‫שיעור ‪ :01‬מבוא למוטציות בחיידקים‬ ‫‪1‬‬ ‫שיעור ‪ :01‬מבוא למוטציות בחיידקים‬ ‫ספרות ורקע על המעבדה‬ ‫קריאת חובה‪Molecular Genetics of Bacteria, Mutations in Bacteria, Capter 3 pages 75- :‬‬ ‫‪.102‬בקורס אנחנו נגיע למסקנות כאלו ואחרות אך יש מי שחושב אחרת ולכן יש גם קריאה מומלצת‬ ‫לראות ולהכיר גישות אחרות‪.‬‬ ‫העבודה בחלק זה תבוצע בחיידקי ‪ .E.coli‬חיידקים אלו היו מקור בסיסי למחקר מנגנונים בסיסיים רבים‬ ‫בביולוגיה וגנטיקה ונחקר מזה כ‪ 100-‬שנה‪ .‬החיידק מכיל גנום של כ‪ 4.5-‬מיליון זוגות בסיסים וכ‪4000-‬‬ ‫גנים‪ ,‬כאשר אחוז מאוד גבוה מתוכם מוכר היום למדע‪.‬‬ ‫יתרונות בעבודה עם חיידקים‬ ‫•‬ ‫קטנים מאוד – ניתן להגיע לאוכלוסיות מאוד גדולות בנפח מאוד קטן‪ .‬במבחנה קטנה ניתן לגדל‬ ‫תרבית של מיליוני חיידקים‪ .‬גודל האוכלוסיה חשוב משום שבמחקר גנטי אנחנו מחפשים פרטים‬ ‫שהתכונות שלהם נדירות – מוטנטים – ולכן אוכלוסיות גדולות מגדילות את הסיכוי למצוא פרטים‬ ‫נדירים אלו‪.‬‬ ‫•‬ ‫זמן דור – הזמן שדרוש לאוכלוסיה להכפיל את עצמה‪ .‬לחיידק ‪ E.coli‬זמן דור של כ‪ 20-‬דקות‪.‬‬ ‫הגדילה היא אקספוננציאלית כך שביום אחד אפשר להגיע לאוכלוסיות של מילארדים‪.‬‬ ‫•‬ ‫הפלואידים – הפנוטיפ הוא הגנוטיפ ולכן קל יותר לראות אותו‪ ,‬אין מיסוך על ידי אלל שני‪.‬‬ ‫•‬ ‫רבייה א‪-‬מינית – חיידק אחד משכפל את הגנום בדיוק יוצא דופן ומתחלק לשני תאים בעלי אותו‬ ‫מטען גנטי‪ .‬חיידק אחד שמתרבה כמה שעות יוצר שבט )‪ (clone‬שלכולם אותו מטען גנטי‪ .‬אם למשל‬ ‫מבקשים להפיק חלבון‪ ,‬יעיל יותר להפיק אותו משבט מסויים מאשר מחיידק בודד‪.‬‬ ‫•‬ ‫קל לעשות מניפולציות גנטיות – אפשר להוריד גנים‪ ,‬להשתיק אותם‪ ,‬להוסיף גנים ולהעביר גנים‬ ‫בין חיידקים‪ ,‬בניגוד למערכות של תאים הומניים‪ .‬בעזרת החיידקים ניתן להתעסק בגנטיקה בלי‬ ‫מכשולים טכניים של המערכת‪.‬‬ ‫מוטציות‬ ‫מוטציה היא כל שינוי ברצף ה‪ DNA-‬שעובר בתורשה לצאצאים הבאים‪ .‬מוטציות יכולות להיות ממגוון‬ ‫סוגים‪ :‬חסרים‪ ,‬הוספות‪ ,‬החלפות וכדומה‪ .‬מוטציות יכולות להשפיע על גנים באופנים שונים – הן יכולות‬ ‫למנוע תוצר גני‪ ,‬לשנות את אורכו ולהשפיע על התכונות שלו כמו אינטראקציה עם סובסטרטים או‬ ‫חלבונים אחרים‪.‬‬ ‫מוטציות יכולות להתרחש כתוצאה מגורם חיצוני – קרינה או חומר כימי שמשנים את ה‪ ,DNA-‬או על‬ ‫ידי מנגנונים טבעיים‪ ,‬למשל טעויות שיכפול של ‪ DNA-Polymerase‬שאינן מאותרות במנגנון ההגהה‪.‬‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬ ‫‪2‬‬ ‫מקור העניין במוטציות‬ ‫נניח שיש אוכלוסיית חיידקים ובתוכה חיידקים שפיתחו עמידות לאנטיביוטיקה; בעזרת האנטיביוטיקה‬ ‫ניתן לבצע סלקציה ולברור את הפרטים העמידים‪ .‬היכולת הזו מכונה סמן או ‪.marker‬‬ ‫מרקרים אינם רק מוטציות של עמידות‪.‬‬ ‫חיידקים יודעים לסנטז את כל חומצות האמינו שלהם; חיידק מסוג זה מכונה פרוטוטרופ‪ .‬יחד עם זאת‬ ‫ישנם מוטנטים הפגועים במסלול הביוסינטטי של הפקת חומצות אמינו כזו או אחרת‪ .‬חיידק כזה יהיה‬ ‫מכונה אוקסוטרופ של אותה חומצת אמינו‪.‬‬ ‫חיידק שלא יודע לסנטז אלמנט מסויים מכונה אוקסוטרופ ביוסינטטי‪ .‬אולם יש עוד סוג אוקסוטרופיה‪,‬‬ ‫אוקסוטרופיה קטאבולית‪ :‬חיידק כזה אינו מסוגל לנצל מקור פחמן מסויים בתור מקור פחמן לגידול‪ .‬כך‬ ‫למשל חיידק שלא יכול לנצל לקטוז לגידול מכונה אוקסוטרופ ללקטוז‪ .‬מרקרים אחרים יכולים להיות‬ ‫גודל המושבה‪ ,‬צורתה‪ ,‬הצבע שלה וכן רגישות לטמפרטורה‪.‬‬ ‫מוטציות יכולות לעזור לנו לא רק לבודד פרטים אלא גם ללמוד על תהליכים שונים‪.‬‬ ‫שיעור מוטציה‪ ,‬סלקציות והעשרות‬ ‫מוטציות הן אירועים נדירים‪ ,‬ולכן נקבע מושג שיעור‬ ‫המוטציה – הסבירות שנמצא חיידק בעל מוטציה‬ ‫מסויימת באוכלוסיה‪ .‬שיעור המוטציה משתנה והוא‬ ‫תלוי פנוטיפ לחלוטין‪.‬‬ ‫נניח שיש תרבית המכילה מיליארד חיידקים ומתוכם‬ ‫בערך ‪ 10‬הם המעניינים אותנו‪ .‬כיצד נוכל לחלץ‬ ‫אותם מהתמיסה? אנחנו יכולים לקחת את התמיסה‬ ‫הנוזלית ולגדל את הפרטים בתור מושבות על צלחות‪ .‬ואולם‪ ,‬עדיין יש לנו בעיה כי יש גבול לכמות‬ ‫המושבות המבודדות שניתן לזרוע על צלחת‪.‬‬ ‫אם החיידקים עמידים לחומר כלשהו‪ ,‬למשל‬ ‫אנטיביוטיקה‪ ,‬ניתן לגדל אותם על מצע עם‬ ‫אנטיביוטיקה ואז המוטנטים יהיו היחידים שייגדלו;‬ ‫זוהי סלקציה חיובית – יצירת תנאים שבהם אך ורק‬ ‫המוטנטים גדלים‪ .‬אולם מה קורה עם חיידקים‬ ‫שפגועים במסלולים מסויימים‪ ,‬למשל סינטזת‬ ‫היסטידין?‬ ‫במקרה הזה אנחנו עושים סלקציה שלילית‪ :‬זורעים‬ ‫את החיידקים על מצע עשיר‪ ,‬שמאפשר לכל‬ ‫החיידקים לגדול‪ ,‬רק כדי להפריד בין פרטים בודדים;‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫שיעור ‪ :01‬מבוא למוטציות בחיידקים‬ ‫‪3‬‬ ‫אז דוגמים כל מושבה פעם אחת על פלטה ללא היסטידין ופעם אחת לפלטה עם היסטידין‪ .