At gøre væsentlige emner til samtalestof
Allosterisk Modulation af Oxytocin Receptoren Med henblik på udvikling af en kærlighedseliksir Projekt Forskerspirer 2012 Bio/Sund Viktor Hesselberg-Thomsen Helsingør Gymnasium Viktor Hesselberg-Thomsen Oktober 2012 Indhold Indledning .......................................................................................................................................................... 3 Formål og problemformulering ......................................................................................................................... 3 Baggrund ........................................................................................................................................................... 4 Sociale og adfærdsmæssige effekter............................................................................................................. 4 Oxytocins distribution i kroppen ................................................................................................................... 4 G protein koblede receptorer........................................................................................................................ 5 Metoder ............................................................................................................................................................. 5 Allosterisk modulation................................................................................................................................... 5 Chinese Hamster Ovary (CHO) cellelinje ....................................................................................................... 5 IP-one Detektering ........................................................................................................................................ 6 Computer kemi .............................................................................................................................................. 6 Udførelse ........................................................................................................................................................... 7 Forberedelse af CHO-OTR.............................................................................................................................. 7 Screening af allosteriske modulatorer med IP-one detektering ................................................................... 8 Tidsramme ..................................................................................................................................................... 9 Budget ......................................................................................................................................................... 10 Efterfølgende undersøgelser ........................................................................................................................... 10 Perspektivering ................................................................................................................................................ 10 Etik ................................................................................................................................................................... 11 Kontakter ......................................................................................................................................................... 11 Referencer ....................................................................................................................................................... 12 Bilag ................................................................................................................................................................. 