‫‪1‬‬ ‫האוניברסיטה העברית בירושלים‬ ‫הפקולטה למתמטיקה ומדעי הטבע‬ ‫המכון לכימיה‬ ‫ספקטרוסקופיה אולטרה‪-‬מהירה בתחום האינפרה‪-‬אדום הקרוב‪:‬‬ ‫חלון ספקטרלי חדש לחקר הפוטוכימיה של חלבונים רטינלים‬ ‫‪Ultrafast spectroscopy in the near Infra Red: A New‬‬ ‫‪Spectral Window on Retinal Protein‬‬ ‫‪Photochemistry‬‬ ‫מגיש בוריס לויבסקי‬ ‫בהנחיית פרופסור סנפורד רוכמן‬ ‫"עבודת גמר לתואר מוסמך במדעי הטבע‬ ‫‪ 07‬נובמבר ‪2011‬‬ ‫י' חשוון התשע"ב‬ ‫"‬ ‫‪2‬‬ ‫תקציר‬ ‫מערך גילוי בתחום האינפרא‪-‬אדום הקרוב )‪ (NIR‬נבנה על מנת להרחיב את התחום‬ ‫הספקטראלי של ספקטרוסקופיית ‪ Pump-Probe‬אולטרא‪-‬מהירה‪ .‬המערך החדש אשר‬ ‫כולל יצירת אור לבן ‪ Supercontinuum‬בתחום ה‪ ,NIR-‬שני ספקטרופוטומטרים מבוססי‬ ‫מערך דיודות ‪ InGaAs‬ומערכת טריגרים אלקטרונית נמצא בשימוש במעבדתינו על מנת‬ ‫לחקור דינמיקה אולטראמהירה של חלבונים רטינאליים וננו‪-‬גבישים בתחום‬ ‫ספקטראלי שלא היה נגיש קודם לכן‪ .‬תהליך של בנייה והטמעה של מערכת זו נדון‬ ‫בכתוב‪.‬‬ ‫כמו כן אנו מציגים תוצאות של ‪All-trans Retinal Protonated Schiff Base‬‬ ‫)‪ ( RPSB‬שנחקרו בשיטת הספקטרוסקופיה האולטרא‪-‬מהירה‪ ,‬תוצאות הממחישות את‬ ‫היכולות החדשות שלנו‪ .‬מוצגות תוצאות של שאיבה ב‪ UV -‬ובדיקה רחבת פס ב‪NIR-‬‬ ‫של ה‪ .RPSB-‬כתוצאה מהעירור מופיעה בליעה קצרת חיים המכסה את כל הטווח‬ ‫הספקראלי שבין ‪ 1μm‬ל‪ .2μm -‬דעיכתה של בליעה מהירה זו חושפת את זנב הפליטה‬ ‫מהרמה ‪ S1‬באורכי גל הקצרים מ‪ 1.3μm-‬יחד עם שאריות של בליעה באורכי גל‬ ‫הארוכים‪ ,‬שניהם עם קינטיקה המתאימה להיפוך הפנימי הידוע לרמה ‪ .S0‬קיומו של‬ ‫מצב מעורר שהתגלה זה עתה דורש בחינה מחדש של המודלים האלקטרוניים‬ ‫הקיימים עבור ה‪ .RPSB-‬הדמיון הרב של התופעה שהתגלתה לתוצאות ב‪ NIR -‬עבור‬ ‫הקרוטנואידים מעלה את השאלה האם בעצם שלושה ולא שני מצבים אלקטרוניים‬ ‫מופיעים בפוטוכימיה של ה‪ .RPSB-‬בנוסף נדון ברלבנטיות של תגלית זו על‬ ‫הפוטוכימיה של החלבונים הרטינליים‪.‬‬ ‫‪3‬‬ ‫תודות‬ ‫ברצוני להודות לפרופ ' סנדי רוכמן על הלימוד וההנחיה המסורה במהלך העבודה ‪ ,‬על‬ ‫העידוד והתמיכה לאורך כל המחקר וכתיבה העבודה‪.‬‬ ‫תודה לפרופ ' מודי שבס ולד"ר נוגה פרידמן ממכון ויצמן על החומרים שסופקו בכל‬ ‫עת ועל שיתוף הפעולה‪.‬‬ ‫כמו כן ברצוני להודות למר מרסלו פרידמן על התמיכה הטכנית והעזרה בכל עת‬ ‫ומכל הלב‪.‬‬ ‫תודה לחבריי למעבדה בהווה ובעבר – אופיר שושנים‪ ,‬אמיר ונד ‪ ,‬פבל קום ‪ ,‬איתי‬ ‫ואפרת גדור‪ ,‬ג'ינגי זו‪ ,‬אושרת ביסמוט ומירב בן לולו ‪ ,‬על הגשת עזרה בכל עת‬ ‫שנדרשה‪.‬‬ ‫ואחרונה חביבה לנה אשתי על הסבלנות והתמיכה‪.‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪Table of Contents‬‬ ‫מבוא‪5...................................................................................................................‬‬ ‫ספקטרוסקופיה אולטרה‪-‬מהירה באינפרה‪-‬אדום הקרוב )‪ :(NIR‬מבוא‪5...................‬‬ ‫חלבונים רטינאליים‪ :‬מבוא‪8.................................................................................‬‬ ‫חלבונים רטינאליים ‪8......................................................................................‬‬ ‫‪ rPSB‬כמערכת מודל למחקר חלבונים רטינלים‪14..............................................‬‬ ‫הפוטוכימיה ב‪ BR-‬וב‪ - rPSB-‬סקר ספרות‪15......................................................‬‬ ‫קרוטנואידים ‪21..............................................................................................‬‬ ‫פוטוכימיה של קרוטנואידים‪23.........................................................................‬‬ ‫חקר הקרוטנואידים באינפרא אדום הקרוב‪24....................................................‬‬ ‫סיכום המבוא‪26.............................................................................................‬‬ ‫החלק נסיוני‪27.................................................................................. Experimental :‬‬ ‫שיטת ה‪27......................................................................................Pump-Probe -‬‬ ‫מבנה מערכת הלייזר ‪28......................................................................................‬‬ ‫המרת אור ‪31.....................................................................................................‬‬ ‫המרת אור‪ :‬כללי ‪31........................................................................................‬‬ ‫אינטראקציה של אור וחומר בתהליכים לא ליניאריים‪31....................................:‬‬ ‫תהליך ה‪ SPM-‬ויצירת אור לבן ‪35..............................................Supercontinuum‬‬ ‫הפילמנט‪36...................................................................................................‬‬ ‫תהליך הסופרפלואורוסנציה‪39........................................................................‬‬ ‫התאמת פאזות ‪40..........................................................................................‬‬ ‫מגברים פרמטריים‪44......................................................................................‬‬ ‫‪ :Time Correction‬תיקון התזמון היחסי של אורכי הגל השונים‪46..........................‬‬ ‫)‪ :Global Fit (GF‬ניתוח קינטי של הניסוי‪48.........................................................‬‬ ‫הקונפיגורציה הניסיונית‪50...................................................................................‬‬ ‫מטרות המחקר‪53...............................................................................................‬‬ ‫תוצאות‪54............................................................................................................ :‬‬ ‫מערך ‪54.....................................................................................................NIR‬‬ ‫יצירת אור לבן‪54............................................................................................‬‬ ‫‪57.................................................................................................NIR NOPA‬‬ ‫תוצאות‪59........................................................................................rPSB & BR :‬‬ ‫ניתוח התוצאות בשיטת ה‪61......................................................................GF-‬‬ ‫דיון בתוצאות ‪63.............................................................................................‬‬ ‫תוצאות עבור חלבון ה‪68...............................................................................BR-‬‬ ‫סיכום ומבט לעתיד‪70.........................................................................................‬‬ ‫‪5‬‬ ‫מבוא‬ ‫ספקטרוסקופיה אולטרה‪-‬מהירה באינפרה‪-‬אדום הקרוב )‪ :(NIR‬מבוא‬ ‫תהליכים ראשוניים בפוטוכימיה הינם תהליכים שזמן חייהם הוא עשרות‬ ‫פמטושניות עד עשרות פיקושניות בודדות‪ .‬מכשירים אלקטרוניים אינם מסוגלים למדוד‬ ‫זמנים כאלה עקב התגובה האיטית של רכיבים אלקטרוניים המסוגלים למדוד זמנים‬ ‫מסד"ג של עד ננושניות בודדות‪ .‬שיטת ‪ Pump-Probe Spectroscopy‬מאפשרת לבחון‬ ‫תהליכים אלה ע"י בחינה ישירה של בליעה‪/‬פליטה מאולצת של צורוני המעבר‪.‬‬ ‫המפתח להתבוננות בתהליכים קצרים אלה הוא יצירת פולסים הקצרים משמעותית‬ ‫מסקלת הזמנים של התהליך עצמו‪ ,‬ושליחתם בזוגות לתוך הדגם כך שהפולס הראשון‬ ‫)השואב‪ (Pump ,‬מביא את המערכת הניסיונית למצב מעורר והפולס השני )הבוחן‪,‬‬ ‫‪ ( Probe‬מודד את השינויים שנגרמו למערכת כתוצאה ממעבר הפולס הראשון‪ .‬כך אנו‬ ‫מעבירים‬ ‫את‬ ‫"צוואר‬ ‫הבקבוק"‬ ‫מבחינת‬ ‫רזולוציית הזמן מהאלקטרוניקה לאופטיקה‪,‬‬ ‫המאפשרת לנו לצלם מספר רב של תמונות‪.‬‬ ‫כך מתקבל מעין "סרט" המראה לנו את‬ ‫התמונה הספקטראלית של המערכת הנבחנת‬ ‫בכל רגע ברזולוציה של עד פמטושניות‬ ‫בודדות‪.‬‬ ‫על‬ ‫מנת‬ ‫לראות‬ ‫תמונה‬ ‫דו‬ ‫מימדית‬ ‫)ספקטרום‪-‬זמן( מלאה עד כמה שניתן‪ ,‬יש‬ ‫צורך לכסות ספקטרום רחב בניסוי יחיד‪.‬‬ ‫השיטה לעשות זאת היא לייצר פולס ‪Probe‬‬ ‫רחב‬ ‫ספקטראלית )על כך בפרק‬ ‫‪,(3.4‬‬ ‫ולפרוש את הפולס בתדר בעזרת שריג‬ ‫דיספרסיבי על חיישן מסוג מטריצת ‪ CCD‬או‬ ‫מערך פוטודיודות‪ ,‬בעזרתם ניתן לכמת את‬ ‫איור ‪ :1.1‬למעלה‪ :‬ספקטרום הפליטה של השמש כפי‬ ‫שהוא נראה מחוץ לאטמוספרה )בצהוב(‪ ,‬בגובה פני‬ ‫הים )בוורוד(‪ ,‬מותאם להתפלגות קרינת גוף שחור‬ ‫בטמפרטורה של ‪) 52500C‬קו(‪.‬‬ ‫למטה‪ :‬התחום הספקטרלי הפעיל לפוטוסינתזה‪.‬‬ ‫עוצמת האור בכל אורך גל‪ .‬איסוף אור בשיטה זו נקרא איסוף רב‪-‬ערוצי‪.‬‬ ‫‪6‬‬ ‫קיימים מספר יתרונות לאיסוף אור בשיטה זו‪ .‬הראשון והבולט הוא הנוחות‬ ‫והחיסכון בזמן כמו גם צמצום הרעש הנובע מביצוע סדרה של ניסויים באורכי גל‬ ‫קרובים‪ .‬יתרון נוסף הוא היכולת להגדיר זמן אפס עבור כל הספקטרום‪ ,‬ובכך להפריד‬ ‫בין תהליכים המתרחשים מיד עם העירור )כגון העלמות מצב הייסוד( ותהליכים‬ ‫מאוחרים יותר )דוגמת העתקה של בליעה לאדום כתוצאה מקירור ויברציוני(‪ .‬יתרון‬ ‫חשוב נוסף הוא השיפור ברזולוצייה הספקטרלית יחד עם שיפור ברזולוציית הזמן‪.‬‬ ‫הסיבה לכך היא שילוב של מספר תנאים הנובעים מאופן ביצוע הניסוי )על כך בחלק‬ ‫הנסיוני(‪ :‬פולס ‪ Probe‬רחב גורם לשיפור רזולוציית הזמן‪ .‬ביצוע ניסוי על פוטודיודה‬ ‫בודדת גורם למיצוע הסיגנל בספקטרום ובזמן‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬בעזרת מדידה רב ערוצית‬ ‫אנחנו מרוויחים רזולוציית זמן גבוהה ברגע המעבר בדוגמה ורזולוציה ספקטרלית טובה‬ ‫במדידה‪.‬‬ ‫עד היום השתמשנו במעבדתנו במערכי איסוף מבוססי סיליקון‪ .‬טכנולוגיית‬ ‫הסיליקון מגיבה לאור בטווח אורכי גל בין כ‪ 350-‬ננומטר )נ"מ( לכ‪ 1-‬מיקרון‪ ,‬ובכך‬ ‫מכסה את כל האור הנראה )‪ (Vis‬ולכן מתאימה לחקר של מערכות פוטוביולוגיות‪.‬‬ ‫במערכות פוטוביולוגיות‪ ,‬תהליכים מושרי אור כגון פוטוסינתזה או הראיה‪,‬‬ ‫מתחילים בחלבונים )או קומפלקסים של חלבונים( הכולאים פוטון והופכים את‬ ‫האנרגיה שלו לפוטנציאל כימי או חשמלי‪ .‬חלבונים מסוג זה מכילים כרומופורים אשר‬ ‫יבלעו פוטון בד"כ בתחום הנראה‪ ,‬משמע‪ ,‬המעבר האלקטרוני ממצב היסוד למצב‬ ‫המעורר המותר הראשון יהיה בטווח שבין ‪400‬‬ ‫ל‪ 700-‬נ"מ‪ .‬הסיבה לכך היא כי הקרינה של‬ ‫הקורנת‬ ‫השמש‪,‬‬ ‫בטמפרטורה‬ ‫של‬ ‫קרינת‬ ‫‪,52500C‬‬ ‫גוף‬ ‫שחור‬ ‫מגיעה‬ ‫לשיא‬ ‫בתחום ספקטרלי זה‪ ,‬כך שבליעה בתחום‬ ‫ספקטראלי‬ ‫אחר‬ ‫הפוטוכימית‪.‬‬ ‫יפגע‬ ‫ביעילות‬ ‫הפוטורספטורים‬ ‫התגובה‬ ‫הפעילים‬ ‫בתחום ספקטרלי זה מורכבים רובם ככולם‬ ‫משלד‬ ‫וכפולים‬ ‫פחמני‬ ‫הקשור‬ ‫לסרוגין‪,‬‬ ‫בקשרים‬ ‫המהווים‬ ‫בודדים‬ ‫מערכות‬ ‫‪π‬‬ ‫איור ‪ :1.2‬רגישות של פוטודיודות סיליקון )בסגול(‪,‬‬ ‫‪ InGaAs‬בואריאציות שונות )באדום‪ ,‬צהוב וכחול(‪.‬‬ ‫מצומדות‪ ,‬חלקם מישוריים )הפרופרנים( וחלקם מוארכים )הקרוטנואידים והרטינאל(‪.‬‬ ‫בעבודה זו נתמקד בפוטורספטורים המוארכים בלבד‪ ,‬עליהם ארחיב בהמשך העבודה‪.‬‬ ‫‪7‬‬ ‫מודל אטום המימן‪ ,‬שהוא המודל הבסיסי ביותר שמסביר את רמות האנרגיה‬ ‫באטומים חוזה הצטופפות של רמות אנרגיה ככל שמספר העירור )‪ (n‬עולה‪ .‬כמובן‬ ‫שלא נצפה התנהגות שדומה לאטום במולקולה רבת אטומים כקרוטנואיד‪ ,‬אך כן‬ ‫נצפה לדמיון מסוים בהתנהגות עבור ‪ .n>1‬ניתן להסתכל גם על המערכת לפי מודל‬ ‫פיזיקלי קוונטי נוסף‪ ,‬חלקיק בקופסה חד מימדית‪ .‬לפי מודל זה נצפה לפערים‬ ‫אנרגטיים הולכים וגדלים עם ‪ .n‬האמת‪ ,‬כמובן‪ ,‬הרבה יותר מסובכת ממודלים אלה‪,‬‬ ‫אך לשניהם השלכות על מערכת של פוליאנים‪ .‬חישובים תאורטיים עבור רמות אנרגיה‬ ‫ראשונות בפוליאנים )וקרוטנואידים בפרט(‪ ,‬צופים רמה חשוכה )רמת אנרגיה שהמעבר‬ ‫אליה מרמת היסוד אסור‪ ,‬יפורט בהמשך העבודה( הנמצאת קרוב לרמה האלקטרונית‬ ‫המעוררת הראשונה‪ .‬שני המודלים מלמדים כי את האינפורמציה על המעבר מהרמה‬ ‫המעוררת הראשונה לשנייה יש צורך לחפש בטווח אנרגיות נמוך יותר‪ ,‬קרי ב‪.NIR-‬‬ ‫בתחום ה‪ NIR-‬חיישני הסיליקון אינם רגישים‪ ,‬ולכן יש צורך לעבוד עם חיישנים‬ ‫באחת משתי הטכנולוגיות הבאות‪ :‬טכנולוגיית ה‪ Germanium -‬וטכנולוגיית ה‪InGaAs-‬‬ ‫)מל"מ מסוג ‪ .(Indium Gallium Arsenide‬פוטודיודה עשויה גרמניום ידועה ברעש מסוג‬ ‫‪ Dark Current‬גבוה‪ ,‬ויש צורך לקרר אותה בחנקן נוזלי‪ .‬משום כך בחרנו במערך דיודות‬ ‫‪ ,InGaAs‬שהיא ידידותית יותר מבחינה זו‪ ,‬וניתן לקרר את כל מערך הדיודות קירור‬ ‫פלטייה )‪ .(Peltier Effect‬טכנולוגיה זו מאפשרת לדגום תחום ספקטרלי נוסף‪ ,‬מכ‪1um -‬‬ ‫עד מעל ‪ 2um‬ובכך לתת לנו את האפשרות לבחון ברמת דיוק כמו בטווח הנראה‬ ‫וברזולוציית זמן זהה עד כדי גבול הטרנספורם )ב‪ NIR-‬יהיה בערך כפול מבנראה ועל‬ ‫כך בהמשך( את המעברים בין הרמות המעוררות השונות‪.‬‬ ‫‪8‬‬ ‫חלבונים רטינאליים‪ :‬מבוא‬ ‫חלבונים רטינאליים‬ ‫המחקר עליו מבוססת העבודה מתמקד בחקר של תהליכים ראשוניים במולקולת‬ ‫ה‪) rPSB-‬ר”ת ‪ ,(Protonated Schiff Base of the Retinal‬המשמשת ככרומופור יחיד‬ ‫בחלבונים מקבוצת החלבונים הרטינאליים‪ .‬כדוגמה לכלל החלבונים מסוג זה נשתמש‬ ‫בחלבון הבקטריורודופסין )‪ ,(BR‬שמחקרים קודמים הראו דמיון רב בינו לבין חלבונים‬ ‫אחרים בקבוצה הן מבחינת המבנה והן מבחינת עיקרון הפעולה‪ .1‬אתחיל בתיאור של‬ ‫מבנהו ופעולתו‪.‬‬ ‫ה‪ BR-‬הנו חלבון השייך למשפחת החלבונים הרטינאליים‪ ,‬הכוללת גם את‬ ‫ה"הלורודופסין" "רודופסין"‪" ,‬קסנטורודופסין" ועוד‪ .‬החלבונים הרטינאליים מתחלקים‬ ‫ל‪ 2-‬קבוצות‪ :‬פיגמנטי ראייה בחי וחלבונים מיקרוביאליים‪ .‬עבודה זו עוסקת בחלבונים‬ ‫הרט ינאליים מהסוג השני‪ .‬החלבונים הרטינאליים המיקרוביאליים מתחלקים ל‪2-‬‬ ‫קבוצות עיקריות‪ :‬חיישני אור ) ‪ (photoreceptors‬שתפקידם לדרבן הזזה פיזית של‬ ‫הארכיבקטריה לאזור בו האור אופטימלי מבחינת עוצמתו וצבעו לצורך תפקוד של‬ ‫קבוצת החלבונים השנייה‪ .‬הקבוצה השנייה היא קבוצת משאבות היונים )‪.(Ion Pumps‬‬ ‫חלבונים בקבוצה זו מנצלים את אנרגיית הפוטון לצורך העברת יון ספציפי דרך‬ ‫הממברנה של התא‪ .2‬ישנם שני צרכים עיקריים להעברת יונים דרך הממבראנה והם‪:‬‬ ‫‪(1‬‬ ‫ויסות לחץ אוסמוטי בתא‪.‬‬ ‫‪(2‬‬ ‫יצירת אנרגיה זמינה ע"י שימוש בגרדיינט חשמלי הנוצר מהעברת הפרוטון‪.‬‬ ‫הפרוטון חוזר לתוך התא דרך אנזים ספציפי הנקרא ‪) ATP synthase‬אנזים יוצר ‪(ATP‬‬ ‫המייצר ‪ ATP‬מ‪.43 ADP-‬‬ ‫בקטריורודופסין )‪(BR‬‬ ‫‪5‬ה‪ BR-‬הינו חלבון טראנס‪-‬ממבראנלי המצוי בארכיבקטריה בשם "הלובקטריום‬ ‫סלינארום"‪ .‬הארכיבקטריה חיה בתנאים של ריכוז מלחים גבוהה‪ ,‬ריכוז חמצן נמוך‬ ‫וכמות אור מוגבלת‪ ,‬ולחלבון תפקיד קריטי בהישרדות הבקטריה‪6 .‬פני השטח של‬ ‫הבקטריה מכילים את ‪7‬הממברנה הסגולה‪ ,‬המכילה ליפידים ואת חלבון ה‪.BR-‬‬ ‫הממבראנה בנויה משרשראות של ליפידים וחלבונים‪ ,‬המוטות בזוית של ‪ 120‬מעלות‬ ‫‪9‬‬ ‫אחת לשניה ובכך יוצרות מבנה דמוי גביש הקסגונאלי‪8 .‬החלבון מתנהג כמשאבת‬ ‫פרוטונים מושרית באור מפנים התא החוצה‪ .‬תהליך זה הינו חלק מתהליך פוטוסינתזה‬ ‫בתנאים אנאירוביים של החיידק‪.‬‬ ‫מבנה של חלבון ה‪ ,BR-‬כמו שאר חברי משפחת החלבונים הרטינאליים מאופיין‬ ‫באופסין )‪9 ( Opsin‬המורכב משבעה סלילי אלפא‪ ,‬החוצים את הממבראנה‪10 .‬סלילי‬ ‫האלפא מאוגדים בצורת גליל הכולא בתוכו מולקולת רטינאל ) ‪ (all-trans retinal‬אחת‪.‬‬ ‫הרטינל ממוקם במרכז האופסין ופונה באלכסון לסלילי האלפא‪ .‬הרטינאל מחובר‬ ‫קוולנטית לחומצה האמינית ‪) Lys216‬ראה איור ‪ .(1.4‬שייר זה ממוקם בחלק הפונה‬ ‫לתוך החלבון של סליל האלפא השביעי )סלילי האלפא ממוספרים מ‪ 1-‬עד ‪ .(7‬בסיס‬ ‫השיף קשור לפרוטון‪ ,‬ועל מנת לייצב את המטען החיובי של הפרוטון‪ ,‬נמצאת בסמוך‬ ‫לו קבוצה קרבוקסילית טעונה שלילית‪ ,‬של שייר הגלוטמט ‪ .Glu113‬הטבעת‬ ‫ההידרופובית של הרטינל יוצרת אינטראקציה עם כיס הידרופובי פנימי בחלבון‪.‬‬ ‫המשמעות‪ ,‬היא שהרטינל מקובע בשלושה קשרים שונים לחלבון משני קצותיו‪ .‬אופן‬ ‫קשירה זה מאפשר ל‪ rPSB-‬לגרום לשינויים מבניים מקיפים בחלבון בעת האיזומריזציה‪,‬‬ ‫כפי שהוזכר לעיל‪ ,‬כתוצאה מפוטואקסיטציה‪.‬‬ ‫הרטינל היא מולקולה המשמשת ככרומופור עבור החלבון הבולע אור בתחום‬ ‫הנראה לאחר פרוטונציה בעת קישורה לאתר הפעיל בחלבון‪ ,‬על תכונותיה נכתוב‬ ‫בהמשך‪ .‬פס הבליעה הספציפי תלוי באופסין ומשתנה בין החלבונים השונים‬ ‫ממשפחת החלבונים הרטינאליים‪ ,‬תופעה הנקראת ‪.Opsin Shift‬‬ ‫‪550 600 650‬‬ ‫‪500‬‬ ‫‪450‬‬ ‫‪400‬‬ ‫)‪α (normalized‬‬ ‫‪rPSB Gas Phase‬‬ ‫‪rPSB In Methanol‬‬ ‫‪PR‬‬ ‫‪SR‬‬ ‫‪BR‬‬ ‫‪HR‬‬ ‫‪350‬‬ ‫)‪λ (nm‬‬ ‫איור ‪ :1.3‬ספקטראות בליעה של מצב היסוד ב‪rPSB-‬‬ ‫ובחלבונים רטינאליים שונים‪.‬‬ ‫‪10‬‬ ‫השפעת החלבון הרטינאלי על בליעת ה‪:rPSB-‬‬ ‫החלבון כולא את הרטינאל כך שבנוסף לקשירה הקוולנטית עם החומצה האמינית‬ ‫‪) Lys216‬השיירים ממוספרים שונה בחלבונים שונים‪ ,‬המספרים הנ"ל נכונים עבור ה‪BR-‬‬ ‫בלבד( קיימת גם קשירה יונית לחומצה האספרטית ‪) Asp96‬איור ‪ 1.4‬מימין(‪ .‬חומצה זו‪,‬‬ ‫בנוסף לתפקידה בקיבוע המולקולה משמשת כאניון הצמוד של קטיון ה‪ rPSB-‬המייצב‬ ‫אותו‪ .‬המרחק בין החומצה האספרטית לחנקן הטעון חיובית משפיעה ישירות על‬ ‫ספקטרום הבליעה של החלבון‪ ,‬כך שאורך גל של הבליעה גדל עם המרחק ‪.11‬‬ ‫במרחק אינסופי ה‪ rPSB-‬בפאזה גזית בולע ב‪ 625-‬נ"מ‪ .