‬האוקסוטרופים‬ ‫להיסטידין לא ייגדלו בצלחת הראשונה ולכן נדע שהם האוקסוטרופים‪ .‬שימו לב שצריך לשמור את‬ ‫המושבה המקורית כדי לחזור אליה‪ .‬לשיטה זו יש חיסרון גדול מאוד כי אנחנו עדיין צריכים לסרוק‬ ‫צלחות גידול שלמות כדי למצוא מוטנט בודד‪.‬‬ ‫על מנת לשפר את התהליך עושים העשרה‪ .‬ההעשרה‬ ‫נעשית במערכת של סלקציה נגדית‪ .‬נניח שרוצים‬ ‫לחפש חיידק שאינו עמיד לעקת חום‪ .‬עקת חום‬ ‫מתרחשת כאשר מגדלים את החיידקים בטמפרטורה‬ ‫של ‪ .42°C‬מגדלים תרבית של חיידקי ‪ WT‬ב‪-‬‬ ‫‪ ;42°C‬אם יש מוטנט לא עמיד הוא פשוט יפסיק את‬ ‫הגידול שלו‪ .‬כאשר חיידק לא יכול להתמודד עם‬ ‫התנאים הוא מפסיק את הגידול‪ ,‬אך לאו דווקא מת‪ .‬אם בשלב הזה נוסיף חומר שפוגע בחיידקים‬ ‫שמתחלקים‪ ,‬המוטנט יהיה בסדר אבל החיידקים האחרים‪ ,WT ,‬ימותו )אנטיביוטיקת אמפצילין(‪ .‬בסוף‬ ‫התהליך נשארים עם הרבה יותר חיידקים מוטנטים )ועדיין עם חלק מה‪ WT-‬שפשוט לא התחלקו בזמן‬ ‫מתן האנטיביוטיקה מסיבות כאלה ואחרות( ועכשיו אפשר לבודד את החיידקים המוטנטים על ידי השיטה‬ ‫שציינו קודם‪.‬‬ ‫שימו לב‪ :‬בפועל בכל אוכלוסיית ‪ WT‬יש תת‪-‬אוכלוסיה שאינה מתחלקת ולכן תהליכי סלקציה‬ ‫נגדית אינם מוחקים טוטאלית לא‪-‬מוטנטים‪ ,‬להבדיל מסלקציה חיובית‪.‬‬ ‫למארקיזם ודארוויניזם‬ ‫במעבדה נבצע סלקציה חיובית ונבודד מוטנטים בסלקציה נגדית‪ ,‬ובסוף נבחן את המקור למוטציות –‬ ‫שאלה שטרדה חוקרים כבר לפני כ‪ 60-‬שנה‪ .‬הגישה הדארוויניסטית אומרת ששינויים גנטיים אקראיים‬ ‫קורים כל הזמן‪ ,‬ואלו מביניהם שנותנים יתרון – שורדים‪ .‬הגישה הלמארקיסטית אומרת שהסביבה‬ ‫גורמת לשינויים באופן ישיר בחיידק והשינויים האלה משפיעים על הגנום‪.‬‬ ‫•‬ ‫היפותזת המוטציה האקראית – מוטציות מתרחשות כל הזמן‪.‬‬ ‫•‬ ‫היפותזת השינוי הישיר – מוטציות מתרחשות רק כתוצאה מחשיפה לגורם סלקטיבי‪.‬‬ ‫סלוואדור לוריה ומקס דלברוק היו שני חוקרים שבדקו איזו היא הגישה הצודקת‪ .‬הם פיתחו מערכת‬ ‫פשוטה לבדיקה זו‪ ,‬שזיכתה אותם בפרס נובל‪ :‬המערכת הייתה עם חיידקים שרגישים לפאג' ‪ .T1‬בכל‬ ‫תרבית יש מספר חיידקים שווה והם זורעים את החיידקים מתרבית עשירה למצע עם ‪.T1‬‬ ‫החוקרים ציפו שלפי התפלגות המושבות המוטנטיות על הפלטות השונות הם יוכלו לקבוע האם זהו מצב‬ ‫אקראי או מכוון‪ :‬אם השונות בין המושבות תהיה נמוכה‪ ,‬המודל יהיה למארקיסטי ואם שונות תהיה גבוהה‬ ‫המודל יהיה דארוויניסטי‪.‬‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫‪4‬‬ ‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬ ‫לפי למארק‪ ,‬רק ברגע הפגישה עם הגורם הסלקטיבי‬ ‫אפשר ליצור מוטנט‪ .‬כתוצאה מכך כל חיידק‬ ‫שיתיישב על הפלאטה ויהיה לו אירוע מוטציה ייתן‬ ‫מושבה אחת‪ .‬כמו כן מכיוון שמוטציה היא אירוע‬ ‫נדיר אנחנו יכולים לצפות שמכל מבחנה נקבל‬ ‫מושבות ספורות בלבד – אם בכלל‪ .‬אם נצייר גרף‬ ‫של אירועי המוטציה הגרף יהיה צר מאוד‪ ,‬בעל‬ ‫שונות מאוד נמוכה‪.‬‬ ‫לעומת זאת לפי דארווין‪ ,‬המוטציות יכולות להתרחש‬ ‫בכל שלב – ואפילו עוד במבחנה‪ .‬אם המוטציה‬ ‫התרחשה מוקדם בנוזל החיידק המוטנט ממשיך‬ ‫להתרבות ואז יש תת‪-‬אוכלוסיה של מוטנטים‪ .‬כל‬ ‫חיידק מתת‪-‬אוכלוסיה זו ייגע בצלחת וייצור מושבה‪,‬‬ ‫ולכן במקרים כאלה של מוטציה עוד בנוזל אנחנו‬ ‫נקבל צלחת מלאה מושבות עמידות‪ ,‬לעומת מקרים‬ ‫בהם לא הייתה מוטציה מראש ואז מספר המושבות‬ ‫יהיה קטן מאוד אם בכלל‪ .‬קיומה של פלטה כזו‬ ‫שמייצגת אירוע מוטציה מוקדם בנוזל מרחיבה את‬ ‫השונות‪ ,‬מפזרת את התוצאות והופכת את הגרף‬ ‫לשמן יותר‪ .‬כמו כן אנחנו יכולים לומר שאירוע‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫שיעור ‪ :01‬מבוא למוטציות בחיידקים‬ ‫‪5‬‬ ‫מוטציה אחד אינו שווה למושבה אחת – הוא יכול‬ ‫להיות גם מקור למושבות רבות‪.‬‬ ‫אירועי מוטציה‪ ,‬בכל אחת מהתיאוריות‪ ,‬מתפלגים‬ ‫לפי התפלגות פואסון‪ ,‬הקרובה להתפלגות נורמלית‬ ‫אבל מתייחסת למקרים בהם ההסתברות שמשהו‬ ‫יקרה‬ ‫היא‬ ‫נמוכה‬ ‫מאוד‪.‬‬ ‫כאמור‪,‬‬ ‫בגישה‬ ‫הלמארקיסטית אירוע מוטציה אחד שווה למושבה‬ ‫אחת ולכן אם נצייר גרף פואסון של ההתפלגות נראה הרבה צלחות ללא מושבות‪ ,‬מעט צלחות עם מושבה‬ ‫אחת‪ ,‬פחות מכך עם שתי מושבות וכן הלאה‪ .‬בגישה הדארוויניסטית לעומת זאת‪ ,‬מוטציה אחת שווה‬ ‫מספר רב של מושבות ולכן יכול להיות שתהיה התפלגות דומה לפואסון בהתחלה אבל יהיה גם פיק‬ ‫מסויים באיזור של כמה עשרות או מאות מושבות – תלוי כמה מוקדם היה אירוע המוטציה בנוזל‪.‬‬ ‫לפי ניסוי זה לוריה ודלברוק הצליחו לענות על‬ ‫שאלת המקור הגנטי – והם הצליחו בעוד משהו‪:‬‬ ‫לחשב את שיעור המוטציה‪ .