בקרה אנדוקרינית 62 . , – . כך ות ועכברים ידוע היום היטב של חולד המוח מבנה
בקרה אנדוקרינית 62 נושא :4צריכת מזון ניסויי האכלה בכפייה של חולדות בהם בדקו מהו משקל החולדות וכמה הן אכלו .ניתן לראות שלמרות העלייה המשמעותית במשקל בזמן ההאכלה בכפייה ,המשקל יורד מעט לאחר מכן – המשקל מווסת על ידי החולדה על מנת לחזור לנורמלי. בקרה רעב ושובע – לפטין מבנה המוח של חולדות ועכברים ידוע היום היטב ,כך שניתן לבצע חריכה ולהרוס נקודתית תאי עצב מסויימים; כך ניתן לבצע פגיעות מדוייקות וספציפיות .נמצא שישנם איזורים בהיפותלמוס שכאשר חורכים אותם אין השפעה על התאבון )משולש(; איזורים אחרים מעודדים אנורקסיה – אי אכילה )עיגול(; וישנם איזורים שכשהם פגועים בעלי החיים לא הבינו שהם אכלו – צרכו מזון בכמויות והפכו ל) obese-ריבוע( .מרכזים אלו מכונים מרכז השובע ומרכז הרעב. כאשר הרסו איזורים במרכז ההיפותלמוס פגעו בקליטת השובע של החיות; כאשר הרסו את האיזורים הלטראלים ,החיה לא חשה ברעב. אמצעי בקרת מרכזי הרעב והשובע ההיפותלמוס עושה אינטגרציה של מידע המתארת את מצב הגוף ומצווה ,בהתאם ,האם לאכול או להפסיק .המדדים הפיזיולוגיים המעוררים צורך לאכול הם רמות סוכר ומתח הקיבה; אולם לא רק: גם ריח וראייה מהווים גירוי ,ואפילו היבטים חברתיים. • הקיבה מפרישה .Ghrelin • האינסולין ,המופרש ברמות סוכר גבוהות ,מעכב את הרעב. • הסיגנל הליפוסטטי – קובע כמה תאי שומן יהיו ,על מנת לאזן את כמות השומן הנדרשת מול כמות שומן רבה מדי שמקשה על בריחה .תאי שומן מפרישים חומרים המשפיעים על ההיפותלמוס ברמות גבוהות על מנת לעכב אכילה ולעודד ליפוליזה ושריפה של שומן חום. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , /נושא :4צריכת מזון 63 התיאוריה הליפוסטטית ההיפותלמוס קולט מידע מתאי השומן; כבר ב1953- העלו את התיאוריה הליפוסטטית והטענה הייתה שכשפוגעים ב VMN19-הסיגנל הזה לא יגיע .ואכן, כאשר עושים חתך ב ,VMN-העכבר ממשיך לאכול ללא הפסקה ומוחו אינו מודע למידת השומן של גופו. ניתן לקשר בין מערכות הדם של שני עכברים כך שהם חולקים סיגנלים הורמונליים .העכבר השמן ,בעל החתך ב ,VMN-אינו קולט את הסיגנל הליפוסטטי החזק; אבל העכבר הנורמלי שמחובר אליו הופך לאנורקטי – כי הוא חושב שהוא שמן מדי. המוטנטים ob/ob & db/db בסוף שנות ה 80-נוצרו שני מוטנטים ob/obו.db/db- העכבר db/dbהופך שמן מאוד וטמפרטורה הגוף שלו נמוכה – כי הוא לא מוציא אנרגיה על שמירת חום גוף .הוא מפתח סכרת ויש לו בעיות אנדוקריניות אחרות ,כמו עקרות. אם לוקחים עכבר נורמלי ונותנים לו דיאטה עתירת שומן הוא ישמין; כאשר מאפשרים לו לחזור לפעילות לצד דיאטה מאוזנת ,הוא חוזר למשקל נורמלי .את עכבר ה ob/ob-אפשר לשמור במשקל נורמלי עם דיאטה דלת שומן ,אבל אפילו בדיאטה מאוזנת ואפשרות לפעילות הוא יהפוך לשמן. הסיבה היא שרמת הפעילות שלו נמוכה יותר ואגירת השומן גבוהה יותר. קולמן ,במאמרו מ ,1973-ניחש באופן מאוד הגיוני ומושכל – בהתאם לניסוייו – היכן משפיעים הגנים של המוטנטים האלו .קולמן חיבר WTלעכבר ;ob/obבעוד שה WT-נשאר נורמלי ,הob/ob- ירד ברמות תיאבון ,גלוקוז ומשקל. ,VMN = ventromedial nucleus 19עשוי להופיע גם בתור .VMH החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב בקרה אנדוקרינית 64 obהוא ההורמון; dbהוא הרצפטור לעומת זאת ,כשקולמן לקח את db/dbוחיבר אותו ל ,WT-דווקא db/dbהיה ללא שינוי וב WT-ירדו תיאבון ,גלוקוז ומשקל .כאשר חיברו את שני המוטנטים ,ה db/db-לא השתנה בעוד שה ob/ob-ירד בתאבון ,גלוקוז ומשקל בדיוק כמו עם ה – WT-ואולי אפילו יותר. קולמן הבחין וטען שה db-עצמו משפיע על שני המינים WT ,או ,ob/obאבל הוא עצמו אינו מושפע – ולכן כנראה שיש לו בעיה ברצפטור לאותו סיגנל ליפוסטטי – כמו העכבר שהרסו לו את ה .VMN-לעומת זאת ה ob/ob-נוטה להתנהג כמו העכבר אליו הוא מאוחה – הוא מבין שהוא שמן; הנספח אליו מעביר לו את האותות שחסרים לו ,מכאן ש ob/ob-אינו מייצר את הסיגנל אבל הרצפטור שלו תקין. ב 1994-בודדו את הסיגנל הליפוסטטי אשר כונה בתחילה ,OB Proteinובהמשך .Leptinכאשר מזריקים לעכבר ob/obלפטין על בסיס יומי ,כמויות המזון שהוא אוכל ) (Aוהמשקל שלו ) (Bיורדים – בדומה לעכבר נורמלי .הגן obמקדד לחלבון הלפטין שחסר בעכבר המוטנט .הלפטין מיוצר ומופרש מתאי שומן וככל שיש יותר שומן יש יותר לפטין בדם. לעומת זאת ,בניסוי דומה שנעשה בעכבר C & ) db/db (Dלא הייתה השפעה למתן הלפטין. בניסוי הבא הלפטין הוזרק ישירות לוריד )במקום מתחת לעור(; כמות המזון ירדה אולם המעניין הוא שהזרקת כמות לפטין קטנה מאוד – מיקרוליטרים בודדים – גורמת להפסקה באכילה אצל העכבר .משמעות הדבר היא שהרצפטורים של לפטין נמצאים בהיפותלמוס .מכאן, שלפטין יכול לעבור את ה BBB-ולהיכנס להיפותלמוס. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , /נושא :4צריכת מזון 65 כאשר בעלי חיים אוגרים מספיק אנרגיה ושומן הם מפרישים לפטין ברמה המסגנלת להיפותלמוס שהוא יכול להוציא אנרגיה; אולם כאשר כמות השומן יורדת מתחת למה שבעל החיים צריך בכדי לשרוד תקופות של חוסר מזון ,רמות הלפטין הנמוכות מסגנלות להיפותלמוס על הצורך לאכול ולהוריד פעילות ,מטבוליזם ואולי אפילו טמפרטורה. מקרי המוטציות בלפטין באדם קיימים אך נדירים;ישנן דוגמאות למשפחות עם בעיה ביצור הלפטין או הרצפטור ללפטין ) Obאו ,(Dbאולם אלו מקרים איזוטריים ונדירים .רוב האוכלוסיה השמנה אינה בעלת בעיה בייצור או בקליטה של הסיגנל הליפוסטטי. תיזמון הרגישות ללפטין מה ניתן לעשות במצבים שכן צריך לאגור מזון – לפני נדידה ,שנת חורף ,תקופות של היעדר מזון? מסתבר שהלפטין אינו עובד תמיד; בניסוי שבדק תגובת אוגר להזרקה של לפטין נמצא שבתקופת הקיץ הלפטין אינו משפיע )בתנאי יום ארוך ,האוגר מתחיל באגירת שומן לקראת החורף ולכן אוכל ללא הגבלה(. הגרף מראה שמתן הלפטין בתקופה יום ארוך אינה גורמת לשינוי בעלייה במשקל; לעומת זאת ,בחורף, בתקופה שבה הוא לא אמור לאגור אנרגיה ,מתן הלפטין מעכב את העלייה במשקל של העכבר – הוא חושב שיש לו לפטין ולכן אינו אוכל .