬
‫מטים‪-‬חומצות‬
‫נבדק‬
‫ומיטוכונדריה‪.‬‬
‫אמינו‬
‫בשיטת‬
‫פפטידים‬
‫קולדהאל‬
‫חומצות‬
‫ונשמר‬
‫והריבוזומליים‪.‬‬
‫חפשיות‪,‬‬
‫באנליזר‬
‫ב א נ ל י ז ר של‬
‫ב‪0°-‬‬
‫בליופיליזר‬
‫הציטופלםמתיים‬
‫גם‬
‫בםרוול‬
‫ליופיליזציה‬
‫ולאתר ה צ י שעה‬
‫המשקע‬
‫נבדקו‬
‫עבר‬
‫פרופלםטידים‪,‬‬
‫החלבונים‬
‫תנקן‬
‫‪,‬‬
‫פעמיים‪,‬‬
‫סולפו‪-‬םליצילית‬
‫ב ע י ק ר את‬
‫בכל‬
‫חנקן‬
‫אמינו‬
‫בעוברי‬
‫חיטה‬
‫שעברו‬
‫הציטופלםמתיים‬
‫נבדק‬
‫בעוברים‬
‫העוברים‬
‫נטתנו‬
‫ומשפה‬
‫‪S-100‬‬
‫הופק‬
‫הושקעו‬
‫בעזרת‬
‫חומצה‬
‫סולפו‬
‫םליצילית‬
‫סולפו‬
‫תומצות‬
‫בטבלה ‪7‬‬
‫מ‪ 2.4-‬ל־‪4.5‬‬
‫הצימופלםמתי‬
‫החלבוני•‬
‫חומצה‬
‫ו כ ר ו מ ט ר ג ר פ י ה של‬
‫המסוכמות‬
‫‪3$‬‬
‫והחלבון‬
‫החלבון‬
‫האמינו‬
‫פ ע מ י י ם עם‬
‫ת'‬
‫^^‪SMn‬‬
‫וםורכזו‬
‫במשך‬
‫וכרומטוגרפית‬
‫הקלדהאל‪.‬‬
‫)‪ (72-48‬ו‪.(72-48-24)-‬‬
‫במשפה‬
‫מכיל‬
‫תמיסת‬
‫לדקה‪.‬‬
‫דפנות‪,‬‬
‫‪10,000‬‬
‫מקטע‬
‫מייל‬
‫ב‪10-‬‬
‫םבובים‬
‫זה‬
‫הפרקציות‪.‬‬
‫של‬
‫נטחנו‬
‫ב מ ה י ר ו ת ‪13,500‬‬
‫כ״משקע"‪.‬‬
‫התםנין‬
‫‪.4‬‬
‫המשקע‬
‫‪50‬‬
‫חלבונים‬
‫מ ״ ג ‪/‬‬
‫מסיסים‬
‫ם״ה‬
‫‪6.25 x N‬‬
‫אמינו‬
‫ב‪-‬‬
‫על‬
‫כך‬
‫מצביעות‬
‫אחוז‪.‬‬
‫םליצילית‬
‫בדורי יבי‬
‫רק‬
‫ויובש‪.‬‬
‫‪ 3‬מ״ג‬
‫דהדרציה‬
‫בני‬
‫כמתואר‬
‫בשיטות‪.‬‬
‫ברכוז‬
‫חלבון‬
‫‪72‬‬
‫שעות‬
‫סופי‬
‫נלקחו‬
‫החלבונים‬
‫של‬
‫‪,3$‬‬
‫להדרוליזה‬
‫‪Beckman Amino Acid Analyser‬‬
‫שבעקבות‬
‫שנוי‬
‫הדהדרציה תלה‬
‫קצוני‬
‫בהרכבם של‬
‫עליה‬
‫בתכולה‬
‫התלבוני•‬
‫היחמיח‬
‫יתבטא‬
‫בהרכב‬
‫בשנוי‬
‫חומצות‬
‫טבלה‬
‫"‬
‫ך‬
‫י‬
‫חומצות‬
‫האמינו‬
‫האמינו‬
‫עדיין‬
‫אין‬
‫החלבון‬
‫של‬
‫פירושו‬
‫הכללי‪,‬‬
‫של דבר‬
‫שהרכב‬
‫ ה ר כ ב ח ו מ צ ו ת ; ‪ .‬י מ י נ ו של ה ח ל ב ו ן‬‫^‬
‫—‬
‫חומצה‬
‫ט י‬
‫פ‬
‫ול‬
‫‪72‬‬
‫א מ י נ י י ז ד ‪^ — -‬‬
‫ליזי ן‬
‫ו ג ם אם‬
‫לא‬
‫אוכלוםית‬
‫הציטופלסמתי‬
‫חל‬
‫שנוי‬
‫החלבונים‬
‫לא‬
‫היחסי‬
‫נשתנה‪.‬‬
‫בעוברי חיםה‬
‫‪ 72-48‬ש ׳‬
‫ש'‬
‫בהרכב‬
‫‪ 72-48-24‬ש '‬
‫‪6.10‬‬
‫‪6.40‬‬
‫‪6.15‬‬
‫היםטידין‬
‫‪1.84‬‬
‫‪1.91‬‬
‫‪1.42‬‬
‫אמוניה‬
‫‪7.91‬‬
‫‪8.25‬‬
‫‪8.30‬‬
‫ארגינין‬
‫‪2.41‬‬
‫‪4.50‬‬
‫‪4.05‬‬
‫‪10.10‬‬
‫‪9.94‬‬
‫‪9.85‬‬
‫טריאונין‬
‫‪5.04‬‬
‫‪4.67‬‬
‫‪4.75‬‬
‫מרין‬
‫‪5.53‬‬
‫‪5.67‬‬
‫‪6.38‬‬
‫‪10.15‬‬
‫‪10.00‬‬
‫‪10.00‬‬
‫פרולין‬
‫‪4.72‬‬
‫‪4.50‬‬
‫‪4.80‬‬
‫גליצין‬
‫‪8.00‬‬
‫‪8.20‬‬
‫‪7.70‬‬
‫אלני ן‬
‫‪8.80‬‬
‫‪8.80‬‬
‫‪8.70‬‬
‫ולין‬
‫‪7.10‬‬
‫‪6.65‬‬
‫‪7.05‬‬
‫‪2.10‬‬
‫‪1.96‬‬
‫‪1.86‬‬
‫‪4.66‬‬
‫‪4.60‬‬
‫‪4.55‬‬
‫לויצין‬
‫‪8.38‬‬
‫‪8.24‬‬
‫‪8.05‬‬
‫טירוזי ן‬
‫‪2.75‬‬
‫‪2.78‬‬
‫‪2.64‬‬
‫‪5.38‬‬
‫‪3.72‬‬
‫‪3.62‬‬
‫אםפרטית‬
‫ח‪.‬‬
‫גלוטמיח‬
‫ח‪.‬‬
‫מתי ו נ י ן‬
‫אי‬
‫ז‬
‫ן — ל ן י‬
‫פנ י ל‬
‫‪50‬‬
‫צ‬
‫י ן‬
‫אלנ י ן‬
‫עוברי‬
‫חיטה מכל‬
‫טיפול‬
‫נטתנו‬
‫םבובים‬
‫מייל‬
‫ב‪10-‬‬
‫ם ר ו ו ל ב מ ה י ר ו ת ‪13.500‬‬
‫ב מ ה י ר ו ת ‪ 40,000‬ם ב ו ב י ם ל ד ק ה ‪ .‬ל ת ס נ י ן‬
‫ב ם ר ו ו ל ל מ ש ך ‪ 10‬ד ק ו ת ב מ ה י ר ו ת ‪10,000‬‬
‫‪10‬‬
‫מייל‬
‫חומצית‬
‫‪3$‬‬
‫םולפוםליצילית‪,‬‬
‫‪1-2N UC6‬‬
‫ההידרוליזט‬
‫נבדק‬
‫לדקה‬
‫יובש‬
‫‪.‬ב‪110°-‬שעות‪24‬ב מ ש ך‬
‫במשך‬
‫תמיסת‬
‫‪20‬‬
‫הנוחר‬
‫םוכרוז‬
‫דקות‪,‬‬
‫הוספה‬
‫םורכז‬
‫ח'‬
‫‪,‬‬
‫לאחר‬
‫התםנין‬
‫השקעה‬
‫בספינקו‬
‫םולפוםליציליח‬
‫םבובים‬
‫לדקה‪,‬‬
‫נלקח‬
‫המשקע‬
‫בליו‪3‬יליזר‪.‬‬
‫מ״ג‬
‫משקע‬
‫חלבוני‬
‫‪3‬‬
‫של‬
‫‪3$‬‬
‫ונשטף‬
‫נלקחו‬
‫בצנטריפוגה‬
‫במשך‬
‫‪120‬‬
‫ולאחר‬
‫פעמיים‬
‫דקות‬
‫םרכוז‬
‫עם‬
‫להידרוליזה‬
‫‪.‬‬
‫‪ Beckman.Amino Acid Analyser‬־‬
‫‪12-^330-1‬‬
‫־ ‪78‬‬
‫חומצות‬
‫הרכב‬
‫א‪.‬‬
‫הרכב‬
‫התומצות‬
‫הרכב‬
‫חומצות‬
‫והיה‬
‫ב‪.‬‬
‫‪50‬‬
‫ענין‬
‫האמיניות‬
‫האמינו‬
‫ידוע‬
‫לדעת באם‬
‫שימהלו‬
‫מאד‬
‫חושבו‬
‫טיפול‬
‫כמיקרומולים‬
‫החופשיות‬
‫תומצות‬
‫בעוברים‬
‫האמינו‬
‫הרטבה‬
‫האפוניה‬
‫בטבלה‬
‫‪9‬‬
‫שיובשו‬
‫והורטבו‬
‫בעוברים‬
‫במגמתם‬
‫מחדש‪.‬‬
‫לאלו‬
‫שתלו‬
‫השנויים‬
‫‪,72‬‬
‫החומצה‬
‫בהרכב‬
‫בעוברי‬
‫צריך‬
‫להמנע‬
‫תוצאות‬
‫מתדש^‬
‫המטופלים‪.‬‬
‫משמוש‬
‫הושקע‬
‫באמינו‬
‫בטבלה‬
‫בעזרת‬
‫אנליזר‬
‫ה א נ ל י ז ה של‬
‫מסוכמות‬
‫בתומצות‬
‫מסומנות‬
‫קיצוניים‪.‬‬
‫החלבון‬
‫לאנליזה‬
‫עוברים‪.‬‬
‫חומצה‬
‫בקמן‬
‫הרכב‬
‫והתוצאות‬
‫חומצות‬
‫‪ .8‬נ צ א כ י‬
‫סולפו‬
‫סה״כ‬
‫האמינו‬
‫של‬
‫)‪.(24-48‬‬
‫האמינו‬
‫למצב‬
‫נראה‬
‫מ‪3.86-‬‬
‫לעומת זאת‬
‫בעוברים‬
‫איפוא כי‬
‫בצמחים‬
‫מאגר‬
‫מיקרומולים‬
‫האםפרטית ה י א‬
‫יובש‪.‬‬
‫תומצות‬
‫הבולטים הם‪:‬‬
‫ל‪1.76-‬‬
‫מיקרומולים‬
‫שנמצאו‬
‫ברמח‬
‫החיטה‬
‫‪ ,‬כלל‬
‫נלקתו‬
‫הדהדרציה‬
‫חומצות‬
‫המים‬
‫בצמחים‬
‫שונים‬
‫)‪.(61‬‬
‫שקדם‬
‫בולטת‬
‫לייבוש‪.‬‬
‫במיותד‬
‫הופעת‬
‫הייבוש‪.‬‬
‫השנויים‬
‫)‪.(72-48-24‬‬
‫שנויים‬
‫והורטבו‬
‫נבדק עקב שתי‬
‫הסיבות‬
‫הבאות‪:‬‬
‫מטבוליים‬
‫ת מ י ס ת ‪TM‬‬
‫ל‪50-‬‬
‫דהדרציה‬
‫לשנויים‬
‫חלים גם‬
‫המשפה‬
‫הוכפל עם‬
‫חוזרת רמת‬
‫שניזוקו על י ד י‬
‫‪ 72‬ל ‪2 . 9 8 -‬‬
‫ועוברים‬
‫עמידים‬
‫החיטה‬
‫האמינו היה‬
‫מייל‬
‫שיובשו‬
‫בעובר בן‬
‫בתכולת‬
‫ב‪5-‬‬
‫שעברו‬
‫כרגיש‬
‫יעברו‬
‫חומצה‬
‫בזמן‬
‫מסוכמים‬
‫חומצות‬
‫אמינית‬
‫מתורשת‬
‫כאלה‬
‫או‬
‫תימה‬
‫בעוברי‬
‫מכבר‬
‫מדגמים מן‬
‫התופשיות‬
‫ההפשית‬
‫מיקרומולים‬
‫הירידה‬
‫נטתנו‬
‫ב ט מ פ ' ש ל ®‪.0‬‬
‫זה‬
‫שנויים‬
‫החפשי‬
‫במאגר‬
‫בעוברי‬
‫החפשיות‬
‫בנסויי‬
‫עוברים מכל‬
‫לאתר‬
‫במאגר‬
‫האנקורפורציה של‬
‫םליצילית‬
‫בני‬
‫האמינו‬
‫החופשי‬
‫י׳‬
‫אחרים‬
‫השנויים‬
‫שגדלו‬
‫ירידה‬
‫בתכולת‬
‫בעובר‬
‫שניזוק על ידי‬
‫מ^קרומולים‬
‫עולה‬
‫שניזוקו‪.‬‬
‫האמינו‬
‫החפסיות‬
‫כ ן‬
‫כמות‬
‫בתנאי‬
‫בעובר בן‬
‫הפרולין‬
‫בולטת‬
‫במאגר‬
‫הופעות‬
‫חומצות‬
‫מחסור‬
‫החומצה‬
‫מים‪.‬‬
‫בעוברים‬
‫הגלוטמית‬
‫יובש‬
‫‪72‬‬
‫מ־‪1.03‬‬
‫מ־‪8.69‬‬
‫)‪.(72-48-24‬‬
‫ל‪1.98-‬‬
‫מיקרומולים‬
‫מיקרומולים‬
‫האמוניה‬
‫האמינו‬
‫רגישים‬
‫בעוברים‬
‫התופשיות‬
‫בעוברים‬
‫)‪(72-48‬‬
‫דומים‬
‫מאד‬
‫‪- 79 -‬‬
‫‪8‬‬
‫טבלה‬
‫‪ -‬השנויים החלים במאגר חומצות האמינו החפשיות עם הייבוש‬
‫פיקרופולים‬
‫עובדים‬
‫ל‪50-‬‬
‫באחוז‬
‫השנוי‬
‫)‪100$‬‬
‫מהבקורת‬
‫‪ L‬ש ׳‬
‫חומצות‬
‫‪24‬‬
‫האמינו‬
‫‪-‬‬
‫היסטידין‬
‫‬‫‪-‬‬
‫אמ ו נ י ה‬
‫ארגינין‬
‫‪0.186‬‬
‫‪0.108‬‬
‫‪0.201‬‬
‫‪0.175‬‬
‫‪24-48-24‬‬
‫ש׳‬
‫‪262‬‬
‫‪1.075‬‬
‫‪-‬‬
‫‪0.283‬‬
‫‪215‬‬
‫‪-‬‬
‫‪185‬‬
‫‪108‬‬
‫‪157‬‬
‫‪0.765‬‬
‫‪1.275‬‬
‫‪2.250‬‬
‫‪1.150‬‬
‫פרולין‬
‫‪0.220‬‬
‫‪0.304‬‬
‫‪0.345‬‬
‫‪158‬‬
‫גליצין‬
‫‪0.115‬‬
‫‪0.250‬‬
‫‪0.135‬‬
‫‪218‬‬
‫‪117‬‬
‫‪0.705‬‬
‫‪1.420‬‬
‫‪1.310‬‬
‫‪202‬‬
‫‪186‬‬
‫גלוטמית‬
‫ת‪.‬‬
‫אלנ ין‬
‫־‪4‬‬
‫לויצין‬
‫לויצין‬
‫אלנין‬
‫עוברים‬
‫‪1‬‬
‫למשך‬
‫נלקחו‬
‫‪.‬‬
‫‪10‬‬
‫לאנליזה‬
‫ליטר‬
‫‪0.045‬‬
‫‪0.225‬‬
‫‪0.089‬‬
‫‪505‬‬
‫‪196‬‬
‫‪0.005‬‬
‫‪0.300‬‬
‫‪0.089‬‬
‫‪0.115‬‬
‫‪0.050‬‬
‫‪0.165‬‬
‫‪0.050‬‬
‫‪8.328‬‬
‫‪4.374‬‬
‫‪3.956‬‬
‫ם ה "כ‬
‫‪50‬‬
‫‪0.040‬‬
‫‪0.040‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‬‫‪-‬‬
‫ט י ר ו ז י ן‬
‫פניל‬
‫‪0.498‬‬
‫‪0.210‬‬
‫‪330‬‬
‫‪140‬‬
‫דקות‬
‫‪0‬‬
‫בקרח‪,‬‬
‫באמינו‬
‫והתוצאות‬
‫מכל‬
‫ונשטפו‬
‫טיפול‬
‫‪M‬‬
‫‪.‬‬
‫ואחרי‬
‫מרכוז‬
‫אצידאנליזר‬
‫חושבו‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫מתיונ י ן‬
‫איזו‬
‫‪-‬‬
‫‪0.150‬‬
‫ולין‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫עקבות‬
‫ציסטין‬
‫‪0.623‬‬
‫‪162‬‬
‫‪102‬‬
‫‪1.675‬‬
‫טריז‬
‫במים‬
‫מזוקקים‪.‬‬
‫מיליגרם‬
‫בםרוול‬
‫תוצרת‬
‫כמיקרומולים‬
‫היטב‬
‫בקמן‪.‬‬
‫חומצה‬
‫שי‬
‫‪-‬‬
‫‪0.605‬‬
‫אספרםית‬
‫(‬
‫‪140‬‬
‫‪0.985‬‬
‫ח‪.‬‬
‫‪T‬‬
‫ש׳‬
‫‪0.071‬‬
‫לי ז י ן‬
‫)‬
‫‪24-48‬‬
‫ש׳‬
‫‪24-48-24‬‬
‫‪48‬‬
‫ש׳‬
‫‪24 -‬‬
‫‪7‬‬
‫=‬
‫ב‪10,000-‬‬
‫על‬
‫העוברים‬
‫גבישי‬
‫םבובים‬
‫העמודות‬
‫אמינית‬
‫‪210‬‬
‫ב‪50-‬‬
‫ב‪5-‬‬
‫פ״ל‬
‫ח ם ו ל פ ו ‪ -‬ס ל י צ י ל י ת‬
‫למשך‬
‫הקצרה‬
‫נטתנו‬
‫‪110‬‬
‫‪10‬‬
‫דקות‬
‫נלקח‬
‫והארוכה כאחת‪,‬‬
‫עוברים‪.‬‬
‫תמיסת‬
‫הוספו‬
‫התםנין‬
‫הועלו‬
‫‪1.5‬‬
‫מ י ל י ­‬
‫­ מ ­‬
‫טבלה ‪9‬‬
‫‪ -‬השנויים החלים במאגר חומצות האמינו החפשיות עם הייבוש‬
‫מיקרומולים ל‪ 50-‬עוברים‬
‫חומצות‬
‫האמינו‬
‫‪ 72‬ש׳‬
‫‪ 7 2 - 4 8‬ש׳‬
‫השגוי‬
‫ב־‪ 72=100$)$‬ש(‬
‫‪72-48‬‬
‫‪ 72-48-24‬ס׳‬
‫‪72-48-24‬‬
‫ליזין‬
‫‪0.692‬‬
‫‪+‬‬
‫היסטידין‬
‫‪0.244‬‬
‫‪+‬‬
‫אמוניה‬
‫‪2.230‬‬
‫‪5.140‬‬
‫‪4-‬‬
‫ארגינין‬
‫‪0.813‬‬
‫‪0.378‬‬
‫‪+‬‬
‫‪2.734‬‬
‫‪1.980‬‬
‫‪70.5‬‬
‫ח‪.‬‬
‫אספרטית‬
‫‪3.860‬‬
‫‪+‬‬
‫‪51.5‬‬
‫טריאונין‬
‫סדין‬
‫‪8.090‬‬
‫‪14.640‬‬
‫‪13.650‬‬
‫‪183.0‬‬
‫‪170.0‬‬
‫‪8.690‬‬
‫‪4.270‬‬
‫‪1.760‬‬
‫‪49.2‬‬
‫‪20.3‬‬
‫פרולי ן‬
‫‪1.030‬‬
‫‪2.985‬‬
‫‪2.450‬‬
‫‪289.0‬‬
‫‪238.0‬‬
‫גליצין‬
‫‪0.847‬‬
‫‪0.990‬‬
‫‪0.613‬‬
‫‪117.0‬‬
‫‪72.5‬‬
‫אלנין‬
‫‪1.548‬‬
‫‪3.960‬‬
‫‪2.400‬‬
‫‪258.0‬‬
‫‪155.0‬‬
‫־‪ 4‬צ י ס ט י ן‬
‫‪0.097‬‬
‫‪0.147‬‬
‫‪0.073‬‬
‫‪151.0‬‬
‫‪75.5‬‬
‫ולין‬
‫‪2.660‬‬
‫‪4.160‬‬
‫‪1.557‬‬
‫‪156.0‬‬
‫‪59.0‬‬
‫מתיונין‬
‫‪0.462‬‬
‫‪0.380‬‬
‫‪0.109‬‬
‫‪83.0‬‬
‫‪23.0‬‬
‫‪2.078‬‬
‫‪2.980‬‬
‫‪0.716‬‬
‫‪144.0‬‬
‫‪34.5‬‬
‫לויצין‬
‫‪2.730‬‬
‫‪3.620‬‬
‫‪0.660‬‬
‫‪134.0‬‬
‫‪24.1‬‬
‫טירוזי ן‬
‫‪0.317‬‬
‫‪0.766‬‬
‫‪0.371‬‬
‫‪240.0‬‬
‫‪117.0‬‬
‫‪0.557‬‬
‫‪0.967‬‬
‫‪0.362‬‬
‫‪174.0‬‬
‫‪64.0‬‬
‫‪33.066‬‬
‫‪45.642‬‬
‫‪31.155‬‬
‫‪131.0‬‬
‫‪93.8‬‬
‫ח‪.‬‬
‫גלוטמית‬
‫איזו‬
‫פניל‬
‫םה״ב‬
‫לויצין‬
‫אלנין‬
‫‪ 50‬ע ו ב ר י ם נ ל ק ח ו מכל ט י פ ו ל ו נ ש ט פ ו היטב ב פ י ם פ ז ו ק ק י ם ‪ .‬ה ע ו ב ר י ם נ ט ח נ ו ב‪ 5-‬מייל תפיסת‬
‫‪ .‬םולפו‪-‬םליצילית‬
‫‪M‬‬
‫ח‬
‫מיליגרם גבישי‬
‫ה ו ס פ ו לפשך ‪ 10‬דקות בקרח‪ ,‬ו א ח ר י ס י ר כ ו ז ב ם ר ו ו ל ב ‪ 1 0 , 0 0 0 -‬ס ב ו כ י ם לפשך ‪ 10‬דקות‪ ,‬נלקח‬
‫ה ת ס נ י ן ל א נ ל י ז ה ב א פ י נ ו א ס י ד א נ ל י ז ר תוצרת ב ק פ ן ‪ .‬על ה ע מ ו ד ו ת הקצרה ו ה א ר ו כ ה כאחת ה ו ע ל ו‬
‫‪ 1.5‬מ י ל י ל י ט ר ו ה ת ו צ א ו ת תושבו כ מ י ק ר ו פ ו ל י ם ח ו פ צ ה א פ י נ י ת ב ‪ 5 0 -‬ע ו ב ר י ם ‪.‬‬
‫‪-‬‬
‫‪.6‬‬
‫‪81‬‬
‫־‬
‫סינתזת החלבונים בעוברי חיטה שעברו דהידרציה‬
‫א‪.‬‬
‫כושר האנקורפורציה של חומצות אמינו‬
‫םינתזת החלבון בעוברי חיטה מטופלים נבדקה על ידי האנקודפורציה של חומצות‬
‫אמינו אל תוך משקע בלתי מטיס בתומצה‪.‬‬
‫‪ 20‬עוברים מכל טיפול עברו אינקובציה‬
‫למשך שעה בתום הטיפול )גידול תקין‪ ,‬ייבוש‪ ,‬או הרטבה מחודשת כמתואר בשיטות(‪,‬‬
‫עם לויצין^‪0‬‬
‫או פניל אלנין^ס‬
‫או תערובת חומצות‬
‫אמינותם‬
‫)‬
‫‪RPH‬‬
‫(‬
‫האנקורפורציה הופסקה ע״י שטיפה עם ‪ M0.05‬איזוטופ קר מתאים וטחינה‬
‫‪ 5$‬כמתואר בהטבר לטבלה ‪.10‬‬
‫‪-TCk2‬‬
‫השמוש במפפר תומצות אמינו בא כדי לבטל תופעות‬
‫המיותרות לאותה תומצה אמינית‪,‬או ארטיפקמים עקב מיהול פנימי‪ ,‬חיוץ‪ ,‬או שוני‬
‫בתדירות‪ .‬את העוברים המיובשימ היה צורך להרטיב לצורך האנקורפורציה‪ .‬בנםויימ‬
‫מעין אלה מוגבלת המדידה בהכרח לשנויים שאינם תוזרים‪ .‬התוצאות המסוכמות בטבלה ‪10‬‬
‫מלמדות כי כושר האנקורפורציה של חומצות האמינו‬
‫יורד‪^0‬ז\־‬
‫‪i n‬‬
‫ב־‪ £0-90$‬מבלי שים‬
‫לב אם העוברים הם עמידים או רגישים לדהדרציה‪ ,‬לעומת זאת‪ ,‬בהרטבה מחודשת של‬
‫עוברים עמידים )‪ ,(24-48-24‬חוזר כושר האנקורפורציה ואף עולה על רמתו הקודמת שלפני‬
‫הדהדרציה‪ .‬הרטבה מחודשת של עוברים רגישים )‪ (72-48-24‬אינה מאפשרת החזרה של למעלה‬
