גנטיקה - מעבדה

‫שיעור ‪ :01‬מבוא למוטציות בחיידקים‬
‫‪1‬‬
‫שיעור ‪ :01‬מבוא למוטציות בחיידקים‬
‫ספרות ורקע על המעבדה‬
‫קריאת חובה‪Molecular Genetics of Bacteria, Mutations in Bacteria, Capter 3 pages 75- :‬‬
‫‪.102‬בקורס אנחנו נגיע למסקנות כאלו ואחרות אך יש מי שחושב אחרת ולכן יש גם קריאה מומלצת‬
‫לראות ולהכיר גישות אחרות‪.‬‬
‫העבודה בחלק זה תבוצע בחיידקי ‪ .E.coli‬חיידקים אלו היו מקור בסיסי למחקר מנגנונים בסיסיים רבים‬
‫בביולוגיה וגנטיקה ונחקר מזה כ‪ 100-‬שנה‪ .‬החיידק מכיל גנום של כ‪ 4.5-‬מיליון זוגות בסיסים וכ‪4000-‬‬
‫גנים‪ ,‬כאשר אחוז מאוד גבוה מתוכם מוכר היום למדע‪.‬‬
‫יתרונות בעבודה עם חיידקים‬
‫•‬
‫קטנים מאוד – ניתן להגיע לאוכלוסיות מאוד גדולות בנפח מאוד קטן‪ .‬במבחנה קטנה ניתן לגדל‬
‫תרבית של מיליוני חיידקים‪ .‬גודל האוכלוסיה חשוב משום שבמחקר גנטי אנחנו מחפשים פרטים‬
‫שהתכונות שלהם נדירות – מוטנטים – ולכן אוכלוסיות גדולות מגדילות את הסיכוי למצוא פרטים‬
‫נדירים אלו‪.‬‬
‫•‬
‫זמן דור – הזמן שדרוש לאוכלוסיה להכפיל את עצמה‪ .‬לחיידק ‪ E.coli‬זמן דור של כ‪ 20-‬דקות‪.‬‬
‫הגדילה היא אקספוננציאלית כך שביום אחד אפשר להגיע לאוכלוסיות של מילארדים‪.‬‬
‫•‬
‫הפלואידים – הפנוטיפ הוא הגנוטיפ ולכן קל יותר לראות אותו‪ ,‬אין מיסוך על ידי אלל שני‪.‬‬
‫•‬
‫רבייה א‪-‬מינית – חיידק אחד משכפל את הגנום בדיוק יוצא דופן ומתחלק לשני תאים בעלי אותו‬
‫מטען גנטי‪ .‬חיידק אחד שמתרבה כמה שעות יוצר שבט )‪ (clone‬שלכולם אותו מטען גנטי‪ .‬אם למשל‬
‫מבקשים להפיק חלבון‪ ,‬יעיל יותר להפיק אותו משבט מסויים מאשר מחיידק בודד‪.‬‬
‫•‬
‫קל לעשות מניפולציות גנטיות – אפשר להוריד גנים‪ ,‬להשתיק אותם‪ ,‬להוסיף גנים ולהעביר גנים‬
‫בין חיידקים‪ ,‬בניגוד למערכות של תאים הומניים‪ .‬בעזרת החיידקים ניתן להתעסק בגנטיקה בלי‬
‫מכשולים טכניים של המערכת‪.‬‬
‫מוטציות‬
‫מוטציה היא כל שינוי ברצף ה‪ DNA-‬שעובר בתורשה לצאצאים הבאים‪ .‬מוטציות יכולות להיות ממגוון‬
‫סוגים‪ :‬חסרים‪ ,‬הוספות‪ ,‬החלפות וכדומה‪ .‬מוטציות יכולות להשפיע על גנים באופנים שונים – הן יכולות‬
‫למנוע תוצר גני‪ ,‬לשנות את אורכו ולהשפיע על התכונות שלו כמו אינטראקציה עם סובסטרטים או‬
‫חלבונים אחרים‪.‬‬
‫מוטציות יכולות להתרחש כתוצאה מגורם חיצוני – קרינה או חומר כימי שמשנים את ה‪ ,DNA-‬או על‬
‫ידי מנגנונים טבעיים‪ ,‬למשל טעויות שיכפול של ‪ DNA-Polymerase‬שאינן מאותרות במנגנון ההגהה‪.‬‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬
‫‪2‬‬
‫מקור העניין במוטציות‬
‫נניח שיש אוכלוסיית חיידקים ובתוכה חיידקים שפיתחו עמידות לאנטיביוטיקה; בעזרת האנטיביוטיקה‬
‫ניתן לבצע סלקציה ולברור את הפרטים העמידים‪ .‬היכולת הזו מכונה סמן או ‪.marker‬‬
‫מרקרים אינם רק מוטציות של עמידות‪.‬‬
‫חיידקים יודעים לסנטז את כל חומצות האמינו שלהם; חיידק מסוג זה מכונה פרוטוטרופ‪ .‬יחד עם זאת‬
‫ישנם מוטנטים הפגועים במסלול הביוסינטטי של הפקת חומצות אמינו כזו או אחרת‪ .‬חיידק כזה יהיה‬
‫מכונה אוקסוטרופ של אותה חומצת אמינו‪.‬‬
‫חיידק שלא יודע לסנטז אלמנט מסויים מכונה אוקסוטרופ ביוסינטטי‪ .‬אולם יש עוד סוג אוקסוטרופיה‪,‬‬
‫אוקסוטרופיה קטאבולית‪ :‬חיידק כזה אינו מסוגל לנצל מקור פחמן מסויים בתור מקור פחמן לגידול‪ .‬כך‬
‫למשל חיידק שלא יכול לנצל לקטוז לגידול מכונה אוקסוטרופ ללקטוז‪ .‬מרקרים אחרים יכולים להיות‬
‫גודל המושבה‪ ,‬צורתה‪ ,‬הצבע שלה וכן רגישות לטמפרטורה‪.‬‬
‫מוטציות יכולות לעזור לנו לא רק לבודד פרטים אלא גם ללמוד על תהליכים שונים‪.‬‬
‫שיעור מוטציה‪ ,‬סלקציות והעשרות‬
‫מוטציות הן אירועים נדירים‪ ,‬ולכן נקבע מושג שיעור‬
‫המוטציה – הסבירות שנמצא חיידק בעל מוטציה‬
‫מסויימת באוכלוסיה‪ .‬שיעור המוטציה משתנה והוא‬
‫תלוי פנוטיפ לחלוטין‪.‬‬
‫נניח שיש תרבית המכילה מיליארד חיידקים ומתוכם‬
‫בערך ‪ 10‬הם המעניינים אותנו‪ .‬כיצד נוכל לחלץ‬
‫אותם מהתמיסה? אנחנו יכולים לקחת את התמיסה‬
‫הנוזלית ולגדל את הפרטים בתור מושבות על צלחות‪ .‬ואולם‪ ,‬עדיין יש לנו בעיה כי יש גבול לכמות‬
‫המושבות המבודדות שניתן לזרוע על צלחת‪.‬‬
‫אם החיידקים עמידים לחומר כלשהו‪ ,‬למשל‬
‫אנטיביוטיקה‪ ,‬ניתן לגדל אותם על מצע עם‬
‫אנטיביוטיקה ואז המוטנטים יהיו היחידים שייגדלו;‬
‫זוהי סלקציה חיובית – יצירת תנאים שבהם אך ורק‬
‫המוטנטים גדלים‪ .‬אולם מה קורה עם חיידקים‬
‫שפגועים במסלולים מסויימים‪ ,‬למשל סינטזת‬
‫היסטידין?‬
‫במקרה הזה אנחנו עושים סלקציה שלילית‪ :‬זורעים‬
‫את החיידקים על מצע עשיר‪ ,‬שמאפשר לכל‬
‫החיידקים לגדול‪ ,‬רק כדי להפריד בין פרטים בודדים;‬
‫חמוטל בן דב‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫שיעור ‪ :01‬מבוא למוטציות בחיידקים‬
