Jämförelse av realtids-PCR av borrelios
som ett komplement till klinisk
diagnostik i ÖKS-regionen
Författare:
Malin Lager, Forskning och utveckning, Länssjukhuset Ryhov, Jönköping, Sverige
Anna J Henningsson, Klinisk mikrobiologi, Länssjukhuset Ryhov, Jönköping, Sverige
Vivian Kjelland, Institutet för naturvetenskap, Universitetet i Agder, Forskningsenheten, Sørlandets
sjukhus, Kristiansand, Norge
Åshild Andreassen, Avdelningen för virologi, Folkhälsoinstitutet, Oslo, Norge
Ram Dessau, Klinisk mikrobiologisk avdelning, Slagelse sjukhus, Slagelse, Danmark
Sølvi Noraas, Medicinsk mikrobiologi, Sørlandet sjukhus HF, Kristiansand, Norge
Ann-Cathrine Petersson, Klinisk mikrobiologi, Laboratoriemedicin, Lund, Sverige
Rimtas Dargis, Klinisk mikrobiologisk avdelning, Slagelse sjukhus, Slagelse, Danmark
Maria Liljeheden, Klinisk mikrobiologi, Laboratoriemedicin, Lund, Sverige
Hanne Quarsten, Medicinsk mikrobiologi, Sørlandet sjukhus HF, Kristiansand, Norge
Katarina Ornstein, VO Specialiserad medicin Infektion, Skånevård Kryh, Region Skåne, Sverige
Tomas Bergström, Kliniska mikrobiologi, Sahlgrenska universitetssjukhuset, Göteborg, Sverige
Claus Bohn Christiansen, Avdelningen för klinisk mikrobiologi, Köpenhamn, Danmark
Per-Eric Lindgren, Institutionen för klinisk och experimentell medicin, Medicinsk mikrobiologi, Linköping,
Sverige
2
Utgitt av Nasjonalt Folkehelseinstitutt og Interreg IV A-prosjektet ScandTick
mars 2015
Tittel:
Jämförelse av realtids-PCR av borrelios som ett komplement till klinisk diagnostik i ÖKS-regionen
Forfattere:
Malin Lager, Forskning och utveckning, Länssjukhuset Ryhov, Jönköping, Sverige
Anna J Henningsson, Klinisk mikrobiologi, Länssjukhuset Ryhov, Jönköping, Sverige
Vivian Kjelland, Institutet för naturvetenskap, Universitetet i Agder, Forskningsenheten, Sørlandets
sjukhus, Kristiansand, Norge
Åshild Andreassen, Avdelningen för virologi, Folkhälsoinstitutet, Oslo, Norge
Ram Dessau, Klinisk mikrobiologisk avdelning, Slagelse sjukhus, Slagelse, Danmark
Sølvi Noraas, Medicinsk mikrobiologi, Sørlandet sjukhus HF, Kristiansand, Norge
Ann-Cathrine Petersson, Klinisk mikrobiologi, Laboratoriemedicin, Lund, Sverige
Rimtas Dargis, Klinisk mikrobiologisk avdelning, Slagelse sjukhus, Slagelse, Danmark
Maria Liljeheden, Klinisk mikrobiologi, Laboratoriemedicin, Lund, Sverige
Hanne Quarsten, Medicinsk mikrobiologi, Sørlandet sjukhus HF, Kristiansand, Norge
Katarina Ornstein, VO Specialiserad medicin Infektion, Skånevård Kryh, Region Skåne, Sverige
Tomas Bergström, Kliniska mikrobiologi, Sahlgrenska universitetssjukhuset, Göteborg, Sverige
Claus Bohn Christiansen, Avdelningen för klinisk mikrobiologi, Köpenhamn, Danmark
Per-Eric Lindgren, Institutionen för klinisk och experimentell medicin, Medicinsk mikrobiologi, Linköping,
Sverige
Bestilling:
Rapporten kan lastes ned som pdf
på prosjektets hjemmeside:
www.scandtick.com
www.fhi.no
ISBN elektronisk utgave ISBN: 978-82-8082-669-5
Jämförelse av realtids-PCR av borrelios som ett komplement till klinisk diagnostik i ÖKS-regionen, 2015
3
ScandTick
ScandTick er et Interreg IV A prosjekt i Øresund, Kattegat og Skagerrak (ØKS) regionen, og er et
grenseoverskridende samarbeidsprosjekt mellom Norge, Sverige og Danmark. Bakgrunnen for
prosjektet er det stadig økende problemet med flått og flåttbårne sykdommer i de
skandinaviske landene, spesielt innen ØKS-regionen.