זאת לעומת האוגר הרגיל שכאשר נותנים לו גישה חופשית למזון לאחר תקופת הרעבה אוכל ועולה בחזרה במשקל. השמנה בבני אדם ולפטין בבני אדם קיימת קורלציה יחסית בין הלפטין לאחוזי השומן; מכאן שלאנשים עם אחוז שומן גבוה יש רמות לפטין גבוהות .מדוע בעלי רמות הלפטין הגבוהות אינם מפסיקים לאכול ולקלוט אנרגיה? חקר הלפטין נעשה מנקודת מבט מערבית – בה יש בעיות של השמנה וסכרת .אולם יש לזכור החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב בקרה אנדוקרינית 66 שאבולוציונית ,לפטין לא התפתח כדי למנוע אכילה אלא כדי לדווח על רמות האנרגיה ולעודד אכילה – מרבית בעלי החיים אינם עומדים בסכנת השמנה אלא בסכנת רעב .בקרה על תחושת הרעב מהווה יתרון הישרדותי; בעולם המודרני ,עם זאת ,אכילה מביאה להשמנה. חוסר תגובתיות ללפטין בבני אדם הוצע שקיימת תנגודת או חוסר תגובתיות ללפטין – שלא נובעת מרצפטור פגום ,אלא ממסלולים פחות אקוטיים ,כמו חשיפה כרונית שגוררת עמידות ללפטין; בעיה בטרנספורט דרך ה;BBB- בעיה במסלול האיתות התוך תאי; ועוד. ישנם גנים המקנים עמידות לחוסר מזון ולכן קצב המטבוליזם של בעלי האללים נמוך והם נוטים לאגור שומן; בחברה המערבית ,שבה יש עודפי שומן ,הגנים יוצרים תנגודת לאינסולין; אולם בהיותם מקנים עמידות לתנאי חוסר מזון ,ייתכן שהם גורמים לתנגודת ללפטין .בתנאים הקשים הם אולי מקנים יתרון אבל בעולם המערבי הם מובילים להשמנת יתר. מסלולים אלטרנטיביים לבקרת הרעב והשובע הפפטיד CCKמופרש לאחר האכילה .כאשר מזריקים אנלוגים שלו לכלבים בריכוזים שונים הכלבים אוכלים פחות .זהו עוד ניסיון למצא מנגנונים לבקרה על השמנה. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , /נושא :4צריכת מזון 67 הגרפים הבאים מתארים עקומות גדילה – לפי אחוזונים ) (Pשל ילדים נורמלים ,והעקומה הכהה היא של ילדים שסובלים מסוג השמנה מסויימת הנגרמת עקב בעיה נוירואנדוקרינית .בבדיקה גנטית נמצאו שיש לילדים מוטציה נקודתית – החלפה של Cב A-הגורמת ליצירת מתיונין ויציאה ממסגרת הקריאה הנכונה של החלבון המיוצר. החלבון הפגוע הוא POMC (pro-opio ) .Melanocorineהחלבון הזה מקדד לכמה פפטידים – האחד בעל השפעות אופיאטיות; ,MSH ,melanocide stimulating hormoneהצובע שיער בשחור; וכן ל ACTH-המופרש מההיפופיזה וגורם להפרשת קורטיזול מבלוטת יותרת הכליה. הרצפטורים המיועדים לקלוט את הפפטידים המופקים מהחלבון melanocortin ) POMC ,(receptorsמצויים במוח ,בהיפותלמוס ובבלוטת יותרת הכליה )בהתאמה( .כאשר POMCאינו מיוצר ,כמו בילדים אלו ,אין הפרשת ACTH מההיפופיזה ולכן חסר להם בדם קורטיזול; כמו כן, צבע השערה ג'ינג'י כיוון שאין קליטה של .MSH בדיקת רמות קורטיזול הינן הבדיקות הפשוטות ביותר לשלילת או אישוש החשד למחלה .התוצר ,MSHכשהוא מיוצר בהיפותלמוס מתאי עצב, מיועד לדיכוי תיאבון .ללא הדיכוי הזה הילדים סובלים מהשמנה. אחרי שגילו שהמוטציה ב POMC-גורמת להשמנה ,ניסו ליצור מודל למחלה .לשם כך יצרו KOשל הגן על ידי החדרת עמידות לניאומיצין ) (Neoלאחד האקסונים של הגן .בעכברי KOהומוזיגוטים אין ACTHואין קורטיזול; העכברים האלה משמינים ,יש להם רמות גבוהות של לפטין ,והבטן שלהם הרבה יותר זהובה מזו של עכבר – WTכלומר יש גם השפעה על זקיקי השערות. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב בקרה אנדוקרינית 68 העכברים האלה לא מבטאים כלל את ;POMCאז איך אפשר להוכיח ש αMSH-הוא שחשוב? בהזרקת ,MSHעכבר רגיל מעלה במשקל שבעוד שעכברי KOמרזים; עם הפסקת הטיפול עכבר הKO- עלה שוב משמעותית במשקל .עובדה זו מעלה סכנה לשימוש ב MSH-כתרופה – מכיוון שהעכברים עלו הרבה יותר במשקל לאחר הפסקת הטיפול מאשר מידת הירידה. בקרת מסת גוף ותצרוכת מזון – הרצאת אורח מרצה אורחת :פרופ' נגה קרונפלד-שור לכאורה ,אין בבני אדם בקרה על תצרוכת המזון; ואולם ,למרות הבקרה הנמוכה לכאורה על האכילה עצמה – המשקל נותר קבוע לאורך זמן .אחד המרכיבים של מערכת הבקרה הקיימת הוא הלפטין. מערכת הבקרה התפתחה מכורח הסלקציה :בעל חיים שמסוגל לצבור מאגרי אנרגיה יכול להימנע משיחור מזון במצבים לא בטוחים; אולם בעלי חיים שמנים מהווים טרף אטרקטיבי ויכולת הבריחה שלהם נמוכה יותר משל פרט רזה .מסיבה זו הבדלים מאוד קטנים במסת הגוף הינם בעלי משמעות אבולוציונית כבדת משקל. לפטין מופרש אל זרם הדם וכמותו נמצאת בהתאמה למסת הרקמה השומנית – עלייה במשקל גוררת עלייה במסה השומנית ולכן עלייה בהפרשת הלפטין; הלפטין חודר את ה BBB-ומשפיע על המוטיבציה להוצאת אנרגיה ולקליטת אנרגיה. הרצפטורים ללפטין מימין :חתך בהיפותלמוס ,המציג את שני הגושים העיקריים בהם מופיע הרצפטור ללפטין .משמאל: מודגשים הגרעינים המכילים את הרצפטורים ללפטין ,ה ARC-וה.DMH- חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , /נושא :4צריכת מזון 69 בבחינת ה ,Arcuate Nucleus (ARC)-נראה שיש ביטוי של ) ,NPY (Neuropeptide Yהגורר הגברה של התאבון :ידוע שכאשר מרעיבים דגים קיימת עלייה ברמות הביטוי של ;NPYבניסוי )תרשים( הוזרק NPYלדגים ,וכתוצאה חלה עלייה בתצרוכת המזון .נוירופפטידים מעוררי תיאבון מכונים אוריקסוגנים .מדכאי תיאבון מכונים אנאוריקסוגנים. התרשים מראה את צריכת המזון ביום ה 1-וה 4-של קבוצת חולדות שקיבלו מינונים שונים של NPYולפטין .נראה שביום הראשון הלפטין לא הצליח להשפיע על היכולת של NPYלעורר צריכת מזון מוגברת ,אולם ביום השני הוא חסם את הפעילות שלו; היום ידוע שההשפעה המעכבת של לפטין נעשית דרך בקרה על ביטוי ה- NPYב.ACN- המערכת המלנוקורטינית מערכת זו אחראית על תפקודים באיזורים שונים בגוף; היא התגלתה כמערכת שמבקרת צבע שיער ויש לה חמישה רצפטורים המבוטאים באיזורים שונים בגוף .לרצפטורים יש אגוניסט, αMSHושני אנטגוניסטים – Agouti & agouti-related ) .protein (Agrpכאשר Agoutiמבוטא בזקיקי-השערות ונקשר לרצפטורים ,הליגנד של הצבע השחור לא נקשר ולכן מתקבל צבע ג'ינג'י; Agrpמבוטא במוח ומשפיע על תצרוכת המזון. המערכת הזו התגלתה בעכברים מוטנטים ,שמנים וג'ינג'ים. αMSHהוא תוצר שיחבור חלופי של ה .POMC-האגוניסט ההורמון נמצא כמדכא תיאבון – בהזרקה לחולדה חלה ירידה בצריכת המזון .לעומת זאת כאשר מזריקים את האנטגוניסט, ,Agoutiצריכת המזון עולה .