‫‪3‬‬
‫אז דוגמים כל מושבה פעם אחת על פלטה ללא היסטידין ופעם אחת לפלטה עם היסטידין‪ .‬האוקסוטרופים‬
‫להיסטידין לא ייגדלו בצלחת הראשונה ולכן נדע שהם האוקסוטרופים‪ .‬שימו לב שצריך לשמור את‬
‫המושבה המקורית כדי לחזור אליה‪ .‬לשיטה זו יש חיסרון גדול מאוד כי אנחנו עדיין צריכים לסרוק‬
‫צלחות גידול שלמות כדי למצוא מוטנט בודד‪.‬‬
‫על מנת לשפר את התהליך עושים העשרה‪ .‬ההעשרה‬
‫נעשית במערכת של סלקציה נגדית‪ .‬נניח שרוצים‬
‫לחפש חיידק שאינו עמיד לעקת חום‪ .‬עקת חום‬
‫מתרחשת כאשר מגדלים את החיידקים בטמפרטורה‬
‫של ‪ .42°C‬מגדלים תרבית של חיידקי ‪ WT‬ב‪-‬‬
‫‪ ;42°C‬אם יש מוטנט לא עמיד הוא פשוט יפסיק את‬
‫הגידול שלו‪ .‬כאשר חיידק לא יכול להתמודד עם‬
‫התנאים הוא מפסיק את הגידול‪ ,‬אך לאו דווקא מת‪ .‬אם בשלב הזה נוסיף חומר שפוגע בחיידקים‬
‫שמתחלקים‪ ,‬המוטנט יהיה בסדר אבל החיידקים האחרים‪ ,WT ,‬ימותו )אנטיביוטיקת אמפצילין(‪ .‬בסוף‬
‫התהליך נשארים עם הרבה יותר חיידקים מוטנטים )ועדיין עם חלק מה‪ WT-‬שפשוט לא התחלקו בזמן‬
‫מתן האנטיביוטיקה מסיבות כאלה ואחרות( ועכשיו אפשר לבודד את החיידקים המוטנטים על ידי השיטה‬
‫שציינו קודם‪.‬‬
‫שימו לב‪ :‬בפועל בכל אוכלוסיית ‪ WT‬יש תת‪-‬אוכלוסיה שאינה מתחלקת ולכן תהליכי סלקציה‬
‫נגדית אינם מוחקים טוטאלית לא‪-‬מוטנטים‪ ,‬להבדיל מסלקציה חיובית‪.‬‬
‫למארקיזם ודארוויניזם‬
‫במעבדה נבצע סלקציה חיובית ונבודד מוטנטים בסלקציה נגדית‪ ,‬ובסוף נבחן את המקור למוטציות –‬
‫שאלה שטרדה חוקרים כבר לפני כ‪ 60-‬שנה‪ .‬הגישה הדארוויניסטית אומרת ששינויים גנטיים אקראיים‬
‫קורים כל הזמן‪ ,‬ואלו מביניהם שנותנים יתרון – שורדים‪ .‬הגישה הלמארקיסטית אומרת שהסביבה‬
‫גורמת לשינויים באופן ישיר בחיידק והשינויים האלה משפיעים על הגנום‪.‬‬
‫•‬
‫היפותזת המוטציה האקראית – מוטציות מתרחשות כל הזמן‪.‬‬
‫•‬
‫היפותזת השינוי הישיר – מוטציות מתרחשות רק כתוצאה מחשיפה לגורם סלקטיבי‪.‬‬
‫סלוואדור לוריה ומקס דלברוק היו שני חוקרים שבדקו איזו היא הגישה הצודקת‪ .‬הם פיתחו מערכת‬
‫פשוטה לבדיקה זו‪ ,‬שזיכתה אותם בפרס נובל‪ :‬המערכת הייתה עם חיידקים שרגישים לפאג' ‪ .T1‬בכל‬
‫תרבית יש מספר חיידקים שווה והם זורעים את החיידקים מתרבית עשירה למצע עם ‪.T1‬‬
‫החוקרים ציפו שלפי התפלגות המושבות המוטנטיות על הפלטות השונות הם יוכלו לקבוע האם זהו מצב‬
‫אקראי או מכוון‪ :‬אם השונות בין המושבות תהיה נמוכה‪ ,‬המודל יהיה למארקיסטי ואם שונות תהיה גבוהה‬
‫המודל יהיה דארוויניסטי‪.‬‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫‪4‬‬
‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬
‫לפי למארק‪ ,‬רק ברגע הפגישה עם הגורם הסלקטיבי‬
‫אפשר ליצור מוטנט‪ .‬כתוצאה מכך כל חיידק‬
‫שיתיישב על הפלאטה ויהיה לו אירוע מוטציה ייתן‬
‫מושבה אחת‪ .‬כמו כן מכיוון שמוטציה היא אירוע‬
‫נדיר אנחנו יכולים לצפות שמכל מבחנה נקבל‬
‫מושבות ספורות בלבד – אם בכלל‪ .‬אם נצייר גרף‬
‫של אירועי המוטציה הגרף יהיה צר מאוד‪ ,‬בעל‬
‫שונות מאוד נמוכה‪.‬‬
‫לעומת זאת לפי דארווין‪ ,‬המוטציות יכולות להתרחש‬
‫בכל שלב – ואפילו עוד במבחנה‪ .‬אם המוטציה‬
‫התרחשה מוקדם בנוזל החיידק המוטנט ממשיך‬
‫להתרבות ואז יש תת‪-‬אוכלוסיה של מוטנטים‪ .‬כל‬
‫חיידק מתת‪-‬אוכלוסיה זו ייגע בצלחת וייצור מושבה‪,‬‬
‫ולכן במקרים כאלה של מוטציה עוד בנוזל אנחנו‬
‫נקבל צלחת מלאה מושבות עמידות‪ ,‬לעומת מקרים‬
‫בהם לא הייתה מוטציה מראש ואז מספר המושבות‬
‫יהיה קטן מאוד אם בכלל‪ .‬קיומה של פלטה כזו‬
‫שמייצגת אירוע מוטציה מוקדם בנוזל מרחיבה את‬
‫השונות‪ ,‬מפזרת את התוצאות והופכת את הגרף‬
‫לשמן יותר‪ .‬כמו כן אנחנו יכולים לומר שאירוע‬
‫חמוטל בן דב‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫שיעור ‪ :01‬מבוא למוטציות בחיידקים‬
‫‪5‬‬
‫מוטציה אחד אינו שווה למושבה אחת – הוא יכול‬
‫להיות גם מקור למושבות רבות‪.‬‬
‫אירועי מוטציה‪ ,‬בכל אחת מהתיאוריות‪ ,‬מתפלגים‬
‫לפי התפלגות פואסון‪ ,‬הקרובה להתפלגות נורמלית‬
‫אבל מתייחסת למקרים בהם ההסתברות שמשהו‬
‫יקרה‬
‫היא‬
‫נמוכה‬
‫מאוד‪.‬‬
‫כאמור‪,‬‬
‫בגישה‬
‫הלמארקיסטית אירוע מוטציה אחד שווה למושבה‬
‫אחת ולכן אם נצייר גרף פואסון של ההתפלגות נראה הרבה צלחות ללא מושבות‪ ,‬מעט צלחות עם מושבה‬
‫אחת‪ ,‬פחות מכך עם שתי מושבות וכן הלאה‪ .‬בגישה הדארוויניסטית לעומת זאת‪ ,‬מוטציה אחת שווה‬
‫מספר רב של מושבות ולכן יכול להיות שתהיה התפלגות דומה לפואסון בהתחלה אבל יהיה גם פיק‬
‫מסויים באיזור של כמה עשרות או מאות מושבות – תלוי כמה מוקדם היה אירוע המוטציה בנוזל‪.‬‬
‫לפי ניסוי זה לוריה ודלברוק הצליחו לענות על‬
‫שאלת המקור הגנטי – והם הצליחו בעוד משהו‪:‬‬