13 2 af 13 Viktor Hesselberg-Thomsen Oktober 2012 Indledning Gennem de sidste 30 år er vores viden omkring hjernen ekspanderet kraftigt. Forskere har specielt undret sig over fænomenet følelser. Blandt alle vores følelser er kærlighed blandt de største. Det er et meget diffust begreb, som alle ved eksisterer. Vi kan føle og mærke den, men vi kan ikke sige, hvad kærlighed egentligt er. Det eneste vi ved, er at den både kan være rar og trist, og at den kan skabe både de værste og de bedste dage i vores liv. Filosoffer og videnskabsmænd har gennem tiden forsøgt at definere kærligheden. Nogle har defineret den som en naturlig kraft der driver mennesker sammen (Sigmund Freud), nogle som et redskab kvinderne har opfundet for at kunne kontrollere mændene (Friedrich Nietzche) og mens andre siger at Gud er kærligheden (Søren Kirkegaard). Den seneste tids forskning viser dog noget andet. Kærlighed er, ligesom alle andre følelser, styret af neuroner i hjernen som kommunikerer via signal stoffer, kaldet neurotransmitterer. Der findes mange forskellige neurotransmitterer, og der er ifølge videnskaben ofte mange forskellige i spil, når man oplever en følelse. Kærlighed er ikke en undtagelse; der er mange forskellige stoffer og faktorer, som spiller ind, når man føler kærlighed. Ingen har endnu det fulde overblik over kærligheden som neurologisk fænomen, men man ved, at stofferne dopamin, serotonin og oxytocin er involverede i forelskelsesprocessen (Boer et al., 2012). Et af disse stoffer er specielt iøjefaldende. Neurotransmitteren oxytocin er af nogle blevet kaldt kælekemikaliet (L. Frank) og af andre samfundets lim. Det lader til, at begge øgenavne har deres ret. Oxytocin er et belønningsstof, som bliver udskilt, når vi har kontakt med andre mennesker, her er det specielt aktivt ved kropslig kontakt så som kys og sex. En øget mængde oxytocin øger vores empati og tillid. På den måde gør oxytocin det nemmere for os at indgå i sociale relationer (Lee et al., 2009). Oxytocin synes derfor at være en meget vigtig ingrediens i en kærlighedseliksir. Formål og problemformulering I dette forskerspirerprojekt vil jeg fokusere på allosterisk modulation af oxytocin receptoren (OTR). Dette vil fungere som en forstærker af det naturlige oxytocin signal. Det kan vise sig at have stor betydning for udviklingen af kærlighedseliksir. Projektet sigter efter at finde et stof, som fungerer som potentiator ved at 3 af 13 Viktor Hesselberg-Thomsen Oktober 2012 binde sig til et såkaldt allosterisk site. Min hypotese er, at man på den måde kan forstærke effekten af den naturligt frigivne oxytocin. Baggrund Sociale og adfærdsmæssige effekter Oxytocin tillægges mange sociale og adfærdsmæssige effekter. Det har to centrale egenskaber; forøgelse af tillid og empati (Lee et al., 2009). Dette påvirker forskellige følelser, fx tryghed, som affødes af tillid til de omgivelser eller den situation, man befinder sig i. Disse egenskaber er begge meget væsentlige for kærlighed. Det er dog ikke de eneste effekter. Oxytocin aktiverer også dopamin systemet, som er hjernens belønnings system og giver en fornemmelse af lykke (Boer et al., 2012). Alle disse positive effekter giver en følelse af velbehag. Det er afhængigheden af denne følelse, som får mennesker til at opsøge sociale fællesskaber, her under kærlighed. Og det er mangel på dette velbehag, som resulterer i kærlighedssorger (Esch og Stefano, 2005). Oxytocins distribution i kroppen Oxytocin bliver distribueret til to forskellige steder i kroppen, som har vidt forskellige funktioner. Begge ruter starter i hypothalamus. Herfra ud går to slags neuroner; magnocellulare og parvocellulare. De magnocellulare neuroner kan, via hypofysen, udskille oxytocin direkte i blodet, hvor det fungerer som et hormon. Dette kaldes oxytocins perifere effekter (Gimpl og Fahrenholz, 2001). Den anden rute fra hypothalamus er via parvocellulare neuroner. Disse forbinder hypothalamus med mange forskellige dele af hjernen1, men fælles for de parvocellulare neuroner er, at de bruger oxytocin som deres neurotransmitter (Lee et al., 2009). Det er disse parvocellulare neuronforbindelser, som man tillægger de sociale- og adfærdsmæssige effekter af oxytocin (Lee et al., 2009). 