ביקורת אחת בניסוי קיבלה סליין בעוד שהביקורת השנייה קיבלה בדיוק את כמות המזון שאכלה ביקורת הסליין – וקיבלה אגוטי; זאת על מנת להראות שהעלייה במשקל נובעת מהאכילה ולא ממשהו אחר. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב בקרה אנדוקרינית 70 מוטציות במערכת Agoutiו:MSH- • Agoutiמבוטא בכל הגוף ברמות גבוהות במקום רק בזקיקי השיערות – הוא נקשר לרצפטורים באיזור הזקיקים וגם לרצפטורים במערכת המלנוקורטינית ,ולכן חוסם את הרצפטורים ל MSH-ומוביל לעכברים שמנים וג'ינג'ים. • ביטוי ביתר של Agrpבמוח – גורם להשמנה אך ללא הפנוטיפ של השיער הג'ינג'י. אותרו משפחות שיש להן מוטציות באיזורים שונים במערכת המלנוקורטינית .הילדים בעלי המוטציה הזו סובלים מתופעות רבות עליהן משפיע הפרה-פרוהורמון כמו העלייה במשקל ,צבע השיער האדום וכדומה. המערכת הנוירונלית והמלנוקורטינית נוירונים מסדר ראשון מקבלים אינפורמציה מהפריפריה על ידי הורמונים ומשפיעים על ביטוי הפפטידים ב- .ACNבמצב של השמנה יש עלייה במסת השומן ,עלייה ברמות הביטוי ושחרור לפלזמה של לפטין; הלפטין עובר את ה BBB-ונקשר בהיפותלמוס לנוירונים ספציפיים ב- ,ACNהמתחלקים לשתי קבוצות עיקריות: • NPY/Agrpמעודדים תצרוכת מזון )מעוכב על ידי לפטין( • POMCמדכאים את תצרוכת המזון )מאוקטב על ידי לפטין(. הירידה ב Agrp-לצד עלייה ב MSH-מובילים לקישור MSHלמערכת המלנוקורטינית וירידה בצריכת המזון; הירידה ב NPY/Agrp-גם מביאה לירידה בצריכת המזון .תוצר שני המצבים הוא אנורקסיה – ירידה בתצרוכת המזון .בתרשים התחתון ניתן לראות את המצב ההפוך .שימו לב שגם מעט ה MSH-שנוצר נחסם על ידי הרצפטורים של המערכת המלנוקורטינית ,מאחר והם תפוסים על ידי .Agrpתוצר תהליך זה הוא עלייה במשקל – .obesity חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , /נושא :4צריכת מזון 71 מסה שומנית מפרישה לפטין; אינסולין מופרש מהלבלב; הקיבה מפרישה ;Ghrelinומידע רב מגיע ממערכת העיכול ומהקורטקס .כל האינפורמציה מגיעה להיפותלמוס ומשפיעה על נוירונים המבטאים POMCאו .NPY/Agrpנוירונים מסדר שני מקבלים אינפורמציה מנוירונים אלו ומעבירים את המידע הלאה למרכזים אחרים .בצורה זו המערכת מבקרת לא רק על תצרוכת המזון אלא גם על קצב הוצאת האנרגיה – ברצון לפעילות וברמת תצרוכת האנרגיה המטבולית הבסיסית. אם כן ,מדוע משמינים? היום ידוע שהתשובה לכך מורכבת ונובעת משילוב של בסיס גנטי ובסיס סביבתי: • מוטציות מונוגנטיות – משפחות שמייצרות לפטין לא פונקציונלי או רצפטור ללפטין שאינו תקין; אולם אלו מיעוט המקרים .רוב ההשמנה נובעת מנטייה פוליגנית – תכונות שנובעות מגנים שונים וההרכב שלהן אינו ידוע ומשתנה בין משפחות. • המשתנה הסביבתי – פעילות גופנית ,אקלים הסביבה ,צריכת המזון ,צריכת התרבות – הוצאת האנרגיה מושפעת מהסביבה ומהתרבות בהן אנו חיים. ברוב המקרים משקל שהינו מעט מעל המשקל האופטימלי הוא מצב רצוי – מכיוון שהוא מאפשר השרדות בתקופות מחסור .בתקופות קדם בני האדם הוציאו הרבה יותר אנרגיה והבקרה הפיזיולוגית הייתה בעלת משקל רב יותר .הפעילות הפיזולוגית הייתה מוגברת הן בשל הצורך לשחר ולצוד מזון ,והן מפני שבקרת האקלים הייתה פחות נישלטת; כמו כן ,המזון הנצרך היה בעל הרכב אחר מהיום ופחות זמין .מכיוון שהסביבה השתנתה לחלוטין – כמות המזון ,האנרגיה היוצאת על השגתו והדחיסות הקלורית שלו – האנושות הגיעה למצב בו הוצאת האנרגיה נמוכה מאוד והזמינות האנרגטית גבוהה מאוד; הביקורת הנדרשת היום על צריכת המזון היא בעיקר בקרה קוגנטיבית – להחליט שלא לאכול בכל רגע נתון ומה לאכול; להחליט לבצע פעילות ספורטיבית. בעצם כל התהליכים הגורמים לעלייה במשקל מביאים רמות לפטין גבוהות אשר זוכות להתעלמות; התעלמות זו גורמת למצב של Diet induced Obesityועמידות ללפטין .התרשים )שקופית (19מדגים את השינוי במסת הגוף במדינות שונות בארה"ב ,כאשר תכלת מציין איזורים בהם פחות מ 10%-הוגדרו כ Obese-וככל שהצבע כהה יותר )כחול כהה ואדום( הדבר מצביע על עלייה באחוז ה ,Obesity-לפי מדד ה BMI>30) BMI-נחשב להשמנה יתר מסוכנת(. חשיפה כרונית של המוח לרמות לפטין גבוהות יכולה לגרום לעמידות ללפטין ,בין אם על ידי טרנפורט לקוי דרך ה BBB-ובין אם בפגיעה בקישור לרצפטור ללפטין או במסלול האיתות שלו .היום נעשים מחקרים על מנת למצוא דרך למניעת העמידות ,למרות שללא פתרון עד כה .המערכת הזו מורכבת החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב בקרה אנדוקרינית 72 ומפותחת מאוד ומכילה מנגנוני פיצוי כך שאם פוגעים באחד המרכיבים שלה היא עדיין מקבלת אינפורמציה רבה ממקורות אחרים ותאמין לתמונה הכללית ,במיוחד בכל הנוגע להשמנה. מחצית מאוכלוסיית העולם מתמודדת דווקא עם רעב ולא השמנה – ולמרות זאת המחקרים עוסקים בעיקר בהשמנה; לאורך רוב ההיסטוריה האבולוציונית מרבית היונקים – כולל בני אדם – התמודדו בעיקר עם מחסור ולא עם עודף .אם בוחנים את המערכת מנקודת המבט הזו ,של רעב ,המערכת עובדת כמו צריך: ירידה ברמה מטבולית וטמפרטורת גוף ,דיכוי מערכת הרבייה ,20הרגשת הרעב וכדומה. גורמים המשפיעים על אגירת מזון או נטייה להשמנה ברגע שתנאי הסביבה הינם קבועים ,אין סיבה לאגור שומן :הסיכוי הסטטיסטי להיות חשוף למחסור במזון נמוך ועדיף לא לסחוב עודף שומן שיוביל להאטה בבריחה ויהפוך את החיה לטרף אטרקטיבי .בסביבה משתנה ,לעומת זאת ,יכולים להיות שינויים בזמינות המזון כמו גם בצורך בו .השינויים יכולים להיות חזויים – כמו עונת החורף באירופה – או לא חזויים – כמו בבית גידול מדברי .בשינויים חזויים מופיע דגם אכילה עונתי :אגירת שומן לקראת החורף ,לעיתים מעלים את מסת הגוף ב ;50%-חלקם לא אוכלים כלל בחורף ומתקיימים ממאגרי האנרגיה בלבד .בסביבה עם שינויים לא חזויים תהיה נטייה לאגירה ,בין אם בצורת שומן ובין אם כמזון אגור ,כמו הגרבילים השומרים מאגר של גרמים עד קילוגרמים של זרעים. כמות השומן שהגוף מסוגל לסחוב עומדת ביחס ישיר לגודלו; לעומת זאת רמת תצרוכת האנרגיה עולה במעלה של 0.75למסת הגוף – פחות מיחס של ;1:1מכאן שבבעלי חיים קטנים תצרוכת האנרגיה ליחידת משקל גבוהה יותר מבבעלי חיים גדולים .