‫לחשב את שיעור המוטציה‪ .‬הם הגדירו את שיעור‬
‫המוטציה )‪ (a‬בתור היחס בין מספר אירועי המוטציה‬
‫)‪ (m‬למספר החיידקים בתרבית )‪.(N‬‬
‫כמות החיידקים שהיו בתרבית לא בעיה לדעת‪ ,‬אבל‬
‫כמות אירועי המוטציות יותר מורכבת משום שאם‬
‫ספרנו חמש מושבות של מוטנטים אין משמעות‬
‫הדבר שהיו לנו חמישה אירועי מוטציה‪ :‬אם הגישה‬
‫של דארווין היא הנכונה הרי שיכול להיות שהיו כל מספר של אירועי מוטציה בין ‪ 1‬ל‪ 5-‬בנוזל‪ ,‬והם פשוט‬
‫התחלקו ולכן הגיעו בסופו של דבר לחמש מושבות‪ .‬לכן לוריה ודלברוק חיפשו דרך לדעת בכל זאת כמה‬
‫אירועי מוטציה היו‪ .‬אנחנו יודעים שאם יש צלחת עם אפס מושבות או מושבה אחת מספר אירועי‬
‫המוטציות ידוע בוודאות – ‪ 0‬או ‪ ,1‬בהתאמה‪.‬‬
‫לכן לוריה ודלברוק ספרו צלחות עם אפס אירועי‬
‫מוטציה‪ ,‬הציבו את הנתון הזה במשוואה של חישוב‬
‫ההסתברות הפואסונית‪ ,‬ומתוך זה חילצו את ‪,m‬‬
‫שיעור המוטציות‪.‬‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬
‫‪6‬‬
‫שיעור ‪ :02‬קוניוגציה בחיידקים‬
‫בשיעור שעבר‪ ,‬איה הזכירה את יתרונות חיידקים למחקר גנטי ואחד מהם היה העובדה שכאשר הם‬
‫מתרבים הם נוקטים בשיטה א‪-‬מינית כך שהמושבה תהיה אחידה מבחינת שונות הגנומים בפרטים‪ .‬היום‬
‫נבדוק האם באמת זו שיטת הרבייה היחידה העומדת לרשותם‪.‬‬
‫רבייה מינית בחיידקים?‬
‫מגדלים בשתי מבחנות שונות שני אוקסוטרופים שונים‪.‬‬
‫כאשר מאחדים דגימות מכל אחת מהמבחנות‪ ,‬מדגירים‬
‫וזורעים את החיידקים על צלחת שלא מכילה את החומר‬
‫הדרוש לכל אוקסוטרופ על מנת שייגדל‪ ,‬רואים שיש גידול‬
‫במושבות בודדות‪.‬‬
‫יכול להיות שהיו במבחנות המוצא רברטנטים אשר היו‬
‫מסוגלים לגדול על מצע עני‪ ,‬והצאצאים שאנו רואים‬
‫במבחנה המשותפת הם מוטנטים; על מנת לבטל אפשרות זו‬
‫שהצאצאים הם מוטנטים‪ ,‬החוקרים לדרברג וטאטום‬
‫)‪ (Lederberg & Tatum‬חזרו על הניסוי באוקסוטרופים‬
‫שהיו מוטנטים לשלושה מסלולים שונים‪ .‬הסיכוי שתהיה‬
‫רברסיה בשלוש מוטציות הוא נמוך מאוד‪ ,‬ואכן אין גידול‬
‫ממבחנות המוצא אך עדיין יש גידול במבחנה המשולבת‪.‬‬
‫החוקרים חשדו שקרה תהליך שזכה לכינוי קוניוגציה‪,‬‬
‫והצאצאים הם קוניוגנטים‪ .‬אולם‪ ,‬יכול להיות שזה לא‬
‫מעבר של חומר גנטי בין החיידקים כי אם הזנה –‬
‫האוקסוטרופ האחד מספק את צורכי האחר וההיפך‪ .‬לשם‬
‫כך החוקר דייויס )‪ (Davis‬ערך אותו הניסוי במבחנה‬
‫בצורת ‪ U‬עם ממברנה באמצע שמונעת מעבר חיידקים אך‬
‫לא מונעת מעבר מומסים; כך דייויס הוכיח שלא חומרים‬
‫מומסים הם העוברים‪.‬‬
‫ב‪ 1953-‬טבע החוקר הייס )‪ (Hayes‬את המונח ‪ Donor‬ו‪-‬‬
‫‪ ,Recipient‬כאשר החיידק ה"זכר" – התורם – מכיל‬
‫יחידת פלסמיד עם גנים המאפשרים העברת הפלסמיד‬
‫חמוטל בן דב‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫שיעור ‪ :02‬קוניוגציה בחיידקים‬
‫‪7‬‬
‫מהתורם אל המקבל‪ .‬בסדרת ניסויים זו נעסוק בחיידקים בעלי הפלסמיד‬
‫הקוניוגטיבי הראשון שגילו – ‪.F-plasmid‬‬
‫כיצד מבוצעת קוניוגציה?‬
‫חיידק תורם מסומן בתור ‪ F+‬ומסוגל להעביר את‬
‫הפלסמיד‪ F-‬שלו לחיידק מקבל‪ ,‬שהוא בהכרח ‪) F-‬לא ניתן‬
‫לתרום לחיידק שכבר יש לו את הפלסמיד הקוניוגטיבי(‪.‬‬
‫בשלב הראשון החיידק התורם בונה ‪ ,Pillus‬הנשלח אל‬
‫החיידק המקבל‪ .‬כאשר נוצר מגע הפילוס מתחיל להתקצר‬
‫עד שהחיידקים נצמדים‪ .‬לאחר שהם נצמדים מתחיל שכפול‬
‫של הפלסמיד תוך כדי הכנסת הגדיל הנגדי לגדיל המשוכפל‬
‫אל תוך לתא המקבל‪ ,‬במנגנון של ‪ .rolling circle‬בצורה‬
‫זו התא התורם משכפל את הגדיל האחד ומשאיר איתו‬
‫פלסמיד דו גדילי והגדיל השני נכנס לתא המקבל‪ ,‬שם הוא‬
‫משוכפל על ידי מקטעי אוקאזאקי‪.‬‬
‫בסופו של דבר לשני התאים יש פלסמיד דו‪-‬גדילי שלם‪.‬‬
‫‪F-Plasmid‬‬
‫המערכת של הפלסמיד חייב להכיל מספר אלמנטים‪:‬‬
‫•‬
‫‪ – Origin of Replication‬מקור תחילת ההכפלה‪,‬‬
‫המגובה על ידי מערך גנים הקשורים בשכפול של‬
‫הפלסמיד – ‪ .Replication Genes‬זה איזור שקיים‬
‫בכל פלסמיד שהינו בעל היכולת לשכפל את עצמו‬
‫לדורות הבאים‪.‬‬
‫•‬
‫‪ – Origin of Transfer‬מקור תחילת ההעברה‬
‫במנגנון ה‪ Rolling Circle-‬על ידי מערך הגנים‬
‫‪.Genes of Transfer‬‬
‫באיור שבעמוד הבא מופיע תהליך ה‪.Rolling Circle-‬‬
‫נראה שהגנים של ההעברה )‪ (Transfer Genes‬נמצאים‬
‫בסופו של המעגל שנכנס לתא המקבל; משמעות הדבר היא‬
‫שרק אם התא המקבל ייקלוט את כל הפלסמיד השלם‬
‫הוא יוכל להמשיך להעביר את הפלסמיד הלאה )יהפוך‬
‫לחיידק ‪ .(F+‬כמו כן‪ ,‬במהלך ההעברה הגדיל הנותר בתורם‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬
‫‪8‬‬
‫משמש כתבנית לשיכפול‪.‬‬
‫רכישת תכונות בסיסיות‬
‫על פי רוב‪ ,‬תכונות בסיסיות – כרומוזומליות – אינן נמצאות על גבי‬
‫פלסמיד‪ .‬אולם‪ ,‬בניסויים ראו שבעזרת קוניוגציה עברו תכונות של‬