1 ”the dorsomedial hypothalamic nucleus, several thalamic nuclei, the dorsal and ventral hippocampus, subiculum, entorhinal cortex, medial and lateral septal nuclei, amygdala, olfactory bulbs, mesencephalic central gray nucleus, substantia nigra, locus coeruleus, raphe nucleus, the nucleus of the solitary tract, and the dorsal motor nucleus of the vagus nerve” (Gimpl og Fahrenholz, 2001) 4 af 13 Viktor Hesselberg-Thomsen Oktober 2012 G protein koblede receptorer OTR er en del af superfamilien G proteinkoblede receptorer (GPCR2) (Gimpl og Fahrenholz, 2001). Det er en type receptorer, som aktiverer et såkaldt G proteinet inde i cellen. Fælles for alle GPCRe er, at de har et extracellulært domæne, hvor f.eks. neurotransmitterer binder3. Den del, som befinder sig i cellemembranen, kaldes 7-transmembran delen, da den består af en aminosyre kæde, som snor sig tværs gennem cellemembranen syv gang. Den sidste del er det intracellulære domæne, der er her G proteinet binder. G proteinet består af tre dele (subunits); en α, β og γ subunit. Når receptoren bliver aktiveret, adskilles G proteinet fra receptoren og α-subuniten adskilles fra βγ-subuniten. α-subuniten og βγ-subuniten kan nu, begge, igangsætte et intracellulært signal ved at binde sig til et membranprotein (Williams og Hill, 2009). For receptorer, som signalerer via et Gq G protein, her i blandt OTR (Gimpl og Fahrenholz, 2001), ender denne signalkæde med et intracellulært signalstof kaldet inositol-tri-phosphat (IP3). IP3 nedbydes til insitol-di-phosphat, her efter til inositol-mono-phosphat (IP1) og til sidst til myo-inositol (Williams og Hill, 2009). Metoder Der vil blive anvendt fire metoder til at udføre projektet. Allosterisk modulation For at øge effekten af OTR vil jeg bruge allosterisk modulation. Her forsøger man, at lave en ligand som binder sig til et allosterisk site i stedet for et orthosterisk site. Det har følgende fordele: Forstærker signalet i stedet for at skabe stimulation4, hvilket mindsker risikoen for bivirkninger. Receptorer har ikke så stor tendens til at nedsætte følsomheden over for allosteriske ligander. Kan potentielt være mere selektive end orthosteriske ligander (Jensen og Spalding, 2003). Chinese Hamster Ovary (CHO) cellelinje CHO bruges til at udtrykke et givent protein (Jeng et al., 19965), så man kan udføre in vitro forsøg med de givne proteiner. Man kan hermed teste, hvordan f.eks. en receptor vil reagere på et bestemt stof uden at skulle lave forsøg på dyr eller mennesker. Dette er også en ulempe for metoden, da man ikke ved, hvordan 2 Fra det engelske G-protein coupled receptor. Dette kaldes det orthosterisk site (Jensen og Tracy, 2003). 4 Dette er også en ulempe, da metoden hermed er afhængig af naturligt forekommende stimulation. 5 Her bruger Jeng et al. CHO til at udtrykke OTR. 3 5 af 13 Viktor Hesselberg-Thomsen Oktober 2012 resten af kroppen reagerer på stoffet, eller hvordan kroppen reagerer på den effekt, stoffet har på receptoren. IP-one Detektering IP-one detektering er en metode, hvorpå man kan måle receptorens aktivitet. Dette sker ved en kvantitativ bestemmelse af IP1, efter påvirkning af en formodet ligand, i forhold til mængden af IP1, uden påvirkning af en formodet ligand. Det er en meget brugt metode til at bestemme receptoraktivitet, da den er præcis og kan bruges på en stor del af GPCRe. IP-one detekteringen består overordnet af fem skridt: 1. De fortyndede ligander tilsættes til en 384-brønds plade 2. Cellerne fordeles i brøndene i 384-brønds pladen 3. Liganderne aktiverer receptorerne, som medfører dannelse af IP1, som naturligt nedbrydes hurtigt. Denne nedbrydning bliver forhindret ved tilstedeværelsen af LiCl i bufferen. Herved sker der en ophobning af IP1 4. Antistoffet anti IP1-Cryptate og et kunstigt IP1 molekyle mærket med en fluorofor (IP1-d2) bliver tilføjet til alle brøndene. Anti IP1-Cryptate binder sig til både IP1og IP1-d2. Jo mere IP1 cellen har produceret, jo mere antistof vil binde sig til dette. 5. 