מכיוון שהצריכה גבוהה יותר ,אולם היכולת לסחוב אחידה ,צריכת המזון גבוהה יותר בבעלי חיים קטנים מבבעלי חיים גדולים וכמות השומן הנדרשת לבעלי חיים קטנים גדולה יותר מאשר בבעלי חיים גדולים. קוצנים זהובים מאפייני הקוצן הזהוב מול הקוצן המצוי קוצנים חיים בבית גידול מדברי )לא חזוי( וניזונים בעיקר מפרוקי רגליים )לא ניתנים לאגירה וזמינותם תלויה בגשמים( .בהתאם לנתונים אלו ,עולה ההשערה שהקוצן ייטה לאגור שומן בעיתות שפע ,בו יישתמש בעת מחסור .מכיוון שכך ,הוא מהווה מודל טוב יותר להשמנה בבני אדם מאשר חולדות ועכברים ,הנוטות לאגור מזון יבש ולא שומן .הקוצן המצוי ,כמו החולדות והעכברים ,נוטה לחיות בבתי גידול עם שינויים חזויים ולכן פחות ייטה להשמנה. 20אנורקטיות מאבדות את המחזור משום שכניסה להריון במצב רעב יכולה להוביל למות האם והועובר – יש יתרון בהשפעה בהישרדות ובשיפור התנאים יהיה יתרון להריון. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , /נושא :4צריכת מזון 73 קוצנים במחקר בניסוי שבו ניתן לשני מיני הקוצנים מזון רגיל או עתיר אנרגיה ,זמינות המזון הגבוהה הובילה לעלייה במשקל הקוצן הזהוב בעוד שהקוצן המצוי עלה בצורה קלה במשקל אך גם המסה שעלתה מהמזון עתיר-האנרגיה תוקנה לאחר מכן .מדידת מסת השומן בגוף )הנמדדת בקרני Xבשני אורכי גל שונים( מראה עלייה משמעותית ברקמה השומנית בקוצנים הזהובים שקיבלו מזון עתיר שומן. בהמשך ביקשו לבדוק מה גורם לנטייה להשמנה: לשם כך נבדקה הקורלציה בין אחוז השומן ללפטין בדם; הקורלציה טובה ,כלומר אין בעיה בלפטין, והיא גם מתאימה לקורלציה הקיימת בבני אדם שסובלים מהשמנת יתר .בבדיקת הנוירופפטידים בהיפותלמוס ,ניתן לראות עלייה מובהקת )בקוצנים מצויים( ב POMC-ו ,CART-נוירופפטידים אנאורקסיגניים )(anorexigenic הגורמים לתחושת שבע; בעוד שבקוצנים הזהובים הייתה ירידה מובהקת בנוירופפטידים האורקסיגניים ).(NPY & Agrp האם הם מפתחים עמידות ללפטין? לצורך בדיקה זו השתמשו במשאבות אוסמוטיות הבנויות משתי ממברנות – החיצונית חצי חדירה ,הפנימית לא חדירה ,וביניהן יש מלחים; כאשר נוזלים נכנסים מהממברנה החיצונית מכוח לחץ אוסמוטי ,הדבר יוצר לחץ על החלק הפנימי ומפריש באופן מדוד את התרופה. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב 74 בקרה אנדוקרינית הגרף מציג את תוצאות הניסוי לאחר מתן הלפטין: בקוצנים זהובים בעלי משקל נורמלי ) (Aובקוצנים מצויים ) (Bהייתה תגובה ללפטין שלא הופיע בקוצנים זהובים בעלי משקל יתר ) – (Cמכאן שהם עמידים ללפטין; בבחינת תצרוכת המזון ניתן לראות שהירידה בצריכה הייתה קטנה בזהובים השמנים אולם לאחר הסרת הטיפול ) (D-Fחלה עלייה בצריכת המזון ) – (Fמכאן שלמרות שאינם מגיבים לנוכחות הלפטין ,הם מגיבים להיעדרו. למעלה :בהגבלת המזון ל 50%-מהכמות הנורמלית הגרבילים ירדו במשקל עד 25%ממשקלם )ואז עצרו את הניסוי בהם כדי לא לסכן אותם( בעוד שהקוצנים הזהובים ירדו עד 90%ממשקלם ואז התייצבו. הקוצנים הצליחו לשמור על מסת גוף קבועה על ידי הקטנה מותאמת של תצרוכת האנרגיה )נמדדה לפי צריכת החמצן ,ירידה עד לכ 50%-מצריכת החמצן הרגילה בקוצנים בעוד שהירידה בגרבילים הייתה קטנה ולא מובהקת( על חשבון הורדת פעילות התרמורגולציה .הקוצנים הניחו לטמפרטורה לצנוח – לא השקיעו כלל מאמץ בתרמורגולציה; כמו כן הם היו פעילים בעיקר בשעות בהן האוכל ניתן. בהיפותלמוס ,ניתן לראות עלייה בביטוי של AGRPעוד לפני העלייה במסת הגוף; NPYעולה לאחר 17 יום עם עלייה לא משמעותית לאחר יום אחד; הפפטידים האנאורגסיגניים לא היו בעלי התנהגות דומה או שינויים מובהקים )שקופית .(33 חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , /נושא :4צריכת מזון 75 הבדלי אסטרטגיות במצבי עקה מה עם סטיות התקן? סטיות התקן היו מאוד גבוהות; ואכן ,בבדיקה התגלה שהקוצנים מתחלקים לשתי קבוצות – האחת לא יורדת במשקל ,נותרת סטטית לתקופה ואז מתחילה בהשמנה; והשנייה יורדת במשקל בצורה יותר משמעותית .בבדיקת רמת הפעילות נמצא שהקבוצה הראשונה הורידה את רמת הפעילות בעוד שהקבוצה השנייה העלתה את רמת הפעילות במאות אחוזים .ייתכן שהפעילות המוגברת מיועדת לשיחור מזון ונסיון למצוא בית גידול טוב יותר במצב העקה. ברגע שיש מגבלת מזון ,קיימות שתי אסטרטגיות שונות לקוצנים (i) :חלק מהקוצנים יורידו את רמת המטבוליזם והאנרגיה ואחרים ) (iiיעלו את רמת הפעילות וייצאו לשיחור מזון .בחינת הבדלים בביטוי הנוירופפטידים ההיפותלמיים מראה שרמות הלפטין נמוכה יותר בקוצנים שאינם פעילים )לא מפתיע – הם יורדים במשקל בשל הפעילות( בעוד שהקבוצה שיוצאת לשיחור מזון מראה עלייה ב POMC-ו .NPY-ה NPY-אמור לגרום לעלייה בצריכת המזון ולכן זה מסתדר; אולם POMCאמור לרדת במגבלת מזון. בבחינה מדוקדקדת יותר של ,POMCחוקרים הבודקים ) Activity Based Anorexia (ABAגילו שבמודל חולדות נורמליות חלה ירידה ב) POMC-כאשר מאכילים אותן פעם ביום ,הן לומדות לנהל את המזון והפעילות בהתאם לירידה במזון( בעוד שחולדות המהוות מודל ל) ABA-שאוכלות פעם ביום ובכל שאר הזמן רצות בגלגל עד שהן מתות מרעב( מפגינות עלייה ב.POMC- במחקר אחר שבו בדקו את רמות NPYעם או ללא גלגל ריצה ,ראו שרמות NPYעולות משמעותית עם גלגל ריצה .כאשר מזריקים NPYישירות לחדר השלישי רואים שהחולדות שקיבלו NPYהורידו מסת גוף יותר מאשר הביקורת ,תצרוכת המזון שלהן ירדה ולא עלתה – בשעה שהמזון היה זמין הן אכלו עוד פחות – והפעילות בגלגל עלתה .עקב העלייה בפעילות לצד הירידה בצריכת המזון ביחס לביקורת ניכרת ירידה במסת הגוף. הניסויים האלו נעשים לרוב בכלובי מעבדה; יכול להיות שהנוירופפטידים השונים משפיעים על התנהגות צריכת מזון אך לאו דווקא על צריכת המזון עצמה .במספר בעלי חיים נמצא ש NPY-ואנלוגים שלו החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב בקרה אנדוקרינית 76 מעורבים בתהליך של חיפוש מזון :באוגרים סיבירים שמקבלים NPYמתחוללת עלייה בכמות המזון הנאסף למחילה אולם אין עלייה בצריכת המזון עצמה; כן ראו שיש ירידה בדברים המלווים את תהליך השיחור – החרדתיות ,למשל. מכאן שיש לחלק את תצרוכת המזון לשניים (i) :המוטיבציה לחפש את המזון ,להשיג אותו; ו(ii)- המוטיבציה להכניס את המזון לפה .