‫יכולות בסיסיות‪ .‬הכיצד?‬
‫החוקר קאבאלי )‪ (Cavalli-Sforza‬בודד קבוצה של חיידקים‬
‫שנמצאו כמעבירים את התכונות הבסיסיות בשכיחות די גבוהה‪,‬‬
‫וכינה אותם ‪ .Hfr – High Frequency Recombination‬מה‬
‫שקאבאלי גילה היה שהפלסמיד עבר ריקומבינציה עם הכרומוזום‬
‫של החיידק‪ ,‬כך שכעת הכרומוזום מכיל את ה‪Genes of -‬‬
‫‪ Transfer‬ולכן מסוגל לעבור בין חיידק תורם למקבל‪.‬‬
‫הגן הקרוב ביותר לנקודת התחלת ההעברה יהיה הראשון שייכנס‬
‫לחיידק המקבל‪ .‬אולם‪ ,‬הכרומוזום משמעותית גדול מפלסמיד‪F-‬‬
‫ולכן ברוב המקרים הקוניוגציה נפסקת לפני מעבר שלם של‬
‫הכרומוזום‪ .‬בצורה זו החיידק המקבל רוכש לעצמו רק מקטע של‬
‫כרומוזום התורם ולא את כולו‪.‬‬
‫אם המקטע הלינארי של החיידק המקבל הכיל אלל תקין לאיזושהי‬
‫מוטציה של החיידק המקבל‪ ,‬על המקטע הלינארי הזה לעבור‬
‫ריקומבינציה לתוך הגנום של החיידק המקבל – רק כך האלל‬
‫התקין ייכנס לתוך הכרומוזום‪.‬‬
‫שימו לב‪ :‬כיווניות ההעברה נשמרת! הגנים של ‪ Tra‬נמצאים‬
‫באותו המקום על הכרומוזום כמו בפלסמיד‪ ,‬כלומר בסוף‪ ,‬ולכן‬
‫חמוטל בן דב‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫שיעור ‪ :02‬קוניוגציה בחיידקים‬
‫‪9‬‬
‫הכיווניות של הכרומוזום – מבחינת הגנים‪ ,‬המיקום שלהם‪ ,‬מרחקי המפה – נשמרים‪ .‬מסיבה זו חיידק‬
‫מקבל גם לא יהפוך לחיידק תורם של כרומוזומים אלא אם הכרומוזום כולו יעבור‪.‬‬
‫ריקומבינציה הומולוגית‬
‫בין‬
‫שני‬
‫מקטעים‬
‫קומפלמנטציה‬
‫שיש‬
‫יכולה‬
‫ביניהם‬
‫להתרחש‬
‫ריקומבינציה הומולוגית‪ .‬אם המקור‬
‫הוא למשל שני מקטעים לינארים‪,‬‬
‫אדום‬
‫וכחול‪,‬‬
‫ומתרחש‬
‫אירוע‬
‫ריקומבינציה אחד‪ ,‬מתקבלים שני‬
‫מקטעים לינארים עם חתיכות כחולות‬
‫ואדומות משולבות; בשני אירועים‬
‫עדיין נקבל מקטעים לינארים‪.‬‬
‫לעומת זאת‪ ,‬בין שני מקטעים מעגליים ריקומבינציה יחידה תוביל ליצירה של מקטע מעגלי אחד וגדול‪.‬‬
‫ריקומבינציה כפולה תביא להחלפה של מקטעים ושמירה על שני הכרומוזומים המעגליים‪.‬‬
‫בריקומבינציה הומולוגית בין מקטע לינארי למעגלי תתקבל בריקומבינציה בודדת לינאריזציה של המקטע‬
‫המעגלי‪ ,‬אבל בריקומבינציה כפולה נקבל שמירה על המעגליות‪/‬לינאריות של כל דו‪-‬גדיל והחלפת‬
‫מקטעים בין המקטע הלינארי למעגלי‪.‬‬
‫כיצד מתבצעת הכניסה של ‪ Hfr‬הפלסמיד לגנום?‬
‫‪ F-plasmid‬מכיל הרבה מאוד קטעי ‪ .IS elements‬הקטעים האלה‬
‫קיימים גם בכרומוזום ונוטים לעודד ריקומבינציה‪ ,‬כך שיש סבירות‬
‫גבוהה שתהיה ריקומבינציה יחידה שתכניס את ‪ F‬פלסמיד לתוך‬
‫הכרומוזום‪.‬‬
‫לעומת זאת‪ ,‬החיידק המקבל מכיל את המקטע הלינארי שקיבל‬
‫בקוניוגציה‪ ,‬ואם תהיה ריקומבינציה בודדת הכרומוזום של החיידק‬
‫יהפוך לינארי – מצב לא תקין‪ .‬לעומת זאת אם המקטע ‪ A+‬ייכנס‬
‫בריקומבינציה כפולה המעגליות של הכרומוזום תישמר‪ ,‬האלל ‪a-‬‬
‫יעבור למקטע הלינארי )אשר יעבור דגרדציה בגוף החיידק(‪,‬‬
‫והתוצאה תהיה החלפה של אלל אחד באלל אחר‪.‬‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬
‫‪10‬‬
‫במעבדה‬
‫אנחנו נעשה ניסוי של ‪ ,interrupted mating‬שבו ננסה לגרום לחיידקים לעבור קוניוגציה ונעצור אותה‬
‫לאחר פרקי זמן שונים‪ .‬מכיוון שהכיווניות נשמרת‪ ,‬ניתן לחפש סמנים מוכרים על הכרומוזום‪ ,‬לראות‬
‫באיזה סדר הם עוברים ולהחליט מהו הסדר הלינארי של הסמנים‪.‬‬
‫בשיטה הזו בעבר מיפו את כל הכרומוזום של ה‪ ;E.coli-‬אולם‪ ,‬על הכרומוזום יש כמה אתרי ‪IS‬‬
‫‪ elements‬כלומר שבין זני ‪ Hfr‬שונים נקודת תחילת ההעברה עשויה להיות שונה – כל פלסמיד‬
‫נכנס למקום אחר בגנום ולכן סדר המארקרים יהיה שונה לינארית )גם אם יהיה זהה מעגלית(‪ .‬כמו‬
‫כן הכיווניות של כניסת הפלסמיד יכולה להיות שונה‪.‬‬
‫יצירה של זן ‪ Hfr‬מזן ‪ F+‬ויצירה של '‪F‬‬
‫הפלסמיד נכנס בעזרת אתר ‪.IS elements‬‬
‫ריקומבינציה נוספת בין שני האתרים האלה יכולה‬
‫לפלוט החוצה את הפלסמיד‪ .‬אולם‪ ,‬אין חובה‬
‫שהריקומבינציה תתרחש בין אותם ‪IS elements‬‬
‫שהכניסו את הפלסמיד; היא יכולה באותה מידה‬
‫להתרחש רק בין אחד מה‪ IS elements-‬האלה ועוד‬
‫‪ IS element‬שאינו תוחם את הפלסמיד‪ .‬כתוצאה‬
‫מכך הפלסמיד החדש שנפלט מתוך הכרומוזום‬
‫מכיל פלסמיד‪ F-‬ועוד קצת – עוד גנים מתוך‬
‫הכרומוזום החיידקים‪.‬‬
‫הפלסמיד הזה מכונה פלסמיד '‪ ,F‬ואם הפלסמיד הזה‬
‫עובר בין חיידקים‪ ,‬מכיוון שהוא מספיק קטן כדי‬
‫לעבור בשלמות כמו פלסמיד ‪ ,F+‬הוא יישמור על‬
‫צורתו המעגלית בגופו של החיידק המקבל וכך‬
‫החיידק המקבל יהפוך דיפלואידי לגנים הספורים‬
‫שהועברו על ידי פלסמיד '‪ .F‬חיידק זה יהיה מכונה מרופלואידי או מרוזיגוט‪.‬‬
‫בשיטה זו למדו בעבר על תכונות של דומיננטיות ורצסיביות – על ידי יצירת מרופלואידים יכלו‬
