1. No category

!
"#$!%#&'#()$#*'+,-#&).#!/,+0&$#$!
1*'$)$0$$!/23!4#5)')*'+!6)2&2.)!
!
!
!
!
!
!
!"#$%&"#'"(")*+&+,-&.,/*+(&.+&),
0$##12%&1"3'&)4,%5#)&%&6,
7$+$7)&+"%&+"#3,*3,("*1*3"%7,)&%)"#3,,
8"1"#,9$17-*,:$#%&#,
7,8%#&232--.,(#!(#5!6)2)*.#*)930$5,**)*.#*!
:0*)!;<==!
!
!
Bacheloroppgave
!"#"#$%
Denne oppgaven er skrevet som avsluttende fordypningsoppgave ved bioingeniørutdanningen,
Institutt for Medisinsk Biologi ved Universitet i Tromsø. Oppgaven er gjennomført våren 2011 ved
Institutt for Kjemi, Universitetet i Tromsø.
Jeg vil rette en stor takk til Professor Tore Lejon for ypperlig faglig veiledning, god hjelp i
skriveprosessen og for at jeg fikk delta i et spennende prosjekt. Takk til veileder Homayoun
Amirnejad for nyttige innspill og veiledning i skriveprosessen.
En stor takk rettes også til kunnskapsrike Alexey Gorovoy som med stort tålmod har hjulpet meg i
det praktiske arbeidet på lab, Reidun Klykken Lie ved MabCent for hjelp med biologisk testing og
ingeniørene ved Institutt for Kjemi for hjelp med analyseinstrumentene. Takk til studenter og
kollegaer som har tatt godt i mot meg og gitt meg nyttige tips og moralsk støtte under
prosjektperioden.
Til slutt vil jeg takke samboeren min Lars, som har støttet meg gjennom hele arbeidet med denne
oppgaven.
Ailin Falkmo Hansen
Tromsø, 6. juni 2011
Universitetet i Tromsø
i
Bacheloroppgave
%
!
Universitetet i Tromsø
ii
Bacheloroppgave
&'(()*$#'+%
Derivater av 1,3-dimetylbarbitursyre og dehydroeddiksyre er blitt syntetisert og karakterisert for å
undersøke biologisk aktivitet overfor kinaser.
Tidligere undersøkelser med liknende substanser har vist lav vannløselighet, som gjør det vanskelig
å gjennomføre biologisk testing mot kinaser. Det har derfor vært ønskelig å syntetisere forbindelser
med høyere løselighet i vann enn tidligere syntetiserte forbindelser. Forbindelsene som er
syntetisert i dette prosjektet viser imidlertid generelt lav vannløselighet, men har gjennomgått
biologisk testing ved MabCent. Enkelte av de syntetiserte forbindelsene ser ut til å ha noe
inhiberende effekt.
Universitetet i Tromsø
iii
Bacheloroppgave
%
!
Universitetet i Tromsø
iv
Bacheloroppgave
&,(-".)#%"+%/"#0"#1).2)#%
ATP
adenosin trifosfat
calcd
kalkulert
CDCl3
deuterert kloroform
CD3OD
deuterert metanol
COSY
correlated spectroscopy
cm-1
bølgetall, resiproke centimetre
į
kjemisk skift (ppm)
d
dublett
D2O
deuterert vann
DMSO
dimetylsulfoxid
EI
elektrospray-ionisering
eq
ekvivalent
FID
free-induction decay
FT
fourier transformasjon
IR
infrarød spektroskopi
J
koblingskonstant
Km
Michaelis-Mentens konstant
KML
kronisk myelogen leukemi
LDA
litium diisopropylamid
m
multiplett
MS
massespektrometri
m/z
masse/ladning
NOESY
Nuclear Overhauser effect spectroscopy
NMR
kjernemagnetisk resonans
ppm
parts per million
s
singlett
t
triplett
TLC
tynnskjiktskromatografi
UV
ultrafiolett
Ȟ
bølgetall
Universitetet i Tromsø
v
Bacheloroppgave
Universitetet i Tromsø
vi
Bacheloroppgave
3**4".$%
Forord .......................................................................................................................................... i!
Sammendrag .............................................................................................................................. iii!
Symboler og forkortelser ............................................................................................................ v!
1 Introduksjon ............................................................................................................................ 1!
2 Teoretisk bakgrunn .................................................................................................................. 3!
2.1 Kinaser og kinase inhibitorer ........................................................................................... 3!
2.2 Metoder for karakterisering av forbindelser ..................................................................... 4!
2.2.1 Tynnskjiktskromatografi (TLC) ................................................................................ 4!
2.2.2 Kjernemagnetisk resonans (NMR) ............................................................................ 4!
2.2.3 Infrarød spektroskopi (IR) ......................................................................................... 7!
2.2.4 Massespektrometri .................................................................................................... 8!
2.3 Kinasescreening ............................................................................................................... 8!
2.3.1 Prinsipp for kinasescreening ..................................................................................... 9!
3 Resultater og diskusjon ......................................................................................................... 11!
3.1 Syntese av 1 .................................................................................................................... 11!
3.2 Syntese av 2 .................................................................................................................... 13!
3.3 Syntese av 3 .................................................................................................................... 16!
3.4 Syntese av 4 .................................................................................................................... 18!
3.5 Syntese av 5 .................................................................................................................... 20!
3.6 Syntese av 6 .................................................................................................................... 22!
3.7 Syntese av 7 .................................................................................................................... 26!
3.8 Syntese av 8 .................................................................................................................... 28!
3.9 Biologisk testing ............................................................................................................. 30!
3.9.1 Resultater fra biologisk testing ................................................................................ 30!
3.9.2 Diskusjon av resultater fra biologiske testing ......................................................... 30!
4 Konklusjon og videre arbeid ................................................................................................. 33!
Referanser................................................................................................................................. 35!
Eksperimentelt .......................................................................................................................... 37!
Appendiks: Spektre .................................................................................................................. 55!
Universitetet i Tromsø
vii
Bacheloroppgave
Universitetet i Tromsø
viii
Bacheloroppgave
5%3*1#"$6027"*%
Kinaser er enzymer som er overaktiverte ved sykdommer som for eksempel kreft. I tillegg er de
også antatt å kunne være viktige ved inflammasjon, kardiovaskulære sykdommer, diabetes og
reumatoid artritt (1). Ved å finne substanser som kan inhibere enzymene, er det mulig å hemme
eller stoppe utviklingen av for eksempel kreft. I dette prosjektet er 1,3-dimetylbarbitursyre og
dehydroeddiksyre blitt benyttet som utgangspunkt for syntese av forbindelser som kan være
potensielle kinaseinhibitorer.
F igur 1: Startmaterialer for syntesene i dette prosjektet: 1,3-dimetyl barbitursyre (til venstre) og
dehydroeddiksyre (til høyre).
Tidligere undersøkelser ved Institutt for Kjemi, Universitetet i Tromsø, har vist at forbindelser med
struktur som gitt i figur 2 viser biologisk aktivitet. Ettersom den biologiske testingen foregår i et
vandig miljø, er det nødvendig å benytte substanser som er vannløselige. Problemet med tidligere
syntetiserte forbindelser har vært at forbindelsene viser lav vannløselighet (2). Ved å syntetisere
forbindelser med høyere vannløselighet, vil dette kunne avsløre om forbindelsene har inhiberende
effekt overfor kinaser. Institutt for Kjemi har i pågående forskningsarbeid jobbet med å syntetisere
forbindelser som er løselig i vann.
F igur 2: Struktur av tidligere syntetiserte forbindelser med lav grad av vannløselighet.
I dette prosjektet er det blitt syntetisert forbindelser som har en liknende struktur som vist i figur 3.
1,3-dimetylbarbitursyre er et av utgangspunktene for syntesene i prosjektet, og ble acylert for å
Universitetet i Tromsø
1
Bacheloroppgave
oppnå høyere løselighet i vann. I tillegg ble dehydroeddiksyre benyttet som utgangspunkt for å
danne liknende forbindelser.
F igur 3: Struktur av målforbindelse.
%
Universitetet i Tromsø
2
Bacheloroppgave
8%9)"#)1:20%-'0+#6**%
2.1 K inaser og kinase inhibitorer
Kinaser er en gruppe enzymer som overfører fosfatgrupper fra vanligvis adenosin trifosfat (ATP) til
substratmolekyler og har mange betydelige oppgaver i kroppens celler. Blant annet er kinasene
viktige i signaloverføring for kontroll av cellesyklus, apoptose og angiogenese, som er prosesser
som er endret hos maligne celler. Ved kreft er kinasene ofte overaktiverte, slik at ved å hemme
kinasene, kan man stoppe eller hemme utviklingen av sykdom. I dag finnes det flere
kinaseinhibitorer som benyttes ved behandling av kreftsykdommer. Glivec® (imatinib) var den
første kinaseinhibitoren som ble utviklet, og benyttes til behandling av kronisk myelogen leukemi
(KML). Glivec® er inhibitor for fusjonsproteinet BCR-ABL som finnes hos noen av pasientene
med KML, og har vist seg å være effektiv i behandlingen av disse pasientene. (1, 3-5)
Kinaser synes å være et ideelt mål for utvikling av nye legemidler. I følge Stout et al. er det i
hovedsak tre ulike måter som man kan inhibere proteinkinaser 1) konkurrerende hemming ved
bindingssetet for ATP, 2) konkurrerende hemming ved proteinsubstratets bindingssete, og 3) ikkekonkurrerende hemming ved inhibitoren binder et annet sted og dermed forandrer enzymets
funksjon. De fleste rapporterte inhibitorer, er konkurrerende med det ATP-bindende setet. Det er
imidlertid flere utfordringer som må møtes ved utforming av en potensiell inhibitor til medisinsk
bruk. Det ATP-bindende setet er velkonservert innenfor kinasefamilien, og i tillegg finnes det også
andre molekyler som kan binde ATP. En forbindelse som etterlikner ATP vil derfor kunne tenkes å
binde seg til ulike kinaser og molekyler. For at en forbindelse skal kunne gi en målrettet effekt,
stilles det følgelig krav til spesifisiteten av inhibitoren. Struktur av kinaser har vist at det er
tilstrekkelig diversitet i sekvens og konformasjon i og rundt det aktive setet slik at spesifisitet kan
oppnås. Det kan også være en fordel dersom ikke absolutt spesifisitet oppnås, fordi man dermed kan
rette molekylet mot mange kinaser som er nært beslektet, i stedet for bare et. I tillegg er det
nødvendig at de konkurrerende inhibitorene er tilstrekkelig potente for å kunne konkurrere med de
høye ATP konsentrasjonene som finnes i intracellulære rom. Dette er særlig viktig for kinaser med
lav Km ovenfor ATP. Betydelig forskning pågår i utvikling av nye kinaseinhibitorer, og ulike
strategier benyttes for å finne nye forbindelser. En av tilnærmingene for å finne nye inhibitorer er å
undersøke syntetisk fremstilte forbindelsers biologiske aktivitet. (1)
Universitetet i Tromsø
3
Bacheloroppgave
2.2 Metoder for karakterisering av forbindelser
Syntesereaksjoner kan resultere i uventede reaksjoner, slik at andre forbindelser dannes. For å sikre
at riktig forbindelse er syntetisert, er det nødvendig å karakterisere produktet av en reaksjon.
Karakteriseringen av en forbindelse gjøres generelt ved å benytte en kombinasjon av flere metoder
og kan også gi et anslag for renhet av syntetiserte forbindelser. Dersom en forbindelse er syntetisert
tidligere, kan opplysninger fra tidligere karakteriseringer sammenliknes med resultatene som
oppnås fra syntesen.
8;8;5%9,**207:0120#"('1"+#'/:%<9=>?%
Tynnskjiktskromatografi (thin-layer chromatography-TLC) er en enkel kromatografisk teknikk.