שתי מוטיבציות שונות אלו יכולות להיות מבוקרות על ידי מנגנונים שונים .בבחינת ההכנה להיברנציה בנישפונים )סוג של עטלף( ,נמצא שבשבועיים שלפני הכניסה לתרדמה יש עלייה של 50%במסת הגוף הנובעת מעלייה ברמות השומן; בבדיקת הפלזמה נמצאה רמת לפטין גבוהה בתחילת ההשמנה היורדת למרות שהעטלף ממשיך לאכול ולהשמין .בבחינת עטלף מהארץ, ינזוב ,האוגר שומן בין הרגליים האחוריות ,עליית מסת הגוף מלווה גם בשינוי בדיאטה – בשבועים האלה הם עוברים לאכול מלכות נמלים שהן שמנות במיוחד ומכילות יחס שומן רווי/לא רווי שונה ,בעל משמעות לעמידות לטמפרטורות .גם בעטלפים אלו נמצא ,במקביל לעליה במסת הגוף ,שינוי בפפטידים נוירותלמיים ,עלייה ב NPY-ועלייה ב .Agrp-ייתכן שעלייה זו ב Agrp-מוביל לשינוי בהעדפות המזון. אחד המועמדים לבקרת השינויים הוא אורך היום – עבודות שפורסמו בשינויים באורך יום בנברנים ואוגרים סיבירים מראות עלייה במסת הגוף וצריכת המזון בנברנים שחיים באורך יום קצר לעומת אורך יום ארוך .באוגרים סיביריים ,שגם בהם רואים עלייה במסת הגוף במהלך הקיץ ,נמצא שהגורם לשינוי הוא אורך היום אולם הם מפתחים עמידות ללפטין בתלות באורך היום בו מחזיקים אותם – אוגרים סיביריים שמוחזקים ביום ארוך וסובלים מהגבלת מזון ,התנהגותם הייתה דומה בהרעבה ובהחזרת המזון, בין אם ניתן להם לפטין ובין אם לא; לעומת זאת בתנאי יום קצר האוגרים שקיבלו לפטין לא חזרו להגדיל את צריכת המזון – מכאן שביום ארוך יש עמידות ללפטין. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :5מדידת ריכוזי הורמונים 77 נושא :5מדידת ריכוזי הורמונים רצפטור של הורמון צריך להיות בעל זיקה המתאימה לריכוזים הפיזיולוגיים של ההורמון .אם הזיקה נמוכה הקישור ייקרה רק בריכוזים גבוהים ואז שינויים קלים ועדינים שקורים בריכוזים נמוכים לא יבואו לידי ביטוי; לעומת זאת אם הזיקה מאוד חזקה הקישור ייעשה כבר בריכוזים הנמוכים ולא יורגשו הבדלים בין ריכוזים גבוהים שונים. על מנת למדוד כמות הורמון ניתן להשתמש בתופעות הפיזיולוגיות-ביולוגיות של ההורמון :ניתן להזריק ) MSHהנקשר לרצפטור לצבע( לצפרדע ולבדוק מה ההשפעה על הפיגמנטציה של העור .שתי בעיות עם שיטה זו הן העובדה שהכימות הוא יחסי בלבד ושיכול להיות שבפלזמה הנבדקת יש עוד פקטורים המשפיעים על עור הצפרדע. "הצפרדע הרפואית" – שתן נשים בהריון מכיל את ההורמון .HCGכאשר מזריקים אותו לצפרדעים זכרים הוא גורם לצפרדע לשחרר זרע למים .מדידת עכירות המים המכילים זרע מספקת מידע האם יש HCG בשתן או לא; בהתאם ניתן היה לקבל תשובה חיובית/שלילית להריון. הזרקת מיצויים של היפופיזה לבידוד הגונדוטרופין. על מנת למדוד את הכמות ,הזריקו את המיצויים לשחלות דג האמנון .התגובה ,היא הפרשת אסטרוגן מהשחלה ,מקבילה לתגובה להזרקה של LHנקי )וכפי שניתן לראות בגרף(. גם כאשר הזריקו הורמונים אחרים או גונדוטרופינים של מינים אחרים )סלמון או בן-אדם( התגובה דומה עד מקבילה; לעומת זאת כאשר הזריקו PRLלא נראתה הפעלה של השחלה .עובדה זו מראה שאין ספציפיות מדוייקת לרצפטורים ,למרות שהיא עדיין אינה מופעלת ממשפחות מאוד שונות של הורמונים – כמו הפרולקטין. )Radio-Immuno-Assay (RIA רופאה וחוקרת בשם רוזלין ילו ניסתה לבדוק, בהקשר של מטופלים חסרי-תגובה לאינסולין, השערה הגורסת שהאינסולין מתפרק בפלזמה של הדם שלהם .לשם כך היא הזריקה לנבדקים אינסולין מסומן ואז הפיקה בדיקות דם והריצה את חלבוני הפלזמה בג'ל .את הג'ל היא חשפה לפילם והסימון הרדיואקטיבי מהאינסולין הופיע על הפילם. באדם חולה ,שאינו מגיב לאינסולין ,ילו אכן קיבלה פס חלש יותר באינסולין; אולם להפתעתה הופיע גם פס רדיואקטיבי בחלק העליון של הג'ל .בהתאם לכך היא שיערה שהאינסולין נקשר לחלבונים אחרים – החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב בקרה אנדוקרינית 78 להנחתה היו אלו נוגדנים – ולכן יוצר צברים .החולים מייצרים נוגדנים כנגד אינסולין שמונעים את פעילות האינסולין. השלב הבא היה להוכיח שאלו אכן נוגדנים ולא קישור קוולנטי :היא הזריקה לחולים אינסולין מסומן )"חם"( ובמשך הלילה הדגירה את הדם עם אינסולין לא מסומן )"קר"( .דיסוציאציה טבעית של הנוגדנים מהאינסולין ה"חם" תגרום לקישור למולקולה חדשה ,ובשל ריכוז האינסולין הקר הגבוה סביר להניח שהוא ייקשר לאינסולין "קר"; מכאן שאם לאורך הלילה תהיה עלייה באינסולין החופשי החם וירידה בצבירי האינסולין החמים ,הרי שיש קישור לא-קוולנטי לחלבון )גם אם לאו דווקא קישור לנוגדן(. ניתן לייצר הורמון מסומן על ידי חיזור טירוזין בנוכחות יוד רדיואקטיבי ,תגובה הגורמת להחלפת שני מימנים בשני אטומי יוד .זכרו כי ההחלפה הזו גורמת לשינוי במולקולה ,שכן הבדלי הגודל בין אטום המימן לאטום היוד אינה יכול הלהיעשות ללא הפרעה אסטרית .שימוש בנוגדנים המכוונים כנגד הצד אליו נספח היוד עשוי שלא לעבוד בשל הפרעה זו. עם זאת ,זמן מחצית החיים של יוד רדיואקטיבי ,המאופיין בקרינת גמא ,הוא קצר .לעומת זאת ניתן להשתמש בהורמונים המיוצרים עם פחמן רדיואקטיבי ,שיש לו קרינת בטא ,והיא בעלת זמן מחצית חיים הרבה יותר ארוך. ילו השתמשה בתחרות מול ההורמון ה"קר" לפיתוח ה :RIA-מכניסים למבחנה נוגדן ספציפי כנגד הורמון ,מוסיפים הורמון מסומן רדיואקטיבית ,ומניחים לחלבונים להיקשר )לרוב .(Over nightלמחרת שוטפים את ההורמון המסומן ומודדים מהו היחס בין ההורמון הקשור להורמון החופשי ) Bound/Free .(Fractionשימו לב שכמות הנוגדן קטנה מכמות ההורמון הרדיואקטיבי :אם היו הרבה נוגדנים כל ההורמון החם היה נקשר ולא היה יחס .Bound/Free כעת ,נוסף לדגימת ההורמון החם מוסיפים הורמון קר .כעת יש תחרות בין שני סוגי ההורמון על הקישור לנוגדן .כל הנוגדנים קושרים משהו ,ולכן כאשר משקיעים את הנוגדנים ניתן למדוד את מידת הסימון הרדיואקטיבי כ.Bound Fraction- פרקציית ההורמון הקשור שהתקבלה בשלב הראשון הBinding- בתור מוגדרת ;Maximum ככל שמוסיפים יותר הורמון קר ,יורדת הפרקציה הרדיואקטיבית הקשורה הנמדדת ועל ידי כך ניתן לחשב את היחסים. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :5מדידת ריכוזי הורמונים 79 בניסוי כזה חשוב לבצע עקומת כיול וביקורות: כביקורות משתמשים בהורמון נקי ללא נוגדן ,כדי לראות מהי רמת הרדיואקטיביות הבזאלית שנובעת מהיספחות מולקולות הורמון לפלסטיק של המבחנה ) .