‬באיור ‪ 1.3‬רואים ספקטראות‬ ‫בליעה של ה‪ rPSB-‬ומספר חלבונים רטינאליים בהם בולטת השפעת האופסין‪.‬‬ ‫ע"מ שהפוטוסינתזה תהיה ביעילות‬ ‫‪τ‬‬ ‫‪φ‬‬ ‫‪Bond‬‬ ‫ספקטרום הפליטה של השמש‪ ,‬ששיאה‬ ‫‪2 / 7 ps‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪C9/C11/C13‬‬ ‫‪rPSB‬‬ ‫באיזור ה‪ .500nm-‬מולקולת ה‪ rSB-‬במתנול‬ ‫‪0.5 ps‬‬ ‫‪0.6‬‬ ‫‪C13=C14‬‬ ‫‪BR‬‬ ‫בולעת פוטון סביב ה‪ .360nm-‬פרוטונציה‬ ‫‪2 / 5 ps‬‬ ‫‪0.5‬‬ ‫‪C13=C14‬‬ ‫‪pHR‬‬ ‫של הבסיס )‪ (rPSB‬מסיטה את הבליעה‬ ‫‪2 / 8 ps‬‬ ‫‪0.25‬‬ ‫‪C13=C14‬‬ ‫‪sHR‬‬ ‫לאזור ה‪ .450nm-‬צימוד ה‪ rPSB-‬לחלבון‬ ‫‪0.5 ps‬‬ ‫‪0.5‬‬ ‫‪C13=C14‬‬ ‫‪SR‬‬ ‫מסיט את הבליעה עוד יותר בהשפעת ה‪-‬‬ ‫‪2 / 20 ps‬‬ ‫‪0.6‬‬ ‫‪C13=C14‬‬ ‫‪PR‬‬ ‫סבירה‪ ,‬על החלבון לבלוע אור בתחום‬ ‫‪Shift‬‬ ‫‪,Opsin‬‬ ‫לאזורים‬ ‫ספקטראליים‬ ‫המתאימים לפעילותו של חלבון ספציפי‪.‬‬ ‫טבלה ‪ :1‬יעילות ל‪ IC-‬ולאיזומריזציה בחלבונים‬ ‫הרטינאליים השונים וב‪) rPSB-‬למעלה(‪.‬‬ ‫למשל ספקטרום הבליעה של סנסורי‪-‬רודופסין )‪ ,(SRII‬ששיא בליעתו ב‪ 487-‬נ"מ עם‬ ‫זנב ל‪ ,Near UV-‬נגזר מתפקידו להרחיק את החלבון מאזורים עם קרינת ‪ Near-UV‬חזקה‪,‬‬ ‫לעומת ה‪ ,BR-‬ששיא בליעתו ב‪ 570-‬נ"מ ותפקידו משאבת פרוטונים לטובת‬ ‫פוטוסינתזה‪.‬‬ ‫במצב יסוד של החלבון )תחת הארה(‪ ,‬ה‪ rPSB-‬נמצא בקונפיגורציה ‪.All Trans‬‬ ‫תהליך שאיבת הפרוטון מתחיל בבליעת פוטון הגורם לפוטואיזומריזציה סביב קשר‬ ‫כפול יחיד )‪ ,(C13=C14‬המביא את הכרומופור ממצב ‪ All-Trans‬למצב ‪ ,Cis-13‬ביעילות‬ ‫קוונטית של כ‪) 7465%-‬גבוהה פי ‪ 2-3‬מן היעילות של הכרומופור בתמיסה(‪ .‬בניגוד‬ ‫למקרה של ‪ rPSB‬בתמיסה‪ ,‬שם בליעת פוטון מובילה לאיזומריזציה סביב קשרים רבים‬ ‫)ראה בהמשך(‪ ,‬הצימוד לחלבון מוביל לאיזומריזציה סביב קשר זה בלבד‪ ,‬ככל הנראה‬ ‫‪11‬‬ ‫עקב אינטראקציות סטריות ואלקטרוסטטיות עם כיס החלבון‪ .‬בנוסף‪ ,‬לחלבון השפעה‬ ‫חזקה על קבועי הזמן להיפוך פנימי ) ‪ ,(Internal Conversion – IC‬שמתבטאת במקרה‬ ‫של ‪ BR‬בקיצור זמני החיים של המצב המעורר‪ .‬בטבלה ‪ 1‬מפורטים זמני החיים ומקדמי‬ ‫יעילות קוונטית ל‪ IC-‬ולאיזומריזציה סביב קשרים פעילים במדגם של חלבונים‬ ‫רטינאליים מיקרוביאליים וה‪.rPSB-‬‬ ‫מעגל האור ב‪:BR-‬‬ ‫כפי שצוין‪ ,‬בליעה של פוטון ע"י הרטינל מובילה לאיזומריזציה סביב הקשר הכפול‬ ‫‪ ,14=13‬ומהווה נקודת התחלה במעגל אור‪ ,‬המתאפיין ע"י כמה תוצרי ביניים‬ ‫המאופיינים ספט רוסקופית‪ .‬נהוג לסמן את תוצרי הביניים ע"י אות אנגלית ) ‪ J, K‬וכו'(‬ ‫ומספר‪ ,‬המסמן את שיא הבליעה‪ .‬בליעת הפוטון מובילה להתפתחות סקפטרלית‬ ‫דרמטית‬ ‫בסקאלת זמנים הקצרה מפיקושנייה‪ ,‬שמאפייניה העיקריים הם‪) :‬א( פס‬ ‫פליטה מאולצת באזור ה‪) NIR -‬עם שיא סביב ‪ 850‬ננומטר(‪ ,‬המאופיין במבנה דו‪-‬‬ ‫דבשתי )עם מינימום(‪ .‬ההסבר הנפוץ למבנה זה הוא קיומו של פס בליעה חופף‪) .‬ב(‬ ‫פס בליעת מצב מעורר "כחול"‪ ,‬עם שיא סביב ה‪ 460 -‬ננומטר‪ .‬תכונות ספקטרליות‬ ‫אלו משויכות למצב המעורר הריאקטיבי "‪ .”I460‬פסים אלו דועכים תוך כפיקושנייה‪,‬‬ ‫ליצירת תוצר הביניים "‪ ”J625‬החי כ ‪ 3-5‬פיקושניות; לפי רוב הפרשנויות‪ ,‬זהו מצב יסוד‬ ‫חם שבו הרטינל כבר עבר איזומריזציה למצב ‪ .cis-13‬בהמשך‪ ,‬מתקבל מצב היסוד "‪K5‬‬ ‫‪ ,”90‬שחי מיקרושניות‪ .‬השלבים הבאים של מעגל האור )‪ L, M, N‬ו‪ ,(O -‬כוללים דה‪-‬‬ ‫פרוטונציה של בסיס ה‪ Schiff -‬ומעבר של פרוטון מתוך התא החוצה )‪ ,(M‬ובשלבים‬ ‫המאוחרים יותר פרוטונציה מחדש וחזרה של החלבון למצבו התחילי )‪ ,(BR570‬ליצירת‬ ‫התהליך המחזורי המכונה “מעגל אור”‪ .‬השלבים המאוחרים אחראים לתפקוד הביולוגי‬ ‫של ה‪ BR -‬כמקור ליצירת אנרגיה כימית‪.‬‬ ‫השלבים הספקטרוסקופיים מתוארים באיור ‪ ,1.4‬ופירוט של השלבים השונים‬ ‫נמצא לאחריו‪.‬‬ ‫‪12‬‬ ‫‪Lys216‬‬ ‫איור ‪ :1.4‬סכימת מחזור האור וזמני החיים של כל אחד ממצבי המעבר‪.‬‬ ‫שלב ‪ :BR570nm→J625nm‬פוטואיזומריזציה של ה‪ ,rPSB-‬מהמצב ‪ All Trans‬למצב ‪-13‬‬ ‫‪ .Cis‬הוא מאופיין בשיא בליעה ב‪ ,625nm-‬וזמן חיים של ‪12 . 0.5ps‬זהו מצב חם )מעורר‬ ‫ויברציונית(‪ .‬מחקר זה מתמקד בחקר המנגנון בו מתבצע תהליך זה‪.‬‬ ‫שלב ‪ : J625nm→K590nm‬התקררות ויברציונית‪ ,‬הזחת הבליעה לכחול )‪ ,(590nm‬זמן‬ ‫החיים הוא ‪ 3-5‬פיקו‪ .‬בשלב זה קבוע הדיסוציאציה )‪ (pKa‬של ה‪ Schiff Base -‬יורד מ‪-‬‬ ‫‪ 13.3‬ל‪ 8.5-‬וה‪ pKa-‬של המרכז ‪ Asp85‬עולה מ‪ 2.2-‬לכ‪ ,7.6-‬מה שמסייע בהמשך‬ ‫לפרוטון לעבור מה‪ Schiff Base-‬ל‪.Asp85-‬‬ ‫שלב ‪13 : K590nm →L550nm‬כיפוף קל של החלק החוץ‪-‬תאי של ‪ ,Helix C‬תוצאה של‬ ‫ארגון מחדש של קשרי מימן בחלק החוץ‪-‬תאי של החלבון‪ .‬למולקולת מים הנמצאת‬ ‫בתווך בין ה‪ Schiff Base-‬ל‪ Asp85-‬ל‪ Asp212-‬תפקיד חשוב בתהליך זה‪ .‬כתוצאה מכך‬ ‫הצימוד בין ‪ Schiff Base‬ל‪ Asp85-‬מתחזק‪.‬‬ ‫שלב ‪14 :L550nm →M410nm‬מעבר פרוטון מה‪ Schiff Base -‬ל‪ Asp85-‬גורר שחרור של‬ ‫פרוטון ע"י המרכז ‪ Glu204‬ו‪ .Glu194-‬ספקטרום הבליעה משתנה מבליעה של‬ ‫‪ protonated Schiff Base‬מופרע )‪ (550nm‬לבליעה של ‪.Unprotonated Schiff Base‬‬ ‫בשלב מאוחר יותר‪ ,‬המכונה " ‪ "Late M State‬שלוש מולקולות ‪ carboxylate‬הנושקות‬ ‫בציטופלזמה )נמצאות בצד הפנימי של הממבראנה( ומשמשות כ‪,"Proton Antenna " -‬‬ ‫עוברות פרוטונציה ע"י הציטופלאזמה‪.‬‬ ‫שלב ‪ :M410nm →N520nm‬פרוטונציה של ה‪ Schiff Base -‬ע"י החומצה האספרטית‬ ‫‪ .Asp96‬כתוצאה מכך מתרחשת העברת פרוטון ממולקולות ה‪ carboxylate -‬למולקולת‬ ‫‪13‬‬ ‫החומצה האספרטית‪ .‬ספקטרום הבליעה חוזר לצהוב עקב פרוטונציה של ה‪Schiff -‬‬ ‫‪.Base‬‬ ‫שלב ‪15 : N520nm →O640nm‬חזרה של ה‪ Schiff Base-‬למצבו ההתחלתי‪13cis to All ) :‬‬ ‫‪ ,(Trans‬ויצירת שרשרת של מולקולות מים‪ ,‬הקשורות בקשרי מימן )איור ‪,(1.5c‬‬ ‫המחברת בין ‪ Asp85‬לאזור שחרור הפרוטון )‪ (Glu204, Glu194‬כהכנה למעבר של‬ ‫פרוטון‪.‬‬ ‫איור ‪ :1.5‬מבנה האתר לשחרור הפרוטון‪ (a) .‬מצב יסוד )‪ (BR570‬וצפיפות המים בתוך‬ ‫החלבון; )‪ (b‬מצב ‪ O‬וצפיפות המים בתוך החלבון; )‪ (c‬מבנה של רשת קשרי מימן של‬ ‫מולקולות מים טיפוסית בתוך החלבון‪ .‬בחישוב המבנה הממוצע של אתר שחרור הפרוטון‬ ‫נלקחו בחשבון הרטינאל‪ ,ASP-85, ASP-212, Arg-82, Glu-194 ,‬ו ‪ Glu-204 -‬ומוצג‬ ‫)א( עבור ‪ BR570‬ו )ב( מצב ‪.O‬‬ ‫שלב ‪ :O640nm →BR570nm‬הפרוטון מ‪ Asp85-‬עובר על שרשרת מולקולות המים לאזור‬ ‫שחרור הפרוטון‪ ,‬ובכך תם ה‪ Photocycle-‬והחלבון חוזר למצבו ההתחלתי‪.‬‬ ‫חשוב לציין שכל הצורונים ‪ K590nm‬עד ‪ N520nm‬הנם צורונים אשר ניתן להקפיאם ע"י‬ ‫קירור לטמפרטורות בין ‪ -1500C‬עד ‪ ,-1800C‬ולבדוק את התנהגותם בכלים‬ ‫ספקטרוסקופיה קלאסית ואף בפיזור קרני ‪.16X‬‬ ‫של‬ ‫‪14‬‬ ‫‪ rPSB‬כמערכת מודל למחקר חלבונים רטינלים‬ ‫ה‪ rPSB -‬הינו הצבען בכל החלבונים‬ ‫הרטינלים‪ ,‬המחובר לחלבון דרך קישור‬ ‫קוולנטי‪.‬‬ ‫בכל החלבונים‪ ,‬התפקוד‬ ‫הביולוגי מונע ע"י בליעת אור ברטינל‬ ‫בשלבים הראשוניים של מעגל האור‪,‬‬ ‫אך השלבים השונים ולוחות הזמנים‬ ‫משתנים מאוד מחלבון לחלבון‪.‬‬ ‫השימוש‬ ‫הטבעי‬ ‫הנרחב‬ ‫באותה‬ ‫איור ‪ :1.6‬שני איזומרים ל‪ :rPSB-‬מצב ‪ All Trans‬למעלה‬ ‫ומצב ‪ 13Cis‬למטה‪.‬‬ ‫ארכיטקטורה בכל משפחת החלבונים‬ ‫מהווה מניע לחקר הנושא של השפעות החלבון‪ ,‬כלומר כיצד שינויים בכיס החלבון‬ ‫משפיעים על הדינמיקה ועל התפקוד‪ .‬לשם כך‪ ,‬על מנת להבין כיצד הדינמיקה‬ ‫מושפעת מן החלבון‪ ,‬ולהפריד השפעות חלבון מהשפעות אחרות‪ ,‬חשוב לחקור את‬ ‫הכרומופור עצמו‪ .‬למעשה‪ ,‬מערכת המודל הטובה ביותר אינה הרטינל עצמו‪ ,‬אלא ה‪-‬‬ ‫‪) PSB‬רטינל שעבר פרוטונציה(‪ ,‬וזאת משום שהפרוטונציה של הקבוצה האימינית‬ ‫משנה את מבנה הרמות האלקטרוני – הן בהסחת הרמות והן בשינוי סדר רמות‬ ‫הסינגלט התחתונות ‪ -‬כפי שמפורט בהמשך‪.‬‬ ‫מולקולת הרטינאל ונגזרותיה‬ ‫הרטינאל היא מולקולה ממשפחת הפוליאנים המורכבת משלד פחמני בעל‬ ‫מערכת ‪ π‬מצומדת בדומה לקרוטנואידים‪ ,‬הנוצרת מחמצון של מולקולת ויטמין ‪) A‬איור‬ ‫‪ a 1.6‬ו‪ .(b-‬החלפת האלדהיד בקבוצה פונקציונלית אלדימינית )‪ (Aldimine‬הופכת את‬ ‫המולקולה לבסיס‪ .‬סוג כזה של בסיסים נקרא בסיס שיף )‪.(Schiff Base‬‬ ‫תחום אורכי הגל הנבלעים תלוי בפוטנציאל האלקטרוסטטי שיוצרת הסביבה על‬ ‫מולקולת ‪ ,rPSB‬כך שלמרות ששיא הבליעה של ‪ rPSB‬לאחר הפרוטונציה הוא ‪,450nm‬‬ ‫החלבונים הרטינאליים השונים בולעים בכל התחום הנראה‪ .‬בליעה של פוטון גורמת‬ ‫לעירור של ‪ rPSB‬ולאיזומריזציה של אחד מהקשרים הכפולים בפחמנים ‪ 11 , 13‬או ‪9‬‬ ‫מטרנס לציס )איור ‪ ,(1.6c‬ביעילות קוונטית התלויה בסביבה בה נמצא ה‪.rPSB-‬‬ ‫‪15‬‬ ‫‪17‬במתאנול‪ ,‬למשל‪ ,‬עבור בליעה של פוטון נצפו ב‪ rPSB-‬איזומריזציות ‪ Trans-Cis‬סביב‬ ‫הקשרים ‪ 11,9‬ו‪ ,13-‬ביעילות של ‪ 14 , 2‬ו‪ 1-‬אחוזים בהתאמה‪ .‬חשוב לציין כי רוב ה‪-‬‬ ‫‪ rPSB‬חוזר למצב ‪ All Trans‬גם בממס‪.‬‬ ‫הפוטוכימיה ב‪ BR-‬וב‪ - rPSB-‬סקר ספרות‪.‬‬ ‫חשיבות המחקר של התהליכים הראשוניים‬ ‫התמקדות בחקר השלבים הראשוניים של פעולת החלבון חיונית לחשיפת‬ ‫התהליכים המולקולריים שבבסיס התמרת האנרגיה הסולרית לכימית‪ .‬שלבים אלו‪,‬‬ ‫כמו יתר השלבים‪ ,‬מורכבים ואינם ברורים לחלוטין‪ .‬עם זאת‪ ,‬חשיבות התהליכים‬ ‫הראשוניים גדולה היות ו‪:‬‬ ‫•‬ ‫תהליך אחסון האנרגיה הפוטונית וייצובה מתרחש בשלבים הראשוניים‪.‬‬ ‫•‬ ‫האיזומריזציה מתבצעת גם כן בשלבים אלו‪ ,‬ומחקרים מוכיחים שזהו השלב‬ ‫המכריע מבחינת קביעת היעילות הקוונטית של התהליך‪.‬‬ ‫לכן‪ ,‬חקר השלבים הראשונים יאפשר את אפיון התזמון והדינמיקה של איזומריזצית‬ ‫הרטינל סביב הקשר הכפול והבנת חשיבותה לפעילות הביולוגית של החלבונים‬ ‫השונים‪ .‬במהלך שלושת העשורים האחרונים‪ ,‬הפכה הטכנולוגיה המאפשרת מחקר‬ ‫ברזולוציה של פיקושניות לזמינה‪ ,‬ומאז רבו המחקרים תלויי‪-‬הזמן של החלבונים ושל‬ ‫ה‪.rPSB -‬‬ ‫לצורך חקר השלבים הראשוניים בפוטוכימיה של חלבונים רטינלים ושל ה‪,rPSB -‬‬ ‫חשוב לענות על השאלות הבאות‪:‬‬ ‫•‬ ‫האם מולקולת ה‪ rPSB-‬מהווה מערכת מודל עבור תהליכים ראשוניים בחלבונים‬ ‫הרטינאליים? כלומר האם המפתח לפתרון של השאלות המרכזיות לגבי‬ ‫התהליכים הראשוניים מצוי בחקר במולקולת ה‪) .rPSB-‬הכוונה היא לשלבים‬ ‫המוקדמים‬ ‫ביותר‪,‬‬ ‫קרי‪,‬‬ ‫קיבוע‬ ‫אנרגיית‬ ‫הפוטון‬ ‫ושימוש‬ ‫בה‬ ‫לטובת‬ ‫האיזומריזציה‪(.‬‬ ‫•‬ ‫האם הפוטואיזומריזציה של הקשר ‪ C13=C14‬הינה תהליך ראשוני או שישנם‬ ‫תהליכים מוקדמים יותר‪.‬‬ ‫‪16‬‬ ‫כמה‬ ‫•‬ ‫רמות‬ ‫אלקטרוניות‬ ‫פעילות‬ ‫אופטית‬ ‫משתתפות‬ ‫בתהליך‬ ‫הפוטואיזומריזציה ?‬ ‫מהי הסיבה לדעיכה מולטיאקספוננציאלית של המצב המעורר ב‪ rPSB-‬ובחלבון‬ ‫•‬ ‫?‬ ‫בנוסף‪ ,‬על מנת להבין את השפעות החלבון‪ ,‬יש להתייחס לסוגיות הבאות‪:‬‬ ‫‪(I‬‬ ‫מה גורם לאיזומריזציה סלקטיבית סביב הקשר ‪? C13=C14‬‬ ‫‪(II‬‬ ‫מה הסיבות ליעילות קוונטית הגבוהה בחלבונים אלה ?‬ ‫‪(III‬‬ ‫מהו המנגנון בעזרתו החלבון מצליח ללכוד את אנרגיית הפוטון ולנצל אותה‬ ‫לטובת הפעילות הביולוגית ?‬ ‫חקר תהליכים מהירים אלו מתבצע בעיקר בשיטת ‪Pump-Probe Spectroscopy‬‬ ‫ובשיטת ‪ Time Resolved Emission‬בפאזה מעובה‪ .‬שיטות נוספות הן הכנסת פולס‬ ‫נוסף )‪ (Dump‬לשיטת ה‪ Pump-Probe Spectroscopy -‬על מנת לבדוק האופי של המצב‬ ‫המעורר‪ ,‬ניסויים על ה‪ rPSB-‬בפאזה גזית ושיטות של הכנסת מוטציות בחלבון או‬ ‫במולקולת הרטינאל‪ .‬עבור כל השאלות שהועלו לעיל‪ ,‬בוצעו מחקרים הן על מולקולת‬ ‫ה‪ rPSB-‬בממסים שונים והן על חלק נכבד מהחלבונים הרטינאליים‪ .‬בפרק זה אציג‬ ‫חלק מהמחקרים שנעשו‪ ,‬את תוצאותיהם ומסקנותיהם‪ .‬גם כאן אציג עבודות על ‪rPSB‬‬ ‫וחלבון ה‪ BR-‬בלבד‪ .‬הסיבה למיקוד ב‪ BR-‬היא כי היסטוריית המחקר שלו ארוכה יותר‬ ‫משאר החלבונים הרטינאליים המיקרוביאליים‪ .‬בסוף הפרק‪ ,‬נציג את השאלות שנותרו‬ ‫פתוחות ומהוות מוטיבציה למחקר הנוכחי‪ ,‬כמו גם התייחסות למשפחת הקרוטנואידים‬ ‫שנחקרה רבות ב‪.NIR -‬‬ ‫‪17‬‬ ‫‪:rPSB‬‬ ‫נתחיל את הסקירה של ה‪ rPSB-‬במאמר פורץ הדרך משנת ‪ ,1986‬בו פורסם כי‬ ‫‪ 17K. A. Freedman and R. S. Becker‬הצליחו להפריד בין האיזומרים השונים של ה‪rPSB-‬‬ ‫וה‪ rSB-‬בשיטת ‪ ,HPLC‬והסתכלו על התוצאות בפוטוליזת פלאש‪ .‬הם הראו לראשונה‬ ‫את הספקטרום של כל אחד מהאיזומרים וגם גילו קשר ישיר לאינטראקציה עם‬ ‫הסביבה )ממס( ע"י ביצוע הניסוי בממסים שונים‪ .‬כבר במאמר זה מתייחס הכותב‬ ‫לסימטריות האופייניות לפוליאנים )קבוצת הסימטריה ‪ (C2h‬ושבירתה ע"י יצירת דיפול‬ ‫ב‪ .rPSB-‬כמו כן התייחסו הכותבים לאפשרות של עירבוב ) ‪ (Mixing‬של הרמות‬ ‫המעוררות הראשונות )‪11Bu+‬‬ ‫ו‪ (21Ag- -‬ואף מצב בו הרמה ‪ 21Ag-‬יורדת באנרגיה אל‬ ‫מתחת לרמה ‪) 11Bu+‬מודל של ‪ 3‬רמות אופטיות פעילות(‪ .‬קביעה חשובה נוספת היא‬ ‫אי היווצרותם של מצבים טריפלטיים בכל מסלולי האיזומריזציה‪ ,‬ב‪ rPSB-‬וב‪ rSB-‬כאחד‪.‬‬ ‫החל משנות ה‪ 90-‬החלו ניסויי ‪ Pump-Probe‬ו‪-‬‬ ‫‪ ,Time-Resolved Emission‬בהם התגלו זמני חיים‬ ‫הראשוניים‬ ‫לתהליכים‬ ‫ברזולוציית‬ ‫זמן‬ ‫של‬ ‫פמטושניות‪ .‬אחת התגליות המעניינות הייתה דעיכה‬ ‫מולטיאקספוננציאלית של המצב המעורר )הבליעה‬ ‫והפליטה(‪ .‬הסיבות לדעיכה זו לא הובהרו במאמר‬ ‫זה ושאלה זו מעסיקה חוקרים עד היום‪ .‬הדיונים לא‬ ‫איור ‪ :1.7‬מודל ‪ 2‬רמות עבור ה‪.rPSB -‬‬ ‫הניבו תשובות חד‪-‬משמעיות לגבי מבנה הרמות וצורת משטחי הפוטנציאל‪ .‬מודל שתי‬ ‫‪18‬‬ ‫הרמות )איור ‪ (1.7‬שהוצג ע"י ‪Hamm etal‬‬ ‫ב‪ 1995-‬לא נתן הסבר מניח את הדעת‬ ‫לתוצאות הנסיוניות‪ .‬ניסויים באנלוגים של ‪ rPSB‬בהם נעלו קשרים כפולים ספציפיים‬ ‫הראו כי נעילת קשר ב‪ All-Trans rPSB-‬אינה משפיעה על קצב ההיפוך הפנימי‪ ,‬אך‬ ‫נעילת ‪ rPSB‬במצב ‪ Cis‬כלשהו מעכבת את דעיכת המצב המעורר‪.20 19‬‬ ‫ב‪ 2005-‬פורסם מחקר בו נטען כי התנהגות ה‪rPSB-‬‬ ‫בפאזה גזית‬ ‫‪21‬‬ ‫מדמה טוב יותר את המצב המעורר שלו‪,‬‬ ‫כיוון שאינטראקציה עם ממס גורמת לעלייה חזקה‬ ‫במחסום הפוטנציאל לאיזומריזציה‪ .‬הניסוי הראה כי ה‪-‬‬ ‫‪ Opsin Shift‬הוא לכחול ולא לאדום כפי שנטען קודם‬ ‫)איור ‪ ,(1.8‬כלומר שדה חיצוני שיוצר הממס או החלבון‬ ‫איור ‪ :1.8‬ספקטראות בליעה של‬ ‫‪ rPSB‬בואקום‪.‬‬ ‫‪18‬‬ ‫מייצב את המולקולה ומעלה את אנרגיית האקסיטציה שלה למרכז הנראה ואף ל‪UV-‬‬ ‫הקרוב‪ ,‬כאשר ה‪ rPSB-‬בפאזה גזית בולע סביב ה‪ 600-‬נ"מ‪.‬‬ ‫‪22‬‬ ‫באותה שנה פורסם מחקרו התאורטי מ‪ 2005-‬של ‪M. Olivucci etal‬‬ ‫בו פורסמה‬ ‫הטענה הבאה‪ :‬דעיכה מולטיאקספוננציאלית תיתכן במקרה של קיום מחסום‬ ‫פוטנציאל‬ ‫העליון‪,‬‬ ‫מזערי‬ ‫אפילו‬ ‫על‬ ‫המשטח‬ ‫של‬ ‫במודל‬ ‫המעורר‬ ‫רמות‬ ‫שתי‬ ‫אלקטרוניות בלבד‪ .‬חישוב בשיטת דינמיקה‬ ‫קוונטית עבור מחסום פוטנציאל בגודל של‬ ‫‪0.6 kcal / mol‬‬ ‫)לעומת הפרש האנרגיות‬ ‫‪ ( Δ E (S 1−S 0 )≈44 kcal / mol‬הניב תוצאה‬ ‫המדמה בצורה טובה תוצאות ניסיוניות‪.‬‬ ‫איור ‪ :1.9‬המודל של ‪ .Zgrablic etal‬עבור ‪rPSB‬‬ ‫במתנול‪.‬‬ ‫ב‪ 2008-‬פורסם מאמר של ‪G.‬‬ ‫‪23‬‬ ‫‪etal‬‬ ‫‪Zgrablic‬‬ ‫שעסק‬ ‫להופעת‬ ‫בסיבה‬ ‫הדעיכה‬ ‫המולטיאקספוננציאלית במולקולת‬ ‫ה‪ rPSB-‬ופירש אותה בדרך קצת‬ ‫שונה‪ :‬המצב *‪" I‬חם"‪ ,‬ותוך כדי‬ ‫קירור‬ ‫מתפצלת‬ ‫האוכלוסיה‬ ‫המעוררת על המשטח ‪ S1‬למספר‬ ‫אוכלוסיות‪ ,‬כאשר לכל אוכלוסיה‬ ‫זמן חיים שונה )איור ‪ .(1.9‬בנוסף‬ ‫חלק מהאוכלוסיה עובר ל‪ ,S2-‬ממנו‬ ‫חזרה ל‪ All-Trans-‬ותוצרים אחרים‪.‬‬ ‫נכון להיום אין תמימות דעים‬ ‫איור ‪ :1.10‬שני מודלים עבור רמות אלקטרוניות בחלבון ה‪,BR-‬‬ ‫כאשר ‪ θ‬היא קורדינטת סיבוב סביב הקשר הכפול ‪) C13=C14‬למטה(‪.‬‬ ‫התמונה השמאלית מראה סכימה עבור מודל ‪ 2‬רמות ואילו הימנית‬ ‫מראה סכימה של מודל ‪ 3‬רמות‪.‬‬ ‫לגבי מודל הרמות המדויק עבור ה‪ ,rPSB-‬ואחת ממטרות המחקר שלנו היא לענות על‬ ‫שאלה זו‪ .‬מטרה נוספת היא לבדוק את רמת הדמיון בין המבנה האלקטרוני של ה‪-‬‬ ‫‪ rPSB‬לזה של החלבונים הרטינאליים‪ ,‬ולכן יש צורך לסקור התפתחויות ושאלות‬ ‫מרכזיות עבור החלבונים‪ ,‬וגם כאן כהרגלינו נתמקד ראשית בחלבון ה‪.BR-‬‬ ‫‪19‬‬ ‫‪:BR‬‬ ‫המודל הקינטי הראשון עבור חלבון ה‪ BR-‬פורסם ב‪ 1988-‬במקביל ע"י ‪D.‬‬ ‫‪25 24‬‬ ‫‪Oesterhelt‬‬ ‫ו‪ R. Mathies-‬והוא תיאר את המערכת כמערכת של ‪ 2‬רמות אלקטרוניות‬ ‫)איור ‪ 1.10‬משמאל(‪ .‬העירור מתבצע מרמה ‪ S0‬לרמה ‪ ,S1‬ומשם תוך כ‪ 100fs-‬מוזח‬ ‫ספקטרום הפליטה המאולצת של המצב המעורר לאדום וספקטרום הבליעה של‬ ‫המצב המעורר לכחול )איור ‪ .(1.11‬לאחר מכן בחתך קוני‪ ,‬האוכלוסיה מתחלקת ל‪2-‬‬ ‫אוכלוסיות‪ :‬האחת עוברת איזומריזציה והשנייה חוזרת למצב ההתחלתי‪.‬‬ ‫‪26‬‬ ‫‪ ,M. A. El-Sayed‬פרסם סדרת מאמרים )‪ (1993-1996‬הטוענת כי מוטציות שונות‬ ‫משפיעות חזק על זמן היווצרות הצורון ‪ ,J625‬שנמצא להיות הצורון החם של ה‪rPSB-‬‬ ‫שעבר איזומריזציה בתוך החלבון‪ .‬ב‪ 1996-‬פרסם ‪ 27P. A. Anfinrud‬מאמר שטוען כי חייב‬ ‫להיות עוד מינימום לוקאלי במשטח ‪) S1‬איור‬ ‫‪ 1.10‬מימין(‪ ,‬והמוטציות בחלבון משפיעות‬ ‫על עומק מינימום לוקאלי זה‪ .‬הוא הגדיר‬ ‫את המינימום כמצב ‪ I‬בעל ספקטרום‬ ‫בליעה לא ידוע‪ ,‬עקב מגבלות רזולוציה‪.‬‬ ‫בשנת ‪ Koji Nakanishi 1983‬העלה את‬ ‫הרעיון לבצע ניסוי באנלוגים נעולי קשרים‬ ‫ל‪rPSB-‬‬ ‫ע"י‬ ‫יצירת‬ ‫טבעת‬ ‫השלד‬ ‫על‬ ‫איור ‪ :1.11‬תוצאות של ‪ :R. Mathies etal‬רואים‬ ‫ברזולוציית זמן של כ‪ 60-‬פמטו' את ההסחה לאדום של‬ ‫פליטה ולכחול של הבליעה‪.