Metoden kan blant annet benyttes for å følge en reaksjon eller påvise antall komponenter i en
blanding og dermed også anslå renhet. TLC kan også benyttes for å separere fraksjoner, såkalt
preparativ TLC. Ved karakterisering av en forbindelse kan TLC benyttes for å identifisere om en
gitt substans er blitt syntetisert, men det forutsetter at man har forbindelsen tilgjengelig som
standard i oppsettet.
Ved TLC er den stasjonære fasen spredt over en plate av glass, metall eller plast. Den stasjonære
fasen er ofte silika, men også andre stasjonære faser finnes, for eksempel plater for revers fase
separasjon. Den mobile fasen beveger seg oppover TLC-platen ved hjelp av kapillærkrefter, og er
den komponenten som er enklest å variere i et TLC-system. Polaritet og pH hos løsemidler er
faktorer som kan optimaliseres for å oppnå best mulig separasjon. Prøvemolekylene som er
applisert nederst på platen vandrer oppover platen og separeres ut fra ulik adsorpsjon og fordeling.
(6, 7)
Deteksjon av forbindelser på en TLC-plate avhenger av hvilke forbindelser som antas å være
tilstede. Påvisning kan også gjøres ved å benytte kjemiske reaksjoner, for eksempel bruk av jod,
vanillin, ninhydrin, svovelsyre eller UV-lys. Enzymer og antistoffer merket med radioaktive
isotoper, fluorescens eller kjemiluminiscens kan også benyttes.(7)
8;8;8%@7)#*)('+*)1:20%#)2"*'*2%<ABC?%
Kjernemagnetisk resonans (NMR) er en mye benyttet metode for karakterisering av forbindelser,
både småmolekylære organiske forbindelser, uorganiske forbindelser i tillegg til mindre peptider.
Universitetet i Tromsø
4
Bacheloroppgave
NMR benyttes for å undersøke den molekylære strukturen av forbindelsen som er syntetisert, men
gir også et anslag av renheten av syntetiserte forbindelse. Signaler som ikke er forventet i et NMR
spekter kan tyde på forurensninger, for eksempel løsemidler.(8) Ved å vurdere integral av signaler
fra forurensninger og produkt, kan det gis et anslag for hvor ren en forbindelse er.1H NMR og 13C
NMR er de vanligste endimensjonale NMR teknikkene. Det finnes også todimensjonale teknikker
som for eksempel correlated spectroscopy (COSY) og Nuclear Overhauser effect spectroscopy
(NOESY). 1H NMR benyttes for å bestemme antallet kjemisk ulike hydrogenatomer i et molekyl,
mens 13C NMR benyttes å bestemme antallet ulike karbonatomer i molekylet. Det kjemiske skiftet
av signalene gir indikasjoner på atomenes kjemiske omgivelser. For at et atom skal kunne
undersøkes ved NMR må atomet inneholde et odde antall protoner og/eller nøytroner. Dersom
antallet er et partall, vil kjernen ha spinn kvantetall lik 0, og ingen magnetiske egenskaper. Dette
gjør at atomer som for eksempel 12C og 16O ikke er synlig for NMR. (9, 10)
NMR utføres ved å løse opp prøven i et løsemiddel der prøven har god løselighet. I tillegg bør ikke
løsemiddelet absorbere i områder der det er forventet at forbindelsens kjerner kan absorbere. NMR
løsemidler er deutererte for å gi et 2+³ORFN-VLJQDO´ Vanlige løsemidler for NMR er CDCl3, DMSO,
CD3OD og D2O. NMR kan utføres på lave prøvemengder, som regel er noen få milligram nok for
1
H NMR. (10)
8;8;5;5%5D%ABC%
Ved 1H NMR undersøkes kjemisk skift, integral og splitting av signaler. Ut fra disse tre
opplysningene kan struktur av enkle molekyler bestemmes. Ulike hydrogenkjerner i et molekyl vil
absorbere ulikt i NMR. Blant annet er kjernens kjemiske omgivelser av betydning. For en
atomkjerne med spinn, vil antallet tillatte spinntilstander være kvantifisert og bestemt av
kvantetallet I. For en kjerne med kvantetall I, vil antall tillatte spinntilstander være gitt som summen
av 2I+1. Kjernenes magnetiske egenskaper undersøkes ved å påføre kjernene et ytre magnetisk felt.
Ved fravær av et ytre magnetfelt vil spinntilstandene av et gitt kjerne være degenererte. Dersom
atomene påføres et ytre magnetfelt, vil derimot ikke spinntilstandene være av samme energi, og
kjernene rettes enten med eller mot feltet. Tendensen er at flertallet av kjernene retter seg med
magnetfeltet, selv om noen retter seg mot (Zeeman effekt). Magnetfeltet gjør at kjernene presesserer
RPVLQHJHQDNVHPHGHQDQJXO UIUHNYHQVȦVRPNDOOHV/Drmorfrekvensen. Presesjonen genererer
et oscillerende elektrisk felt. Fourier Transform (FT)-instrumenter sender en puls stråling av
Universitetet i Tromsø
5
Bacheloroppgave
radiofrekvens som er lik Larmorfrekvensen til kjernene, og noen atomer i den laveste
energitilstanden eksiteres til den høyere energitilstanden. Når strålingen fjernes, returnerer kjernene
til den opprinnelige tilstanden, og energi emitteres når kjernene relakserer. De ulike kjernene vil
sende ut ulike frekvenser av elektromagnetisk stråling, som danner et free-induction decay (FID)
signal. Et dataprogram gjennomfører en fourier transformasjon av FID-signalet slik at de
individuelle frekvensene fra ulike kjerner skilles. (9, 10)
Frekvensen avhenger blant annet av de kjemiske omgivelsene til atomene. Elektronskyen som
omgir et atom har ladning og en bevegelse rundt kjernen som gir den et magnetisk moment. Det
magnetiske feltet fra elektronene endrer omgivelsene rundt kjernen. Feltet som påføres en gitt
kjerne er dermed også avhengig av de omliggende elektronene ± et fenomen som kjennes som
skjerming. Nedsatt skjerming fører til økt resonansfrekvens. Tilstedeværelse av en
elektrontiltrekkende gruppe i et molekyl reduserer elektrontettheten rundt kjernen og fører til økt
resonansfrekvens enn dersom denne gruppen ikke hadde vært tilstede i molekylet. (9, 10)
To nærliggende hydrogenkjerner (vanligvis på forskjellige karbonatomer) påvirker hverandre og gir
opphav til splitting av signaler. Avstanden mellom splittingene i signaler er et mål for hvor sterkt
kjernene påvirker hverandre, og er gitt ved koblingskonstanten J. Dersom to hydrogenkjerner er
koblet til hverandre vil dette resultere i en splitting av signalene der koblingskonstanten J er lik for
hydrogenkjernene. Kobling til n ekvivalente kjerner splitter signalet i en n+1 multiplett, der
intensiteten av signalene kan finnes ved Pascals triangel. (9)
8;8;8;8%5E>%ABC%%
Karbonatomer av typen 12C kan ikke undersøkes med NMR ettersom atomet har spinn lik null.
Derimot kan isotopen 13C undersøkes ved hjelp av NMR. På tilsvarende måte som for 1H NMR vil
karbonatomer i ulike kjemiske omgivelser gi ulikt kjemisk skift. 13C NMR viser imidlertid ikke
kobling mellom ulike karbonatomer. Dette skyldes at forekomsten av 13C er lav, bare ca. 1,1 % av
karbonatomene i naturen er av isotopen 13C. Det er derfor lav sannsynlighet for at et molekyl skal
ha 13C i sin struktur, og desto lavere sannsynlighet for at to 13C karbonatomer skal befinne seg som
naboatomer. Protoner som er festet direkte til 13C atomer vil interagere med spinnet til karbon og
føre til splitting av signalene. De fleste 13C NMR spektre tas imidlertid som proton-dekoblede
spektre. Dette gir singletter av signalene, og gjør spekteret lettere å tolke. Ulempen er at man mister
Universitetet i Tromsø
6
Bacheloroppgave
informasjon om hydrogenatomene koblet til karbonatomene. NMR-instrumenter benytter en
³decoupler´ der stråling fører til metning av protonene, der de gjennomgår raske overganger
mellom sine spinntilstander. De raske overgangene dekobler spinn-spinn interaksjonene mellom 1H
og 13C. (10)
13
C NMR signaler kan normalt ikke integreres, og et 13C NMR spekter vil derfor bare gi
informasjon om antallet ulike karbonatomer i en forbindelse. Det er fordi at signaler fra
metylgrupper er generelt sterkere enn signaler fra CH2-grupper og CH-grupper, mens kvartære
karboner er generelt svakest i et spektrum. I motsetning til hydrogenatomer, har karbonatomer mer
varierende relaksasjonstid og bidrar ulikt til FID-signalet. (9, 10)
8;8;E%3*/#'#F$%2G)01#"20"G:%<3C?%
Infrarød spektroskopi (IR) benytter elektromagnetisk stråling i det infrarøde området
(4000-400 cm-1), og benyttes ofte til identifisering av forbindelser ved å gjenkjenne absorpsjon fra
funksjonelle grupper som er tilstede i forbindelsene. IR kan også benyttes i kvantitativ analytisk
sammenheng. (6, 11)
Absorpsjon av IR-stråling fører til endring av vibrasjoner i et molekyl. Vibrasjonene er kvantifiserte
og dette innebærer at bare spesifikke frekvenser (bølgetall) kan absorberes. Molekylene absorberer
frekvenser som stemmer overens med frekvensen til bindingen eller gruppen som vibrerer.
Frekvensene er først og fremst avhengig av massen til atomene samt bindingsstyrken, slik at atomer
med lavere masse vil vibrere ved høyere bølgetall enn atomer med høyere masse. På tilsvarende vis
vil sterkere bindinger vibrere ved høyere bølgetall enn svakere bindinger. Bindinger i funksjonelle
grupper vil generelt gi opphav til absorpsjon i området over 1500 cm-1, mens området under ofte
betegnes som ³finger print´ området. IR er særlig nyttig for identifikasjon av molekyler som ikke
kan studeres ved andre teknikker. For eksempel er det ikke mulig å studere nitrogrupper ved hjelp
av 1H NMR, men kan studeres ved hjelp av IR.(6, 9)
Dersom et molekyl skal kunne absorbere i IR må det være en endring i dipol under vibrasjonen.
Symmetriske, ikke-polare bindinger kan derfor ikke absorbere. Et molekyl kan vibrere på ulike
måter, og hver måte kalles en vibrasjonell mode. For et molekyl med N atomer vil lineære
molekyler ha 3N-5 grader av vibrasjonelle moder, mens ikke-lineære molekyler vil ha 3N-6 grader
av vibrasjonelle moder. (6)
Universitetet i Tromsø
7
Bacheloroppgave
8;8;H%B'22)2G)01#"()1#:%
Massespektrometri (MS) er en analytisk teknikk som baserer seg på måling av ratioen
masse/ladning (m/z) og kan benyttes både i kvalitative og kvantitative sammenhenger. For
strukturbestemmelse av forbindelser, er massespektrometri nyttig ved at massen til molekyler kan
bestemmes. Massespektrometeret kan også kalkulere hvilke grunnstoff som inngår i en gitt
forbindelse ved å studere isotopmønstre rundt et gitt m/z topp. (9)
Et massespektrometer består generelt av fem hovedkomponenter som vist i figur 4. For at en
forbindelse skal kunne undersøkes i et massespektrometer, må atomene eller molekylene ioniseres. I
et typisk massespektrometer vil prøven ved injisering fordampe og deretter ioniseres ved hjelp av
ulike ioniseringsmetoder. Elektrospray-ionisering (EI) er en vanlig ioniseringsteknikk, der morionet
av forbindelsen bevares. Etter dannelse av gassioner ved EI sendes ionene inn i masseseparatoren.