‬הם הגדירו את שיעור‬ ‫המוטציה )‪ (a‬בתור היחס בין מספר אירועי המוטציה‬ ‫)‪ (m‬למספר החיידקים בתרבית )‪.(N‬‬ ‫כמות החיידקים שהיו בתרבית לא בעיה לדעת‪ ,‬אבל‬ ‫כמות אירועי המוטציות יותר מורכבת משום שאם‬ ‫ספרנו חמש מושבות של מוטנטים אין משמעות‬ ‫הדבר שהיו לנו חמישה אירועי מוטציה‪ :‬אם הגישה‬ ‫של דארווין היא הנכונה הרי שיכול להיות שהיו כל מספר של אירועי מוטציה בין ‪ 1‬ל‪ 5-‬בנוזל‪ ,‬והם פשוט‬ ‫התחלקו ולכן הגיעו בסופו של דבר לחמש מושבות‪ .‬לכן לוריה ודלברוק חיפשו דרך לדעת בכל זאת כמה‬ ‫אירועי מוטציה היו‪ .‬אנחנו יודעים שאם יש צלחת עם אפס מושבות או מושבה אחת מספר אירועי‬ ‫המוטציות ידוע בוודאות – ‪ 0‬או ‪ ,1‬בהתאמה‪.‬‬ ‫לכן לוריה ודלברוק ספרו צלחות עם אפס אירועי‬ ‫מוטציה‪ ,‬הציבו את הנתון הזה במשוואה של חישוב‬ ‫ההסתברות הפואסונית‪ ,‬ומתוך זה חילצו את ‪,m‬‬ ‫שיעור המוטציות‪.‬‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬ ‫‪6‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬קוניוגציה בחיידקים‬ ‫בשיעור שעבר‪ ,‬איה הזכירה את יתרונות חיידקים למחקר גנטי ואחד מהם היה העובדה שכאשר הם‬ ‫מתרבים הם נוקטים בשיטה א‪-‬מינית כך שהמושבה תהיה אחידה מבחינת שונות הגנומים בפרטים‪ .‬היום‬ ‫נבדוק האם באמת זו שיטת הרבייה היחידה העומדת לרשותם‪.‬‬ ‫רבייה מינית בחיידקים?‬ ‫מגדלים בשתי מבחנות שונות שני אוקסוטרופים שונים‪.‬‬ ‫כאשר מאחדים דגימות מכל אחת מהמבחנות‪ ,‬מדגירים‬ ‫וזורעים את החיידקים על צלחת שלא מכילה את החומר‬ ‫הדרוש לכל אוקסוטרופ על מנת שייגדל‪ ,‬רואים שיש גידול‬ ‫במושבות בודדות‪.‬‬ ‫יכול להיות שהיו במבחנות המוצא רברטנטים אשר היו‬ ‫מסוגלים לגדול על מצע עני‪ ,‬והצאצאים שאנו רואים‬ ‫במבחנה המשותפת הם מוטנטים; על מנת לבטל אפשרות זו‬ ‫שהצאצאים הם מוטנטים‪ ,‬החוקרים לדרברג וטאטום‬ ‫)‪ (Lederberg & Tatum‬חזרו על הניסוי באוקסוטרופים‬ ‫שהיו מוטנטים לשלושה מסלולים שונים‪ .‬הסיכוי שתהיה‬ ‫רברסיה בשלוש מוטציות הוא נמוך מאוד‪ ,‬ואכן אין גידול‬ ‫ממבחנות המוצא אך עדיין יש גידול במבחנה המשולבת‪.‬‬ ‫החוקרים חשדו שקרה תהליך שזכה לכינוי קוניוגציה‪,‬‬ ‫והצאצאים הם קוניוגנטים‪ .‬אולם‪ ,‬יכול להיות שזה לא‬ ‫מעבר של חומר גנטי בין החיידקים כי אם הזנה –‬ ‫האוקסוטרופ האחד מספק את צורכי האחר וההיפך‪ .‬לשם‬ ‫כך החוקר דייויס )‪ (Davis‬ערך אותו הניסוי במבחנה‬ ‫בצורת ‪ U‬עם ממברנה באמצע שמונעת מעבר חיידקים אך‬ ‫לא מונעת מעבר מומסים; כך דייויס הוכיח שלא חומרים‬ ‫מומסים הם העוברים‪.‬‬ ‫ב‪ 1953-‬טבע החוקר הייס )‪ (Hayes‬את המונח ‪ Donor‬ו‪-‬‬ ‫‪ ,Recipient‬כאשר החיידק ה"זכר" – התורם – מכיל‬ ‫יחידת פלסמיד עם גנים המאפשרים העברת הפלסמיד‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬קוניוגציה בחיידקים‬ ‫‪7‬‬ ‫מהתורם אל המקבל‪ .‬בסדרת ניסויים זו נעסוק בחיידקים בעלי הפלסמיד‬ ‫הקוניוגטיבי הראשון שגילו – ‪.F-plasmid‬‬ ‫כיצד מבוצעת קוניוגציה?‬ ‫חיידק תורם מסומן בתור ‪ F+‬ומסוגל להעביר את‬ ‫הפלסמיד‪ F-‬שלו לחיידק מקבל‪ ,‬שהוא בהכרח ‪) F-‬לא ניתן‬ ‫לתרום לחיידק שכבר יש לו את הפלסמיד הקוניוגטיבי(‪.‬‬ ‫בשלב הראשון החיידק התורם בונה ‪ ,Pillus‬הנשלח אל‬ ‫החיידק המקבל‪ .‬כאשר נוצר מגע הפילוס מתחיל להתקצר‬ ‫עד שהחיידקים נצמדים‪ .‬לאחר שהם נצמדים מתחיל שכפול‬ ‫של הפלסמיד תוך כדי הכנסת הגדיל הנגדי לגדיל המשוכפל‬ ‫אל תוך לתא המקבל‪ ,‬במנגנון של ‪ .rolling circle‬בצורה‬ ‫זו התא התורם משכפל את הגדיל האחד ומשאיר איתו‬ ‫פלסמיד דו גדילי והגדיל השני נכנס לתא המקבל‪ ,‬שם הוא‬ ‫משוכפל על ידי מקטעי אוקאזאקי‪.‬‬ ‫בסופו של דבר לשני התאים יש פלסמיד דו‪-‬גדילי שלם‪.‬‬ ‫‪F-Plasmid‬‬ ‫המערכת של הפלסמיד חייב להכיל מספר אלמנטים‪:‬‬ ‫•‬ ‫‪ – Origin of Replication‬מקור תחילת ההכפלה‪,‬‬ ‫המגובה על ידי מערך גנים הקשורים בשכפול של‬ ‫הפלסמיד – ‪ .Replication Genes‬זה איזור שקיים‬ ‫בכל פלסמיד שהינו בעל היכולת לשכפל את עצמו‬ ‫לדורות הבאים‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ – Origin of Transfer‬מקור תחילת ההעברה‬ ‫במנגנון ה‪ Rolling Circle-‬על ידי מערך הגנים‬ ‫‪.Genes of Transfer‬‬ ‫באיור שבעמוד הבא מופיע תהליך ה‪.Rolling Circle-‬‬ ‫נראה שהגנים של ההעברה )‪ (Transfer Genes‬נמצאים‬ ‫בסופו של המעגל שנכנס לתא המקבל; משמעות הדבר היא‬ ‫שרק אם התא המקבל ייקלוט את כל הפלסמיד השלם‬ ‫הוא יוכל להמשיך להעביר את הפלסמיד הלאה )יהפוך‬ ‫לחיידק ‪ .(F+‬כמו כן‪ ,‬במהלך ההעברה הגדיל הנותר בתורם‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬ ‫‪8‬‬ ‫משמש כתבנית לשיכפול‪.‬‬ ‫רכישת תכונות בסיסיות‬ ‫על פי רוב‪ ,‬תכונות בסיסיות – כרומוזומליות – אינן נמצאות על גבי‬ ‫פלסמיד‪ .‬אולם‪ ,‬בניסויים ראו שבעזרת קוניוגציה עברו תכונות של‬ ‫יכולות בסיסיות‪ .