‬‬ ‫הפחמני‪ ,‬המונעת איז ומריזציה סביב קשר ספציפי‪ ,‬ולהטמיע אותם בחלבון רטינאלי‪,‬‬ ‫ובכך לגלות את הקשר הפעיל לאיזומריזציה ‪ .28‬התוצאה החשובה מהניסויים שלו היא‬ ‫כי יצירה של טבעת על הקשר ‪) C13=C14‬איור‬ ‫‪ (1.12‬היא היחידה שמבטלת לחלוטין את כל‬ ‫השלבים המאוחרים של מעגל האור בחלבונים‬ ‫רטינאליים‪ .‬מסקנתו הייתה כי האיזומריזציה‬ ‫‪29‬‬ ‫מתרחשת סביב הפחמן ‪ C13‬בלבד‬ ‫‪ .30‬תחילה‬ ‫טענה זו נבדקה עבור החלבון ‪Chlumydomonas‬‬ ‫‪ reinhardtii‬ואחר‪-‬כך על חלבון ה‪) BR-‬תחילת‬ ‫שנות ה‪.(90-‬‬ ‫איור ‪ :1.12‬למעלה‪ -‬אנלוג ל‪ rPSB-‬נעול הקשר‬ ‫‪ C13= C14‬במצב טראנס‪ .‬למטה‪ -‬אנלוג ל‪rPSB-‬‬ ‫נעול הקשר ‪ C13= C14‬במצב ציס‪.‬‬ ‫‪20‬‬ ‫בשנת בשנת ‪ 1999‬התפרסם מאמר של הקבוצה של ‪ , S. Ruhman‬על ניסוי בו‬ ‫נעלו את הקשר ‪ C13=C14‬ע"י יצירת טבעת מחומשת פחמנית‪ ,31‬כפי שעשה ‪K.‬‬ ‫‪ ,Nakanishi‬על מנת לבדוק את המערכת בשיטת ‪.Pump-Probe Spectroscopy‬‬ ‫הממצאים הראו כי ספקטרום הבליעה של החלבון לא השתנה‪ ,‬למרות שהמולקולה‬ ‫לא יכולה לבצע איזומריזציה‪ ,‬וזמני החיים של המצב המעורר התארכו ביותר מסדר‬ ‫גודל‪ .‬ניסוי זה מחזק את הטענה כי קיים לפחות צורון נוסף שחי זמן סופי לפני‬ ‫האיזומריזציה‪ .‬ניסוי שנעשה מאוחר יותר‪ ,‬ובדק התנהגות של ‪ rPSB‬נעול בממס‪ ,‬מראה‬ ‫התנהגות דומה ל‪ rPSB-‬הרגיל‪ ,32‬מה שמדגיש את עוצמת השפעת החלבון‪ ,‬המבטלת‬ ‫לחלוטין את האפשרות לאיזומריזציה סביב הקשרים ‪ C11=C12‬ו‪.C9=C10-‬‬ ‫בהמשך‪,‬‬ ‫על‬ ‫מנת‬ ‫לבדוק‬ ‫את‬ ‫ההתפתחות של המצב המעורר‪ ,‬התבצע‬ ‫ניסוי ‪ 3‬פולסים‪ ,Pump-Dump-Probe ,‬בו‬ ‫נבדק ישירות מצב זה‪ .‬המטרה הייתה‬ ‫לבדוק את חתך הפעולה לפליטה מאולצת‬ ‫של המצב המעורר‪ ,‬ע"י פולס המתאים‬ ‫בתדירותו למעבר מ‪ S1-‬ל‪ .S0-‬התוצאות‬ ‫הראו כי חתך הפעולה לפליטה מאולצת‬ ‫עבור זמני ריקון של ‪ S1‬שונים נשאר קבוע‬ ‫)איור ‪ ,(1.13‬וריקון הרמה מפחית את כמות‬ ‫איור ‪ :1.13‬תוצאות עבור ניסוי ‪ 3‬פולסים‪ :‬חתך הפעולה‬ ‫לפליטה מאולצת נשמר‪.‬‬ ‫הצורון ‪ . J‬המסקנה המיידית היא קיום של מינימום לוקאלי נוסף על המשטח ‪S‬‬ ‫‪, 1‬‬ ‫המסומן ב‪ ,I-‬וזהו צורון שמהווה חלק ממעגל האור‪.‬‬ ‫חיזוק נוסף למודל שלוש הרמות התפרסם ב‪ 2008-‬ע"י ‪ ,R. Mathies etal‬שבשיטת‬ ‫‪) TRSRS‬ר"ת ‪ (Time Resolved Stimulated Raman Spectroscopy‬מדדו ויברציות של‬ ‫המצבים האלקטרוניים המעוררים ע"י התבוננות בהסחת ‪ .Raman‬תדר הויברציה של‬ ‫הקשר הכפול ‪ C=C‬עובר הזחה לאדום עם קבוע של ‪ 180‬פמטו' והזחה לכחול לתוצאה‬ ‫הידועה בניסויי ‪ Raman‬רגילים ב‪ 3-‬פיקו'‪ ,‬זמנים התומכים במודל הנ”ל‪.‬‬ ‫‪21‬‬ ‫שאלות פתוחות ומוטיבציה למחקר הנוכחי‬ ‫השאלות שנשארו פתוחות ועליהן ננסה לענות בעבודתינו הן‪:‬‬ ‫•‬ ‫מהן הרמות האלקטרוניות הפעילות בתהליך הפוטואיזומריזציה?‬ ‫•‬ ‫מהי הסיבה למולטיאקספוננציאליות בדעיכת המצב המעורר?‬ ‫•‬ ‫האם מערכת ה‪ rPSB-‬בממס מהווה מודל טוב ללימוד הפוטוכימיה של‬ ‫החלבונים הרטינאליים?‬ ‫בטבע קיימת קבוצת פיגמנטים נוספת ששלדה מורכב מפחמנים בעלי מערכת‬ ‫קשרי ‪ π‬מצומדים‪ ,‬וכמו הרט ינאל גם אחד מישומיהם הטבעיים הוא פוטוסינתזה‪,‬‬ ‫הקרוטנואידים‪ .‬קבוצת פיגמנטים זו נחקרה רבות ונכון להיום ידוע עליה יותר מאשר על‬ ‫ה‪ . rPSB-‬בפרק הקרוב אעשה סיכום של מחקרים על קבוצת פיגמנטים זו ואבדוק את‬ ‫הרלוונטיות של התוצאות ממחקרים אלה על חקר ה‪.rPSB-‬‬ ‫קרוטנואידים‬ ‫קרוטנואידים‪ :‬כללי‬ ‫‪33‬הקרוטנואידים‬ ‫הם‬ ‫צבענים‬ ‫טבעיים‬ ‫הנפוצים ברקמות של צמחים ‪ ,‬אצות ‪ ,‬חיידקים‪,‬‬ ‫פטריות ובע"ח‪ ,‬כולל בני האדם‪ .‬הם מורכבים‬ ‫מפחמנים הקשורים ביניהם במערכת ‪ N‬קשרים‬ ‫כפולים מצומדים )מערכת אלקטרוני ‪ ,(π‬כאשר‬ ‫המספר ‪ N‬נותן את מספר קשרי פחמן כפולים‬ ‫מצומדים‪ ,‬לדוגמא ל‪) violaxanthin (9) -‬איור‬ ‫‪ 1.14‬למטה( תשעה קשרי פחמן מצומדים‪.‬‬ ‫איור ‪ :1.14‬קרוטנואידים טיפוסיים‪.‬‬ ‫בהמשך נראה כי הרבה תכונות אופטיות של הקרוטנואידים נוב עות מגודלו של ‪ . N‬על‬ ‫פי רוב צבעם של הקרוטנואידים צהוב ‪ ,‬כתום או אדום )החזרה(‪ .‬עם הקרוטנואידים‬ ‫נמנים קרוטנים ‪ ,‬שהם תת‪-‬קבוצה של פחמימנים ‪ ,‬כגון ‪-β‬קרוטן )בעל תועלת לראייה(‪.‬‬ ‫‪22‬‬ ‫קסנתופילים הם קרוטנואידים המכילים קבוצות פונקציונליות חמצניות ‪ ,‬ועמהם נמנים‬ ‫כהלים‪ ,‬אלדהידים‪ ,‬קטונים‪ ,‬חומצות ואפוקסידים‪.‬‬ ‫הקרוטנואידים בפוטוסינתזה מתפקדים כפיגמנטים בחלבונים במערך איסוף האור‬ ‫)‪) ( Light-Harvesting Proteins, LHP‬איור ‪ 1.15‬למעלה(‪ .‬כהמחשה לאופן פעולתם‬ ‫אתאר בקצרה את תהליך הפוטוסינתזה בצמחים‪ .‬תהליך הפוטוסינתזה בצמחים‬ ‫מתרחש במברנות טילקואידיות ) ‪ (Thilakoid Membrane‬בתוך הכלורופלאסט בתא‬ ‫הצמח‪ .‬הממברנה מכילה חלבונים וכלורופילים המרוכזים במרכז פעיל הנקרא‬ ‫‪ Photosystem I‬או בקיצור ‪ .PSI‬ה‪ PSI-‬בנוי ממרכז פעיל‪ ,‬בליבו נמצא הקטליזטור ‪ATP‬‬ ‫‪,Synthase‬‬ ‫קומפלקסים‬ ‫וסביבו‬ ‫‪ ,cytochrome b6f complex‬ואת כולם‬ ‫מקיפה טבעת של חלבוני ה‪ .LHP -‬ה‪-‬‬ ‫‪ LHP‬הנם חלבונים הבנויים מטבעת‬ ‫המורכבת‬ ‫בעשרות‬ ‫מסלילים‬ ‫מולקולות‬ ‫כלורופילים‬ ‫לקרוטנואידים‬ ‫הממולאת‬ ‫צבע‬ ‫מסוג‬ ‫וקרוטנואידים‪.‬‬ ‫תפקיד‬ ‫משולש‬ ‫בחלבון‪:‬‬ ‫•‬ ‫הראשון הוא שמירה על מבנה‬ ‫החלבון בו נמצא הקרוטן‪ .‬נמצא‬ ‫כי הוצאת הקרוטנואיד מהחלבון‬ ‫החוצה גורם לשינוי מבני חזק‬ ‫בחלבון‪.34‬‬ ‫•‬ ‫התפקיד השני הוא הגנה על‬ ‫הכלורופיל מפני חמצון על ידי‬ ‫שיכוך מצבי הטריפלט שנוצרים‬ ‫איור ‪ :1.15‬למעלה‪ :‬מבנה וספקטרום בליעה של חלבון קוצר‪-‬‬ ‫אור בצמחים‪.‬‬ ‫למטה‪ :‬ספקטראות של ‪ (B)Chl‬מסוג א )ירוק כהה( ו‪-‬ב )ירוק‬ ‫בהיר( וספקטרום אופייני של קרוטנואידים )צהוב(‬ ‫במהלך הפוטוסינתזה‪ .‬זהו תהליך רב‪-‬שלבי הדורש נוכחות של חמצן בחלבון‪.‬‬ ‫התהליך מתחיל בכך ש‪ (B)Chl-‬יוצר מצבי טריפלט כתוצאה מבליעת פוטון‪.‬‬ ‫מולקולת החמצן‪ ,‬שמטבעה היא במצב טריפלטי‪ ,‬מגיבה עם ‪ (B)Chl‬במצב‬ ‫טריפלטי ובכך משככת אותו‪ ,‬ושתי המולקולות עוברות למצב סינגלטי‪ .‬החמצן‬ ‫‪23‬‬ ‫הסינגלטי עלול להזיק לחלבון‪ ,‬ומכאן החשיבות הרבה לתכונה זו של‬ ‫הקרוטנואיד‪ .‬הקרוטנואיד‪ ,‬בהתנגשות עם החמצן‪ ,‬גורם לשיכוך המצב הסינגלטי‬ ‫הלא יציב‪ ,‬ושניהם הופכים לטריפלטים‪ .‬בסופו של התהליך הטריפלט‬ ‫בקרוטנואיד דועך טרמית בסקאלה של מיקרושניות בודדות‪ .35‬תהליך זה‬ ‫מתאפשר היות ושני תנאיו הבסיסיים ‪ -‬שימור אנרגיה ושימור ריבוי‪-‬ספין –‬ ‫מתקיימים ברמות האלקטרוניות הרלוונטיות של החמצן והקרוטנואיד‬ ‫•‬ ‫התפקיד השלישי הוא בליעת הפוטון והעברת האנרגיה שלו לאנרגיה כימית‪.‬‬ ‫ספקטרום הבליעה של הקרוטנים משתרע בנראה )‪ (VIS‬ועד אולטרא‪-‬סגול הקרוב‬ ‫)‪) .(NUV‬איור ‪ 1.15‬למטה בצהוב(‪.‬‬ ‫פוטוכימיה של קרוטנואידים‬ ‫למגוון‬ ‫שקיימים‬ ‫התפקידים‬ ‫לקרוטנואידים בטבע אין אח ורע בשום‬ ‫משפחה של פיגמנטים טבעיים‪ .‬מגוון זה נובע‬ ‫ישירות מהתכונות הספקטרוסקופיות הנגזרות‬ ‫מהמבנה של מולקולת הקרוטנואיד‪ .‬המבנה‬ ‫טבלה ‪ :2‬הצגה אופרטורית בלתי פריקה של קבוצת‬ ‫הסימטריה ‪.C2h‬‬ ‫המרכזי שחוזר על עצמו בכל הקרוטנואידים הוא השלד המורכב מקשרים כפולים‬ ‫ויחידים לסירוגין בפחמן‪ ,‬היוצרים מערכת קשרי ‪ π‬מצומדים האחראים לרוב התכונות‬ ‫הספקטרוסקופיות של הקרוטנואידים‪.‬‬ ‫רוב הקרוטנואידים משתייכים לקבוצת‬ ‫הסימטריה ‪) C2h‬לעומת ה‪ rPSB-‬שהיא‬ ‫מולקולה‬ ‫במונחים‬ ‫אסימטרית(‪.‬‬ ‫של‬ ‫קבוצת סימטריה זו‪ ,‬רמת היסוד )‪(S0‬‬ ‫מסומנת‬ ‫הסינגלטיות‬ ‫─‬ ‫כ‪A g -‬‬ ‫ושתי‬ ‫המעוררות‬ ‫הרמות‬ ‫הראשונות‬ ‫‪1 ‬‬ ‫─ ‪1‬‬ ‫מסומנות ב‪ (S1) 2 A g -‬ו‪(S2) 1 B u -‬‬ ‫בסדר אנרגיה עולה‪.‬‬ ‫איור ‪ :A :1.16‬מודל רמות עבור קרוטנואידים "קצרים"‪.‬‬ ‫─ ‪1‬‬ ‫‪ :B‬הרמה ‪ 1 B u‬היורדת מתחת ל‪ S2-‬בקרוטנואידים‬ ‫ארוכים‪.‬‬ ‫‪ :C‬הווצרותה של הרמה *‪ S‬בקרוטנואידים ארוכים‪.‬‬ ‫‪24‬‬ ‫─ ‪1‬‬ ‫─‬ ‫‪ 2 A g  A g‬הינו מעבר אסור משיקולי סימטריה‪ ,‬כך שניתן לתאר אותה‬ ‫המעבר‬ ‫‪1 ‬‬ ‫─‬ ‫‪ 1 B u  Ag‬מותר מאותם השיקולים‪ ,‬ולכן‬ ‫כרמה חשוכה‪ .‬לעומת זאת המעבר‬ ‫‪1 ‬‬ ‫ספקטרום בליעת הקרוטנואיד מתקבל מהמעבר האופטי מרמת היסוד ל‪ . 1 B u -‬לפי‬ ‫המודל הפשוט ביותר העירור מתבצע לרמה ‪ , S2‬לאחר מכן מתבצעת דעיכה בסקלת‬ ‫זמנים של עשרות עד מאות פמטושניות )מעבר ‪ S2‬ל‪ (S1-‬ואז דעיכה למצב יסוד‬ ‫)‪ S1‬ל‪ (S0-‬בסקלת זמנים של פיקושניות )איור ‪ .(1.15A‬עבור קרוטנואידים ארוכים‬ ‫)‪ ,(N<10‬נוספות רמות פעילות אופטית בין ‪ S1‬ל‪ S2-‬בסקלת האנרגיה‪.‬‬ ‫─‬ ‫הרמות‬ ‫‪1‬‬ ‫─‬ ‫‪1‬‬ ‫‪ 3 A g‬ו‪) 1 B u -‬איור ‪ (1.16B‬עבור ‪ N‬נמוך הנמצאות מעל לרמה ‪,S2‬‬ ‫יורדות בפוליאנים ארוכים מתחת לרמה ‪ ,S2‬הופכות פעילות אופטית בשלבי הדעיכה‪.‬‬ ‫‪36‬‬ ‫בנוסף‪ ,‬בפוליאנים ארוכים )‪ (N≥10‬קיימת הרמה *‪S‬‬ ‫דרכה מתבצע מעבר סינגלט‪-‬‬ ‫טריפלט מהיר )איור ‪.(1.16C‬‬ ‫חקר הקרוטנואידים באינפרא אדום הקרוב‬ ‫בשיטות‬ ‫של‬ ‫השונות‬ ‫ספקטרוסקופיה‬ ‫במצב עמיד ניתן לקבל אינפורמציה על‬ ‫התכונות של משטח הפוטנציאל של מצב‬ ‫היסוד‬ ‫האלקטרוני‬ ‫מהספקטרוסקופיה‬ ‫הנראה‬ ‫של‬ ‫הקרוטנואיד‪.‬‬ ‫הטרנזיאנטית‬ ‫)‪Resolved‬‬ ‫‪Time‬‬ ‫בתחום‬ ‫‪Pump-Probe,‬‬ ‫‪ (Emission, Time Resolved Raman‬ניתן להסיק‬ ‫המעברים ‪S 1 ⇒ S 0 , S 2 ⇔S 0‬‬ ‫על‬ ‫ו‪-‬‬ ‫איור ‪ :1.17‬ספקטרום טרנזיאנטי עבור מעבר ‪S1-S2‬‬ ‫של ‪ spheroidene‬ב‪ n-hexane-‬ושל‬ ‫‪ violaxanthin‬במתנול‪.‬‬ ‫‪ S N ⇔ S 1‬כמו גם המעברים ל‪ SN-‬מהרמות‬ ‫─‬ ‫‪1‬‬ ‫─‬ ‫‪1‬‬ ‫‪ 3 A g‬ו‪ 1 B u -‬ו‪S*-‬‬ ‫ועל‬ ‫האופי‬ ‫של‬ ‫משטחים‬ ‫אלה‪.‬‬ ‫מודל‬ ‫שלוש‬ ‫הרמות‬ ‫בקרוטנואידים הפך מקובל בקהילה המדעית פרט לאנרגיה של המצב האלקטרוני ‪.S1‬‬ ‫הסיבה לכך היא כי מדובר ברמה חשוכה‪ ,‬שממנה המעבר ל‪ S0 -‬אסור‪ ,‬כך שעוצמת‬ ‫הפליטה של רמה זו נמוכה מאוד‪ ,‬ובחלק מהקרוטנואידים נמצאות בחפיפה עם‬ ‫המעבר ‪ S 2  S 1‬החזק‪.‬‬ ‫משום כך‪ ,‬לרוב‪ ,‬לא ניתן להפריד ביניהם בעזרת שיטות‬ ‫ספקטרוסקופיה של מצב עמיד‪ .‬עבור קרוטנואידים ספציפיים היו הצלחות נקודתיות‬ ‫‪25‬‬ ‫בשימוש בשיטות של מצב עמיד‪ ,‬למשל תכונותיה של ‪ S1‬מתבהרות מהסתכלות‬ ‫בנראה על המעבר‬ ‫‪ , S 1  S N‬ספקטרוסקופיית ‪ Raman‬סיפקה תוצאות עבור רמת‬ ‫היסוד הויברציונית ב‪ ,S1-‬אך אינפורמציה זו אינה מספיקה ע"מ למקם אנרגטית את‬ ‫הרמה עבור כל הקרוטנואידים‪ .‬כמו כן בניסויים מסוג זה המולקולות הפולטות הן‬ ‫מועטות‪ ,‬ולכן לא בהכרח מייצגות את עיקר האוכלוסיה המעוררת‪.‬‬ ‫פענוח של אנרגיית הרמה הגיע מכיוון ספקטרוסקופיה אולטרה מהירה ב‪,NIR -‬‬ ‫המתאימה אנרגטית הן למעבר‬ ‫‪S2 → S N‬‬ ‫והן למעבר‬ ‫‪ . S 1 → S 2‬היתרון הגדול של‬ ‫השיטה הוא היכולת להפריד בין המעברים האלה בזמן‪ ,‬ובכך לפתור את בעית‬ ‫החפיפה הספקטרלית של מעברים אלה‪ .‬זמן החיים של הרמה ‪ S2‬נע בין ‪ 100‬ל‪300-‬‬ ‫פמטושניות; לעומתו זמן החיים של ‪ S1‬הוא פיקושניות בודדות עד עשרות פיקושניות‪.‬‬ ‫ספקטרום הבליעה הטרנזיאנטי למעבר ‪ S 1  S 2‬בעל מבנה ויברציוני חזק )איור ‪,(1.17‬‬ ‫וממנו ניתן לחלץ את אנרגיית המעבר בין הרמות‪ .‬כיוון שאנרגיה של הרמה ‪ S2‬ידועה‬ ‫מניסויים במצב עמיד ניתן למקם אנרגטית את ‪ S1‬ע"י חיסור‪ .‬להלן כמה תגליות‬ ‫הקשורות לרמות ‪ S1‬ו‪: S2 -‬‬ ‫מהסתכלות על הפליטה המאולצת במעבר ‪ S 2 → S 1‬ועל הבליעה במעבר האופטי‬ ‫‪ S 2  S N‬בסוגי קרוטנואידים שונים‪ ,‬ניתן להסיק כי מחסום הפוטנציאל להיפוך‬ ‫הפנימי במעבר זה הולך וקטן עם ‪) N‬מספר הצימוד(‪ .‬טענה זו נתמכת גם ע"י מחקר‬ ‫תאורטי‪ . 37‬בנוסף‪ ,‬גילו השפעה רבה של מומנט הדיפול של הממס על ‪ S2‬הן על‬ ‫האנרגיה‪ ,‬הן על זמן חיים והן על תדרי הויברציה‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬רמת ‪ S1‬מתנהגת כאילו‬ ‫המולקולה מבודדת מהממס‪ :‬עבור מעבר מממס עם מומנט דיפול חזק יחסית כמו‬ ‫מתנול לממס ללא מומנט דיפול כלל )‪ (CS2‬לא נצפו שינויים משמעותיים בקינטיקה‬ ‫עבור קרוטן מסוג ‪ .hydroxyechinenone -3‬לעומת זאת צימודו של הקרוטן לחלבון‬ ‫קיצרה את זמן החיים של ‪ S1‬ביותר מפקטור ‪ 2‬מ‪ 6-‬פיקו' ל‪ 2.6-‬פיקו'‪.‬‬ ‫כמו כן שני תהליכי העברת מטען בקרוטנואידים נצפו בספקטרוסקופיה אולטרה‪-‬‬ ‫מהירה לראשונה רק עם פתיחת חלון ה‪:NIR-‬‬ ‫‪ .1‬העברת מטען מהקרוטנואיד לממס תוך יצירת קטיון‪-‬רדיקל על הקרוטנואיד‪.‬‬ ‫המחקר התמקד בבטא‪-‬קרוטן בממסים שונים‪ .‬הקטיון‪-‬רדיקל ניתן לזיהוי ע"י‬ ‫ספקטרום בליעה חזק ב‪ .NIR-‬גילו כי מעבר מטען זה מתרחש ישירות מהרמה‬ ‫‪ S2‬תוך כ‪ 140-‬פמטושניות‪.‬‬ ‫‪26‬‬ ‫‪ .2‬תהליך העברת מטען פנים‪-‬מולקולרית )‪ (ICT‬נצפתה בקרוטנואידים רבים‪.‬‬ ‫תהליך זה חשוב עקב היותו שלב הכרחי בתגובות כימיות רבות‪ .‬לפי ‪M. R.‬‬ ‫‪ , Wasielewski‬קיים צימוד חזק בין הרמה ‪ S1‬ורמת ‪ ICT‬כך שלמומנט הדיפול של‬ ‫הממס השפעה על האופי של המשטח המעורר התחתון‪ :‬מומנט דיפול חזק של‬ ‫הממס יתעדף את מצב ה‪ ICT-‬כמינימום במשטח האלקטרוני המעורר ואילו‬ ‫‪38‬‬ ‫מומנט דיפול חלש יתעדף את ‪.S1‬‬ ‫סיכום המבוא‬ ‫ה‪ rPSB-‬הוא בסיס ‪ Schiff‬בעל שלד פחממני בעל מערכת ‪ π‬מצומדת המשמש‬ ‫ככרומופור בחלבונים הרטינאליים‪ ,‬ובפרט בחלבונים רטינאליים מיקרוביאליים‪ ,‬בהם‬ ‫מתמקדת עבודה זו‪ .‬כפי שהוסבר‪ ,‬הרטינל במצבו זה )שעבר פרוטונציה( מהווה‬ ‫מערכת מודל לחקר הדינמיקה במערכות של חלבונים רטינלים‪ .‬ספקטרום הבליעה‬ ‫של הכרומופור במצבו זה משתנה מ‪ 625-‬נ"מ בפאזה גזית‪ ,‬לאזור הנראה וה‪NUV-‬‬ ‫בהשפעת הממס )סביב כ‪ 450 -‬ננומטר(‪ .‬בהכנסת הכרומופור לחלבון‪ ,‬חלה הסחה‬ ‫נוספת‪ ,‬המכונה ה‪ ,Opsin Shift -‬לאזור מרכז הנראה )‪ 550-600‬ננומטר(‪ .‬בתוך החלבון‬ ‫ה‪ rPSB-‬מבצע איזומריזציה ‪ Trans-Cis‬סביב הפחמן ה‪ 13-‬במולקולה בלבד‪ ,‬כאשר‬ ‫בממס מתאפשרת איזומריזציה סביב הקשרים ‪ 11 ,13‬ו‪ .9-‬לחלבון השפעה גם על זמני‬ ‫החיים של צורוני המעבר והיעילות הקוונטית לאיזומריזציה‪ .‬מערכות ביולוגיות אלה‬ ‫נלמדו בשיטות ניסיוניות ותאורטיות‪ ,‬בעזרתן הצליחו לגלות את כל השלבים במעגל‬ ‫האור פרט לתהליך הראשוני‪ ,‬שלגבי אופיו אין תמימות דעים גם היום‪ .‬עיקר המחלוקת‬ ‫סביב מספר הרמות האופטיות הפעילות בתהליך הפוטואיזומריזציה של ה‪rPSB-‬‬ ‫והסיבה למולטיאקספוננציאליות בשלב הדעיכה של המצב המעורר‪.‬‬ ‫חקר הקרוטנואידים‪ ,‬בזמנו‪ ,‬נתקל בבעיות דומות‪ ,‬ושאלות רבות נענו כתוצאה‬ ‫משימוש בכלים של ספקטרוסקופיה אולטרה‪-‬מהירה בתחום הספקטראלי של ‪.NIR‬‬ ‫למרות החשיבות שנמצאה לחקר אלה ב ‪ ,NIR‬משפחת החלבונים הרטינאליים‬ ‫והכרומופור האופייני לא נחקרו בתחום ספקטראלי זה מעולם ‪ .‬בעבודה זו אציג תוצאות‬ ‫של מחקר על ה‪ ,rPSB-‬את הכלים האופטיים בהם השתמשתי ואת העקרונות מאחורי‬ ‫פעולתם של כלים אלה‪.‬‬ ‫‪27‬‬ ‫החלק נסיוני‪Experimental :‬‬ ‫שיטת ה‪Pump-Probe -‬‬ ‫‪) Pump-Probe‬תרשים של מערכת ‪ Pump-Probe‬באיור ‪ (2.2‬הינה שיטה ניסיונית‬ ‫למחקר‬ ‫ספקטרוסקופי במרחב הזמן של תופעות שזמן‬ ‫חייהן קצר יותר מזמנים שניתן למדוד ישירות‬ ‫בכלים אלקטרוניים‪ .‬העיקרון בשיטה הוא‬ ‫להגדיר את זמן ה‪-‬אפס ע"י עירור של דוגמה‬ ‫בעזרת פולס עוצמתי )ה‪ ,(Pump-‬ולמדוד את‬ ‫השינויים‬ ‫הספקטרליים‬ ‫הנוצרים‬ ‫כתוצאה‬ ‫מהתפתחות המערכת בזמן‪ .‬המדידה מתבצעת‬ ‫איור ‪ :2.1‬שליטה בזמני הגעה יחסיים של הפולסים‬ ‫מאפשרת לנו לדגום תהליך ברזולוציית זמן של‬ ‫הפולסים‪.‬‬ ‫ע"י פולס ה‪ ,Probe-‬שהוא פולס בעוצמה נמוכה ב‪ ( t−t 0 ) Delay-‬נשלט‪.‬‬ ‫ה‪ Delay-‬הוא גודל הנשלט ע”י טרנסלטור‪ ,‬והשליטה בו מאפשרת לנו לקבל את‬ ‫התמונה הספקטרלית של המערכת כפונקציה של הזמן )איור ‪ .(2.1‬ספקטרום המושג‬ ‫בצורה זו נקרא ספקטרום טרנזיאנטי )רגעי(‪ .‬יתרונה הגדול של שיטה זו הוא בכך‬ ‫שרזולוציית הזמן תלויה רק באורך הפולסים בזמן‪ ,‬ואינה תלויה ברזולוציית הזמן של‬ ‫של גלאי האור המשמשים למדידת הפולס הבודק‪ .‬משום כך‪ ,‬השיטה מאפשרת‬ ‫למדוד תהליכים שזמן חייהם נמדד בפמטושניות‪ ,‬לעומת רזולוציית זמן מקסימלית של‬ ‫ננושניות עבור מכשירי מדידה אלקטרוניים‪.‬‬ ‫התזמון היחסי של הפולסים נשלט ע"י שינוי הדרך האופטית שעובר אחד‬ ‫הפולסים‪.‬‬ ‫‪28‬‬ ‫אחרי שהבנו את הצורך ביצירת פולסים קצרים אפשר להתחיל לדון בדרך בה אנו‬ ‫איור ‪ :2.2‬סכמה של מערך ‪.Pump-Probe‬‬ ‫יוצרים פולסים אלה‪ ,‬החל ביצירת פולס אולטרא‪-‬מהיר‪ ,‬דרך הגברתו‪ ,‬שליטה בתדירות‬ ‫הגעת הפולסים‪ ,‬וכלה בדרכים להמרת אורך הגל של הפולס מאורך גל המוצא‬ ‫)‪ (Fundamental‬לאורך הגל המתאים ביותר לביצוע ניסוי ספציפי‪.‬‬ ‫מבנה מערכת הלייזר‬ ‫אוסצילטור‬ ‫יצירת הפולסים הקצרים במערכת שלנו מתבססת על שיטה הנקראת "‪Mode‬‬ ‫‪) " Locking‬נעילת אופני תנודה(‪ .‬השיטה מתבססת על הגברה סלקטיבית של אופני‬ ‫תנודה מתואמי פאזה להתאבכות בונה במהוד של הלייזר‪ .‬קיימות שתי טכניקות‬ ‫לנעילת אופני התנודה‪ :‬אקטיבית ופסיבית‪.‬‬ ‫• בשיטה האקטיבית מוסיפים מאפנן אקוסטו‪-‬אופטי או גביש אלקטרו‪-‬אופטי‬ ‫המצומדים למהוד הלייזר‪ ,‬וע"י שליטה אלקטרונית בגביש‪ ,‬ובכך‪ ,‬בתנאי המהוד‪,‬‬ ‫בוחרים אך ורק את האופנים בעלי התאבכות בונה ברגע יצירת תנאים המתאימים‬ ‫ללזירה‪.‬‬ ‫•‬ ‫בשיטה הפסיבית )‪KLM-Kerr Lens‬‬ ‫‪ (Mode locking‬אנו מנצלים תופעות‬ ‫אופטיות לא לינאריות של התווך‬ ‫הלוזר‪ ,‬בעבודה זו גביש ‪,Ti:Sapphire‬‬ ‫על מנת לקבל העדפה ללזירה‬ ‫איור ‪ :2.4‬עקב "עדשת קר" הנוצרת בתווך הלוזר מוקד‬ ‫פולסי השונה מהמוקד במצב של לזירה רציפה‪.‬‬ ‫פולסית על פני לזירה רציפה במהוד )איור ‪ .(2.3‬בשיטה זו אתעמק מעט‪ ,‬שכן‪,‬‬ ‫היא השיטה המיושמת במעבדתנו‪.‬‬ ‫‪29‬‬ ‫‪ Kerr Lensing‬הינו תהליך לא ליניארי מסדר שלישי )תלוי ב‪ χ3-‬ועל כך בהקדמה‬ ‫המתמטית בהמשך(‪ ,‬הגורם להגדלת אינדקס הרפרקציה בתווך הנקרא "‪Kerr‬‬ ‫‪ "Medium‬כתלות בעוצמה של השדה המושרה בחומר‪ .