Både positive og negative ioner kan genereres på samme tid, men bare en polaritet kan velges og
derfor vil enten positive eller negative ioner kunne detekteres. Molekyler som ikke ioniseres, vil
pumpes unna og vil ikke kunne detekteres i et massespektrometer. Ionene som dannes, blir separert
etter deres masse/ladning ratio og danner et massespekter.(9)
F igur 4: Skjematisk fremstilling av et massespektrometer. (9)
2.3 K inasescreening
MabCent i Tromsø undersøker innsamlede marine materialer for om de kan ha biologisk aktivitet,
blant annet mot kreft. Det blir benyttet to ulike screeningstrategier for påvisning av biologisk
aktivitet overfor kreft; 1) det kan gjøres fenotypisk screening ved å undersøke forbindelsenes
cytotoksiske/cytostatiske effekt eller 2) såkalt målrettet screening der det undersøkes hvorvidt en
gitt forbindelse inhiberer et cellulært protein som har en kjent funksjon i utvikling og forløp av
kreft. MabCent utfører målrettet screening blant annet mot proteinkinaser.(12)
Universitetet i Tromsø
8
Bacheloroppgave
8;E;5%I#:*2:GG%/"#%0:*'2)2J#))*:*+%
Assayet baserer seg på prinsipp for bioluminescens, der lys genereres i en luciferase-luciferinreaksjon. Luciferin-luciferase-systemet kan generelt benyttes i assay der ATP og et enzym eller en
metabolitt deltar i en ATP-dannende eller nedbrytende reaksjon. Proteinkinaser har evne til å
overføre fosfatgrupper på substratmolekyler ved å bryte ned ATP. Mengden lys som genereres er
derfor et indirekte mål på kinaseaktiviteten. På denne måten kan man identifisere inhiberende
substanser. Dersom inhiberende substanser ikke er tilstede i assayet, vil kinasen i assayet overføre
en fosfatgruppe fra ATP til et substratmolekyl, slik at ATP brytes ned. Dette gjør at luciferin kan
benytte mindre ATP for omdanningen til oxyluciferin og lys. Ved inhibering av kinasen, vil mindre
ATP brytes ned. Dette gjør at luciferase kan omdanne mer luciferin til oxyluciferin og lys. Mengden
lys som genereres sammenliknes med kontroller for å gi et anslag om substanser har en inhiberende
effekt. Staurosporin er en kjent inhibitor av kinaser og benyttes som positiv kontroll. Det gjøres to
avlesninger, der disse normaliseres mot en blank kontroll som ikke inneholder peptidsubstrat. (13,
14)
F igur 5: Prinsipp for luciferase-luciferin-reaksjonen som benyttes for biologisk screening av forbindelser med
kinaseaktivitet. Bilde er hentet fra presentasjon fra M ab C ent.
Universitetet i Tromsø
9
Bacheloroppgave
Universitetet i Tromsø
10
Bacheloroppgave
E%C)26.1'1)#%"+%$:20627"*%
3.1 Syntese av 1,3-dimetyl-barbitursyre (1,3-dimetyl-pyrimidine-2,4,6-trione) (1)
1,3-dimetyl barbitursyre 1 er startmateriale for videre syntesereaksjoner, og ble syntetisert ved å
benytte en modifisert versjon av en publisert prosedyre av Adolf von Baeyer.(15)
1
F igur 6: Syntesesk jema for syntese av 1.
N,N-dimetylurea og malonylsyre i forholdet 1:1 ble blandet sammen for å syntetisere 1,3dimetylbarbitursyre (1). Reaksjonen ble utført ved flere anledninger under prosjektperioden, der
høyeste oppnådde utbytte av reaksjonen var 61 %. Ved langsom oppvarming ble det ikke observert
noen eksoterm reaksjon, og oppnådde utbytte av reaksjonen var bare 25 %. Det ser derfor ut til at
rask oppvarming, med påfølgende eksoterm reaksjon, gir høyeste utbytte av syntesereaksjonen.
Reaksjonsmekanisme
F igur 7: M ulig reaksjonsmekanisme for syntese av 1,3-dimetyl-pyrimidine-2,4,6-trione
Universitetet i Tromsø
11
Bacheloroppgave
N,N-dimetylurea har to nitrogenatomer med frie elektronpar. Nitrogenatomene kan følgelig virke
som nukleofile i reaksjon med malonylsyre. N,N-dimetylurea reagerer med det elektrofile
karbonylkarbonet. Resultat er dannelse av nitrogen-karbonbinding. På tilsvarende vis vil det andre
nitrogenatomet virke som nukleofil og reagere med det andre karbonylkarbonet. Resultatet er
dannelse av en heterosyklisk forbindelse ved avspalting av vann.
Karakterisering av forbindelse
Forbindelse 1 ble karakterisert ved hjelp av 1H NMR, 13C NMR og IR. Spekter for forbindelsen 1,3dimetyl-barbitursyre er kjent, og sammenlikning av kjent spekter mot spekter for isolerte
forbindelse var derfor mulig. Forbindelse inneholder to ulike hydrogenatomer; de seks
hydrogenatomene (a) som tilhører metylgruppene. I tillegg finnes to hydrogenatomer på
heterosykelen (b). 13C NMR viser tilstedeværelse av fire ulike karbonatomer. Metylgruppene har
lavest kjemisk skift i 13C NMR, deretter CH2 gruppen. Karbonylkarbonatomene med høyest
kjemiske skift. IR viser også tilstedeværelse av karbonylgrupper med sterk absorpsjon ved 1655 og
1692cm-1.
a
b
a
F igur 8: T ilordning av kjemiske skift for 1H N M R.
Universitetet i Tromsø
12
Bacheloroppgave
3.2 Syntese av ethyl 3-(1,3-dimethyl-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-5-yl)-3oxo-propanoate (2)
Ethyl 3-(1,3-dimethyl-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-5-yl)-3-oxo-propanoate (2) var ønskelig å
syntetisere for å danne utgangspunkt for videre syntesereaksjoner.
2
1
F igur 9: Syntesesk jema for syntese av 2.
Forbindelsen (2) ble syntetisert ved å reagere 1,3-dimetyl barbitursyre med etylmalonylklorid i
forholdet 1:1 i en acyleringsreaksjon. Ved å helle reaksjonsblandingen over vann, dannes det olje,
og deretter utfelling av hvite krystaller. Høyeste utbytte av reaksjonen var 26%. Ved bruk av større
mengder løsemiddel enn beskrevet i eksperimentaldelen, oppnås lavere utbytte av reaksjonen. Det
ser derfor ut til at det er gunstig å holde mengden løsemiddel lavest mulig. Rekrystallisering fra
etanol ser ut til å gi høyere utbytte enn ved å gjøre en rekrystallisering ved å løse krystallene i
ammoniakkløsning og deretter tilsette HCl til utfelling av produkt. Ved senere undersøkelser i
prosjektet ser det ut til at bedre utbytte kan oppnås ved å benytte overskudd av etylmalonylklorid.
Reaksjonsmekanisme
F igur 10: M ulig reaksjonsmekanisme for reaksjon mellom dimetylbarbitursyre og etyl malonyl klorid ved tilstedeværelse av
trietylamin som base.
Universitetet i Tromsø
13
Bacheloroppgave
Trietylamin fjerner det ene av de sure hydrogenatomene og danner et enolat. Enolatet virker som en
nukleofil og angriper karbonylkarbonet og danner en karbon-karbon binding. Klorid er en bedre
utgående gruppe enn etoksid, og reaksjonen skjer derfor ved dette karbonatomet.
Karakterisering av forbindelse
Forbindelsens struktur ble bestemt ved hjelp av 1H NMR, 13C NMR og IR. Spekter for 1H NMR
viser at forbindelsen inneholder seks hydrogenatomer (b) som tilhører metylgruppene.
Metylgruppene er ikke ekvivalente ettersom det eksisterer en likevekt mellom keto- og enolformen
av forbindelsen (keto-enol tautomerisme). Enolet er vanligvis ustabilt og likevekten er forskjøvet
mot ketoformen. Spekter for 1H NMR viser proton med høyt kjemisk skift (17,4 ppm) (e), noe som
tyder på at forbindelsen foreligger i enolform. Enolet er trolig stabilisert ved at forbindelsen danner
intramolekylære hydrogenbindinger.
F igur 11: K eto-enol likevekt. Det foreligger en likevekt mellom keto- og enolformen av forbindelsen. 1 H N M R viser
tilstedeværelse av enolfor men. E nolet kan være stabilisert av intramolekylære hydrogenbindinger.
Det finnes to hydrogenatomer (c) mellom karbonylgruppene og fem hydrogenatomer i etylgruppen
(a og d). Hydrogenatomene i etylgruppen viser splitting av signal der de tre hydrogenatomene i
metylgruppen (a) forekommer som en triplett, mens de to nabohydrogenatomene (d) forekommer
som en kvartett.
d
b
c
a
e
b
F igur 12: T ilordning av k jemiske skift for 1 H N M R.
Universitetet i Tromsø
14
Bacheloroppgave
13
C NMR viser tilstedeværelse av 11 karbonatomer som stemmer overens med foreslått struktur av
forbindelse 2. Karbonylgruppene har høyeste kjemiske skift. Karbonatomet bundet til
hydroksylgruppen og dobbeltbindingen vil også ha høyt kjemisk skift. De laveste kjemiske skiftene
tilhører etyl- og metylgruppene i molekylet. Det tertiære karbonatomet på ringen har trolig skift ved
95 ppm. IR viser absorpsjon av karbonylgrupper, der absorpsjonen finner sted ved høyere bølgetall
sammenliknet med 1. Dette skyldes et den ene karbonylgruppen foreligger i en estergruppe. IR viser
imidlertid ikke tilstedeværelse av hydroksylgruppe, som er forventet dersom forbindelsen skal
foreligge i enolformen. Det er ingen absorpsjon i området 3400 - 3200 cm-1 som er forventet
dersom forbindelsen skal foreligge i enolform. Det kan derfor tenkes at enolet eksisterer i løsning,
mens forbindelsen i fast form ser ut til å foreligge som keton.
Universitetet i Tromsø
15
Bacheloroppgave
3.3 Syntese av 5-(5-hydroxy-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrimidin-7-yl)-1,3-dimethylhexahydropyrimidine-2,4,6-trione (3)
5-(5-hydroxy-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrimidin-7-yl)-1,3-dimethyl-hexahydropyrimidine-2,4,6-trione
(3) ble syntetisert ved å reagere 2 med overskudd av 3-amino-1H-1,2,4 triazol under oppvarming.
Tilsetning av etanol til reaksjonsblandingen gav utfelling av produkt 3 som hvite krystaller.
3
2
F igur 13: Synteseskjema for syntese av 3.
Utbytte av reaksjonen var bare 13 %. For å oppnå produkt av syntesereaksjonen var det nødvendig
med tilstrekkelig lang reaksjonstid ved kokepunkt. Dersom etanol ble tilsatt løsningen etter for kort
tid, ble ikke produkt 3 dannet. Det ser ut til at det er nødvendig med høy nok temperatur over
tilstrekkelig lang tid for å oppnå forbindelsen. For å oppnå høyere utbytte av reaksjonen er det
nødvendig å optimalisere reaksjonsbetingelsene. Ettersom prosjektet ønsker å syntetisere flest
mulige forbindelser, ble det ikke gjennomført optimalisering av reaksjonen.
Reaksjonsmekanisme
F igur 14: M ulig reaksjonsmekanisme for syntese av 3.
Universitetet i Tromsø
16
Bacheloroppgave
Reaksjonen skjer ved at det nukleofile nitrogenatomet på 3-amino-1H-1,2,4 triazol reagerer med det
elektrofile karbonylkarbonet på 2. Ved at nabonitrogenatomet på triazol også reagerer med det
andre elektrofile karbonylkarbonet dannes et ringsluttet produkt. I reaksjonen spaltes vann av.