‫מ‪ 60$-‬של כושר האנקורפורציה של עוברים בני )‪ .(72‬בסכום‪:‬‬
‫הפסקת םינתזת החלבון‬
‫היא תופעה כללית בעובדי חיטה שעברו דהדרציה‪ .‬הרטבה מחודשת מאפשרת חזרה לרמה‬
‫התקינה סל םינתזת החלבון בעוברים העמידים )‪ .(24‬בעוברים רגישים )‪ ,(72‬מאפשרת‬
‫הרטבה מחודסת תזרה ל‪ 60-‬אחוז מבושר האנקורפורציה של עוברים בלתי פגועים‪.‬‬
‫‪-82 -‬‬
‫‪10‬‬
‫טבלה‬
‫ אינקורפורציה של חומצות אנ?ינו אל תוך משקע בלתי מסים‬‫בעוברים שלמים‬
‫)‬
‫התוצאות‬
‫טיפול‬
‫חומצה‬
‫‪24‬‬
‫אמינית‬
‫מחושבות‬
‫‪48‬־‪24‬‬
‫*‬
‫ספירות‬
‫‪C‬‬
‫בספירות‬
‫שעות‬
‫לדקה‬
‫לדקה‬
‫אלנין‬
‫לויצין‬
‫תערובת‬
‫‪(RPH‬‬
‫)‬
‫לויצין‬
‫תערובת‬
‫)‪RPH‬‬
‫עוברים‬
‫פוספט‬
‫‪,pH-100^6 . 8‬‬
‫או‬
‫האינקובציה‬
‫אלנין‬
‫קר‬
‫)‪50‬‬
‫נטחנו‬
‫ספירות‬
‫אנקורפו‪-‬‬
‫לדקה‬
‫אלנין‬
‫שעה‬
‫העוברים‬
‫בתוך‬
‫כללית‬
‫והועלו‬
‫במונה‬
‫נצנץ‪.‬‬
‫הגורם‬
‫בנםוייס‬
‫או‬
‫גבי‬
‫‪45,630‬‬
‫‪39-2‬‬
‫‪13,035‬‬
‫‪38.4‬‬
‫‪2279‬‬
‫‪7.6‬‬
‫‪29,300‬‬
‫‪44‬‬
‫‪28,356‬‬
‫‪26.8‬‬
‫‪4163‬‬
‫‪6.9‬‬
‫‪31,350‬‬
‫‪34.8‬‬
‫שעות‬
‫שעות‬
‫‪76,900‬‬
‫‪38.5‬‬
‫‪1090‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪14,718‬‬
‫‪35,775‬‬
‫‪40.5‬‬
‫‪742‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪11,050‬‬
‫‪22.0‬‬
‫‪127,150‬‬
‫‪32.8‬‬
‫‪1915‬‬
‫‪2.4‬‬
‫‪30,878‬‬
‫‪20.1‬‬
‫אנקובציה ב ‪1‬‬
‫סולפט‬
‫מייל‬
‫‪-1|j,c‬‬
‫ו‬
‫החדר‬
‫ובחושך‪.‬‬
‫‪. f ° 5‬‬
‫מיליפור‬
‫ה מ ג ב י ל את‬
‫‪M0.05‬‬
‫סימון המכילה‬
‫^‪C‬‬
‫לויצין‬
‫‪( u M‬‬
‫תמיסת‬
‫)‬
‫‪4‬‬
‫בני‬
‫נשטפו‬
‫התלבון‬
‫מרכיביה‬
‫בופר‬
‫א ו ‪RPH‬‬
‫‪1‬‬
‫םינתזת‬
‫עם‬
‫תערובת‬
‫תוממו‬
‫במנות‬
‫של‬
‫בעובר‬
‫במשך‬
‫בנות‬
‫בתוצאה‬
‫תמיסת‬
‫ח׳‬
‫ק ר א ל י ק ו ו ט י ם‬
‫השונים‬
‫התלבון‬
‫שטיפה‬
‫או‬
‫‪ 0.5‬מייל‬
‫פילטר‪,‬‬
‫םינתזת‬
‫נבתנו‬
‫אחרי‬
‫ל ו י צ י ן ‪,‬‬
‫ואליקווטים‬
‫מעכבים‬
‫‪72-48‬‬
‫‪72-48-24‬‬
‫שעות‬
‫‪20.3‬‬
‫‪ 6‬מייל‬
‫את‬
‫‪-‬רציה‬
‫‪-‬רציה‬
‫‪4772‬‬
‫‪M‬‬
‫הבאים‬
‫אנקורפו‪-‬‬
‫‪.‬‬
‫בטמפרטורת‬
‫על‬
‫הנפגעים‬
‫‪^C‬‬
‫‪1‬‬
‫לדקה‬
‫‪5.3‬‬
‫עברו‬
‫‪0.05‬‬
‫קליטה‬
‫ב‪.‬‬
‫מכל‬
‫*‬
‫‪52,500‬‬
‫סטרפטומיצין‬
‫מייל(‬
‫איתור‬
‫טיפול‬
‫‪g‬‬
‫פניל‬
‫נמשכה‬
‫(‬
‫‪24-48-24‬‬
‫שעות‬
‫‪42‬‬
‫טיפול‬
‫פנ י ל‬
‫ל‪20-‬‬
‫ספירות‬
‫אנקורפו‪-‬‬
‫‪72‬‬
‫אלנ י ן‬
‫עוברים(‬
‫שעות‬
‫רציה‬‫פניל‬
‫ב‪TCA-‬‬
‫‪5$‬‬
‫‪0.05‬‬
‫אמינו‬
‫בני‬
‫‪15‬‬
‫‪0.1‬‬
‫דקות‬
‫)‪0.5‬‬
‫מ״ל‬
‫ב‪-‬‬
‫‪ 4‬מ י י ל ‪TCA °?5‬‬
‫פניל‬
‫‪M‬‬
‫מ״ג‪/‬מ״ל(‬
‫נלקתו‬
‫‪,90‬‬
‫למניה‬
‫קוררו‬
‫קר‪,‬‬
‫בהתאם‪.‬‬
‫של‬
‫ל‪0^-‬‬
‫יובשו‬
‫ונמנו‬
‫מדהדרציה‪.‬‬
‫המערכת‬
‫תיטה‬
‫המםנטזת‬
‫שעבר‬
‫חלבון‪,‬כדי‬
‫דהידרציה‪.‬‬
‫לאתר‬
‫את‬
‫הגורמים‬
‫‪C‬‬
‫‪ I‬התכולה האנדוגנית של ‪sRNA‬‬
‫האם ‪&BNA‬‬
‫של עוברי חיטה שעברו דהידרציה‪.‬‬
‫נפגע בעוברים שעברו התיבשות? הנטוי שתוצאותיו מתוארות בטבלה ‪1 1‬‬
‫נועד לענות לשאלה זו‪ ,‬משפה ‪S - 1 0 0‬‬
‫שיטות‪ .‬תכולת‬
‫‪A‬־‪SRNA‬‬
‫‪1‬‬
‫בהסבר לטבלה ‪. 1 1‬‬
‫ה‪sRNA -‬‬
‫הכללית נבדקה על ידי יכולת הקישור של תערבת חומצות אמינו‬
‫) ‪RPH‬‬
‫רדיואקטיביוח " ^‪C‬‬
‫הופק מעוברים שעברו טיפולי יובש שונים כמתואר בפרק‬
‫( על ידי משפה ‪S - 1 0 0‬‬
‫במערכת טעינה שהרכבה מפורט‬
‫במערכת טעינה הרוויה בחומצות אמינו‪,‬מותנית רמת האצילציה בכמות‬
‫המוסף‪ .‬כבקורת שמשו תערובות ריאקציה אשר משפה ‪ S - 1 0 0‬הוסף אליהן לאחר‬
‫מתן ה‪ , TCA -‬או תערובות ריאקציה שבהן האמינו אציל ‪sRNA‬‬
‫תכולת האמינו אציל‬
‫השוקע ב‪TCA5-‬‬
‫‪3‬‬
‫‪A‬‬
‫‪N‬‬
‫‪R‬‬
‫‪f°‬‬
‫‪ sRNA‬נמדדה בספירות לדקה של חומצה אמינות שעברה קישור לקומפלקס‬
‫ועובר הדרוליזה מלאה‬
‫‪,‬‬
‫ב‪90°-‬‬
‫ל‪ -‬ד ק ו ת ‪ . 1 5‬התכולה היחסית של פניל‬
‫נבדקה אף היא באותה דרךוהתוצאות מסוכמות בטבלה‬
‫הירידה המזערית בכמות ^‪sRNA‬‬
‫הפניל אלניל ‪sRNA‬‬
‫עבר הדרוליזה חומצית‪.‬‬
‫‪.11‬‬
‫הכללי ניכרת גם בעובר העמיד וגם בעובר הרגיש‪ .‬בכמות‬
‫ובכמות הלויציל‬
‫‪ sRNA‬לא חלו שנויים של למעלה » ־ ‪ 1 5‬אחוזים‬
‫ונראה כי אין להניח שפגיעה בתכולה או פעילות של ^ ‪s R N A‬‬
‫בםינטזת החלבון של עוברים שעברו דהידרציה‪.‬‬
‫מהוים את הגורם המגביל‬
‫ ‪- 84‬‬‫‪11‬‬
‫טבלה‬
‫ תכולה פנימית של ‪sRNA‬‬‫חיםה שעברו‬
‫מתוך עוברי‬
‫במשפה ‪S-100‬‬
‫דהידרציה‬
‫) ס פ י ר ו ת לדקה של חומצה א מ י נ ו ת ק ש ו ר ה ( ‪.‬‬
‫פניל‬
‫טיפול‬
‫אלנין‬
‫תערובת‬
‫לויצין‬
‫‪ 2‬ד<‬
‫‪ 5‬דקי‬
‫‪ 15‬ד ק י‬
‫‪1 4‬‬
‫‪ 2‬דקי‬
‫‪ 5‬ד<‬
‫‪ 15‬דקי‬
‫‪RPH C‬‬
‫‪ 15‬ד ק י‬
‫‪24‬‬
‫‪1952‬‬
‫‪2320‬‬
‫‪6392‬‬
‫‪1340‬‬
‫‪2180‬‬
‫‪3025‬‬
‫' > ‪4792-‬‬
‫‪24-48‬‬
‫‪1933‬‬
‫‪3110‬‬
‫‪6470‬‬
‫‪1210‬‬
‫‪2182‬‬
‫‪3360‬‬
‫‪3765‬‬
‫‪24-48-24‬‬
‫‪1966‬‬
‫‪3240‬‬
‫‪6872‬‬
‫‪1417‬‬
‫‪1675‬‬
‫‪2320‬‬
‫‪3620‬‬
‫‪72‬‬
‫‪6200‬‬
‫‪8000‬‬
‫‪11,000‬‬
‫‪3920‬‬
‫‪4800‬‬
‫‪5420‬‬
‫‪11780‬‬
‫‪72-48‬‬
‫‪5890‬‬
‫‪7928‬‬
‫‪9040‬‬
‫‪2443‬‬
‫‪3070‬‬
‫‪4052‬‬
‫‪9678‬‬
‫‪72-48-24‬‬
‫‪5140‬‬
‫‪5650‬‬
‫‪12420‬‬
‫‪2720‬‬
‫‪4720‬‬
‫‪7350‬‬
‫רקע‪ :‬זמן ‪0‬‬
‫‪334‬‬
‫‪369‬‬
‫ב ק ו ר ת ‪ :‬ז פ ן ‪15‬‬
‫ד ק ו ת ‪ +‬ה י ד ר ו ל י זה‬
‫חומצית‪.‬‬
‫‪373‬‬
‫‪110‬‬
‫‪92‬‬
‫‪108‬‬
‫‪1fiM‬‬
‫‪KC10,f!M GTP1,5‬‬
‫מגנזיום‪,‬‬
‫ערובתה א נ ק ו ב צ י ה ‪ -‬בנפח של‬
‫‪ 0 . 5‬א ת נ ו ל ‪,‬‬
‫‪- , n M‬מרקפתו‪ixMATP‬‬
‫קינז‪^ig‬‬
‫פירוביק‬
‫) ‪( | i . c | 0 . 1 g‬‬
‫‪RPH‬‬
‫( ‪1 0 , 1 4 1 1‬‬
‫)נ>‪ic/(.‬אי‬
‫‪MC^0.5‬‬
‫( או ל ו י צ י ן‬
‫‪M‬‬
‫‪1‬‬
‫‪j‬‬
‫שהופק מ ע ו ב ר חיטה מ ן ה ט י פ ו ל י ם ה ש ו נ י ם ‪ .‬ה ר י א ק צ י ה החלה על י ד י‬
‫ו כ ן ‪ 0.4‬מ ״ ל משפה ‪S - 1 0 0‬‬
‫ק ד ‪ .‬לאחר‬
‫‪TCA‬‬
‫‪10$‬‬
‫עברת תערובת ה א נ ק ו ב צ י ה מקרח ל ‪ 3 0 0 -‬לפרק ה ז מ ן ה ד ר ו ס והופסקה ע ל י ד י‬
‫‪ 10‬דקות ב ק ו ר הועברה התערובת ד ר ך מ י ל י פ ו ר פ י ל ט ר ונשטפה היסב עם ‪ 4‬מ נ ו ת של ‪ 5‬מ ל‪TCA‬‬
‫כ ב ק ו ר ת שמשו ד ו ג מ א ו ת מ ז מ ן ‪ , 0‬או‬
‫‪ 5 $‬ק ר ‪ .‬נ י ד ו ת ה מ י ל י פ ו ר י ו ב ש ו ו נ מ נ ו ב מ ו נ ה נ צ נ ץ פקרד‪.‬‬
‫ב ‪ 9 0 ° -‬למשך רבע שעה‪ .‬הספירה‬
‫‪TGA‬‬
‫‪5$‬‬
‫ד ו ג מ א ו ת מ ‪ 1 5 -‬דקות שעברו ה י ד ר ו ל י ז ה ח ו מ צ י ת עם‬
‫‪. C P M‬‬
‫‪350‬‬
‫בבקורת נ ע ה לרב סביב‬
‫‪4‬‬
‫‪1‬‬
‫‪,,‬‬
‫ב ‪ II -‬פ ע י ל ו ת א מ י נ ו א צ י ל‬
‫בנםוי‬
‫כמתואר‬
‫‪sRNA‬‬
‫ם נ ט ט ז ב ע ו ב ר י תימה שעברו ד ה י ד ר צ י ה ‪.‬‬
‫המתואר בטבלה ‪ 12‬נ ב ח ן כ ו ש ר ו של משפה ‪S-100‬‬
‫ב ש י ט ו ת ‪ ,‬ל ה מ ר י ץ א צ י ל צ י ה ס ל ‪sRNA‬‬
‫ה א נ ד ו ג נ י ת של‬
‫‪sRNA‬‬
‫שהופק מ ע ו ב ר י חיטה מ ט ו פ ל י ם‬
‫שהוכן מעוברי חיטה‪ .‬כבקורת לתכולה‬
‫בתםניןןשמשו ד ו ג מ א ו ת ללא‬
‫‪ . sRNA‬מ ן התוצאות נראה ב י א י ן‬
‫בפעילות‬
‫הבדל‬
‫האקטיבציה‬
‫האנזימתית של‬
‫והאצילציה‬
‫אינה‬
‫משפה ‪S - 1 0 0‬‬
‫הגורם‬
‫מעוברים‬
‫המגביל של‬
‫‪ - 12‬פעילות אמינו‪-‬אציל‪-‬‬
‫טבלה‬
‫מ ש פ ה‬
‫כמות‬
‫משפה‬
‫‪0.08‬‬
‫מייל‬
‫שעברו‬
‫םינתזת‬
‫טיפולים‬
‫החלבון‬
‫שונים‪,‬‬
‫בעוברים‬
‫חלבון‬
‫תכולת‬
‫ספירות‬
‫לדקה‪,‬‬
‫תערובת‬
‫חומצות‬
‫אמינו‬
‫‪C‬‬
‫^בתוך‬
‫שעות‬
‫‪24‬‬
‫שעות‬
‫‪24-49‬‬
‫שעות‬
‫‪24-48-24‬‬
‫שעות‬
‫‪72‬‬
‫‪II‬‬
‫שעות‬
‫‪72-48‬‬
‫תםנינים‬
‫‪42‬‬
‫״‬
‫‪52‬‬
‫״‬
‫‪3683‬‬
‫‪48‬‬
‫•י‬
‫‪1928‬‬
‫‪50‬‬
‫״‬
‫‪1982‬‬
‫‪46‬‬
‫‪1832‬‬
‫ללא‬
‫‪166-112‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫ובת‬
‫בנפח של‬
‫האינקובציה‬
‫פוםפו‬
‫מגנזיום>\‬
‫אנול‬
‫)‬
‫לאתר‬
‫‪5$‬‬
‫‪TCA‬‬
‫כבקרת‬
‫עם‬
‫תםנין‪,‬‬
‫ללא!‪&7‬־‪.31‬‬
‫ב‬
‫מנית‬
‫ריבוזומלי‬
‫הריאקציה‬
‫דקות‬
‫שמשו‬
‫ק‬
‫ז‬
‫נ‬
‫‪2‬‬
‫‪»1.51‬‬
‫‪i MATP!0.5,2.5\M‬‬
‫‪,‬‬
‫מרקפתו‪-‬אתנול‪,‬‬
‫‪pc‬‬
‫סנטטז‪.‬‬
‫‪20‬‬
‫י‬
‫הכילה‬
‫‪,‬‬
‫‪1p,MKC10J.MG T P‬‬
‫‪0.14‬‬
‫פוסט‬
‫‪-100‬‬
‫קר‪.‬‬
‫מ״ל‬
‫‪M‬‬
‫פירוביק‬
‫‪RPH‬‬
‫משפה‬
‫‪NA1‬‬
‫‪4750‬‬
‫‪5319‬‬
‫‪II‬‬
‫שעות‬
‫‪72-48-24‬‬
‫בקורת‪:‬‬
‫‪II‬‬
‫אמינ ו ‪ -‬א צ י‬
‫מיקרוגרם‬
‫‪40‬‬
‫‪II‬‬
‫דהידדציה‪.‬‬
‫סנטטז במשפה מעוברי חיטה‬
‫‪sRNA‬‬
‫‪II‬‬
‫והפגיעה‬
‫שעברו‬
‫בכושר‬
‫הועברה‬
‫ניר‬
‫הביקורת‬
‫פעילות‬
‫כושרו‬
‫נ מ ש כ ה ‪10‬‬
‫יובש‬
‫‪clfS‬‬
‫דקות‬
‫בתםנינים‬
‫משפה ‪S - 1 0 0‬‬
‫‪Peptvdil‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫במונה‬
‫התסנין‬
‫ה ס ו נ י ם לא‬
‫במשפה‬
‫שהופק‬
‫כמקור‬
‫ב‪37°-‬י והופסקה ע ל י ד י ‪1‬‬
‫מיליפור‬
‫ונמנה‬
‫ר י א ק צ י ה אשר‬
‫ג ו ר מ י הפולעריזציה‬
‫של‬
‫מהעוברים‬
‫התערובת ע ל ג ב י‬
‫המיליפור‬
‫תערובות‬
‫שהופק‬
‫בנםויים‬
‫השונים‬
‫פילטר‬
‫נצנץ‬
‫הוסף‬
‫עלן!‬
‫ה‬
‫‪S -100‬‬
‫מעוברי‬
‫‪^.‬‬
‫גורמי‬
‫ונשטפה‬
‫מ י י ל‪T C A&/10‬‬
‫פ ע מ י ם עם‬
‫קר‪.‬‬
‫מ נ ו ת של ‪1‬‬
‫מייל‬
‫פקרד‪.‬‬
‫אליהם‬
‫ע‬
‫‪4‬‬
‫לאנזים‬
‫אמינו‬
‫אציל‬
‫ל א ח ר ה ‪A°/10-‬‬
‫ל‬
‫‪166‬‬
‫מעוברי‬
‫חיטה‬
‫חיטה‬
‫מטופלים‬
‫‪1.2221^21^2:121‬‬
‫פולימריזציה‬
‫‪C‬‬
‫‪ ,‬או‬
‫‪T‬‬
‫‪M‬‬
‫‪C‬‬
‫‪P‬‬
‫תערובות‬
‫ראקציה‬
‫‪.‬‬
‫מטופלים‪.‬‬
‫כמתואר‬
‫־״‪sRNA‬‬
‫בשיטות‬
‫‪U‬‬
‫להמריץ‬
‫את‬
‫‪Phenylalanile G‬‬
‫‪SRNH‬‬
‫‪Peptydil‬‬
‫‪- 86 -‬‬
‫נבדק‬
‫או‬
‫במערכת‬
‫א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה עם‬
‫‪40‬‬
‫שהופק‬
‫לפעילות‬
‫"הטרנספר"‬
‫האנקורפורציה‬
‫לא‬
‫במקום‬
‫כמםג'‬
‫סונים‬
‫מספה‬
‫יסרה‬
‫והמכיל‬
‫‪S-100‬‬
‫המסוכמות‬
‫בתוצאה מ ן‬
‫מבלה‬
‫וסטנדרטי‪.‬‬
‫ל פ ע י ל ו ת הפולימריזציה במשפה‪,‬‬
‫הופסקה‬
‫ומערכת‬
‫בטבלה‬
‫‪13‬‬
‫לראות כי‬
‫אפשר‬
‫)מקור‬
‫ספירות‬
‫‪(S-10CK1‬‬
‫‪40‬‬
‫שעות‬
‫‪24-48-24‬‬
‫הפעילות‬
‫האנזימתית‬
‫לדקה‬
‫פ ו ל י מ ר י ז צ י ה של‬
‫משפה‬
‫עבור‬
‫‪160‬‬
‫מיקרוגרם‬
‫‪14,882‬‬
‫‪33,560‬‬
‫‪1747‬‬
‫‪2883‬‬
‫‪6,207‬‬
‫‪1448‬‬
‫‪7049‬‬
‫שעות‬
‫אנקורפורציה‬
‫)‬
‫‪sRNA‬‬
‫דקות‬
‫‪8‬‬
‫כמויות‬
‫אנקובציה‬
‫נמשך‬
‫למבתנות‬
‫םטנדדמית שלא‬
‫שונות סל‬
‫ב‪ -‬־ ‪30‬‬
‫<‬
‫כבמערכת‬
‫בקרת‬
‫‪1‬‬
‫>‬
‫אנקורפורציה‬
‫הוסף‬
‫משפה‬
‫‪109‬‬
‫א‪.‬‬
‫כללה‬
‫משפה‬
‫שעות‪,‬‬
‫מ ש פ ה ‪S -100‬‬
‫הופסקה‬
‫‪S100-‬‬
‫‪10‬‬
‫םטנדרטיח )ראה‬
‫אחרי‬
‫רגיל‬
‫‪ng‬‬
‫שהוכנו‬
‫הריאקציה ע״י‬
‫ה‪S-100-‬‬
‫‪100‬‬
‫‪S -‬‬
‫(‬
‫‪4‬‬
‫^"‪(C‬‬
‫‪200‬‬
‫‪3403‬‬
‫‪102‬‬
‫במערכת‬
‫הקסר‬
‫הפפטידי‬
‫מיקרוגרם‬
‫‪16,233‬‬
‫בקורת‬
‫מטופלים‪.‬‬
‫מופלה‬
‫ביצירת‬
‫פנילאלנין‬
‫‪39,945‬‬
‫שעות‬
‫‪72-48-24‬‬
‫התומכת‬
‫‪14,920‬‬
‫שעות‬
‫שעות‬
‫‪72-48‬‬
‫לאחר‬
‫כמערכת‬
‫ר יאקציה‬
‫‪50‬‬
‫‪20‬‬
‫האנקובציה‬
‫‪46,308‬‬
‫שעות‬
‫‪24-48‬‬
‫בה‬
‫הלינארי‬
‫בו‬
‫הדהידרציה‪.‬‬
‫חלבון‬
‫‪72‬‬
‫בתחום‬
‫״פעילות פולימריזציה בתכנון שהופק מעוברי חיסה״)משפה‬
‫‪-13‬‬
‫נסוי‬
‫‪24‬‬
‫מיקרוגרמים‬
‫הריאקציה‬
‫חלבון‬
‫למבחנה שמש‬
‫כמקור‬
‫רגילה‪.‬‬
‫התוצאות‬
‫נפגעה‬
‫מטיטולים‬
‫פרפורציונית‬
‫אנקורפורציה‬
‫מן‬
‫פולי‪11-‬‬
‫סנטטי‬
‫ופניל‬
‫אלניל‬
‫‪sRNA‬‬
‫ב‪.‬‬
‫הוכללו‬
‫פולי‪-‬ח‬
‫כמתואר‬
‫‪10$‬‬
‫בפרק‬
‫‪g1|39‬‬
‫‪ig.|1‬‬
‫שיטות‬
‫פניל‬
‫שיטות(‪.‬‬
‫אנקובציה‬
‫אלניל‬
‫מעוברי‬
‫‪TCA‬‬
‫ותוספת^!"‬
‫ריבוזומים‬
‫‪.5$‬‬
‫חיטה‬
‫והטיפול‬
‫^‪C‬‬
‫‪1‬‬
‫־‪87‬־‬
‫ב ‪ IV -‬פעילות הריבוזומים בעוברי חיטה שעברו דהידרציה‬
‫האם הדהידרציה פוגעת בריכוזום?‬
‫הניסויים הבאים מיועדים לענות על שאלה זו‪.‬‬
‫פעילותם של הריבוזומים במערכת אנקורפורציה ללא מםנגיר סנטטי מותנית‬