‬כיוון שבמצב פולסי השדה‬ ‫המושרה בתווך הלוזר חזק בכ‪ 9-‬סדרי גודל מהשדה המושרה בלזירה רציפה‪ ,‬אינדקס‬ ‫הרפרקציה של הגביש יהיה גדול משמעותית במצב הפולסי‪ .‬הפרופיל הגאוסי של‬ ‫הקרן גורם להתפלגות תלויית מיקום של מקדם השבירה בגביש‪ ,‬כך שבמרכז הגביש‬ ‫מקדם השבירה מקסימלי‪ .‬בצורה זו נוצרת מעין עדשה נוספת במהות שקיימת רק‬ ‫במצב פולסי‪.‬‬ ‫אופטימיזציה של המהוד על המצב הפולסי גורמת להגבר חזק יותר של הפולסים‬ ‫והעדפת מצב זה כמצב היציב במהוד‪ .‬התווך הלוזר הינו הגביש ‪ ,Ti:Sapphire‬שיוצר‬ ‫לזירה לפי מודל של ‪ 4‬רמות )רלקסציה טרמית בין הרמות ‪ 1-2‬ו ‪ .(3-4‬יתרונותיו‬ ‫הבולטים הם פס לזירה רחב‪ ,‬זמן חיים ארוך מספיק של הרמה הלוזרת‪ ,‬גם לצרכים‬ ‫של הגבר אופטי )מילישניות(‪ ,‬סף נזק גבוה ומוליכות חום מעולה‪.‬‬ ‫ספקטרום הבליעה של הגביש‬ ‫הינו רחב )איור ‪ (2.5‬באזור ה‪,500nm-‬‬ ‫מושלם‬ ‫לעירור‬ ‫‪Nd:YAG‬‬ ‫עם‬ ‫או‬ ‫‪ Nd:YLF‬מוכפל )~‪ .(530nm‬התוצאה‬ ‫היא פולס באורך גל של כ‪780nm-‬‬ ‫הניתן לכיווץ לכעשרות פמטושניות‪.‬‬ ‫תדירות‬ ‫ביציאה‬ ‫הפולסים‬ ‫איור ‪ :2.5‬מימין‪ :‬ספקטרום בליעה ופליטה של גביש‬ ‫ה‪ .Ti:Sapphire-‬משמאל‪ :‬רמות האנרגיה של הגביש‪.‬‬ ‫מהמהוד )מספר הפולסים ליח' זמן( תלויה באורך המהוד ועומדת על כ‪87MHz-‬‬ ‫במעבדה שלנו‪ .‬כיוון שזמני החיים של דגמים ביולוגיים )מיקרושניות ומילישניות( הם‬ ‫ארוכים‬ ‫יותר‬ ‫והאלקטרוניקה‬ ‫ממחזור‬ ‫שלנו‬ ‫מסוגלת‬ ‫המהוד‪,‬‬ ‫לעבוד‬ ‫בתדירויות נמוכות בהרבה )סד"ג של ‪kHz‬‬ ‫בודדים עבור ערוץ יחיד ומאות ‪ Hz‬עבור‬ ‫מדידה רב‪-‬ערוצית( מתעורר צורך להוריד‬ ‫איור ‪ :2.6‬תרשים של שיטת ה‪.CPA-‬‬ ‫‪30‬‬ ‫את תדירות הפולסים‪ .‬את הפעולה מבצעת מערכת שנקראת בורר פולסים )‪Pulse‬‬ ‫‪.(Selector‬‬ ‫בורר הפולסים מורכב ממערך אלקטרוני שמסנכרן בין התדירות הטבעית של‬ ‫האוסצילטור לבין התדירות הרצויה עבור ניסוי ספציפי ו‪) Pockel Cell-‬ר"ת ‪ .(PC‬ליבו‬ ‫של ה‪ PC-‬הוא גביש אלקטרואופטי – גביש איזוטרופי במישור המאונך לקרן‬ ‫שבהשפעה של שדה חיצוני הופך להיות ‪) Birefringent‬בעל אינדקס שבירה כפול(‬ ‫כתוצאה מעליית אינדקס השבירה בכיוון המקביל לשדה החשמלי‪ .‬תנאי מתמטי‬ ‫לגביש מסוג זה הוא חוסר סימטריה לאינוורסיה‪ .‬נרצה לגרום למערכת לסנן את כל‬ ‫הפולסים הלא רצויים‪ .‬לשם כך נוכל לכוונן את השדה החשמלי ) סד”ג השדות הוא ‪kV‬‬ ‫‪ (/mm‬כך שהגביש ישמש כלוחית גל אך ורק בזמן הגעת הפולס הנבחר וכן להציב ה‪-‬‬ ‫‪ PC‬בין שני מקטבים מאונכים‪ .‬כך ניתן להוריד את תדירות הפולסים לתדירות הרצויה‪.‬‬ ‫האנרגיה של כל פולס ביציאה מהאוסצילטור היא מסדר גודל של ‪ ,1nJ‬ואינה‬ ‫מספיקה לצרכי הניסויים במעבדה‪ .‬ע"מ להגביר את הפולס אנו משתמשים בשיטת‬ ‫ההגבר ‪) Chirped Pulse Amplification‬ר"ת ‪ ,CPA‬על תופעת ה‪ Chirp-‬יורחב בהמשך(‪.‬‬ ‫שיטה זו מאופיינת בהרחבת הפולס בזמן במכשיר אופטי הנקרא ‪ ,Stretcher‬הגברתו‬ ‫במגבר )‪ (Amplifier‬ולאחר מכן כיווץ הפולס ב‪ .Compressor-‬איור ‪ 2.6‬מציג תרשים‬ ‫סכמטי של שיטה זו‪.‬‬ ‫ה‪ Stretcher-‬מותח את הפולס בזמן ע"י שימוש בשריג דיפרקציה להפרדה‬ ‫ספקטראלית של הפולס ובמראות‪ ,‬ע"מ להקנות הפרש בדרכים האופטיות בין חלקו‬ ‫ה‪"-‬כחול" של הפולס לחלקו ה‪"-‬אדום"‪ .‬כתוצאה מהמעבר ב‪ Stretcher -‬הפולס מתארך‬ ‫לכ‪ 100-‬פיקושניות‪ .‬המגבר נבנה לפי מודל ‪ 9‬מעברים של קבוצת ‪ Backus etal‬בו גביש‬ ‫ה‪ Ti:Sapphire-‬נשאב ע"י לייזר פולסי ‪ Q-Switched Nd:YLF‬תעשייתי לשם הגברה‬ ‫אופטית‪ .‬הקומפרסור‪ ,‬בשונה מה‪ ,Stretcher-‬בנוי משני שריגים מקבילים זה לזה‪ ,‬אשר‬ ‫על המרחק ביניהם ניתן לשלוט ע"י טרנסלטור‪ .‬השריג הנוסף מאפשר שליטה רציפה‬ ‫על אורך הפולס וכיוון ה‪ .Chirp-‬בדרך זו אנו מקבלים פולסים במוצא מהקומפרסור‬ ‫בעוצמה של ‪0.5−1 mJ / pulse‬‬ ‫כ‪ 30-‬פמטו' ב‪ 780-‬נ"מ‪.‬‬ ‫עד עכשיו דיברנו על יצירת פולסי ה‪ .Fundamental -‬בהמשך בכוונתי להסביר‬ ‫בעזרת אילו מכשירים אופטיים ובהתבסס על איזה עקרונות פיזיקליים אנו יכולים‬ ‫לשלוט בספקטרום של הפולסים ולהתאים אותם לצרכים הניסיוניים שלנו‪.‬‬ ‫‪31‬‬ ‫המרת אור‬ ‫המרת אור‪ :‬כללי‬ ‫בחלק זה של העבודה נתעסק בשיטות להמרת אור ) ‪ ,(Light Conversion‬כלומר‬ ‫יצירת פולס בספקטרום הדרוש עבור הניסוי תוך שימוש בפולס המצוי‪ ,‬ה‪-‬‬ ‫‪ .Fundamental‬כאן אתייחס לשיטות בהן אנו משתמשים במעבדה באופן שוטף‪.‬‬ ‫‪ .1‬יצירת אור לבן ) ‪ – (White light Generation Supercontinuum‬אור עוצמתי‬ ‫הממוקד לתוך תווך דיאלקטרי יכול לעבור תהליך של ‪) SPM‬ר"ת ‪Self-Phase‬‬ ‫‪ ,(Modulation‬הגורם להרחבה ספקטרלית של הפולס היוצא מן התווך‪.‬‬ ‫‪ .2‬הכפלת תדר ) ‪ :(Second Harmonic Generation - SHG‬תהליך שבו שני פוטונים‬ ‫יוצרים פוטון יחיד בתדר כפול‪ .‬בעבודה זו השתמשתי בגביש מכפיל מסוג ) ‪BBO‬‬ ‫‪ (Type I‬ע”מ לייצר פולס ב‪ 390-‬נ"מ )על תהליך ההכפלה בפרט ו‪Three Wave -‬‬ ‫‪ Mixing‬בכלל יפורט בהמשך(‪.‬‬ ‫‪ .3‬מכשיר מסחרי להמרת אורך גל של פולסים‪ ,‬ה‪) TOPAS-‬ר"ת ‪Traveling-wave :‬‬ ‫‪.(OPA of Superfluoresence‬‬ ‫‪ ) NIR NOPA .4‬ר”ת ‪ .( Near Infra-Red Noncolinear OPA‬בפרק זה אנתח את‬ ‫עקרונות הפעולה של מכשירי ‪) OPA‬ר"ת ‪ (Operative Parametric Amplifier‬בכלל‬ ‫ועל המכשירים בהם השתמשתי בפרט‪ .‬כחלק מההרחבה אסביר גם על‬ ‫הכפלת תדר ויצירת אור לבן ‪.Supercontinuum‬‬ ‫אינטראקציה של אור וחומר בתהליכים לא ליניאריים‪:‬‬ ‫נגדיר כי כיוון התקדמות הגל תהיה בציר ‪ ,z‬ומשוואת הגלים תראה כך‪:‬‬ ‫‪̂y‬‬ ‫) ‪z−ω t‬‬ ‫‪y‬‬ ‫‪x̂ +E y ×e i (k‬‬ ‫) ‪z −ω t‬‬ ‫‪x‬‬ ‫‪E (x , y , z)=E x ×e i(k‬‬ ‫⃗ ‪ ,‬כאשר‬ ‫‪ k j‬הוא מספר הגל בקיטוב ‪.j‬‬ ‫בפרק זה אדון באינטראקציה של אור עם חומר לא איזוטרופי‪ ,‬ולכן יש להתייחס‬ ‫לקיטוב האור ולאופי הטנזורי של הסוספטביליות ברוב הפיתוחים המתמטיים אך‬ ‫תחילה נדבר על תכונות של פולס קצר )מסדר גודל של מחזורים בודדים(‪.‬‬ ‫‪32‬‬ ‫‪1‬‬ ‫לפי עיקרון אי‪-‬הודאות של הייזנברג‪ ,‬צריך להתקיים‪:‬‬ ‫‪2‬‬ ‫≥‪ , Δ t×Δ ν‬כאשר ‪∆t‬‬ ‫מסמן את רוחב הפולס בזמן ו‪ ∆ν -‬את רוחב הפולס בתדר )שניהם עבור השדה‪ ,‬לא‬ ‫העוצמה(‪ .‬משמע‪ ,‬התנאי לקבלת פולס קצר בזמן הינו רוחב ספקטראלי של הפולס‪.‬‬ ‫לדוגמה‪ ,‬אם ניקח פולס עם התפלגות ספקטראלית גאוסית )‪ (FWHM‬בין ‪ 500‬ל‪600-‬‬ ‫ננומטר ‪ (σfreq=1420cm-1) ,‬הפולס הקצר ביותר שנוכל לקבל יהיה כ‪ 7-‬פמטו' ‪FWHM‬‬ ‫)שהן ‪ .(σtime≈2fs‬גבול זה נקרא “‪ ,”Transform Limit‬והוא מהווה חסם עליון לרזולוציית‬ ‫הזמן של המערכת‪ .‬במצב זה‪ ,‬בהזנחת הקיטוב בנקודה ‪ z0‬משואת הגלים תכלול גם‬ ‫את איבר המעטפת הגאוסית ותראה כך‪:‬‬ ‫) ‪) i (k z−ω t‬‬ ‫‪e‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪Chirp‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪ . E (t)=E 0 e− t /(2 σ‬עבור התפלגות‬ ‫ספקטראלית ריאלית )בדרך כלל לא גאוסית( ה‪ Transform Limit -‬מחושב ע"י התמרת‬ ‫פורייה של השדה ממרחב התדר למרחב הזמן‪ .‬אם אורך הפולס בזמן ארוך מה‪-‬‬ ‫‪ , Transform Limit‬אזי לא כל הצבעים של הפולס בעלי פאזה זהה‪ .‬בפרט‪ ,‬אם שינוי‬ ‫הפאזה מונוטוני עם התדר נהוג לכנות תופעה זו כ‪.Chirp-‬‬ ‫בסעיף הקודם לצורך ההמחשה הוזנחה הדיספרסיה‪ .‬ללא ההזנחה‪ ,‬ובהינתן‬ ‫העובדה שמדובר בספקטרום בעל רוחב סופי‪ ,‬התדירות ומספר הגל תלויים לפי‬ ‫המשואה‬ ‫‪ . k = c ω‬כשיש דיספרסיה‪ ,‬התדר הרגעי שנמדד בנקודה ‪ z‬אינו קבוע‬ ‫) ‪n (λ‬‬ ‫זהותית‪ ,‬ולכן אם נפרוש את מספר הגל לטור טיילור לפי הזמן נקבל‪:‬‬ ‫‪∂k ∂ω‬‬ ‫‪1 ∂ 2 k ∂ 2 ω 2 1 ∂3 k ∂ω3 3‬‬ ‫‪k‬‬ ‫‪=k‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪t‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪t +‬‬ ‫)∗ (‪t ...‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪ .‬בצורה זו כל איבר בטור מייצג‬ ‫‪∂ω ∂t‬‬ ‫‪2 ∂ω 2 ∂t 2‬‬ ‫‪6 ∂ω3 ∂ t 3‬‬ ‫תכונה של הפולס‪ .‬הא יבר הראשון מייצג את אורך הגל הנושא המרכזי; האיבר השני‬ ‫מייצג את רוחב המעטפת; האיבר השלישי מייצג את קצב שינוי הפאזה הליניארי‬ ‫ברוחב של הגל הנישא‪ ,‬ובספרות מכונה ‪) GVD‬ר"ת ‪ (Group Velocity Dispersion‬ומייצג‬ ‫את ההתרחבות של הפולס בזמן‪ .‬בספרות נהוג לסמנו‬ ‫‪1‬‬ ‫‪ . β2= GVD‬סדרים גבוהים‬ ‫‪2‬‬ ‫יותר )‪ (TOD, FOD‬מייצגים שינויים לא ליניאריים בפאזה של הפולס‪ ,‬הגורמים להרחבת‬ ‫הפולס בזמן גם כן‪ .‬בספרות נוהגים לסמנם‬ ‫‪k‬‬ ‫‪. βk = 1 ∂ k2‬‬ ‫‪k ! ∂ω‬‬ ‫ה‪ Chirp-‬הינו סיגנל בו התדר משתנה כפונקציה של הזמן‪ .‬אם התדר עולה תוך‬ ‫כדי הסיגנל‪ ,‬ה‪ Chirp-‬מוגדר כחיובי‪ ,‬ואם התדר יורד ה‪ Chirp-‬יוגדר כשלילי‪ .‬המשואה‬ ‫‪33‬‬ ‫של פולס כזה תיראה כך‪:‬‬ ‫‪3‬‬ ‫)‪(β3 )t −....‬‬ ‫)‪(2‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪(β 2)t − f‬‬ ‫)‪(1‬‬ ‫‪z−ω0 t− f‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪i (k‬‬ ‫‪ , E (t)=E 0 e‬כאשר הפונקציות‬ ‫במעריך באות מהמשואה המסומנת ב‪ .(*)-‬את גודל ה‪ Chirp-‬ניתן לחשב מהדיספרסיה‬ ‫) ) ‪ ( n (λ‬של החומר בו עובר הפולס‪ .‬אדגים עבור ה‪ ,GVD-‬אך בדרך דומה )אך‬ ‫ארוכה יותר( ניתן לקבל ביטוי מתמטי לכל סדר‪ .‬הביטוי למהירות החבורה הוא‪:‬‬ ‫‪∂ω‬‬ ‫‪∂k‬‬ ‫= ‪ v g‬הסדר הבא הוא ה‪: GVD-‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪d k ω d‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪= ×‬‬ ‫‪≡GVD‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪dω‬‬ ‫‪v‬‬ ‫‪dω‬‬ ‫‪g ω ‬‬ ‫בספרות נהוג‬ ‫‪1‬‬ ‫לסמנו ב‪.  2 = GVD :β-‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪dv g dλ dv g‬‬ ‫‪λ2 dv g‬‬ ‫× =‬ ‫‪=−‬‬ ‫×‬ ‫)✡(‬ ‫‪dω dω dλ‬‬ ‫‪2πc dλ‬‬ ‫]‬ ‫‪λ0‬‬ ‫[‬ ‫‪2‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪n( λ)− λ× dn‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪dk‬‬ ‫‪λ‬‬ ‫‪dk‬‬ ‫‪λ‬‬ ‫‪d‬‬ ‫‪2πcn‬‬ ‫‪dλ‬‬ ‫כעת נגזור את התוצאה‬ ‫‪= =−‬‬ ‫‪× =−‬‬ ‫( ×‬ ‫=)‬ ‫‪v g dω‬‬ ‫‪2πc dλ‬‬ ‫‪2πc dλ cλ‬‬ ‫‪c‬‬ ‫למהירות החבורה לפי ‪ λ‬ונציב במשואה את המשואה המסומנת ב‪ (✡) -‬ונקבל תוצאה‬ ‫אנליטית ל‪:GVD-‬‬ ‫]‬ ‫‪λ0‬‬ ‫[‬ ‫‪dv‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪1 d 1‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪λ3‬‬ ‫‪d2n‬‬ ‫= ‪=− 2 × g‬‬ ‫×‬ ‫× =‪. β= ×GVD‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪2 dω v g‬‬ ‫‪2 v g dω‬‬ ‫‪4πc 2 dλ 2‬‬ ‫‪ ‬‬ ‫בנוסף לדיספרסיה הנגרמת כתוצאה ממעבר בתווך ליניארי קיימת דיספרסיה‬ ‫הנגרמת מתהליכים לא ליניאריים בתווך הדיאלקטרי‪ .‬תהליכים אלה תלויים בעוצמה‬ ‫של השדה המושרה ובתכונות הלא ליניאריות של התווך )ועל כך מיד(‪ .‬תהליך ה‪SPM-‬‬ ‫הוא אחד מתהליכים אלה ועליו יורחב בהמשך‪.‬‬ ‫המקדם הדיאלקטרי של חומר הינו טנזור המודד את היכולת של חומר ליצור‬ ‫דיפולים חשמליים כתגובה לשדה חשמלי חיצוני )בכיוון המנטרל את השדה(‪ .‬המקדם‬ ‫הדיאלקטרי נתון בדרך כלל באופן יחסי לזה של הריק ‪ ,‬כמקדם דיאלקטרי יחסי‬ ‫כלומר מוגדר על ידי היחס‬ ‫‪̂ε‬‬ ‫‪ε0‬‬ ‫=‪ε̂r‬‬ ‫‪ ,‬כאשר‬ ‫‪F‬‬ ‫‪m‬‬ ‫‪, εr‬‬ ‫‪−12‬‬ ‫‪ , ε0 =8.854×10‬ו‪ ε̂ -‬הוא המקדם‬ ‫הדיאלקטרי של החומר ולכן ‪ ε̂r‬הינו גודל חסר יחידות ‪ .‬בריק‪ ,‬על פי הגדרה‪ ,‬מתקיים‬ ‫‪. ε̂r=1‬‬ ‫כיוון ש‪)  1 -‬בכל איברי הטנזור( נהוג לבטא אותו כך‪ , ε̂ =ε̂r ε0=(1+ χ̂e )×ε0 :‬כאשר‬ ‫‪ χe‬מוגדר להיות הסוספטיביליות החשמלית של החומר‪ .‬הפולריזציה של התווך בשדה‬ ‫‪34‬‬ ‫ניתנת ע"י המכפלה‬ ‫⃗‬ ‫⃗‬ ‫‪P =ε 0 χ̂e × E‬‬ ‫‪ .‬ניתן לתאר את התלות בטור טיילור כך‪:‬‬ ‫‪ . χ̂e = χ̂1+ χ̂2+ χ̂3+...‬אם נטפל בשדה המושרה בצורה זו הפולריזציה תיראה כך‪:‬‬ ‫⃗‬ ‫‪⃗ ( x , t )+ χ̂2 × E⃗2 ( x , t )+ χ̂3× E⃗3 ( x , t )+...≡ P⃗(1)+ P⃗(2)+ P⃗(3 )+...‬‬ ‫‪P ( x ,t )=χ̂1× E‬‬ ‫כאשר האיבר הראשון לינארי עם הפולריזציה המושרית ולכן נהוג לקרוא לו‬ ‫הסוספטביליות הליניארית‪ .‬האיברים השני והשלישי הם האיברים הלא‪-‬ליניאריים‬ ‫מסדר שני ושלישי ולכן הם נקראים הסוספטביליות הלא ליניארית מסדר שני ושלישי‬ ‫)קיימים סדרים גבוהים יותר שגם להם חשיבות במקרי קיצון(‪ .‬בחומר צנטרוסימטרי‬ ‫)בפרט איזוטרופי(‪ χ̂e ,‬היא פונקציה סימטרית‪ ,‬ולכן כל איברי הטור סימטריים גם הם‪.‬‬ ‫השדה החשמלי ) ‪E  r ‬‬ ‫‪ ( ‬הינו פונקציה אנטיסימטרית‪ .‬בהיפוך של השדה‬ ‫) ) ‪ ( E →(−E‬גודל הדיפול חייב להישמר‪:‬‬ ‫⃗ ≡])‪⃗ ( x , t‬‬ ‫⃗‪−‬‬ ‫‪P [E‬‬ ‫⃗ ‪P [−‬‬ ‫⃗ ‪E ( x ,t )]= χ̂1‬‬ ‫‪E ( x , t)+χ̂2 E⃗ 2( x , t)+χ̂3 E⃗3 ( x , t )+... → χ 2k E⃗2k ( x ,t)=0‬‬ ‫תנאי זה דורש התאפסות של כל האיברים הזוגיים במשואה‪ .‬גבישים בהם אין‬ ‫התאפסות של האיברים הזוגיים נקראים לא‪-‬ליניאריים‪ ,‬הם אינם צנטרוסימטריים ולכן‬ ‫‪  e‬בגבישים מסוג זה אינה פונקציה סימטרית‪ .‬לדוגמה‪ ,‬גביש ה‪ BBO-‬עליו ארחיב‬ ‫הרבה בהמשך הוא גביש מסוג זה‪ .‬עבור שדות קוונטיים המשוואה מקבלת משמעות‬ ‫מעשית המתארת אינטראקציה של פוטונים בודדים‪ :‬המספר ‪ n‬ב‪χ̂n -‬‬ ‫מתאר‬ ‫אינטראקציה של ‪ n+1‬פוטונים‪ .‬האינטראקציה של כל איבר פרופורציונית למכפלת‬ ‫הדיפול המושרה בשדה החיצוני )שהוא בעצם השדה שמשרה את הדיפול(‪:‬‬ ‫‪. P⃗(n )× E⃗ext = χ̂n E n +1‬‬ ‫‪35‬‬ ‫תהליך ה‪ SPM-‬ויצירת אור לבן ‪Supercontinuum‬‬ ‫‪39‬אפנון עצמי של הפאזות בתווך דיאלקטרי ) ‪ (SPM, Self Phase Modulation‬בו‬ ‫מתקיים אפקט קר )‪ (Kerr Effect‬הוא השיטה הנפוצה ביותר להרחבה ספקטראלית של‬ ‫פולסים מהירים‪ .‬בד"כ משתמשים בסיבים אופטיים המכילים חומר דיאלקטרי או גז‬ ‫בתור ‪ ,Kerr Media‬על מנת להוליך את הפולס לאורכו ולקבל הרחבה מקסימלית‪.‬‬ ‫שיטה נוספת ונפוצה הרבה פחות היא הולכת הפולס כפילמנט )על כך בהמשך(‪.‬‬ ‫פולס בעל עוצמה גבוהה )בספיר כ‪-‬‬ ‫‪ ( 20 MW‬העובר בתוך תווך דיאלקטרי‬ ‫‪cm‬‬ ‫‪2‬‬ ‫איזוטרופי )ולכן צנטרוסימטרי( שקוף‪,‬‬ ‫משנה את מקדם השבירה של החומר‬ ‫כתלות בעוצמה הרגעית לפי המשואה‬ ‫‪ , n ( I )=n0+n2× I‬כאשר אנו מניחים‬ ‫‪2‬‬ ‫פולס גאוסי‬ ‫תהליך‬ ‫‪t‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪τ‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪ . I ( t )=E ( t ) =I 0×e‬זהו‬ ‫מסדר‬ ‫שלישי‬ ‫ב‪χ-‬‬ ‫כיוון‬ ‫איור ‪ :2.7‬התרחבות הפולס בתווך ‪ .Kerr‬כחול‪ :‬עוצמת הפולס‬ ‫כתלות בזמן‪ .‬אדום‪ :‬שינוי בתדר הפולס כתלות בזמן‬ ‫)בנקודה ‪.(z0‬‬ ‫שמשוואת‬ ‫הדיפול‬ ‫המושרה‬ ‫נראית‬ ‫כך‪:‬‬ ‫⃗ )‪P=ε 0 χ E=ε 0×(n0 +n 2 E⃗2 −1‬‬ ‫‪E‬‬ ‫עקב הפרופיל הגאוסי של הקרן בזמן נראה עליה ולאחריה ירידה של מקדם‬ ‫השבירה‪ ,‬מה שיגרום למודולציה של מקדם השבירה‪:‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪−t‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪τ‬‬ ‫יגרום‬ ‫) ‪dn( I‬‬ ‫) ‪dI (t‬‬ ‫‪−2t‬‬ ‫‪ .‬התלות של וקטור הגל במקדם השבירה‬ ‫‪=n2‬‬ ‫‪=n2 I 0× 2 ×e‬‬ ‫‪dt‬‬ ‫‪dt‬‬ ‫‪τ‬‬ ‫להופעה‬ ‫מיידית‬ ‫של‬ ‫הפרש‬ ‫פאזות‬ ‫לפי‬ ‫המשואה‬ ‫הבאה‪:‬‬ ‫‪2π‬‬ ‫‪ ϕ =ω t−k x=ωt − λ n( I ) x‬נגזור את הפאזה בזמן ע"מ לקבל את השינוי בתדירות‪:‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪−t‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪4  x n2 I 0‬‬ ‫‪d‬‬ ‫‪2  x dn  I ‬‬ ‫‪=t= t−k x= 0−‬‬ ‫‪=0 ‬‬ ‫‪t×e ‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪dt‬‬ ‫‪dt‬‬ ‫‪0 2‬‬ ‫הפתרון הרגעי של המשואות נותן שינוי ספקטראלי בפולס‪ ,‬הנראה כנגזרתו )איור‬ ‫‪ .(2.7‬ניתן לראות כי הפולס מתרחב לתדרים אדומים בחזיתו ולתדרים כחולים בזנבו‪.‬‬ ‫התקדמות ארוכה מספיק בתווך הדיאלקטרי תרחיב את הפולס כל עוד העוצמה בשיא‬ ‫‪36‬‬ ‫שלו תהיה גדולה מספיק‪ ,‬ועם ההתקדמות בתווך‪ ,‬הפולס מגיע לרוויית הרחבה )איור‬ ‫‪.(2.8‬‬ ‫על‬ ‫מנת‬ ‫לקבל‬ ‫הרחבה‬ ‫ספקטראלית יעילה קיים צורך להוביל‬ ‫הפולס‬ ‫את‬ ‫בתווך‬ ‫כך‬ ‫שיתרחב‬ ‫ספקטראלית אך ישמור על תכונותיו‬ ‫המרחביות‪ .‬קיימות לכך שתי שיטות ‪:‬‬ ‫‪ .i‬הולכת‬ ‫הקרן‬ ‫בסיב‬ ‫אופטי‬ ‫)‪.(Waveguide‬‬ ‫איור ‪ :2.8‬התרחבות ספקטראלית תוך כדי התקדמות ב‪Kerr-‬‬ ‫‪.Media‬‬ ‫‪ .ii‬יצירת פילמנט בתווך הדיאלקטרי‪.‬‬ ‫במעבדתנו אנו מייצרים פילמנט בספיר‪ ,‬ולכן ארחיב מעט בנוגע לתהליך זה‪.‬‬ ‫הפילמנט‬ ‫‪40‬פילמנט )‪ (Filament‬הינו פולס אור השומר על תכונותיו המרחביות לאורך מרחק‬ ‫סופי‪ ,‬ע"י ניצול של תכונות אופטיות ליניאריות ולא ליניאריות של התווך בו הוא‬ ‫מתקדם‪ .‬הפילמנטציה מתאפשרת כתוצאה מהיכולת להביא את המערכת לשיווי‬ ‫משקל עבור ‪ 3‬תהליכים מתחרים‪:‬‬ ‫‪ .i‬התבדרות טבעית של קרן גאוסית‪,‬‬ ‫זניחה‪.‬‬ ‫‪‬‬ ‫‪ . = ×‬בד"כ השפעת תהליך זה‬ ‫‪0‬‬ ‫‪37‬‬ ‫‪ .ii‬התבדרות הקרן כתוצאה מהפלאסמה )איור ‪ 2.9‬מימין( שנוצרת באיזור השיא‬ ‫של הפולס והיווצרות של מעין עדשה מבדרת )‪ (f<0‬לפי המשואות הבאות‪ :‬אינדקס‬ ‫הרפרקציה של הפלאסמה נתון ע"י המשואה הבאה‪:‬‬ ‫תדירות הפלאסמה‪:‬‬ ‫‪4 π N 0 e2‬‬ ‫‪μ‬‬ ‫√‬ ‫=‪ω p‬‬ ‫אזי בקירוב‬ ‫‪1‬‬ ‫‪ n =(n −ω2 /ω2) 2‬נציב את‬ ‫‪p‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪p‬‬ ‫נכניס למשואה את התלות‬ ‫בעוצמת השדה והעובדה שהיינון מתרחש כתוצאה מבליעה רב‪-‬פוטונית‪ ,‬ומכאן‬ ‫שההסתברות ליינון עולה עם עוצמת ההקרנה‪:‬‬ ‫‪1 αI‬‬ ‫‪ . N 0= 2 n ħ ω‬כאשר ‪ n0‬הוא מספר‬ ‫‪0‬‬ ‫הפוטונים הדרושים ליינון התווך‪ τR ,‬הנו מקדם רקומבינציה אלקטרון‪-‬קטיון ו‪ α-‬הוא‬ ‫פרמטר להסתברות של בליעה ‪-n0‬פוטונית‪ .‬קיבלנו את המשואה של ‪ Δn‬כתלות‬ ‫בעוצמה‪:‬‬ ‫‪π e 2 α I τR‬‬ ‫‪n0 m ħ ω 3‬‬ ‫‪ . n 2=−‬מכאן נובע כי‬ ‫‪4‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪π e 2 α τR‬‬ ‫‪×I ∝E‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪n0 m ħ ω‬‬ ‫‪, Δ n plasma=n−n2 I =n−‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪2‬‬ ‫כלומר התהליך מקטין את מקדם השבירה כתלות‬ ‫‪ωp‬‬ ‫‪1 4 πN0e‬‬ ‫× ‪n p≈n−‬‬ ‫←‬ ‫‪≪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪2‬‬ ‫בריבוע העוצמה‪ .