De vanligste flåttbårne sykdommene er borreliose og flåttbåren encefalitt (TBE). De siste årene
har stadig flere personer blitt syke etter infeksjon med flåttbårne bakterier og virus. Et forsiktig
estimat viser at over 40.000 mennesker i regionen ble smittet i 2011, de fleste av disse i
Sverige. Trolig er antall tilfeller enda høyere, da meldingssystemene for flåttbårne sykdommer
er ufullstendige. Meldingssystemene for flåttbåren sykdom i de tre landene er også
forskjellige, noe som gjør at datagrunnlaget ikke blir direkte sammenlignbart.
De problemene flåttbårne infeksjoner medfører er forholdsvis like i våre tre skandinaviske
land, og et sterkere samarbeid over grensene vil føre til økt samlet kunnskap om flått og
flåttbårne sykdommer. ScandTick ønsker å styrke kapasiteten på forskning om flått og
flåttbårne sykdommer, samt å forbedre tilhørende helsetjenester.
Erfaringsutveksling over landegrensene, som vil stå sentralt i prosjektet, skal blant annet
forbedre diagnostikk og risikovurderinger i de tre landene. Problemene med flåttbårne
infeksjoner er relativt like i de tre landene, og ved å slå sammen datamateriale fra et større
område vil dette gi et større datagrunnlag som kan gi sikrere konklusjoner. ScandTicks
satsningsområde er derfor økt samarbeid, for å legge til rette for at de stadig økende
utfordringene knyttet til flått håndteres på best mulig måte.
Oslo, Januari 2015
Jämförelse av realtids-PCR av borrelios som ett komplement till klinisk diagnostik i ÖKS-regionen, 2015
4
Innhold
ScandTick ___________________________________________________________________________ 3
Jämförelse av klinisk diagnostik av borrelios i ÖKS-regionen
Borrelios
Metod
Resultat
Konklusion
5
5
6-7
7
Referenser ________________________________________________________________________ 8-9
Jämförelse av realtids-PCR av borrelios som ett komplement till klinisk diagnostik i ÖKS-regionen, 2015
5
Borrelios
Fästingen Ixodes ricinus, som är vanligt förekommande i Europa, verkar som vektor vid
överföring av flera humana patogener 1. En av de medicinskt mest betydande patogenerna är
Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.)-spiroketen som orsakar Lyme borrelios (LB) 2. Överföringen
till människa sker via fästingbett och risken att utveckla LB i Sverige är låg 3. Hud, nervsystem
och leder drabbas oftast, och sjukdomsförloppet uppvisar tämligen stor variation mellan olika
individer 4,5. I dagsläget ställs diagnosen LB med stöd av patientens sjukhistoria, symtom samt
kliniska undersöknings- och laboratoriefynd 6. En snabb och pålitlig metod för påvisning av LB
är av stor vikt 7 för att fastställa diagnos i ett tidigt skede av infektionen så att adekvat
behandling kan påbörjas 8. En tidigt insatt behandling är associerad med snabbt tillfrisknande,
minskat lidande och ekonomisk besparing för vården 4,8.