‫ב‪ 2-‬גורמים‪:‬‬
‫כשירות הריבוזומים כיחידת פעילות ונוכחות מםנגיר‬
‫‪ RNA‬פעיל‪ .‬פעילותם‬
‫של הריבוזומים שהופקו מעוברי חיטה מטופלים‪ ,‬נבתנה איפוא במערכת אנקורפורציה סטנדרטית‪.‬‬
‫הריבוזומים שהופקו מעוברי החיטה כמתואר בשיטות‪ ,‬חולקו על מפל םוכרוז והופרדו‬
‫למונוזומים ופוליזומים )ראה נםוי ‪ .(31‬חלק מן המונוזומים עבר טיפול חשיפה )ראה‬
‫טבלה ‪ (4‬והפך לריבוזומים חשופים‪ 3 .‬סוגי הריבוזומים הוכנו מכל טיפול של עוברים‬
‫והוספו בכמות של ‪ 50‬מיקרוגרם למערכת אנקורפורציה סטנדרטית‪ .‬מתוצאות הפעילות האנדוגנית‬
‫המסוכמות בטבלה ‪ 14‬אפשר לראות כי פעילותם האנדוגנית של המונוזומים יורדת ב‪ 75-‬אחוז‬
‫אחרי ייבוש העוברים )‪ .(24-48‬לאחר ההרטבה עולה הפעילות האנדוגנית מחדש‪ .‬הפעילות‬
‫הספציפית של הפוליזומים אינה משתנה כמעט בין הטיפולים של העובר העמיד‪ .‬בעובר רגיש‬
‫יורדת הפעילות האנדוגנית במונוזומים בשיעור שלמעלה מ‪ 90-‬אתוז עם הדהידרציה‪ .‬גם‬
‫הפעילות הספציפית של הפוליזומים יורדת עם הדהידרציה ב־‪ 50$‬בעוברים ‪.(72-48) -‬‬
‫על ידי תוספת פולי‪11-‬‬
‫למערכות האנקורפורציה ניתן להבחין אם הירידה בפעילות‬
‫האנדוגנית היא בגלל פגיעה בריבוזום עצמו‪ ,‬או בגלל פגיעה במסג'‪ .‬התשובה המצויה‬
‫בטבלה ‪ 14‬היא ברורה‪ ,‬בכל הטיפולים יש לריבוזומים כושר פעילות מלא עם פולין‪1‬‬
‫נראה איפוא כי מקום המפגע של הדהידרציה אינו ביכולתו הקטליטית של ה ר י ב ו ז י ‪. p e r 3 6‬‬
‫ם‬
‫־‪88‬־‬
‫טבלה‬
‫‪-14‬‬
‫אנקורפורציה של פניל אלנין במערכת חפשית מתאים‪,‬ע״י ריבוזומים‬
‫מעוברי חיטה‪.‬‬
‫תכשיר‬
‫מונוזומים‬
‫ר י ב ו ז ומים‬
‫פוליזומים‬
‫מונודומים‬
‫ריבוזומים‬
‫פוליזומים‬
‫מקור ה ר י ב ו ז ו מ י ם‬
‫עוברים מטיפול‬
‫פעילות‬
‫אנדוגנית‬
‫‪10(^2‬‬
‫פוליס‬
‫‪ 24‬ש׳‬
‫‪4540‬‬
‫‪146,000‬‬
‫‪ 2 4 - 4 8‬ש'‬
‫‪1200‬‬
‫‪145,000‬‬
‫‪ 24-48-24‬ש'‬
‫‪3300‬‬
‫‪160,000‬‬
‫‪ 24‬ש'‬
‫‪910‬‬
‫‪283,000‬‬
‫‪ 2 4 - 4 8‬שי•‬
‫‪730‬‬
‫‪240,000‬‬
‫‪ 2 4 - 4 8 - 2 4‬ש׳‬
‫‪805‬‬
‫‪238,000‬‬
‫‪ 24‬ש'‬
‫‪4840‬‬
‫‪11,220‬‬
‫‪ 2 4 - 4 8‬ש׳‬
‫‪4420‬‬
‫‪14,850‬‬
‫‪ 2 4 - 4 8 - 2 4‬ש׳‬
‫‪6850‬‬
‫‪11,420‬‬
‫‪ 72‬ש'‬
‫‪3250‬‬
‫‪14,010‬‬
‫‪ 7 2 - 4 8‬ש׳‬
‫‪230‬‬
‫‪10,250‬‬
‫‪ 7 2 - 4 8 - 2 4‬ש׳‬
‫‪405‬‬
‫‪12,550‬‬
‫‪ 72‬ש׳‬
‫‪320‬‬
‫‪37,000‬‬
‫‪ 72-48‬ש'‬
‫‪435‬‬
‫‪31,700‬‬
‫‪ 72-48-24‬ש'‬
‫‪528‬‬
‫‪43,000‬‬
‫‪ 72‬ש'‬
‫‪13,800‬‬
‫‪17,280‬‬
‫‪ 7 2 - 4 8‬ש'‬
‫‪6230‬‬
‫‪16,100‬‬
‫‪ 7 2 - 4 8 - 2 4‬ש׳‬
‫‪12,000‬‬
‫‪21,000‬‬
‫מערכת ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה מתוארת בפרק ש י ט ו ת ‪ .‬ה ג ו ר ם המשתנה במערכת הם ה ר י ב ו ז ו מ י מ‬
‫התכשירים ה ר י ב ו ז ו מ ל י י ם ת ו ל ק ו על ג ב י‬
‫שמקורם ב ע ו ב ר י ם מ ן ה נ ס ו י י ם ה ש ו נ י ם ‪.‬‬
‫מפל ם ו כ ר ו ז ‪ 5 - 2 0 / 0‬ו ק ב ו צ ו ת ה ם ד י מ נ ט צ י ה ה ש ו נ ו ת נ א ס פ ו ‪ .‬ר י ב ו ז ו מ י ם הם מ ו נ ו ז ו מ י ם‬
‫שעברו השיפה ו נ ק ו י מ מ ס ג ' א נ ד ו ג נ י )ראה טבלה ‪ . ( 4‬ה ר י ב ו ז ו מ י ם ה ו ס פ ו בכמות קבועה‬
‫של ‪ 50‬מ י ק ר ו ג ר ם בכל ד ו ג מ ה ‪.‬‬
‫ ‪- 89‬‬‫ג‬
‫ש נ ו י י ם בהרכב א ו כ ל ו ם י ת ה ר י ב ו ז ו מ י ם ב ע ו ב ר י חיטה שעברו‬
‫‪-‬‬
‫דהידרציה‪.‬‬
‫האם א ו כ ל ו ם י ת ה ר י ב ו ז ו מ י ם משנה את הרכבה ה י ח ס י ב ת נ א י מחסור מ י ם ?‬
‫המתוארים‬
‫מעוברים‬
‫ב ת מ ו נ ו ת ‪ 40‬ו ‪ 4 1 -‬מתארים את התשובה לשאלה‬
‫ז ו ‪ .‬תכשיר ר י ב ו ז ו מ ל י‬
‫ר ג י ל הופק‬
‫מ ן ה ט י פ ו ל י ם ה ש ו נ י ם כמתואר בפרק ה ש י ט ו ת ‪ .‬מ ד ג מ י ם ה מ כ י ל י ם כ מ ו ת שוה של‬
‫ריבוזומים‬
‫ה ו פ ר ד ו על מפל ם ו כ ר ו ז כמתואר בשיטות ו ב ה ס ב ר י ם ל ת מ ו נ ו ת ‪ .‬המפל ח ו ל ק ל ־ ‪2 0‬‬
‫מקטעים שהושלמו‬
‫במקביל‬
‫הנםויים‬
‫לנםוי‬
‫ונקראו‬
‫ל‪ 1-‬פ ״ ל עם ב ו פ ר ‪TM‬‬
‫בםקפטרופוטומטר באורך גל‬
‫ז ה ‪ ,‬נ ל ק ח ו כ מ ו י ו ת ש ו ו ת של ר י ב ו ז ו מ י ם מכל ט י פ ו ל ו ה ו ע ב ר ו א נ ק ו ב צ י ה עם‬
‫‪ 0 . 5‬מ י ק ר ו ג ר ם ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ‪ ,‬במשך ‪ 15‬דקות ב ‪ , 2 5 ° -‬ל פ נ י החלוקה על מפל ה ם ו כ ר ו ז ‪.‬‬
‫ה ר י ב ו ז ו מ ל י ו ח שהתפרקו ע ״ י‬
‫הסטרוקטורוח‬
‫ריבונוקליאז‬
‫ו ת ו צ ר י ה פ י ר ו ק שלהן ה ו פ י ע ו‬
‫באיזור‬
‫ה מ ו נ ו ז ו מ י ם ‪ ,‬ה ו ג ד ר ו כ פ ו ל י ז ו ט י ם ‪ .‬ב ת מ ו נ ה ‪ 40‬מ ת ו א ר י ם ה ש נ ו י י ם שחלו עם ה ד ה י ד ר צ י ה‬
‫באוכלוסית‬
‫ה ר י ב ו ז ו מ י ם של ע ו ב ר י ם ע מ י ד י ם ה א ו כ ל ו מ י ה ה ת ק י נ ה ב ע ו ב ר ב ן‬
‫בתמונה‬
‫נהרסו‬
‫‪C‬‬
‫‪40‬‬
‫כ ל י ל ‪ .‬בתמונה ‪0‬‬
‫הופיעו‬
‫אפשר לראות כ י‬
‫)‪.(24‬‬
‫ה פ ו ל י ז ו פ י ם של ה ע ו ב ר י ם ב נ י‬
‫)‪(24-48‬‬
‫‪ 40‬אפשר לראות כ י לאחר הרטבה מתורשת של ע ו ב ר י ם ) ‪( 2 4 - 4 8 - 2 4‬‬
‫ה פ ו ל י ז ו מ י ם מתדש‪.‬‬
‫בתמונה ‪ 41‬מ ת ו א ר י ם ה ש נ ו י י ם שחלו עם ה ד ה י ד ר צ י ה ב א ו כ ל ו ם י ת ה ר י ב ו ז ו מ י ם של ע ו ב ר י ם‬
‫רגישים‬
‫יבושו‬
‫לדהדרציה‪ .‬תפונה ‪3‬‬
‫נ ה ר ס י ם כ ל י ל ה פ ו ל י ז ו פ י ם של ע ו ב ר י ם ) ‪( 7 2 - 4 8‬‬
‫מחודשת‬
‫)תפונה‬
‫‪41‬‬
‫שאמנם מ ם נ ג י ר‬
‫הרגישים‬
‫נשארת‬
‫‪ 41‬מתוארת א ו כ ל ו ם י ת ה ר י ב ו ז ו מ י ם של ע ו ב ר ב ן ‪ . 7 2‬לאחר‬
‫‪D‬‬
‫( א י ן הופעה פחודשת של ה פ ו ל י ז ו פ י ם ‪.‬‬
‫‪ RNA‬הוא ה נ פ ג ע כ ת ו צ א ה מ ד ה ד ר צ י ה ‪,‬‬
‫לדהדרציה‪.‬‬
‫נ ם ו י י ם א ל ו פ צ ב י ע י ם על כך‬
‫ו ז א ת הן ב ע ו ב ר י ם ע מ י ד י ם ו ה ן ב ע ו ב ר י ם‬
‫א ו ל ם ב ע ו ד ש ה פ ו ל י ז ו מ י ם מ ו פ י ע י ם מחדש ב ע ו ב ר י ם ע מ י ד י ם ) ‪( 2 4 - 4 8 - 2 4‬‬
‫א ו כ ל ו ס י ת ה ר י ב ו ז ו מ י ם במצב של‬
‫מנםיונות‬
‫)תפונה‬
‫‪41‬‬
‫‪C‬‬
‫(‬
‫ו א י ל ו הרטבה‬
‫‪77‬‬
‫‪S‬‬
‫בעוברים ר ג י ש י ם לדהדרציה‬
‫)‪.(72-48-24‬‬
‫ההפקה ה כ מ ו ת י י ם המסוכמים בטבלה ‪ 15‬נראה כ י התכולה ה כ ל ל י ת של ה ר י ב ו ז ו מ י ם‬
‫לא משתנית ב ע ו ב ר י ם ע מ י ד י ם‬
‫ו י ו ר ד ת בכ‪ 50$-‬בעוברים ר ג י ש י ם לדהדרציה‪.‬‬
‫‪- 90 -‬‬
‫המונה‬
‫‪":40‬‬
‫הרבב‬
‫אובלוםית‬
‫תכשיר‬
‫ריבוזומלי‬
‫תכשיר‬
‫חולק‬
‫רבונוקליאז‬
‫ו‪2-‬‬
‫‪0.3‬‬
‫מייל‬
‫מקטעים‬
‫בכל‬
‫מקטע‬
‫נקראה‬
‫מכל‬
‫נפח‬
‫רגיל‬
‫כמתואר‬
‫ו‪24-48-24-‬‬
‫וכל‬
‫הריבוזומים‬
‫הובן‬
‫בפרק‬
‫ל‪2-‬‬
‫תכשיר‬
‫הושלם‬
‫בםפקטרופוטומטרצים‬
‫תמונה‬
‫‪A‬‬
‫תמונה‬
‫‪B‬‬
‫תמונה‬
‫‪C‬‬
‫תמונה‬
‫‪D‬‬
‫‪:‬‬
‫מ‪100-‬‬
‫למנה‬
‫הועברו‬
‫הופרדו‬
‫המקטעים‬
‫עוברי‬
‫שיטות‪.‬‬
‫מנות‪.‬‬
‫המנות‬
‫של‬
‫על‬
‫מפל‬
‫התפלגות‬
‫והורטבו‬
‫ם‬
‫מנת‬
‫קודם‬
‫להפרדה‬
‫על‬
‫מדגמים‬
‫עם‬
‫גל‬
‫מעוברים‬
‫וכמות‬
‫‪i‬‬
‫‪260‬‬
‫בני‬
‫״‬
‫״‬
‫המקבילה‬
‫מפל‬
‫‪TM‬‬
‫מעוברים‬
‫״‬
‫״‬
‫הריבוזומים‬
‫הוםפו‬
‫‪0.5‬‬
‫מיקרוגרם‬
‫מייל‬
‫מחדס‪.‬‬
‫)‪(0-0‬‬
‫אחת‬
‫פוזרו‬
‫הריבוזומים‬
‫הרובוזומים‬
‫)‪°‬־ (‬
‫)•־•(‬
‫חיטה‬
‫הריבוזומיס‬
‫בני‬
‫‪24-48 ,24‬‬
‫ב‪ 1-‬מ י י ל‬
‫למסר‬
‫באייר‬
‫״‬
‫״‬
‫עוברי‬
‫עמידים‬
‫‪ 5‬ד ק ו ת ל‪.25°-‬‬
‫ס ו כ ר ו ז ט"‪ 5-20‬ו ח ו ל ק ו ל‪20-‬‬
‫ל‪1-‬‬
‫ריבוזומים‬
‫חיטה‬
‫ליובלז‪,‬‬
‫בני‬
‫‪24‬‬
‫שעות‬
‫‪.‬‬
‫סי ובסו‬
‫סעות‪.‬‬
‫שעות‪.‬‬
‫‪24-48‬‬
‫‪24-48-24‬‬
‫שטופלה‬
‫הסוכרוז‪.‬‬
‫‪24‬‬
‫‪j‬‬
‫‪m‬‬
‫בני‬
‫סעות‪.‬‬
‫בריבונוקליאז‬
‫*‪N‬‬
‫‪Fraction‬‬
‫‪r‬‬
‫‪Fractal N‬‬
‫»‬
‫תמונה ‪:41‬‬
‫‪1‬‬
‫*‪Fracfcon N‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1—1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫י‬
‫‪Fraco‬‬
‫‪t* M‬‬
‫»‬
‫הרכב אוכלוסית הריבוזומים של עוברי חיטה רגישים ליובש‪.‬‬
‫יי‬
‫תכשיר ריבוזומלי רגיל הוכן מ‪ 100-‬עוברי חיטה בני ‪72-48 ,72‬‬
‫ו‪ 72-48-24-‬כמתואר בפרק שיטות‪ .‬המשך הנטוי התנהל כמתואר‬
‫בהסבר לתמונה ‪.40‬‬
‫תמונה‪A‬‬
‫תמונה^‬
‫תמונה‪0‬‬
‫תמונהם‬
‫&‬
‫‪ :‬התפלגות הריבוזומים מעוברים בני ‪ 72‬שעות שיובשו‬
‫והורטבו מחדש‪.‬‬
‫‪ $0—0; :‬ריבוזומיר מעוברים בני ‪ 72‬שעות‪.‬‬
‫)•‪ (•-‬ריבוזומים מעוברים בני ‪ 72-48‬שעות‪.‬‬
‫‪:‬‬
‫‪) :‬גן‪-‬ם( ריבוזומים מעוברים בני ‪ 72-48-24‬שעות‪.‬‬
‫‪ .‬מנת וזריבוזומיש המקבילה שטופלה בריבונוקליאז קודח‬
‫להפרדה על מפל הסוכרוז‪.‬‬
‫־‪-92‬‬
‫טבלה‪:15‬‬
‫השפעת הייבוש על תכולת הריבוזומים בעוברי החיטה‬
‫ה נ ם וםיי ק ר ו ג ר ם‬
‫עוברים‬
‫‪/rRNA‬‬
‫‪50‬‬
‫‪ 24‬ש '‬
‫‪ 650‬־ ‪545‬‬
‫‪ 2 4 - 4 8‬ש׳‬
‫‪500 - 550‬‬
‫‪ 24-48-24‬ש'‬
‫‪ 600‬־ ‪565‬‬
‫‪ 72‬ש׳‬
‫‪2600‬‬
‫‪ 72 - 48‬ש׳‬
‫‪ 1600‬־־ ‪1250‬‬
‫‪ 72-48-24‬ש'‬
‫‪1280 - 1000‬‬
‫הריבוזומים‬
‫‪2320 -‬‬
‫ה ו פ ק ו כמתואר בפרק ש י ט ו ת מ ת ו ך ‪ 50‬ע ו ב ר י ם בכל מ נ ה ‪ .‬הקביעה הכמותית‬
‫נעשתה על י ד י קריאה ב ס פ ק ט ר ו פ ו מ ו מ ט ר ב א ו ר ו ג ל‬
‫עבור‬
‫תמימה של‬
‫'‬
‫‪$‬‬
‫‪mRNA‬‬
‫‪.rRNA‬‬
‫ב ע ו ב ר י חיטה שעברו ד ה ד ר צ י ה‬
‫מרבית‬
‫על‬
‫‪1‬‬
‫‪.‬׳^‪ 260 :‬ושמוש במקדם הבליעה ‪A 2 6 0 =20‬‬
‫ת ו צ א ו ת ה נ י ס ו י י ם עד כ א ן ‪ ,‬ה צ ב י ע ו ע ל האפשרות של פ ג י ע ה ב מ ס ג '‬
‫נ י ס ו י י ם אלו‬
‫ובכושר‬
‫יצירתו‪.‬‬
‫נ מ נ י ם ה פ ג י ע ה ב ס י נ ת ז ת ה ח ל ב ו ן כאשר רב ה מ ר כ י ב י ם ה ס ט ר ו ק ט ו ר ל י ת‬
‫ו ה א נ ז י מ ת י ם של מערכת ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה א י נ ם פ ג ו ע י ם ‪ ,‬ו כ ן ה פ י ר ו ק התל ב פ ו ל י ז ו מ י ם עקב‬
‫הדהידרציה‪.‬‬
‫א‪.‬‬
‫א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של‬
‫בנסויי‬
‫‪52‬‬
‫‪P‬‬
‫ב ע ו ב ר י ם שעברו ד ה י ד ר צ י ה‬
‫^‪RNA‬‬
‫א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה עם‬
‫‪32‬‬
‫‪P‬‬
‫נמצא כ י ס י נ ת ז ה‬
‫^‪RNA‬‬
‫המתרחשת בתקופת ההרטבה‬
‫המתודשת של ע ו ב ר ע מ י ד ש י ו ב ש ‪ ,‬ה י א נמרצת ב י ו ת ר ‪ .‬ע ו ב ר י ם ב נ י‬
‫‪32‬‬
‫‪p‬‬
‫) ‪ ( 2 4 - 4 8‬שהורטבו‬
‫למייל‪ ,‬למשך ‪ 24‬ש ע ו ת ‪ ,‬נ ת נ ו תכשירי‬
‫מחדש בתמיסת ס י מ ו ן המכילה ‪ 100‬מ י ק ר ו ק י ר י‬
‫‪32‬‬
‫כ ל ל י ו מ נ ו ק ה ) ר א ה ש י ט ו ת ( ב ע ל י פ ע י ל ו ת ס פ צ י פ ו ת של ‪ 3 8 . 0 0 0‬ס פ י ר ו ח‬
‫‪P‬‬
‫‪RNA‬‬
‫לדקה ל פ י ק ר ו ג ר ם‬
‫אותה כמות‬
‫‪^ P‬‬
‫לפ׳יך‬
‫‪RNA‬‬
‫‪2‬‬
‫‪ .‬מעוברים בני‬
‫שהורטבו פחדש בוזפיםוז ס י פ ו ן ה מ כ י ל ה‬
‫)‪(72-48‬‬
‫‪ 2 4‬שעות התקבלו ת כ ש י ר י ‪^P‬‬
‫ס פ י ר ו ת לדקהלפיקרוגרם‪RNA(620‬‬
‫‪ RNA‬עם פ ע י ל ו ת נ פ ו כ ה של פאות‬
‫‪2‬‬
‫ס פ י ר ו ת בתכשיר ב נ ם ו י‬
‫רי!ר? ‪ 7‬ר ״ ( ‪.‬‬
‫האם נ ו צ ר פ ם נ ג ׳ ר ‪ RNA‬בתעופת ההרטבה הפתודשת?‬
‫‪,‬‬
‫פחיטה עם‬
‫‪DNA‬‬
‫נעשתה הרו יה שד‬
‫‪2‬‬
‫)‬
‫‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪8‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪4‬‬
‫‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫(‬
‫‪^P‬‬
‫‪RNA‬‬
‫‪2‬‬
‫שעבר ט ר נ ם ק ר י פ צ י ה בפשר ‪ 24‬שעות ההרטבה המחודשת של ע ו ב ר י ם ב נ י ‪ 24‬ש י ו ב ש ו ‪ 48‬ש ע ו ת ‪.‬‬
‫‪200‬‬
‫‪100‬‬
‫‪400‬‬
‫‪300‬‬
‫‪3‬‬
‫( ‪24-48-24)fJLg P i RNA‬‬
‫‪DNA‬עקום‬
‫ר ו ו י ה של‬
‫;‬
‫)‪(24-18-24‬‬
‫‪42‬‬
‫פ ע ו ב ר חיטה עם )‪(24-28-24‬‬
‫ש נ ו צ ר ב ע ו ב ר חיטה ע פ י ד ל י י ב ש לאחר הרטבתו המחודשת‪.‬‬
‫כ ל ד ו ג מ ה ה כ י ל ה ‪ 10‬פ י ק ר ו ג ר ם ‪ DNA‬ו כ פ ו י ו ת ה ו ל כ ו ת ו ע ו ל ו ת של‬