Karakterisering av forbindelsen
Struktur av syntetiserte forbindelse 3 ble undersøkt ved å benytte NMR, MS og IR. Forbindelsen er
til dels vanskelig å karakterisere ut fra 1H NMR, ettersom forbindelsen inneholder få
hydrogenatomer. Protonspektrum viser tre hydrogenatomer med høyt kjemisk skift. Disse opptrer
som singletter og er merket med a, b og c i figur 15. Disse finnes ved 8,2 - 7,4 ppm. Ettersom
hydroksylgruppen på barbituratringen har et høyt kjemisk skift, burde det ha vært undersøkt
kjemiske skift i området rundt 18 ppm for påvisning av hydroksylgruppen.
Ettersom forbindelsen var vanskelig å løse i vanlige løsemiddel for NMR som CDCl3, CD3OD, D2O
samt DMSO, ble det ikke oppnådd tilfredsstillende høy konsentrasjon for 13C NMR analyse av
syntetiserte forbindelse. MS viser tilstedeværelse av forbindelse med samme molekylvekt som
oppgitte struktur for forbindelsen.
a
d
b
c
d
F igur 15: T ilordning av hydrogenatome r til 1 H N M R.
Universitetet i Tromsø
17
Bacheloroppgave
3.4 Syntese av 5-(5-hydroxy-1H-pyrazol-3-yl)-1,3-dimethylhexahydropyrimidine-2,4,6-trione (4)
5-(5-hydroxy-1H-pyrazol-3-yl)-1,3-dimethyl-hexahydropyrimidine-2,4,6-trione (4) ble syntetisert
ved å reagere 2 med et overskudd av hydrazine under oppvarming. Tilsetting av etanol til
reaksjonsblandingen gav utfelling av hvitt produkt 4.
4
2
F igur 16: Synteseskjema for syntese av 4.
Utbytte av reaksjonen var 45 %. Reaksjonen gav tilstrekkelig materiale for videre undersøkelser, og
optimalisering av reaksjonen ble ikke gjennomført. Det ser ut til at reaksjonen ikke krever like høy
temperatur som syntese av produktene 3 og 5. Ved syntese av forbindelse 4 ble etanol tilsatt før
kokepunkt av reaksjonsblanding ble oppnådd. Syntesereaksjonen gav likevel produkt 4.
Reaksjonsmekanisme
F igur 17: M ulig reaksjonsmekanisme for syntese av 4.
Universitetet i Tromsø
18
Bacheloroppgave
Nitrogenatomene virker som elektrofile i reaksjonen med 2. Reaksjonen finner sted ved nukleofilt
angrep på det elektrofile karbonylkarbonet. Reaksjonen forløper ved at begge nitrogenatomene
danner en femring.
Karakterisering av forbindelsen
Forbindelse 4 ble karakterisert ved NMR, IR og MS. I likhet med forbindelse 3 er forbindelsen
vanskelig å identifisere ved hjelp av NMR grunnet det lave antallet hydrogenatomer i molekylet. 1H
NMR viser et bredt signal ved 7.28 ppm. Signalet kan stamme fra N-H hydrogenatomet. I tillegg
sees et signal ved 5,91 ppm som tilhører hydrogenatom b, i tillegg til de seks hydrogenatomene på
de to metylgruppene, indikert med a i figur 18. MS viser tilstedeværelse av forbindelse med masse
som forbindelse 4. IR viser absorpsjon av karbonylgrupper. I tillegg absorberer 4 ved 3317 cm-1
som tyder på tilstedeværelse av NH eller OH gruppe. 13C NMR viser seks karbonatomer, noe som
innebærer at et karbonatom mangler. Dette er imidlertid sett for liknende forbindelser som er
syntetisert. Det kan derfor tenkes at noen av karbonatomene har lang relaksasjonstid og dermed
ikke kan sees i et 13C NMR spekter med valgte analysebetingelser.
c
a
b
a
F igur 18: T ilordning av hydrogenatomer til 1H N M R.
Universitetet i Tromsø
19
Bacheloroppgave
3.5 Syntese av 5-[(Z)-3-hydroxy-3-[2-(methyleneamino)phenyl]sulfanyl-allyl]1,3-dimethyl-hexahydropyrimidine-2,4,6-trione (5)
5-[(Z)-3-hydroxy-3-[2-(methyleneamino)phenyl]sulfanyl-allyl]-1,3-dimethyl-hexahydropyrimidine2,4,6-trione (5) ble syntetisert ved å reagere 2 med 2-aminotiofenol. Reaksjonsblandingen ble kokt i
noen minutter før etanol ble tilsatt. Tilsetting av etanol til reaksjonsblandingen gav utfelling av gult
produkt 5.
2
5
F igur 19: Synteseskjema for syntese av 5.
Utbyttet av reaksjonen var lavt (15 %). Ved tilsetning av etanol før tilstrekkelig temperatur hadde
blitt oppnådd, ble det ikke oppnådd utfelling av produkt 5. Dersom tilsetningen av etanol skjedde
umiddelbart etter oppnådd kokepunkt, gav dette heller ikke ønsket produkt. Det ser derfor ut til at
det er nødvendig med høy nok temperatur over tilstrekkelig lang tid for å oppnå forbindelse 5. For å
oppnå høyere utbytte av reaksjonen er det nødvendig av optimalisering av reaksjonsbetingelsene.
Reaksjonsmekanisme
F igur 20: M ulig reaksjonsmekanisme for syntese av 5.
Universitetet i Tromsø
20
Bacheloroppgave
Nitrogenatomet virker som nukleofil i reaksjonen med 2, og angriper det elektrofile
karbonylkarbonet. Svovelatomet kan også virke som nukleofil og reagerer med det andre
karbonylkarbonet. Resultatet er dannelsen av et syvringet produkt.
Karakterisering
Forbindelse 5 ble karakterisert ved hjelp av NMR, IR og MS. Forbindelsen 5 viste seg å være svært
lite løselig i vanlige løsemidler for NMR, og det var derfor vanskelig å oppnå tilstrekkelig høy
konsentrasjon av forbindelsen for 13C NMR analyse, selv ved lang opptakstid. 13C NMR er derfor
ikke bestemt for forbindelsen. 1H NMR viser tilstedeværelse av til sammen fem hydrogenatomer i
det aromatiske området. Dette stemmer overens med foreslåtte struktur der fire hydrogenatomer
befinner seg på benzenringen (a, b, c og d), mens et enkelt hydrogenatom befinner seg mellom
nitrogen og svovelatomene. Dette enkle hydrogenatomet forekommer som en singlett i 1H NMR
spekteret, og tilhører trolig hydrogenatom e. Spekter for forbindelsen er bare undersøkt i området
14-0 ppm. Ideelt burde et større område ha vært undersøkt for å påvise tilstedeværelse av mulige
hydroksylgruppene i forbindelsen.
a, b, c, d
e
F igur 21: T ilordning av hydrogenatomer til 1H N M R.
Universitetet i Tromsø
21
Bacheloroppgave
3.6 Syntese av[4-[(Z)-2-(1,3-dimethyl-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidine-5carbonyl)-3-ethoxy-3-oxo-prop-1-enyl]phenyl] (6)
Produkt av syntese gitt i figur 22 ble forsøkt syntetisert ved å benytte ulike tilnærminger. Syntesene
gav imidlertid ikke forventet produkt, men sykliske forbindelser 6a, 6b og 6c.
CO2Et
2
F igur 22: Forsøk på syntese av
[4-[(Z)-2-(1,3-dimethyl-4-oxido-2,6-dioxo-pyrimidine-5-carbonyl)-3-ethoxy-3-oxo-prop-1-enyl]phenyl]
Det er ønskelig å syntetisere forbindelser som produktet gitt i figur 22. Forbindelsene kan benyttes i
videre synteser ved å reagere forbindelsene med for eksempel hydrazine, 2-aminotiofenol og 3amino-1H-1,2,4 triazol. Ettersom liknende synteser med acetyl barbitursyre har vist reaktivitet
ovenfor aldehyder ved tilstedeværelse av piperidin, ble forbindelsen forsøkt oppnådd med samme
prosedyre. Piperidine i 20 % overskudd ble benyttet sammen med aldehydene parametoksybenzaldehyd, benzaldehyd og 4-nitrobenzaldehyd. Ingen av syntesene gav ønsket produkt.
Ulike reaksjonsbetingelser ble benyttet for å forsøke å syntetisere forbindelsene. Faktorer som
lengre koketid og høyere temperatur ble variert, uten at dette så ut til å endre resultatet av
syntesereaksjonene.
Det ble også forsøkt å endre base for å undersøke om basen var tilstrekkelig sterk for å fjerne ønsket
proton fra 2. Natriumhydroksid (NaOH) i 10 % og 100 % overskudd gav ikke ønsket forbindelse,
heller ikke bruk av litium diisopropylamid (LDA). Problemet med å syntetisere ønsket forbindelse
så ut til å være at reaksjonene førte til dannelse av mange produkter. Startmaterialet 2 har flere
reaksjonssentre der reaksjoner kan finne sted. TLC av syntesene viste generelt 1-3 distinkte flekker
på TLC platene foruten startmaterialene. Forsøk på separasjon, både ved hjelp av preparativ TLC
(system: 29 % metanol: 71 % etylacetat) og søylekromatografi (system: 52% metanol: 79 %
etylacetat) (16), gav ikke isolasjon av ønsket produkt, til tross for at separasjonen syntes å være god.
Universitetet i Tromsø
22
Bacheloroppgave
Problemet med å fjerne ønsket proton kan være at det ikke er det sureste på 2. Dersom protonet
fjernes kan den negative ladningen stabiliseres av de to karbonylgruppene. Tilsvarende vil fjerning
av protonet på heterosykelen resultere i en stabilisering ved hjelp av de tre karbonylgruppene. Det
kan også tenkes at hydroksylgruppen på heterosykelen gjennomgår syre-base reaksjoner.
Det ble forsøkt et system med natrium etoksid (Na/EtOH). Etoksidet vil enten deprotonere Įposisjonen av esteren, eller gjennomgå nukleofil substitusjon. I dette tilfellet vil nukleofil
substitusjon ikke føre til endret ester. Syntese gav ikke ønsket produkt.
Det ble forsøkt å beskytte hydroksylgruppen på heterosykelen ved å benytte tert-butyl dimetylsilyl
klorid som beskyttende gruppe. TLC viste tilstedeværelse av svært svak flekk som ikke var
startmateriale. NMR av crude viste delvis nedbrytning av startmaterialet og mulig noe av ønsket
beskyttet forbindelse. Det ble ikke gjennomført isoleringer av forbindelsen, ettersom det samtidig
ble gjennomført synteser ved bruk av piperidine ved nærvær av eddiksyre. Ved å la reaksjonen skje
ved tilstedeværelse av eddiksyre, var tanken å fjerne protonet på hydroksylgruppen og holde
forbindelsen i en bestemt konformasjon. Syntesen gav ikke forventet produkt, men trolig en syklisk
forbindelse. Det er mulig at fordampning av reaksjonsblandingen skjedde ved for høye
temperaturer, slik at ringslutning av forbindelsen fant sted. En foreslått mekanisme for denne
prosessen kan være en hydrolyse av esteren og deretter en dekarboksylering.
Eddiksyre
2
6
F igur 23: Syntesen av en sy klisk forbindelse med foreslåtte struktur 6.
6a: R = OH
6b: R = MeO
6c: R = N(CH3)2
Universitetet i Tromsø
23
Bacheloroppgave
Reaksjonene gav utbytte mellom 38 og 59 % for ulike substituenter (R). Reaksjonen ser ut til å gi
høyest utbytte ved bruk av R= N(CH3)2, mens laveste utbytte ble oppnådd ved bruk av R=OMe.