‫לבדוק מיהו האלל הדומיננטי‪ ,‬זה שעל הכרומוזום או זה שעל הפלסמיד‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫שיעור ‪ :02‬קוניוגציה בחיידקים‬
‫‪11‬‬
‫סיכום‬
‫•‬
‫חיידק ‪ F-‬הוא חיידק ללא פלסמיד קוניוגטיבי ויכול להיות מקבל פלסמיד‪.‬‬
‫•‬
‫חיידק ‪ F+‬הוא חיידק המכיל פלסמיד קוניוגטיבי ויכול להיות תורם לחיידק ‪.F-‬‬
‫•‬
‫חיידק ‪ Hfr‬הוא חיידק שבו הפלסמיד עבר ריקומבינציה יחידה ונכנס לתוך הכרומוזום‪ .‬כעת החיידק‬
‫יכול להעביר מקטעים לינארים של הכרומוזום לחיידקים אחרים‪.‬‬
‫•‬
‫חיידק '‪ F‬הוא חיידק שהיה ‪ Hfr‬ואז‪ ,‬עקב ריקומבינציה פנימית בכרומוזום‪ ,‬הפלסמיד יצא החוצה‬
‫באופן יותר ממלא – וכעת הוא מכיל גנים כרומוזומליים‪ .‬החיידק יכול להעביר את הפלסמיד‬
‫לחיידקים אחרים ולהפכם למרופלואידים ובעלי ‪.Genes of Transfer‬‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬
‫‪12‬‬
‫מעבדה ‪ :03‬גנטיקה בשמרים‬
‫השמרים הם חלק ממערכת הפטריות‪ ,‬המכילה גם את העובש והפטריות‪ .‬השמר מתקיים באיזורים‬
‫מגוונים‪ ,‬בעיקר איזורים עשירים בסוכר – דוגמת קליפות ענבים‪.‬‬
‫מאפייני השמר‪:‬‬
‫•‬
‫חד‪-‬תא אאוקריוט בעל ‪ 16‬כרומוזומים‪.‬‬
‫•‬
‫עובר חילוף דורות ויכול להיות הפלואידי ודיפלוחאידי‪.‬‬
‫•‬
‫יכול לשמש מודל ליצורים מורכבים יותר )כי הוא אאוקריוט(‪.‬‬
‫•‬
‫הגנום שלו היה הראשון שרוצף‪ ,‬כאשר הוא מכיל ‪ 12‬מיליון זוגות בסיסים וכ‪ 6000-‬גנים שאנו‬
‫מכירים את הפונקציה של רובם )בניגוד לאדם בו מוכרת הפונקציה של פחות מרבע מהגנים(‪.‬‬
‫מניפולציות גנטיות‪ ,‬במיוחד חוסרים של גנים‪ ,‬הן קלות יחסית בשמר‪ ,‬ונעשות בעיקר על ידי‬
‫טרנספורמציות וריאקומבינציות‪ .‬ניתן להכניס לשמר מקטע לינארי המכיל גן סימון כלשהו – עמידות‬
‫לקאנאמיצין למשל‪ .‬משני צידי הגן יש מקטעים שיכולים לבוא בריקומבינציה עם קטע מסויים בגנום‪.‬‬
‫הריקומבינציה מכניסה את העמידות לגנום במקום הגן שאנחנו מבקשים לעשות לו חסר‪ ,‬ואז אנחנו יכולים‬
‫לבודד את השמרים שהכניסו את המקטע על ידי האנטיביוטיקה מחד‪ ,‬ולדעת שהם בעלי חסר בגן המעניין‬
‫אותנו מאידך‪.‬‬
‫מיטוזה‬
‫השמר יכול להתקיים בשני מופעים‪ :‬הפלואידי ודי‪-‬‬
‫פלואידי‪ ,‬המתרבים בחלוקות מיטוטיות‪ .‬בחלוקות‬
‫מיטוטיות יש הכפלה של ה‪ DNA-‬המחולק לאחר‬
‫מכן באופן שווה‪ ,‬בעיקרון‪ ,‬בין שני תאי הבת‪ .‬מכיוון‬
‫שזוהי מיטוזה‪ ,‬תאי הבת לרוב יהיו זהים לחלוטין‬
‫לתא האם )אלא אם תתרחש ריקומבינציה מיטוטית‪,‬‬
‫שהיא אירוע נדיר בתהליך זה(‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫מעבדה ‪ :03‬גנטיקה בשמרים‬
‫‪13‬‬
‫באיור הבא מופיע מחזור החיים של‬
‫השמר‪ .‬ניתן לעקוב אחר שלב החיים‬
‫של התא לפי גודל התא המנץ‪ ,‬עד‬
‫שהוא משתחרר מתא האם והופך לתא‬
‫בפני עצמו‪ .‬המחזור הזה קורה בתאים‬
‫דיפלואידים והפלואידים כאחד‪ .‬תא‬
‫האם יכול להיות מזוויג מסויים –‬
‫כאשר בשמרים הזוויגים הם ‪ a‬או ‪.α‬‬
‫דיפלואידים מכילים אללים של ‪ a‬ושל‬
‫‪ α‬יחד‪.‬‬
‫סקס בשמרים‬
‫כאשר שני תאים הפלואידים משני‬
‫זוויגים שונים נפגשים הם יכולים‪,‬‬
‫בתנאים מתאימים‪ ,‬לעבור ‪.mating‬‬
‫בתהליך זה כל תא מפריש פרומונים‪,‬‬
‫שהתא השני חש ואז שולח שלוחות‬
‫ומתקרב‪ .‬בתהליך ה‪ mating-‬שני‬
‫התאים מתאחים לאחד‪.‬‬
‫ספורולציה‬
‫ספורולציה היא תהליך המתרחש‬
‫במצבי עקה שאינם מאפשרים לשמר להתחלק מיטוטית‪ .‬כתוצאה מתנאי העקה התא הדיפלואיד יעבור‬
‫מיוזה ליצירת ספורות‪ ,‬שהן גוף עמיד יותר מהתא החי ויכולות לשרוד את תנאי העקה‪ .‬בתהליך‬
‫הספורולציה ארבעת תאי הבת של המיוזה אינם נפרדים אלא נותרים יחד בשק אסקוס וכל ספורה בתוך‬
‫השק הינה בעלת מעטפת קשיחה היכולה לעמוד בתנאי העקה‪ .‬ישנן שתי ספורות מכל זוויג בתוך אסקוס‬
‫ספציפי‪.‬‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬
‫‪14‬‬
‫לאחר שיעברו תנאי העקה יכולות הספורות לצאת מהאסקוס ולנבוט; מרגע שנבטו הם תאים הפלואידים‬
‫חיים‪ ,‬לא עוד ספורות‪ ,‬שיכולים לעבור זיווג עם שמר אחר מהזוויג ההפוך להם‪ .‬האיור הבא מציג שוב את‬
‫מחזור החיים של השמר‪ ,‬עם הידע החדש שלנו אודות תהליכי הזיווג והספורולציה שלהם‪.‬‬
‫שינוי זוויג‬
‫‪ Mating Type Switching‬הוא תהליך שבו שמר הפלואידי יכול לעבור מזוויג אחד לאחר‪ .‬מצב זה מגן‬
‫על ההפלואיד ממוטציות מזיקות שיכולות להתבטא כשהוא במצב ההפלואיד; במידה ולא זמינים בסביבתו‬
‫בני זוויג הפוך ממנו‪ ,‬הוא יכול להחליף זוויג‪ ,‬להזדווג עם שמר סמוך ולהגיע למצב דיפלואידי – מצב בו‬
‫הגנים שלו מוגנים יותר מפני מוטציות באללים מכיוון שכעת יש גיבוי על ידי שני אללים ולא אלל יחיד‬
‫לכל גן‪ .‬כמו כן במצבי עקה הדיפלואיד יכול לעבור ספורולציה‪ ,‬להבדיל מההפלואיד‪.‬‬
‫יש לציין כי במעבדה הזנים אינם יכולים לשנות את הזוויג‪.‬‬