Antikroppspåvisning i serum och cerebrospinalvätska utgör i dagsläget den huvudsakliga
kliniska laboratoriediagnostiken vid detektion av LB, men kan i vissa fall kompletteras med
påvisning av Borrelia-specifik nukleinsyra (DNA), odling och histologi. Då odling uppvisar hög
specificitet anses den vara ”gold standard”, men då sensitiviteten i kliniska prover är
otillfredsställande och varierande (1-70 procent) 6 tillämpas inte odling inom rutindiagnostik i
de skandinaviska länderna. Påvisning av DNA uppvisar en sensitivitet på 10-70 procent
beroende på provtagningsmaterial, och används av några laboratorier som komplement till
antikroppspåvisning vid vissa indikationer. 2011 utfördes en kartläggning över Borreliadiagnostiken inom Danmark, Finland, Norge och Sverige 9. 43 laboratorier deltog och av dessa
erbjöd 6 laboratorier påvisning av Borrelia-specifikt DNA. Av dessa laboratorier var i
genomsnitt 2 procent av undersökningarna positiva på prov från cerebrospinalvätska, mot 13
procent för prov från hud eller leder. Under hösten 2013 gjordes inom ramen för ScandTick en
kartläggning över vilka molekylärbiologiska metoder som användes för klinisk diagnostik av LB
inom ÖKS-regionen. Tre kliniska laboratorier inom ÖKS-regionen hade metoder för detektion
av Borrelia-specifikt DNA som komplement till antikroppsdiagnostiken, en så kallad
polymerase chain reaction (PCR)-metod. Vidare fanns även två forskningslaboratorier som
utförde påvisning av Borrelia-specifikt DNA med PCR-diagnostik, vilka vore intressanta att
jämföra med de metoder som används vid klinisk diagnostik.
Syftet med jämförelsen är att försöka förbättra diagnostiken så att den blir mer tillämpbar i
klinisk diagnostik samt likrikta tolkningen och bedömningen av resultat mellan olika
laboratorier i ÖKS-regionen.
Metod
Påvisning av Borrelia-specifikt DNA i fästingar uppvisar en högre känslighet än i kroppsvätskor
såsom serum och cerebrospinalvätska. För att utvärdera känsligheten bland metoderna som
används inom ÖKS-regionen har DNA från fästingar skickats till fem laboratorier (tre kliniska
laboratorier och två forskningslaboratorier). De fem laboratorierna har med sina
molekylärbiologiska metoder analyserat förekomst av Borrelia-specifikt DNA och sedan
rapporterat sina resultat samt diagnostiska protokoll.
Jämförelse av realtids-PCR av borrelios som ett komplement till klinisk diagnostik i ÖKS-regionen, 2015
6
Resultat
Sammanställningen visade att varje laboratorium hade sitt eget diagnostiska protokoll. Vid en
jämförelse mellan samtliga laboratorium fann vi samstämmiga positiva resultat hos 29/96
prover och samstämmiga negativa resultat hos 51/96 prover. Detta ger en acceptabel
överenstämmelse på 83.3% när positiva och negativa resultat tolkas tillsammans. Ett
laboratorium påvisade 38 positiva prover medan övriga påvisade 32-34 positiva prover. Ctvärdet, ett mått på metodens känslighet och effektivitet, var generellt lägre för ett protokoll,
men det förelåg inget samband mellan lågt Ct-värde och antalet positiva prover (Tabell 1).
Tabell 1. Borreliadiagnostik: Resultat och PCR**-metoder som används för påvisning av
Borrelia-specifikt DNA vid kliniska laboratorier samt forskningslaboratorier i ÖKS-regionen.
Laboratorium
PCR-metod
Institutitionen för
naturvetenskap
Universitetet i Agder
Kristiansand
(Forskningslaboratorium)
Csv*, hud,
ledvätska, fästingar:
Påvisning:
regioner i 16S
rRNA-genen
amplifieras med
realtids-PCR
Artbestämning:
nested PCR av rrs
(16S)-rrl (23S)
intergenic-spacer
(IGS) regionen följt
av sekvensering
Fästingar:
Klinisk mikrobiologi
Länssjukhuset Ryhov
Jönköping
Påvisning:
(Forskningslaboratorium) regioner i 16S rRNA
genen amplifieras
med
realtids-PCR
Klinisk mikrobiologi
Laboratoriemedicin
Lund
(Kliniskt laboratorium)
Artbestämning:
nested PCR av 5S23S rRNA
intergenic-spacer
(IGS) regionen följt
av sekvensering
Csv*, hud,
ledvätska:
Påvisning:
regioner i 16S
rRNA-genen
amplifieras med
realtids-PCR
Referens
Tsao et al.10,
(modifierat)****
Antal
positiva
Medelvärde
Ct***
34
Ct Medel = 32,5
33
Ct Medel = 35,9
Bunikis et al. 11,
Portnoi et al. 12
(modifierade)****
Wilhelmsson et al.