‬הכיצד?‬ ‫החוקר קאבאלי )‪ (Cavalli-Sforza‬בודד קבוצה של חיידקים‬ ‫שנמצאו כמעבירים את התכונות הבסיסיות בשכיחות די גבוהה‪,‬‬ ‫וכינה אותם ‪ .Hfr – High Frequency Recombination‬מה‬ ‫שקאבאלי גילה היה שהפלסמיד עבר ריקומבינציה עם הכרומוזום‬ ‫של החיידק‪ ,‬כך שכעת הכרומוזום מכיל את ה‪Genes of -‬‬ ‫‪ Transfer‬ולכן מסוגל לעבור בין חיידק תורם למקבל‪.‬‬ ‫הגן הקרוב ביותר לנקודת התחלת ההעברה יהיה הראשון שייכנס‬ ‫לחיידק המקבל‪ .‬אולם‪ ,‬הכרומוזום משמעותית גדול מפלסמיד‪F-‬‬ ‫ולכן ברוב המקרים הקוניוגציה נפסקת לפני מעבר שלם של‬ ‫הכרומוזום‪ .‬בצורה זו החיידק המקבל רוכש לעצמו רק מקטע של‬ ‫כרומוזום התורם ולא את כולו‪.‬‬ ‫אם המקטע הלינארי של החיידק המקבל הכיל אלל תקין לאיזושהי‬ ‫מוטציה של החיידק המקבל‪ ,‬על המקטע הלינארי הזה לעבור‬ ‫ריקומבינציה לתוך הגנום של החיידק המקבל – רק כך האלל‬ ‫התקין ייכנס לתוך הכרומוזום‪.‬‬ ‫שימו לב‪ :‬כיווניות ההעברה נשמרת! הגנים של ‪ Tra‬נמצאים‬ ‫באותו המקום על הכרומוזום כמו בפלסמיד‪ ,‬כלומר בסוף‪ ,‬ולכן‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬קוניוגציה בחיידקים‬ ‫‪9‬‬ ‫הכיווניות של הכרומוזום – מבחינת הגנים‪ ,‬המיקום שלהם‪ ,‬מרחקי המפה – נשמרים‪ .‬מסיבה זו חיידק‬ ‫מקבל גם לא יהפוך לחיידק תורם של כרומוזומים אלא אם הכרומוזום כולו יעבור‪.‬‬ ‫ריקומבינציה הומולוגית‬ ‫בין‬ ‫שני‬ ‫מקטעים‬ ‫קומפלמנטציה‬ ‫שיש‬ ‫יכולה‬ ‫ביניהם‬ ‫להתרחש‬ ‫ריקומבינציה הומולוגית‪ .‬אם המקור‬ ‫הוא למשל שני מקטעים לינארים‪,‬‬ ‫אדום‬ ‫וכחול‪,‬‬ ‫ומתרחש‬ ‫אירוע‬ ‫ריקומבינציה אחד‪ ,‬מתקבלים שני‬ ‫מקטעים לינארים עם חתיכות כחולות‬ ‫ואדומות משולבות; בשני אירועים‬ ‫עדיין נקבל מקטעים לינארים‪.‬‬ ‫לעומת זאת‪ ,‬בין שני מקטעים מעגליים ריקומבינציה יחידה תוביל ליצירה של מקטע מעגלי אחד וגדול‪.‬‬ ‫ריקומבינציה כפולה תביא להחלפה של מקטעים ושמירה על שני הכרומוזומים המעגליים‪.‬‬ ‫בריקומבינציה הומולוגית בין מקטע לינארי למעגלי תתקבל בריקומבינציה בודדת לינאריזציה של המקטע‬ ‫המעגלי‪ ,‬אבל בריקומבינציה כפולה נקבל שמירה על המעגליות‪/‬לינאריות של כל דו‪-‬גדיל והחלפת‬ ‫מקטעים בין המקטע הלינארי למעגלי‪.‬‬ ‫כיצד מתבצעת הכניסה של ‪ Hfr‬הפלסמיד לגנום?‬ ‫‪ F-plasmid‬מכיל הרבה מאוד קטעי ‪ .IS elements‬הקטעים האלה‬ ‫קיימים גם בכרומוזום ונוטים לעודד ריקומבינציה‪ ,‬כך שיש סבירות‬ ‫גבוהה שתהיה ריקומבינציה יחידה שתכניס את ‪ F‬פלסמיד לתוך‬ ‫הכרומוזום‪.‬‬ ‫לעומת זאת‪ ,‬החיידק המקבל מכיל את המקטע הלינארי שקיבל‬ ‫בקוניוגציה‪ ,‬ואם תהיה ריקומבינציה בודדת הכרומוזום של החיידק‬ ‫יהפוך לינארי – מצב לא תקין‪ .‬לעומת זאת אם המקטע ‪ A+‬ייכנס‬ ‫בריקומבינציה כפולה המעגליות של הכרומוזום תישמר‪ ,‬האלל ‪a-‬‬ ‫יעבור למקטע הלינארי )אשר יעבור דגרדציה בגוף החיידק(‪,‬‬ ‫והתוצאה תהיה החלפה של אלל אחד באלל אחר‪.‬‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬ ‫‪10‬‬ ‫במעבדה‬ ‫אנחנו נעשה ניסוי של ‪ ,interrupted mating‬שבו ננסה לגרום לחיידקים לעבור קוניוגציה ונעצור אותה‬ ‫לאחר פרקי זמן שונים‪ .‬מכיוון שהכיווניות נשמרת‪ ,‬ניתן לחפש סמנים מוכרים על הכרומוזום‪ ,‬לראות‬ ‫באיזה סדר הם עוברים ולהחליט מהו הסדר הלינארי של הסמנים‪.‬‬ ‫בשיטה הזו בעבר מיפו את כל הכרומוזום של ה‪ ;E.coli-‬אולם‪ ,‬על הכרומוזום יש כמה אתרי ‪IS‬‬ ‫‪ elements‬כלומר שבין זני ‪ Hfr‬שונים נקודת תחילת ההעברה עשויה להיות שונה – כל פלסמיד‬ ‫נכנס למקום אחר בגנום ולכן סדר המארקרים יהיה שונה לינארית )גם אם יהיה זהה מעגלית(‪ .‬כמו‬ ‫כן הכיווניות של כניסת הפלסמיד יכולה להיות שונה‪.‬‬ ‫יצירה של זן ‪ Hfr‬מזן ‪ F+‬ויצירה של '‪F‬‬ ‫הפלסמיד נכנס בעזרת אתר ‪.IS elements‬‬ ‫ריקומבינציה נוספת בין שני האתרים האלה יכולה‬ ‫לפלוט החוצה את הפלסמיד‪ .‬אולם‪ ,‬אין חובה‬ ‫שהריקומבינציה תתרחש בין אותם ‪IS elements‬‬ ‫שהכניסו את הפלסמיד; היא יכולה באותה מידה‬ ‫להתרחש רק בין אחד מה‪ IS elements-‬האלה ועוד‬ ‫‪ IS element‬שאינו תוחם את הפלסמיד‪ .‬כתוצאה‬ ‫מכך הפלסמיד החדש שנפלט מתוך הכרומוזום‬ ‫מכיל פלסמיד‪ F-‬ועוד קצת – עוד גנים מתוך‬ ‫הכרומוזום החיידקים‪.‬‬ ‫הפלסמיד הזה מכונה פלסמיד '‪ ,F‬ואם הפלסמיד הזה‬ ‫עובר בין חיידקים‪ ,‬מכיוון שהוא מספיק קטן כדי‬ ‫לעבור בשלמות כמו פלסמיד ‪ ,F+‬הוא יישמור על‬ ‫צורתו המעגלית בגופו של החיידק המקבל וכך‬ ‫החיידק המקבל יהפוך דיפלואידי לגנים הספורים‬ ‫שהועברו על ידי פלסמיד '‪ .F‬חיידק זה יהיה מכונה מרופלואידי או מרוזיגוט‪.