‫‪ ,‬שעבר } ! ר נ מ ק ר י פ צ י ה‬
‫‪RNA(cpm/ng) P‬‬
‫‪38.000‬‬
‫בפשך ‪ 24‬שעות ההרטבה ה ח ו ז ר ת ‪.‬‬
‫‪^p‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪RJJA‬‬
‫‪3‬‬
‫פ ת ו צ א ו ת ה נ י ס ו י הנראה כ י ‪ 2$‬פ כ ל ל ה ג נ ו ם ה י ו ע ם ו ק י ם ‪v i v o‬‬
‫מ‬
‫! ב ס נ ת י ז ת ‪mRNA‬‬
‫נסויי־ ה ר ו י ה עם כ פ ו י ו ת ע ו ל ו ת של ( ‪RNA P ) 7 2 - 4 8 - 2 4‬שעבר ט ר נ ס ק ר י פ צ י ה בפשך‬
‫‪2‬‬
‫‪ 24‬שעות ההרטבה הפחודשת של ע ו ב ר י ם ב נ י ‪ 72‬שיובישו‬
‫תוצאות‬
‫לב‪2.6$-‬‬
‫ה נ ם ו י מ ע י ד ו ת כי‪ ,‬פעט ה ־‬
‫‪RNA‬‬
‫מ ן ה ג נ ו ם ת ו ר ג פ ו בפרק הדפן‬
‫‪ 48‬ס ע ו ת ‪ ,‬פ ת ו א ר ב ת פ ו נ ה ‪.43‬‬
‫ה נ ו צ ר בעוברים אלו פ כ י ל‬
‫הנידון‪.‬‬
‫‪mRNA‬‬
‫הקופפלפנמרי‬
‫‪- 94 -‬‬
‫סי‬
‫>‪a‬‬
‫ס־‬
‫‪k.‬‬
‫‪JO‬‬
‫י<‬
‫>‬
‫‪c‬‬
‫‪a‬‬
‫‪300‬‬
‫‪200‬‬
‫‪500‬‬
‫‪400‬‬
‫)‪24‬־‪48‬־‪RNA(72‬‬
‫‪960‬‬
‫‪mRNA‬‬
‫‪3‬‬
‫‪fMq‬‬
‫עק!ם ר ו ו י ה של ‪ DNA‬מ ע ו ב ר חיטה עם ) ‪( 7 2 - 4 8 - 2 4‬‬
‫תמונה ‪:43‬‬
‫ש נ ו צ ר בעובר חיטה ר ג י ש ל י ו ב ש לאתר הרטבתו המתודשת‪.‬‬
‫ו כ מ ו י ו ת ע ו ל ו ת של‬
‫כ ל ד ו ג מ א הכילה ‪ 150‬מ י ק ר ו ג ר ם ‪DNA‬‬
‫( ‪.,‬שעבר טרנםקריתציה‬
‫‪R‬‬
‫‪N‬‬
‫‪A‬‬
‫‪cpm/ng ) P‬‬
‫ב ‪ 2 4 -‬שעות ההרטבה המחודשת‪.‬‬
‫ב ע ו * ‪ .‬ר י ה י ה י ו י ס שעברו ד ה ד ר צ י ה‬
‫•בנסוי‬
‫ה ב ר י ד ז צ י ה תחרותית המתואר ב ת מ ו נ ה ‪ 44‬נ ח ק ר ו השאלות הבאות‪:‬‬
‫האם נהרס ^ ‪m R N A‬‬
‫בשעת ה י ב ו ש ב ע ו ב ר ב ן‬
‫האם ה ‪ mRNA -‬ה נ ו צ ר ב ע ו ב ד‬
‫ס‬
‫ו‬
‫נ‬
‫ה‬
‫כאשר‬
‫פ ה‬
‫_ ‪mRNA‬‬
‫)‪? (24-48‬‬
‫) ‪ ( 2 4 - 4 8 - 2 4‬ב ‪ 2 4 -‬שעות הרטבתו המחודשת‪,‬זהה א ו‬
‫ה נ ו צ ר בעובר ר ג י ל באותו‬
‫ג י ל ) ב י ן השעות ‪ 2 4 - 4 8‬לנבימה(‪.‬‬
‫‪ RNA‬בלתי מ ס ו מ ן שהועק מ ע ו ב ר י ם ב נ י ‪ 24‬ש י י ב ש ו במשך ‪ 48‬שעות מתחרה‬
‫‪32‬‬
‫ב‪RNA(48)-‬‬
‫‪•P‬‬
‫אשר עבר ם ר נ ם ק ר י פ צ י ה ב י ן ‪ 24‬ל ‪ 4 8 -‬שעות נביטה^מםתבר כ י‬
‫החחרות ה י א מלאה‪ ,‬בדומה ל ז ו המושגת עם ‪RNA‬‬
‫כאשר‬
‫מ ע ו ב ר ב ן ‪ 24‬שעות שלא י ו ב ש ‪.‬‬
‫‪ RNA‬שהופק מ ע ו ב ר י ם ב נ י ‪ 24‬שעות ס י ו ב ש ו‬
‫מתחרה עם ) ‪RNA ( 4 8‬‬
‫) ‪RNA ( 4 8‬‬
‫מתוצאות‬
‫ו ה ו ר ט ב ו מחדש במשר ‪ 24‬ש ע ו ת ‪,‬‬
‫‪ , P‬התחרות ה י א מלאה^בדומה לתחרות העצמית עם‬
‫בלתי מ ס ו מ ן ‪.‬‬
‫ה נ י ס ו י י ם המתוארות ב ת מ ו נ ה ‪ 44‬אפשר להסיק כ י‬
‫‪n‬‬
‫־*‪mRNA‬‬
‫א י נ ו נהרס‬
‫ ‪- 95‬‬‫במהלך יבושו של עובר עמיד‪ ,‬ובי ה‪ mttNA -‬הנוצר עם ההרסבה המחודשת של עובר זה )‪,(24-48-24‬‬
‫זהה עם המסג' הנוצר בין ‪ 24‬ל‪ 48-‬שעות נביטה רגילות‪ .‬המסג' הנוצר ב‪ 24-‬שעות ההרטבה המחודשת‬
‫סל עוברים בני )‪ ,(24-48‬דומה למסג' הרגיל הנוצר בין ‪ 24‬ל‪ 48-‬שעות נביטה‪,‬ביכולתו להתחרות‬
‫רק ב‪ 50-‬אחוז עם מםנגיר הנוצר בין ‪ 48‬ל‪ 72-‬שעות נביטה])‪/RNA ( 72‬‬
‫‪L‬‬
‫‪6‬‬
‫ו‬
‫‪5‬‬
‫ו‬
‫‪4‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪3‬‬
‫‪2‬‬
‫כמתואר בתמונה ‪.45‬‬
‫‪J‬‬
‫‪I‬‬
‫)‪ RNA 148‬״‪Ratio unloblltd RNA 10 P‬‬
‫הכילה‬
‫‪0‬‬
‫‪4‬‬
‫‪4‬‬
‫)‬
‫‪3‬‬
‫תמונה ‪ :44‬נםוי הברידיזציה תחרותית להשואת הרכב אוכלוםית• המסנגיר‬
‫בעובר חיטה עמיד ליובש‪,‬סעבר ייבוש והרמבה מחודשת ואוכלוסית‬
‫המסג' הנוצרת בעובר שגידולו תקין‪ ,‬בין ‪ 24‬ו‪ 40-‬שעות נביטה‪.‬‬
‫מיקרוגרם )‪?'*RNA (48‬‬
‫‪UNA‬‬
‫‪,‬‬
‫מיקרוגרם‬
‫‪1‬‬
‫‪ , ( c p r a ^ i g‬וכמויות הולכות ועולות סל ‪ RNA‬קר‬
‫‪8100‬‬
‫מעוברים מטיפולים )‪ (24-48‬ו‪.(24-48-24)-‬‬
‫‪2‬‬
‫תמונה ‪ :45‬נםוי הברידיזציה תחרותית להסוואה הרכב אוכלוםית המםנגיר‬
‫הנוצר בעובר החיטה העמיד לאחר הרטבתו המחודשת‪ ,‬עם זו הנמצאת‬
‫בעוברים שגידולם תקין‪ ,‬בני ‪ 24‬או ‪ 72‬סעות‪ .‬כל דוגמא הכילה‬
‫‪RNA‬‬
‫‪P‬‬
‫‪ 66 ,‬מיקרוגרם )‪(24-20-24‬‬
‫‪ ^\[29‬פיקרוגרםמ‬
‫‪ ( c p m ^ g‬וכמויות עולוח של^‪ 1‬קר מעוברים בני ‪72, 24‬‬
‫‪4760‬‬
‫י‬
‫שעות ועוברים )‪.(24-48-24‬‬
‫‪32‬‬
‫)‬
‫‪-‬‬
‫בעוברים‬
‫‪mRNA‬‬
‫האם‬
‫‪aRNA‬‬
‫התחרותית‬
‫ר ג י ש י ן ג שעברו‬
‫משתמר‬
‫המתוארים‬
‫בעובר‬
‫‪-‬‬
‫‪96‬‬
‫דהידרציה‪.‬‬
‫הרגיס^שעבר‬
‫ב ת מ ו נ ה ‪^46‬התוורה‬
‫דהדרציה‬
‫)‪?(72-48‬‬
‫בלתי‬
‫‪RNA‬‬
‫ב נ ם ו י י‬
‫שהופק‬
‫מסומן‬
‫ההברידיזציה‬
‫ב נ י‬
‫מעוברים‬
‫)‪^(72-18‬‬
‫‪ o‬כי‬
‫עם‬
‫)‪.RNA (72‬‬
‫״>כ‪70/*-‬‬
‫שעות‬
‫שעבר‬
‫‪P‬‬
‫מאוכלוםית‬
‫טרנםקריפציה‬
‫שהיתה‬
‫המסג*‬
‫ב י ן‬
‫מצויה‬
‫‪48‬‬
‫שעות‬
‫ל‪72-‬‬
‫בן‬
‫בעובר‬
‫‪72‬‬
‫נביטה‪.‬‬
‫שעות‪,‬‬
‫התוצאה‬
‫א י נ ה‬
‫מצביעה‬
‫עוד‬
‫מצויה‬
‫על‬
‫לאחר‬
‫בך‬
‫‪48‬‬
‫ייבוש‪.‬‬
‫האם‬
‫אוכלוסית‬
‫)‪,(72-48-24‬‬
‫בנמוי‬
‫זהה‬
‫המםנג'ר‪RNA‬‬
‫ל ז ו‬
‫הנמצאת‬
‫ההברידיזציה‬
‫הנוצר‬
‫בעובר‬
‫התחרותית‬
‫בעובר‬
‫בן‬
‫‪72‬‬
‫בתמונה‬
‫הרגיש‬
‫במשך‬
‫‪24‬‬
‫שעות‬
‫הרטבתו‬
‫המחודשת‬
‫שעות?‬
‫התחרו‬
‫‪46‬‬
‫כ מ ו י ו ת‬
‫עולות‬
‫של‬
‫)‪•RNA (72‬‬
‫‪32‬‬
‫קר‬
‫בכמות‬
‫‪70‬‬
‫אחוז‬
‫ב א י ז ו ר‬
‫קבועה‬
‫של‬
‫מאוכלוסית‬
‫גנטי‬
‫הסונה‬
‫)‪ RNA(72-48-24‬־ ‪. P‬‬
‫המסג'‬
‫מזה‬
‫החדש‬
‫הפעיל‬
‫שנוצרה‬
‫באופן‬
‫מתוצאות‬
‫בעוברים‬
‫הנםוי‬
‫פגועים‬
‫נ י ת ן‬
‫סהורטבו‬
‫כ י‬
‫ללמוד‬
‫לפחות‬
‫מחדס^עברו‬
‫מרנםקריפציה‬
‫נ ו ר מ ל י ‪.‬‬
‫ו‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪r‬‬
‫*‪-# RNA (72) /P - RNAI72-4W‬ז—•‬
‫)‪-RNA(72‬״‪1 . RNA (72-48)/P‬‬
‫)‪-RNA(72‬״‪A A RNA (72) /P‬‬
‫‪S‬‬
‫‪100‬‬
‫—‪1‬‬
‫ ‪50‬‬‫‪•85‬‬
‫_‪1‬‬
‫‪I‬‬
‫‪I‬‬
‫‪I‬‬
‫‪J‬‬
‫‪I‬‬
‫‪1 2‬‬
‫‪3 4‬‬
‫‪3 6‬‬
‫‪ RNA‬״‪Ratio unlablkd RNA to P‬‬
‫)‬
‫‪2‬‬
‫תמונה ‪ :46‬נסוי הברידזציה תחרותית‪ ,‬להשואת אוכלוםית המסנגיר הנמצאת‬
‫בעובר רגיש לייוב^עם זו הנותרת בו לאחר הייבוש‪ ,‬או נוצרת‬
‫לאחר ההרטבה המחודשת‪.‬‬
‫מיקרוגרם‬
‫‪ x—x‬כל דוגמא הכילה ‪ 10‬מיקדוגדם ‪DMA , 125‬‬
‫‪ ( 1 1 . 5 0 0 / ; 1 g ) P ₪ A‬וכמויות עולות של‬
‫‪ c p m ( 7‬׳‬
‫)‪ RNA (72-48‬בלתי מסומן‪.‬‬
‫•—‪ ft‬כל דוגמא הכילה ‪ 130‬מ י קר וגרי•׳ ‪ J^NA‬ו‪ 240-‬מיקרוגרם‬
‫וכמויות‬
‫) ‪PRNA^/(655c p m 7 2 - 4 8 - 2 4‬‬
‫עולות של )‪ •RNA(72‬בלתי מסומן‪.‬‬
‫‪ A—4‬כל דוגמא הכילה ‪ 10‬מיקרוגרם ‪NA°, 125‬מיקרוגרם‬
‫‪ 1 g ) p 3‬ו כ מ ו י ו ת עולות סל )‪472RN‬‬
‫‪( c p m / l‬‬
‫‪3 2‬‬
‫)‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪R N A‬‬
‫בלתי‬
‫מסומן‪.‬‬
‫י‬
‫‪g‬‬
‫(‬
‫‪- 97 -‬‬
‫‪.8‬‬
‫ה ‪DNA -‬‬
‫חיטה‬
‫בעוברי‬
‫האלקטרון‬
‫ניזוק‬
‫ב נ י‬
‫שעברו‬
‫מ י ק ד ו ג ר פ י ם של תאי‬
‫בעוברים‬
‫‪24‬‬
‫דהדרציה‬
‫אלו• כדי‬
‫ו‪ 72-‬סעות‪ ,‬הופק‬
‫םוכרוז‬
‫‪5-20/0‬‬
‫מ נ ה בת‬
‫‪ 500‬מ ״ ג‬
‫עוברים בני‬
‫לבדוק באם ^ ‪D N A‬‬
‫ה‪DNA-‬‬
‫ב ם פ י נ ק ו ראש‬
‫בהפקה‬
‫‪SW 39‬‬
‫)‪(72-48-24‬‬
‫נ י ז ו ק אף ה ו א‬
‫כמתואר‬
‫יסירה‬
‫‪36.000‬‬
‫במהירות‬
‫הצביעו על כך‬
‫במהלך‬
‫הדהדרציה סל‬
‫בשיטות‪DNA^ .‬‬
‫םבובים‬
‫גרעין‬
‫לדקה‬
‫עוברים‬
‫הופרד על‬
‫במסך‬
‫‪7‬‬
‫מפל‬
‫סעות‪.‬‬
‫‪3‬‬
‫כך‬
‫מנה‬
‫במשך‬
‫יובשה‬
‫אחרת בת‬
‫עוברים‬
‫‪ .48‬ש ע ו ת‬
‫הונבטה‬
‫במשך‬
‫‪24‬‬
‫‪24‬‬
‫שעות‬
‫והורטבה‬
‫‪ 500‬מ ״ ג ה ו נ ב י ט ה‬
‫במשך‬
‫בתמיסת‬
‫שעות‬
‫בתמיסת‬
‫‪ 48‬ש ע ו ת‬
‫הנבטה‬
‫הנבטה‬
‫בתמיסת‬
‫המכילה‬
‫רגילה‬
‫הנבטה‬
‫טימידין‬
‫כמתואר‬
‫ואחר‬
‫‪H‬‬
‫בשיטות‪.‬‬
‫רגילה‪.‬‬
‫‪3‬‬
‫הועברה‬
‫ל‪24-‬‬
‫מחודשת‬
‫בתמיסת‬
‫הייבוש‬
‫וההרטבה‪.‬‬
‫בני‬
‫שעות‬
‫‪72-48-24‬‬
‫םפטולה‪.‬‬
‫מעוברים‬
‫על י ד י‬
‫‪72‬‬
‫בני‬
‫הנתונים‬
‫מעידים‬
‫ההפקה ש ל ה ‪-‬‬
‫חומר‬
‫בדרך‬
‫מסומן‬
‫לפרגמנטים‬
‫לא‬
‫ר‬
‫ניתן היה‬
‫הפגום על מפל‬
‫םוכרוז‬
‫‪.‬‬
‫שבור‬
‫ומופיע‬
‫בקצה הקל ס ל מ פ ל‬
‫בעוברים‬
‫ניתנים‬
‫רגישים‬
‫להפקה‬
‫להפיק‬
‫התמיסה‬
‫לדהדרציה‬
‫בדרך של‬
‫אותו‬
‫הכהלית‬
‫‪TCA5‬‬
‫מעוברים‬
‫בעזרת‬
‫‪.f°‬‬
‫סהופק‬
‫לעיל‪.‬‬
‫לראות כ י מעט ^ ‪D N A‬‬
‫הםדימנטציה‬
‫מעגל‬
‫במקביל ^ ‪D N A‬‬
‫כניזכר‬
‫בתמונה‬
‫זה לזה‬
‫שעבר את‬
‫להשקיעו על י ד י‬
‫ה ‪DNA ( 7 2 - 4 5 - 2 4 ) -‬‬
‫בתמונת‬
‫ניתן‬
‫וקצריםנידלו מן‬
‫‪ .47‬ב ה‬
‫הוא‬
‫שאינם‬
‫ו‬
‫א‬
‫ס‬
‫הועברה‬
‫ה מ ס ו מ ן ה ו א ‪DNA‬‬
‫מעוברים אלו‬
‫בודדים‬
‫‪H‬‬
‫אפסר‬
‫ודומים‬
‫איפוא כי‬
‫ב‬
‫‪DNA-n‬‬
‫מתוארות‬
‫שבורים‬
‫‪-‬‬
‫ה ‪DNA -‬‬
‫‪DNA‬‬
‫תוטים‬
‫ז ו ‪ ,‬מ י צ ג את‬
‫הופרד‬
‫המכילה‬
‫באופן כזה‬
‫כריכה‪ ,‬ורק‬
‫)‪,(72-48-24‬‬
‫ה ‪DNA -‬‬
‫ה‪-‬‬
‫ס'‬
‫הניסוי‬
‫אינם‬
‫‪DNA‬‬
‫נוכח‬
‫לתמיסת‬
‫הרגילה‪.‬‬
‫בנםיון‬
‫סנידלה‬
‫בני‬
‫תוצאות‬
‫מעוברים‬
‫הנבטה‬
‫בחמיםה‬
‫מ ע ט ה ‪DNA -‬‬
‫נוספות‬
‫הנבטה‬
‫טימידין‬
‫‪,‬‬
‫לייבוש‬
‫והרטבה‬
‫הםוכרוז‪.‬‬
‫הניתן‬
‫כל סאר‬
‫להפקה‬
‫תכשירי‬
‫סלהם‪.‬‬
‫שעברו‬
‫יבוש‬
‫כריכה על מוט‬
‫והרטבה‬
‫מחדש‪,‬‬
‫זכוכית‪.‬‬
‫נשבר‬
‫־‪- 98‬‬
‫)‪DNA (24‬‬
‫)‪H DNA(24-48-24‬‬
‫‪3‬‬
‫‪5‬‬
‫‪No.‬‬
‫ת מ ו נ ה ‪ : 4 7‬התפלגות‪DNA‬‬
‫‪10‬‬
‫•‬
‫‪x‬‬
‫•‬
‫‪x‬‬
‫‪15‬‬
‫‪Fraction‬‬
‫שהופק מ ע ו ב ר י חיטה על ג ב י מטל ם ו כ ר ו ז ‪.‬‬
‫מ נ ו ת ב נ ו ת ‪ 1000‬ז ר ע י ם ה ו ג ב ט ו בתמיסת הנבטה לפרקי ז מ ן ס ל‬
‫הופק כמתואר ב ש י ט ו ת ‪.‬‬
‫‪ 24‬א ו ‪ 72‬ש ע ו ת ‪ ,‬ה ע ו ב ר י ם נ ו ת ק ו ^‪DNA‬‬
‫ב נ י ס ו י מ ק ב י ל ה ו נ ב ט ו ה ע ו ב ר י ם בתמיסת הנבטה המכילה ט י מ י ד י ן ^ ‪/‬‬
‫)‪ 10‬מ י ק ר ו ק י ר י ‪ /‬מ ״ ל ( במסך ‪ 24‬ס ע ו ת ‪ ,‬א ו למסך ‪ 48‬סעות בתמיסת‬
‫הנבטה ר ג י ל ה ‪ ,‬ו ה ו ע ב ר ו לאחר מ כ ן לתמיסת ה ס י מ ו ן למסך ‪ 24‬שעות‬
‫‪I‬‬
‫‪ , .‬נ ו ס פ ו ת ‪ .‬לאחר מ כ ן י ו ב ס ו ה ע ו ב ר י ם ‪ 48‬ס ע ו ת בתא י י ב ו ש ו ה ו ר ט ב ו‬
‫מחרס בתמיסת הנבטה ל ‪ 2 4 -‬ס ע ו ת נ ו ס פ ו ת )ראה ס י ט ו ת ( ה ‪DNA -‬‬
‫הופק' כמתואר ב ס י ט ו ח ‪ 0 . 2 .‬מייל ה מ כ י ל י ם כ ‪ 5 0 0 -‬מ י ק ר ו ג ר מ ‪DNA‬‬
‫שעות‪,‬‬
‫‪SW‬‬
‫‪,‬‬
‫‪7‬‬
‫ה ו פ ר ד ו על מפל ם ו כ ר ו ז ‪) 5 - 2 0 $‬ראש ספי נ ק ו ‪39‬‬
‫‪ 3 6 . 0 0 0‬ס ב ו ב י ם לדקה( ו ח ו ל ק ו ל ‪ 1 8 -‬מ ק ט ע י ם ‪ ,‬כ מ ו ת ה ‪DNA -‬‬
‫נקבעה על י ד י מ נ י ה ב ת כ ש י ר י ם ה מ ס ו מ נ י ם א ו ב ס פ ק ט ר ו פ ו ט ו מ ט ר ציי«‬
‫ב א ו ר ך ג ל ‪.26Qraji‬‬
‫הנובט‬
‫העובר‬
‫הזרע‬
‫עוברת‬
‫הזיגומה‬
‫בתמונות‬
‫כאשר‬
‫ניחן‬
‫למצב‬
‫כבר‬
‫לביצי‬
‫לטנטי‬
‫בהתיבשות‬
‫הבלתי‬
‫קולט‬
‫להבחין‬
‫בע״ח‬
‫לתנאי‬
‫על‬
‫ה ז ר ע את‬
‫את‬
‫הייבוש‬
‫גורם‬
‫תהליכי‬
‫זמן‬
‫המלאה‬
‫וקליטת‬
‫להמשך‬
‫הנמצאת‬
‫מכיון‬
‫הראינו‬
‫הזרע‬
‫שקליטת‬
‫היתה‬
‫ההתפתחות‪,‬‬
‫כאלקטרון‬
‫גורמת‬
‫הרי‬
‫‪24‬‬
‫חוזרת של‬
‫חל‪,‬‬
‫במגע עם‬
‫היא‬
‫לו‬
‫מיקרוגרפים‬
‫התפתחות‪.‬‬
‫מים‬
‫משלב‬
‫מסוים‬
‫על‬
‫וייעוד‬
‫ההפריה‪,‬‬
‫המעבר‬
‫החיים של‬
‫הצמח‬
‫נכנם‬
‫למצב‬
‫גידולו‬
‫מוגדרים־‬
‫נכנס‬
‫למצב‬
‫עובר‬
‫הלטנטי‬
‫נחיחד‬
‫החיטה‬
‫קשור‬
‫בעמידותו‬
‫העדר‬
‫תמצן‬
‫ואור‪.‬‬
‫הלטנטי‬
‫)‪,(62‬‬
‫אולם‬
‫)‪,(51‬‬
‫וכניסתו‬
‫העובר‬
‫ההתפתחות‪.‬‬
‫לאחר‬
‫‪24‬‬
‫לאפשר את‬
‫נראה‬
‫היבש‬
‫הארגון‬
‫במיקרוסקופ‬
‫ו—‪14‬‬
‫רק‬
‫כדי‬
‫הזרע‬
‫הנביטה‬
‫ל ה ת ע ו ר ר ש ו ב עם‬
‫תהליכי‬
‫מהירה‪ ,‬הרי‬
‫בדרגת‬
‫‪13‬‬
‫הראשונות של‬
‫איפוא‪,‬‬
‫המים‬
‫היה‬
‫לשנוי‬
‫שהתצפית‬
‫השעות‬
‫הפוטנציאלית‬
‫חזרה‬
‫ההתפתתות‪.‬‬
‫שחלה‬
‫במחזור‬
‫האנדוםפרם‪,‬‬
‫למעגל‬
‫נעצר‬
‫כאשר‬
‫ההתפתחות‬
‫שנית‪.‬‬
‫בלתי‬
‫המים‬
‫בעלות‬
‫תאי‬
‫) ‪1.2x10‬‬
‫תאים(‪.‬‬