384-well pladen aflæses på Envision Xcite (PerkinElmer). Dette instrument udnytter metoden Flourescence Resonance Energi Transfer (FRET). Belysning af anti IP1-Cryptate aktiverer det fluoroscerende cryptatmolekyle, som så kan sende energien videre IP1-d2. Dette sker dog kun, hvis de to fluoroscerende molekyler er tæt på hinanden, altså hvis antistoffet har bundet sig til det kunstige IP1-d2. Hvis energien videregives til IP1-d2, udsendes der lys med en bestemt bølgelængde. Instrumentet måler intensiteten af denne bølgelængde. Jo mere FRET, jo flere antistof:IP1-d2 komplekser og jo mindre celleproduceret IP1. Nu kan man finde forholdet mellem koncentrationen af IP1 fra kontrolbrøndene og testbrøndene. Herved kan man bestemme receptorens aktivitet (IP-one tb Protokol). Computer kemi Computer kemi er en metode, hvor man forsøger at forudsige, hvordan forskellige stoffer reagerer med f.eks. proteiner. Dette sker med et computerprogram, som kan tage højde for forskellige kemiske faktorer. 6 af 13 Viktor Hesselberg-Thomsen Oktober 2012 Resultaterne fra computerprogrammet er dog langt fra sikre og skal efterprøves via andre naturvidenskabelige metoder. Dette er en stor ulempe for metoden, men det kan være en god vejledning. Det kan ske, at man overser nogle stoffer, men det må man acceptere, da alternativet er at gætte sig frem. (URL 1) I dette projekt vil jeg alliere mig med en computer-kemiker, som kan finde nogle forslag til allosteriske modulatorer, som jeg så vil efterprøve, som beskrevet her i opgaven. Her kunne man f.eks. spørge David Gloriam (Gloriam, 2011). Udførelse Når resultaterne modtages fra computerkemikerne, skal de stoffer som de forslår, anskaffes. Det er sikrest og nemmest at købe dem. Samtidigt med at de allosteriske modulatorer bliver anskaffet, kan jeg begynde forberedelserne af CHO-OTR. Forberedelse af CHO-OTR Forberedelsen går ud på at lave en CHO cellelinje, som udtrykker OTR (CHO-OTR). Dette sker gennem to faser: 1. Opformering af OTR plasmider. 2. Tranfektion af CHO med OTR plasmider. Først skal OTR DNA’et erhverves, her vil jeg spørge Katja Burger, som tidligere har arbejdet med OTR (Burger et al., 1999). Forhåbentlig vil hun sende noget OTR DNA (og måske sågar samarbejde på projektet). Man får sjældent særlig meget tilsendt, derfor skal metoden Maxiprep, hvor DNA opformeres som plasmider, anvendes (URL 2). De opformerede plasmider skal nu tranfekteres ind i CHO cellerne. Her benyttes produktet Polyfect Transfection reagent fra firmaet Qiagen. Det er meget simpelt at anvende. Polyfect Transfection reagent tilsættes til OTR-plasmiderne og rystes blidt i 10 sek., hvorefter det skal stå i 5 – 10 min. ved stuetemperatur. Mediet tilsættes og efter at blanding er blevet pipetteret op og ned to gange, skal den tilsættes til cellerne. Nu skal cellerne stå, i en inkubator (37o C og 5 % CO2) i 24 – 48 timer (Polyfect Handbook). 7 af 13 Viktor Hesselberg-Thomsen Oktober 2012 Screening af allosteriske modulatorer med IP-one detektering Efter 24 – 48 timer, forventes det at CHO udtrykker OTR. Screeningen af allosteriske modulatorer kan nu påbegyndes. Dette gøres med IP-one detektering. CHO-OTR fordeles ud i 3 + 3n antal brønde, i en 384-brønds plade6. Nu tilføjes de forskellige modulatorstoffer til hver sin brønd. Umiddelbart efter tilføres liganden (oxytocin) og LiCl bufferen i alle brøndene (også kontrolbrøndene), som er beskrevet i (IP-one tb Protokol). Cellerne stilles i et varmeskab (37 oC) i 30 min., hvor oxytocinen aktiverer receptorerne og IP1 ophobes. Dernæst tilsættes det kunstige IP1-d2 og antistoffet anti IP1-Cryptate i alle brøndene. Nu stilles blandingen i 1 time ved stuetemperatur i mørke. I dette tidsrum binder anti IP1-Cryptate sig både til det naturligt forekommende IP1 og det kunstige IP1. Herefter aflæses 384-brønds pladen på Envision Xcite (URL 3). Intensiteten af den bestemte bølgelængde kan omregnes direkte til IP1 koncentration. Forholdet mellem IP1 koncentrationen i kontrolbrøndene og testbrøndene udregnes for alle testbrøndene, således: Hvis X > 1 betyder det et øget signal ved tilstedeværelse af det testede stof, og dermed et positivt hit. Hvis X er mindre end 1 har vi mere IP1 i kontrolbrøndene end testbrøndene og dermed hæmmet signalet (antagonist effekt). Hvis X = 1 har modulatoren ingen effekt. 