‬‬ ‫בשיטה זו למדו בעבר על תכונות של דומיננטיות ורצסיביות – על ידי יצירת מרופלואידים יכלו‬ ‫לבדוק מיהו האלל הדומיננטי‪ ,‬זה שעל הכרומוזום או זה שעל הפלסמיד‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬קוניוגציה בחיידקים‬ ‫‪11‬‬ ‫סיכום‬ ‫•‬ ‫חיידק ‪ F-‬הוא חיידק ללא פלסמיד קוניוגטיבי ויכול להיות מקבל פלסמיד‪.‬‬ ‫•‬ ‫חיידק ‪ F+‬הוא חיידק המכיל פלסמיד קוניוגטיבי ויכול להיות תורם לחיידק ‪.F-‬‬ ‫•‬ ‫חיידק ‪ Hfr‬הוא חיידק שבו הפלסמיד עבר ריקומבינציה יחידה ונכנס לתוך הכרומוזום‪ .‬כעת החיידק‬ ‫יכול להעביר מקטעים לינארים של הכרומוזום לחיידקים אחרים‪.‬‬ ‫•‬ ‫חיידק '‪ F‬הוא חיידק שהיה ‪ Hfr‬ואז‪ ,‬עקב ריקומבינציה פנימית בכרומוזום‪ ,‬הפלסמיד יצא החוצה‬ ‫באופן יותר ממלא – וכעת הוא מכיל גנים כרומוזומליים‪ .‬החיידק יכול להעביר את הפלסמיד‬ ‫לחיידקים אחרים ולהפכם למרופלואידים ובעלי ‪.Genes of Transfer‬‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬ ‫‪12‬‬ ‫מעבדה ‪ :03‬גנטיקה בשמרים‬ ‫השמרים הם חלק ממערכת הפטריות‪ ,‬המכילה גם את העובש והפטריות‪ .‬השמר מתקיים באיזורים‬ ‫מגוונים‪ ,‬בעיקר איזורים עשירים בסוכר – דוגמת קליפות ענבים‪.‬‬ ‫מאפייני השמר‪:‬‬ ‫•‬ ‫חד‪-‬תא אאוקריוט בעל ‪ 16‬כרומוזומים‪.‬‬ ‫•‬ ‫עובר חילוף דורות ויכול להיות הפלואידי ודיפלוחאידי‪.‬‬ ‫•‬ ‫יכול לשמש מודל ליצורים מורכבים יותר )כי הוא אאוקריוט(‪.‬‬ ‫•‬ ‫הגנום שלו היה הראשון שרוצף‪ ,‬כאשר הוא מכיל ‪ 12‬מיליון זוגות בסיסים וכ‪ 6000-‬גנים שאנו‬ ‫מכירים את הפונקציה של רובם )בניגוד לאדם בו מוכרת הפונקציה של פחות מרבע מהגנים(‪.‬‬ ‫מניפולציות גנטיות‪ ,‬במיוחד חוסרים של גנים‪ ,‬הן קלות יחסית בשמר‪ ,‬ונעשות בעיקר על ידי‬ ‫טרנספורמציות וריאקומבינציות‪ .‬ניתן להכניס לשמר מקטע לינארי המכיל גן סימון כלשהו – עמידות‬ ‫לקאנאמיצין למשל‪ .‬משני צידי הגן יש מקטעים שיכולים לבוא בריקומבינציה עם קטע מסויים בגנום‪.‬‬ ‫הריקומבינציה מכניסה את העמידות לגנום במקום הגן שאנחנו מבקשים לעשות לו חסר‪ ,‬ואז אנחנו יכולים‬ ‫לבודד את השמרים שהכניסו את המקטע על ידי האנטיביוטיקה מחד‪ ,‬ולדעת שהם בעלי חסר בגן המעניין‬ ‫אותנו מאידך‪.‬‬ ‫מיטוזה‬ ‫השמר יכול להתקיים בשני מופעים‪ :‬הפלואידי ודי‪-‬‬ ‫פלואידי‪ ,‬המתרבים בחלוקות מיטוטיות‪ .‬בחלוקות‬ ‫מיטוטיות יש הכפלה של ה‪ DNA-‬המחולק לאחר‬ ‫מכן באופן שווה‪ ,‬בעיקרון‪ ,‬בין שני תאי הבת‪ .‬מכיוון‬ ‫שזוהי מיטוזה‪ ,‬תאי הבת לרוב יהיו זהים לחלוטין‬ ‫לתא האם )אלא אם תתרחש ריקומבינציה מיטוטית‪,‬‬ ‫שהיא אירוע נדיר בתהליך זה(‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫מעבדה ‪ :03‬גנטיקה בשמרים‬ ‫‪13‬‬ ‫באיור הבא מופיע מחזור החיים של‬ ‫השמר‪ .‬ניתן לעקוב אחר שלב החיים‬ ‫של התא לפי גודל התא המנץ‪ ,‬עד‬ ‫שהוא משתחרר מתא האם והופך לתא‬ ‫בפני עצמו‪ .‬המחזור הזה קורה בתאים‬ ‫דיפלואידים והפלואידים כאחד‪ .‬תא‬ ‫האם יכול להיות מזוויג מסויים –‬ ‫כאשר בשמרים הזוויגים הם ‪ a‬או ‪.α‬‬ ‫דיפלואידים מכילים אללים של ‪ a‬ושל‬ ‫‪ α‬יחד‪.‬‬ ‫סקס בשמרים‬ ‫כאשר שני תאים הפלואידים משני‬ ‫זוויגים שונים נפגשים הם יכולים‪,‬‬ ‫בתנאים מתאימים‪ ,‬לעבור ‪.mating‬‬ ‫בתהליך זה כל תא מפריש פרומונים‪,‬‬ ‫שהתא השני חש ואז שולח שלוחות‬ ‫ומתקרב‪ .‬בתהליך ה‪ mating-‬שני‬ ‫התאים מתאחים לאחד‪.‬‬ ‫ספורולציה‬ ‫ספורולציה היא תהליך המתרחש‬ ‫במצבי עקה שאינם מאפשרים לשמר להתחלק מיטוטית‪ .‬כתוצאה מתנאי העקה התא הדיפלואיד יעבור‬ ‫מיוזה ליצירת ספורות‪ ,‬שהן גוף עמיד יותר מהתא החי ויכולות לשרוד את תנאי העקה‪ .‬בתהליך‬ ‫הספורולציה ארבעת תאי הבת של המיוזה אינם נפרדים אלא נותרים יחד בשק אסקוס וכל ספורה בתוך‬ ‫השק הינה בעלת מעטפת קשיחה היכולה לעמוד בתנאי העקה‪ .‬ישנן שתי ספורות מכל זוויג בתוך אסקוס‬ ‫ספציפי‪.‬‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬ ‫‪14‬‬ ‫לאחר שיעברו תנאי העקה יכולות הספורות לצאת מהאסקוס ולנבוט; מרגע שנבטו הם תאים הפלואידים‬ ‫חיים‪ ,‬לא עוד ספורות‪ ,‬שיכולים לעבור זיווג עם שמר אחר מהזוויג ההפוך להם‪ .‬האיור הבא מציג שוב את‬ ‫מחזור החיים של השמר‪ ,‬עם הידע החדש שלנו אודות תהליכי הזיווג והספורולציה שלהם‪.‬‬ ‫שינוי זוויג‬ ‫‪ Mating Type Switching‬הוא תהליך שבו שמר הפלואידי יכול לעבור מזוויג אחד לאחר‪ .‬מצב זה מגן‬ ‫על ההפלואיד ממוטציות מזיקות שיכולות להתבטא כשהוא במצב ההפלואיד; במידה ולא זמינים בסביבתו‬ ‫בני זוויג הפוך ממנו‪ ,‬הוא יכול להחליף זוויג‪ ,‬להזדווג עם שמר סמוך ולהגיע למצב דיפלואידי – מצב בו‬ ‫הגנים שלו מוגנים יותר מפני מוטציות באללים מכיוון שכעת יש גיבוי על ידי שני אללים ולא אלל יחיד‬ ‫לכל גן‪ .‬כמו כן במצבי עקה הדיפלואיד יכול לעבור ספורולציה‪ ,‬להבדיל מההפלואיד‪.‬‬ ‫יש לציין כי במעבדה הזנים אינם יכולים לשנות את הזוויג‪.