‫פולריות‬
‫קיצוניות‬
‫לאבדן‬
‫והחל‬
‫רב‬
‫היושב‬
‫מרגע‬
‫ואין‬
‫שלב‬
‫הזרע‬
‫הנביטה‬
‫במשך‬
‫ביכולתו‬
‫ש א י ן מהם‬
‫נמצא‬
‫תהליכי‬
‫המים‬
‫לעצור‬
‫כ‬
‫לעצירה‬
‫זה‬
‫יצור‬
‫עצמו‬
‫מריםטמות‬
‫ניתנת‬
‫‪.9-12$‬‬
‫מתפתת‬
‫העובר‬
‫כגון‪ ,‬טמפרטורות‬
‫מתחילה‬
‫י‬
‫כי‬
‫חלקית של‬
‫ה מ ב י א י ם את‬
‫לאינאקםיבציה‬
‫מסוים שבו‬
‫של‬
‫אין‬
‫לפגוע‬
‫ההתפתתות‬
‫הלטנטי‪.‬‬
‫מחדש‬
‫לראות‬
‫אינה‬
‫מים של‬
‫ה ח י י ם של‬
‫בתוצאה מהן‬
‫מ ט ב ו ל י ת של ממש‬
‫קשים‬
‫התהליכים‬
‫בנםיונותינו‬
‫העובר‬
‫פעילות‬
‫לתכולת‬
‫שאותם‬
‫מבלי‬
‫התפתתות‬
‫סביבה‬
‫המים‬
‫הדפרנציאציה‬
‫כל‬
‫עד‬
‫אפשר‬
‫בדפרנציאציה‬
‫שבהם‬
‫אין‬
‫הרקמות‬
‫י ד ו ע דבר‬
‫רב של‬
‫מיוחד‬
‫ח ל ו ק ו ת אשר‬
‫המיקרוםקופיים‬
‫שבו‬
‫רגילה‬
‫החיטה‬
‫מספר‬
‫החתכים‬
‫בניגוד‬
‫לא‬
‫היבש של‬
‫מ י צ ג שלב‬
‫במחזור‬
‫הצמח‪.‬‬
‫עם‬
‫ההפריה של‬
‫הביצית‬
‫כי‬
‫מצביעה‬
‫נוכתות‬
‫מצויד‬
‫במבנים‬
‫המיוחדת‬
‫האלקטרוני‬
‫על‬
‫מועד‬
‫שעות‬
‫יצירת‬
‫ניתן‬
‫ההרטבה‬
‫עדיין‬
‫המחודשת‪.‬‬
‫הכניסה של‬
‫יש‪,‬‬
‫נביטה‪.‬‬
‫מלוא ה ת נ א י ם‬
‫המים‬
‫עצמם‬
‫ודרגת‬
‫לזרע‬
‫היבש‬
‫צריכה‬
‫היתה‬
‫לגלות‬
‫כך שלא‬
‫תל‬
‫בל‬
‫שנוי‬
‫ליציאה‬
‫אינה‬
‫יצירת‬
‫תת‬
‫זו‬
‫לתוך‬
‫צורך‬
‫מן‬
‫בפרק‬
‫המצב‬
‫מספיקה‬
‫להפעלתם‬
‫תאיים‬
‫מיוחדים‬
‫מבנים‬
‫תופעות‬
‫ניכר‬
‫תקופה‬
‫העובר‬
‫איפוא‪,‬‬
‫ארגון‬
‫או‬
‫לחזור‬
‫לאחר‬
‫וליבש‬
‫במבנה‬
‫חיוניים‬
‫אלו‪.‬‬
‫התשובה‬
‫התאים‬
‫של‬
‫ ‪ 00‬ו ­‬‫ע ו ב ר החיטה עם נ ב י ט ת ו ‪ .‬אסר היה ב ע ו ב ר היבש ה ו א שנמצא גם בעובר ה נ ו ב ט ‪:‬‬
‫מיטוכונדריה‪,‬‬
‫ה ג ר ל ו ת עד‬
‫‪60.000‬‬
‫כלורופלםטים‪,‬‬
‫ו ג ר ע י נ ו ן ה מ א ו ר ג נ י ם ב ס י ד ו ר ד ו מ ה כ כ ל סמתאפסרת הבחנה‬
‫סל המיקרוסקופ ה א ל ק ט ר ו נ י ‪.‬‬
‫‪x‬‬
‫הם‪:‬‬
‫גרעין‬
‫תחילתה ס ל הופעת‬
‫ריבוזומים‪,‬‬
‫ה ס נ ו י י ם ה י ח י ד י ם התלים ב ת נ א י ע ו ב ר שנבט‬
‫ו ק ו א ו ל ו ת והבלטת מה ס ל ה ר ט י ק ו ל ו ם האנדופלסמתי ‪.‬‬
‫מכאןשעיקר השנויים‬
‫החלים עם ה נ ב י ט ה מתרחשים ברמה שמתתת לכושר ההבחנה סל ה מ י ק ר ו ס ק ו פ ‪ -‬ברמה ה מ ו ל ק ו ל ר י ת ‪ .‬ממצאים‬
‫אלו הם בהתאם לממצאי קלי ן ב נ ב ט י ש ע ו ע י ת ) ‪(63‬‬
‫פעילות‬
‫השונים‪,‬‬
‫םנתיזת‬
‫ושטרן בשעורה‬
‫ה מ נ ג נ ו ז ה ג נ ט י בשעות ה נ ב י ט ה ה ר א ש ו נ ו ת‬
‫קליטת המים אל ת ו ך ע ו ב ר החיטה היא מ ה י ר ה‬
‫לפיכך‬
‫)‪.(64‬‬
‫נ ס ו י י הקליטה של ה א י ז ו ט ו פ י ם‬
‫ו כ פ י שמראים‬
‫ג ו ר ם ה ד פ ו ז י ה א י נ ו מ ג ב י ל את ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ‪ ,‬פרט ל‪ 10-‬הדקות ה ר א ס ו נ ו ת ס ל ה נ ב י ט ה ‪.‬‬
‫נ י ת ן ה י ה לבדוק את ה ת ה ל י כ י ם ה ב י ו כ י מ י י ם בתחילת ה נ ב י ט ה בעזרת השימוש ב א י ז ו ט ו פ י ם ‪.‬‬
‫ה‪-‬‬
‫‪DKA‬‬
‫כ פ י שנמדדה על י ד י‬
‫ה א נ ק ו ד פ ו ר צ י ה של מ י מ י ד י ן מ ס ו מ ן א י נ ה מתהילה אלא לאתר‬
‫הסעה ה‪ 12-‬סל ה נ ב י ט ה ‪ .‬מ י ט ו ז ו ת ר א ס ו נ ו ת ה נ י ת נ ו ת לתצפית מ י ק ר ו ס ק ו פ י ת מ ו פ י ע ו ת מ ן השעה ה ‪. 1 6 -‬‬
‫לא‬
‫י ד ו ע דבר על ה ס י ב ו ת ל ד כ ו י ה ס י נ ת ז ה של‬
‫ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה עם‬
‫‪P‬‬
‫‪DNA‬‬
‫בשעות ה נ ב י ט ה ה ר א ס ו נ ו ת ‪.‬‬
‫)טבלה ‪ (2‬מ ע י ד ו ת כ י גם ה ס י נ ת ז ה הכללית של ‪RNA‬‬
‫במסך ‪ 12‬סעות ה נ ב י ט ה ה ר א ס ו נ ו ת ‪ .‬הפרדת א ו כ ל ו ם י ת מ ו ל ק ו ל ו ת ה ־‬
‫ה נ ב י ט ה ה ר א ס ו נ ו ת על עמודת ‪MAK‬‬
‫מצב‬
‫זה ד ו מ ה לממצאי‬
‫של ם י נ ת ז ת ה ‪RNA -‬‬
‫בתכולת ה ‪rRNA -‬‬
‫גורדון‬
‫מראה כ י‬
‫ובראון‬
‫)‪(65,66‬וגלישין‬
‫) ‪ ( 6 7‬בביצי ד ו‬
‫מתהילה רק אתרי השעה ה ‪ 2 4 -‬ל נ ב י ט ה ‪.‬‬
‫ה נ ו צ ר ת במשך שס שעות‬
‫ח י י ם סבהם יס ד כ ו י‬
‫מ צ ב י ע ו ת כ י העליה‬
‫‪rRNA‬‬
‫נ ת ו נ י ם א ל ו הם‬
‫)דפרסיה(‬
‫ב נ י ג ו ד ל נ ת ו נ י די ורם‬
‫במשך ‪ 24‬השעות ה ר א ש ו נ ו ת ל נ ב י ט ה לא משתנה תכולת ה ר י ב ו ז ו מ י ם‬
‫א ו ל ם כבר לאחר שעת נ ב י ט ה מ ו פ י ע י ם פ ו ל י ז ו מ י ם ‪.‬‬
‫נ ס ו י י ה ח י ת ו ך של ה פ ו ל י ז ו מ י ם ה מ ו ק ד מ י ם האלו‬
‫א י נ ם מ צ ב י ע י ם על כך ש ה מ ם נ ג י ר שאפשר את ה ו ו צ ר ו ת ם ה ו א ‪wRNA‬‬
‫פ ו ל י ז ו מ י ם ש ה ו פ ק ו מ ע ו ב ד י ם ב נ י ‪ 48‬ש' מ צ ב י ע על כך ש ‪-‬‬
‫ל פ ו ל י ז ו מ י ם ה ו א ‪RNA‬‬
‫מדוכאת )‪(Repressed‬‬
‫‪ SRNA‬הוא ה מ ו ל ק ו ל ה ה ר א ס ו נ ה המסתמנת במהלך ה נ ב י ט ה ‪.‬‬
‫עד שלב ה ג ם ט ר ו ל צ י ה ‪ .‬ב ד י ק ו ת ה ס י נ ת ז ה נ ט ו של‬
‫ו וטרם ב נ ב י מ ת כ ו ת נ ה ) ‪. ( 6 8 , 5 1‬‬
‫וקושרם‬
‫‪RNA‬‬
‫תוצאות נ ם ו י‬
‫חדש ש נ ו צ ר לאחר ה נ ב י ט ה ‪.‬‬
‫‪RNA‬‬
‫ש נ ו צ ר אחרי ה נ ב י ט ה‬
‫תיתוך‬
‫הנמצא על פ נ י השטח של ה ר י ב ו ז ו מ י ם‬
‫נ ט ו י י ם אלו אינם‬
‫י כ ו ל י ם להבחין‬
‫‪—101 -‬‬
‫ב‬
‫מ א פ ש ר ו ת את‬
‫בשיטה‬
‫שנוצר מ י ד‬
‫‪mRNA‬‬
‫זו‬
‫ההבתנה ב י ן‬
‫נקבע כ י רק‬
‫טרנםקריפציה‬
‫ליותר‬
‫ל ‪-‬‬
‫לאחר‬
‫מאשר‬
‫‪0.3‬‬
‫ן ‪-‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫ופוליזומים‪,‬‬
‫הפעלת‬
‫גם‬
‫נחשף‬
‫ל ק ב ו ע את‬
‫ה ‪-‬‬
‫הגנום‬
‫ע‬
‫השעות‬
‫שעות‬
‫הנביטה‬
‫גודל כמו‬
‫מכיון‬
‫יש‬
‫א י ן‬
‫‪0.28‬‬
‫המתאים‬
‫נמצא‬
‫הגנטי‬
‫‪ DNA‬ו ג ם‬
‫להעשות‬
‫לגלות‬
‫הנביטה‬
‫בשעות‬
‫איפוא כי כל‬
‫אינו‬
‫ההברידיזציה‪.‬‬
‫‪mRNA‬‬
‫חדש‬
‫שקדמו ל כ ך‬
‫אוחו חלק‬
‫נסויי‬
‫פעיל עד‬
‫מנגנון‬
‫בשיטת‬
‫נוכחותו של‬
‫לגודלו של‬
‫הפעלת‬
‫הגנום‬
‫שעבר‬
‫אינו‬
‫קומפלמנטרי‬
‫הקומפלמנטרי‬
‫ת ו ך ^ ם ‪RNA,‬‬
‫האנקורפורציה אל‬
‫השעה‬
‫ה‪12-‬‬
‫לנביטה‪.‬‬
‫הטרנםקריפציה‪ .‬הלק‬
‫‪ DNA‬מ ו ע ת ק‬
‫המתוארים‬
‫בנםויים‬
‫הבסיסים‬
‫העובר‬
‫שנבדקו‪.‬‬
‫)‪.(69‬‬
‫מאותו ז מ ן‬
‫הגנום‬
‫חלה‬
‫המועתק‬
‫להסיק מכך כ י עד‬
‫‪48‬‬
‫טדנםקריפציה‬
‫השעות‬
‫אחוז‬
‫הגנום‬
‫בנםויי‬
‫ו ג ו ד ל הלק‬
‫נביטה‬
‫חלקים‬
‫אפשר‬
‫סוגי‬
‫‪RNA‬‬
‫בעוברי‬
‫מלאה עם‬
‫הופעל‬
‫אחרים של‬
‫אפשרו‬
‫‪RNA‬‬
‫אותו חלק‬
‫הגנום לא‬
‫בפרק ז מ ן של‬
‫הושוו‬
‫האחראי‬
‫הוא‬
‫איפוא‬
‫אוכלוסיות‬
‫לקבוע כ י‬
‫העובר‬
‫אחוזים‪.‬‬
‫בנםויי‬
‫ונשאר‬
‫ההרוויה‬
‫הגנום‬
‫שפעל‬
‫קודם‬
‫פעלו‬
‫קודם‬
‫כ‬
‫במהלך‬
‫באותו‬
‫הנמצאות‬
‫היבש‬
‫העובר‬
‫בין‬
‫‪2.3$‬‬
‫נמצא‬
‫המסג'‬
‫של‬
‫אחוזים‪.‬‬
‫‪.‬‬
‫שעות‬
‫לנביטה‪.‬‬
‫הגנום‬
‫טרנםקריפציה‬
‫טרנםקריפציה ב י ן‬
‫בעובר‬
‫כדי‬
‫ליצירת‬
‫‪0.023‬‬
‫‪0.6‬‬
‫משתנה‬
‫‪24‬‬
‫אחוז‪.‬‬
‫אחוז‪.‬‬
‫ג ו ד ל תלק‬
‫שעבר‬
‫אינו‬
‫‪1.9‬‬
‫‪3.8‬‬
‫‪(3.8-0.6) 3.2$‬‬
‫פרקי ז מ ן א ל ו‬
‫חיטה‬
‫הגנום‬
‫‪sRNA‬‬
‫‪RNiWo‬‬
‫התחרותית‬
‫נםויים אלו‬
‫הפעיל ה ו א‬
‫אלו הוא‬
‫איפוא‬
‫החיטה ה ו א‬
‫לראות כ י‬
‫הגנום של ה ‪-‬‬
‫מוקדמת ה ו א‬
‫ההברידיזציה‬
‫עובר‬
‫הגנום‬
‫‪,24-48‬‬
‫הפעיל‬
‫תחרות‬
‫נביטת‬
‫עובר‬
‫גודלו של חלק‬
‫‪A,B22‬‬
‫המיתרגם ב י ן‬
‫הנביטה‪.‬‬
‫שעות‬
‫מנםויים אלו כ י‬
‫בתמונות‬
‫הנביטה‬
‫שחלק‬
‫בקביעת‬
‫המשלימים של ש נ י‬
‫אחוז‬
‫מעובר יבש‬
‫צורך‬
‫השונים‪,‬‬
‫הגנום‬
‫ש ו נ י ם של‬
‫בשעה‬
‫ה‪ 12-‬ש ל‬
‫‪i n v i v o‬הרי‬
‫המיתרגם היה‬
‫הנסויים‬
‫נמצא כ י‬
‫‪RNA‬‬
‫השונים‬
‫במהלר‬
‫טרנסקריפציה‬
‫טרנםקריפציה ב י ן‬
‫בפרקי ז מ ן‬
‫להסיק‬
‫אתוז‬
‫לסוגי ה ‪-‬‬
‫‪RNA‬‬
‫במידע‬
‫בבע״ח‬
‫^‪RNA‬‬
‫ה ‪-‬‬
‫שהמנגנון‬
‫העובר‬
‫אחוז‬
‫ה מ כ י ל את‬
‫‪,48-72‬‬
‫החיטה‬
‫‪ .‬מן‬
‫המסג'‬
‫ם‬
‫כפי‬
‫שנראה‬
‫להלן‪.‬‬
‫גדיל אחד של ה ‪-‬‬
‫שעבד‬
‫‪RNA‬‬
‫המסתמן‬
‫אחוז מן‬
‫חלקו של ה ‪-‬‬
‫חלק הגנום‬
‫הנביטה‬
‫הגנום‬
‫ההכפלה של ה ‪-‬‬
‫דבר‬
‫ניתן‬
‫ניתן‬
‫‪-‬‬
‫הקומפלמנטרי‬
‫הוא‬
‫חלקו של‬
‫בשעה‬
‫ה‪12-‬‬
‫של‬
‫זה‬
‫לפוליזומים‪ .‬גם‬
‫‪RNA‬‬
‫אחת‪.‬‬
‫‪ - r R N A‬ו‪sRNA‬‬
‫‪rRNA‬‬
‫‪mRNA‬‬
‫מצביעים על כך‬
‫גודל חלק‬
‫מכי ו ן שרק‬
‫ו ־‬
‫‪.rRNA‬‬
‫תתילת‬
‫‪rRNA‬‬
‫כ ו ל ו בבת‬
‫הנביטה אך לא‬
‫הנביטה‪.‬‬
‫מנגנון‬
‫חלק הגנום‬
‫אתרי‬
‫הגיע‬
‫ההפרדות של‬
‫כ ? ל י ע ל ^ ל א י‬
‫מכיל‬
‫‪24‬‬
‫בעובר‬
‫‪,mRNA‬‬
‫ל‪48-‬‬
‫שעות‪,‬‬
‫להתיבשותו‪.‬‬
‫מ‬
‫ו‬
‫ת‬
‫ה‬
‫_‬
‫סדר‬
‫‪RNA‬‬
‫־־ ‪- 102‬‬
‫בעובר‬
‫החיטה היא‬
‫בנםוי‬
‫ההברדיזציה‬
‫מיקרוגרם‪/‬ג״ר‬
‫כי‬
‫‪3.5‬‬
‫התתרותית‬
‫עוברים‬
‫קצב‬
‫הטרנםקריפציה‬
‫העדר‬
‫כושר‬
‫עוברים‪.‬‬
‫ו י ד י ע ת םך‬
‫בתישוב של‬
‫‪mRNA‬‬
‫מיקרוגרם‬
‫ש‪40-‬‬
‫מ״ג‪/‬ג״ר‬
‫)‪(33‬‬
‫מעידים‬
‫כי‬
‫המסג׳‬
‫בלתי‬
‫מופרות של‬
‫קפודי‬
‫י ם ) ‪(70,71‬‬
‫אולם‬
‫נביטה‪,‬‬
‫מכן‪.‬‬
‫כי‬
‫‪60‬‬
‫שגודל‬
‫מכיוון‬
‫בחלקו עבר‬
‫חישוב‬
‫התדר של‬
‫מידת‬
‫נתוני‬
‫הגנום‬
‫כ ‪-‬‬
‫‪1‬‬
‫האחראי‬
‫לחישוב‬
‫זו‬
‫בשעור של‬
‫היא‬
‫ט ר נ ט ק ר י פ צ י ה בעת‬
‫המסג'‬
‫כמות‬
‫הנביטה‪.‬‬
‫בעובר‬
‫היבש‬
‫‪,‬‬
‫שנועד‬
‫להישמר‬
‫ועמידותו של‬
‫העובר‬
‫בתנאי‬
‫יציב‪,‬‬
‫וממוסך‪.‬‬
‫מוגן‬
‫כ‪760-‬‬
‫מכאן‬
‫אפשר‬
‫בעובר‬
‫סביבה‬
‫כזה‬
‫מסג׳‬
‫לתשב‬
‫היבש‪.‬‬
‫קיצוניים‬
‫בביצים‬
‫נמצא‬
‫ח י י ם )‪.(72‬‬
‫ודו‬
‫לקבוע‬
‫סוגים‬
‫כי‬
‫המסג'‬
‫השתנה‬
‫וחלק‬
‫חדשים של‬
‫שנוצרה‬
‫באופן‬
‫לפני‬
‫ניכר‬
‫מקביל עבר‬
‫מסגי‬
‫מופיעים‬
‫‪ 48‬ש ע ו ת‬
‫באותו פרק‬
‫אתרי‬
‫ממשיכים‬
‫זמן‪,‬‬
‫הרי‬
‫‪ 48‬ש ע ו ת‬
‫להיווצר‬
‫שניתן‬
‫גם‬
‫להסיק‬
‫לאתר‬
‫מכאן‬
‫‪. Switch‬‬
‫‪011‬‬
‫‪rDNA‬‬
‫למיקרא של כ ל ס ו ג‬
‫‪10x2.08‬‬
‫היבש‬
‫‪o rDNA‬־‪sDNA‬‬
‫ה ה ב ר י ד י ז צ י ה עם‬
‫פיקורגרם‪20.8‬ג י י ר‬
‫‪1‬‬
‫ו ‪-‬‬
‫כמות‬
‫לציסטרון של מ ס ג‬
‫חייב‬
‫הפעיל לא‬
‫‪sDNA‬‬
‫שלמה אחת‪.‬‬
‫להיות‬
‫אפשרו‬
‫היבש‪.‬‬
‫על פי‬
‫בעובר‬
‫‪Switch off‬‬
‫הגנום‬
‫‪RNA‬‬
‫פעם‬
‫עוברים‬
‫העוברים‬
‫היבש‬
‫האוכלוסיה של‬
‫הגנום‬
‫בעובר‬
‫)‪(44‬‬
‫בעובר‬
‫התתרותית‬
‫אחוזים מן‬
‫העתקה‬
‫חלבון‬
‫הנמצא‬
‫נסויי‬
‫ה‪-‬‬
‫ה י ה כ‪16-20-‬‬
‫הממוצע‬
‫המסג׳‬
‫‪RNA‬‬
‫ה‪-‬‬
‫‪ 2.3$‬מ ן‬
‫נ ו צ ר ו בעת‬
‫סינתזה של‬
‫ההברידיזציה‬
‫כמות‬
‫בגרם‬
‫ניתנת‬
‫מנקודת‬
‫ההרוויה‬
‫מולקולרי‬
‫‪.‬‬
‫או‬
‫מ א פ ש ר י ם את‬
‫ס‬
‫כמות‬
‫זה‪.‬‬
‫ל‬
‫‪RNA‬‬
‫זו‬
‫נמצאת‬
‫התדר)‪(Redundency‬של‬
‫חישוב‬
‫כמות‬
‫באותו‬
‫ה ‪-‬‬
‫סדר‬
‫בגרעין‬
‫‪DNA‬‬
‫גודל של‬
‫חלק‬
‫חושבה‬
‫תכולת‬
‫‪DNA‬‬
‫בקבוצות‬
‫ך‪ /‬ו­‬
‫‪)73‬צמחים ש ו נ ו ת‬
‫לו‬
‫המולקולרי‬
‫גנום‬
‫של‬
‫ערך‬
‫(‪.‬‬
‫משקלו‬
‫הפלואידי של‬
‫הרויה‬
‫בנםוי‬
‫המולקולרי‬
‫עובר‬
‫גנום‬
‫של‬
‫ניתן‬
‫חיטה הוא לכן‬
‫‪sRNA‬‬
‫ה ה ר ו י ה עם‬
‫לחישוב‬
‫איפוא‬
‫)‪(74‬‬
‫‪12‬‬
‫‪. x 6 . 2‬‬
‫ניתן‬
‫לתשב‬
‫את‬
‫גודל‬
‫‪10x12.5‬‬
‫ונמצא‬
‫ד ל ט ו ן ‪ 1 0‬מ ת ו ך‬
‫ה ‪sDNA -‬‬
‫הכללי‪:‬‬
‫‪12‬‬
‫‪0‬‬
‫___‪1.43X2!212‬‬
‫=‬
‫אחת של‬
‫‪sRNA‬‬
‫יש‬
‫‪-‬‬
‫‪1‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫~‬
‫‪2.4‬‬
‫ל נ ו‬
‫בהנחה שיש‬
‫בגודל‬
‫לנו‬
‫כ‪60-‬‬
‫סוגי‬
‫ש ל‪10xsDNA‬‬
‫דלטון‪.‬‬
‫מידת‬
‫‪sRNA‬‬
‫התדר‬
‫עבור‬
‫‪7‬‬
‫בהנחת‬
‫משקל‬
‫מ ו ל ק ו ל ר י של‬
‫‪10‬‬
‫ד‬
‫בסדר‬
‫ג ו ד ל אחד‬
‫‪4‬‬
‫ל‬
‫ט‬
‫ן‬
‫ן‬
‫ע ב ו ר‬
‫‪sRNA‬‬
‫היא‬
‫ל כ ן‪-9.6X_10<>4^2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪.‬‬
‫‪10‬‬
‫‪2.5x10‬‬
‫תדר‬
‫זה‬
‫גבוה‬
‫הרב צ י ס ט ר ו נ י‬
‫ש‬
‫ל‬
‫ה‬
‫_‬
‫‪sDNA‬‬
‫ממידת‬
‫התדר‬
‫המתאימה‬
‫שנמצאה‬
‫בדרוזופילה‬
‫)‪(74‬‬
‫ומעידה על‬
‫אופיו‬
‫‪- 103 -‬‬
‫החרו יה‬
‫מערך‬
‫ע‬
‫ניתן‬
‫‪rlWA‬‬
‫ם‬
‫את‬
‫לחשב‬
‫גודל‬
‫‪x‬‬