‬עקב הפרופיל הגאוסי של הקרן‬ ‫‪mω‬‬ ‫‪ω‬‬ ‫התופעה יוצרת עדשה "עם מוקד שלילי"‪.‬‬ ‫איור ‪ :2.9‬המחשה עבור התקדמות של פילמנט‪ .‬משמאל‪ :‬בהשפעת ‪ Kerr Effect‬מימין‪ :‬בהשפעת‬ ‫הפלאסמה‪.‬‬ ‫חשוב לציין כי התאפסות האיברים הזוגיים כאן יכולה להישבר עקב שבירת‬ ‫הסימטריה הנובעת מהשדה החזק‪.‬‬ ‫כמו כן‪ ,‬במוצקים קיים מצב הנקרא ‪ Pre-Plasma‬שיכול להיגרם מבליעה רב‬ ‫פוטונית‪ ,‬והוא מקטין את מקדם השבירה עקב צפיפות גבוהה של אלקטרונים באנרגיה‬ ‫‪38‬‬ ‫גבוהה‪ .‬סדר התהליך הוא כמספר האלקטרונים הנבלעים וההתנהגות דומה‬ ‫להתנהגות בגז‪.‬‬ ‫‪ .iii‬מיקוד‬ ‫‪ .iv‬עצמי של הקרן הגאוסית )‪ (self focusing‬כתוצאה מ‪ ,Kerr Effect-‬תהליך בו‬ ‫התחלנו לדון בסעיף קודם‪ .‬מקדם‬ ‫השבירה גדל כתלות בעוצמה לפי‬ ‫הבאה‪. n ( I )=n0+n2× I :‬‬ ‫המשואה‬ ‫עקב‬ ‫הפרופיל‬ ‫הגאוסי‬ ‫של‬ ‫הקרן‬ ‫במרחב‪ ,‬במקרה זה נוצרת מעין עדשה‬ ‫בעלת מוקד חיובי )ממקדת(‪41) ,‬איור‬ ‫‪ 2.9‬משמאל(‪.‬‬ ‫איזון של תהליכים אלה נותן את‬ ‫האפשרות לקרן להתקדם מרחקים‬ ‫גדולים‬ ‫תוך‬ ‫שמירה‬ ‫על‬ ‫התכונות‬ ‫המרחביות שלה‪.‬‬ ‫יש המתייחסים להתקדמות של‬ ‫פילמנט בתווך דיאלקטרי כיצירה של‬ ‫מעין "סיב אופטי" בתווך שבא לידי‬ ‫ביטוי‬ ‫כקפיצה‬ ‫במקדם‬ ‫השבירה‬ ‫כתוצאה מאותו ‪ .Kerr Effect‬לעניות‬ ‫איור ‪ :2.10‬תוצאות של סימולציה עבור התקדמות פילמנט‬ ‫במרחב‪ .‬בתמונה למעלה‪ :‬פילמנט עמיד‪ .‬למטה‪ :‬פילמנט‬ ‫אוסצילטורי‪.‬‬ ‫דעתי‪ ,‬ההסבר הנ"ל לא שלם‪ ,‬שכן‬ ‫קפיצה במקדם השבירה לא קיימת ולכן לא תיתכן החזרה מלאה‪.‬‬ ‫במאמרם של ‪J. Schwarz etal‬‬ ‫‪42‬נעשה פיתוח של משוואות דיפרנציאליות‬ ‫המתארות את התקדמות הפילמנט באוויר‪ ,‬כתוצאה מיצירת פולסים גאוסיים בזמן‬ ‫ובמרחב באורך מאות פיקושניות )ע"מ להניח מצב עמיד באוויר(‪ ,‬באורך גל של‬ ‫‪ ,248nm‬בעוצמה המשתנה בין ‪ 50MW-400MW‬בשיא‪ .‬התוצאות מראות שני פתרונות‪:‬‬ ‫עמיד ואוסצילטורי‪ .‬בשני המקרים‬ ‫בסופו של דבר מתרחשת התבדרות של הקרן‪,‬‬ ‫כאשר המצב האוסצילטורי )איור ‪ (2.10‬מאבד את תכונותיו המרחביות מהר יותר‬ ‫מהפילמנט העמיד‪ .‬הסיבות העיקריות לאיבוד האנרגיה שלבסוף גורם לדעיכת‬ ‫‪39‬‬ ‫הפילמנט הן קרינת הפלסמה‪ ,‬בליעה רב‪-‬פוטונית בה נבלעים יותר מ‪ n-‬פוטונים‪,‬‬ ‫פיזורים שונים )בעיקר פיזור ריילי ופיזור ראמאן( ומריחת הפולס בזמן‪ ,‬שפוגעת‬ ‫בעוצמת השיא של הפולס וכתוצאה מכך מקטינה את האפקטים הלא ליניאריים‪.‬‬ ‫לאור לבן המיוצר בשיטה של ‪ SPM‬בפילמנט שני שימושים אצלנו במעבדה‪:‬‬ ‫‪ .i‬שימוש בפולס ישירות כ‪.Probe-‬‬ ‫‪ .ii‬שימוש בפולס לצורך הגברתו בשיטת ההגברה הפרמטרית‪.‬‬ ‫במאמר מוסגר‪ ,‬אציין כי הפולס מקבל ‪ Chirp‬חיובי ליניארי כתוצאה מ‪ SPM-‬ו‪Chirp-‬‬ ‫שלילי עקב המעבר בפלאסמה תוך כדי התקדמותו בתווך )בצורת פילמנט(‪ .‬ישנם‬ ‫מחקרים על ‪ 43‬וריאציות בתכונות התווך לצורך יצירת איזון בין ה‪ Chirp-‬השלילי לחיובי‬ ‫לאורך התקדמות הפולס‪ ,‬כך שהפולס יתרחב ספקטראלית וישמור על כיווץ מקסימלי‪.‬‬ ‫תהליך הסופרפלואורוסנציה‪.‬‬ ‫סופרפלואורוסנציה היא תופעה רב גופית )‪ (Many-Body Effect‬המאופיינת בפליטה‬ ‫משותפת ומתואמת פאזה של צבר אטומים מעוררים‪ .‬ע"מ לפלוט בצורה זו יש צורך‬ ‫בעירור ע"י מקור אור חיצוני )לא בהכרח קוהרנטי( של צבר מאקרוסקופי לאותה רמה‬ ‫וירטואלית )ריקון מוחלט של רמת הייסוד(‪ .‬אם המקור השואב חזק מספיק ע"מ לעורר‬ ‫את כל האוכלוסיה של הצבר המאקרוסקופי‪ ,‬כל הצבר המעורר יתחיל להתנודד‬ ‫בתדר העירור‪ ,‬ויקרוס ספונטנית לפאזה אחידה לכל הצבר תוך זמן קצר‪ .‬ברגע שכל‬ ‫הצבר מתנודד באותה פאזה מתרחשת פליטה אימפולסיבית וקוהרנטית הגורמת‬ ‫לשיכוך )‪ (Damping‬של הצבר‪ ,‬כך שעוצמת הפליטה פרופורציונית לריבוע מספר‬ ‫האטומים בצבר )אופייני ללזירה(‪.44‬‬ ‫במצב אידאלי היינו מקבלים פולס קוהרנטי‪ ,‬צר בתדר וצר בגבול האפשרי‬ ‫)‪ (Transform Limit‬בזמן‪ .‬אך זהו אינו המצב עקב תופעת ‪ Dephasing‬הנובעת‬ ‫מאינטראקציה טרמית בתוך התווך המעורר וגורמת להרחבת הפולס הן בזמן והן‬ ‫בתדר כלומר ה‪ Dephasing-‬אחראי להופעת פוטונים באורכי גל השונים מאורך גל‬ ‫העירור‪.‬‬ ‫עיקרון זה של התנודה הקוהרנטית המשותפת לצבר אטומים כתוצאה מריקון‬ ‫מוחלט של רמת היסוד‪ ,‬הינו תנאי דומה אך חזק יותר מתנאי היפוך האוכלוסין עבור‬ ‫‪40‬‬ ‫לזירה‪ .‬לכן תופעה זו מנוצלת לבניית מהודי לייזר עם אפשרות לשליטה באורך הגל‬ ‫במוצא ומגברים פרמטריים עליהם נדבר מיד‪.‬‬ ‫התאמת פאזות‬ ‫התאמת פאזות )‪ (Phase Matching‬הינה טכניקה להשגת אינטראקציות אופטיות לא‬ ‫ליניאריות ביעילות גבוהה‪ .‬תהליכים פרמטריים רגישי‪-‬פאזה רבים‪ ,‬כגון תהליכי ‪Three‬‬ ‫‪ Wave Mixing‬הכוללים הכפלת התדר‪ ,‬יצירת תדרי הפרש וסכום‪ ,‬הגבר פרמטרי‬ ‫ותהליכים כגון ‪ ,Four Wave Mixing‬מתרחשים ביעילות גבוהה ביותר בתנאים )ראה‬ ‫איור ‪ (2.11‬של התאמת פאזות )‪ .4445(PM‬הכוונה היא ליחס פאזות אופטימלי בין הגלים‬ ‫המגיבים לגלים הנוצרים‪ .‬ניתן לתאר זאת בצורה פשוטה כך‪ :‬נסתכל על משוואת‬ ‫) ‪i (k x−ωt‬‬ ‫‪. E (x , t)=E 0×e‬‬ ‫הגלים‪,‬‬ ‫‪2 2   i ni  n i× i‬‬ ‫=‬ ‫=‬ ‫‪‬‬ ‫‪C‬‬ ‫‪c‬‬ ‫כאשר‬ ‫כעת‬ ‫=‪. k i‬‬ ‫הינו‬ ‫‪ki‬‬ ‫נסתכל‬ ‫‪. P ( x ,t )=χ (1) ×E ( x ,t )+χ (2 )×E 2 ( x , t)+χ (3 )×E 3 ( x ,t )+...‬‬ ‫לא‬ ‫קבוע‬ ‫הגל‬ ‫על‬ ‫הפולריזציה‪:‬‬ ‫ננתח‬ ‫את‬ ‫ה‪,i-‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪‬‬ ‫ומעלה‪ ,‬אלא נסתכל רק על הסדר השני‪.‬‬ ‫‪Δk‬‬ ‫) ‪k 1 ( λ1‬‬ ‫)‪k 2 ( λ 2‬‬ ‫) ‪k 3 ( λ3‬‬ ‫תרשים ‪ :2.11‬תרשים של וקטורי הגל עבור מצב של ‪ .Three Wave Mixing‬רק כאשר ‪ Δk=0‬נקבל ‪.PM‬‬ ‫‪i  m1 k 1m2 k 2 x− m1 1m2  2 t ‬‬ ‫‪C.C.‬‬ ‫‪n2‬‬ ‫‪n1‬‬ ‫‪ 2‬‬ ‫‪2 ‬‬ ‫‪P  x , t  ∝   n0 E1 E2 e‬‬ ‫מדובר על סכימה של כל‬ ‫הפעולות המתמטיות האפשריות במערכת‪ :‬הכפלת תדר עבור ‪ E1‬או ‪ ,E2‬סכימה והפרש‬ ‫של התדירויות‪ .‬תהליך הכפלת תדר הוא מקרה פרטי של סכימה‪ ,‬כאשר שתי הקרניים‬ ‫באותו אורך גל‪ .‬שאר איברי הטנזור )‪ P(2‬מתאפסים כתוצאה מהסכימה עם האיבר‬ ‫הצמוד‪ .‬לכן ניתן לומר‪ ,‬כי אם ‪  3=m1  1m2  2‬אז ע"מ לקבל ‪ PM‬יעיל‪ ,‬חייב‬ ‫להתקיים גם התנאי הבא‪) k 3=m1 k 1m2 k 2 :‬איור ‪ ,(2.11‬כאשר ‪ mi‬מספר שלם‬ ‫המתאר את מספר הפוטונים בתדר ‪ ωi‬שיבלעו ע"מ לייצר את ‪ , k3‬אחרת נקבל ‪.|Δk|>0‬‬ ‫למיטב ידיעתי‪ ,‬אין בספרות מקרים בהם ‪.m1,m2≠1‬‬ ‫‪41‬‬ ‫יעילותם של תהליכים לא‪-‬ליניאריים‬ ‫בתוך גבישים תלויה בחוסר ההתאמה‬ ‫בפאזה‪,‬‬ ‫רכיבי‬ ‫‪ ,Phase Mismatch – PMM‬בין‬ ‫הגל‬ ‫השונים‬ ‫שמבצעים‬ ‫אינטראקציה )הגלים הנכנסים והגלים‬ ‫הנוצרים(‪ .Δk :‬למעשה‪ ,‬זהו ביטוי לחוסר‬ ‫ההתאמה בין החלק תלוי הזמן לחלק‬ ‫איור ‪:2.12‬עוצמה של הכפלת תדר ללא ‪) PM‬קו מקווקו(‬ ‫ועם ‪) PM‬קו רציף(‬ ‫תלוי המקום במשוואת הגלים‪ .‬כאשר ‪ Δk‬שונה מ‪ ,0-‬יווצר הפרש פאזה בגל הנוצר‬ ‫לאורך מסלולו בתווך‪ ,‬והפרש זה יהיה פונקציה של ‪ PMM‬ושל הדרך בתווך הלא‬ ‫ליניארי )איור ‪ .(2.12‬כתוצאה מכך תהיה‬ ‫התאבכות הורסת של הגל הנוצר עם עצמו‪,‬‬ ‫כך שעוצמתו לא תגדל אלא תהיה מחזורית‬ ‫ואורך המחזור יהיה‬ ‫‪) 2 π / Δ k‬ביחידות של‬ ‫מטר(‪ .‬מכאן רואים כי אם ‪ Δk‬יהיה קטן מאוד‪,‬‬ ‫נקבל מחזור גדול מאוד‪ ,‬כלומר התאבכות‬ ‫בונה‪ ,‬ולכן עלייה פראבולית המאפיינת הגבר‬ ‫קוהרנטי‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬כאשר קיים חוסר‬ ‫התאמה בפאזה‪ ,‬התהליך הלא‪-‬ליניארי אינו‬ ‫יעיל‪.‬‬ ‫איור ‪ :2.13‬למעלה‪ :‬עקומות ‪ o‬ו‪ e-‬בגביש לא לינארי‪,‬‬ ‫שינוי אופייני של מקדם השבירה כתלות בתדר‪.‬‬ ‫למטה‪ :‬התקדמות חזית גל בגביש כפול‪-‬שבירה‪:‬‬ ‫)‪ :(a‬בציר ‪ o‬החזית מרגישה גביש איזוטרופי‪:(b) .‬‬ ‫בציר ‪ e‬חזית הגל מרגישה אנאיזוטרופיות מקסימלית‪.‬‬ ‫)‪ :(c‬מקדם שבירה אליפטי לעומת איזוטרופי )מעגלי(‪.‬‬ ‫‪42‬‬ ‫שליטה ב‪PM-‬‬ ‫השיטה המקובלת לשליטה ב‪  k  -‬היא ע"י שימוש בגביש בעל מקדם שבירה‬ ‫כפול )‪ (Birefringence‬לא ליניארי )אסימטרי לאינברסיה עבור תא היחידה(‪ ,‬בו לאור‬ ‫שקיטובו מקביל לציר הגביש יהיה מקדם שבירה שונה מלמישור המאונך לציר‪ .‬בד”כ‪,‬‬ ‫מקדם השבירה גדול יותר לקיטוב המקביל למישור‪ ,‬איור ‪ .2.12‬קיטוב המקביל למישור‬ ‫רגיל‬ ‫יקרא‬ ‫)‪(Ordinary‬‬ ‫ויסומן‬ ‫ב‪,o-‬‬ ‫וקיטוב‬ ‫המאונך‬ ‫למישור‬ ‫יקרא‬ ‫מיוחד‬ ‫)‪ (Extraordinary‬ויסומן ב‪ .e-‬קיימים גם גבישים בעלי ‪ 3‬צירים אופטיים שונים‪ ,‬בהם‬ ‫הסימונים שונים‪ ,‬אבל לא ארחיב על כך‪.‬‬ ‫התקדמות של חזית גל בתדר ‪ ω‬בציר ‪ e‬של הגביש תהיה באורך גל שונה‬ ‫ובמהירות שונה מאשר בהתקדמות בציר ‪o‬‬ ‫של אותו הגביש )איור ‪ .(2.13‬ע"י משחק‬ ‫בזוית ההתקדמות יחסית לציר הגביש כפי‬ ‫שמתואר באיור ‪ Q‬ניתן לשלוט באינדקס‬ ‫הרפרקציה )‪ ne(θ‬ובכך להגיע לגדלים של ‪k‬‬ ‫‪1‬‬ ‫איור ‪ :2.14‬התקדמות בציר ‪ eeff‬מקטינה את האליפטיות‬ ‫באינדקס הרפרקציה שמרגישה חזית הגל‪.‬‬ ‫ו‪ k2-‬כך שיאפסו את גודלו של ‪ PMM‬ויאפשרו תהליך לא לינארי ספציפי ביעילות‬ ‫גבוהה‪.‬‬ ‫ישנם מספר סוגי ‪ ,PM‬המחולקים לפי קיטוב של הקרניים המגיבות יחסית לקרן‬ ‫הנוצרת‪ PM .‬מסוג ‪ Type I‬משמעותו שהגביש מתאים לביצוע פעולת ‪) Mixing‬תדר‬ ‫סכום‪/‬הפרש( ע"י שני הגלים המגיבים בקיטוב‬ ‫‪ .o‬תוצאת הפעולה תהיה קרן בקיטוב ‪e‬‬ ‫הנקראת‬ ‫‪Signal‬‬ ‫והיא‬ ‫תהיה‬ ‫בתדר‬ ‫‪ .  signal =1 2‬קיימים סוגי התאמת פאזה‬ ‫מסדרים גבוהים יותר‪ .Type II-VIII :‬בגבישים‬ ‫בעלי ‪) Δn<0‬רוב הגבישים( משתמשים בעיקר‬ ‫ב‪PM-‬‬ ‫‪I/II‬‬ ‫‪.Type‬‬ ‫בגבישים‬ ‫בעלי‬ ‫‪Δn>0‬‬ ‫משתמשים בעיקר ב‪.Type VII/VIII PM-‬‬ ‫השיטה המקובלת להתאמת גביש נתון‬ ‫לביצוע המרת סקאלה רחבה של אורכי גל‪,‬‬ ‫איור ‪ :2.15‬גביש בחיתוך )‪ (θ,φ‬על מערכת צירים‬ ‫של הגביש כאשר המישור )‪ (X,Y‬הוא ‪Ordinary‬‬ ‫וציר ‪ Z‬הנו ‪.Extraordinary‬‬ ‫‪43‬‬ ‫הדורשים ‪ Δn‬קטן יותר מהקיים בגביש‪ ,‬היא יצירת אינדקס רפרקציה ‪extraordinary‬‬ ‫אפקטיבי‪ . neeff ,‬השיטה מתבססת על חיתוך הגביש שלא על פי הצירים הטבעיים‬ ‫שלו‪ ,‬כך שהקרן מתקדמת בזווית ‪ θ‬יחסית לציר ‪) e‬איור ‪ (2.14‬של הגביש ו"מרגישה"‬ ‫את אינדקס הרפרקציה לפי המשוואה הבאה‪:‬‬ ‫זווית‬ ‫ישרה‬ ‫נקבל‬ ‫כי‬ ‫‪neeff=ne‬‬ ‫‪1‬‬ ‫)‪sin2 (θ) cos2 ( θ‬‬ ‫=‬ ‫‪+‬‬ ‫‪ . eff 2‬עבור‬ ‫)‪ne (θ‬‬ ‫‪n2e‬‬ ‫‪n2o‬‬ ‫ועבור‬ ‫‪θ=0‬‬ ‫נקבל‬ ‫כי‬ ‫‪.neeff=no‬‬ ‫ע"מ לנצל את היתרונות הגלומים בשליטה רציפה בזוית ‪ ,θ‬חותכים את הגביש‬ ‫בזווית אופטימלית )איור ‪ (1.14‬עבור התהליך אותו הגביש אמור לבצע ונותנים דרגת‬ ‫נוספת חופש לשליטה רציפה בזוית ‪ .θ‬בנוסף הוגדרה זוית נוספת‪ ,φ ,‬שהיא הזוית בין‬ ‫ההיטל של כיוון ההתקדמות של הקרן )‬ ‫‪ (K‬על מישור )‪ (X,Y‬לציר ה‪) X-‬איור‬ ‫‪ .(2.15‬בתהליכים בהם הקרניים מגיעות‬ ‫לגביש בקיטוב מקביל )סוג ‪ (I‬הזוית ‪φ‬‬ ‫תמיד תהיה ‪ .0‬בתהליכים מסוג ‪ II‬הזוית‬ ‫‪ φ‬תהיה תלויית ייעוד‪ ,‬בד"כ עשרות‬ ‫מעלות‪ .‬בהכפלת תדר מסוג ‪ II‬הזוית‬ ‫איור ‪ :2.16‬תלות הכפלת תדר בטמפרטורת הגביש המכפיל‬ ‫תהיה ‪ 45o‬בדיוק‪.‬‬ ‫לטמפרטורה השפעה לא הומוגנית על אינדקס הרפרקציה בגבישים מסוג זה‪ .‬כיוון‬ ‫שמדובר בגבישים בעלי מבנה אנאיזוטרופי‪ ,‬שינוי בצפיפות הגביש כתלות בטמפרטורה‬ ‫יהיה שונה בין צירו למישורו של הגביש‪ ,‬וזה יבוא‬ ‫לידי ביטוי גם ב‪) Δn-‬איור ‪ .(2.16‬לכן בהרבה‬ ‫מערכות מבוססות גבישים כפולי‪-‬שבירה מצמדים‬ ‫את הגבישים לאמבט חום )‪ (Heat Sink‬ע"מ‬ ‫לשלוט בטמפרטורת הגביש‪ .‬לפעמים משתמשים‬ ‫בתכונה זו כטכניקה להשגת התאמת פאזות‪.‬‬ ‫הגבר פרמטרי אופטי‬ ‫תהליך ההגבר האופטי הפרמטרי הינו תהליך‬ ‫בו קרן חלשה )‪ (Seed‬בתדר ‪ ωs‬מוגברת ע"י קרן‬ ‫טבלה ‪ :2‬סוגי התאמת פאזות )‪ (PM‬וקיטובים‬ ‫מתאימים‪.‬‬ ‫‪44‬‬ ‫חזקה יותר )‪ (Booster‬בתדר גבוה יותר ‪ .ωb‬בתהליך זה נוצרת גם קרן נוספת‪ ,‬ה‪,Idler -‬‬ ‫‪,ωi‬‬ ‫בתדר‬ ‫שמתקיים‬ ‫כך‬ ‫התנאי‪:‬‬ ‫תהליך זה הפוך לתהליך הסכימה מבחינה ‪ Booster = Signal idler ,  Signal idler‬‬ ‫מתמטית‪ :‬במקום לסכום ‪ 2‬פוטונים‪ ,‬פוטון יחיד מתפצל ל‪ 2-‬פוטונים שסכום התדרים‬ ‫שלהם ייתן את התדר המגביר‪.‬‬ ‫לכן גביש המסוגל לבצע את פעולת ההגבר הנ"ל‪ ,‬יוכל לבצע פעולה של סכימה‬ ‫עבור תדרי ה‪ Signal-‬וה‪ Idler-‬באותה גיאומטריה בדיוק )בטבלה ‪ 2‬ניתן לראות את סוגי‬ ‫ה‪PM-‬‬ ‫עבור‬ ‫הגבר‬ ‫פרמטרי(‪.‬‬ ‫בתהליך‬ ‫זה‬ ‫משתמשים במכשירים אופטיים מסוג ‪ OPA‬ו‪NOPA-‬‬ ‫עליהם‬ ‫ארחיב‬ ‫בהמשך‪.‬‬ ‫יכולת ההגבר בטכניקה זו מוגבלת בד"כ ע"י‬ ‫איור ‪ :2.18‬סכמה של מגבר פראמטרי מרובה‪-‬‬ ‫מעברים‪.‬‬ ‫סף הנזק של התווך הלא ליניארי‪ .‬קיימת שיטה להתגבר על מגבלה זו‪ :‬פיצול ההגבר‬ ‫למספר שלבים ע"י ‪46‬ריבוי מעברים בתווך הלא‪-‬ליניארי עם עוצמת ‪ Booster‬הולכת‬ ‫וגדלה‪ .‬שיטה זו נקראת ‪) Multipass OPA‬איור ‪.(2.18‬‬ ‫אם כך‪ ,‬תנאים לשליטה על תדרי המוצא )‪ Signal‬ו‪-‬‬ ‫‪:(Idler‬‬ ‫‪.i‬‬ ‫קיומו של ‪ Seed‬לטובת הגבר פרמטרי‪.‬‬ ‫‪.ii‬‬ ‫‪ PM‬בגביש הלא לינארי ‪. k sk i =k b‬‬ ‫‪.iii‬‬ ‫שימור אנרגיה של פוטון ‪.  s i= b‬‬ ‫בנוסף‪ ,‬בגבישים ריאליים קיימת אנרגיית מינימום ל‪-‬‬ ‫‪ ,Idler‬עקב רזוננסים הקיימים ב‪ .IR-‬ספציפית לגביש ה‪-‬‬ ‫‪ BBO‬האנרגיה המינימלית של ה‪ Idler-‬היא כ‪ 2.6-‬מיקרון‬ ‫עקב בליעה באזור ה‪ 3-‬מיקרון‪.‬‬ ‫איור ‪ :2.19‬המחשה לחפיפה מרחבית‬ ‫במצב של ‪ (a‬הגבר קוליניארי‪(b .‬‬ ‫הגבר לא קוליניארי‪ (c .‬תרשים של‬ ‫חפיפה לא קוליניארית עם הזוויות‬ ‫הרלוונטיות‪.‬‬ ‫‪45‬‬ ‫מגברים פרמטריים‬ ‫מגברים פראמטריים מתחלקים ל‪ 2-‬קבוצות‪ OPA :‬ו‪) NOPA-‬ר"ת ‪.(Noncollinear OPA‬‬ ‫ההבדל המבני ביניהם הוא אופן החפיפה בין ה‪ Booster-‬ל‪ .Seed-‬ב‪ ,OPA-‬שתי הקרניים‬ ‫מגיעות לגביש בצורה קוליניארית‪ ,‬לעומת ה‪ ,NOPA-‬בה פותחים זוית של מספר מעלות‬ ‫בין ה‪ Seed-‬לבוסטר במישור המאונך לציר ה‪ .47eeff-‬ישנן מספר סיבות עיקריות‬ ‫לפתיחת הזווית המקנות לקונפיגורציה הלא ליניארית יתרון על פני הליניארית‪:‬‬ ‫‪ .1‬ראינו כי בקונפיגורציה קוליניארית מתקיים מצב של ‪ PM‬עבור התנאי הבא‪:‬‬ ‫‪ . kb− ks −ki=k =0‬המצב נכון גם עבור קונפיגורציה שאינה קוליניארית‬ ‫)איור ‪ .(2.20‬אופטימיזציה על דרגת החופש ‪) Ψ‬איור ‪ (2.19C‬יכולה להרחיב את‬ ‫הספקטרום ל‪ PM-‬ובכך להרחיב את הפולס היוצא‪ .‬הצורך בפולס רחב נובע‬ ‫מעיקרון אי הודאות‪ ,‬כלומר‪ ,‬מפולס רחב ספקטרלית ניתן ליצור פולס קצר‬ ‫מאוד בזמן‪.‬‬ ‫‪ .2‬בהצבה ליניארית של המערכת נוצר מצב בו ה‪ Idler-‬מתקדם בתווך מהר יותר‬ ‫מה‪ .Signal-‬תוך כדי ההתקדמות כל אחד מהם מוגבר ע"י קרן ה‪ Booster -‬וכך‬ ‫נוצר מצב בו שני התוצרים נוצרים לאורך אזור רחב ורזולוציית הזמן נפגעת‬ ‫בצורה שלא ניתן לתקן אחר‪-‬כך )איור ‪.(2.19a‬‬ ‫‪ .3‬כיוון שמדובר בגביש בעל מקדם שבירה כפול‪ ,‬שימוש בהגברה מכל סוג תגרום‬ ‫לקרניים להיפרד מרחבית אחת‬ ‫מהשנייה בגביש )איור ‪ .(2.19‬ע"י‬ ‫שליחת‬ ‫להגדיל‬ ‫הקרניים‬ ‫את‬ ‫בזוית‬ ‫הדרך‬ ‫‪kB‬‬ ‫ניתן‬ ‫האופטית‬ ‫בגביש בה יש חפיפה במקום‬ ‫ובזמן ובכך להגדיל את יעילות‬ ‫‪k I 3 ‬‬ ‫‪k I 2 ‬‬ ‫‪k S  3 ‬‬ ‫‪k I  1‬‬ ‫‪k S 2 ‬‬ ‫‪k S 1‬‬ ‫הקונברסיה‪.‬‬ ‫‪ .4‬קיימים‬ ‫גבישים‬ ‫)בחיתוכים‬ ‫איור ‪ :2.20‬רישום וקטורי הגל עבור ‪ PM‬ב‪.NOPA-‬‬ ‫ספציפיים( בהם טווח אורכי הגל בהם יש הגבר יעיל‪ ,‬רחב‪ .‬זה קורה בד"כ‬ ‫באיזורים ספקטראליים בהם העקומה ‪ n ‬שטוחה‪ ,‬ולכן ‪ PM‬מתקיים על‬ ‫ספקטרום רחב‪ .‬אם ספקטרום ההגבר חוצה את הסדר השני של הבוסטר‬ ‫‪46‬‬ ‫) ‪ ,(  Signal ⊂ Booster×2‬אזי תהיה חפיפה ספקטראלית בין ה‪ Signal -‬וה‪.Idler-‬‬ ‫מצב זה יגרום להתאבכויות ולחוסר יציבות ואף יפגע ברזולוציית הזמן‪ .‬ע"מ‬ ‫להימנע ממצב זה יוצרים זוית )איור ‪ (2.19c‬בין ה‪ Signal-‬ל‪) Booster-‬נהוג לסמנה‬ ‫ב‪(Ψ-‬‬ ‫וכך‬ ‫‪ Idler‬‬ ‫‪‬‬ ‫‪ Signal‬‬ ‫נוצרת‬ ‫זוית‬ ‫בין‬ ‫ה‪Signal-‬‬ ‫ל‪Idler-‬‬ ‫לפי‬ ‫המשוואה‬ ‫הבאה‪:‬‬ ‫‪. ≈ ×1‬‬ ‫ל‪ NOPA-‬גם חסרונות לעומת הקונפיגורציה הקוליניארית‪:‬‬ ‫‪ .1‬אין אפשרות להשתמש ב‪ .Idler-‬כפי שניתן לראות באיור ‪ ,2.20‬ה‪ Idler-‬עוזב את‬ ‫המכשיר כשהוא פרוס זויתית )כל תדר יוצא בזוית שונה(‪.‬‬ ‫‪ .2‬בהרבה מקרים ישנו צורך בתדר צר ומתכוונן בעוצמה חזקה )בד"כ לעירור( ואת‬ ‫צורך זה מתקשה ה‪ NOPA-‬לספק )חשוב לציין כי קיימות טכניקות להצרת‬ ‫הפולס ב‪.(NOPA-‬‬ ‫‪ .3‬מאוד מסובך ליישם את טכניקת ה‪ Multipass -‬ב‪ NOPA-‬ע”י שימוש בגביש יחיד‪.‬‬ ‫קיימים מערכים עם שני שלבי הגברה‪ ,‬אך כל שלב בהגבר מצר את‬ ‫הספקטרום במוצא‪.‬‬ ‫יצירת ספקטרום רחב גוררת מספר בעיות‪:‬‬ ‫•‬ ‫פולס רחב ספקטראלית אינו מתאים לעירור סלקטיבי של קו בליעה צר‪ .‬חייבים‬ ‫לדעת היטב את התכונות הספקטרליות של מצב היסוד לפני שמשתמשים‬ ‫בפולס רחב לעירור‪.‬‬ ‫•‬ ‫הפולס במוצא מה‪ NOPA-‬פרוס בזמן ) ‪ (Chirped‬כתוצאה מהדיספרסיה שהפולס‬ ‫עובר הן בשלב ההרחבה הספקטראלית )‪ (SPM‬והן בשלב ההגברה‪ .‬עקב כך יש‬ ‫גם ירידה ברזולוציית הזמן ותזמון הסיגנל בכל אורך גל משתנה בהתאם ל‪.Chirp -‬‬ ‫יש שתי שיטות להתגבר על כך‪:‬‬ ‫◦‬ ‫כיווץ הפולס בזמן‪.‬‬ ‫◦‬ ‫‪ ,Time Correction‬שיטה לתיקון התיזמונים היחסיים של הסיגנל בכל אורך‬ ‫גל בהתאם לעקומת דיספרסיה הנמדדת באופן בלתי תלוי‪.‬‬ ‫‪47‬‬ ‫‪ :Time Correction‬תיקון התזמון היחסי של אורכי הגל השונים‬ ‫פולס רחב הנוצר בשיטת ‪ ,SPM‬נוצר כשהוא ‪ ,Chirped‬וה‪ Chirp-‬גדל במעבר‬ ‫ברכיבים האופטיים השקופים השונים‪ .