Forskjell mellom utbytte av reaksjonene er imidlertid relativt små og det er derfor mulig at
syntesebetingelsene spiller en viktigere rolle for oppnådd utbytte enn valg av substituent.
Reaksjonsmekanisme
Piperidine fjerner et hydrogen fra 2 og danner et nukleofilt enolat. Enolatet reagerer med det
elektrofile karbonylkarbonet i benzaldehydet. Ved påfølgende hydrolyse av esteren og
dekarboksylering antas det at det dannes en syklisk forbindelse 6.
Hydrolyse
Dekarboksylering
F igur 24: M ulig reaksjonsmekanisme for dannelse av mulig syklisk forbindelse 6.
Karakterisering av forbindelse
Forbindelsene 6a, 6b og 6c ble karakterisert ved hjelp av NMR og IR. Forbindelser med masse lik
foreslåtte struktur av forbindelsene kunne ikke påvises ved hjelp av MS. 1H NMR stemmer overens
med foreslåtte struktur, mens 13C NMR viser et karbonatom for lite, selv ved økte relaksasjonstider
og lengre opptakstid. Det har imidlertid vist seg ved tidligere undersøkelser ved liknende
Universitetet i Tromsø
24
Bacheloroppgave
forbindelser at noen av karbonatomene kan være vanskelig å se på et 13C NMR spekter. Det er også
mulig at det karbonatomet som mangler, har samme kjemiske skift som et annet av karbonatomene.
Spekter for 1 H NMR viser mønster for en parasubstituert forbindelse (b,c) og seks hydrogenatomer
fra metylgruppene (a) i tillegg til et enkelt proton som singlett (d) ved dobbeltbindingen for de tre
forbindelsene 6a-c. 6b og 6c har i tillegg signaler fra e.
Ettersom karakteriseringen av forbindelsene ikke er ensbetydende med foreslåtte strukturer, er
forbindelsene 6a og 6b med R=OMe og R=OH krystalliserte fra kloroform og sendt til
røntgenkrystallografiske undersøkelser for bestemmelse av strukturen.
a
d
b,c
a
e
F igur 25: T ilordning av hydrogenatomer til 1H N M R.
Universitetet i Tromsø
25
Bacheloroppgave
3.7 Syntese av [4-[(E)-3-(2-hydroxy-6-methyl-4-oxo-pyran-3-yl)-3-oxo-prop-1enyl]phenyl] (7)
Dehydroeddiksyre ble benyttet som utgangsmateriale for liknende synteser som forsøkt oppnådd
ved å benytte 2 som startmateriale. Ønskede produkter ble oppnådd ved å benytte tilnærmet samme
prosedyre som for reaksjoner med 2. Forbindelsene 7a, 7b, 7c, 7d og 7e ble syntetisert ved å
reagere ulike benzaldehyder med dehydroeddiksyre i nærvær av piperidine.
7
F igur 26: Synteseskjema for syntese av 7.
7a: R= OH
7b: R= Cl
7c: R= OMe
7d: R=N(CH3)2
7e: R=NO2
Reaksjonsmekanisme
F igur 27: M ulig reaksjonsmekanisme for syntese av 7.
Universitetet i Tromsø
26
Bacheloroppgave
Reaksjonen forløper gjennom en aldol kondensasjon. En aldol kondensasjon finner sted ved Įkarbonet på en karbonylgruppe. Grunnet tilstedeværelse av relativt sure protoner på
dehydroeddiksyre, kan disse fjernes ved bruk av base. Piperidine benyttes som base, og fjerner et
proton fra dehydroeddiksyre og danner et enolat. Det nukleofile enolatet reagerer med
aldehydforbindelsene og danner ønsket produkt.
Karakterisering av forbindelsene
Forbindelsene ble karakterisert ved å benytte NMR, MS og IR. MS viser signaler for syntetiserte
forbindelser. Forbindelsene viser parasubsitusjonsmønster ved 1H NMR (c, d) med skift i det
aromatiske området av 1H NMR spekteret. Forbindelsene viser også to hydrogenatomer som
dubletter (e, f). I tillegg finnes tre hydrogenatomer på metylgruppen (a) og et enkelt hydrogen på
heterosykelen (b). Forbindelsene kan også ha proton fra R gruppen (g). 13 C NMR viser
tilstedeværelse av riktig antall karbonatomer for hver av forbindelsene. IR av 7e (R=NO2) viser
absorpsjon ved 1515 cm-1 og 1342 cm-1 som indikerer tilstedeværelse av nitrogruppe.
b
c, d
e, f
g
a
F igur 28: T ilordning av hydrogenatomer for 1 H N M R.
Det ble også utført syntesereaksjon ved å benytte benzaldehyd. Syntesen gav ikke ønsket produkt.
Reaksjonsblandingen ble for varm ved tilsetning av piperidine og førte til forkulling av produktene.
Det er grunn til å tro at forbindelsene lar seg syntetisere ved å benytte optimaliserte
forsøksbetingelser.
Universitetet i Tromsø
27
Bacheloroppgave
3.8 Syntese av 3-[2-(4-dimethylaminophenyl)-1,5-benzothiazepin-4-yl]-2hydroxy-6-methyl-pyran-4-one (8)
Forbindelse 7d ble reagert med 2-aminotiofenol i overskudd for å syntetisere 3-[2-(4dimethylaminophenyl)-1,5-benzothiazepin-4-yl]-2-hydroxy-6-methyl-pyran-4-one (8).
Forbindelsene ble blandet sammen og varmet opp til kokepunkt. Etter noen få minutter ble det
dannet et rødt presipitat. Reaksjonsblandingen ble tilsatt etanol og presipitatet isolert ved filtrering.
8
7d
F igur 29: Synteseskjema for syntese av 8.
Utbytte av reaksjonen var 67 %. Ettersom syntesen bare ble gjennomført en gang, ble det ikke
undersøkt hvilke betingelser reaksjonen optimalt foregår ved.
Reaksjonsmekanisme
F igur 30: M ulig reaksjonsmekanisme for syntese av 8.
Universitetet i Tromsø
28
Bacheloroppgave
Nitrogenatomet i 2-aminothiophenol virker som nukleofil og reagerer med det elektrofile
karbonylkarbonet på forbindelse 7d. Svovel virker også som nukleofil og danner en ringsluttet
forbindelse.
Karakterisering
Forbindelsen ble karakterisert ved hjelp av 1H NMR, 13C NMR, IR og MS. 13C NMR viser
tilstedeværelse av 20 ulike karbonatomer som stemmer overens med struktur av forbindelse 8. 1H
NMR viser tilstedeværelse av åtte hydrogenatomer i det aromatiske området der to og to danner par
med lik koblingsverdi. Dette tyder på to aromatiske ringer, hver orientert slik at symmetri oppnås.
For den aromatiske ringen ved nitrogen og svovel sees det imidlertid et mer komplekst
splittingsmønster, som er forventet ettersom hydrogenatomene ikke er identiske. 13C NMR viser 20
karbonatomer som stemmer overens med struktur av forbindelsen som er gitt i figur 31.
h-k
b
f,g
d,e
a
c
F igur 31: T ilordning av hydrogenatomer for 1 H N M R.
Syntesereaksjonen viser at der mulig å gjøre denne typen synteser. For å lage flere forbindelser kan
ulike forbindelser av typen 7, benyttes. Samme type reaksjon kan også forsøkes med 3-amino-1H1,2,4 triazol. Det ble forsøkt å gjennomføre liknende synteser ved bruk av hydrazine. Ulike
forbindelser av typen 7a-e ble forsøkt benyttet som utgangsmaterialer, men førte ikke frem til
forventet produkt. Det viste seg senere at dette er i overensstemmelse med tidligere publiserte
resultater, der reaksjon med hydrazine fører til en åpning av ringen i dehydroeddiksyre.(17)
Universitetet i Tromsø
29
Bacheloroppgave
3.9 Biologisk testing
Screening overfor proteinkinaser ble gjennomført ved MabCent i Tromsø, etter deres prosedyre for
kinasetesting, for forbindelsene 2-8 (14). Alle forbindelsene bortsett fra forbindelse 4 var lite
vannløselige. De lite vannløselige prøvene ble tilsatt 25 µl DMSO og deretter 975 µl vann
istedenfor 1000 µl vann. Ettersom tilsetningen av DMSO ikke førte til økt løselighet av
forbindelsene ble det valgt å sentrifugere ned prøvene og benytte supernatanten i videre
undersøkelser.
E;K;5%C)26.1'1)#%/#'%-:"."+:20%1)21:*+%
Figuren under viser sammenfatning av resultater fra den biologiske testingen.
!"#$%$#&#'(%&)*()'"$+,-&)'
(%$
(#$
($$
'$
&$
%$
#$
$
"#$
#
)
%
*
&+
&,
&-
.+
.,
.-
./
.0
'+
12
F igur 32: M ab C ent benytter følgende cutoff verdier for bestemmelse hvorvidt en substans viser inhiberende effekt ovenfor
kinaser. A lt under 51 er bestemt som aktivt. M ellom 51 og 60 bestemmes som Q (som i kanskje), og alt over der igjen, som I
=inaktivt
E;K;8%L:20627"*%'M%#)26.1'1)#%/#'%-:"."+:20)%1)21:*+%
Den positive kontrollen som inngår i oppsettet godkjennes (verdi skal ligge rundt null), og
resultatene fra assayet leses av. MabCent benytter følgende verdier for beregning av cutoff: Alt
under 51 er bestemt som aktivt. Mellom 51 og 60 bestemmes som Q (som i kanskje), og alt over der
Universitetet i Tromsø
30
Bacheloroppgave
igjen, som I = inaktivt. Dersom MabCents cutoff verdier benyttes, viser ingen av forbindelsene
inhiberende effekt på proteinkinaser.
Forbindelsene viste generelt lav vannløselighet, og førte til at konsentrasjonene av forbindelsene
ikke var som ønsket i assayet. En vurdering av resultatene må derfor ta høyde for at substansene kan
være biologisk aktive, og lav vannløselighet gjør at ikke tilstrekkelig mengde av forbindelsene
foreligger i løsningen. Forbindelsene 7b, 7c og 7e viser noe effekt sammenliknet med de andre
prøvene som ble analysert. Disse forbindelsene ser derfor ut til å ha noe biologisk aktivitet, til tross
for lav konsentrasjon under testingen.
Universitetet i Tromsø
31
Bacheloroppgave
Universitetet i Tromsø
32
Bacheloroppgave
H%@"*0.627"*%"+%M:$)#)%'#-):$%%
I dette prosjektet har potensielle inhibitorer for kinaser blitt syntetisert og karakterisert. 1,3dimetylbarbitursyre og dehydroeddiksyre er benyttet som startmaterialer. Forbindelsene har
gjennomgått biologisk testing for inhiberende effekt ovenfor kinaser. Dersom MabCents cutoff
verdier benyttes, viser ingen av forbindelse biologisk aktivitet. Biologisk aktivitet kan imidlertid
ikke utelukkes, ettersom forbindelsene var lite vannløselige. Lav vannløselighet kan ha ført til at det
ikke ble oppnådd tilstrekkelig høye konsentrasjoner for å få en inhiberende virkning av substansene.
Et videre arbeid i dette arbeidet er å lage forbindelser som er mer vannløselige. Det kan være
aktuelt å forsøke samme typer reaksjoner ved å benytte for eksempel Meldrums syre som
utgangsmateriale. Meldrums syre er blitt syntetisert i prosjektet, men må acyleres før videre
synteser kan gjennomføres. Prosedyre for acylering av Meldrums syre er kjent og publisert. Forsøk
på syntese i dette prosjektet har imidlertid ikke gitt acylert produkt.