‫בהתתשב‬
‫‪3‬‬
‫במשקל‬
‫^ ‪1 0‬‬
‫היא‪:‬‬
‫‪1‬‬
‫‪10x8.5‬‬
‫היחם‬
‫של‬
‫של‬
‫מולקולרי‬
‫‪X‬‬
‫‪72‬‬
‫=‬
‫‪2‬‬
‫דלטון‬
‫‪10x2‬‬
‫‪7‬‬
‫ה‪-‬‬
‫‪rDNA‬‬
‫‪6Wix_0.28‬‬
‫=‬
‫‪K‬‬
‫עבור‬
‫סוגי‬
‫‪2‬‬
‫־ — ‪-rDNA.-‬גםה‬
‫הוא‬
‫דלטיז‬
‫הרי‬
‫ה‬
‫זה‬
‫במקרה‬
‫‪10‬‬
‫רב‬
‫התדר‬
‫שמידת‬
‫‪10‬‬
‫ע ב ו ר‪rRNA-RNA‬‬
‫ציםטרוני‪.‬‬
‫‪2x10‬‬
‫אחרים‬
‫בין‬
‫‪1/10‬‬
‫על‬
‫)‪(75,76‬‬
‫ומידת‬
‫התדר‪.‬‬
‫ואולי‬
‫על‬
‫אף‬
‫םינתזת‬
‫יחס‬
‫החלבון‬
‫הגורם‬
‫המגביל‬
‫העדר‬
‫זה‬
‫אינה‬
‫את‬
‫הטמפלט‬
‫מודרכת‬
‫ע״י‬
‫המסג׳‬
‫על‬
‫כי‬
‫מצביעים‬
‫המסג'‬
‫בקרת‬
‫סל‬
‫נחשף‬
‫של‬
‫כך‬
‫בבת‬
‫התרגום‬
‫גיקוב‪-‬מונו‬
‫מעובר‬
‫)‪(78‬‬
‫עד‬
‫על‬
‫שני‬
‫קרבה‬
‫גודל‬
‫סדרי‬
‫טופוגרפית‬
‫בין‬
‫של‬
‫המשקלים‬
‫הציםטרונים‬
‫המולקולריים‬
‫של‬
‫‪rRNA‬‬
‫ו‪-‬‬
‫עבן־‬
‫ר‬
‫ה‪-‬‬
‫‪DNA‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫)‪.(linkage‬‬
‫ם‬
‫בחצי‬
‫שעה‬
‫מקליטת‬
‫כי‬
‫העובר‬
‫היבש‬
‫שהראה‬
‫של‬
‫החלבון‬
‫המסג'‪.‬‬
‫אורידין‬
‫על‬
‫יבש‪,‬‬
‫עד‬
‫המצריך‬
‫אינו‬
‫היבש‬
‫מצד‬
‫‪.‬‬
‫של‬
‫שני‬
‫מסגי‬
‫של‬
‫המסג'‬
‫הממוםך‬
‫רק‬
‫מקרה‬
‫מסג'‬
‫קצר‬
‫הוא‬
‫החלבון‬
‫הנמצא‬
‫במקרה‬
‫מסוגל‬
‫הפוליזומים‬
‫בעובר‬
‫כאן‬
‫ועולה‬
‫של‬
‫דק‬
‫האנקורפורציה‬
‫שםינטזת‬
‫קיומו‬
‫המיס‬
‫היבש‪.‬‬
‫לנו‬
‫עתה‬
‫תוך‬
‫‪mRNA‬‬
‫על‬
‫האקטיבציה‬
‫יש‬
‫בעובר‬
‫נסויי‬
‫אל‬
‫כך‬
‫מחדש של‬
‫הממוםך‬
‫אחת‪.‬‬
‫הוכחה‬
‫י‬
‫כולם‬
‫בםינטזה‬
‫של‬
‫אולי‬
‫םינתזת‬
‫מצביעים‬
‫‪RNA‬‬
‫י‬
‫באחד‬
‫מתחילה‬
‫האקטיבציה‬
‫מותנית‬
‫נ‬
‫י‬
‫סוגי‬
‫‪RNA‬‬
‫הגנום‬
‫לזה‬
‫עבור‬
‫הנובט‬
‫)‪(44‬‬
‫אנקורפורציה‬
‫ההברידזציה‬
‫ב‬
‫החלבון‬
‫הראשונות‪,‬‬
‫הסינתזה‬
‫מעיד‬
‫בעובר‬
‫מרכוז‬
‫או‬
‫אף‬
‫של‬
‫השוני‬
‫הצימיי‬
‫סינתזת‬
‫כי‬
‫התדר‬
‫שני‬
‫ה‪-‬‬
‫בתוך‬
‫דומה‬
‫שנמצא‬
‫אורגניזמים‬
‫שבו‬
‫חיים‬
‫המסג'‪.‬‬
‫קליטת‬
‫המים‬
‫של‬
‫מצביעים‬
‫לראשונה‬
‫במשך‬
‫נסויי‬
‫זה‪.‬‬
‫נראה‬
‫‪12‬‬
‫השעות‬
‫כי‬
‫ע״י‬
‫המים‬
‫היא‬
‫החלבון‬
‫היא‬
‫על‬
‫קליטת‬
‫סינתזת‬
‫צימוד‬
‫)‪(77‬‬
‫אולם‬
‫וקצב‬
‫נראה‬
‫הטרנסקריפציה‬
‫מאפשרת‬
‫הנביטה‬
‫כי‬
‫את‬
‫של‬
‫הנביטה‬
‫ופעילות‬
‫החלבון‬
‫המוקדמת‬
‫העליה‬
‫באנקורפודציה‬
‫הדרגתית‬
‫ולא‬
‫כל‬
‫ברמה של‬
‫התרגום‪.‬‬
‫בניגוד‬
‫לתרגום‪,‬‬
‫‪D‬‬
‫ונםויי‬
‫התחרותית‬
‫סינתזת‬
‫הציע‬
‫אקטינומיצין‬
‫הראשונות‬
‫ההברדיזציה‬
‫איפוא‬
‫‪,‬‬
‫‪i n vitro‬‬
‫עם‬
‫הופעת‬
‫דו‪-‬חיים‬
‫לצורך‬
‫חומצות‬
‫אמינו‬
‫שעות‬
‫בנוכחות‬
‫הפוליזומים‬
‫)‪(71‬‬
‫הבקרה‬
‫ביצי‬
‫לםנטז‬
‫חלבון‬
‫המופיעים‬
‫בעובר‬
‫נמרץ‬
‫גם‬
‫המוקדמת‬
‫קצב‬
‫בקצב‬
‫במשך‬
‫‪12‬‬
‫הנביטה‬
‫הרי‬
‫למודל‬
‫הבקרה‬
‫ביצורים‬
‫‪-‬‬
‫ג ב ו ה י ם שבהם המסג׳‬
‫בניסויים‬
‫א ר ו ך ‪ -‬ח י י ם ‪ ,‬ק י ו מ ו של מ נ ג נ ו ן בקרת ת ר ג ו ם ה ו א מ ח ו י ב ה מ צ י א ו ת ‪.‬‬
‫במערכת ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ש מ ר כ י ב י ה כ ו ל ם מ ע ו ב ר ח י ט ה ‪,‬‬
‫אופטימלית‪.‬‬
‫אמינית‬
‫נתקרו התנאים לפעילות הגנה‬
‫ב ת נ א י ה א ו פ ט י מ ו ם מ ס ו ג ל ת מערכת ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה לקשור ‪ 53‬מ י ל י מ י ק ר ו מ ו ל‬
‫ל פ ו ל י פ פ ט י ד ל מ ״ ג אתר‬
‫מעוברים‬
‫‪104‬‬
‫‪-‬‬
‫ש‬
‫ל ‪ rRNA‬בשעה ) ‪ 8 7 . 3‬מ י ק ר ו ג ר ם ( ‪ .‬זאת ב ת נ א י ש ה ר י ב ו ז ו מ י ם ה ו פ ק ו‬
‫ב נ י לא י ו ת ר מ־־‪ 24‬שעות נ ב י ט ה ‪ ,‬עבדו‬
‫הריבוזומים‬
‫חומצה‬
‫הוא ע ו ב ר י ם ב נ י ‪ 48‬א ו ‪ 72‬ש ע ו ת ‪.‬‬
‫נ ק ו י ותשיפה‪ .‬ה י ע י ל ו ת י ו ר ד ת פי ‪ 10‬כאשר מ ק ו ר‬
‫י ע י ל ו ת סינתזת החלבון‬
‫‪ i n vivo‬בתקופת ה ג י ד ו ל‬
‫ש ב י ן ‪ 24‬ל ‪ 4 8 -‬ש ע ו ת ‪ ,‬היא מ ״ ג ח ל ב ו ן ל מ ״ ג ר י ב ו ז ו מ י ם בשעה )מחושב מתוספת ח ל ב ו ן בשעה^מחולקת‬
‫בכמות‬
‫אתוז‬
‫ה ר י ב ו ז ו מ י ^ ב ע ו ב ר י ם שלמים(‪.‬‬
‫מהאנקורפורציה‬
‫רב מ ע ר כ ו ת‬
‫‪i n vivo‬‬
‫י ע י ל ו ת מערכת ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה‬
‫ו ה י נ ה מ א ו ת ו סדר ג ו ד ל של מערכות א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה מ ח י ד ק י ם ) ‪. ( 7 9‬‬
‫ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה מ ! ^ ־ ‪in‬‬
‫ש ב ו ד ד ו מ א ו ר ג נ י ז י מ י מ ש ו נ י ם מ ש ל י מ ו ת את פ ע ו ל ת ן ת ו ך‬
‫‪20‬־‪ 15‬דקות ב ע ו ד מערכת ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה מחיטה עם פ ו ל י‬
‫‪ U‬פ ו ע ל ת כ ש ע ת י י ם בקצב ל י נ א ר י ת ו ך‬
‫איניציאציה מתמדת של שרשרות חדשות‪ .‬ה ר י א ק צ י ה נעשית כ ו ל ה על ג ב י‬
‫הרטיקולוציטים‬
‫בין‬
‫המסג'‬
‫ולפעול‬
‫ו‪-‬‬
‫)‪.(60‬‬
‫מ ו נ ו ז ו מ י ם ב ל ב ד ‪ ,‬ב ד ו מ ה למערכת‬
‫נ ס ו י י ה ת י ת ו ך של פ ו ל י ז ו מ י ם עם ר י ב ו נ ו ק ל י א ז בלתי מסים הראו כ י הקשר‬
‫והריבוזומים יציב ביותר‪,‬‬
‫פ ע י ל ו ת מלאה ב ת נ א י ט י פ ו ל‬
‫‪•54S‬‬
‫‪i n vitro‬‬
‫היא א י פ ו א ‪8.7‬‬
‫ו כ י ד י ב ו ז ו מ י ם שהיו פ ע י ל י ם ב ס י נ ת ז ה ח ל ב ו ן מ ס ו ג ל י ם ל ח ז ו ר‬
‫ברכוז‬
‫נ מ ו ך ה ג ו ר ם ל ד י ם ו צ י א צ י ה ל ת ת ־ ח ל ק י ק י ם של‬
‫נ ם ו י י ם אלו מ צ ב י ע י ם על האפשרות כ י לפחות ל ג ב י מסגי‬
‫‪S33Mg‬‬
‫ם י נ ט ט י קים י ו ת ר מאתר אחד‬
‫ל ק י ש ו ר ו של ה מ ס ג ' ‪ ,‬אפשרות ש נ י ד ו נ ה כבר ביתם ל ר י ב ו ז ו מ י ס מ ת י ד ק י ק ו ל י‬
‫)‪.(80‬‬
‫השפעת ה ד ה ד ר צ י ה‬
‫ש נ ו י י מ ב נ ה והרכב התלים ב ע ו ב ר י ם שעבר ד ה ד ר צ י ה‬
‫ה ת צ פ י ו ת ב מ ק ר ו ט ק ו פ ה א ל ק ט ר ו נ י מ ל מ ד ו ת כ י ה י י ב ו ש של ע ו ב ר י החיטה א י נ ו ג ו ר ם ל ש י נ ו י י ם‬
‫סטרוקטורליים‬
‫נ כ ר י ם ו ז א ת ב נ י ג ו ד ל ת י א ו ר י ו ת של א י ל י ן ) ‪( 1 9‬‬
‫ח ל י ם במשך ‪ 24‬שעות ש נ ו י י ם ג ד ו ל י ם בתאי ע ו ב ר ב ן‬
‫ופיזור‬
‫ו ל ו י ט ) ‪ . ( 1 4‬עם ההרטבה מחדש‬
‫‪ 72‬שעות המתבטאים ב ע י ק ר ב ה ת פ ו צ צ ו ת ה ג ר ע י ן‬
‫ה צ י ט ו פ ל ס מ ה ‪ .‬ש נ ו י י ם אלו לא ק ו ר י ם ב ע ו ב ר ה ע מ י ד ‪ .‬ההנחה כ י‬
‫ל א ו ר ממצאים א ל ו כפשטנית מ ד י ‪.‬‬
‫נ ז ק י ה י ו ב ש הם מ כ נ י י ם נ ר א י ת‬
‫ה נ ם ו י י ם ל ב ח י נ ת ה ת י א ו ר י ה של ה פ י ר ו ק ה א נ ז י מ ת י כ ג ו ר ם ל נ ז ק י‬
‫ ‪ 05‬ו ­‬‫ה י ו ב ש א י נ ם מאשרים את ההנחה כ י יש א נ ד ו ק צ י ה של פ ע י ל ו ת א נ ז י מ ת י ת פ ר ו ט י א ו ל י ט י ת ‪,‬‬
‫ריבונוקלאוליטית‪ .‬אין‬
‫אוליטית או‬
‫דאוקםי‬
‫אנזימתית‬
‫ע ״ י תסיפת ם ו ב ס ט ר ט י ם ‪ ,‬הפעלת ג ו פ י ם ד מ ו י י‬
‫ריבונוקלי‪-‬‬
‫ה נ י ס ו י י ם ה ל ל ו מ ו נ ע י ם את האפשרות של א ק ם י ב צ י ה‬
‫ליזוזים וכדי‪.‬‬
‫בדיקת תכולת ה ח ל ב ו ן ב ע ו ב ר י ם ש י ו ב ש ו א י נ ה מאשרת את ה ת י א ו ר י ו ת ה ר ו ו ח ו ת בדבר ה ד ר ו ל י ז ה של‬
‫המושרית ע ״ י‬
‫החלבונים‬
‫י ו ב ש ) ‪ . ( 8 1‬ה ח ל ב ו ן המסיס‬
‫ו ח ל ב ו נ י המשקע א י נ ם מתפרקים‬
‫בעוברים‬
‫ע מ י ד י ם כ ב ע ו ב ר י ם ר ג י ש י ם ל ד ה ד ר צ י ה ‪ .‬את ה ע ל י ה התלה בתכולת ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ ו החפשיות יש ליחס א ו‬
‫לטרנםלוקציה מן‬
‫האמינו‬
‫ל ד ה ד ר צ י ה התבטאה בעיקר בהופעת א מ ו נ י ה תפשית‬
‫האםפרטית‬
‫אחרים‬
‫ליחס‬
‫ו ה ג ל ו ט מ י ת ו ע ל י ה בתכולת ה פ ר ו ל י ן ‪ .‬ה י ר י ד ה ברמת החומצה ה ג ל ו ט מ י ח י ו ח ס ה במקרים‬
‫ל ס י נ ת ז ה ד ה ‪ -‬נ ו ב ו ) ‪ . ( 3 4‬כך או כ ך ‪,‬‬
‫מ כ י ו ן ש ה ש י נ ו י י ם אשר ת ל ו בהשפעת הדהדרציה במאגר‬
‫ה א מ י נ ו התפשיות ח ל ו במגמה ד ו מ ה ב ע ו ב ר י ם ע מ י ד י ם כ ב ע ו ב ר י ם ר ג י ש י ם ‪ ,‬א י ן לראות בהם‬
‫מ ט ב ו ל י מ ר כ ז י שיש ל ו קשר עם ההבדל ב ע מ י ד ו ח ‪ -‬ס נ ט י ז ת ה ח ל ב ו ן‬
‫נסויי‬
‫בעוברים‬
‫שדכוי‬
‫וארגינין‪.‬‬
‫י ר י ד ה נכרת בתכולת החומצה‬
‫ל ד א מ י נ צ י ה א ו ק ס י ד ט י ב י ה המושרית ע ״ י מחסור המים ) ‪ . ( 3 6‬את העליה בתכולת ה פ ר ו ל י ן יש‬
‫החומצות‬
‫גורם‬
‫האנדוםפרם‪ ,‬או‬
‫ל ס י נ ת ז ה ד ה ‪ -‬נ ו ב ו ‪ ,‬כ פ י שנמצא בצמתים א ת ר י ם ) ‪ . ( 8 2‬ת ג ו ב ת ת ו מ צ ו ת‬
‫ב ע ו ב ר י ם שעברו ד ה ד ר צ י ה ‪.‬‬
‫ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה ‪ '•vivo‬מ‪1‬של ח ו מ צ ו ת א מ י נ ו מ ר א י ם כ י ס י נ ת ז ת ה ח ל ב ו ן נפסקת כמעט‬
‫עמידים‬
‫ו ר ג י ש י ם ש י ו ב ש ו ‪ .‬מ כ י ו ן שבדיקת‬
‫םינתזת החלבון‬
‫אינו‬
‫ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה נעשתה ת ו ך הרטבת ה ע ו ב ר י ם הרי‬
‫ר ו ר ז ב י ל י ‪ .‬במצב זה ד ו מ י ם ה ע ו ב ר י ם ש נ ב ט ו ‪ 24‬שעות‬
‫ויובשו‪,‬‬
‫לעוברים‬
‫שלא נ ב ט ו כ ל ל ‪ .‬ב ח י פ ו ש אחד ה ג ו ר ם ה מ ג ב י ל את ם י נ ת ז ת ה ח ל ב ו ן ב ע ו ב ד י ם ש י ו ב ש ו נמצא כ י ת כ ו ל ה‬
‫ופעילות ה‪-‬‬
‫‪ sRNA‬ה כ ל ל י‬
‫ושניים ממרכיביו‬
‫‪ -‬ל ו ־ י צ י ן ‪ sRNA‬ו פ נ י ל א ל נ י ן‬
‫‪ sRNA‬א י נ ם משתנים‬
‫עכב ה י י ב ו ש ‪ .‬כ ו ש ר ה א ק ט י ב צ י ה ו ה ט ר נ ם פ ר של א נ ז י מ י ם ב ת ם נ י ן שנלקח מ ע ו ב ר י ם מ י ו ב ש י ם אף ה ו א‬
‫לא נ פ ג ע ‪ .‬לעומת זאת כושר ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של ר י ב ו ז ו מ י ם ש נ ל ק ת ו מ ע ו ב ר י ם ש י ו ב ש ו‬
‫נפגם כ ל י ל ‪.‬‬
‫ב נ ם ו י י ם שבהם נבדק פ ו ט נ צ י א ל ה פ ע ו ל ה של ר י ב ו ז ו מ י ם א ל ו עם מסגי ם נ ט ט י נמצא כ י ה ר י ב ו ז ו ם‬
‫עצמו‬
‫פ ע י ל ב מ ל ו א ו ‪ .‬המסקנה המתבקשת ה י א שהפגם מ צ ו י ב מ ס ג '‬
‫ה א נ ד ו ג נ י ‪ .‬הרטבה מחודשת של‬
‫העוברים‬
‫מ ח ז י ר ה את ם י נ ת ז ת ה ח ל ב ו ן ב ע ו ב ר י ם ע מ י ד י ם למעלה מרמת הבקורח ורק בחלקה ב ע ו ב ר י ם‬
‫רגישים‪.‬‬
‫בעוד ש ר י ב ו ז ו מ י ם שנלקחו מעוברים‬
‫בדיקת ה ר י ב ו ז ו מ י ם במערכת א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה מראה כ י‬
‫‬‫עמידים‬
‫שיובסו‬
‫רגישים‬
‫נשארים‬
‫הדהדרציה‬
‫גורמת‬
‫גורמת‬
‫להופעה‬
‫המסגיר‬
‫והורטבו‬
‫ללא‬
‫בנבטי‬
‫קקיון‬
‫לפירוק‬
‫בעוברי‬
‫משמעותה‬
‫של‬
‫איניציאציה‪,‬‬
‫ע‬
‫ם‬
‫‪48‬‬
‫המצב‬
‫של‬
‫והוא‬
‫לזה‬
‫ממוסך‬
‫שאינו‬
‫כ‪80-‬‬
‫המסג'‬
‫מן‬
‫‪RNA‬‬
‫נמצאה‬
‫בנבטי‬
‫עגבניה‬
‫הנוצר‬
‫בעוברים‬
‫תקינים‬
‫הרי‬
‫שמסג'‬
‫של‬
‫על‬
‫סוכרוז‬
‫הריבוזומים‬
‫ובעוברים‬
‫עמידים‪.‬‬
‫מ נ ג נ ו ן‬
‫ביטוי‬
‫או‬
‫רגישים‪,‬‬
‫נטויים‬
‫םינתזית‬
‫מפל‬
‫אלו‬
‫החלבון‬
‫אולם‬
‫כקודמיהם‬
‫בדומה‬
‫הראתה‬
‫ההרטבה‬
‫המחודשת‬
‫מצביעים‬
‫למה‬
‫כי‬
‫שהציע‬
‫על‬
‫מרי‬
‫‪72‬‬
‫מיוחד‬
‫זה‬
‫או‬
‫בעובר‬
‫נמצא‬
‫מגיבים‬
‫שמסג'‬
‫המסג'‪.‬‬
‫נסויי‬
‫ההברידיזציה‬
‫העמיד‬
‫הדיבוזומים‬
‫ולפיכך‬
‫התתרותית‬
‫הקיים‬
‫לפני‬
‫שנפגע‬
‫על‬
‫ממוסך‬
‫יש‬
‫הרי‬
‫מסגי‬
‫שמסג'‬
‫הריבוזומים‬
‫ל פ ו ל י ן‬
‫נראה‬
‫כי‬
‫הנמצא‬
‫הזהה‬
‫לזה‬
‫זה‬
‫או‬
‫ואינו‬
‫מדברת‬
‫תהליך‬
‫זהה‬
‫רגישים‬
‫מכיון‬
‫אינו‬
‫ע״י‬
‫עם‬
‫עם‬
‫דהדרציה‬
‫נכון‬
‫המסג'‬
‫שיובשו‬
‫שאין‬
‫יכול‬
‫לטובת‬
‫היבש‬
‫בעובר‬
‫‪-‬‬
‫הנמצא‬
‫שהוא‬
‫או‬
‫נותר‬
‫פגום‬
‫תחרותית‬
‫בעובר‬
‫נמצא‬
‫להתקשר‬
‫ההשערה‬
‫ההתיבשות‪,‬‬
‫השניה‪.‬‬
‫שהוא‬
‫עדיין‬
‫בעובר‬
‫בן‬
‫על‬
‫עמם‬
‫מאפשר‬
‫מגיע‬
‫בעוביים‬
‫נעלמו‪.‬‬
‫והורטב‬
‫נסויי‬
‫מחדש‬
‫בני‬
‫האנקורפורציה‬
‫ליצור‬
‫מסוגל‬
‫לגבי‬
‫עוברים‬
‫עמידים‬
‫שנוצר‬
‫בעוברי‬
‫הבקורת‬