‫הגדרת הריקומבינציה‬
‫ריקומבינציה )הומולוגית( היא שיחלוף בין שני מקטעי ‪ DNA‬הומולוגים‪ .‬התהליך הזה יכול לשמש למשל‬
‫לתיקון שברים בגנום‪ ,‬כאשר הכרומוזום השבור יכול לעבור ריקומבינציה עם גדיל תקין‪ ,‬ועל בסיסו‬
‫לבנות את החלק החסר בו‪ .‬השבירה של הכרומוזום גורמת לאותו איזור להיות מאוד פעיל ולכן הוא נוטה‬
‫לעבור את הריקומבינציה‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫מעבדה ‪ :03‬גנטיקה בשמרים‬
‫‪15‬‬
‫דרך אחת לריקומבינציה היא תהליך הקרוס‪-‬אובר‪ ,‬שבה‬
‫מקטע מכרומוזום אחד עובר לכרומוזום השני; בתהליך‬
‫המרת הגנים )‪ (Gene Conversion‬הסיב השבור פשוט‬
‫מעתיק את המידע מהסיב התקין וכך משלים את הפער‬
‫שנוצר בו‪.‬‬
‫כאשר הגנום תקין‪ ,‬ריקומבינציה תתרחש בתהליך המיוזה‬
‫בין שני כרומוזומים הומולוגים פרנטאליים‪ .‬התהליך‬
‫מתרחש על ידי בניית כיאזמות בין שני הכרומוזומים שבהן‬
‫מתרחש שיחלוף חומר גנטי‪ .‬התוצר של הריקומבינציה‬
‫מביא לשונות גנטית בין הורים לצאצאים‪ .‬התהליך מתוכנת‪,‬‬
‫מחייב ושכיח‪.‬‬
‫הריקומבינציה יכולה לשמש אותנו לדעת האם גנים‬
‫נמצאים בתאחיזה או מרוחקים‪ :‬אם גנים מרוחקים‬
‫או נמצאים על כרומוזומים שונים‪ ,‬אנחנו מצפים‬
‫שיהיה סיכוי שווה לקבל בצאצאים הפרדה בין‬
‫הגנים לעומת המצב הפרנטאלי‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬אם‬
‫הגנים סמוכים זה לזה על אותו הכרומוזום אנחנו‬
‫מצפים שהיכולת שלהם להיפרד בצאצאים נמוכה‬
‫יותר כי יש פחות סיכוי לריקומבינציה במרחק‬
‫המצומצם שביניהם‪.‬‬
‫מורגן הגדיר כי התפלגות הצאצאים מעידה על המרחק בין שני סמנים הגנטיים ולמעשה הגדיר את‬
‫המונח סנטי‪-‬מורגן‪ ,‬יחידה אחת של מרחק בין הגנים‪ 1% .‬של ריקומביננטים שווה למרחק של ‪1‬‬
‫סנטימורגן ולכן איננו יכולים להגדיר יותר מ‪ 50-‬סנטימורגן בין גנים – שכן לא ניתן לקבל התפלגות של‬
‫יותר מ‪.50:50-‬‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬
‫‪16‬‬
‫מטרת הניסוי‬
‫במעבדה ניקח זן דיפלואידי בעל גנוטיפ הורים ידוע‪ ,‬נגרום לשמר‬
‫לספורולציה ולפי התפלגות הצאצאים ההפלואדים נלמד על‬
‫הגנוטיפים של ההורים ועל תכונות נוספות של הגנום‪ .‬למשל‪ ,‬אם‬
‫ההורה היה הטרוזיגוט ליכולת לסנטז אדנין אנחנו מצפים שמחצית‬
‫מההפלואידים יהיו תקינים ומחצית לא‪-‬תקינים‪.‬‬
‫אולם‪ ,‬מכיוון שהתרבית שלנו מקורה בהרבה תאים דיפלואידים‪,‬‬
‫נתקשה לשייך צאצאים להורים ספציפיים; אפשר במקום זאת‬
‫להפריד אסקוסים‪ ,‬לפרק אותם ולזרוע אותם לצלחת – תהליך‬
‫המכונה אנאליזת טטראדות‪ .‬זאת לעומת השיטה השנייה‪ ,‬שבה‬
‫הצאצאים מפוזרים בצלחת באופן אקראי ואיננו יודעים מהו המקור‬
‫של הצאצאים‪.‬‬
‫בעזרת אנאליזת הטטראדות ניתן לאתר גם רביעיות ספורות‬
‫חריגות‪ ,‬למשל מצב שבו מוצאים שלושה מסוג אחד וצאצא אחד‬
‫מהסוג השני; דבר כזה יכול לקרות למשל בריקומבינציה הומולוגית‬
‫בעת המיוזה‪ ,‬שיכולה הייתה לגרום לקרוס‪-‬אובר או המרת גנים‪,‬‬
‫שיביאו לשינוי המצב הצפוי‪.‬‬
‫יחסים בין אללים וגנים‬
‫המוטציה‬
‫פנוטיפ הדיפלואיד‬
‫פנוטיפ הספורות ההפלואידיות )‪(%‬‬
‫מוטציה רצסיבית ‪a-/A+‬‬
‫‪A+‬‬
‫‪50:50‬‬
‫‪A+ B+ (prototroph) = 25%‬‬
‫מוטציות רצסיביות בגנים שונים לא‬
‫אחוזים באותו מסלול ביוסינטטי‬
‫‪A+ B+‬‬
‫‪B+/b- A+/a‬‬‫מוטציה רצסיבית ‪a/a‬‬
‫‪ 2‬אללים מוטנטים רצסיביים שונים‬
‫‪a/a‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫‪A+ b- (oxotroph) = 25%‬‬
‫‪a- B+ (oxotroph) = 25%‬‬
‫‪a- b- (oxotroph) = 25%‬‬
‫‪a‬‬
‫‪a‬‬
‫‪a‬‬
‫‪a = 50%‬‬
‫‪a = 50%‬‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫שיעור ‪ :04‬גנטיקה של האדם‬
‫‪17‬‬
‫שיעור ‪ :04‬גנטיקה של האדם‬
‫כל הדברים שציינו קודם בתור יתרונות של מערכות המודל הופכים במחקר הגנטי באדם לקשיים – שנות‬
‫הדור‪ ,‬הגנום הגדול והדיפלואידי‪ ,‬מעורבות של גנים רבים בתכונות‪ ,‬מערכות מודל מוגבלות‪ ,‬קושי‬
‫במניצפולציות גנטיות ושאלות אתיות‪ .‬מכאן שאנחנו מוגבלים לשאלות שאנחנו יכולים לענות עליהן‬
‫כמעט רק בעזרת המצב הקיים‪.‬‬
‫פולימורפיזם באוכלוסיה‬
‫לתחום זה נכנס הפולימורפיזם – גיוון תכונות‪ .‬עולה השאלה מה ההבדל בעצם בין פולימורפיזם לבין‬
‫אללים שונים הנובעים ממוטציות? שהרי אלו אללים ואלו אללים‪ .‬התשובה היא השכיחות – ישנו ערך סף‬
‫באוכלוסיה ואלל נחשב פולימורפי אם הוא נפוץ ב‪ 1%-‬מהאוכלוסיה ואם בפחות מכך – ייחשב כמוטציה‪.‬‬
‫כמובן שיש יוצאי דופן אך זו ההגדרה השרירותית בה נשתמש בקורס זה‪.‬‬
‫אם כן‪ ,‬מה זה ‪ ?WT‬האם זה שיער שחור‪ ,‬עור בהיר? המושג הזה בתכונות פולימורפיות בטל בשישים‪,‬‬
‫אבל מה שלרוב עושים הוא להגדיר את ‪ WT‬בתור האלל הפולימורפי הנפוץ ביותר‪.‬‬