Forbindelsene som er syntetisert i dette prosjektet er raske syntesereaksjoner, som generelt ikke
stiller krav til opparbeid eller rensing etter syntese. Dette gjør syntesene enkle å utføre, ettersom
man på relativt kort tid, kan lage et stort bibliotek av substanser som det kan utføres biologiske
testing på. Ettersom det var ønskelig å syntetisere flest mulige forbindelser, er det ikke gjennomført
optimaliseringer av reaksjonene.
Universitetet i Tromsø
33
Bacheloroppgave
%
!
Universitetet i Tromsø
34
Bacheloroppgave
C)/)#'*2)#%
1.
Stout TJ, Foster PG, Matthews DJ. High-Throughput Structural Biology in Drug Discovery:
Protein Kinases. Current Pharmaceutical Design. 2004;10(10): 1069-82.
2.
Guyader D. Synthesis of 5-, 6-, and 7-membered heterocycles from barbituric acid
derivatives (masteroppgave). Tromsø: Universitetet i Tromsø; 2011.
3.
Zhang J, Yang PL, Gray NS. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat
Rev Cancer. 2009;9(1):28-39.
4.
Dancey J, Sausville EA. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer
treatment. Nat Rev Drug Discov. 2003;2(4):296-313.
5.
Gaßel M, Breitenlechner C, Herrero S, Engh R, Bossemeyer D. Inhibitors of PKA and
Related Protein Kinases. In: Pinna LA, Cohen PTW, editors. Inhibitors of Protein Kinases
and Protein Phosphates: Springer Berlin Heidelberg; 2005: 85-124.
6.
Vogel AI, Mendham J. Vogel's textbook of quantitative chemical analysis. Harlow: Prentice
Hall; 2000.
7.
Forsdahl K og Thoresen TS. Kromatografi for bioingeniører (2. utgave) Tromsø: Høgskolen
i Tromsø, avdeling for helsefag, bioingeniørutdanningen; 1995.
8.
Gottlieb HE, Kotlyar V, Nudelman A. NMR Chemical Shifts of Common Laboratory
Solvents as Trace Impurities. The Journal of Organic Chemistry. 1997;62(21):7512-5.
9.
Pavia DL. Introduction to spectroscopy. Belmont: Brooks/Cole; 2009.
10.
Lambert JB, Mazzola EP. Nuclear magnetic resonance spectroscopy: an introduction to
principles, applications, and experimental methods. Upper Saddle River: Pearson/Prentice
Hall; 2004.
11.
Smith JG. Organic chemistry. Boston, Mass.: McGraw-Hill; 2011.
12.
MabCent. Anti-cancer activities. http://tinyurl.com/6zuuxz8 (20.05.11).
13.
Inglis R. Firefly Light: Illuminating the Path to New Drugs. BioThema AB.
Universitetet i Tromsø
35
Bacheloroppgave
14.
MabCent. Prosedyre. Cancer: Kinase RR-analyse for testing av HPLC-fraksjoner for mulig
inhibering av PKA og Abl i 384-formatsbrett og 25 µl volum.
15.
Baeyer A. Untersuchungen über die Harnsäuregruppe. Justus Liebigs Annalen der Chemie.
1864;131(3):291-302.
16.
Still WC, Kahn M, Mitra A. Rapid chromatographic technique for preparative separations
with moderate resolution. The Journal of Organic Chemistry. 1978;43(14):2923-5.
17.
Aït-Baziz N, Rachedi Y, Hamdi M, Silva AMS, Balegroune F, Thierry R, et al. 4-hydroxy6-methyl-3-(5-phenyl-2E,4E-pentadien-1-oyl)-2H-pyran-2-one: Synthesis and reactivity
with amines. Journal of Heterocyclic Chemistry. 2004;41(4):587-91.
%
!
%
!
Universitetet i Tromsø
36
Bacheloroppgave
N02G)#:()*1).1%
Eksperimentelle forhold ved syntesene presenteres. Spektre er vedlagt i appendiks. Alle reagenser
og løsemidler som er benyttet i dette prosjektet var til syntetisk bruk, og kom fra kommersielle
leverandører. Navn til forbindelser er funnet ved hjelp av symyx. Struktur av forbindelser er også
tegnet ved hjelp av dette programmet.
1
H NMR og 13C NMR spektre er funnet ved å benytte et Varian Mercury 400 plus (399.65/100.54
MHz) spektrometer. Prøvene ble løst i enten CDCl3 eller DMSO-d6, avhengig av forbindelse. Se
den enkelte forbindelse for spesifikasjon. Kjemiske skift (į) er gitt i ppm (parts per million).
Koblingskonstanten J er gitt i Hertz (Hz). Signalenes multiplisitet er gitt som s (singlett), d
(dublett), t (triplett), q (kvartett) eller m (multiplett).
TLC-analyser ble utført med silika gel 60 F254 aluminiumsplater. Deteksjon ved bruk UV-lys og
vanillin. Søylekromatografi ble utført ved å benytte Davisil® Chromatographic Silica Media, Grace
Davison, 35-70 Micron.
Spektre for infrarød ble målt på et Varian 7000e FT-IR spektrometer. Frekvensene er oppgitt i
resiproke centimeter (cm-1).
Massespektre ble målt på Thermo electron LTQ Orbitrap + Electrospray ion source (ION-MAX).
Screening overfor proteinkinaser ble gjennomført ved MabCent i Tromsø, etter deres prosedyre for
kinasetesting.
Universitetet i Tromsø
37
Bacheloroppgave
Universitetet i Tromsø
38
Bacheloroppgave
x
Syntese av 1,3-dimetyl-barbitursyre (1)
1
F igur 33: 1,3-dimetyl-barbitursyre
Prosedyre
Dimetylurea (34,99 g; 0,397 mol; 1 eq) og malonyl syre (41,33 g; 0,396 mol; 1 eq) ble blandet
sammen i en Erlenmeyerkolbe. 50 ml eddiksyreanhydrid ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble
varmet opp til 80 °C under omrøring. Dimetylurea og malonylsyre løste seg opp og blandingen ble
blank. Ved 80 °C startet en eksoterm reaksjon og reaksjonsblandingen ble fjernet fra varmeplaten.
Temperaturen steg videre til 125 °C. Reaksjonsblandingen ble gul. Reaksjonsblandingen ble avkjølt
til 100 °C og deretter varmet opp til 125 °C en gang til. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til
romtemperatur. Isopropanol ble tilsatt og hvite krystaller kom til syne. Krystallene ble filtrert og
vasket med kald isopropanol.
Utbytte: 37,49 g (61 %)
Karakterisering
1
H NMR (400 MHz, CDCl3): į = 3.67 (s, 2H), 3.30 (s, 6H) ppm.
13
C NMR (101 MHz, CDCl3): į = 164.7, 151.9, 39.4, 28.5 ppm.
IR (vmax): 2967, 2928, 1692, 1655, 1526, 1464, 1417, 1386, 1357, 1278, 1149, 1116, 1031, 984,
934, 763, 714, 688, 635 cm-1.
Universitetet i Tromsø
39
Bacheloroppgave
x
Syntese av ethyl 3-(1,3-dimethyl-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-5-yl)-3-oxopropanoate (2)
2
F igur 34: E thyl 3-(1,3-dimethyl-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-5-yl)-3-oxo-propanoate
Prosedyre
1,3-dimetylbarbitursyre (18,00 g; 0,12 mol; 1 eq) ble løst opp i 40 ml dioxane. Trietylamin (16 ml;
0,12 mol; 1 eq) ble tilsatt løsningen. Etylmalonylklorid(14,6 ml, 0,11 mol, 1 eq) ble tilsatte
løsningen under omrøring. Temperaturen i løsningen steg til ca. 80 °C. Reaksjonsblandingen ble
rørt over natt ved romtemperatur. Vann ble deretter tilsatt reaksjonsblandingen og olje ble dannet.
Reaksjonsblandingen ble hatt på is i ca. 1 time. Tilsatte deretter mer vann, og krystaller felte ut av
løsningen. Krystallene ble isolert ved filtrering og deretter omkrystallisert fra minste mengde etanol.
Utbytte: 6,82 g (23 %)
Karakterisering
1
H NMR (400 MHz, CDCl3): į = 17.38 (s, 1H), 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.06 (s, 2H), 3.38 (s, 3H),
3.30 (s, 3H), 1.28 (t, J = 7.1 Hz, 3H) ppm.
13
C NMR (101 MHz, CDCl3): į = 189.7, 169.3, 166.6, 160.6, 150.0, 96.3, 61.4, 43.1, 27.8, 27.7,
13.9 ppm.
IR (vmax): 2992, 2944, 1730, 1667, 1611, 1540, 1485, 1447, 1415, 1366, 1330, 1272, 1202, 1153,
1112, 1053, 1035, 1013, 956,905, 859, 808, 783, 757, 675, 644 cm-1.
Universitetet i Tromsø
40
Bacheloroppgave
x
Syntese av 5-(5-hydroxy-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrimidin-7-yl)-1,3-dimethylhexahydropyrimidine-2,4,6-trione (3)
3
F igur 35: 5-(5-hydroxy-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrimidin-7-yl)-1,3-dimethyl-hexahydropyrimidine-2,4,6-trione
Prosedyre
Ethyl 3-(1,3-dimethyl-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-5-yl)-3-oxo-propanoate (2) (0,53 g, 2,07
mmol, 1 eq) ble blandet sammen med 3- amino-1H-1,2,4 triazol (0,348 g, 4,1 mmol, 2 eq) og
varmet opp på en varmeplate. Blandingen ble kokt i 3 minutter og 1 ml etanol ble tilsatt. Hvitt
presipitat kom til syne. Utfellingen ble filtrert og vasket med etanol.
Utbytte: 80 mg (13 %)
Karakterisering
1
H NMR (400 MHz, DMSO): į = 8.18 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 3.18 (s, 6H).
IR (vmax): 3254, 2971, 2764, 1670, 1632, 1602, 1558, 1526, 1481, 1428, 1389, 1344, 1279, 1190,
1167, 1088, 1040, 980, 947, 851, 795, 745, 719, 670, 640 cm-1.
HRMS (EI): Kalkulert [M-H+]: C11H9N6O4: 289,069. Funnet: 289,1.
Universitetet i Tromsø
41
Bacheloroppgave
x
Syntese av 5-(5-hydroxy-1H-pyrazol-3-yl)-1,3-dimethyl-hexahydropyrimidine-2,4,6trione (4)
4
F igur 36: 5-(5-hydroxy-1H-pyrazol-3-yl)-1,3-dimethyl-hexahydropyrimidine-2,4,6-trione
Prosedyre
Ethyl 3-(1,3-dimethyl-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-5-yl)-3-oxo-propanoate (2) (0,24 g, 0,93
mmol, 1 eq) ble blandet sammen med hydrazine (0,1 ml, 1,9 mmol, 2 eq) og varmet opp. 2 ml
etanol ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble kokt i 2 minutter. Hvit utfelling kom til syne.
Presipitatet ble isolert ved filtrering og vasket med etanol.
Utbytte: 110 mg (49 %)
Karakterisering
1
H NMR (400 MHz, DMSO): į = 7.28 (s), 5.91 (s, 1H), 3.10 (s, 6H) ppm.
13
C NMR (101 MHz, DMSO): į = 161.3, 161.2, 152.0, 143.5, 85.3, 80.8, 27.0 ppm.
IR (vmax): 3317, 3058, 3002, 2842, 2782, 2613, 2112, 1946, 1681, 1609, 1571, 1535, 1443, 1398,
1320, 1245, 1179, 1142, 1114, 1091, 1030, 928, 781, 752, 734, 678, 649 cm-1.
HRMS (EI): kalkulert [M+H+]: C9H11N4O4: 239,0775, funnet: 239,0773.