(Blankכמו כן מבצעים בדיקה עם הורמון חם בלבד ,לצורך קבלת הMaximum - ,Bindingוכן אינקובציות עם כמויות הורמון קר ידועות ,על מנת לבדוק מהי מידת הירידה בקישור .חשוב להחסיר את ה Blank-מכל אחת מהדגימות עם הנוגדן. את הערכים המתקבלים ) (CPM – counts per minuteמשקללים לאחוז הקשירה )(% binding ומחשבים בסקאלה לוגריתמית על מנת לקבל תוצאות בגרף לינארי .בצורה זו ניתן יהיה לחשב את כמותו המדוייקת של ההורמון בדגימה )כל עוד הערכים שלו נמצאים בתחום עקומת הכיול(. ייצור נוגדנים כנגד הורמונים הזרקה של הורמונים מחיה אחת לגופה של חיה אחרת תגרום לזיהוי החלבון כגוף זר והפעלת תגובה חיסונית ,הכוללת ייצור מסיבי של נוגדנים. בצורה כזו ניתן להפיק נוגדנים לחלבונים הזרים בין אורגניזמים שונים; אולם מה בנוגע להורמונים הדומים בין בעלי החיים ,כמו הפפטיד הקצר ?OTבמקרים כאלו מחברים למולקולת הפפטיד לחלבון גדול יותר שייצור תגובה אימונית. לאחר החיסון מבודדים את התאים מייצרי-הנוגדנים )תאי פלזמה( ובוחרים ביניהם את אלו המייצרים את הנוגדנים בעלי הזיקה הגבוהה ביותר להורמון .מתאים אלו מיצרים היברידומות עם תאי מילומה ) – (myelomaתאי Bסרטניים בעלי תכונת אל-מותיות ) ,(immortalאך שאינם מייצרים נוגדנים .מבודדים החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב בקרה אנדוקרינית 80 את התאים ובודקים מהם הנוגדנים ואיכות הזיקה שלהם לחלבון המטרה .את ההיברידומות המונוקלונאליות מגדלים במסה בתרבית ,כך שמתקבלת כמות מסיבית של נוגדנים .ניתן גם להזריק את התאים לגוף העכבר ולהפיק את הנוגדנים מגוף העכבר. תרביות מונוקלונליות ספציפיות לאפיטופ מסויים על גבי החלבון; תרביות פוליקלונליות ספציפיות לחלבון אולם נקשרות למגוון אפיטופים על גביו .הספציפיות שלהן ,באופן יחסי ,נמוכה יותר אולם הקישור לאפיטופים רבים מאפשר אמפליפיקציה כפי שנדרש ,למשל ,מנוגדן שניוני. מהימנות המבחן במבחן ,RIAכמו בכל מבחן ,ישנם כמה דברים שצריך לבדוק: • מבחן מקבילות – האם הדגימה מכילה חומר אחר המוכר על ידי הנוגדן .לשם כך מריצים את הסטנדרט מול מהילה בהורמון קר; במקביל ,מוהלים את דגימת הפלזמה ביחסים דומים לסטנדרט .אם הקווים מקבילים ניתן לדעת שהנוגדן נקשר להורמון המבוקש בלבד. אם הקווים אינם מקבילים סימן שיש חומרים אחרים שנקשרים לנוגדן או שהקישור אינו זהה לקישור להורמון הסטנדרט. • ספציפיות – מידת הביטחון שהקישור נעשה להורמון הנתון בלבד .מדידה זו נבדקת בעזרת הורמון של הורמון אחר מאותה משפחה. למשל ,נוגדן לאסטרדיול הינו בעל Cross- Reactivityגם לאסטרון ,הורמון אחר דומה, ולכן אם יהיו ריכוזים גבוהים של אסטרון בדגימה הוא יכול להתחרות על האסטרדיול. • דיוק – המצוי מול הצפוי. • רגישות – מהי המסה הנמדדת הנמוכה ביותר השונה מן האפס. • עקיבות – מהי השונות בתוך אותו המבחן ובין מבחנים שונים. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :5מדידת ריכוזי הורמונים 81 )Enzyme-Link Immunosorbent Assay (ELISA “Sandwich” ELISA • קושרים לבאריות בפלטה נוגדן מונוקלונלי לאפיטופ מסויים ) ;(captureכמות הנוגדן גבוהה מכמות ההורמון בדגימה. • מוסיפים את הדגימה ,ואם ההורמון נמצא בה הוא יקשר לנוגדן. • שוטפים את שאריות הדגימה ומוסיפים נוגדן שני ) ,(detectionהנקשר לאפיטופ אחר בהורמון וכן קשור לאנזים המסוגל לבצע פעולה המייצרת צבע. • ככל שיש יותר צבע ,יש יותר קשירה = יותר הורמון. להבדיל מה ,RIA-כאן אין קשירה תחרותית ולכן כמות הנוגדן הנדרשת גבוהה מאוד – כדי שבכל ריכוז יישארו עודפי נוגדן וכל ההורמון הנמצא בדגימה ייקשר ,על מנת שהמדידה תהיה מדוייקת. שיטת ELISAעם תחרות בדיקת Sandwich ELISAפחות רגישה מבדיקה עם תחרות ,ולכן פותחה ELISAעם תחרות: • סופחים את ההורמון עצמו לתחתית הבאריות; • מוסיפים נוגדן שקשור לאנזים המפיק צבע; • מוסיפים נוגדן "קר" – דהיינו נוגדן שאינו ספוח לבאריות. הוספת הנוגדן ה"קר" מביאה לכך שחלק מהנוגדנים ייקשרו אליו ובשלב השטיפה יישטפו מהדגימה. בצורה זו ,התחרות מורידה את כמות הנוגדן הקשור בבארית ולכן גורמת לירידה בצבע. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב 82 בקרה אנדוקרינית In situ Hybridization במבחן זה משתמשים במולקולת גלאי )(probe הקומפלמנטרית ל mRNA-מסויים .הגלאי מסופח לחלבון ,DIGשאינו קיים בגוף החיה ,ונקשר אל ה mRNA-בכל מקום בו הוא מתבטא .בהמשך מוסיפים נוגדן כנגד DIGהמחובר לAlkaline - .Phosphataseהאנזים APמפרק סובסטרט ומשנה את הצבע שלו. העוברים שבהם עושים את המבחן הזה מקובעים בפורמלין ואינם חיים בשלב הבדיקה. כך למשל ניתן לראות ש PONC-מבוטא רק בהיפותלמוס ,וניתן אפילו לכמת את ה mRNA-במידה חלקית. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :6הומיאוסטזיס של סידן 83 נושא :6הומיאוסטזיס של סידן לסידן תפקידים רבים בגוף ,ועל מנת לשמור על רגישות לסיגנלים שהוא מעביר ריכוז הסידן בתוך התא נשמר נמוך מאוד וקבוע .הריכוז מחוץ לתא יכול להשתנות מאוד ,ולכן חשוב למנוע מהדבר לשנות את ריכוז הסידן בתא כמו גם לנטר את הריכוז החיצוני. הורמונים קשורים פראתירואיד הורמון ),(PTH קלציטונין ו- ) 1,25(OH)2D3ויטמין (Dהינם הורמונים המבקרים את ריכוזי הסידן .ההורמון PTHמיוצר בבלוטת הפרא- תירואידית ,הצמודה לבלוטת התירואיד )בלוטת התריס(. ירידה בריכוז הסידן בדם ,הנגרמת למשל על ידי הסרת בלוטת הפראתירואיד ,מובילה להתכווצות שרירית טטנית עד מוות. PTH הPTH- הינו פפטיד קצר ושמור הנחתך מפריקורסור ארוך יותר .הפריקורסור מכיל פפטיד נוסף ,המכונה ,Parathyroid Related-Hormone הדומה מאוד ל PTH-במבנהו ובפעילותו הביולוגית. בקרה על PTH ה PTH-מעלה את ריכוז הסידן בדם .מקור הסידן לצרכים אלו הינו בראש ובראשונה מהעצמות – המהוות מאגרי סידן )ויש שסוברים שזה היה תפקידה המקורי לפני שעלה הצורך בשלד המשמש ליציבה( .מקורות נוספים הינם דרך המזון ובקרת הסינון בכליה .