‫יש גם פולימורפיזם שנובע משינויים סביבתיים אבל אנחנו לא נתייחס אליהם במחקר במעבדה זו‪.‬‬
‫חקר פולימורפיזם‬
‫•‬
‫חקר מחלות תורשתיות‬
‫•‬
‫מחקר אבולוציוני‬
‫•‬
‫סדר חברתי – זיהוי פרטים לצרכים שונים‪ ,‬כמו זיהוי פלילי או בדיקת אבהות‪.‬‬
‫עד כה הסתכלנו על סמנים גנטיים שונים של אורגניזם מודל – כמו עמידות לאנטיביוטיקה או‬
‫אוקסוטרופיות – ועל ידי גידול או אי גידול יכולנו לבדוק את הנוכחות של הסמן‪ .‬אם היינו יכולים לרצף‬
‫את כל הפרטים היינו יכולים לדעת את הנתונים כבר ברמה הגנטית‪ ,‬ולמצוא סמנים גנטיים הרבה לפני‬
‫הגידול‪ .‬ה‪ DNA-‬מהווה עבורנו סמן גנטי כי כאשר הוא ידוע אין צורך לבצע את הניסוי ולבדוק‬
‫גידול‪ /‬אי גידול‪.‬‬
‫סמן גנטי הוא כל שינוי ברצף ה‪ DNA-‬אשר יש לו פנוטיפ שניתן לזהות‪ .‬אם היינו יכולים לראות את‬
‫הרצף היינו יכולים לחסוך גילוי הפנוטיפ ברמות מאוחרות יותר‪ ,‬כמו רמת האורגניזם‪ .‬לשם כך התפתחה‬
‫שיטת הסניפים – ‪ .SNP = Single Nucleotide Polymorphism‬השיטה משתמשת בריצוף של‬
‫מספר מקטעים וזיהוי סניפים – אתרים שבהם יש הבדלים בין פרטים‬
‫מסויימים )בחלק מהאנשים למשל יש ‪ C‬ובאחרים יש ‪ .(A‬האתרים האלה‬
‫לא חייבים להיות מקודדים לחלבון‪.‬‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬
‫‪18‬‬
‫מאפייני סמנים גנטיים‬
‫•‬
‫הסניפים הם אירועי החלפת נוקליאוטיד שהם יציבים גנטית – יש להם שכיחות מסויימת‬
‫באוכלוסיה והשכיחות הזו יציבה גנטית‪.‬‬
‫•‬
‫הסניפים מורשים מהורים לילדים בתורשה קלאסית‪ ,‬ואפשר להסתכל עליה כ"גן" תורשתי לכל‬
‫דבר – יכולים להיות עד ארבעה אללים שונים לכל אתר סניפ‪ ,‬מכיוון שיש ארבעה נוקליאוטידים‬
‫אפשריים לאותה עמדה‪ .‬אולם‪ ,‬לא בהכרח תמיד יהיו כל האללים האפשריים‪.‬‬
‫•‬
‫שכיחות הופעת האללים – לכל אלל של סניפ יש שכיחות מסויימת באוכלוסיה‪ ,‬ואין חוקיות‬
‫שמגדירה שכיחויות של אללים מסויימים‪.‬‬
‫ריצוף‬
‫הריצוף היא שיטה טובה למציאת סמנים גנטיים‪ ,‬אולם זו בעקרון שיטה יקרה )למרות שהמחקר‬
‫והטכנולוגיה מוזילים אותה מרגע לדודלי(‪ .‬לפיכך יש לנו סמנים גנטיים נוספים נפוצים‪ ,‬יותר קלים או‬
‫זולים לאיתור‪.‬‬
‫‪RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism‬‬
‫שינויים באתרי ‪ DNA‬מסויימים משפיעים על קיום או אי קיום אתר רסטריקציה מסויים‪ .‬אם ניקח למשל‬
‫מקטע מסויים מכרומוזום ‪ ,III‬נגביר אותו בעזרת ‪ PCR‬ונחתוך את הגנום הזה בעזרת אנזימי רסטריקציה‪,‬‬
‫נראה שבאלל ‪ A‬יש שני אתרי חיתוך‬
‫לאנזים‬
‫ולכן‬
‫מתקבלים‬
‫שלושה‬
‫פרגמנטים מחיתוך ה‪ ,PCR-‬בעוד‬
‫שבאלל ‪ B‬יש קיבוע של נוקליאוטיד‬
‫ששינה את אתר החיתוך של האנזים‪,‬‬
‫כך שמתקבלים רק שני בנדים בתבנית‬
‫של אלל ‪.B‬‬
‫הדוגמה הקלאסית היא אנמיה חרמשית )איך לא(‪ :‬בגן שיוצר את חלבון ה‪heme-‬‬
‫יש מוטציה המביאה לשינוי בצורת כדורית הדם האדומה‪ .‬היות וזו מחלה הנובעת‬
‫ממוטציה בנוקליאוטיד יחיד בגן יחיד‪ ,‬אנחנו יכולים לעשות ‪ PCR‬לגן ולראות‬
‫מהם האללים‪ .‬השינוי הנוקליאוטידי גורם לתבנית בנדים שונה בין אלל תקין‬
‫לאלל חולה‪ .‬כך ניתן לזהות אדם הנושא את המחלה גם ללא ריצוף‪.‬‬
‫רצפי ‪Alu‬‬
‫רצפים אלו הם בגודל ‪ 300‬נוקליאוטידים בערך‪ ,‬שמקורם ברטרו‪-‬טרנספוזון עתיק‪ .‬הרצפים פזורים בגנום‬
‫בכמעט מיליון עותקים‪ ,‬ובאמצע הרצף יש אתר רסטריקציה לאנזים ‪ .AluI‬כל אתר ‪) Alu‬אתר של ‪300‬‬
‫נוקליאוטידים( בגנום יכול להכיל את אתר החיתוך ויכול שלא‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫שיעור ‪ :04‬גנטיקה של האדם‬
‫‪19‬‬
‫נניח שיש אתר ‪ Alu‬שנמצא באוכלוסיה בתאחיזה‬
‫לאלל מחלה‪ .‬אם רואים שאין תאחיזה כזו לאלל‬
‫הבריא‪ ,‬ניתן להניח כי באמת קיימת תאחיזה לגן‬
‫המוטנטי ואז ניתן להשתמש בנוכחות האתר כמרקר‬
‫לגנום המוטנטי‪.‬‬
‫השימוש נעשה באופן הבא‪ :‬מגבירים‬
‫אתר שבו אנו חושדים שיש אתר ‪Alu‬‬
‫בעזרת פריימרים ימני ושמאלי סביב‬
‫האתר‪ .‬אם אתר ‪ Alu‬אינו נמצא‬
‫באתר‪ ,‬אנחנו נקבל גודל מסויים של‬
‫תוצר ‪ PCR‬ואם הוא נוכח הגודל של התוצר ייגדל ב‪ 300-‬נוקליאוטידים‪ .‬כעת אם נריץ את התוצרים‬
‫בג'ל נראה הבדל בריצה של כל אלל – האלל ללא ‪ Alu‬ירוץ מהר יותר מזה עם ‪ ,Alu‬כי הוא קצר יותר‪.‬‬
‫בהנחה שידועה תאחיזה‪ ,‬אנחנו יכולים לדעת האם יש אלל חולה או לא; אם לא יודעים‪ ,‬אפשר לעשות‬
‫זאת לאנשים חולים ובריאים ולבדוק במי האלל מופיע ובמי לא‪.‬‬
‫‪VNTR = Variable Number of Tandem Repeats‬‬
‫בניגוד לאתרי ‪ Alu‬שפזורים בגנום לחוד‪ ,‬כאן יש יחידת ליבה חוזרנית‪ .‬בדוגמה יחידת הליבה מכילה ‪5‬‬
‫בסיסים )אבל יכולה להכיל גם יותר( והפולימורפיזם מתבטא במספר הפעמים שהיחידה חוזרת על עצמה‪.‬‬
‫גם צורת התורשה של התכונה הזו היא תורשה קלאסית‪ ,‬כאשר כל אלל מכיל מספר חזרות שונה‪ .‬כאן‬