Universitetet i Tromsø
42
Bacheloroppgave
x
Syntese av 5-[(Z)-3-hydroxy-3-[2-(methyleneamino)phenyl]sulfanyl-allyl]-1,3-dimethylhexahydropyrimidine-2,4,6-trione (5)
5
F igur 37: 5-[(Z)-3-hydroxy-3-[2-(methyleneamino)phenyl]sulfanyl-allyl]-1,3-dimethyl-hexahydropyrimidine-2,4,6-trione
Prosedyre
Ethyl 3-(1,3-dimethyl-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-5-yl)-3-oxo-propanoate (2) (0,30 g, 1,2
mmol, 1 eq) ble blandet sammen med 2-aminotiofenol (0,35 ml, 3,52mmol, 2 eq) i et lite prøverør.
Reaksjonsblandingen ble varmet opp til 160 °C i to minutter og ble deretter fjernet fra varmeplaten.
3ml etanol ble tilsatt og gult presipitat ble dannet. Utfellingen ble filtrert og vasket med etanol.
Utbytte: 60 mg (15 %)
Karakterisering
1
H NMR (400 MHz, DMSO): į= 7.91 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.46 (d, J = 6.3 Hz, 2H),
7.29 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 3.19 (s, 6H) ppm.
IR (vmax): 3169, 3109, 2334, 2124, 1865, 1642,1534, 1494, 1463, 1419, 1365, 1310, 1260, 1226,
1153, 1100, 1025, 981, 965, 876, 799, 751, 681, 648 cm-1.
HRMS (EI): kalkulert: C15H13N3O4SNa: 354.0519 funnet; 354.0519.
Universitetet i Tromsø
43
Bacheloroppgave
x
Syntese av [4-(1,3-dimethyl-2,4,5-trioxo-pyrano[2,3-d]pyrimidin-7-yl)phenyl] (6)
6
F igur 38: [4-(1,3-dimethyl-2,4,5-trioxo-pyrano[2,3-d]pyrimidin-7-yl)phenyl]
Generell prosedyre
Ethyl 3-(1,3-dimethyl-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-5-yl)-3-oxo-propanoate (2) ble blandet
sammen med R-benzaldehyd (5 % overskudd) i et lite prøverør og varmet opp. 2 ml konsentrert
eddiksyre ble tilsatt, før piperidine (20 % overskudd) ble tilsatt dråpevis. Reaksjonsblandingen ble
deretter kokt med tilbakeløp. ca. 5 ml etanol ble deretter tilsatt og eddiksyre ble fordampet bort ved
bruk av varmeplaten. Produktet ble filtrert og vasket med etanol.
T abell 1: O versikt over utbytte og farge på forbindelsene 6a-c
R (substituent)
Utbytte
Farge av produkt
OH
200 mg (57 %)
Gult
MeO
150 mg (38 %)
Gult
N(CH3)2
210 mg (55 %)
Intens rødt
Universitetet i Tromsø
44
Bacheloroppgave
7-(4-hydroxyphenyl)-1,3-dimethyl-pyrano[2,3-d]pyrimidine-2,4,5-trione (6a)
Ethyl 3-(1,3-dimethyl-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-5-yl)-3-oxo-propanoate (2) (0,29 g; 1,2
mmol; 1 eq) ble blandet sammen med 4-hydroksybenzaldehyd (0,15 g, 1,2 mmol, 1 eq). 2 ml
eddiksyre ble tilsatt. 0,15 ml piperidine ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble kokt med tilbakeløp i 1
time.
6a
F igur 39: 7-(4-hydroxyphenyl)-1,3-dimethyl-pyrano[2,3-d]pyrimidine-2,4,5-trione
1
H NMR (400 MHz, DMSO): į = 10.81 (s, 1H), 8.29 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.25 (s, 1H), 6.87 (d, J =
8.8 Hz, 1H), 3.20 (s, 3H), 3.19 (s, 3H) ppm.
13
C NMR (101 MHz, DMSO): į = 163.3, 162.9, 161.1, 156.6, 151.3, 138.5, 124.0, 115.7, 114.1,
28.8, 28.2 ppm.
IR (vmax): 2950, 2590, 2473, 2314, 2113, 1923, 1717, 1638, 1527, 1505, 1475, 1419, 1385, 1354,
1316, 1297, 1259, 1232, 1184, 1157, 1076, 997, 971, 856, 828, 789, 753, 720, 649 cm-1.
HRMS (EI): Inkonklusiv
Universitetet i Tromsø
45
Bacheloroppgave
7-(4-methoxyphenyl)-1,3-dimethyl-pyrano[2,3-d]pyrimidine-2,4,5-trione (6b)
Ethyl 3-(1,3-dimethyl-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-5-yl)-3-oxo-propanoate (2) (0,30 g; 1,2
mmol; 1 eq) ble blandet sammen med p-anisaldehyd (0,24 g, 1,8mmol, 1 eq). 2 ml eddiksyre ble
tilsatt, før 0,15 ml piperidine deretter ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble kokt med tilbakelløp i 2
timer.
6b
F igur 40: 7-(4-methoxyphenyl)-1,3-dimethyl-pyrano[2,3-d]pyrimidine-2,4,5-trione
1
H NMR (400 MHz, CDCl3): į = 8.51 (s, 1H), 8.32 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.97 (d, J = 9.0 Hz, 2H),
3.90 (s, 3H), 3.41(s, 3H), 3.39 (s, 3H) ppm
13
C NMR (101 MHz, CDCl3): į = 164.8, 163.6, 161.4, 159.4, 151.9, 138.4, 126.0, 114.8, 114.4,
76.2, 56.1, 29.5, 28.8 ppm.
IR (vmax):2113, 1887, 1718, 1660, 1601, 1535, 1509, 1430, 1361, 1314, 1257, 1230, 1180, 1151,
1080, 1019, 840, 816, 789, 751, 685 cm-1.
HRMS (EI): Inkonklusiv
Universitetet i Tromsø
46
Bacheloroppgave
7-(4-dimethylaminophenyl)-1,3-dimethyl-pyrano[2,3-d]pyrimidine-2,4,5-trione (6c)
Ethyl 3-(1,3-dimethyl-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-5-yl)-3-oxo-propanoate (2) (0,30 g; 1,2
mmol; 1 eq) ble blandet sammen med 4-dimetylaminobenzaldehyd (0,22 g, 1,5 mmol, 1 eq). 2 ml
eddiksyre ble tilsatt før 0,15 ml piperidine. Reaksjonsblandingen ble kokt med tilbakeløp i 2 timer.
6c
F igur 41; 7-(4-dimethylaminophenyl)-1,3-dimethyl-pyrano[2,3-d]pyrimidine-2,4,5-trione
1
H NMR (400 MHz, CDCl3): į = 8.43 (s, 1H), 8.41 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 9.2 Hz, 1H),
3.40 (s, 3H), 3.39 (s, 3H), 3.15 (s, 6H) ppm.
13
C NMR (101 MHz, CDCl3): į = 164.0, 161.6, 158.8, 154.4, 151.8, 139.5, 121.1, 111.0, 109.7,
40.1, 28.9, 28.2 ppm.
IR (vmax):2476, 2321, 2123, 1944, 1713, 1644, 1608, 1535, 1500, 1467, 1443, 1411, 1363, 1319,
1235, 1193, 1161, 1081, 972, 941, 830, 786, 751, 718, 685, 648 cm-1.
HRMS (EI): Inkonklusiv
Universitetet i Tromsø
47
Bacheloroppgave
x
Syntese av [4-[(E)-3-(2-hydroxy-6-methyl-4-oxo-pyran-3-yl)-3-oxo-prop-1-enyl]phenyl]
(7)
7
F igur 42: [4-[(E)-3-(2-hydroxy-6-methyl-4-oxo-pyran-3-yl)-3-oxo-prop-1-enyl]phenyl]
Generell prosedyre
Dehydroeddiksyre og R-benzaldehyd ble blandet i et lite prøverør, og varmet opp til kokepunkt og
kokt i noen få minutter. Deretter ble 0,10 ml piperidine tilsatt og varmet videre i ca. 2 minutter.
Løsningen ble avkjølt til romtemperatur og deretter ble etanol tilsatt. Reaksjonsblandingen ble
deretter varmet opp til kokepunktet og avkjølt til romtemperatur. Presipitatet ble filtrert og vasket
med etanol.
T abell 2: Utbytte og farge på syntetiserte forbindelser 7a-e.
R (substituent)
Utbytte
Farge av produkt
OH
420 mg (50 %)
Oransje-brunt
OMe
350 mg (40 %)
Oransje
N(CH3)2
300 mg (32 %)
Rødt
NO2
450 mg (41 %)
Gult
Cl
440 mg (49 %)
Gulbrunt
Universitetet i Tromsø
48
Bacheloroppgave
2-hydroxy-3-[(E)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoyl]-6-methyl-pyran-4-one (7a)
7a
F igur 43: 2-hydroxy-3-[(E)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoyl]-6-methyl-pyran-4-one
Prosedyre
Dehydroeddiksyre (0,52g, 3,1 mmol, 1 eq) og 4-hydroksybenzaldehyd (0,38 g, 3,1mmol, 1 eq) ble
blandet i et lite prøverør, og varmet opp til kokepunkt (ca. 170 °C) i noen få minutter. Deretter ble
0,10 ml piperidine tilsatt og varmet videre i ca. 1 minutter. Løsningen ble avkjølt til romtemperatur
og etanol tilsatt. Reaksjonsblandingen ble deretter varmet opp til kokepunktet og avkjølt til
romtemperatur. Den oransje utfellingen ble filtrert og vasket med etanol.
Karakterisering
1
H NMR (400 MHz, DMSO): į = 18.00 (s), 10.31 (s, 1H), 8.03 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.90 (d, J =
15.7 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.27 (s, 1H), 2.27 (s, 3H) ppm.
13
C NMR (101 MHz, DMSO): į = 191.5, 182.8, 169.3, 161.1, 160.5, 146.5, 131.4, 125.5, 118.7,
116.2, 102.1, 98.7, 20.0 ppm.
IR (vmax): 3211, 2362, 2119, 1677, 1602, 1497, 1441, 1360, 1328, 1278, 1239, 1199, 1160, 1102,
1021, 996, 829, 789, 714, 608 cm-1.
HRMS (EI): kalkulert C15H12O5Na: 295.0577: funnet: 295,06
Universitetet i Tromsø
49
Bacheloroppgave
3-[(E)-3-(4-chlorophenyl)prop-2-enoyl]-2-hydroxy-6-methyl-pyran-4-one (7b)
7b
F igur 44: 3-[(E)-3-(4-chlorophenyl)prop-2-enoyl]-2-hydroxy-6-methyl-pyran-4-one
Prosedyre
Dehydroeddiksyre (0,52 g, 3,1mmol, 1 eq) og 4-klorbenzaldehyd (0,52 g, 3,7 mmol, 1 eq) ble
blandet i et lite prøverør, og reaksjonsblandingen ble varmet opp til kokepunkt (ca. 180 °C) og kokt
i noen få minutter. Deretter ble 0,10 ml piperidine tilsatt og varmet videre i ca. 3 minutter.
Løsningen ble avkjølt til romtemperatur og etanol ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble deretter
varmet opp til kokepunktet og avkjølt til romtemperatur. Presipitatet ble filtrert og vasket med
etanol.
Karakterisering
1
H NMR (400 MHz, CDCl3): į = 17.77 (s), 8.27 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 15.7 Hz, 1H),
7.61 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.97 (s, 1H), 2.28 (s, 3H) ppm.
13
C NMR (101 MHz, CDCl3): į= 192.7, 183.2, 169.0, 161.4, 144.7, 137.2, 133.3, 130.4, 129.4,
123.6, 102.5, 99.6, 20.8 ppm.