6 Tre kontrolbrønde og n er antallet af forskellige modulator stoffer. Talet må ikke overstige 384. Man bruger tre brønde til hvert stof for at minimere usikkerhederne (Nørskov-Lauritsen personlig kommunikation). 8 af 13 Viktor Hesselberg-Thomsen Oktober 2012 Tidsramme Projektet er opdelt i fem faser7. Dets varighed anslås til: den tid som computer kemikerne bruger + 17 dage.8 Første fase: 2 dage Etablering af kontakt til computer-kemikere. Anskaffelse af OTR plasmider. Anden fase9: 2 dage Indkøb af materialer, her i blandt mulige allosteriske modulatorer. Tilrettelægning af laboratorium tid. Tredje fase: 3 dage10 Opformering af plasmider. Transfektion af CHO med OTR. Fjerde fase: 3 dag IP-one detektering Databehandling Femte fase: 7 dage Diskussion, med projektgruppen, af resultater og muligt videre arbejde. Skrivning af videnskabeligartikel. 7 Man kan gå videre til næste fase, når fasen før, er fuldført, med mindre andet beskrevet. Projektet kan i gang sættes, når kapital haves. 9 OTR plasmider behøver ikke at være anskaffet, men en aftale skal være indgået. 10 Heraf 48 timer til opformering af plasmider. 8 9 af 13 Viktor Hesselberg-Thomsen Oktober 2012 Budget Projektet skal udføres i samarbejde Hans Bräuner-Osborne og hans projekt gruppe11. Her er et laboratorium med det fornødne apparatur tilknyttet. Dette gør, at udgifterne kun er til materiale og transport. I alt 46.200 (bilag 1). Efterfølgende undersøgelser Hvis nogle af de allosteriske agonister har tilfredsstillende effekt, skal det undersøges om de, som formodet, binder sig til et allosterisk site12. Dette kan undersøges med IP1 detektering. Denne gang tilføres der intet oxytocin. Hvis en øget IP1 koncentration bliver detekteret, må den allosteriske agonist også fungere som orthosterisk agonist. Man må nu lave en vurdering af, om det er en bi-effekt13 eller en hovedeffekt14. Det vil også være relevant at undersøge, om de mest effektive allosteriske agonister har en effekt på vasopressin receptoren V1a. Oxytocin kan aktivere denne, og den findes ofte i de samme områder af hjernen som OTR. Aktivering af V1a kan have uønskede bivirkninger ved en kærlighedseliksir (Boer et al., 2012). Såfremt at de allosteriske agonister er positive i ovenstående tests, vil næste trin være at teste stofferne i dyrmodeller (i første omgang mus og/eller rotter). Forudsat at der ikke er nogle alvorlige bivirkninger i dyreforsøgene, kan stofferne på sigt, måske, afprøves på mennesker. Her testes om de allosterisk agonister, har den ønskede adfærdsmæssige virkning. Perspektivering Dette forskerspirerprojekt kan vise sig at være det første på vejen mod udviklingen af en ”kærligheds eliksir”, men oxytocin systemet er langt fra det eneste, der skal moduleres førend, at vi kunstigt kan fremkalde kærlighed. Boer et al. (2012), nævner 7 neurologiske systemer, som indtil videre er blevet koblet 11 Lenea Nørskov, Christoffer Clemmensen og David Gloriam. Der er også den mulighed, at de fungerer som en kraftigere orthosterisk agonist end oxytocin. 13 X er lidt større end 1. 14 Koncentrationen af IP1 i det efterfølgende forsøg koncentrationen af IP1 i det første forsøg. 