‬‬ ‫הגדרת הריקומבינציה‬ ‫ריקומבינציה )הומולוגית( היא שיחלוף בין שני מקטעי ‪ DNA‬הומולוגים‪ .‬התהליך הזה יכול לשמש למשל‬ ‫לתיקון שברים בגנום‪ ,‬כאשר הכרומוזום השבור יכול לעבור ריקומבינציה עם גדיל תקין‪ ,‬ועל בסיסו‬ ‫לבנות את החלק החסר בו‪ .‬השבירה של הכרומוזום גורמת לאותו איזור להיות מאוד פעיל ולכן הוא נוטה‬ ‫לעבור את הריקומבינציה‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫מעבדה ‪ :03‬גנטיקה בשמרים‬ ‫‪15‬‬ ‫דרך אחת לריקומבינציה היא תהליך הקרוס‪-‬אובר‪ ,‬שבה‬ ‫מקטע מכרומוזום אחד עובר לכרומוזום השני; בתהליך‬ ‫המרת הגנים )‪ (Gene Conversion‬הסיב השבור פשוט‬ ‫מעתיק את המידע מהסיב התקין וכך משלים את הפער‬ ‫שנוצר בו‪.‬‬ ‫כאשר הגנום תקין‪ ,‬ריקומבינציה תתרחש בתהליך המיוזה‬ ‫בין שני כרומוזומים הומולוגים פרנטאליים‪ .‬התהליך‬ ‫מתרחש על ידי בניית כיאזמות בין שני הכרומוזומים שבהן‬ ‫מתרחש שיחלוף חומר גנטי‪ .‬התוצר של הריקומבינציה‬ ‫מביא לשונות גנטית בין הורים לצאצאים‪ .‬התהליך מתוכנת‪,‬‬ ‫מחייב ושכיח‪.‬‬ ‫הריקומבינציה יכולה לשמש אותנו לדעת האם גנים‬ ‫נמצאים בתאחיזה או מרוחקים‪ :‬אם גנים מרוחקים‬ ‫או נמצאים על כרומוזומים שונים‪ ,‬אנחנו מצפים‬ ‫שיהיה סיכוי שווה לקבל בצאצאים הפרדה בין‬ ‫הגנים לעומת המצב הפרנטאלי‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬אם‬ ‫הגנים סמוכים זה לזה על אותו הכרומוזום אנחנו‬ ‫מצפים שהיכולת שלהם להיפרד בצאצאים נמוכה‬ ‫יותר כי יש פחות סיכוי לריקומבינציה במרחק‬ ‫המצומצם שביניהם‪.‬‬ ‫מורגן הגדיר כי התפלגות הצאצאים מעידה על המרחק בין שני סמנים הגנטיים ולמעשה הגדיר את‬ ‫המונח סנטי‪-‬מורגן‪ ,‬יחידה אחת של מרחק בין הגנים‪ 1% .‬של ריקומביננטים שווה למרחק של ‪1‬‬ ‫סנטימורגן ולכן איננו יכולים להגדיר יותר מ‪ 50-‬סנטימורגן בין גנים – שכן לא ניתן לקבל התפלגות של‬ ‫יותר מ‪.50:50-‬‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬ ‫‪16‬‬ ‫מטרת הניסוי‬ ‫במעבדה ניקח זן דיפלואידי בעל גנוטיפ הורים ידוע‪ ,‬נגרום לשמר‬ ‫לספורולציה ולפי התפלגות הצאצאים ההפלואדים נלמד על‬ ‫הגנוטיפים של ההורים ועל תכונות נוספות של הגנום‪ .‬למשל‪ ,‬אם‬ ‫ההורה היה הטרוזיגוט ליכולת לסנטז אדנין אנחנו מצפים שמחצית‬ ‫מההפלואידים יהיו תקינים ומחצית לא‪-‬תקינים‪.‬‬ ‫אולם‪ ,‬מכיוון שהתרבית שלנו מקורה בהרבה תאים דיפלואידים‪,‬‬ ‫נתקשה לשייך צאצאים להורים ספציפיים; אפשר במקום זאת‬ ‫להפריד אסקוסים‪ ,‬לפרק אותם ולזרוע אותם לצלחת – תהליך‬ ‫המכונה אנאליזת טטראדות‪ .‬זאת לעומת השיטה השנייה‪ ,‬שבה‬ ‫הצאצאים מפוזרים בצלחת באופן אקראי ואיננו יודעים מהו המקור‬ ‫של הצאצאים‪.‬‬ ‫בעזרת אנאליזת הטטראדות ניתן לאתר גם רביעיות ספורות‬ ‫חריגות‪ ,‬למשל מצב שבו מוצאים שלושה מסוג אחד וצאצא אחד‬ ‫מהסוג השני; דבר כזה יכול לקרות למשל בריקומבינציה הומולוגית‬ ‫בעת המיוזה‪ ,‬שיכולה הייתה לגרום לקרוס‪-‬אובר או המרת גנים‪,‬‬ ‫שיביאו לשינוי המצב הצפוי‪.‬‬ ‫יחסים בין אללים וגנים‬ ‫המוטציה‬ ‫פנוטיפ הדיפלואיד‬ ‫פנוטיפ הספורות ההפלואידיות )‪(%‬‬ ‫מוטציה רצסיבית ‪a-/A+‬‬ ‫‪A+‬‬ ‫‪50:50‬‬ ‫‪A+ B+ (prototroph) = 25%‬‬ ‫מוטציות רצסיביות בגנים שונים לא‬ ‫אחוזים באותו מסלול ביוסינטטי‬ ‫‪A+ B+‬‬ ‫‪B+/b- A+/a‬‬‫מוטציה רצסיבית ‪a/a‬‬ ‫‪ 2‬אללים מוטנטים רצסיביים שונים‬ ‫‪a/a‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫‪A+ b- (oxotroph) = 25%‬‬ ‫‪a- B+ (oxotroph) = 25%‬‬ ‫‪a- b- (oxotroph) = 25%‬‬ ‫‪a‬‬ ‫‪a‬‬ ‫‪a‬‬ ‫‪a = 50%‬‬ ‫‪a = 50%‬‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫שיעור ‪ :04‬גנטיקה של האדם‬ ‫‪17‬‬ ‫שיעור ‪ :04‬גנטיקה של האדם‬ ‫כל הדברים שציינו קודם בתור יתרונות של מערכות המודל הופכים במחקר הגנטי באדם לקשיים – שנות‬ ‫הדור‪ ,‬הגנום הגדול והדיפלואידי‪ ,‬מעורבות של גנים רבים בתכונות‪ ,‬מערכות מודל מוגבלות‪ ,‬קושי‬ ‫במניצפולציות גנטיות ושאלות אתיות‪ .‬מכאן שאנחנו מוגבלים לשאלות שאנחנו יכולים לענות עליהן‬ ‫כמעט רק בעזרת המצב הקיים‪.‬‬ ‫פולימורפיזם באוכלוסיה‬ ‫לתחום זה נכנס הפולימורפיזם – גיוון תכונות‪ .‬עולה השאלה מה ההבדל בעצם בין פולימורפיזם לבין‬ ‫אללים שונים הנובעים ממוטציות? שהרי אלו אללים ואלו אללים‪ .‬התשובה היא השכיחות – ישנו ערך סף‬ ‫באוכלוסיה ואלל נחשב פולימורפי אם הוא נפוץ ב‪ 1%-‬מהאוכלוסיה ואם בפחות מכך – ייחשב כמוטציה‪.‬‬ ‫כמובן שיש יוצאי דופן אך זו ההגדרה השרירותית בה נשתמש בקורס זה‪.‬‬ ‫אם כן‪ ,‬מה זה ‪ ?WT‬האם זה שיער שחור‪ ,‬עור בהיר? המושג הזה בתכונות פולימורפיות בטל בשישים‪,‬‬ ‫אבל מה שלרוב עושים הוא להגדיר את ‪ WT‬בתור האלל הפולימורפי הנפוץ ביותר‪.‬‬ ‫יש גם פולימורפיזם שנובע משינויים סביבתיים אבל אנחנו לא נתייחס אליהם במחקר במעבדה זו‪.