13
Postic et al.14
Tsao et al.10
32
Ct Medel = 33,1
Jämförelse av realtids-PCR av borrelios som ett komplement till klinisk diagnostik i ÖKS-regionen, 2015
7
Medicinsk mikrobiologi
Sørlandet sjukhus HF
Kristiansand
(Kliniskt laboratorium)
Klinisk mikrobiologisk
avdelning
Slagelse sjukhus
Slagelse
(Kliniskt laboratorium)
Artbestämning:
nested PCR av
ospA-genen följt av
sekvensering
Csv*, hud,
ledvätska:
Påvisning:
regioner i 16S
rRNA-genen samt
OspA-genen
amplifieras
parallellt och
analyseras med
realtids-PCR
Tsao et al.10
Gooskens et al.16
38
Ct Medel = 31,5
Tsao et al.10
32
Ct Medel = 30,5
Artbestämning:
Utförs inte
Csv*, hud,
ledvätska:
Påvisning:
regioner i 16S
rRNA-genen
amplifieras med
realtids-PCR
Artbestämning:
nested PCR av
ospA-genen följt av
sekvensering
*
Ornstein et al.15
Ornstein et al.15
Csv: cerebrospinalvätska. **PCR: polymerase chain reaction. ***Medelvärdet av prover som uppnår detekterbara nivåer DNA.
Modifierade protokoll finns sammanställda i Kjelland et al. 17
****
Konklusion
Jämförelsen mellan de olika laboratorierna i ÖKS-regionen visar att samtliga laboratorier, både
kliniska laboratorier och forskningslaboratorier, använder PCR-baserad diagnostik för DNApåvisning. Dock varierar protokollen samt dess sensitivitet och specificitet mellan
laboratorierna. Eventuella skillnader avser vi att systematiskt analysera vidare genom att
jämföra de olika testprotokollen samt försöka att optimera olika steg i analyserna.
Förhoppningsvis kan resultaten utgöra ett stöd för kliniska laboratorier i valet av analysmetod
så att den molekylärbiologiska diagnostiken i regionen kan förbättras. Detta är till stor nytta
för befolkningen, då rätt diagnos och behandling givetvis är högsta prioritet för alla som
drabbas av en Borrelia-infektion.
Jämförelse av realtids-PCR av borrelios som ett komplement till klinisk diagnostik i ÖKS-regionen, 2015
8
Referenser
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Belova, O. A., Burenkova, L. A. & Karganova, G. G. Different tick-borne
encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially engorged ixodid
ticks--evidence of virus replication and changes in tick behavior. Ticks and tickborne diseases 3, 240-246, doi:10.1016/j.ttbdis.2012.05.005 (2012).
Berglund, J. et al. An epidemiologic study of Lyme disease in southern Sweden.
The New England journal of medicine 333, 1319-1327,
doi:10.1056/NEJM199511163332004 (1995).
Fryland, L. et al. Low risk of developing Borrelia burgdorferi infection in the
south-east of Sweden after being bitten by a Borrelia burgdorferi-infected tick.
International journal of infectious diseases : IJID : official publication of the
International Society for Infectious Diseases 15, e174-181,
doi:10.1016/j.ijid.2010.10.006 (2011).
Berglund, J., Stjernberg, L., Ornstein, K., Tykesson-Joelsson, K. & Walter, H. 5y Follow-up study of patients with neuroborreliosis. Scandinavian journal of
infectious diseases 34, 421-425, doi:10.1080/00365540110080421 (2002).