‫בין‬
‫שונה‬
‫לגמרי‬
‫והורטבו‬
‫מחדש‪,‬‬
‫פוליזומים‬
‫לריבוזומים‪.‬‬
‫מחודשת‬
‫יתכן‬
‫שעות‬
‫‪72‬‬
‫כעוברים‬
‫יצירת‬
‫כנראה‬
‫הנותר‬
‫‪RNA‬‬
‫ההתיבשות‪,‬‬
‫הדבר‬
‫)‪,(37‬‬
‫עמידים‬
‫שעות‪.‬‬
‫אלו‬
‫אן‬
‫אנקורפורציה‬
‫יכולה‬
‫להיות‬
‫מיםון״‬
‫מסגי‬
‫והיעדר‬
‫במערכת‬
‫דומה‬
‫בכללו‬
‫הווצרותו‬
‫בן‬
‫שעות‬
‫‪24‬‬
‫הייבוש‪.‬‬
‫העובר‬
‫בעוברים‬
‫אינו‬
‫נבט‬
‫העמיד‪,‬‬
‫כי‬
‫בפעילות‬
‫שהוא‬
‫שלא‬
‫של‬
‫במערכת‬
‫המסג'‬
‫מראים‬
‫שריבוזומים‬
‫ע״י‬
‫מראים‬
‫בני‬
‫עמידים‬
‫בעוברים‬
‫אנדוגנית‬
‫שיובשו‬
‫שבעובר‬
‫כי‬
‫המסג'‬
‫שעברו‬
‫ההברידיזציה‬
‫הנוצר‬
‫אוכלוסית‬
‫בעוברים‬
‫רק‬
‫אנדוגנית‬
‫דהדרציה‬
‫והיעלמות‬
‫לו‬
‫בעובר‬
‫נפגע‬
‫נסויי‬
‫אחוז‬
‫בדיקת‬
‫המרכיבים‬
‫פעילות‬
‫ממו‪£‬ך‬
‫העובדה‬
‫במדויק‬
‫מסגי‬
‫חוטר‬
‫שאין‬
‫במצב‬
‫‪. i n‬‬
‫‪vitro‬‬
‫חיטה‬
‫בעוברים‬
‫מכיון‬
‫הריבוזומים‬
‫פוליזומים‬
‫בשרשרת‬
‫סבירה‬
‫הנותר‬
‫שעות‪.‬‬
‫אנדוגנית‪.‬‬
‫הפוליזומים‬
‫סל‬
‫הפגיעה‬
‫הם‬
‫נורמלית‪,‬‬
‫הרי‬
‫הריבוזומים‬
‫מעוברים‬
‫)‪.(48‬‬
‫מ ם נ ג י ר ^ !‬
‫‪RNA‬‬
‫פעילות‬
‫מחודשת‬
‫בתוליה‬
‫מהדש‬
‫בעלי‬
‫‪106‬‬
‫פעילות‬
‫־‬
‫‪24‬‬
‫של‬
‫ליתם‬
‫‪5 2‬‬
‫מםנגיר‪.‬‬
‫רגישים‪,‬‬
‫ל‪48-‬‬
‫רגישים‬
‫את‬
‫יצירת‬
‫"‪P‬‬
‫מראים‬
‫אל‬
‫תופעה‬
‫אולם‬
‫שעות‬
‫מאוכלוםית‬
‫בעוברים‬
‫ויש‬
‫שיובשו‪,‬‬
‫בעוד‬
‫שהמסג׳‬
‫הרי‬
‫בעוברים‬
‫המורטבים‬
‫המסג'‬
‫תוך‬
‫דומה‬
‫נביטה‪,‬‬
‫המסג'‬
‫כי‬
‫מחדש‪,‬‬
‫הבלתי‬
‫־‬
‫'נורמלי‬
‫הגרעי‬
‫סוף‬
‫רגישים‬
‫כעוברים‬
‫והורםבו‬
‫שיובשו‬
‫‪107‬‬
‫מתדש‬
‫‪-‬‬
‫ה‪ENA-‬‬
‫לשבירת‬
‫בנםויי‬
‫המתוארת‬
‫ופיצוץ‬
‫ההפקה‪,‬‬
‫נים־‬
‫דבר‬
‫הנםויים‬
‫בעוברים‬
‫עמידים‬
‫השיפה‪,‬‬
‫בלא‬
‫האתרים‬
‫של‬
‫מחדש‬
‫המנגנון‬
‫סינתזת‬
‫החלבון‬
‫חלבון‬
‫מסגי‬
‫אלו‪.‬‬
‫תקין‬
‫לתהליכי‬
‫גורם‬
‫נראה‬
‫גידול‬
‫החיטה‪.‬‬
‫הגנטית‬
‫באמצעות‬
‫הנובם‬
‫של‬
‫הפגיעה‬
‫הייבוש‬
‫שכנראה‬
‫כי‬
‫לפגיעה‬
‫בניה‬
‫הוא‬
‫זה‬
‫איפוא‬
‫בעובר‬
‫המים‬
‫כי‬
‫הרי‬
‫הקים‪,‬‬
‫שלפני‬
‫בהרטבה‬
‫מחודשת‬
‫המסג'‬
‫בגנום‬
‫פגום‪,‬‬
‫של‬
‫או‬
‫משבירה‬
‫תלקית‬
‫הנביטה‬
‫מחודשת‬
‫נפגע‪.‬‬
‫של‬
‫מכיון‬
‫מאפשרים‬
‫פוליזומים‪,‬‬
‫המים‬
‫הגנטי‪.‬‬
‫מכך‬
‫כתוצאה‬
‫בהרטבה‬
‫מסוגל‬
‫אין‬
‫קשורים‬
‫שרשרת‬
‫גורמת‬
‫הקים‪.‬‬
‫הרי‬
‫אינו‬
‫כתוצאה‬
‫את‬
‫המתפתת‬
‫הבקרה‬
‫והרם‬
‫פגיעה‬
‫תקינים‪.‬‬
‫מפעילים‬
‫במנגנון‬
‫לא‬
‫מן‬
‫המסג'‬
‫התקופה‬
‫נפגעו‬
‫מצידו‬
‫חלה‬
‫מסגי‬
‫הראינו‬
‫התא‪.‬‬
‫בעובר‬
‫של‬
‫של‬
‫החיטה‬
‫םינתזת‬
‫סינתזה‬
‫מסגי‬
‫שכל‬
‫המים‬
‫פעיל‬
‫הממכיבים‬
‫לגנום‬
‫חלבון‪,‬‬
‫שעבר‬
‫לפעול‬
‫והמשך‬
‫תקין‪.‬‬
‫והתפתחות‬
‫התפוררות‪.‬‬
‫בעובר‬
‫המאפשר‬
‫במסלול‬
‫מכיון‬
‫התקינה‪.‬‬
‫ועמה‬
‫דכוי‬
‫או‬
‫שהמםג'‬
‫רגישים‬
‫בעוברים‬
‫זה‬
‫ממיםוכו‬
‫הממוםך‬
‫וההתפתחות‬
‫בעוברים‬
‫המסג'‬
‫נובע‬
‫לעיל‬
‫שנותר‬
‫וליצור‬
‫הגידול‬
‫הבקרה‬
‫המתוארים‬
‫מציעים‬
‫כי‬
‫ייבושס‬
‫עוברי‬
‫גורם‬
‫לדכוי‬
‫התלבון‪.‬‬
‫המאורעות‬
‫הרחקתם‬
‫של‬
‫מכך‬
‫מחודשת• נ ו צ ר‬
‫להתקשר‬
‫העובר‬
‫באופן‬
‫נפסקת‬
‫עם‬
‫ממשיך‬
‫הדוק‬
‫המים‪,‬‬
‫השונה‬
‫הריבוזומים‬
‫גידולו‬
‫את‬
‫בתהליכי‬
‫המוקדמת‪,‬‬
‫םינתזת‬
‫מסגי‬
‫היסוד‬
‫המאפשרת‬
‫להפסקת‬
‫מאוכלוםית‬
‫ולאפשר‬
‫והתאים‬
‫של‬
‫הפעלתו‬
‫הגידול‬
‫החלבון‬
‫םינתזת‬
‫נכנסים‬
‫גידול‬
‫של‬
‫עובר‬
‫מ נ ג נ ו ן‬
‫והדפרנציאציה‬
‫‪-‬‬
‫‪108 -‬‬
‫ס י כ ו ם‬
‫‪.1‬‬
‫נחקרה‬
‫מערכת‬
‫ה ד ר ו ש ין!‬
‫‪.2‬‬
‫נמצא‬
‫‪.3‬‬
‫לאינקורפורציה של‬
‫כי‬
‫אורך‬
‫פולי‬
‫הפולי‬
‫בתנאי‬
‫נמצא‬
‫אין‬
‫הנוצר‬
‫חומצות‬
‫חומצות‬
‫הנוצר‬
‫לקבל‬
‫אמינו‬
‫במערכת‬
‫במערכת‬
‫מיעילות‬
‫יצירת‬
‫במערכת‬
‫התפשיח‬
‫מתאים‪.‬‬
‫המודרכת‬
‫ידי‬
‫פולי ‪U‬‬
‫המודרכת‬
‫על‬
‫א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של‬
‫םינתזת‬
‫על‬
‫פוליזומים‬
‫החלבון‬
‫ידי‬
‫מחיטה‬
‫על‬
‫ידי‬
‫‪60‬‬
‫פולי‬
‫‪A‬‬
‫מגיע‬
‫מגיע‬
‫‪=10‬‬
‫לאורך‬
‫של‬
‫‪-30‬‬
‫‪n‬‬
‫‪n‬‬
‫מ י ל י מ י ק ר ו פ ו ל ח ‪ .‬אפינית לפ״ג ר י ב ו ז ו מ י ם‬
‫בשעה‬
‫‪.in vivo‬‬
‫מסג‬
‫‪,‬‬
‫סנטטי‬
‫וכל‬
‫הפפטיד‬
‫נוצר‬
‫על‬
‫גבי‬
‫פונוזומים‬
‫אליו‪.‬‬
‫התנאים‬
‫להיברידיזציה‬
‫צמחי‬
‫‪RNA‬‬
‫אלנין‬
‫ניתן‬
‫‪8.7/°‬‬
‫קשור‬
‫נקבעו‬
‫של‬
‫ל י ז י ן‬
‫של‬
‫כי‬
‫ונשאר‬
‫‪.5‬‬
‫פניל‬
‫אופטימום‬
‫בניצולת‬
‫‪.4‬‬
‫ה א נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של‬
‫אמינו‬
‫שמרכיביה‬
‫כולם‬
‫ונמצאו‬
‫תנאי‬
‫האופטימום‬
‫נקבעה‬
‫‪ RNA‬מ ע ו ב ר‬
‫של‬
‫באמצעות‬
‫ח י ט ה עם‬
‫וירלי‪ ,‬בקטריאולי‬
‫‪DNA‬‬
‫הומולוגי‪.‬‬
‫םפציפיות‬
‫ההברידיזציה‬
‫ואנימלי‪.‬‬
‫‪IX‬‬
‫‪.1‬‬
‫נמצאה‬
‫מערכת‬
‫‪.2‬‬
‫נערכו‬
‫בדיקות ; צ י ט ו ל ו ג י ו ת‬
‫שנויים‬
‫‪.3‬‬
‫הכפלת‬
‫צמחית‬
‫בהרכב‬
‫ה‬
‫‪A‬‬
‫_‬
‫‪DN‬‬
‫‪.4‬‬
‫‪.5‬‬
‫הסינתזה של‬
‫‪.6‬‬
‫‪.7‬‬
‫תכולת‬
‫‪rRNA‬‬
‫הריבוזומים‬
‫ה‪-‬‬
‫‪sRNA‬‬
‫בתאי‬
‫‪mRNA‬‬
‫התת‪-‬תאיים‬
‫‪12‬‬
‫מ ת ח י ל ה דק‬
‫לאחר‬
‫עולה רק‬
‫לאתר‬
‫לאחר‬
‫‪24‬‬
‫לאחר‬
‫ב‪80-‬‬
‫יחסי‬
‫נובטים‪,‬‬
‫שעות‬
‫מתחילה‬
‫יורדת‬
‫עוברים‬
‫החלקיקים‬
‫מתחילה רק‬
‫ה ט ר נ מ ק ר י פ צ י ה של‬
‫כמות‬
‫פשוטה שבה‬
‫וארגון‬
‫ניתן‬
‫לחקור‬
‫‪24‬‬
‫אחוז‬
‫שעות‬
‫במיקרוסקופ‬
‫במהלך‬
‫אופטי‬
‫הנביטה‪.‬‬
‫נביטה‪.‬‬
‫‪12‬‬
‫שעות‬
‫נביטה‪.‬‬
‫נבייטה‪.‬‬
‫שעות‬
‫תוך‬
‫מים‬
‫צמח‪.‬‬
‫‪72‬‬
‫נביטה‪.‬‬
‫שעות‬
‫הנביטה‬
‫הראשונות‪.‬‬
‫ואלקטרוני‪.‬‬
‫לא‬
‫ניצפו‬
‫־ ‪- 109‬‬
‫‪.8‬‬
‫מנגנון‬
‫ההכפלה‬
‫‪.9‬‬
‫םינתזת‬
‫החלבון‬
‫‪.10‬‬
‫הוכת כי‬
‫והוצע‬
‫‪.11‬‬
‫והטרנסקריפציה‬
‫המתתילה‬
‫העובר‬
‫כי‬
‫היבש‬
‫בקרת‬
‫אותו חלק‬
‫מכיל‬
‫םינתזת‬
‫הגנום‬
‫בשעת‬
‫בעובר‬
‫במשך‬
‫לפני‬
‫‪12‬‬
‫הראשונה‬
‫בתוכו מסג'‬
‫החלבון‬
‫שפעל‬
‫עצורים‬
‫הנביטה‬
‫במשך‬
‫שמור‬
‫שעות‬
‫‪12‬‬
‫התיבשות‬
‫שעות‬
‫הראשונות‪.‬‬
‫הנביטה‬
‫אינה‬
‫מותנית‬
‫בסינתזה‬
‫ופמוסך‬
‫המתתיל‬
‫להתשף ע ם‬
‫הנביטה‬
‫הזרע‪,‬‬
‫הראשונות‬
‫גם‬
‫הוא‬
‫‪mRNA‬‬
‫נעשית‬
‫המופעל‬
‫חדש‪.‬‬
‫קליטת‬
‫ברמת‬
‫במשך‬
‫המים‬
‫הטרנסקריפציה‪.‬‬
‫שעות‬
‫‪48‬‬
‫הנביטה‬
‫הראשונות‪.‬‬
‫‪.12‬‬
‫בין‬
‫‪48‬‬
‫‪.13‬‬
‫לאחר‬
‫‪48‬‬
‫‪.14‬‬
‫גודלו‬
‫‪.15‬‬
‫מידת‬
‫של‬
‫‪.16‬‬
‫ל‪72-‬‬
‫שעות‬
‫הגנום‬
‫התדר של‬
‫חלקי‬
‫נחקרו‬
‫ה‪-‬‬
‫גנום‬
‫בכושרם‬
‫מסגי‬
‫מן‬
‫הגנום‬
‫הקומפלמנמרי‬
‫חושבה‬
‫‪rDNA‬‬
‫ל‪-‬‬
‫כ‪8500-‬‬
‫נוכח‬
‫לכן‬
‫‪.Switch off‬‬
‫‪rRNA‬‬
‫הוא‬
‫ושל‬
‫‪sDNA‬‬
‫אחוז‬
‫‪0.28‬‬
‫הוא‬
‫‪sRNA-Vi‬‬
‫ונקבע‬
‫כ־־‪960‬‬
‫אחוז‪.‬‬
‫‪0.023‬‬
‫א ו פ י ם הרב‬
‫צי סטור וני‬
‫אלו‪.‬‬
‫התכונות‬
‫הפיזיקליות‬
‫חשופים‬
‫ריבוזומים‬
‫נביטה‬
‫נביטה עבר חלק‬
‫של חלק‬
‫ריבוזומים‬
‫‪.17‬‬
‫שעות‬
‫נוצר‬
‫חדש שלא ה י ה‬
‫קודם‬
‫בעובר‪.‬‬
‫שהיו‬
‫ממסג'‬
‫פעילים‬
‫והוצע‬
‫הקטליטי‬
‫ו ה ק ט ל י ט י ו ת של‬
‫אנדוגני‬
‫ופוליזומים‬
‫בפוליזומים‪ ,‬הופרדו‬
‫כי‬
‫הריבוזומים‬
‫לריבוזומים אלו‪,‬‬
‫החיטה‪.‬‬
‫מעוברי‬
‫להכנת‬
‫עובדה דרך‬
‫יציבים‪.‬‬
‫בעזרת‬
‫יותר‬
‫ריבונוקליאז‬
‫מאתר אחד‬
‫בלתי‬
‫מסים‬
‫לקישורו של‬
‫ללא‬
‫פגיעה‬
‫המסג'‪.‬‬
‫‪III‬‬
‫‪.1‬‬
‫נמצא‬
‫כי‬
‫עד‬
‫‪.2‬‬
‫לאחר‬
‫‪72‬‬
‫שעות‬
‫‪.3‬‬
‫היובש לא‬
‫ל‪24-‬‬
‫נביטה‬
‫גורם‬
‫‪.4‬‬
‫אין‬
‫פירוק של‬
‫‪.5‬‬
‫רמת‬
‫התומצות‬
‫שעות‬
‫נביטה‬
‫גורם‬
‫לעליה‬
‫חלבונים‬
‫האמיניות‬
‫אפשר‬
‫היובש‬
‫להפסקת‬
‫בפעילותם של‬
‫בהשפעת‬
‫ל י ב ש את‬
‫החופשיות‬
‫גידול‬
‫אנזימים‬
‫מחסור‬
‫העוברים ללא נ ז ק ‪.‬‬
‫בלתי‬
‫חוזרת‪.‬‬
‫פרוטיאוליטים‬
‫מים‪.‬‬
‫עולה בעת‬
‫מחסור‬
‫מים‪.‬‬
‫או‬
‫ה ע ו ב ר י ם הם‬
‫עוברים אלו‬
‫עמידים‬
‫רגישים‬
‫נוקליאוליטים‪.‬‬
‫ליובש‪.‬‬
‫ליובש‪.‬‬
‫ ‪- 110‬‬‫‪.6‬‬
‫‪7‬‬
‫י‬
‫אחוז הארגינין בחלבון הציטומלסמתי נכפל בעוברים שעברו דהדרציה‪.‬‬
‫ה‬
‫_ ‪ sRNA‬גורמי ה״טרנטפר" ואנזימי האקטיבציה אינם נפגעים על ידי היובש‪.‬‬
‫‪.8‬‬
‫היובש גורם לפירוק הפוליזומים‪.‬‬
‫‪.9‬‬
‫הפוליזופים מופיעים מחדש לאוזר הרטבה מחודשת של עוברים עמידים שעברו דהדרציה‪.‬‬
‫‪ .10‬םינתזת ^‪RNA‬‬
‫בעוברים רגישים יורדת פי ‪ 30‬בהשפעת היובש בהשואה לזו שבעוברים‬
‫עמידים‪.‬‬
‫ןן‪mRNA ,‬‬
‫אינו נהרס בעוברים עמידים ליובש שעברו דהדרציה במשך ‪ 82‬שעות‪.‬‬
‫‪ .12‬כ‪ 80$-‬מאוכלוסית ה‪ mRNA -‬נעלמה בעוברים רגישים ליובש בזמן הדהדרציה‪.‬‬
‫‪ .13‬אוכלוטית ‪ mRNA-n‬הנוצרת בזמן הרטבתם המחודשת סל עוברים עמידים שיובשו‪ ,‬דומה לחלוטין‬
‫לזו הנוצרת בעובר תקין בפרק התיים המקביל‪.‬‬
‫‪ .14‬מעט ‪mRNA-n‬‬
‫ההדס הנוצר עם הרטבתם המחודשת של עוברים רגישים שיובשו‪ ,‬סונה מזה‬
‫הנוצר בעובר שהתפתחותו תקינה‪ .‬הוצע כי מםג' זה הוא פגום‪.‬‬
‫‪ .15‬נצפה כי גרעיני התאים סל עוברים רגישים נפגעים בזמן היובש וה‪ DNA -‬של עוברים אלו‬
‫נפגם ונשבר‪.‬‬
‫‪ .16‬הוצע כי פגיעת הדהדרציה ‪ DNA -‬אחראית ליצירת המםג' הפגום‪ .‬המסג' הפגום אינו מאפשר‬
‫ב‬
‫סינתזת חלבון וגידול‪.‬‬
References
1.
‫רשימת הספרות‬
Oparin, A.I., Life, Its Origin and Development (Edinburgh, London:
Oliver and Boyd, 1961)
2.
Huxley, J., Essays of a humanist (Penguinbooks, 1966) pp. 284.
3.
Edsall, J.T., andj. Wymann, Biophysical Chemistry (New York: Academic:
Press, 1958) p. 45.
4.
Crafts, A.S., H.B. Qurier.and C.R.. Stocking, Water in the Physiology of
Plants (Chronica botanica, 1949) pp. 285.
5.
Szent-georgy, A., Introduction to Submolecular Biology (New York: Academic
Press, 1962) pp. 135.
6.
Klotz, I.M., in Horizons in Biochemistry (New York: Academic Press, 1962)
PP. 523.
7.
Nemethy, G., Federation Proceedings, 24, 538 (1965).
8.
Singer, S.J., Advances in Protein Chemistry, 17_, 1 (1962).
9.
May, L.H., and F.L. Milthorpe, Field Crop Abstracts, 15, 1 (1962).
10.
Goodwin, T.W., Biochemistry of Chloroplasts (London and New York: Academic
Press, 1967) pp. 776.
11.
Mahler, R.H., and E.H. Cordes, Biological Chemistry (New York-London:
Harper and Row pub., 1966) pp. 872.
12.
Maximov, W.A., The Plant in Relation to Water (London: George Allen and
AnwinLtd., 1929) pp. 451.
13.
Stocker, O., Plant Water Relationships in Arid and Semi Arid Zones (Paris:
UNESCO Pub., 1961) pp. 65.
14.
Levit, J., Protoplamatologia, 8, 6 (1958).
15.
Kramer, P.J., Agronomy Journal, 55, 31 (1963).
16.
Slatyer, R.C., Plant Water Relationships (New York: Academic Press, 1962) pp. 366.
17.
Vaadia, Y., F.C. Raney andR.M. Hagen, Ann. Rev. Plant Physiol., 11, 265 (1961).
18.
Oppenheimer, H.R., Adaptation to Drought-xerophytism (Paris: UNESCO, 1959)
pp. 415.
- 112
-
19.
Iljin, W.S.,
Ann. Rev. Plant Physiol., 8, 257 (1957).
20.
Mayer, A.M., and A. Polyakoff-Mayber, The Germination of Seeds (Oxford:
Pergamon Press, 1963) pp. 236.
21.
Oppenheimer, H.R., and A. Halevi, Bull. Res. Counc. of Israel, D. 11, 3,
127 (1962).
22.
Mothes, K., in Encyk. Plant Physiol., 3, 656 (1956).
23.
Sysakyan, H.M.,
A.M. Kobjakoba and H.A. Vavileva, Dok. Akad. Nauk, CCCR,
LVII, 479 (1947).
24.
Sjyssakyan, W., Biochimiya, 5, 7 (1940).
25.
Zohlkeovich, V.N., and T. F. Kosebkaya, Soviet Plant Physiol., 6, 686 (1961).
26.
Piruscova, L.D., Soviet Plant Physiol. 9, 446 (1963).
27.
Stocker, O., Indian J. of Plant Physiol. 4, 82 (1961).