רמות הסידן בדם מהוות את הבקרה להפרשת – PTHכאשר ריכוזי סידן גבוהים מהווים עיכוב להפרשת .PTH החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב בקרה אנדוקרינית 84 בבדיקת ריכוזי הסידן הגורמים לשחרור ,PTH שיפוע הגוף מתתחזק מאוד בריכוזים 1.20-1.25 .mmol/lזהו הריכוז התקין של סידן בדם. תאים המפרישים PTHרגישים לריכוז הסידן בדם; ה PTH-מוחזק בתאים אלו בוזיקולות המשחררות אותו לזרם הדם לאחר איחוי עם הממברנה .אולם ,וזיקולות מעין אלו משתחררות לרוב עקב עלייה בריכוז הסידן באיזור הממברנה; אלא שבתאים אלו הסיגנל של ירידת הסידן ,הנקלט על ידי רצפטורים ממברנלים ,מוביל לעלייה בסידן בתוך התא ,המאפשר איחוי הוזיקולות המפרישות .PTH על גבי תאים אלו ישנם קולטני סידן )ממשפחת (7-transmembrane הקשורים פפטיד ל.G-protein- הקולטן מכיל הרבה חומצות אמינו עם שיירים שליליים ,המאפשרים קישור של יון הסידן בעל הערכיות החיובית. בצורה זו הקולטנים יכולים לחוש את ריכוז הסידן החיצוני :כאשר ריכוז הסידן מעל סף מסויים ,הקולטן קושר סידן ,מופעל ומפעיל .G-Proteinהפעלה זו מובילה לירידה בריכוז cAMPועיכוב בהפרשת ה- .PTH אפשר ללמוד על הבקרה של הפרשת ה PTH-דרך מחלות הנובעות ממוטציות גנטיות בקולטן :אם מוטציה מובילה לכך שהקולטן אינו יכול לקשור את הסידן ,הוא אינו יכול לעכב את שחרור PTHולכן ריכוז הסידן בדם יהיה גבוה .בעיות הנובעות ממוטציה זו הן עיוותים קלים במבנה העצם וריכוזי סידן גבוהים בדם. מוטציות אחרות גורמות להפעלה קבועה של הרצפטור ,כך שה PTH-אינו משוחרר לדם כלל .במצב זה ריכוז הסידן בדם יהיה נמוך מאוד והחולים ייסבלו מהתכווצויות טטניות .אם ההתכווצויות יהיו חזקות מאוד, הדבר יוביל גם למוות .זה עדיין לא ברמת כריתת הפראתירואיד ,כיוון שיכול להיות שפותחו חלופות עם התפתחות החולים )שנולדו עם המחלה( או שיש זליגה טבעית של .PTH חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :6הומיאוסטזיס של סידן 85 תפקידי הPTH- • ספיגת סידן במעי – תאי האפיתל של המעי מכילים ) ,Ca-Binding Protein (CaBPהמאפשר קישור של הסידן מהמזון והעברתו בוזיקולות לזרם הדם PTH .מעלה את ריכוז ה CaBP-בתאי האפיתל. • מניעת איבוד סידן בכליה • שחרור סידן מהעצם – להבדיל משתי התגובות האחרות ,פירוק העצם אסור שיהיה מהיר .העצם בנויה מאוסטאונים ,מבנים עשויי רובדים מעגליים המורכבים מהפרשות קולגן ושקיעות קריסטלים של זרחן וסידן המחזקים את העצם .בניית העצם נעשית על ידי תאי האוסטיאובלאסטים ,בעוד שפירוק העצם נעשה על ידי אוסטיאוקלאסטים .גדילת העצם, למשל בעצם על בסיס סחוס ,מתבססת על שיווי המשקל בפעילות של שני סוגי תאים אלו :האוסטיאוקלאסטים מפרקים את הסחוס ואחריהם מגיעים האוסיאובלאסטים ,המפרישים את החומר הגרמי והקשה של בניית העצם; כשהללו "נקברים" בתוך העצם הם הופכים לאוסטיאוציטים. האוסטיאוקלאסט הוא תא מרובה-גרעינים הנצמד אל העצם ומפריש פרוטונים לתווך .הדבר מוביל לירידה ב ,pH-הגוררת פירוק של העצם .מכיוון שה PTH-צריך להעלות את ריכוז הסידן ,צפוי שהרצפטורים שלו יהיו על גבי האוסטיאוקלאסט; אולם בפועל הרצפטורים ל PTH-נמצאים על גבי האוסטיאובלאסט ,אשר בקליטת האות מעביר אות נוסף אל האוסטיאוקלאסט ומשפעל אותו. העצם מכילה תאי פריקורסור-אוסטיאוקלאסט אשר כאשר הם ייתחברו יחד וייצרו תא מרובה-גרעינים הם יהוו אוסטיאוקלאסט .תאים אלו מבטאים רצפטור המכונה Receptor of activator kB factor nuclear ) .(RANKהפעלה של RANKמעוררת את הפריקורסור לחפש פריקורסורים נוספים ולהפוך לאוסטיאוקלאסט פעיל RANK .מופעל על ידי – RANK-ligandהורמון פראקריני המופרש מהאוסטיאובלאסט .הליגנד מיוצר ומופרש בתגובה ל.PTH- בנשים מבוגרות שכיחים מקרי שבירת עצם עקב אוסטאופרוזיס ,ולנשים מעל גיל 50מומלץ לבצע בדיקות תדירות של צפיפות עצם .הירידה בצפיפות העצם נובעת מהשפעה על המערכת שתוארה החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב בקרה אנדוקרינית 86 לעיל :החלבון OPGהוא חלבון המיוצר על ידי אוסטיאובלאסטים ומהווה חיקוי של הרצפטור .RANKייצור מאסיבי של OPGקושר את ,RANK-ligandכך שיש פחות קישור והפעלה של RANKולכן קיימים פחות אוסטיאוקלאסטים .ההורמון אסטרוגן ,המופרש באופן קבוע מהשחלה במהלך הביוץ ,גורם לייצור מוגבר של OPGועיכוב ההפרשה של ה .RANK ligand-ייתכן שעובדה זו מהווה את הסיבה לכך שבנות גדלות מהר יותר ,ועוצרות מוקדם יותר ,מבנים .ואולם, בגיל הבלות נפסקת הפרשת האסטרוגן בנשים; ה OPG-נעלם וייצור הליגנד אינו מעוכב ,ולכן RANKמופרש וגורר הפעלה גבוהה של אוסטיאוקלאסטים .עקב כך יש פירוק עצם מהיר יותר ביחס לגילאים צעירים יותר ,המוביל לירידה בצפיפות העצם. • הפרשה של PTHמעודדת את האוסטיאובלאסט להפריש .RANK Ligand • קישור של הליגנד לרצפטור RANKמעודד פריקורסור-אוסטיאוקלאסטים להפוך לתא אוסטיאוקלאסט פעיל ,המתחיל בתהליך פירוק העצם ושחרור סידן. • אסטרוגן מעודד הפרשת OPGעל ידי אוסטיאובלאסטים OPG .הוא אנלוג של RANK ,Ligandהנקשר לרצפטור RANKומונע התהוות אוסטיאוקלאסטים .ירידה בכמות האסטרוגן מעודדת היווצרות מאסיבית של אוסטיאוקלאסטים ומעלה סיכון להדלדלות עצם. על מנת להוסיף ולחקור את השפעת PTHעל אוסטיאובלאסטים ,נתנו לעכברים טיפול ממושך ב– PTH- בין אם בזריקות יומיות ובין אם באינפוזיה – וחיפשו גנים המופעלים על ידי PTHבעזרת .microarray ישנם לא מעט גנים שעולים בכל טיפול – ולכן החוקרים חיפשו משהו שתמיד עולה; בתנאי זה עלה מספר קטן של גנים שאחד מהם היה גן ידוע שלא הוכר כמעורב בתהליך – .MCP-1 חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :6הומיאוסטזיס של סידן 87 במחקר שנערך על מעורבות ,MCP-1לקחו cell-lineשל אוסטיאובלאסטים והדגירו אותם בריכוזים עולים של PTH )עליון( .ניכרה עליה בביטוי של ,MCP-1דבר המאשר את תוצאות ה .microarray-בשלב השני )אמצעי( לקחו את אותו cell-lineובדקו את ריכוז ה MCP-1-במדיה בתגובה להדגרה עם ;PTHניכרה עלייה ביחס ישר לעלייה ב ,PTH-מכאן שהחלבון לא רק מיוצר ביתר אלא גם מופרש החוצה מהתאים. מכיוון שאותו דגם פעילות קיים גם ב ,RANK ligand-ביקשו החוקרים לבדוק מהי ההשפעה על אוסטיאוקלאסטים .