‫מספר האללים האפשריים הוא לכאורה בלתי מוגבל – כיוון שכל מספר חזרות אפשרי‪ .‬זהו פולימורפיזם‬
‫מאוד משמעותי‪ .‬עם זאת‪ ,‬חשוב לזכור‬
‫שלא כל מספר חזרות אפשרי בהכרח‬
‫קיים באוכלוסיה‪.‬‬
‫כעת ניתן לתכנן פריימרים שיושבים משני צידי אתר ה‪-‬‬
‫‪ VNTR‬ואורך מספר תוצר ה‪ PCR-‬יהיה תלוי במספר‬
‫החזרות‪ .‬הג'ל בדוגמה מציג שישה פרטים באוכלוסיה שבהם‬
‫הוגבר אתר ‪ VNTR‬מסויים‪ .‬אפשר לראות את‬
‫הפולימורפיות הרבה בין הפרטים שמתקבלת כאן‪ ,‬מה שלא‬
‫יכולנו להשיג בשיטות הקודמות בהן מספר האללים היה‬
‫מאוד מוגבל‪.‬‬
‫יחד עם זאת‪ ,‬למרות הפולימורפיות הרבה ראו שיש אוכלוסיות מסויימות שבהן יש שכיחות גבוהה של‬
‫אללים ספציפיים‪ .‬בצורה זו העץ )שקופית ‪ 16‬במצגת ‪ (4‬מנסה למפות אוכלוסיות שונות בעולם לפי אתר‬
‫‪ VNTR‬מסויים‪ .‬בצורה זו ניתן להשתמש באתרים אלו למחקרים אבולוציוניים‪.‬‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬
‫‪20‬‬
‫פרופיל גנטי‬
‫אם רוצים באמת להבדיל בין פרטים באוכלוסייה‬
‫צריך ליצור פרופיל גנטי; סביר להניח שהשימוש‬
‫בשיטה אחת עם אתר אחד לא יצליח להפריד‬
‫באוכלוסיות; שימוש באתר ‪ Alu‬הרבה פחות יעיל‬
‫מ‪ VNTR-‬אבל ככל שאוספים יותר סמנים גנטיים‬
‫במקביל ההבחנה הופכת יותר דקה וניתן ליצור‬
‫פרופיל גנטי שונה עבור כל אחד‪ .‬ככל שלוקחים‬
‫יותר נתונים‪ ,‬הסיכוי שנמצא עוד פרט עם אותו‬
‫פרופיל גנטי הולך וקטן‪ .‬פרופיל זה משמש למשל‬
‫בזיהוי פלילי ובדיקות אבהות‪.‬‬
‫קבוצות הדם‬
‫במאה ה‪ 18-‬התחילו לעשות עירויי דם‪ ,‬וראו שבחלק מהמקרים זה מצליח ובאחרים זה נגמר באסון;‬
‫כאשר בדקו עירויים שונים‪ ,‬כדוריות לחוד ופלזמות לחוד מאנשים שונים והצליבו את הנתונים; ראו‬
‫מאפיינים שונים של אגרגציה של התאים ומתוך זה חילקו את ארבע קבוצות הדם‪.‬‬
‫הקבוצות האלו נובעות מביטוי אנטיגנים מסויימים – ‪ A‬או ‪B‬‬
‫– על גבי כדורית הדם‪ .‬ארבע הקבוצות נובעות מהשילובים‬
‫השונים‪ AB ,B ,A :‬או אף נוגדן )‪ .(O‬בפלזמות נמצאים‬
‫נוגדנים נגד האנטיגנים שאינם קיימים על הכדורית‪.‬‬
‫כיצד אדם שמעולם לא קיבל תרומת דם נחשף לאנטיגנים שלא‬
‫שלו?‬
‫האנטיגנים של כדוריות הדם נישאים גם על ידי חיידקים‬
‫מסויימים; אדם עם דם ‪ A‬יש לו נוגדנים לדם ‪ B‬כי הוא נחשף‬
‫לחיידקים בעלי האנטיגן ‪.B‬‬
‫חיידקים בעלי אותו אנטיגן כמו כדוריות הדם‪ ,‬כתוצאה מכך‪,‬‬
‫זוכים להתעלמות מצד המערכת החיסונית שכן היא מתייחסת‬
‫אליהם כאל כדוריות דם‪.‬‬
‫האנטיגן עשו עץ סוכרי‪ ,‬הנבנה על ידי אנזים‬
‫ספציפי‪ .‬העצים הסוכריים נבדלים אלו מאלו בשל‬
‫אללים שונים של האנזים היוצרים כל אחד‬
‫מודיפיקציות שונות; הטרוזיגוט ‪ AB‬מכיל את שני‬
‫האנזימים ולכן הכדורית שלו מציגה את שני‬
‫הסוכרים‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫שיעור ‪ :04‬גנטיקה של האדם‬
‫‪21‬‬
‫מבחינה גנטית‪ ,‬יחסי האללים ‪ A‬ו‪ B-‬הם קו‪-‬דומיננטים כי הם לא מפריעים אחד לשני‪ .‬בין ‪ A‬או ‪B‬‬
‫ל‪ O-‬יש יחסים של דומיננטיות נגד ‪.O‬‬
‫מכיוון שהדם מכיל נוגדנים לאללים שאין לאדם‪ ,‬כדוריות דם מסוג ‪ O‬הן תורמות אוניברסליות כי‬
‫הנוגדנים לא מזהים אותן )הן לא מציגות אנטיגנים( ואדם בעל דם מסוג ‪ AB‬הוא הנתרם האוניברסלי כי‬
‫הפלזמה שלו אינה מכילה נוגדנים כלל‪.‬‬
‫בניסוי מ‪ 2008-‬לקחו סוג דם מסויים והגיבו אותו‬
‫עם נוגדנים מתאימים‪ .‬הטיפול הנחקר ניסה ליצור‬
‫אנזים שיוריד את האנטיגנים מכדוריות הדם‬
‫האדומות‪ ,‬כך שהם לא יגיבו עם הנוגדנים‪ .‬בצורה‬
‫כזו כל תרומת דם תהיה כמו תרומת ‪ ,O‬תרומת דם‬
‫אוניברסלית‪ .‬ניתן לראות שכאשר מגיבים עם‬
‫הטיפול אין קישור בין הנוגדן לאנטיגן‪.‬‬
‫בטבלה הבאה רואים שכיחות של סוגי הדם‬
‫באוכלוסיות שונות‪.‬‬
‫כמה מילים על הארדי‪-‬וויינברג‬
‫שיווי משקל הארדי וויינברג מתקיים בתנאים‬
‫מסויימים ומקיים תנאים מתמטיים לגבי שכיחות‬
‫הגנוטיפים השונים )מודגם על שני אללים(‪ .‬נניח ויש‬
‫מחלה הומוזיגוטית רצסיבית )‪ .(aa‬מכאן שרק‬
‫להומוזיגוט הרצסיבי יש פנוטיפ‪ .‬אם ‪ aa‬מבקש שלא‬
‫יהיו לו צאצאים בעלי פנוטיפ‪ ,‬הוא יכול ללכת עם ‪ .AA‬על מנת לדעת כמה ‪ AA‬יש באמת באוכלוסיה‪,‬‬
‫אפשר לחשב את השכיחות של ‪ ,aa‬מתוך זה לחלץ את השכיחות של ‪ ,a‬מתוך זה לחשב את השכיחות של‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬
‫‪22‬‬
‫‪ A‬ואז את השכיחות של ‪ .AA‬כך ניתן למצוא את הסיכוי למצוא בן זוג מתאים שהוא גם ‪) AA‬זאת‬
‫בהנחה שאין תאחיזה למין‪ ,‬אז הסיכוי יורד פי ‪ 2‬כי מחפשים מין מסויים(‪.‬‬
‫יחד עם זאת‪ ,‬אפשר לעשות דבר אחר – אפשר להראות שיש סטיות שמלמדות כי לא מתקיים הארדי‬
‫ויינברג‪ ,‬ואז להעמיק את המחקר כדי לראות מה קורה שם‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