‬‬ ‫חקר פולימורפיזם‬ ‫•‬ ‫חקר מחלות תורשתיות‬ ‫•‬ ‫מחקר אבולוציוני‬ ‫•‬ ‫סדר חברתי – זיהוי פרטים לצרכים שונים‪ ,‬כמו זיהוי פלילי או בדיקת אבהות‪.‬‬ ‫עד כה הסתכלנו על סמנים גנטיים שונים של אורגניזם מודל – כמו עמידות לאנטיביוטיקה או‬ ‫אוקסוטרופיות – ועל ידי גידול או אי גידול יכולנו לבדוק את הנוכחות של הסמן‪ .‬אם היינו יכולים לרצף‬ ‫את כל הפרטים היינו יכולים לדעת את הנתונים כבר ברמה הגנטית‪ ,‬ולמצוא סמנים גנטיים הרבה לפני‬ ‫הגידול‪ .‬ה‪ DNA-‬מהווה עבורנו סמן גנטי כי כאשר הוא ידוע אין צורך לבצע את הניסוי ולבדוק‬ ‫גידול‪ /‬אי גידול‪.‬‬ ‫סמן גנטי הוא כל שינוי ברצף ה‪ DNA-‬אשר יש לו פנוטיפ שניתן לזהות‪ .‬אם היינו יכולים לראות את‬ ‫הרצף היינו יכולים לחסוך גילוי הפנוטיפ ברמות מאוחרות יותר‪ ,‬כמו רמת האורגניזם‪ .‬לשם כך התפתחה‬ ‫שיטת הסניפים – ‪ .SNP = Single Nucleotide Polymorphism‬השיטה משתמשת בריצוף של‬ ‫מספר מקטעים וזיהוי סניפים – אתרים שבהם יש הבדלים בין פרטים‬ ‫מסויימים )בחלק מהאנשים למשל יש ‪ C‬ובאחרים יש ‪ .(A‬האתרים האלה‬ ‫לא חייבים להיות מקודדים לחלבון‪.‬‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬ ‫‪18‬‬ ‫מאפייני סמנים גנטיים‬ ‫•‬ ‫הסניפים הם אירועי החלפת נוקליאוטיד שהם יציבים גנטית – יש להם שכיחות מסויימת‬ ‫באוכלוסיה והשכיחות הזו יציבה גנטית‪.‬‬ ‫•‬ ‫הסניפים מורשים מהורים לילדים בתורשה קלאסית‪ ,‬ואפשר להסתכל עליה כ"גן" תורשתי לכל‬ ‫דבר – יכולים להיות עד ארבעה אללים שונים לכל אתר סניפ‪ ,‬מכיוון שיש ארבעה נוקליאוטידים‬ ‫אפשריים לאותה עמדה‪ .‬אולם‪ ,‬לא בהכרח תמיד יהיו כל האללים האפשריים‪.‬‬ ‫•‬ ‫שכיחות הופעת האללים – לכל אלל של סניפ יש שכיחות מסויימת באוכלוסיה‪ ,‬ואין חוקיות‬ ‫שמגדירה שכיחויות של אללים מסויימים‪.‬‬ ‫ריצוף‬ ‫הריצוף היא שיטה טובה למציאת סמנים גנטיים‪ ,‬אולם זו בעקרון שיטה יקרה )למרות שהמחקר‬ ‫והטכנולוגיה מוזילים אותה מרגע לדודלי(‪ .‬לפיכך יש לנו סמנים גנטיים נוספים נפוצים‪ ,‬יותר קלים או‬ ‫זולים לאיתור‪.‬‬ ‫‪RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism‬‬ ‫שינויים באתרי ‪ DNA‬מסויימים משפיעים על קיום או אי קיום אתר רסטריקציה מסויים‪ .‬אם ניקח למשל‬ ‫מקטע מסויים מכרומוזום ‪ ,III‬נגביר אותו בעזרת ‪ PCR‬ונחתוך את הגנום הזה בעזרת אנזימי רסטריקציה‪,‬‬ ‫נראה שבאלל ‪ A‬יש שני אתרי חיתוך‬ ‫לאנזים‬ ‫ולכן‬ ‫מתקבלים‬ ‫שלושה‬ ‫פרגמנטים מחיתוך ה‪ ,PCR-‬בעוד‬ ‫שבאלל ‪ B‬יש קיבוע של נוקליאוטיד‬ ‫ששינה את אתר החיתוך של האנזים‪,‬‬ ‫כך שמתקבלים רק שני בנדים בתבנית‬ ‫של אלל ‪.B‬‬ ‫הדוגמה הקלאסית היא אנמיה חרמשית )איך לא(‪ :‬בגן שיוצר את חלבון ה‪heme-‬‬ ‫יש מוטציה המביאה לשינוי בצורת כדורית הדם האדומה‪ .‬היות וזו מחלה הנובעת‬ ‫ממוטציה בנוקליאוטיד יחיד בגן יחיד‪ ,‬אנחנו יכולים לעשות ‪ PCR‬לגן ולראות‬ ‫מהם האללים‪ .‬השינוי הנוקליאוטידי גורם לתבנית בנדים שונה בין אלל תקין‬ ‫לאלל חולה‪ .‬כך ניתן לזהות אדם הנושא את המחלה גם ללא ריצוף‪.‬‬ ‫רצפי ‪Alu‬‬ ‫רצפים אלו הם בגודל ‪ 300‬נוקליאוטידים בערך‪ ,‬שמקורם ברטרו‪-‬טרנספוזון עתיק‪ .‬הרצפים פזורים בגנום‬ ‫בכמעט מיליון עותקים‪ ,‬ובאמצע הרצף יש אתר רסטריקציה לאנזים ‪ .AluI‬כל אתר ‪) Alu‬אתר של ‪300‬‬ ‫נוקליאוטידים( בגנום יכול להכיל את אתר החיתוך ויכול שלא‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫שיעור ‪ :04‬גנטיקה של האדם‬ ‫‪19‬‬ ‫נניח שיש אתר ‪ Alu‬שנמצא באוכלוסיה בתאחיזה‬ ‫לאלל מחלה‪ .‬אם רואים שאין תאחיזה כזו לאלל‬ ‫הבריא‪ ,‬ניתן להניח כי באמת קיימת תאחיזה לגן‬ ‫המוטנטי ואז ניתן להשתמש בנוכחות האתר כמרקר‬ ‫לגנום המוטנטי‪.‬‬ ‫השימוש נעשה באופן הבא‪ :‬מגבירים‬ ‫אתר שבו אנו חושדים שיש אתר ‪Alu‬‬ ‫בעזרת פריימרים ימני ושמאלי סביב‬ ‫האתר‪ .‬אם אתר ‪ Alu‬אינו נמצא‬ ‫באתר‪ ,‬אנחנו נקבל גודל מסויים של‬ ‫תוצר ‪ PCR‬ואם הוא נוכח הגודל של התוצר ייגדל ב‪ 300-‬נוקליאוטידים‪ .‬כעת אם נריץ את התוצרים‬ ‫בג'ל נראה הבדל בריצה של כל אלל – האלל ללא ‪ Alu‬ירוץ מהר יותר מזה עם ‪ ,Alu‬כי הוא קצר יותר‪.‬‬ ‫בהנחה שידועה תאחיזה‪ ,‬אנחנו יכולים לדעת האם יש אלל חולה או לא; אם לא יודעים‪ ,‬אפשר לעשות‬ ‫זאת לאנשים חולים ובריאים ולבדוק במי האלל מופיע ובמי לא‪.‬‬ ‫‪VNTR = Variable Number of Tandem Repeats‬‬ ‫בניגוד לאתרי ‪ Alu‬שפזורים בגנום לחוד‪ ,‬כאן יש יחידת ליבה חוזרנית‪ .‬בדוגמה יחידת הליבה מכילה ‪5‬‬ ‫בסיסים )אבל יכולה להכיל גם יותר( והפולימורפיזם מתבטא במספר הפעמים שהיחידה חוזרת על עצמה‪.‬‬ ‫גם צורת התורשה של התכונה הזו היא תורשה קלאסית‪ ,‬כאשר כל אלל מכיל מספר חזרות שונה‪ .‬כאן‬ ‫מספר האללים האפשריים הוא לכאורה בלתי מוגבל – כיוון שכל מספר חזרות אפשרי‪ .