לצורך כך גידלו תרבית של פריקורסור-אוסטיאוקלאסט )תחתון( ובדקו מה קורה בהוספת ) MCP-1לפי ספירת תאים מרובי-גרעינים(. למרות שלא הייתה תגובה להוספת MCP-1לבדו ,הוספת MCP-1+RANK ligandמובילה לתגובה סינרגית חזקה של יצירת אוסטיאוקלאסטים – הרבה יותר מאשר התגובה לRANK - ligandלבדו. קלציטונין גם קלציטונין הוא פפטיד ,המיוצר על ידי תאי Cהמצויים בבלוטת התריס ) .(thyroidתפקיד הקלציטונין להוריד את ריכוז הסידן ולכן הוא מדכא את פעילות האוסטיאוקלאסטים דרך רצפטורים לקלציטונין המצויים על גבי האוסטיאוקלאסט. הקלציטונין גם מושפע מריכוז הסידן – הוא מופרש כאשר ריכוז הסידן בדם עולה ,והחישה של ריכוז הסידן על ידי תאי Cנעשית על ידי רצפטורים זהים לרצפטורים של התאים מפרישי ה PTH-אולם התאים האלו מגיבים לריכוז בצורה שונה – כאן הם מעלים את ריכוז ה cAMP-בתא )במקום להוריד אותו( כך שוזיקולות הקלציטונין יכולות להתאחות עם הממברנה ולשחרר את הפפטיד. ויטמין D המולקולה 7-Dehydroxycholestrolהינו נגזרת של כולסטרול .כאשר קרינת UVפוגעת במולקולה אחת הטבעות נפתחת .המבנה ההידרופובי עובר הידרוקסילציה בכבד ,תהליך המוריד מעט את ההידרופוביות של המולקולה )יכול להיות גם חיבור של שני הידרוקסילים או חיבור הידרוקסילים במקומות שונים(; גם בכליה יכולים להתווסף הידרוקסילים למולקולה .התוצר הינו מולקולה פחות ופחות הידרופובית ,כך שהמולקולה יכולה להינשא בקלות רבה יותר בדם. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , חמוטל בן דב בקרה אנדוקרינית 88 התהליך הזה נראה כמו תהליך של סילוק פסולת :קרינת ה UV-פגעה במולקולה המקורית וכדי לסלקה ביתר קלות המולקולה עוברת תהליכים שהופכים אותה מסיסה יותר ,על מנת שיהיה קל יותר להפריש ולפנות אותה. בתהליך זה מיוצר ויטמין .D ישנה תיאוריה הגורסת שרבים מההורמונים התחילו באבולוציה כטעות או פסולת שיש להיפטר ממנה ועם הזמן הפכו לסיגנל. Rickets מחלה זו מובילה לגפיים עקומות בשלד והייתה נפוצה במאה ה 18-ובתחילת המאה ה,19- בתקופת המהפכה התעשייתית .בתקופה זו חל מעבר מהכפר אל העיר וילדים היו עובדים בבתי חרושת כל שעות היום; במדינות צפוניות ,שגם כך אין בהן הרבה אור. הדבר הוביל למחסור בויטמין Dבקרב אותם ילדים .על תופעה זו עלה רופא שראה שבכפר אין Ricketsובעיר יש, ומכאן שצריך להיות חשופים לאור; ואכן כשילדים נשלחו להבראה בכפר, חל שיפור במצבם. שנתיים מאוחר יותר רופא אחר גילה שלא צריך להוציא את הילדים לחופשה ,ואפשר לתת להם פשוט שמן דגים; רק 100שנים מאוחר יותר גילו שהקשר בין האור לשמן הדגים הוא ויטמין .Dמחלה אחרת שהתגלתה הייתה מחלת השחפת – באנשים שחלו בשחפת )לפני תקופת האנטיביוטיקה( והוצאו להבראה במקומות עם שמש חל שיפור במצבם. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , נושא :6הומיאוסטזיס של סידן 89 ייצור ויטמין D קרינת UVמייצרת את ויטמין D הלא-פעיל )שזה מה שמקבלים בכדורי ויטמין( מ;7-Hydroxycholestrol- הסובסטרט הזה נע בדם ומגיע לכבד, שם הוא עובר הידרוקסילציה על פחמן .(25-OH-D3) 25הוא יכול לעבור הידרוקסילציות נוספות אולם לאחר קבלת הידרוקסיל 25-הוא זורם בדם אל הכליה ,שם נוסף לו הידרוקסיל בעמדת פחמן ;(1,25-OH-D3) 1זוהי הצורה הפעילה של הויטמין. ה PTH-מעלה את ריכוז ויטמין Dעל ידי עידוד ההידרוקסילציה בכליה וייצור ויטמין Dפעיל. קרינת השמש מובילה את צורת הויטמין הלא-פעילה לתוך הכבד; PTHמעודד יצירה של הצורה הפעילה בכליה .יחד ,ויטמין Dו PTH-מובילים לשחרור של סידן מהמעי ,כליה ומהעצמות .בעוד שפעילות PTHיכולה להיות מיידית ,הצורך בויטמין Dהינו תחזוקתי וארוך טווח. מכיוון שויטמין Dהידרופובי בעיקר, הוא יכול לחדור ישירות דרך הממברנה ולכן יש לו רצפטור ציטופלזמטי אשר בקישור לויטמין Dנכנס לגרעין )נחשב כרצפטור גרעיני( .כמו ,PTH גם ויטמין Dמגביר את ביטוי CaBP במעי על מנת להגדיל את קליטת הסידן מהמזון; בכליה הוא מגביר את ביטוי משאבות הסידן המסלקות סידן מתסנין השתן; וגם בעצמות ישנם רצפטורים למעשה, גרעיניים רצפטורים לויטמין; לויטמין D נמצאים בכל רקמה. תפקידי ויטמין D עודף סידן במזון • • • ירידה בהפרשת PTH ירידה בייצור ויטמין D ירידה בספיגה של הסידן מהמזון לדם החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 , מחסור בסידן במזון בדם • • • הפרשה של PTH עלייה בייצור ויטמין D עלייה בריכוז הסידן בדם חמוטל בן דב בקרה אנדוקרינית 90 אולם לויטמין Dיש פעילויות נוספות; כאמור ,ויטמין Dהתגלה על ידי מחלת – Ricketsשכן חשיפה לאור או צריכת שמן דגים 21 הובילו לעלייה בכמויות ויטמין Dהמופק/נצרך על ידי הילדים .פעילויות נוספות שנמצאו לויטמין: • ישנם כ 1,000-גנים בעלי אתר קישור בפרומוטור לרצפטור הגרעיני של ויטמין .D • תפקיד אנטי סרטני – חלק מהגנים המושפעים על ידי הרצפטור מעכבים חלוקה של תאי סרטן ומעודדים התמיינות. • תפקיד אנטי-בקטריאלי – שניים מהגנים שעולים בטיפול בעזרת ויטמין Cathelicidin & ) D (Defensin-β2הם גנים עם פעילות חיסונית לא-ספציפית אנטי-בקטריאלית אנטי-פטרייתית .כמו כן הגנים האלו מעלים את העמידות בפני חיידקי השחפת )משום כך חולים שנשלחו להבראה במקומות עם שמש והתחילו לייצר ויטמין Dהפגינו שיפור במחלה(. • לויטמין Dיש השפעה במוח ונמצא לאחרונה קשר בין הויטמין למצבי הרוח – מחסור בויטמין D משפיע גם על מצבי הרוח. לאחרונה שינו את ערכי הגבולות של ויטמין ;Dעל מנת לשמור על רמות סידן תקינות נדרשת רמה מסויימת של ויטמין ,Dאולם לשם פעילויותיו האחרות צריך רמות גבוהות יותר .עדכון זה הוביל לכך שמרבית הנבדקים סובלים כיום ממחסור בויטמין .D חלק מהתפקידים של הויטמין התגלו במחקרים אפידמיולוגיים – כאשר ראו במחקרים בארה"ב ,שנמצאת בכמה קווי רוחב ,שבמקומות צפוניים יותר יש יותר מקרי דיכאון וסרטן מאשר באיזורים הדרומיים .אולם מה עם בעלי חיים ,שלא מקבלים תוספי מזון? מקור נוסף לויטמין הינו מצמחים ולכן ייתכן שהם מקבלים תוספים באופן "בלתי-מכוון" מהמזון שלהם. 21שמן דגים הינו נוזל הידרופובי המופק מהדגים ולכן מכיל את הויטמין ההידרופובי .הצריכה בצורת שמן גם עוזרת לספיגה שלו בצורת המיצלות על ידי המעי. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011-2012 ,
© Copyright 2024