28.
Kessler, B., Recent Adv. in Botany, 2, 1153 (1961).
29.
Kursanov, A.L., Advan. inEnzym., 1, 329 (1941).
30.
Oparin, A., and U. Kurssanov, Biochem. Z., 239, 1 (1931).
31.
Daisuke, Y., Plant and Cell Physiol., 2, 209 (1961).
32.
Chen, D., Effect of Water Stress on Nitrogen Metabolism (M. Sc. thesis,
Hebrew Univ., 1962) pp. 44.
33.
Chen, D., Environmental Biology, ed. P. Altaian (Washington: Fed. of Am.
Soc. Exp. Biol. 1966) pp. 694.
34.
Thompson, J. F., CR. Stewart and C.J. Morris, Plant Physiol. 41, 1578 (1966).
35.
Chen, D., B. Kessler and S. P. Monselise, Plant Physiol. 39, 379 (1964).
36.
Koretskaya, T. F., and V.N. Zhalkovitch, Soviet Plant Physiol. 13, 290 (1966).
37.
Gates, C.T., and Bonner, J., Plant Physiol. 34, 49 (1959).
38.
Shah, C.B., and R.S. Loomis, Physiol. Plantarum, 18, 240 (1965).
39.
West, S.H., Plant Physiol. 37, 565 (1962).
40.
Nechaeva, E.P., Soviet Plant Physiol, n, 587 (1964).
41.
Tselniker, Y.L., Soviet Plant Physiol. 10, 279 (1963).
-113-
42.
Gardner, W.R., andR.H. Nieman, Science, 143, 1460 (1964).
43.
Sturrani, E., and E. Marre, Giorn. Bot et al. 73, 344 (1966).
44.
Marcus, A., and J. Feeley, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 51, 1085 (1964).
45.
Allende, J., M. Bravo and C. Bassilio, J. Biol. Chem. 244, 5813 (1966).
46.
Marcus, A., and J. Feeley, J. Biol. Chem., 240, 1625 (1965).
47.
Degroot, N., Y. Chen and I. Shafrir, Biochem. Biophys. Res. Comm. 26, 691
(1967).
48.
Marre, E., Current Topics in Developmental Biology, Ed. A. A. Mo scone and
A. Monroy (New York : Academic Press, 1967).
49.
App, A.A., andG.K. Barton, Cont. Boyce Thomp. Inst., 23, 127 (1965).
50.
Dure, L., and L. Waters, Science, 149, 188 (1965).
51.
Koller, D., A.M. Mayer, A. Polyakoff-Mayber and S. Klein, Ann. Rev.
<
Plant Physiology, 13, 432 (1962).
52.
Varher, J.E., and R. Chandra, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S., 52, 100 (1964).
53.
Jhonston, F.B., and H. Stern, Nature, 129, 160 (1957).
54.
Kirby, K.S., Biochem. J., 96, 266 (1965).
55.
Sueoka, N., and T. Cheng, J. Mol. Biol. 4, 161 (1962).
56.
Marmur, J., J. Mol. Biol. 3, 208 (1961).
57.
Mercer, E.H., and M. Birbeck, Electron Microscopy (Oxford: Blackwell
Scient. Pub. 1961) pp. 125.
58.
Frey-Wyssling, A., and K. Muhlethaler, Ultrastructural Plant Cytology
(Amsterdam, N.Y.: Elsevier Pub. Co., 1965), pp. 377.
59.
Marcus, A., J. Feeley and T. Vulcani, Plant Physiol. 41, 1167 (1966).
60.
Williamson, A.R., and R. Schweet, J. Mol. Biol. 11., 358 (1965).
61.
Petrie, A.H.K., andJ.G. Wood, Ann. Botany, 2, 887 (1938).
62.
Bonner, J.F., Plant Biochemistry (New York: Academic Press, 1965) pp. 1054.
63.
Klein, S., and Y. Ben Shaul, Can. J. of Botany, 44, 331 (1966).
64.
Setterfield, G., H. Stern and F.B. Jhonston, Can. J. of Botany, 37, 65 (1959).
f
-114-
65.
Brown, D.D., and Littna, E., J. Mol. Biol. 8, 669 (1964).
66.
Brown, D.D., in Current Topics in Developmental Biology, Ed. A. A. Moscona
and A. Monroy (New York: Academic Press, 1967), Vol. 2, p. 47.
67.
Glisin, V.R., M.V. Glisin and P. Doty, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.,
56, 285 (1966).
68.
Waters, L.C., andL.S. Dure, J. Mol. Biol., 19 (1966).
69.
Denis, W., J. Mol. Biol., 22, 285 (1966).
70.
Monroy, A., and P.R. Gross, Biology and Medicine Symp. (Karger, S.,
Pub., 1968) in press.
71.
Spirin, A.S., in Current Topics in Developmental Biology, Ed. A.A. Moscona
and A. Monroy (New York: Academic Press, 1966) Vol. 1, p. 2.
72.
Crippa, M., E.H. Davidson and H.E. Mirsky, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.,
57, 885 (1967).
73.
Baetcke, K.P., A.H. Sparrow, C.H. Newman and S.S. Schavemmer, Proc.
Natl. Acad. Sci., U.S., 58, 533 (1967).
74.
Rittossa, F.M., A. Atwood and S. Spiegelman, Genetics, 54, 819 (1966).
75.
Giocomani, S., and S. Spiegelman, Science, 138, 1382 (1962).
76.
Attardi, G., P. Huang and S. Kabat, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S., 54^ 185
(1965) .
77.
Gross, P.R., in Current Topics of Developmental Biology, Ed. A.A. Moscona
and A. Monroy, (New York: Acadepiic Press, 1967) Vol. 2, p. 1.
78.
Jacob, F., andJ. Monod, in Cytodifferentiation and Macromolecular Synthesis,
Ed. M. Locke (New York: Academic Press, 1963) pp. 30.
79.
Schweet, R., and R. Heihtz, Ann. Rev. of Biochemistry, 35, 723 (1966).
80.
Takanami, M., and O. Toshio, J. Mol. Biol., 7, 323 (1963).
81.
Todd, G.W.,
82.
Thompson, J.F., R.C. Stewart and J. C. Morris, Plant Physiol. 41, 1578
andE. Basler, Fyton, 22, 79 (1965).
(1966) .
83.
Gillespie, D., and S. Spiegelman, J. Mol. Biol. 12, 829 (1965).
Studies on the Molecular Biology of Dehydration
of Wheat Embryos
THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE
DOCTOR
OF
D A V I D
PHILOSOPHY
C H E N
SUBMITTED TO THE SCIENTIFIC COUNCIL OF THE WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE,
REHOVOTH
MARCH. 1948
This work was carried out under the
supervision of Professor Ephraim Katchalsky
at the Department of Biophysics, The
Weizmann Institute of Science, Rehovoth, Israel.
SUMMARY
The aim of this work was to study plant-water relationships at the particulate
and molecular levels. The germinating wheat embryo was chosen as the model system
for the study of the biochemical events triggered by hydration and dehydration.
The cell free amino acid incorporation system derived from the wheat
embryo was closely studied and optimal conditions for the incorporation reaction were
found. Polyphenylalanine, programmed by polyuridine, is polymerized by the cell free
incorporation system to an average length of n = 30, while for polylysine, programmed
by polyadenine n was estimated as n = 10. The efficiency of the incorporation system
in vitro is about 8 percent of the protein gynthesis in vivo in a germinating wheat embryo.
The polypeptides are formed on monosomes solely when programmed by a synthetic
message, and remain bound to the ribosomes as peptidyl sRNA molecules.
The conditions for wheat embryo DNA-RNA hybridization were studied, and
the specificity of the hybridization reaction was established by hybridization and competition
with viral, bacterial and animal RNA.
The following observations were made about the germination period of the wheat
embryo. No marked structural changes could be detected in the composition and organization of subcellular particles at the optical and electron microscopic levels. DNA replication
starts after 12 hr of germination. mRNA transcription is switched on after 12 hr of
germination. rRNA synthesis and net increase in ribosome content starts after 24 hr
of germination. The sRNA present in the dry embryo is depleted by 80% during 22 hr
of germination. Both replication and transcription seem to be repressed during the first
12 hr of germination. The initial protein synthesis, activated upon germination, is not
dependent on newly transcribed mRNA.
Evidence is presented for the conservation of a masked message in the dry
embryo. It is suggested that unmasking of the conserved message controls initial protein
synthesis of the germinating embryo at the translation level.
The same part of the genome which was active in the embryo before dehydration
of the seed is first activated during the initial 48 hr of germination. Thereafter, new
‫ ־‬2-
messenger RNA species can be detected and part of the genome is switched off.
0.28% of the genome was found to be complementary to rRNA, while 0.023% is
complementary to sRNA. The redundancy of rDNA was calculated as 8500 and the
redundency of sDNA as 960. The multiplicity of the rRNA and sRNA cystrons is
therefore demonstrated.
Physical properties of wheat embryo ribosomes were studied, and
methods for the preparation of ribosomes stripped of endogenous message, and for
the isolation of stable polysomes are described. Ribosomes which were active
in protein synthesis were prepared with insoluble ribonuclease without significant
damage to their catalytic activity. It is suggested that this ribosome may have
more than one site for the binding of the message.
The germinating wheat embryos were subjected to severe water stress
24 and 72 hr after germination. It was found that 24 hr germinated wheat embryos
can be dehydrated without any damage. At that stage of germination the embryos
are drought resistant. After 72 hr of germination, however, dehydration of the
embryos results in an irreversible arrest of growth. At that stage of germination
the embryos are drought sensitive.
Dehydration does not result in an increase in the activity of proteolytic
or nucleolytic enzymes. The protein is not hydrolyzed upon germination. The
free amino acid level increases, and the arginine content in the cytoplasmatic
protein doubles upon dehydration. sRNA, polymerization factors and activation
enzymes involved in protein biosynthesis are not damaged by dehydration, while
polysomes are destroyed, but reappear upon rehydration of drought resistant wheat
embryos.
RNA synthesis slows down 30-fold in dehydrated drought-sensitive wheat
embryos. About 80% of the mRNA of drought sensitive embryos disappears upon
dehydration while the mRNA of drought resistant embryos survives extreme
dehydration.
-3-
The newly transcribed mRNA which is synthesized upon rehydration of dried
‫״‬
resistant embryos resembles the rRNA population which is normally transcribed at the
same life period. The traces of mRNA transcribed upon rehydration of drought sensitive
r
embryos is different from the messenger population transcribed in normal embryos.
The nuclei of drought sensitive embryos are broken upon dehydration and the
DNA breaks down to low molecular weight components. It is suggested that the damage to the
DNA induced by dehydration is responsible for the false mRNA transcription. The false
message prevents protein !synthesis and concomitant growth of wheat embryos subjected
*
1
to water stress.