‬זהו פולימורפיזם‬ ‫מאוד משמעותי‪ .‬עם זאת‪ ,‬חשוב לזכור‬ ‫שלא כל מספר חזרות אפשרי בהכרח‬ ‫קיים באוכלוסיה‪.‬‬ ‫כעת ניתן לתכנן פריימרים שיושבים משני צידי אתר ה‪-‬‬ ‫‪ VNTR‬ואורך מספר תוצר ה‪ PCR-‬יהיה תלוי במספר‬ ‫החזרות‪ .‬הג'ל בדוגמה מציג שישה פרטים באוכלוסיה שבהם‬ ‫הוגבר אתר ‪ VNTR‬מסויים‪ .‬אפשר לראות את‬ ‫הפולימורפיות הרבה בין הפרטים שמתקבלת כאן‪ ,‬מה שלא‬ ‫יכולנו להשיג בשיטות הקודמות בהן מספר האללים היה‬ ‫מאוד מוגבל‪.‬‬ ‫יחד עם זאת‪ ,‬למרות הפולימורפיות הרבה ראו שיש אוכלוסיות מסויימות שבהן יש שכיחות גבוהה של‬ ‫אללים ספציפיים‪ .‬בצורה זו העץ )שקופית ‪ 16‬במצגת ‪ (4‬מנסה למפות אוכלוסיות שונות בעולם לפי אתר‬ ‫‪ VNTR‬מסויים‪ .‬בצורה זו ניתן להשתמש באתרים אלו למחקרים אבולוציוניים‪.‬‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬ ‫‪20‬‬ ‫פרופיל גנטי‬ ‫אם רוצים באמת להבדיל בין פרטים באוכלוסייה‬ ‫צריך ליצור פרופיל גנטי; סביר להניח שהשימוש‬ ‫בשיטה אחת עם אתר אחד לא יצליח להפריד‬ ‫באוכלוסיות; שימוש באתר ‪ Alu‬הרבה פחות יעיל‬ ‫מ‪ VNTR-‬אבל ככל שאוספים יותר סמנים גנטיים‬ ‫במקביל ההבחנה הופכת יותר דקה וניתן ליצור‬ ‫פרופיל גנטי שונה עבור כל אחד‪ .‬ככל שלוקחים‬ ‫יותר נתונים‪ ,‬הסיכוי שנמצא עוד פרט עם אותו‬ ‫פרופיל גנטי הולך וקטן‪ .‬פרופיל זה משמש למשל‬ ‫בזיהוי פלילי ובדיקות אבהות‪.‬‬ ‫קבוצות הדם‬ ‫במאה ה‪ 18-‬התחילו לעשות עירויי דם‪ ,‬וראו שבחלק מהמקרים זה מצליח ובאחרים זה נגמר באסון;‬ ‫כאשר בדקו עירויים שונים‪ ,‬כדוריות לחוד ופלזמות לחוד מאנשים שונים והצליבו את הנתונים; ראו‬ ‫מאפיינים שונים של אגרגציה של התאים ומתוך זה חילקו את ארבע קבוצות הדם‪.‬‬ ‫הקבוצות האלו נובעות מביטוי אנטיגנים מסויימים – ‪ A‬או ‪B‬‬ ‫– על גבי כדורית הדם‪ .‬ארבע הקבוצות נובעות מהשילובים‬ ‫השונים‪ AB ,B ,A :‬או אף נוגדן )‪ .(O‬בפלזמות נמצאים‬ ‫נוגדנים נגד האנטיגנים שאינם קיימים על הכדורית‪.‬‬ ‫כיצד אדם שמעולם לא קיבל תרומת דם נחשף לאנטיגנים שלא‬ ‫שלו?‬ ‫האנטיגנים של כדוריות הדם נישאים גם על ידי חיידקים‬ ‫מסויימים; אדם עם דם ‪ A‬יש לו נוגדנים לדם ‪ B‬כי הוא נחשף‬ ‫לחיידקים בעלי האנטיגן ‪.B‬‬ ‫חיידקים בעלי אותו אנטיגן כמו כדוריות הדם‪ ,‬כתוצאה מכך‪,‬‬ ‫זוכים להתעלמות מצד המערכת החיסונית שכן היא מתייחסת‬ ‫אליהם כאל כדוריות דם‪.‬‬ ‫האנטיגן עשו עץ סוכרי‪ ,‬הנבנה על ידי אנזים‬ ‫ספציפי‪ .‬העצים הסוכריים נבדלים אלו מאלו בשל‬ ‫אללים שונים של האנזים היוצרים כל אחד‬ ‫מודיפיקציות שונות; הטרוזיגוט ‪ AB‬מכיל את שני‬ ‫האנזימים ולכן הכדורית שלו מציגה את שני‬ ‫הסוכרים‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫שיעור ‪ :04‬גנטיקה של האדם‬ ‫‪21‬‬ ‫מבחינה גנטית‪ ,‬יחסי האללים ‪ A‬ו‪ B-‬הם קו‪-‬דומיננטים כי הם לא מפריעים אחד לשני‪ .‬בין ‪ A‬או ‪B‬‬ ‫ל‪ O-‬יש יחסים של דומיננטיות נגד ‪.O‬‬ ‫מכיוון שהדם מכיל נוגדנים לאללים שאין לאדם‪ ,‬כדוריות דם מסוג ‪ O‬הן תורמות אוניברסליות כי‬ ‫הנוגדנים לא מזהים אותן )הן לא מציגות אנטיגנים( ואדם בעל דם מסוג ‪ AB‬הוא הנתרם האוניברסלי כי‬ ‫הפלזמה שלו אינה מכילה נוגדנים כלל‪.‬‬ ‫בניסוי מ‪ 2008-‬לקחו סוג דם מסויים והגיבו אותו‬ ‫עם נוגדנים מתאימים‪ .‬הטיפול הנחקר ניסה ליצור‬ ‫אנזים שיוריד את האנטיגנים מכדוריות הדם‬ ‫האדומות‪ ,‬כך שהם לא יגיבו עם הנוגדנים‪ .‬בצורה‬ ‫כזו כל תרומת דם תהיה כמו תרומת ‪ ,O‬תרומת דם‬ ‫אוניברסלית‪ .‬ניתן לראות שכאשר מגיבים עם‬ ‫הטיפול אין קישור בין הנוגדן לאנטיגן‪.‬‬ ‫בטבלה הבאה רואים שכיחות של סוגי הדם‬ ‫באוכלוסיות שונות‪.‬‬ ‫כמה מילים על הארדי‪-‬וויינברג‬ ‫שיווי משקל הארדי וויינברג מתקיים בתנאים‬ ‫מסויימים ומקיים תנאים מתמטיים לגבי שכיחות‬ ‫הגנוטיפים השונים )מודגם על שני אללים(‪ .‬נניח ויש‬ ‫מחלה הומוזיגוטית רצסיבית )‪ .(aa‬מכאן שרק‬ ‫להומוזיגוט הרצסיבי יש פנוטיפ‪ .‬אם ‪ aa‬מבקש שלא‬ ‫יהיו לו צאצאים בעלי פנוטיפ‪ ,‬הוא יכול ללכת עם ‪ .AA‬על מנת לדעת כמה ‪ AA‬יש באמת באוכלוסיה‪,‬‬ ‫אפשר לחשב את השכיחות של ‪ ,aa‬מתוך זה לחלץ את השכיחות של ‪ ,a‬מתוך זה לחשב את השכיחות של‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫גנטיקה ‪ -‬מעבדה‬ ‫‪22‬‬ ‫‪ A‬ואז את השכיחות של ‪ .AA‬כך ניתן למצוא את הסיכוי למצוא בן זוג מתאים שהוא גם ‪) AA‬זאת‬ ‫בהנחה שאין תאחיזה למין‪ ,‬אז הסיכוי יורד פי ‪ 2‬כי מחפשים מין מסויים(‪.‬‬ ‫יחד עם זאת‪ ,‬אפשר לעשות דבר אחר – אפשר להראות שיש סטיות שמלמדות כי לא מתקיים הארדי‬ ‫ויינברג‪ ,‬ואז להעמיק את המחקר כדי לראות מה קורה שם‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫החוג לביולוגיה‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב‪2011 ,‬‬