‬אם במערכת הנמדדת קיימים תהליכים מהירים‬ ‫המביאים לתוצר בסקלת הזמנים של הרחבת הפולס הנובעת מהצ'ירפ‪ ,‬קיימת‬ ‫איור ‪ :2.21‬באמצע‪ :‬תוצאות ניסוי ריאלי על ‪ rPSB‬שעורר ב‪ 400-‬נ"מ ונבדק ב‪ .NIR-‬משמאל‪ :‬תוצאות שנמדדו עם אותם‬ ‫הפו לסים על פרוסת סיליקון גבישי‪ .‬מימין‪ :‬התוצאות לאחר ביצוע תיקון התזמון היחסי‪.‬‬ ‫אפשרות שאפילו לא נדע להבדיל מהי בליעת מצב מעורר ומהו התוצר‪ .‬על מנת‬ ‫שניתוח התוצאות לא יהיה מושפע מתופעה זו יש צורך באחד מהשניים‪ (1 :‬כיווץ של‬ ‫הפולס בזמן בשיטה אקטיבית או פסיבית‪ (2 .‬למדוד באופן בלתי תלוי את תזמון‬ ‫ההגעה של כל אורך גל יחסית לרעהו‪ ,‬ולתקן בדיעבד את זמני ההגעה היחסיים של‬ ‫כל אורכי הגל לכדי אותו רגע‪ ,‬כפי שניתן לראות באיור ‪.2.21‬‬ ‫השיטה לעשות זאת בתחום ה‪ NIR-‬היא לבצע בנוסף לניסוי על הדוגמה הרצויה‪,‬‬ ‫ניסוי על חומר בעל תגובה מיידית עם ספקטרום טרנזיאנטי ידוע‪ ,‬רחבה ככל הניתן‬ ‫ולחלץ משם את עקומת ה‪) Group Delay Despersion -‬ר"ת ‪ (GDD‬של פולס ה‪.Probe-‬‬ ‫מעקומת ה‪ GDD-‬ניתן לתקן את זמני ההגעה של כל אורך גל בניסוי המקורי‪ .‬לשיטה זו‬ ‫קוראים ‪ Time Correction‬והיא מיושמת במעבדתנו בכל ניסוי בו אנו משתמשים ב‪-‬‬ ‫‪ Probe‬שאינו מכווץ בזמן‪.‬‬ ‫‪48‬‬ ‫)‪ :Global Fit (GF‬ניתוח קינטי של הניסוי‬ ‫שיטת אנליזה זו מאפשרת לנו להתאים מודל קינטי לתוצאות ניסיוניות דו מימדיות‬ ‫)בעבודה זו בפרט‪ ,‬ובמחקרים במעבדתנו בכלל‪ ,‬מדובר במרחב זמן ואורך גל(‪.‬‬ ‫התאמה מסוג זה מספקת אינפורמציה על התפתחות של אוכלוסיות בזמן‪ ,‬כאשר כל‬ ‫אוכלוסיה הינה בעלת ספקטרום ייחודי לה‪ .‬כל זה נגזר ממודל קינטי שאנו מניחים‬ ‫לגבי התוצאות‪.‬‬ ‫שיטת ה‪ GF-‬מניחה מודל קינטי לגבי הנתונים‪ ,‬מה שבא לידי ביטוי מתמטית‬ ‫בהפרדת משתנים בין פונקציית תדר לפונקציית הזמן‪:‬‬ ‫ותהליכי דעיכה מסדר ראשון‬ ‫‪ OD  , t=F ×T t ‬‬ ‫‪−t / τ‬‬ ‫) ‪ . T (t )=Σi ( Ai×e‬השיטה לוקחת בחשבון את‬ ‫תגובת המערכת כקונבולוציה של גאוסיאן )המסמל את רזולוציית הזמן( והקינטיקה‬ ‫של המערכת‪:‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪−t‬‬ ‫)) ‪, Σ ( Ai×e τ‬‬ ‫‪−t‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪2σ‬‬ ‫‪. T (t )=conv ( e‬‬ ‫‪i‬‬ ‫האנליזה הגלובלית מניחה שהרוב המוחלט של האוכלוסייה אותה אנו בודקים‬ ‫נמצא במצב היסוד או באחד מתוצרי הביניים‪ .‬לכן ‪ ,‬בכל רגע נתון הספקטרום‬ ‫המתקבל מורכב מתרומות שמגיעות ממספר סופי של צורונים בעלי ספקטראות‬ ‫קבועים ‪ ,‬כאשר האבולוציה הספקטרלית מתקבלת אך ורק כתוצאה משינויים בריכוזים‬ ‫של צורונים אלו בהתאם למודל בו אנו משתמשים‪ ,‬וקבועי הקצב האופייניים להם‪.‬‬ ‫הנחה זו אינה נכונה עבור תהליכים אולטרה‪-‬מהירים כי היא לא לוקחת בחשבון‬ ‫תופעות שבאות לידי ביטוי בשינוי רציף של הספקטרום‪ ,‬כגון קירור ויברציוני‪ ,‬או ארגון‬ ‫מחדש של ממס סביב התוצר ועוד‪ .‬בתהליכים אלה לא ניתן להזניח את האוכלוסיות‬ ‫שנמצאות בשלבי הביניים של הראקציה‪ .‬בתאוריה ניתן לתאר מערכות מסוג זה‬ ‫)מערכות דינמיות( בצורה מדוייקת ע"י ריבוי צורונים במודל‪ ,‬אך בפועל יש להימנע‬ ‫מכך‪ ,‬כיוון שכל צורון במצב זה יאכלס רק אוכלוסיה מועטה ולכן תהיה לו השפעה‬ ‫מועטה על הספקטרום‪ ,‬ותגרור הגדלת השגיאה‪ .‬למזלנו‪ ,‬תהליכים דינמיים אלה בד"כ‬ ‫קצרים משמעותית מהתהליכים הקינטיים‪ ,‬ולכן ניתן להניח מודל קינטי עבור זמנים‬ ‫ארוכים יותר מהשינויים הרציפים מיד לאחר העירור‪ .‬עם זאת‪ ,‬צריך לזכור כי בזמנים‬ ‫קצרים אנו נצפה לסטייה מהמודל הקינטי‪ ,‬ולכן בזמנים קצרים )סד"ג של מאות פמטו'(‬ ‫אלה‪ ,‬האמינות של כל ההתאמה מוטלת בספק‪.‬‬ ‫‪49‬‬ ‫שלבי האנליזה‪:‬‬ ‫‪ .1‬השלב הראשון הוא הוא שלב מתמטי בשם ‪ : SVD‬בשלב זה מניחים כי המטריצה‬ ‫המייצגת את התוצאות‬ ‫אחת‬ ‫מהן‬ ‫) ‪Δ OD( λ , t‬‬ ‫היא‬ ‫היא סכום של מטריצות בלתי תלויות‪ ,‬שכל‬ ‫תוצאה‬ ‫של‬ ‫המכפלה‬ ‫הווקטורית‬ ‫) ‪min(m ,n‬‬ ‫)) ‪Σ ai ×(Λ (λ)×T t (t‬‬ ‫‪ , Δ OD (λ , t)= i=1‬כאשר ‪ T‬ו‪ Λ-‬הן מטריצות מרובעות‬ ‫בגדלים ‪ nxn‬ו‪ mxm-‬בהתאמה‪ ,‬ושורותיהן הן הוקטורים האורטונורמליים ‪ Ti‬ו‪ Λi -‬ו‪a-‬‬ ‫היא מטריצה בגודל ‪ nxm‬של אפסים‪ ,‬פרט לאיבר אלכסוני ה‪ i-‬שגודלו ‪ .ai‬כל‬ ‫מטריצה בסכימה מתארת מימד אחד של המטריצה הניסיוניות )מכפלה של שני‬ ‫מימדים תיתן ‪ .(0‬השיטה להגיע להצגה כזאת של נתונים נקראת ‪SVD‬‬ ‫)ר"ת ‪ .(Singular Value Decomposition‬מה שמיוחד בהצגה כזו של התוצאות‪ ,‬הוא‬ ‫העובדה שכך ניתן לזהות את המימדים בהם התוצאות מציגות את השינוי הגדול‬ ‫ביותר‪ .‬גודל השינוי במימד ה‪ i-‬מיוצג ע"י ‪ .ai‬השיטה מאפשרת להציג את התוצאות‬ ‫באופן מצומצם יותר ולנפות רעש‪.‬‬ ‫‪ .2‬לאחר שמצאנו את המימדים בהם השינוי מקסימלי‪ ,‬עלינו לקבל החלטה‪ :‬בעזרת‬ ‫כמה מימדים ניתן לתאר את המערכת בדיוק מספיק טוב? מכיוון שהרעש סטטי‪,‬‬ ‫ברור שה‪ ai-‬הקטנים ביותר ייצגו את הרעש והגדולים ביותר את הסיגנל‪ .‬לכן‪ ,‬את‬ ‫המימדים מכניסים לפי גודל ‪ a‬יורד‪ :‬ככל שנכניס יותר מימדים גדל הסיכוי שנכניס‬ ‫רעש מיותר‪ ,‬אך אם ניקח מעט מדי מימדים נאבד אינפורמציה‪.‬‬ ‫‪ .3‬בשלב זה עלינו לבחור את מספר תוצרי הביניים לתיאור התוצאות‪ .‬כאן יש צורך‬ ‫בהבנה של המערכת הניסיונית‪ .‬מחסור במצבים ייתן התאמה גרועה ותוצאות‬ ‫שאינן מתארות את המערכת כהלכה‪ .‬עודף מצבי ביניים דומה למצב של ‪n‬‬ ‫משוואות עם ‪ n+1‬נעלמים ולכן אינסוף פתרונות‪ ,‬בפרט במערכת הניסיונית‬ ‫המתוארת לא יתקבל פתרון חד משמעי‪.‬‬ ‫‪ .4‬בחירת מודל קינטי צריכה לבוא גם היא מהבנת המערכת‪ .‬המודל משפיע על‬ ‫המשוואות בהן נשתמש ע"מ להתאים אותן לווקטורי הזמן‪ ,‬אך לא על מקדמי‬ ‫האקספוננטים‪ .‬כך‪ ,‬בחירה לא נכונה של המודל תוביל לחילוץ של ספקטראות לא‬ ‫נכונים לצורוני הביניים‪.‬‬ ‫‪ .5‬שחזור התוצאות הניסיוניות בעזרת תוצאות ה‪) GF-‬שלב הבדיקה(‪.‬‬ ‫‪50‬‬ ‫התוצאות של ה‪ GF-‬יהיו ספקטראות של צורוני המעבר וזמני חייהם‪.‬‬ ‫הקונפיגורציה הניסיונית‬ ‫איור ‪ :2.22‬המערך הנסיוני‪.‬‬ ‫תוצאה של מערך ליצירת הפולסים כפי שתואר בתחילת החלק הנסיוני הוא קרן‬ ‫באורך גל ב‪ 780 -‬נ"מ‪ ,‬בעוצמה של ‪ 250mW‬בתדר ‪ 400Hz‬בצאתה מהמגבר )באנרגיה‬ ‫של ‪ (625μJ/Pulse‬שמתפצלת ל‪ 2-‬קרניים )איור ‪ .(2.22‬כשני שליש מהעוצמה עובר‬ ‫המרת אורך גל ב‪ TOPAS-‬ל‪ 480-‬נ"מ או ‪ 570‬נ"מ או הכפלת תדר בגביש מכפיל ל‪390-‬‬ ‫נ"מ‪ .‬הפולס עובר דרך ‪ Chopper‬המסונכרן עם המחשב‪ ,‬החוסם חצי מהפולסים )אחד‬ ‫עובר‪ ,‬אחד נחסם(‪ .‬שליש מעוצמת הפולס עובר הרחבה ספקטראלית בשיטת ‪ SPM‬או‬ ‫המרת אורך גל ב‪.NIR-NOPA-‬‬ ‫ה‪TOPAS-‬‬ ‫עיקרון הפעולה של מכשיר ה‪ ,TOPAS-‬כפי שניתן לראות באיור ‪ ,2.23‬הוא‬ ‫‪ Multipass OPA‬ב‪ 4-‬שלבי הגברה של ‪ .Seed‬ה‪ Seed-‬מיוצר ע"י סופרפלואורוסנציה‬ ‫בגביש ה‪ ,BBO-‬המשמש גם כגביש הלא‪-‬לינארי עבור פעולת ההגבר הפרמטרי‪.‬‬ ‫‪51‬‬ ‫ביכולתו של המכשיר להמיר את אורך גל המוצא )‪ (~780nm‬לכל אורך גל מ‪1150nm-‬‬ ‫עד ‪ 1600nm‬עבור ה‪ Signal-‬ומ‪ 1600nm-‬עד כ‪ 2400nm-‬עבור ה‪ .Idler-‬ע"י שימוש‬ ‫בתהליכי ‪ Frequency Summing‬עם תדר המוצא בגביש ‪ Type II‬ו‪Frequency Doubling-‬‬ ‫של ה‪ Signal-‬או ה‪ Idler-‬בגביש ‪ ,Type I‬ניתן לייצר פולסים בצורה רציפה מ‪475nm -‬‬ ‫ועד ‪ ,1150nm‬כמוצג בטבלה‪.‬‬ ‫‪Polarization‬‬ ‫‪Pulse energy‬‬ ‫‪Tuning range‬‬ ‫‪vertical‬‬ ‫‪>240 µJ at peak‬‬ ‫‪1150-1600 nm‬‬ ‫‪Signal‬‬ ‫‪horizontal‬‬ ‫‪>240 µJ at peak‬‬ ‫‪1600-2400nm‬‬ ‫‪Idler‬‬ ‫‪horizontal‬‬ ‫‪>80 µJ at peak‬‬ ‫‪580–800 nm‬‬ ‫)‪SH of signal (SHS‬‬ ‫‪vertical‬‬ ‫‪>30 µJ at peak‬‬ ‫‪800–1150 nm‬‬ ‫)‪SH of idler (SHI‬‬ ‫‪vertical‬‬ ‫‪>90 µJ at peak‬‬ ‫‪475–533 nm‬‬ ‫)‪Pump+signal (SFS‬‬ ‫‪ ‬‬ ‫טבלה ‪ :3‬יכולות ה‪ TOPAS -‬בשאיבה עם פולס באורך גל של ‪ 780‬נ"מ באורך ‪ 80‬פמטו'‪.‬‬ ‫הפולסים במוצא מה‪ TOPAS-‬צרים בתדר )כ‪ 1500cm-1 -‬בנראה וכ‪ 500cm-1-‬ב‪,(NIR-‬‬ ‫ולכן לפי עיקרון אי הודאות מוגבלים ברזולוציית זמן )תהליכי ‪ Mixing‬ו‪Doubling-‬‬ ‫מקצרים את הפולס במוצא(‪ .‬רזולוציית הזמן המקסימלית אליה ניתן להגיע לאחר כיווץ‬ ‫הפולס בזוג פריזמות היא ‪ 25fs‬בנראה וכ‪ 80fs-‬ב‪.NIR-‬‬ ‫מערך איסוף האור ב‪ NIR-‬מתבסס על אחד משני‬ ‫ספקטרופוטומטרים מבית היוצר של ‪ ,BWTek‬שניהם מבוססי‬ ‫מערך דיודות מקורר מסוג ‪ .InGaAs‬האחד‪ ,BTC261E ,‬מכסה‬ ‫את התווך הספקטראלי ‪ 0.9-1.7μm‬והשני‪ ,BTC262E ,‬מכסה‬ ‫את התווך הספקטראלי ‪) 1.1-2.2μm‬איור ‪.(2.24‬‬ ‫איסוף הפולסים נעשה ב‪ 2-‬שיטות‪ :‬עם שימוש בסיב‬ ‫אופטי או עם הדמיה ישירה לסדק הספקטרופוטומטר‪ .‬לכל‬ ‫איור ‪ :2.24‬ספקטרופוטומטר‬ ‫מבית ‪.BWTek‬‬ ‫אחת מהשיטות יתרונות וחסרונות משלה‪:‬‬ ‫היתרון החשוב והיחיד של ההדמיה לתוך הסיב האופטי הוא הנוחות שבאה לידי‬ ‫ביטוי בחיסכון במקום ובדינמיות ב‪.Setup-‬‬ ‫‪52‬‬ ‫חסרונות שיטה זו‪:‬‬ ‫•‬ ‫הנחתת עוצמת ה‪ Probe-‬עקב כך שרוחב הסדק בספקטרופוטומטר הוא ‪50‬‬ ‫מיקרון‪ ,‬לעומת עובי הסיב האופטי בו עבדנו‪ ,‬הנע מ‪ 200-‬ל‪ 600-‬מיקרון‪.‬‬ ‫•‬ ‫זיהינו שינוי במבנה הספקטראלי בקרן כתוצאה מההדמיה לסיב‪ ,‬המתבטאת‬ ‫בהתווספות של רעש דמוי מסור למבנה הספקטראלי של הקרן‪ .‬הוספת תווך‬ ‫מפזר ביציאה מהסיב או בצמוד לכניסה אליו מבטלת את התופעה אך מנחיתה‬ ‫את העוצמה של ה‪ Probe-‬פעם נוספת‪.‬‬ ‫יתרון ההדמיה הישירה לסדק הספקטרופוטומטר מתבטא בכמות האנרגיה‬ ‫הגדולה הנכנסת אליו וחסרונו הוא הגודל וחוסר הניידות )הרבה יותר קל לנייד סיב‬ ‫אופטי(‪ .‬גם ההדמיה לספקטרופוטומטר אינה מושלמת‪ .‬כיוון שההדמיה נעשית בעזרת‬ ‫עדשה אנו יוצרים אברציית צבעים‪ ,‬אומנם חלשה יחסית שכן מדובר ב‪ ,NIR-‬אך בכל‬ ‫זאת מורגשת‪ ,‬שבאה לידי ביטוי בהגדלת המוקד ואי דיוק בקריאת הגלאי‪ .‬בהדמיה‬ ‫לסיב תופעה זו לא קיימת כי אנו מצליחים לדמות את כל הקרן לסיב‪ ,‬שם הקרן‬ ‫"מתמצעת" ויוצאת הומוגנית‪.‬‬ ‫את הטריגר למערכת מספק מחולל תדרים מדגם ‪Stanford Research Systems‬‬ ‫‪ DG535‬שמסנכרן את הספ קטרופוטומטר‪ ,‬הלייזר השואב במגבר‪ ,‬הצ'ופר ובורר‬ ‫הפולסים לעבודה ב‪ .400Hz-‬הצ'ופר מחלק את התדר ב‪ 2-‬ושולח למחשב אינפורמציה‬ ‫לגבי מצב ה‪) Pump-‬נחתך או לא(‪.‬‬ ‫המחשב מקבל מהספקטרופוטומטר קריאה של כל פולס ואת מצב הצ'ופר‪ .‬ע"מ‬ ‫לקבל ספקטרום טרנזיאנטי‪ ,‬יש להחסיר את רעש הרקע הממוצע שברובו נובע מה‪-‬‬ ‫‪ Dark Current‬ולחשב את הסיגנל לפי הנוסחה‬ ‫‪I (t−t 0) Pump‬‬ ‫)‬ ‫‪I (t−t 0 )No Pump‬‬ ‫( ‪. Δ OD (t−t 0 )=−log 10‬‬ ‫כמו כן‪ ,‬המחשב שולט על הטרנסלטור )ובכך מגדיר את ה‪ (Delay-‬ועל מספר‬ ‫המיצועים בכל נקודה‪.‬‬ ‫‪53‬‬ ‫מטרות המחקר‬ ‫במשפחת הקרו טנואידים הגיעו למסקנות מרחיקות לכת מהתבוננות בפעילות‬ ‫הספקטראלית בתחום האינפרא‪-‬אדום הקרוב )‪ .(NIR‬למרות חשיבותו‪ ,‬תחום ספקטרלי‬ ‫זה לא נחקר עד עבודה זו בספקטרוסקופיה תלוית‪-‬זמן עבור חלבונים רטינלים ועבור‬ ‫הכרומופור שלהם‪ ,‬ה‪.rPSB -‬‬ ‫בהתאם למה שהוצג ברקע התיאורטי‪ ,‬מטרות המחקר הן‪:‬‬ ‫‪ .1‬בניית מערך ‪ Pump-Probe‬בתחום האינפרא‪-‬אדום הקרוב )‪ (NIR‬הכולל יצירת‬ ‫‪ Probe‬ב‪ NIR-‬והטמעת גלאי רב‪-‬ערוצי לתחום ספקטראלי זה‪.‬‬ ‫מערך זה צפוי לשמש בחקר של מערכות של חלבונים רטינלים נוספים ושל ננו‪-‬‬ ‫חלקיקים‪.‬‬ ‫‪ .2‬בחינת הדינמיקה האולטרה‪-‬מהירה במערכת ה‪ rPSB-‬באתאנול בשיטת ‪Pump-‬‬ ‫‪ Probe‬בתחום ה‪) NIR-‬בין ‪ 900‬ל‪ 2200-‬נ”מ(‪.‬‬ ‫‪ .3‬בחינת החלבון ‪ BR‬בשיטה זהה וזיהוי דמיון ושוני הנגרמים ע"י החלבון‪.‬‬ ‫במסגרת מטרות המחקר )‪ (2‬ו‪ ,(3) -‬נרצה לתת מענה לשאלות שהוצגו בסוף הרקע‬ ‫התיאורטי כמטרת המחקר‪:‬‬ ‫•‬ ‫מהו רוחב פס הפליטה שנצפה בעבר בקצה הנראה )לאיזה עומק לתוך ה‪NIR -‬‬ ‫נכנס פס זה( ?‬ ‫•‬ ‫מהן הרמות האלקטרוניות הפעילות בתהליך הפוטואיזומרזיציה ? כמה רמות‬ ‫אלקטרוניות )‪ 2‬או ‪ (3‬מעורבות בדינמיקה הראשונית של הכרומופור ושל‬ ‫החלבון ?‬ ‫•‬ ‫מהי הסיבה למולטיאקספוננציאליות בדעיכת המצב המעורר ?‬ ‫•‬ ‫האם ה‪ rPSB -‬בממס אכן מהווה מערכת מודל טובה ללימוד הפוטוכימיה של‬ ‫החלבונים הרטינליים ?‬ ‫‪54‬‬ ‫תוצאות‪:‬‬ ‫מערך ‪NIR‬‬ ‫במהלך המחקר השתמשתי ב‪ 2-‬שיטות ליצירת אור לבן עבור ה‪ :Probe-‬יצירת אור‬ ‫לבן ‪ Supercontinuum‬בשיטת ‪ SPM‬ע"י פילמנטציה בספיר ו‪.NIR NOPA-‬‬ ‫יצירת אור לבן‬ ‫יצירת אור לבן הייתה אחת הבעיות הקשות איתן‬ ‫התמודדנו במהלך בניית מערך ה‪ IR-‬מכמה סיבות‪:‬‬ ‫‪ .1‬הצורך להרחיב פולס ב‪ 780nm-‬כך שיכסה את‬ ‫הטווח הספקטראלי ‪ 900nm-2200nm‬ולוודא‬ ‫שהספקטרום יהיה אחיד מספיק לביצוע ניסוי‬ ‫ב‪.NIR-‬‬ ‫‪ .2‬חוסר יציבות בתדר גבוה )סדר גודל של תדר‬ ‫איור ‪ :3.1‬אור לבן כפי שהוא נראה‬ ‫על דף לבן‪.‬‬ ‫הפולסים( וחוסר יציבות בתדר נמוך )מחזור של עשרות שניות(‪.‬‬ ‫‪ .3‬ספקטרום לא אחיד )איור ‪ (3.1‬ופרינג'י שאינו משחזר את עצמו‪.‬‬ ‫‪ .4‬רזולוציית זמן נמוכה )כ‪ 300-‬פמטושניות בניסויים הראשונים(‪.‬‬ ‫כחלק מאבולוציה בת כשנתיים של המערכת‪ ,‬חלק מהבעיות נפתרו והגענו לרמה‬ ‫בה יכולנו לבצע ניסוי עם רזולוציית זמן ‪ , Δt (FWHM) < 100 fs‬רמת רעש סבירה‬ ‫ותוצאות אמינות שחוזרות על עצמן )איור ‪ .(3.2‬בפרק זה אנתח את הבעיות בהן‬ ‫נתקלנו וכיצד פתרנו בעיות אלה‪ .‬ישנן בעיות נוספות לפתור‪ ,‬וגם על כך אפרט‬ ‫בהמשך‪.‬‬ ‫‪55‬‬ ‫איור ‪ :3.2‬מימין תוצאות ראשונות בניסוי מערכת ה‪ ,NIR-‬משמאל תוצאות אופייניות בימים אלה‪.‬‬ ‫לפני המעבר למדידה בתחום ה‪ ,NIR-‬היה נהוג במעבדתנו להסתכל על ‪ 2‬עותקים‬ ‫של אותו פולס בזמן מדידת ההעברה ) ‪ ,(Probe & Reference‬כך שבחישוב הבליעה‬ ‫הטרנזיאנטית‪ ,‬הפולס שעבר דרך דוגמה מנורמל לעצמו ללא הדוגמה לפי המשוואה‬ ‫‪no pump‬‬ ‫‪pump‬‬ ‫‪I sample I reference‬‬ ‫‪Δ OD=−log( pump‬‬ ‫) ‪× no pump‬‬ ‫‪I reference I sample‬‬ ‫ולכן הצורך בדמיון בין שני הפולסים העוקבים קטן‪.‬‬ ‫כאשר משתמשים במכשיר מדידה עם מערך דיודות יחיד אין אפשרות לנרמל את‬ ‫הפולס לעצמו‪ ,‬כך שהצורך ביציבות גדל‪ .‬הניסיונות לשפר את יציבות האור הלבן‬ ‫)בתדר גבוה(‪ ,‬העלו כי המוקד חייב להיות חזק הרבה יותר מבעבר‪ :‬בעבר מיקדנו קרן‬ ‫בקוטר של כ‪ 1-‬ס"מ בעדשה באורך מוקד של ‪ 10-30‬סנטימטר‪ ,‬כאשר היום‬ ‫ממקדים בעדשה ‪ . f =5cm‬יש צורך להשתמש בספיר עבה ככל הניתן )אנו‬ ‫משתמשים בעובי של ‪ 3‬מ"מ(‪ ,‬ולמקד את הפולס לדופן האחורית )הפונה לקרן( של‬ ‫הספיר‪ .‬גילינו כי הרעש בתדר הנמוך הוא החזק ביותר עבור עבודה בפילמנט יחיד‪,‬‬ ‫וככל שמגדילים את העצמה של הפולס כך תדר הרעש עולה והאמפליטודה יורדת‪.‬‬ ‫‪56‬‬ ‫בעוצמות פולס הקרובות לסף הנזק של הספיר‪ ,‬כאשר מבנה הפולס הוא מולטי‪-‬‬ ‫פילמנט )מצב בו הרבה פילמנטים יוצאים מאותה נקודה( נצפתה היציבות הטובה‬ ‫ביותר‪ .‬ספקטראות אופיניים ניתן לראות באיור ‪.3.3‬‬ ‫כאן‬ ‫לציין‬ ‫ראוי‬ ‫כי‬ ‫לאחרונה‬ ‫הצלחנו לייצר אור לבן יציב בצורת‬ ‫פילמנט יחיד‪ ,‬ככל הנראה עקב שיפור‬ ‫היציבות הטרמית בחדר‪.‬‬ ‫במהלך העבודה נתקלנו בתופעה בה‬ ‫בכל ניסוי קיבלנו צורה ספקטראלית‬ ‫איור ‪ :3.3‬ספקטראות אופייניים של מולטי‪-‬פילמנט בספיר‪.‬‬ ‫שונה מבקודמיו‪ ,‬עבור אותה דוגמה‪,‬‬ ‫באותם תנאים‪ .‬גילינו שתופעה זו נובעת מהפרדת צבעים ביצירת מבנה המולטי‪-‬‬ ‫פילמנט‪ ,‬והבעיה מחריפה עם התקדמות הפולס‪ :‬בדוגמה‪ ,‬בנוסף לפריסת צבעים‪,‬‬ ‫ישנה גם תופעה של אברציה מרחבית ) ‪ (Spatial Aberration‬מסוג קומה ואסטיגמטיזם‬ ‫)‪ .(Astigmatism & Coma‬עיוותים אלו יוצרים בעיה בהדמיה טובה של ה‪ Probe -‬לתוך‬ ‫הנפח השאוב אופטית ע"י ה‪ Pump -‬בדגם‪ ,‬ובכך נוצרים עיוותים בקריאת הסיגנל של‬ ‫הבליעה הטרנזיינטית‪.‬‬ ‫גילינו‬ ‫הפרדת‬ ‫כי‬ ‫הצבעים‬ ‫מחריפה‬ ‫שגודל‬ ‫ככל‬ ‫מוקד‬ ‫ה‪-‬‬ ‫‪ Probe‬גדול יותר‪.‬‬ ‫פתרנו את הבעיה‬ ‫באמצעות‬ ‫של‬ ‫מוקד‬ ‫יצירה‬ ‫קטן‬ ‫מאוד בדוגמה ע"י‬ ‫איסוף‬ ‫של‬ ‫האור‬ ‫הלבן‬ ‫בזוית‬ ‫חדה‬ ‫איור ‪ :3.4‬תרשים של המערך הנסיוני המפצה על האסטיגמטיות הנובעת מאיסוף האור ע"י‬ ‫מראה כדורית‪ ,‬בדומה לשיטה שפיתח ‪. N. P. Ernsting‬‬ ‫מאוד )‪ (α~50‬ומיקודו בזוית קהה הרבה יותר )‪ .(β~11.50‬מערך זה מאפשר את הקטנת‬ ‫הדמות של המולטי‪-‬פילמנט בפקטור של כמעט ‪ .2.5‬פתרנו את בעיית האברציה‬ ‫‪57‬‬ ‫המרחבית ע"י יצירה מכוונת של אברציה בציר מאונך‪ ,‬המתקנת את האברציה‬ ‫הראשונית‪ .‬להמחשה‪ ,‬גודל מוקד ה‪ Probe -‬בתחילת הדרך היה כ‪ 400-‬מיקרון ‪FWHM‬‬ ‫)מדדנו ‪ 25‬אחוזי מעבר דרך ‪ Pin Hole‬בגודל ‪ 100μm‬במוקד( לעומת המצב לאחר‬ ‫התיקון‪ ,‬בו קוטר הקרן קטן מ‪ 75-‬מיקרון )מדדנו מעל ‪ 95‬אחוזי מעבר במוקד דרך אותו‬ ‫‪ .( Pin Hole‬על פי הניסויים האחרונים‪ ,‬המערכת נותנת תוצאות הדירות מבעבר ולכן‬ ‫אמינות יותר‪ .‬השינויים שביצענו במערכת‪ ,‬בעיקר הקטנת המוקד של ה‪ Probe -‬שיפרו‬ ‫משמעותית גם את רזולוציית הזמן מ‪ 300-‬פמטו' לפחות מ‪ 100-‬פמטו' ‪ .FWHM‬עם זאת‪,‬‬ ‫תיקון זה פותר את בעיית האסטיגמטיזם בלבד‪ ,‬לגבי בעית ה‪ Coma-‬גילינו שהתוצאות‬ ‫מספקות בהחלט ללא תיקונה‪.‬‬ ‫‪NIR NOPA‬‬ ‫את ה‪ NIR NOPA-‬בנינו לפי המודל של ‪ .48 G. Cerullo etal‬ה‪ NOPA-‬ממירה פולס‬ ‫מהמגבר‬ ‫בתחום‬ ‫לפולס‬ ‫רחב‪-‬פס‬ ‫‪1100-2100nm‬‬ ‫ע"י‬ ‫יצירת אור לבן בשיטת יצירה‬ ‫של פילמנט בספיר ותהליך‬ ‫הגורם‬ ‫‪SPM‬‬ ‫להרחבה‬ ‫ספקטראלית של הפולס בשלב‬ ‫ראשון‪,‬‬ ‫והגברתו‬ ‫הפרמטרית‬ ‫איור ‪ :3.5‬תרשים ה‪.NIR-NOPA-‬‬ ‫של האור הלבן בגביש ה‪ BBO-‬בשלב השני‪ .‬השתמשנו בגביש ‪ BBO Type I‬חתוך בזוית‬ ‫‪ θ=220‬ע"מ ליצור התאמת פאזות‪.‬‬ ‫אפרט על דרגות החופש ב‪ :NOPA-‬דרגת חופש טרנסלציונית באיסוף האור הלבן‬ ‫מהספיר שולטת על גודל הקרן בגביש ה‪ .BBO-‬עדשה ממקדת הממוקמת על‬ ‫טרנסלטור לפני הספיר‪ ,‬יחד עם דרגת חופש רוטציונית וה‪) VA-‬ר"ת ‪Variable Absorber‬‬ ‫– איור ‪ ,( 3.5‬השולט על עוצמת הפולס הנכנס לספיר‪ ,‬שולטות על האיכות )עוצמה‪,‬‬ ‫צורה ויציבות( של הפילמנט‪ .