Vrethem, M. et al. Chronic symptoms are common in patients with
neuroborreliosis -- a questionnaire follow-up study. Acta neurologica
Scandinavica 106, 205-208 (2002).
Stanek, G. et al. Lyme borreliosis: clinical case definitions for diagnosis and
management in Europe. Clinical microbiology and infection : the official
publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious
Diseases 17, 69-79, doi:10.1111/j.1469-0691.2010.03175.x (2011).
Mygland, A. et al. EFNS guidelines on the diagnosis and management of
European Lyme neuroborreliosis. European journal of neurology : the official
journal of the European Federation of Neurological Societies 17, 8-16, e11-14,
doi:10.1111/j.1468-1331.2009.02862.x (2010).
Henningsson, A. J., Malmvall, B. E., Ernerudh, J., Matussek, A. & Forsberg, P.
Neuroborreliosis--an epidemiological, clinical and healthcare cost study from an
endemic area in the south-east of Sweden. Clinical microbiology and infection :
the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and
Infectious Diseases 16, 1245-1251, doi:10.1111/j.1469-0691.2009.03059.x
(2010).
Dessau, R., Eliasson, I., Skarpaas, T. & Nyman, D. Report from a survey of
laboratory methods used in Scandinavia. Testing for Lyme Borreliosis in the
Nordic countries-variations in strategies and rate of seropositivity (2011).
Tsao, J. I. et al. An ecological approach to preventing human infection:
vaccinating wild mouse reservoirs intervenes in the Lyme disease cycle.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 101, 18159-18164, doi:10.1073/pnas.0405763102 (2004).
Bunikis, J. et al. Sequence typing reveals extensive strain diversity of the Lyme
borreliosis agents Borrelia burgdorferi in North America and Borrelia afzelii in
Europe. Microbiology 150, 1741-1755, doi:10.1099/mic.0.26944-0 (2004).
Portnoi, D. et al. A single-run, real-time PCR for detection and identification of
Borrelia burgdorferi sensu lato species, based on the hbb gene sequence. FEMS
microbiology letters 259, 35-40, doi:10.1111/j.1574-6968.2006.00249.x (2006).
Wilhelmsson, P. et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that
have bitten humans in Sweden. Journal of clinical microbiology 48, 4169-4176,
doi:10.1128/JCM.01061-10 (2010).
Jämförelse av realtids-PCR av borrelios som ett komplement till klinisk diagnostik i ÖKS-regionen, 2015
9
14
15
16
17
Postic, D., Assous, M. V., Grimont, P. A. & Baranton, G. Diversity of Borrelia
burgdorferi sensu lato evidenced by restriction fragment length polymorphism of
rrf (5S)-rrl (23S) intergenic spacer amplicons. International journal of
systematic bacteriology 44, 743-752 (1994).
Ornstein, K. & Barbour, A. G. A reverse transcriptase-polymerase chain reaction
assay of Borrelia burgdorferi 16S rRNA for highly sensitive quantification of
pathogen load in a vector. Vector borne and zoonotic diseases 6, 103-112,
doi:10.1089/vbz.2006.6.103 (2006).
Gooskens, J., Templeton, K. E., Claas, E. C. & van Dam, A. P. Evaluation of an
internally controlled real-time PCR targeting the ospA gene for detection of
Borrelia burgdorferi sensu lato DNA in cerebrospinal fluid. Clinical
microbiology and infection : the official publication of the European Society of
Clinical Microbiology and Infectious Diseases 12, 894-900, doi:10.1111/j.14690691.2006.01509.x (2006).
Kjelland, V., Stuen, S., Skarpaas, T. & Slettan, A. Prevalence and genotypes of
Borrelia burgdorferi sensu lato infection in Ixodes ricinus ticks in southern
Norway. Scandinavian journal of infectious diseases 42, 579-585,
doi:10.3109/00365541003716526 (2010).
Jämförelse av realtids-PCR av borrelios som ett komplement till klinisk diagnostik i ÖKS-regionen, 2015