12 10 af 13 Viktor Hesselberg-Thomsen Oktober 2012 sammen med kærlighed, her er oxytocin systemet blot et af dem. Alle 7 systemer behøver dog ikke bliver direkte aktiveret, da nogle15 aktiverer nogle af de andre systemer. Hvis det lykkes at finde en effektiv allosterisk agonist til OTR, vil den, i første om gang, (såfremt at den ikke har slemme bivirkninger) kunne bruges som et empati og tillids fremmende middel. Dette kan, muligvis, bruges til dæmpning af forskellige psykiske lidelser f.eks autisme (Gimpl, 2008). Man kunne også forstille sig, at det ville have en positiv effekt på kærlighedssorger, da man mener at grunden til kærlighedssorger er en ”neurologisk koldtyrker” bl.a. på grund af oxytocin mangel. Sådanne lægemidler kunne ”formuleres” som næsespray, da man på den måde kan få midlet direkte op i hjernen, uden om blod-hjerne-barrieren (Gimpl, 2008). Etik Kunstig at skabe kærlighed og generelt at manipulere med hjernes biologi er et meget kontroversielt emne, som kræver en lang række etiske overvejelser. En helt overordnet overvejelse kunne være, om kærlighed er så essentielt for vores eksistens, at vi kan risikere at miste noget af meningen med livet ved at kunne kontrollere kærligheden (forstærke og evt. formindske). Eller vil denne kontrol blot give os mere glæde, da vi kan være gladere, når vi er påvirket af kærligheden og formindske perioden, hvor vi er ulykkelige over kærlighedens fravær. Denne overvejelse grunder i et af biovidenskabens helt generelle etiske dilemmaer; om hvor idealistisk/romantisk vi skal se på naturens fænomener. Er det bedre/mere rigtigt, når naturen styrer sig selv, end når mennesket tager kontrollen over den. Et andet aspekt er godkendelse til at udføre eksperimenter på dyr og mennesker. Dette kræver accept af projektbeskrivelsen fra en etisk instans, så før eller siden bliver etikken ved nærværende projekt relevant. Kontakter Lenea Nørskov-Lauritsen Ph.D. Student, Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet. Christoffer Clemmensen 15 Her i blandt oxytocin systemet (Boer et al., 2012) 11 af 13 Viktor Hesselberg-Thomsen Oktober 2012 Ph.D. Student, Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet. Hans Bräuner-Osborne Professor, Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet. Referencer Boer A De, Buel E M Van, Horst G J Ter (2012). Love is more than just a kiss: a neurobiological perspektive on love and affection. Neuroscience 201: 114 – 124. IP-one tb protokol af Cisbio. Dokument reference: 62IPAPEX rev04 (May 2009) Esch T, Stefano G B (2005). The Neurobiologi of Love. Neuroendocrinology Letters No. 3: Vol. 26 Frank L, artikel i: Rangvid M, Kærlighedens filosofi . 1. udgave, Systime (2010) Gimpl G, Fahrenholz F (2001). The Oxytocin Receptor System: Structure, Function, and Regulation. The Amercan Physosiological Society No. 2 Vol. S1 Gimpl G (2008). Oxytocin receptors ligands: a survey of patient literatur. Informa UK Ltd ISSN 13543776. Gloriam E D (2011). Kemi detektiver kortlægger cellens kommunikationssystem. Københavns universitets nyheder d. 02.12.2011 Jensen A A, Spalding T A (2003). Allosteric modulation of G-protein coubled receptors.European Journal of Pharmaceutical Science 21 (2004): 407-420. Lee Heon-Jin, Macbeth Abbe H, Pagani Jerome, Young W Scott (2009). Oxytocin: The Great Faciliator of life. Prog Neurobiol. 88(2): 127-151. Polyfect Transfection Reagent Handbook. QAIGEN september 2000. Sigmund Freund i: Rangvid M, Kærlighedens filosofi. 1. udgave, Systime (2010) Søren Kirkegaard i: Rangvid M, Kærlighedens filosofi . 1. udgave, Systime (2010) Williams Christine, Hill Stephen J 2009. GPCR Signaling: Understanding the Pathway to Successful Drug Discovery. Humana Press Vol. 552 Hjemmesider: URL 1: http://en.wikipedia.org/wiki/Computational_chemistry (besøgt d. 28-10-2012) URL 2: https://products.invitrogen.com/ivgn/product/K210006 (besøgt d. 28-10-2012) URL 3: http://www.biocompare.com/Application-Notes/43246-HTRF-IP-One-Assay-Performed-OnThe-PHERAstar-And-RUBYstar-Plate-Readers/ (besøgt d. 28-10-2012) 12 af 13 Viktor Hesselberg-Thomsen Oktober 2012 Forside billede: http://blog.levoma.com/love-on-the-brain/ (besøgt d. 28-10-2012) Bilag Bilag 1: Budget Oxytocin CHO-kit Maxiprep kit IP-one detekterings kit Mulige allosteriske modulatorer Uforudsete udgifter Transport I alt Detaljer 25 mg N/A N/A N/A Beløb i DKK 2.500 4.100 1.300 3.300 Antal kendes ikke, dog max 100. N/A Ca. 30.000* Til og fra KU 1.000 Ca. 46.200 4.000 *Dette er et overslag. Prisen kendes ikke før resultaterne fra computer kemikeren haves. 13 af 13
© Copyright 2024