‬דרגת חופש טרנסלציונית נוספת שולטת על התזמון‬ ‫היחסי בין הפולס הלבן לפולס ה‪ .Fundamental-‬כיוון שהפולס הלבן הוא ‪,Chirped‬‬ ‫דרגת חופש זו בוחרת את אורכי הגל המוגברים‪.‬‬ ‫דרגת חופש חשובה נוספת היא הזווית ‪ θ‬בגביש ה‪ .BBO-‬וריאציה בזוית זו משפיעה‬ ‫ישירות על התאמת הפאזות בין האור הלבן ל‪ ,Booster-‬ובכך משפיעה על המבנה‬ ‫‪58‬‬ ‫הספקטראלי של הפולס היוצא‪ .‬באיור ‪ 3.6‬למעלה מוצגים ספקטראות אופייניים של‬ ‫הפולס המתקבל במוצא של ה‪.NOPA-‬‬ ‫מאפייני הפולסים‪:‬‬ ‫אנרגיה‪ :‬הצלחנו להגיע להספק מקסימלי של כ‪ .7.5μJ/pulse-‬רזולוציית הזמן‬ ‫המקסימלית אליה הצלחנו להגיע בניסוי ללא כיווץ כלל היא )‪.63fs (FWHM‬‬ ‫החישוב המדויק של רזולוציית‬ ‫הזמן נעשה ע"י מדידת סיגנל על‬ ‫) ‪I n te n s ity ( a r b . u n its‬‬ ‫לוחית סיליקון באיכות אופטית משני‬ ‫צידיה‪ .‬פיסת הסיליקון נותנת סיגנל‬ ‫ארוך מאוד לצרכים שלנו ולכן ניתן‬ ‫להתייחס אליו כאל פונקציית מדרגה‪.‬‬ ‫מכאן‪ ,‬שצורת הסיגנל בזמן‪ ,‬בהנחה‬ ‫‪2100‬‬ ‫הפולסים‬ ‫ששני‬ ‫גאוסיים‪,‬‬ ‫‪1800‬‬ ‫‪1200‬‬ ‫‪1500‬‬ ‫) ‪λ (n m‬‬ ‫היא‬ ‫קונבולוציה של ‪ 2‬גאוסיאנים )שהוא‪,‬‬ ‫למעשה‪,‬‬ ‫ברוחב‬ ‫גאוסיאן‬ ‫‪General model:‬‬ ‫פונקציית‬ ‫)))‪f(x) = a*exp(-(x-x0)^2/(2*(sigma^2‬‬ ‫‪Coefficients (with 95% confidence bounds):‬‬ ‫)‪a = 0.002342 (0.002177, 0.002507‬‬ ‫)‪sigma = 27.17 (24.96, 29.38‬‬ ‫)‪x0 = 1180 (1178, 1182‬‬ ‫מדרגה‪ .‬תוצאה של חישוב זה נותנת‪,‬‬ ‫‪Goodness of fit:‬‬ ‫‪SSE: 4.625e-006‬‬ ‫‪R-square: 0.9063‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪( σ total =√ σ 1+σ 2‬‬ ‫עם‬ ‫עד כדי קבוע‪ ,‬אינטגרל על גאוסיאן‬ ‫)איור‬ ‫‪3.3‬‬ ‫למטה(‪.‬‬ ‫לכן‪,‬‬ ‫גזירת‬ ‫הטרנזיאנט נותנת גאוסיאן המתאר את‬ ‫רוחב הקונבולוציה בין ה‪ Pump-‬ל‪-‬‬ ‫‪.Probe‬‬ ‫)‪t (fs‬‬ ‫איור ‪ :3.6‬למעלה‪ :‬ספקטרום פליטה אופייני במוצא מה‪NIR-‬‬ ‫‪ .NOPA‬למטה‪ :‬חישוב רזולוציית הזמן ע"י התאמה של גאוסיאן‬ ‫)באדום( לנגזרת )בשחור( של תוצאות נסיוניות )בכחול(‪.‬‬ ‫בהנחה שאורך הפולס ב‪ 800nm-‬הוא כ‪ ,30fs-‬אורך הפולס של ה‪ NOPA-‬הוא‬ ‫‪√ 632−30 2≃55 fs FWHM‬‬ ‫‪ .‬ניתן‪ ,‬תאורטית‪ ,‬להגיע לפולסים קצרים בהרבה‪ ,‬לאיזור ה‪-‬‬ ‫‪ ,15fs‬אך זה ידרוש כיווץ פסיבי )באחת מהשיטות הבאות‪ :‬זוג פריזמות‪ ,‬קומפרסור‬ ‫שריגים או ‪ (Chirp Mirrors‬או אקטיבי )מראה מתעוותת או ‪.(Liquid Crystal‬‬ ‫חשוב לומר כי אחת התוצאות שה‪ GF -‬נותן הוא רוחב הגאוסיאן בזמן‪ .‬עם זאת‪,‬‬ ‫רוחבו של גאוסיאן זה יהיה ארוך משמעותית מהרזולוציה של תגובת המערכת עקב‬ ‫‪59‬‬ ‫הרחבת התגובה‪ ,‬הנגרמת ע"י ‪) GVM‬ר”ת ‪ ,Group Velocity Mismatch‬הכוונה היא‬ ‫להפרש בין מהירות החבורה של שני הפולסים( בתוך הדגם‪.‬‬ ‫תוצאות‪rPSB & BR :‬‬ ‫בפרק זה אציג תוצאות של סדרת ניסויים בתחום ה‪ NIR-‬שבו אבדוק ישירות האם‬ ‫מערכת ה‪ rPSB-‬בממס היא מערכת בעלת שתי או שלוש רמות אלקטרוניות פעילות‬ ‫בתהליך הפוטואיזומריזציה‪ .‬כמו כן נשווה תוצאות אלה לתוצאות בחלבון ה‪.BR-‬‬ ‫בליעת רמת היסוד של מולקולת ה‪ rPSB-‬בפאזה מעובה של מתנול ממוקמת סביב‬ ‫ה‪ 450-‬ננומטר )מוצגת באיור ‪ 3.8‬בקו הכחול(‪ .‬צורת הבליעה חלקה וללא מאפיינים‬ ‫מיוחדים פרט לזנב שנמשך לכחול‪ .‬את ה‪ rPSB-‬עיררנו ב‪ 2-‬אורכי גל‪ 390 :‬נ"מ ו‪480-‬‬ ‫נ"מ‪ ,‬וזאת ע"מ לבדוק את מידת ההשפעה שיש לעודף אנרגיית הפוטון שקיימת בעירור‬ ‫בצד ה"כחול" של הבליעה לעומת הצד ה"אדום"‪ .‬ספקטרום הבליעה של חלבון ה‪BR -‬‬ ‫)מוצג באיור ‪ 3.8‬בקו אדום( ממוקם סביב ‪ 570‬נ"מ וחלק אף הוא‪.‬‬ ‫העירור‬ ‫של‬ ‫החלבון‬ ‫בוצע‬ ‫באמצעות פולס באורך גל של ‪580‬‬ ‫נ"מ‪ .‬בולטת ההשפעה של הזחת‬ ‫אופסין‪ ,‬המביאה את בליעת מצב‬ ‫היסוד‬ ‫של‬ ‫ה‪rPSB-‬‬ ‫מ‪400-‬‬ ‫נ"מ‬ ‫באתנול ל‪ 570-‬נ"מ בחלבון ה‪.BR-‬‬ ‫באיור ‪ 3.9‬רואים את מפת ה‪ΔOD-‬‬ ‫עבור‬ ‫‪rPSB‬‬ ‫מעורר‬ ‫ב‪400-‬‬ ‫נ"מ‪,‬‬ ‫כאשר ציר ה‪ x-‬הוא אורך הגל‬ ‫בננומטרים וציר ה‪ y-‬הוא ציר הזמן‬ ‫איור ‪ :3.8‬בקו האדום מוצג ספקטרום הבליעה של ‪ .BR‬בקו הכחול‬ ‫מוצג ספקטרום הבליעה של ‪ .rPSB‬בסגול ותכלת מוצגים ספקטראות‬ ‫הפולסים בהם השתמשנו לעירור של ‪ .rPSB‬בצהוב מוצג הפולס בו‬ ‫השתמשנו לעירור של ‪.BR‬‬ ‫בפיקושניות‪ .‬במפה רואים בליעה חזקה שנעלמת בסקלת זמנים של עשרות‬ ‫פמטושניות‪ ,‬החוצה כמעט את כל הטווח הספקטראלי ב‪.NIR-‬‬ ‫‪60‬‬ ‫איור ‪ :3.9‬בצד שמאל של הגרף תוצאות עבור עירור ב‪ 390-‬נ”מ‪ ,‬בצד ימין של האיור תוצאות עבור עירור ב‪ 480-‬נ"מ‪.‬‬ ‫חלק עליון‪ :‬ספקטרום טרנזיאנטי רב ערוצי עבור ‪ rPSB‬בזמנים שונים‪ :‬זמנים קצרים )עד פיקו'( למעלה‬ ‫וזמנים ארוכים )עד ‪ 15‬פיקו'( באמצע‪.‬‬ ‫חלק תחתון‪ :‬מפה של )‪ Δ OD ( λ , t‬מוצגת לפי סרגל הצבעים הנמצא בין שתי המפות‪.‬‬ ‫עם העירור נוצרת בליעה מהירה בכל ה‪ .NIR-‬בליעה זו דועכת תוכ כמה עשרות‬ ‫פמטושניות‪ .‬בחלוף הבליעה המהירה בחלק ה"כחול" של המפה‪ ,‬מופיעה פליטה‬ ‫מאולצת‪ ,‬שבמקום לדעוך בכיוון ה‪ IR-‬כצפוי מפליטה של מצב מעורר‪ ,‬הפליטה הופכת‬ ‫לבליעה חלשה באיזור ה‪ 1300-‬נ"מ‪ .‬סקלת הזמנים לדעיכת הבליעה והפליטה נראה‬ ‫זהה‪ ,‬כ‪ 2-‬פיקושניות‪ .‬מהספקטראות הטרנזיאנטיים ניתן לראות נקודה אזאזבסטית‬ ‫בזמנים הארוכים מ‪ 300-‬פמטו' הנמצאת ב‪ 1300-‬נ"מ‪ 1mOD ,‬מעל האפס‪ ,‬תצפית‬ ‫שיכולה להצביע כבר בשלב זה על כך שהבליעה והפליטה הן מדד לאיכלוס של‬ ‫אותה רמה אלקטרונית‪ .‬אם נסתכל על זמנים ארוכים‪ ,‬מעל ‪ 10‬פיקו' נוכל להבחין‬ ‫בשני הניסויים בצורון ארוך חיים‪ ,‬כאשר עבור עירור ב‪ 480-‬נ"מ חוזק בליעתו הוא על‬ ‫גבול שגיאת המדידה לעומת בליעה בכל ה‪ NIR-‬עבור עירור ב‪ 400-‬נ"מ‪.‬‬ ‫קיימים עוד כמה הבדלים בתוצאות של שני הניסויים‪:‬‬ ‫‪61‬‬ ‫המעבר מפליטה לבליעה בעירור ב‪ 480-‬נ"מ נמצא ב‪ 1320-‬נ"מ לעומת ‪ 1300‬נ"מ‬ ‫•‬ ‫עבור העירור ב‪ 400-‬נ"מ‪.‬‬ ‫•‬ ‫זמן החיים של הרכיב המהיר נראה‪ ,‬על פניו‪ ,‬קצר יותר בניסוי השני )‪ 480‬נ"מ(‪.‬‬ ‫•‬ ‫מבנה ספקטרלי בבליעה המהירה‪.‬‬ ‫•‬ ‫מבנה ספקטרלי בבליעה האיטית‪.‬‬ ‫משמעות ההבדלים הספקטרליים נדונה במעבדתנו לפני מספר שנים‪ ,‬אז נעשה‬ ‫‪49‬‬ ‫ניסוי‬ ‫על ה‪ rPSB-‬בו העירור היה זהה וה‪ Probe-‬היה בתחום הנראה‪ .‬המסקנה הייתה‬ ‫כי קיימת אנאיזוטרופיה במצב היסוד של ה‪.rPSB-‬‬ ‫כמו כן‪ ,‬חשוב לציין כבר כאן‪ ,‬שהצורון המהיר גובל ברזולוציית הזמן שלנו‪ ,‬מה‬ ‫שיוצר מספר בעיות‪:‬‬ ‫• חובת ההוכחה כי מדובר במצב אלקטרוני אמיתי ולא בתופעה לא ליניארית‪,‬‬ ‫הגורמת לכך שאנו רואים איזושהי קרוסקורלציה בין שני הפולסים של הניסוי‪.‬‬ ‫• בהנחה שמדובר בצורון אמיתי‪ ,‬הספקטרום שאנחנו רואים יהיה מושפע מהמון‬ ‫גורמים‪ :‬שינוי ברזולוציית הזמן בין אורכי הגל השונים של ה‪ Probe -‬ותיקון ‪GDD‬‬ ‫לא מושלם עלולים לעוות את הספקטרום‪.‬‬ ‫על נושאים אלה ארחיב בפרקים הבאים‪.‬‬ ‫על מנת להגדיל את כמות האינפורמציה שיש בידינו אודות מערכות אלה יש צורך‬ ‫באנליזה באמצעותה נוכל להבין טוב יותר כל שלב בתגובה הפוטוכימית‪.‬‬ ‫ניתוח התוצאות בשיטת ה‪GF-‬‬ ‫בפרק זה אציג תוצאות של שימוש בשיטת ה‪ GF-‬ע"מ לחלץ קבועי זמן‬ ‫וספקטראות של כל מצבי המעבר‪ .‬המודל בו השתמשנו עבור עירור ב‪ 390-‬נ"מ מניח‬ ‫סדרת תגובות עוקבות מסדר ראשון‪ ,‬כאשר לאחר העירור האוכלוסיה מתחלקת ל‪:2 -‬‬ ‫הראשונה מביאה ל‪ ,IC-‬והשנייה מביאה לתוצר ארוך‪-‬חיים כלשהו ונשארת שם‬ ‫)בסקלת הזמנים שלנו(‬ ‫‪1 / τ4‬‬ ‫‪1/ τ 3‬‬ ‫‪1/ τ 2‬‬ ‫‪1/ τ 1‬‬ ‫‪1 / τ5‬‬ ‫‪ . P ← A∗ → B ∗ → C ∗ → D ∗ → A‬עבור העירור ב‪ 480-‬נ"מ‬ ‫השתמשנו במודל ‪) EADS‬ר"ת ‪ (Evolution Associated Difference Spectra‬רגיל )אותו‬ ‫המודל רק ללא הצורון המקביל ‪ ,(P‬זאת כי ככל הנראה עוצמת התוצר ‪ P‬קטנה ככל‬ ‫‪62‬‬ ‫שמעוררים באנרגיה נמוכה יותר‪ .‬בניסוי ספציפי זה עוצמת הסיגנל הנובעת מהתוצר ‪P‬‬ ‫היא בגבול הרעש‪.‬‬ ‫איור ‪ :3.10‬באיור זה רואים תוצאות עבור ‪ .GF‬צד שמאל עבור עירור ב‪ 390-‬נ"מ וימין עבור עירור ב‪ 480-‬נ"מ‪ .‬החלק‬ ‫העליון מראה ‪ EADS‬עבור כל אחד מצורוני המעבר ואת זמן חייו‪ .‬בחלק התחתון ניתן לראות את טיב ההתאמה לחתכים בציר‬ ‫הזמן‪.‬‬ ‫שיקולי בחירת המודל‪ :‬נרצה שהמודל הנבחר יתאר בצורה טובה מערכת הכוללת‬ ‫מספר רמות אלקטרוניות פעילות ומצב בו האוכלוסיה מעוררת למצב העליון ומשם‬ ‫יורדת למצבים הנמוכים ללא פיצול של האוכלוסיה‪ ,‬בדומה למודל ‪ 3‬הרמות )איור ‪1.10‬‬ ‫מימין(‪ .‬ידוע לנו כי מודל זה לא יכול לתאר במדוייק את הקינטיקה המקבילה שמציע‬ ‫‪) Zgrablic etal‬איור ‪ (1.9‬וגם ידוע לנו כי על סמך התוצאות שנקבל לא נוכל להפריכו‪.‬‬ ‫חשוב לציין כי אין לנו כוונה להצהיר שמודלים אלה הם המודלים האפשריים‬ ‫היחידים למערכת‪ .‬כיוון שכך‪ ,‬אין לייחס משמעות לספקטראות המתקבלות‪ ,‬כי הן‬ ‫תשתנינה עבור מודל שונה מהמודל בו השתמשנו‪ .‬מטרתנו כאן היא להראות את‬ ‫הדמיון בין תוצאות אלה לתוצאות הידועות זה מכבר בנראה‪ ,‬ולבדוק את האפשרות‬ ‫לקיומם של מצבים אלקטרוניים שטרם נראו‪.‬‬ ‫מהתוצאות של ה‪ GF-‬עבור ה‪ rPSB-‬ניתן לראות דפוס התנהגות דומה ב‪2-‬‬ ‫הניסויים‪ :‬רכיב מהיר הדועך בסקלת זמנים של עשרות פמטו' )איור ‪ 3.9‬למעלה(‬ ‫‪63‬‬ ‫ואחריו דעיכה תלת‪-‬אקספוננציאלית בסקלת הזמנים של כשליש פיקו'‪ ,‬שתי פיקו' וכ‪-‬‬ ‫‪ 7.5‬פיקו'‪ .‬באופן לא מפתיע‪ ,‬תוצאות אלה זהות לתוצאות בנראה )בטווח השגיאה(‪.‬‬ ‫במאמר של ‪ 31B. Hou etal‬משנת ‪ ,2007‬יוחסו זמנים אלה לאכלוס של הרמה ‪.S1‬‬ ‫דיון בתוצאות‬ ‫בתחום הנראה של הספקטרום הטרנזיאנטי ראינו הלבנה‬ ‫)‪ ,Bleach‬העדר בליעה‬ ‫‪49‬‬ ‫של מצב היסוד( באזור הבליעה של מצב היסוד‪ ,‬שהופך לבליעה חזקה‪ ,‬עם הסחה‬ ‫לאדום‪ ,‬שנהוג לשייך אותה למעבר האופטי בין הרמות ‪ S1‬ו‪) Sn-‬איור ‪ .(3.11‬בליעה‬ ‫חזקה זו עוברת עם אורך הגל לפליטה בעלת מבנה דו‪-‬דבשתי‪ ,‬המיוחסת למעבר‬ ‫מהצורון‬ ‫האופטי‬ ‫בחזרה‬ ‫‪I‬‬ ‫ל‪) S0-‬לפי מודל של שלוש רמות אלקטרוניות פעילות אופטית(‪ .‬פליטה זו רדודה‬ ‫מהמצופה ובעלת מבנה דו‪-‬דבשתי‪ ,‬למרות שבמאמרו‪ 23G. Zgrablic etal ,‬פרסם תוצאות‬ ‫עבור פליטה ספונטאנית המראות פליטה ללא מבנה בתחום זה‪ ,‬עם מקסימום פליטה‬ ‫באזור ה‪ 720-‬נ"מ‪ .‬הימצאות בליעה בעלת‬ ‫שיא באזור ‪ ‰ 750‬נ"מ‪ ,‬יכולה להסביר את‬ ‫‪-1‬‬ ‫) ‪ν (cm‬‬ ‫‪6,000‬‬ ‫‪21,000 18,000 15,000 12,000 9,000‬‬ ‫)‪∆ OD @ 250 fs (Ref. 8a‬‬ ‫)‪∆ OD @ 250 fs (this study‬‬ ‫המבנה הדו‪-‬דבשתי‪.‬‬ ‫)‪∆ OD (a. u.‬‬ ‫תוצאה זו מחזקת את הטענה של ‪P. A.‬‬ ‫‪ , Anfinrud‬כי קיימת חפיפה ספקטרלית בין‬ ‫בליעה לפליטה בתחום זה‪ .‬כמו כן‪ ,‬זהו‬ ‫המקום לציין‪ ,‬כי המודל של ‪G. Zgrablic etal‬‬ ‫המדבר על כך שהמעבר מ‪ S2-‬ל‪ S1-‬אינו‬ ‫מתרחש )איור ‪ ,(1.9‬נופל במבחן הניסיון‪ .‬זאת‬ ‫משום‬ ‫שהפליטה‬ ‫נמשכת‬ ‫עמוק‬ ‫ל‪,NIR-‬‬ ‫‪1.2 1.51.8‬‬ ‫‪0.9‬‬ ‫)‪λ (µ m‬‬ ‫‪0.6‬‬ ‫איור ‪ :3.11‬הדבקה של התוצאות עבור הספקטרום‬ ‫הטרנזיאנטי ב‪ NIR-‬לתוצאות בתחום הנראה‪250 ,‬‬ ‫פמטו' מרגע העירור‪.‬‬ ‫לאזורים המתאימים למעבר בין רמות אלה‪ .‬כמו כן‪ ,‬אם המעבר האופטי מ‪ S1-‬ל‪S2-‬‬ ‫קיים‪ ,‬אזי המעבר ההפוך מותר גם כן‪.‬‬ ‫התוספת שלנו בתחום ה‪ NIR-‬מראה על קיום של בליעה רדודה עוד יותר בתחום‬ ‫הספקטרלי ‪ 1.3‬מיקרון עד לפחות ‪ 2.2‬מיקרון‪ ,‬סף יכולת הגילוי שלנו )איור ‪,3.11‬‬ ‫החלק האפור(‪ .‬ספקטרום בליעה טיפוסי מתאפיין בעליה מהירה בחלק האדום וזנב‬ ‫הנמשך לכחול‪ .‬תופעה זו נובעת מבליעה ומעבר למצבי ויברציה גבוהים‪ .‬לפליטה‬ ‫‪64‬‬ ‫תמונת ראי של הבליעה בציר האנרגיה‪ :‬עליה בכחול וזנב לאדום‪ ,‬גם כאן עקב פליטה‬ ‫ומעבר למצבים ויברציוניים גבוהים‪ ,‬ניתן לשער שגם הבליעה בתחום זה )‪1300-2200‬‬ ‫מיקרון( חופפת‪ ,‬לפחות חלקית‪ ,‬עם פליטה מאולצת‪ .‬אם כך‪ ,‬מדובר במעברים‬ ‫אופטיים באנרגיה נמוכה משמעותית מהמעברים עליהם דווח בספרות המדעית עד‬ ‫כה‪.‬‬ ‫מעברים אלה מראים קינטיקה זהה‬ ‫לבליעה‬ ‫ופליטה‬ ‫המתועדות‬ ‫בנראה‬ ‫)איור ‪ ,(3.12‬ולכן מדובר בשני מעברים‬ ‫המלמדים על איכלוס של אותה רמה‬ ‫אלקטרונית‬ ‫‪.S1‬‬ ‫ההבדל‬ ‫בספקטרום‬ ‫הבליעה נובע מכך שהמעבר בנראה‬ ‫הוא ל‪ Sn-‬והמעבר ב‪ NIR-‬יהיה ל‪.S2-‬‬ ‫אינטרפרטציה זו של התוצאות מחייבת‬ ‫השוואה למודל שלוש הרמות עבור‬ ‫איור ‪ :3.12‬בכחול‪ :‬בליעה של המצב המעורר בנראה‪.‬‬ ‫באדום‪ :‬בליעת המצב המעורר ב‪ NIR-‬לאחר הזזה אנכית‪.‬‬ ‫באפור‪ :‬אותה בליעה ללא הזזה‪.‬‬ ‫חלבון ה‪) BR-‬למשל כפי ש‪ Kobayashi etal-‬מציג‪ ,‬איור ‪ (2.3‬ואף למודל הסטנדרטי‬ ‫התלת רמתי עבור הקרוטנואידים )איור ‪ 1.10‬משמאל(‪.‬‬ ‫ההשוואה ל‪ BR-‬מתבקשת‪ :‬זמני החיים של הרמות‬ ‫המעוררות מתקצרים עקב השפעת החלבון‪ .‬זמן המעבר מ‪-‬‬ ‫‪ H‬ל‪ I-‬מתקצר בפקטור ‪ 3-4‬לכ‪ 500-‬פמטו' וזמן החיים‬ ‫למעבר מ‪ I-‬ל‪ J-‬מתקצר עד כדי כך שאכלוס המצב ‪ J‬נשמר‬ ‫נמוך כל הזמן‪ ,‬כלומר קצר מ‪ 500-‬פמטו'‪ .‬משתנה גם היחס‬ ‫בליעה‪-‬פליטה‪ ,‬אבל זה לא אומר לנו הרבה כי אין לנו דרך‬ ‫לנתח את אזור החפיפה בין בליעה לפליטה‪ .‬ככלל חייבים‬ ‫לציין כי על סמך תוצאות ראשוניות ב‪ NIR-‬קיים דמיון לא‬ ‫מבוטל בין התוצאות עבור ‪ BR‬לאלה עבור ה‪ rPSB-‬ועל כך‬ ‫נרחיב בהמשך‪.‬‬ ‫איור ‪ :3.13‬מצבי סימטריה של‬ ‫מודל ‪ 3‬רמות כפי שמתואר ע"י‬ ‫‪.M. Garavelli etal‬‬ ‫השוואה לא פחות מעניינת היא ההשוואה למעברי האנרגיה בקרוטנואידים‪ .‬ננסה‬ ‫להסביר דמיון זה ברמה התאורטית‪ .‬הקרוטנואיד והרטינאל מתבססים על שלד של‬ ‫פוליאני‪ ,‬מה שמגדיר את מבנה רמות ה‪ π-‬בצורה דומה בשני המקרים‪ .‬ברוב‬ ‫‪65‬‬ ‫הקרוטנואידים מספר הקשרים הכפולים גדול מברטינאל מה שגורם לדיפול המושרה‬ ‫להיות חזק‪ .‬בנוסף מחקרים הראו כי זה מנמיך את מחסום הפוטנציאל‬ ‫את סדר הרמות‬ ‫‪48‬‬ ‫‪33‬‬ ‫ל‪ ICT-‬והופך‬ ‫‪ Ag‬ו‪ .Bu -‬קרוטנואיד מעורר עובר ‪ IC‬דרך אחד משני צורוני המעבר‬ ‫הבאים‪:‬‬ ‫‪ .1‬צורון מעבר יוני‪ :‬כתוצאה מהעירור מתרחשת העברת מטען פנים‪-‬מולקולרית‬ ‫)‪ (ITC‬הגורמת ליצירת דיפול חזק הגורמת ל‪ .IC-‬מצב זה שייך לקבוצת‬ ‫‪1‬‬ ‫‪. 1 Bu‬‬ ‫הסימטריה‬ ‫‪ .2‬קוולנטי‪ :‬היווצרות של רדיקלים בכצוות של הקרוטנואיד בצורה סימטרית‪ .‬מצב‬ ‫זה שייך לסימטריה‬ ‫‪1‬‬ ‫‪. 2 Ag‬‬ ‫רמת הייסוד בקרוטנואידים שייכת לקבוצת הסימטריה ‪ A g‬ולכן המעבר ממנה‬ ‫לרמה מאותה קבוצה אסור‪ .‬לכן המעבר מתרחש לרמה מקבוצת הסימטריה‬ ‫‪1‬‬ ‫‪, 1 Bu‬‬ ‫שזה מצב מעבר של רזוננס בין שני הדיפולים האפשריים‪) 50‬איור ‪ 3.13‬למעלה(‪.‬‬ ‫אם נסתכל בצורה זו על ה‪ ,rPSB-‬הרי‬ ‫שמומנט דיפול חזק קיים מלכתחילה‪ ,‬וקבוע הזמן‬ ‫לדעיכת מצב היסוד דומה לקרוטנואיד עם ‪.N>11‬‬ ‫לא ניתן להזניח את העובדה כי קיים דמיון‬ ‫האלקטרונים‬ ‫מבחינת‬ ‫מבנה‬ ‫המתילית‬ ‫לקבוצה‬ ‫בין‬ ‫האלדאמינית‬ ‫הקבוצה‬ ‫עם‬ ‫המטען‬ ‫החיובי‪ ,‬קרי‪ ,‬בסיס השיף‪ .‬ההבדל המהותי היחיד‬ ‫הוא‬ ‫הדיפול‪,‬‬ ‫שבתורו‬ ‫גורם‬ ‫להתנהגות‬ ‫אנטיסימטרית )לא מושלמת( לאינברסיה‪ ,‬לעומת‬ ‫קבות ‪ A g‬הסימטרית‬ ‫לאינברסיה‪.‬‬ ‫לכן‪,‬‬ ‫מצב‬ ‫היסוד יהיה דומה באופיו לקבוצת הסימטריה‬ ‫‪ . Bu‬חישובים תאורטיים של ‪M. Garavelli etal‬‬ ‫‪50‬‬ ‫הראו כי במצב זה יכול להתקיים חתך קוני בין‬ ‫איור ‪ :3.14‬ירידת הרמה ‪ S2‬אל מתחת ל‪ .S1-‬כך‬ ‫נוצר מחסום הפוטנציאל הגורם לכך שהרמה ‪S2‬‬ ‫הופכת פעילה אופטית‪.‬‬ ‫הרמות ‪ S1‬ו‪ S2-‬ובכך לגרום להיווצרות של מינימום לוקאלי על המשטח המעורר‬ ‫העליון‪.‬‬ ‫‪66‬‬ ‫מחקר תאורטי זה מחזק את הטענה שלנו‪ ,‬כי אנו רואים את המעבר ‪ S1-S2‬בדומה‬ ‫לקרוטנואידים בספקטרוסקופיית ‪.NIR‬‬ ‫דנו בממצא העיקרי של המחקר של ה‪ rPSB-‬שהוא הבליעה בסקלה של כ‪-‬‬ ‫פיקושניה בתחום הספקטראלי ‪ 1300-2200‬נ"מ‪ ,‬והצגנו את מסקנתנו כי מדובר במעבר‬ ‫האופטי בין הרמות המעוררות ‪ .S1→S2‬כעת‪ ,‬הגענו לממצא השני‪ ,‬והוא הבליעה החזקה‬ ‫שעולה מיד עם העירור ודועכת תוך עשרות פמטו'‪ ,‬המשתרעת בכל התחום‬ ‫הספקטרלי‪ .‬השאלות המרכזית שעלינו לענות עליה הן‪:‬‬ ‫‪ .I‬האם ברזולוציית הזמן שלנו יש ביכולתנו לזהות צורון שתוחלת חייו היא עשרות‬ ‫פמטו'‪.‬‬ ‫‪ .II‬האם לא מדובר בתופעה של ‪ .Coherent Artifact‬הכוונה היא לעשות קרוס‪-‬‬ ‫מודולצייה של פאזות ה‪ Probe-‬ע"י פולס ה‪.Pump-‬‬ ‫רזולוציית הזמן שלנו מגבילה אותנו בזמני החיים אותם אנו מסוגלים לראות מכדי‬ ‫שנוכל לספק אינפורמציה מלאה לגבי זמני חיים הארוכים משמעותית מזמן המוגדר‬ ‫ע"י הקונבולוציה של ה‪ Pump-‬עם ה‪ .Probe-‬בקירוב‪ ,‬קונבולוציה של התפלגות עוצמה‬ ‫גאוסית בזמן תיתן לנו גאוסיאן שרוחבו יהיה כשורש ריבועי הרוחב של שני הפולסים‪.‬‬ ‫הצורה של עקומת הזמן הריאלית תהיה קונבולוציה של עקומת הסיגנל‪ ,‬בדרך כלל‬ ‫אקספוננט דועך )או סדרה של אקספוננטים דועכים( עם הגאוסיאן שנוצר‬ ‫מקונבולוציית שני הפולסים‪ .‬עבור אקספוננט דועך עם קבוע ארוך משמעותית מרוחב‬ ‫הגאוסיאן‪ ,‬נקבל צורה של עלייה מיידית )פונקציית מדרגה( ודעיכה אקספוננציאלית‪.‬‬ ‫במצב הפוך‪ ,‬בו קבוע הדעיכה הוא הקצר‪ ,‬נקבל צורה של קונבולוציה של גאוסיאן עם‬ ‫פונקציית ‪ ,δ‬שזה אותו הגאוסיאן‪.‬‬ ‫ארטיפקט הנובע מתגובה לא לינארית הלא‬ ‫רזונטיבית של התווך )הממס(‪ ,‬יכול לגרום לשני סוגי‬ ‫תגובה הבאים לידי ביטוי כשינוי בבליעת הדגם‪:‬‬ ‫‪ (1‬תגובה‬ ‫בצורת‬ ‫גאוסיאן‬ ‫היא‬ ‫תוצאה‬ ‫של‬ ‫התאבכויות בין שני הפולסים ברגע חפיפתם בזמן בתוך‬ ‫איור ‪ :3.15‬ארטיפקט קוהרנטי‬ ‫)למעלה( ובידודו )למטה(‪.‬‬ ‫הדגם‪ ,‬הגורמות לשינוי בעוצמת ה‪ .51Probe-‬תגובה זו חזקה מאוד כאשר הפולסים‬ ‫באותו קיטוב ואותו אורך גל‪ ,‬אך קיימת בעוצמות חלשות גם בפולסים בצבעים שונים‬ ‫‪67‬‬ ‫וקיטובים שונים‪ .