IR (vmax): 3348, 3100, 2974, 2890, 2362, 2092, 1722, 1626, 1510, 1489, 1386, 1307, 1276, 1238,
1206, 1166, 1087, 1047, 999, 979, 938, 879, 819, 791, 708 cm-1.
HRMS (EI): kalkulert C15H11ClO4Na: 313.0238: funnet: 313,02
Universitetet i Tromsø
50
Bacheloroppgave
2-hydroxy-3-[(E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enoyl]-6-methyl-pyran-4-one (7c)
7c
F igur 45: 2-hydroxy-3-[(E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enoyl]-6-methyl-pyran-4-one
Prosedyre
Dehydroeddiksyre(0,52 g, 3,1mmol, 1 eq) og 4-metoksyanisaldehyd (0,56 g, 4,1mmol, 1 eq) ble
blandet i et lite prøverør, og reaksjonsblandingen ble varmet opp til kokepunkt (ca. 175 °C) og
varmet i noen få minutter. Deretter ble 0,10 ml piperidine tilsatt og varmet videre i ca. 2 minutter.
Løsningen ble avkjølt til romtemperatur og etanol ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble deretter
varmet opp til kokepunktet og avkjølt til romtemperatur. Presipitatet ble filtrert og vasket med
etanol.
Karakterisering
1
H NMR (400 MHz, CDCl3): į = 18.07 (s), 8.20 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 15.7 Hz, 1H),
7.66 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 8.8 Hz, 3H), 5.94 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), 2.27 (s, 3H) ppm.
13
C NMR (101 MHz, CDCl3): į = 192.9, 183.8, 168.7, 162.8, 147.0, 131.7, 130.2, 128.0, 120.8,
114.9, 103.1, 99.8, 55.9, 21.1 ppm.
IR (vmax): 2840, 1703, 1622, 1598, 1507, 1458, 1423, 1299, 1256, 1170, 1113, 1019, 996, 878, 828,
731, 705, 607 cm-1.
HRMS (EI): kalkulert C16H14O5Na: 309,0733: funnet: 309,07.
Universitetet i Tromsø
51
Bacheloroppgave
3-[(E)-3-(4-dimethylaminophenyl) prop-2-enoyl]-2-hydroxy-6-methyl-pyran-4-one (7d)
7d
F igur 46: 3-[(E)-3-(4-dimethylaminophenyl) prop-2-enoyl]-2-hydroxy-6-methyl-pyran-4-one
Prosedyre
Dehydroeddiksyre (0,59 g, 3,5 mmol, 1 eq) og 4-dimetylaminobenzaldehyd (0,47 g, 3,2 mmol, 1
eq) ble blandet i et lite prøverør. Reaksjonsblandingen ble varmet opp til kokepunkt (ca. 120 °C) og
varmet i noen få minutter. Deretter ble 0,15 ml piperidine tilsatt og varmet videre i ca. 2 minutter.
Løsningen ble avkjølt til romtemperatur og etanol ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble deretter
varmet opp til kokepunktet og avkjølt til romtemperatur. Presipitatet ble filtrert og vasket med
etanol.
Karakterisering
1
H NMR (400 MHz, CDCl3): į = 18.50 (s, 1H), 8.12 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 15.5 Hz,
1H), 7.61 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.68 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 5.90 (s, 1H), 3.07 (s, 6H), 2.25 (s, 3H) ppm.
13
C NMR (101 MHz, CDCl3): į = 191.6, 184.2, 167.6, 153.0, 148.6, 132.1, 122.9, 116.7, 112.0,
103.5, 99.3, 40.4, 20.8 ppm.
IR (vmax):3077, 2916, 2331, 2118, 2089, 1727, 1652, 1594, 1519, 1462, 1439, 1374, 1340, 1310,
1289, 1242, 1187, 1128, 1061, 1022, 992, 940, 861, 840, 811, 711 cm-1.
HRMS (EI): kalkulert [M+H+]:C17H17NO4 300,1230: funnet; 300,1236.
Universitetet i Tromsø
52
Bacheloroppgave
2-hydroxy-6-methyl-3-[(E)-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enoyl]pyran-4-one (7e)
7e
F igur 47: 2-hydroxy-6-methyl-3-[(E)-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enoyl]pyran-4-one
Prosedyre
Dehydroeddiksyre (0,64 g, 3,8 mmol, 1 eq) og 4-nitrobenzaldehyd (0,52 g, 3,4 mmol, 1 eq) ble
blandet i et lite prøverør. Reaksjonsblandingen ble varmet opp til kokepunkt (ca. 180 °C) og varmet
i noen få minutter. Deretter ble 0,15 ml piperidine tilsatt og varmet videre i ca. 2 minutter.
Løsningen ble avkjølt til romtemperatur og etanol ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble deretter
varmet opp til kokepunktet og avkjølt til romtemperatur. Presipitatet ble filtrert og vasket med
etanol.
Karakterisering
1
H NMR (400 MHz, CDCl3): į = 17.40 (s), 8.41 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 8.27 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.91
(d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.01 (s, 1H), 2.31 (s, 3H) ppm.
13
C NMR (101 MHz, CDCl3): į= 192.5, 183.0, 169.6, 161.3, 148.9, 142.5, 141.0, 129.7, 127.5,
124.3, 102.3, 99.9, 20.9 ppm.
IR (vmax): 2590, 2123, 1891, 1717, 1635, 1595, 1515, 1454, 1411, 1343, 1230, 1205, 1109, 1205,
1109, 997, 981, 881, 844, 784, 750, 715, 669, 636cm-1.
HRMS (EI): kalkulert [M+H+]: C15H12NO6 302,0659: funnet; 302,07
Universitetet i Tromsø
53
Bacheloroppgave
x
Syntese av 3-[2-(4-dimethylaminophenyl)-1,5-benzothiazepin-4-yl]-2-hydroxy-6methyl-pyran-4-one (8)
8
F igur 48: 3-[2-(4-dimethylaminophenyl)-1,5-benzothiazepin-4-yl]-2-hydroxy-6-methyl-pyran-4-one (8)
Prosedyre
3-[(E)-3-(4-dimethylaminophenyl) prop-2-enoyl]-2-hydroxy-6-methyl-pyran-4-one (7d) (0,10 g,
0,33 mmol, 1 eq) ble blandet sammen med 2-aminotiofenol (0,10 ml, 0,67 mmol, 2 eq) og varmet
opp til kokepunktet. Reaksjonsblandingen ble kokt i noen få minutter før etanol ble tilsatt, og
oransje utfelling kom til syne. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur. Presipitatet ble
filtrert og vasket med etanol.
Utbytte: 90 mg (67 %)
Karakterisering
1
H NMR (400 MHz, CDCl3): į = 15.58 (s, 1H), 7.75 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.49 (t, J = 7.7 Hz, 1H),
7.34 (dd, J = 12.4, 7.6 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.65 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.82 (s, 1H), 5.17
(dd, J = 12.3, 4.3 Hz, 1H), 4.23 (dd, J = 11.7, 4.3 Hz, 1H), 2.93 (s, 6H), 2.69 (t, J = 12.1 Hz, 1H),
2.19 (s, 3H) ppm.
13
C NMR (101 MHz, CDCl3): į= 185.8, 173.9, 164.2, 163.6, 150.6, 140.1, 136.5, 132.4, 130.4,
129.6, 128.7, 127.5, 125.2, 112.9, 107.8, 97.3, 56.9, 41.0, 40.4, 20.5 ppm.
IR (vmax): 2793, 1707, 1660, 1610, 1569, 1549, 1522, 1465, 1423, 1388, 1353, 1334, 1300, 1278,
1256, 1228, 1187, 1157, 1065, 1043, 999, 946, 898, 840, 812, 761, 718, 684 629 cm-1.
HRMS (EI): kalkulert [M+H+]: C23H23N2O3S 407,1424: funnet: 407,1424
Universitetet i Tromsø
54
Bacheloroppgave
OGG)*$:02P%&G)01#)%
%
Universitetet i Tromsø
55
Bacheloroppgave
Universitetet i Tromsø
56
Bacheloroppgave
1,3-dimetyl-barbitursyre (1)
1
57
Bacheloroppgave
58
Bacheloroppgave
59
Bacheloroppgave
60
Bacheloroppgave
E thyl 3-(1,3-dimethyl-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-5-yl)-3-oxo-propanoate (2)
2
61
Bacheloroppgave
62
Bacheloroppgave
63
Bacheloroppgave
64
Bacheloroppgave
5-(5-hydroxy-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrimidin-7-yl)-1,3-dimethyl-hexahydropyrimidine-2,4,6trione (3)
3
65
Bacheloroppgave
66
Bacheloroppgave
67
Bacheloroppgave
68
Bacheloroppgave
5-(5-hydroxy-1H-pyrazol-3-yl)-1,3-dimethyl-hexahydropyrimidine-2,4,6-trione (4)
4
69
Bacheloroppgave
70
Bacheloroppgave
71
Bacheloroppgave
72
Bacheloroppgave
73
Bacheloroppgave
74
Bacheloroppgave
5-[(Z)-3-hydroxy-3-[2-(methyleneamino)phenyl]sulfanyl-allyl]-1,3-dimethylhexahydropyrimidine-2,4,6-trione (5)
5
75
Bacheloroppgave
76
Bacheloroppgave
77
Bacheloroppgave
78
Bacheloroppgave
7-(4-hydroxyphenyl)-1,3-dimethyl-pyrano[2,3-d]pyrimidine-2,4,5-trione (6a)
6a
79
Bacheloroppgave
80
Bacheloroppgave
81
Bacheloroppgave
82
Bacheloroppgave
7-(4-methoxyphenyl)-1,3-dimethyl-pyrano[2,3-d]pyrimidine-2,4,5-trione (6b)
6b
83
Bacheloroppgave
84
Bacheloroppgave
85
Bacheloroppgave
86
Bacheloroppgave
7-(4-dimethylaminophenyl)-1,3-dimethyl-pyrano[2,3-d]pyrimidine-2,4,5-trione
6c
87
Bacheloroppgave
88
Bacheloroppgave
89
Bacheloroppgave
90
Bacheloroppgave
2-hydroxy-3-[(E)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoyl]-6-methyl-pyran-4-one (7a)
7a
91
Bacheloroppgave
92
Bacheloroppgave
93
Bacheloroppgave
94
Bacheloroppgave
95
Bacheloroppgave
96
Bacheloroppgave
3-[(E)-3-(4-chlorophenyl)prop-2-enoyl]-2-hydroxy-6-methyl-pyran-4-one
7b
97
Bacheloroppgave
98
Bacheloroppgave
99
Bacheloroppgave
100
Bacheloroppgave
101
Bacheloroppgave
102
Bacheloroppgave
2-hydroxy-3-[(E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enoyl]-6-methyl-pyran-4-one (7c)
7c
103
Bacheloroppgave
104
Bacheloroppgave
105
Bacheloroppgave
106
Bacheloroppgave
107
Bacheloroppgave
108
Bacheloroppgave
3-[(E)-3-(4-dimethylaminophenyl) prop-2-enoyl]-2-hydroxy-6-methyl-pyran-4-one (7d)
7d
109
Bacheloroppgave
110
Bacheloroppgave
111
Bacheloroppgave
112
Bacheloroppgave
113
Bacheloroppgave
114
Bacheloroppgave
2-hydroxy-6-methyl-3-[(E)-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enoyl]pyran-4-one (7e)
7e
115
Bacheloroppgave
116
Bacheloroppgave
117
Bacheloroppgave
118
Bacheloroppgave
119
Bacheloroppgave
120
Bacheloroppgave
3-[2-(4-dimethylaminophenyl)-1,5-benzothiazepin-4-yl]-2-hydroxy-6-methyl-pyran-4-one (8)
8
121
Bacheloroppgave
122
Bacheloroppgave
123
Bacheloroppgave
124
Bacheloroppgave
125
Bacheloroppgave
126