‬אורך התגובה בזמן יהיה קונבולוציה של שני הפולסים במקרה ששני‬ ‫הפולסים מכווצים בצורה אופטימלית‪ ,‬אך קצרה הרבה יותר אם פולס ה‪ Probe -‬פרוס‬ ‫בזמן )‪.(Chirped‬‬ ‫‪(2‬‬ ‫ארטיפקט בצורת הנגזרת של אותו גאוסיאן )איור ‪ ,(2.7‬בדומה למנגנון של ה‪-‬‬ ‫‪ ,SPM‬כאשר המודולציה של הפאזה באה לידי ביטוי ב‪ Probe -‬בהשראת ה‪) Pump-‬הרי‬ ‫זה ‪.(XPM, Cross Phase Modulation‬‬ ‫יש לציין כי בעוצמות חזקות של עירור‬ ‫קיימת תופעה תלויית ‪ χ4‬המתנהגת כנגזרת‬ ‫שניה של גאוסיאן ואף סדרים גבוהים יותר‪.‬‬ ‫באיור ‪ 3.16‬ניתן לראות שהמצב הוא‬ ‫מצב ביניים‪ ,‬בו אין אנו רואים אקספוננט‬ ‫ברור‪ ,‬אך גם לא גאוסיאן מושלם‪ .‬באיור זה‬ ‫אנו רואים שלוש התאמות על עקומה‬ ‫נסיונית )נקודות( ב‪ 1300-‬נ"מ‪ ,‬אזור המעבר‬ ‫מבליעה לפליטה של הרמה ‪ .S1‬שתי‬ ‫איור ‪ :3.16‬תוצאות ניסיוניות באזור המעבר מבליעה‬ ‫לפליטה )נקודות(‪ .‬באדום‪ :‬התאמה גאוסית לעליה‪ .‬בכחול‪:‬‬ ‫התאמה גאוסית לירידה‪ .‬בחום‪ :‬התאמה של קונבולוציה‬ ‫של גאוסיאן עם אקספוננט‪ .‬בפינה למעלה ערכי ה‪.SSE-‬‬ ‫התאמות גאוסיות‪ ,‬האחת מותאמת בתחום ‪ 200‬פמטו' עד ‪ 75‬פמטו' והשניה מ‪-20 -‬‬ ‫פמטו' עד ‪ 300‬פמטו'‪ .‬ההתאמה השלישית הינה קונבולוציה של גאוסיאן עם‬ ‫אקספוננט )התאמה של גאוסיאן לכל המבנה נותנת את התוצאה הגרועה ביותר‪ ,‬ולכן‬ ‫לא‬ ‫הצגתי‬ ‫אותה(‪.‬‬ ‫כבר‬ ‫בעין‬ ‫ניתן‬ ‫לראות‬ ‫שהקונבולוציה מתאימה טוב יותר‪ ,‬בפרט הסטיה‬ ‫מההתאמה )‪ (SSE‬קטנה בפקטור של יותר מ‪3-‬‬ ‫עבור הקונבולוציה‪ ,‬כאשר התאמה חופשית של‬ ‫גאוסיאן‬ ‫נותנת‬ ‫שגיאה‬ ‫הגדולה‬ ‫בפקטור‬ ‫‪10‬‬ ‫מהתאמת הקונבולוציה‪.‬‬ ‫יתר על כן‪ ,‬ניסויים על ממס בלבד‪ ,‬בהם רואים‬ ‫איור ‪ :3.17‬ארטיפקט כפי שנראה אצלנו‬ ‫במעבדה‪ ,‬לאחר עירור ממס בעוצמות גבוהות;‬ ‫סכום של גאוסיאן ונגזרת שנייה ושלישית‪.‬‬ ‫ארטיפקט בלבד‪ ,‬נתנו תוצאה הנראית שונה הן בספקטרום והן בזמן מהתוצאה הנ"ל‬ ‫ויחס עוצמת עירור לסיגנל קטן יותר מסדר גודל מבניסוי על ה‪.rPSB-‬‬ ‫ניסוי נוסף שעשינו היה וריאציה בעוצמת ה‪ .Probe-‬גם בניסוי זה לא זיהינו שינוי‬ ‫של המבנה הספקטרלי ושל עוצמת הסיגנל‪ .‬כיוון שכך‪ ,‬המסקנה שלנו היא כי מדובר‬ ‫‪68‬‬ ‫באחד מהשניים‪ :‬תגובה לא לינארית רזונטיבית או צורון מעבר קצר‪-‬חיים‪ .‬בלי כל‬ ‫ספק‪ ,‬בליעה מהירה זו מצביעה על רזוננס אמיתי שקיים ב‪ rPSB-‬עמוק ב‪ .NIR-‬בשלב‬ ‫ראשוני זה של המחקר אין לנו מספיק אינפורמציה כדי להבין את האופי של מעבר זה‬ ‫ואת משמעותו‪ .‬יכול להיות שמדובר בבליעה של ‪ I‬חם‪ ,‬כמו גם בליעה של רמה‬ ‫אלקטרונית נוספת באזור החתך הקוני ‪ .‬על מנת להבין את אופיו של המעבר עלינו‬ ‫לשפר את רזולוציית הזמן שלנו לאזור ה‪ 20-‬פמטו ומטה‪.‬‬ ‫חשוב לציין שבתזה של ‪ ,52G. Zgrablic‬בה‬ ‫הוא משווה בליעה ופליטה של ה‪ rPSB-‬בממסים‬ ‫שונים‪,‬‬ ‫הערך‬ ‫המחולץ‬ ‫עבור‬ ‫ההסחה‬ ‫)‬ ‫‪ (Displacement‬של אופן התנודה של מתיחת‬ ‫הקשר ‪) C=C‬בתדר ‪ ( 1,562 cm−1‬הוא ‪D=2.69‬‬ ‫)בהתבסס על אנליזה לפי מודל ‪ .(DHO‬הערך‬ ‫המתקבל הוא גדול מאוד בתיאור של מולקולות‬ ‫במודל זה‪ ,‬והוא יכול להעיד על כך שהפליטה‬ ‫איור ‪ :3.18‬ספקטרום בליעה של מים בנראה‬ ‫וב‪. IR-‬‬ ‫מתרחשת לא מהמצב האלקטרוני הראשון‪ ,‬אלא לאחר מעבר רזונטיבי כלשהו‪.‬‬ ‫אחת ממטרות המחקר הייתה לבדוק האם מולקולת ה‪ rPSB-‬יכולה להוות מערכת‬ ‫מודל עבור התהליכים הראשוניים בחלבונים רטינאליים‪ .‬כחלק מהמאמץ לענות על‬ ‫שאלה זו ביצענו סדרת ניסויים על חלבון ה‪ ,BR -‬והתוצאות עם הפרשנות יוצגו בפרק‬ ‫זה‪.‬‬ ‫תוצאות עבור חלבון ה‪BR-‬‬ ‫בעבודה זו אציג רק את התוצאות הטובות ביותר שהצלחנו להשיג עבור ‪BR‬‬ ‫המעורר ב‪ 580-‬נ"מ ונדגם ב‪) NIR-‬איור ‪ .(3.19‬הקושי הניסיוני במערכת זו הוא עצום‬ ‫עקב הדינמיקה המהירה ב‪ ,BR-‬רזוננס של אחד האופנים החלשים של המים נמצא‬ ‫כבר ב‪ 1500-‬נ"מ )איור ‪ (3.18‬והוא גורם לדיספרסיה חזקה‪ ,‬וזו‪ ,‬כנראה‪ ,‬הסיבה‬ ‫לארטיפקט לא לינארי חזק בעוצמות עירור נמוכות מאוד ) ‪Peak Intensity = 1.3‬‬ ‫‪ ,GW/cm2‬לעומת הניסוי ב‪ rPSB-‬בו נמדד ‪ Peak Intensity = 8.4 GW/cm2‬ללא הופעת‬ ‫ארטיפקט משמעותי(‪.‬‬ ‫‪69‬‬ ‫באיור ‪ 3.19‬נראות תוצאות עבור ניסוי‬ ‫על חלבון ה‪ ,BR-‬שעורר ע"י פולס ב‪580-‬‬ ‫נ"מ‪ ,‬ונבחן ב‪ .NIR-‬גם במקרה זה רואים‬ ‫בליעה‬ ‫הדועכת‬ ‫פמטושניות‪,‬‬ ‫על‬ ‫בסקלה‬ ‫גבול‬ ‫עשרות‬ ‫של‬ ‫הרזולוציה‬ ‫שלנו‪.‬‬ ‫לעומת הניסיוניים הקודמים‪ ,‬התהליך הלא‬ ‫ליניארי בולט בניסוי זה‪ ,‬והוא בא לידי ביטוי‬ ‫בסיגנל‬ ‫שלילי‬ ‫לפני‬ ‫העלייה‬ ‫המהירה‬ ‫)מסומן באליפסה באיור ‪ 3.8‬למטה(‪.‬‬ ‫ב‪ BR-‬קיים גם מעבר מבליעה לפליטה‬ ‫ב‪ ,NIR-‬אך לעומת ה‪ rPSB-‬זהו תהליך‬ ‫דינאמי המתחיל ב‪ 1240-‬נ"מ ועובר לכחול‬ ‫עם הזמן )איור ‪ 3.19‬באמצע(‪ .‬לא זיהינו‬ ‫נקודה אזאזבסטית וצורון שחי מעבר לזמן‬ ‫ההיפוך הפנימי )בטווח השגיאה שלנו(‪.‬‬ ‫איור ‪ :3.19‬ספקטרום טרנזיאנטי רב ערוצי עבור ‪BR‬‬ ‫בזמנים שונים‪ :‬זמנים קצרים )עד ‪ 300‬פמטו'( למעלה‬ ‫וזמנים ארוכים )עד ‪ 5‬פיקו'( באמצע‪.‬‬ ‫חלק תחתון‪ :‬מפה של )‪ Δ OD (λ , t‬מוצגת לפי‬ ‫סרגל הצבעים הנמצא בין שתי המפות‪ .‬הארטיפקט מסומן‬ ‫באליפסה שחורה‪.‬‬ ‫כפי שציינתי קודם‪ ,‬רזוננס של מים מופיע לראשונה ב‪ 1500-‬נ"מ ויוצר דיספרסיה‬ ‫חזקה המורגשת בכל ה‪ .NIR-‬הרזוננס נובע מבליעה של המצב הויברציוני‬ ‫‪53‬‬ ‫‪−1‬‬ ‫‪−1‬‬ ‫) ‪ . ν 1 (3280cm )+ν 3 (3490cm‬מכיוון שארטיפקט קוהרנטי הוא פונקציה של ערכי‬ ‫‪ ̂χ‬אשר גדלים בקרבת רזוננסים‪ .‬נתקלנו בהופעתם בעירור בעוצמה נמוכה‬ ‫משמעותית מבניסוי על ‪ rPSB‬באתנול‪ .‬על מנת לנתח תוצאות הכוללות ארטיפקט‬ ‫משמעותי חייבים לקחת אותו בחשבון כחלק מחישוב ה‪) GF -‬איור ‪ .(3.20‬עשינו זאת‬ ‫ע"י הוספת צורון שהתפתחותו בזמן היא גאוסית ברוחב הפולס המעורר ויש לו‬ ‫ספקטרום מוגדר‪.‬‬ ‫השוני הבולט ביותר בין ה‪ rPSB-‬ל‪ BR-‬בשלב זה הוא הדעיכה ה‪ 4-‬אקספוננציאלית‬ ‫בכרומופור לעומת ‪ 3‬אקספוננטים בחלבון‪ ,‬עם זמנים שונים‪ .‬בנוסף‪ ,‬מצאנו גם דמיון‬ ‫בין הקינטיקה של ה‪ BR-‬לזו של ה‪ rPSB-‬בכמה מובנים‪:‬‬ ‫•‬ ‫הצורון המהיר קיים גם בחלבון‪ .‬זהו גם חיזוק לטענה כי לא מדובר בארטיפקט‪,‬‬ ‫שכן‪ ,‬כאן רואים בבירור גם את הארטיפקט וגם את הצורון המהיר‪.‬‬ ‫‪70‬‬ ‫•‬ ‫זמן חייו של הצורון האיטי קרוב מאוד‬ ‫ב‪ 2-‬הניסויים )‪ 9‬פיקו מול ‪ 8‬ב‪rPSB-‬‬ ‫מעורר ב‪ 400-‬נ"מ(‪.‬‬ ‫•‬ ‫המעבר מבליעה לפליטה קיים ב‪EADS-‬‬ ‫השני‪,‬‬ ‫המשקף‬ ‫את‬ ‫הזמן‬ ‫ל‪IC-‬‬ ‫המתרחש תוך ‪ 550‬פמטו'‪ ,‬ערך הזהה‬ ‫לתוצאות מהספרות‪ .27‬התוצאה תומכת‬ ‫בקיום של שלוש רמות פעילות אופטית‬ ‫גם בחלבון ה‪.BR-‬‬ ‫איור ‪ :3.20‬באיור זה רואים תוצאות עבור ‪ GF‬של‬ ‫חלבון ה‪ BR-‬שעורר ב‪ 580-‬נ"מ ונדגם ב‪ .NIR-‬החלק‬ ‫העליון מראה ‪ EADS‬עבור כל אחד מצורוני המעבר ואת‬ ‫זמן חייו‪ .‬בחלק התחתון ניתן לראות את טיב ההתאמה‬ ‫לחתכים בציר הזמן באורכי גל שונים‪.‬‬ ‫‪71‬‬ ‫סיכום ומבט לעתיד‬ ‫לאור צרכים ניסיוניים של המעבדה‪ ,‬נבנתה מערכת ליצירה וקריאה של פולסים‬ ‫אולטרה‪-‬מהירים בתחום האינפרה‪-‬אדום הקרוב )‪.(NIR‬‬ ‫בתחום יצירת הפולסים‪ ,‬נחקרו אפשרויות להשתמש באור לבן )‪(Supercontinuum‬‬ ‫ובהתקן של הגברה אופטית פרמטרית )‪ .(NIR-NOPA‬לאור הניסיון הנצבר‪ ,‬נראה כי‬ ‫השימוש באור הלבן נמצא מתאים יותר לשמש כפולס הבוחן )‪ (Probe‬בניסויים שבוצעו‬ ‫על מערכות של חלבונים רטינלים ושל ננו‪-‬חלקיקים )לא נסקר בעבודה זו‪ ,‬אך בוצע‬ ‫במעבדה( בשל רוחב הפס וקלות התפעול‪ .‬רזולוצית הזמן שהושגה בניסויי ‪pump-‬‬ ‫‪ probe‬עם המערכת )קרוסקורלציה של שני הפולסים( הייתה כ‪ 50-60 -‬פמטושניות‪ .‬על‬ ‫מנת לשפר את רזולוציית הזמן )עד כדי ‪ 10‬פמטושניות(‪ ,‬יהיה צורך בבניית מערך של‬ ‫כיווץ אקטיבי של ה‪ .NOPA -‬כמו כן‪ ,‬לשם יישומים שדורשים אנרגיה גבוהה יותר‬ ‫לטובת עירור או יצירת תהליכים לא ליניאריים‪ ,‬יהיה צורך בשימוש ב‪.NIR-NOPA -‬‬ ‫בתחום הגילוי‪ ,‬הוכנסו לשימוש שני גלאים מבוססי פוטודיודות מסוג ‪,InGaAs‬‬ ‫המונים כל אחד ‪ 256‬פיקסלים‪ .‬הגלאים‪ ,‬מתוצרת ‪ ,BWTek‬מתאימים לתחום ה‪900- -‬‬ ‫‪ 1600‬ננומטר )“הרגיל"( ו‪ 1100-2200 -‬ננומטר )“המורחב"(‪ .‬לצורך הפעלתם במערכת‪,‬‬ ‫נכתבה תוכנת קריאה המיישמת תקשורת וסנכרון של מערך הקריאה עם המערכת‪.‬‬ ‫תדר הקריאה המירבי הוא ‪ 400‬הרץ‪ ,‬עובדה המאפשרת עבודה ‪ ,pulse-by-pulse‬ללא‬ ‫צורך בערוץ נוסף של ‪.reference‬‬ ‫בעזרת היכולות החדשות‪ ,‬נחקרה הספקטרוסקופיה האולטרה‪-‬מהירה של ה‪-‬‬ ‫‪ RPSB‬וה‪ BR -‬לראשונה בתחום ה‪ ,NIR -‬תוך כדי השוואתם לתכונות הידועות של‬ ‫הקרוטנים בתחום ספקטרלי חשוב זה‪ .‬בהקשר ל‪ ,RPSB -‬המסקנות העיקריות של‬ ‫המחקר הן‪) :‬א( צורך לתאר את הספקטרוסקופיה של המולקולה במערכת של שלוש‪-‬‬ ‫רמות לפחות‪ ,‬בניגוד לטענות קודמות‪ .‬עובדה זו נתמכת ע"י קיומה של רמה אחת‬ ‫הפעילה אופטית ב‪ NIR-‬בדומה למשפחת הקרוטנואידים‪) .‬ב( קיומו של צורון מהיר‪,‬‬ ‫בעל זמן חיים קצר מ‪ 100 -‬פמטושניות ובעל רוחב ספקטרלי עצום הנמשך מהנראה‬ ‫ועד האינפרה‪-‬אדום‪) .‬ג( המשך של הפליטה המאולצת‪ ,‬שתועדה קודם לכן רק עד‬ ‫לכ‪ 950 -‬ננומטר‪ ,‬עמוק לתוך ה‪) NIR -‬עד ‪ 1300‬ננומטר לפחות(‪) .‬ד( קיומה של בליעה‬ ‫עמוק ב‪) NIR -‬החל מ‪ 1300 -‬ננומטר(‪.‬‬ ‫‪72‬‬ ‫תוצאות ראשוניות על מערכת ה‪ BR -‬תומכות במודל דומה‪ ,‬דבר שיכול להיות בעל‬ ‫השלכה עצומה להבנת הספקטרוסקופיה של משפחת החלבונים הרטינאליים‪.‬‬ ‫בנוסף למחקרים שמוצגים בעבודה זו‪ ,‬יושמה המערכת גם לחקר מערכות של‬ ‫חלבונים רטינלים נוספים )קסנטורודפסין‪ ,‬אנאבנה סנסורי רודופסין( ושל מערכות של‬ ‫ננו‪-‬חלקיקים‪ ,‬כאשר חלק מהתוצאות כבר מפורסמות בעיתונות המדעית‪ .‬המערכת‬ ‫מוכיחה את עצמה ככלי חיוני בהשלמת פערי הידע במערכות השונות בתחום‬ ‫הספקטרלי החדש‪.‬‬ ‫תוכניות לעתיד‪:‬‬ ‫• להגיע לרזולוציית זמן גבוהה יותר במטרה לאפיין את הצורון קצר החיים בצורה‬ ‫יותר משכנעת ב‪ rPSB-‬וב‪ ,BR-‬ע"י בניית מערך כיווץ אקטיבי ל‪.NOPA -‬‬ ‫• ביצוע ניסוי פליטה טרנזיאנטית )שת"פ( על מנת לבודד את הבליעות ואת‬ ‫הפליטות במערכות אלה‪ ,‬על מנת לפתור את בעיית חפיפת הבנדים‬ ‫הספקטרליים‪.‬‬ 73 Abstract Near-IR ultrafast probing and detection setup was built in order to enhance the spectral range of femtosecond pump-probe spectroscopy in our lab. The new setup, which includes NIR white light supercontinuum generation, two InGaAs photodiode array light detectors and electronic triggering system is now readily used in our lab to study ultrafast dynamics of retinal proteins and nanocrystals in a probing region which was inaccessible before” procedure of its building and implementation are discussed within the text. Here, we present the results of an ultrafast study of the All-trans Retinal Protonated Schiff Base (RPSB), as an example to the new capabilities. A UV pump / hyperspectral near-IR (NIR) probe study of RPSB in ethanol is presented. Upon irradiation, a short lived absorption band covers the recorded range from l=1-2 mm. It decays to reveal the tail of S1 emission at l<1.3 mm, along with a residual absorption at longer wavelengths, both of which decay with the known kinetics of internal conversion to S0. The existence of this hitherto unrecorded excited state absorption deep in the NIR will require a revision of current models for RPSB electronic structure. The phenomenological similarity of these observations with ultrafast NIR studies of carotenoids raises the question of whether three, and not two, electronic states participate in RPSB photochemistry. The relevance of these observations to retinal protein photochemistry is discussed. 1 J. L. Spudich, C. S. Yang, K. H. Jung, E. N. Spudich, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000, 16, 365–392. 2 D. Oesterhelt, J. Tittor, TIBS, 1989, feb., 57-61. 3 S. Matuschka, K. Zwicker, T. Nawroth, G. Zimmer, Archives of Biochem. and Biophys., 1995, 322, 1, 135-142. 4 J. Krupinski, G. G. Hammes, 1986, 83, 4233-4237. 5 D. Oesterhelt, W. Stoeckenius PNAS 1973, 70, 10, 2853-2857. 6 H. Michel, D. Oesterhelt, R. Henderson PNAS 1980 77, 1, 338-342. 7 E. Racker, W. Stoeckenius, The Journal of Biological Chemistry, 1974, 249, 2, 662-663. 8 R. Hartmann, H. D. Sickinger, D. Oesterhelt, 1980, 77, 6, 3821-3825. 9 R. Henderson, P. N. T. Unwin, Nature, 257, 28-32. 10 R. Henderson, J. M . Baldwin, T. A. Ceskat F. Zemlin, E. Beckmann, K. H. Downing, Journal of Molecular Biology, 1990, 213, 899-929. 11 J. Rajput, D. B. Rahbek, L. H. Andersen, A. Hirshfeld, M. Sheves,P. Alto, G. Orlandi, M. Garavelli, Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 1790 –1793. 12 A. Kahan, O. Nahmias, N. Friedman, M. Sheves, S. Ruhman JACS, 2006, 129, 537-546. 13 A. Royant K. Edman, T. Ursby, E. Pebay-Peyroula, E. M. Landau R. Neutz, Photochemistry and Photobiology, 2001, 74(6), 794–804 14 E. Nachliel, M. Gutman, J. Tittor, D. Oesterhelt 15 H. C. Watanabe, T. Ishikura T. Yamato, Proteins, 2009, 75, 53–61. 16 H.J. Sass, I.W. Schachowa, G. Rapp, M.H.J. Koch, D. Oesterhelt, N.A. Dencher G. Büldt, EMBO Journal 1997, 16, 1484 - 1491 17 K. A. Freedman, R. S. Becker, JACS, 1986, 108, 1245-1251. 18 P. Hamm, M. Zurek, T. R. Sschinger, H. Patzelt, D. Oesterhelt, W. Zinth, Chem. Phys. Lett. 1996 263 613-621. 19 B. Hou, N. Friedman, S. Ruhman, M. Sheves, M. Ottolenghi, J. Phys. Chem. B 2001, 105, 7042-7048 20 H. Kandori, Y. Katsuta, M. Ita, H. Sasabet, JACS 1995, 117, 2669-2670 21 L. H. Andersen, I. B. Nielsen, M. B. Kristensen, M. O. A. El Ghazaly, S. Haacke, M. B. Nielsen, M. A. Petersen, JACS 2005, 127, 12347-12350 22 M. Olivucci, A. Lami, F. Santoro, Angew, Chem. Int. Ed. 2005, 44, 5118 –5121. 23 G. Zgrablic´, Stefan Haacke, Majed Chergui, J. Phys. Chem. B, 2009, 113, 4384–4393 24 R. A. Mathies, C. H. B. Cruz, W. T. Pollard, C. V. Shank. Science, 1988, 240, 4853, 777-779. 25 J. Dobler, W. Zinth, W. Kaiser, D. Oesterhelt, Chem. Phys. Letters, 1988, 144, 2, 225-220. 26 L. Song, M. A. El-Sayed, J. K. Lanyi, Science, 1993, 261, 891-894. 27 K. C. Hasson, F. Gai, P. A. Anfinrud, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 15124-15129. 28 J. Fang, J. D. Carriker, V. Balogh-Nair, K. Nakanishi, JACS, 1983, 105, 5162-5164. 29 C. H. Chang, R. Govindjee, T. Ebrey, K. A. Bagley, G. Dollinger, L. Eisenstein, J. Marque, H. RODER, J. Vittitow, J.-M. Fang, K. Nakanishi, BIOPHYS. J., 1985, 47, 509-512. 30 T. Takahashi, K. Yoshihara, M. Watanabe, M. Kubotag, R. Johnson, F. Derguini, Koji Nakanishi, Biochem. & Biophys. Res. Com. 1991, 178, 3, 1273-1279. 31 B. Hou, N. Friedman, M. Ottolenghi, M. Sheves, S. Ruhman, Chemical Physics Letters, 2003, 381, 549–555. 32 B. Hou, N. Friedman, S. Ruhman, M. Sheves, M. Ottolenghi, J. Phys. Chem. B 2001, 105, 7042-7048. 33 T. Poluvka, V. Sundstrom,Chem. Rev., 2004, 104, 2021−2071 34 J. Zurdo, C. fernandez-Cabrera, J. M. Ramirez, Biochem. J. 1993 290, 531-537 35 M. A. J. Rowers, A. l. Bates, Photochemistry and Photobiology. 1980, 31, 533-537. 36 E. Papagiannakis, J. T. M. Kennis, I. H. M. van Stokkum, R. J. Cogdell, R. van Grondelle, PNAS, 2002 ,99 6017–6022. 37 W. Fuu, Y. Haas, S. Zilberg, Chem. Phys., 2000, 259, 273-295. 38 H. A. Frank, J. A. Bautista, J. Josue, Z Pendon, R. G. Hiller, F. P. Sharples, D. Gosztola, M. R. Wasielewski, J. Phys. Chem. B, 2000, 104, 4569-4577 39 Encyclopedia of Laser Physics and Technology BY Rudiger Paschotta. 40 R. Y. Chiao, E. Garmire, C. H. Townes, Phys. Rev. Letters, 1964, 13, 15, 479-482. 41 C.P. Hauri, W. Kornelis, F.W. Helbing A. Heinrich A. Couairon A. Mysyrowicz J. Biegert U. Keller, Appl. Phys. B 2004 79, 673–677. 42 J. Schwarz and J. C. Diels Phys. Rev. A, 65, 013806 (1-10). 43 A. Couairon, M. Franco, A. Mysyrowicz, J. Biegert, U. Keller, Optics Letters, 2005, 30, 19, 2657-2659. 44 R. Bonifacio, L. A. Lugiato, Phys. Rev. A, 1975, 11, 5, 1507-1521. 45 Nonlinear Optics Third Edition BY Robert W. Boyd. 46 T. H. Jeys, Optics Letters 1996, 21, 16, 1229-1231. 47 E. Riedle, M. Beutter, S. Lochbrunner, J. Piel, S. Schenkl∗, S. Spörlein, W. Zinth, Appl. Phys. B 2000 71, 457–465. 48 49 50 51 52 53 D. Brida, G. Cirmi, C. Manzoni, S. Bonora, P. Villoresi, S. De Silvestri, G. Cerullo, Optics Letters, 2008 , 33,7 . O. Bismuth, N. Friedman, M. Sheves, S. Ruhman, Chemical Physics, 2007, 341 267–275 M. Garavelli Theor. Chem. Acc. 2006 116, 87–105. Z. Vardeny, J. Tauc, Optics Communications, 1981, 39, 6, 396-400. G. Zgrablic´, PHD Thesis, University Of Zagreb, Croatia, 2006. M. Stomp, J. Huisman, L. J. Stal, H. C. P. Matthijs, The ISME Journal 2007 1, 271–282.