02.02.2015
Oversikt
Bruk av Q-TOF-MS til
rettstoksikologiske analyser
Åse Marit Leere Øiestad
Folkehelseinstituttet
Avdeling for rusmiddelforskning
og metodeutvikling
04.02.2015
• Bakgrunn, litt om TOF
• Bruksområder ved Folkehelseinstituttet,
Divisjon for Rettsmedisinske fag
• Eksempler på spesielle saker
• Oppsummering
Bakgrunn
P=760 torr
P= 1 x 10-5
torr
• TOF = time-of-flight = flyvetid
• ”Feltfri” masseseparator - kombinerer pulsing av
ioner med et langt feltfritt flyverør
• Enkelt konsept – for en gitt kinetisk energi vil
lette ioner ha større fart og bruke kortere tid på
å bevege seg til detektoren enn tunge ioner
Bakgrunn
+
+
+
+
+
Måler tid
E = ½ M v2
+
-
+
Detektor
mi = mass of analyte ion
zi = charge on analyte ion
E = extraction field
ti = time-of-flight of ion
ls = length of the source
ld = length of the field-free drift
region
e = electronic charge
(1.6022x10-19 C)
oa-TOF
• Vanlige bruksområder for TOF:
– Proteomikk/metabolomikk
– Non-targeted screening av matvarer eller miljøprøver
– Analyse av urenheter innen f.eks. farmasøytisk produksjon
– Metabolittidentifisering
– Strukturoppklaringer
– Utvikling av nye legemidler
• Etterhvert også bruk innen kliniske/toksikologiske
miljøer
J.C. Fjelsted, Liquid chromatography Time-of-Flight Mass Spectometry: Principles, Tools, and
Applications for Accurate Mass Analysis. Edited by I. Ferrer, E.M. Thurman, Wiley 2009
1
02.02.2015
Høytoppløsende TOF-instrumenter
Spesifikasjoner for dagens HR-TOF
• Tilgjengelig i mange år
• Masseoppløsningsevne 10 000 – 80 000
• Primært brukt til strukturoppklaring og identifikasjon av
metabolitter
• Massenøyaktighet <3 ppm
• Tidligere lite egnet til kvantitative bioanalytiske
applikasjoner:
• Scanhastigheter >10 Hz (muliggjør kobling til UPLC/UHPLC)
• Masseområde > 10 000 m/z
• Gode isotopfordelingsmønstre
– Ikke optimale scanhastigheter
• Følsomhet som nærmer seg trippelkvadrupoler
– Begrenset dynamisk område
• Dynamisk område på inntil 5 dekader
– Dårlig følsomhet
• Mulig å bruke kvantitativt
Nøyaktig masse og oppløsning
“If the mass of an ion from a chemical compound
is determined with sufficient accuracy, the
elemental composition of that compound could
be deduced”
– Beynon JH. Qualitative analysis of organic compounds by mass
spectrometry. Nature 174 (1954) 735-37.
Differensiering mellom isobariske forbindelser på
grunnlag av nøyaktig masse
Metamfetamin MH+ C10H16N = 150.1
Eksakt masse 150.12773
Katinon MH+ C9H12NO = 150.1
Eksakt masse 150.09134
ΔM = 36.4 mDa or 242 ppm
Mulige formler for små molekyler med
elementene C, H, N, O, P, S og Cl
Prøveopparbeidelse/kromatografi
• Prøveopparbeidelse er fortsatt viktig! Vi ser ikke
stoffer som ikke lar seg ekstrahere eller ionisere!
• Bruk av retensjonstid i databasesøk gir signifikant
økt spesifisitet i forhold til nøyaktig masse alene.
Dette gjør det lettere å skille isobariske forbindelser.
=> krever standardisert kromatografi med høy
oppløsningsevne og reproduserbarhet
Grange and Sovocool, Liquid chromatography Time-of-Flight Mass Spectometry: Principles, Tools, and
Applications for Accurate Mass Analysis. Edited by I. Ferrer, E.M. Thurman, Wiley 2009
2
02.02.2015
Bruk av retensjonstid for å skille isomere
Bruk av fragmentering
• Nøyaktig masse, isotopmønster, retensjonstid
og evt. metabolittmønster gir en foreløpig
identifikasjon, men ikke nødvendigvis sikker
bekreftelse
• Økt sikkerhet ved bruk av fragmentering.
E. Tyrkkö, A. Pelander, I. Ojanperä, Prediction of liquid chromatographic retention for differentiation of
• Strukturinformasjon fra MS/MS-spektrene.
Kan skille mellom isomere hvis de har ulike
fragmenter.
structural isomers, Analytica Chimica Acta, 720 (2012) 142.
MSMS Library Search for High Confidence Compound ID
Isomers are identified
Bruksområder for Q-TOF ved FHI-RE
MSMS spectra contain structural information
Measured
Comparison
Library
- Dexamisole?
- Tetramisole?
Tetramisole!
• Rutinescreening av obduksjonsprøver
- Cocaine?
Cocaine!
- Fenoterol?
- Hydromorphinol?
- Scopolamine?
Benzoylecgonine!
- Benzoylecgonine
- Roletamide?
- Norcocaine?
Measured
Comparison
Library
• Beslag og spesialanalyser
• Utvikler metode for analyse av nye psykoaktive stoffer (NPS)
• Metabolismestudier av nye psykoaktive stoffer
Gjengitt med tillatelse fra Johnny Tran, Matriks
Screening av obduksjonsprøver
• Analyse av blodprøver fra obduksjonssaker, 1600-1700
prøver/år
• Semikvantitativ targeted screening etter 63 legemidler
• Kvalitativ analyse av ca. 200 legemidler/rusmidler
• Mulighet for screening mot stort bibliotek ved
observasjon av (store) ukjente topper i kromatogrammet eller opplysninger som tilsier at det kan være
andre stoffer tilstede
Database og bibliotek (PCDL)
• Forensic/Tox, Broecker, Herre & Pragst
- Ca. 9000 komponenter med nøyaktig masse (database)
- Ca. 3000 av disse har spektra (bibliotek)
- ca. 200 stoffer med retensjonstider (lagt til ved FHI)
• MSMS-spektra og retensjonstider for alle
komponenter i FHI-repertoaret legges inn
fortløpende
• Mulighet for retrospektiv analyse
3
02.02.2015
Bruk av Q-TOF til spesialanalyser
• I noen saker ønsker vi å se etter et
større repertoar av stoffer enn de vi
vanligvis analyserer i rutinen, for
eksempel insektmidler, veterinærmedisiner, giftstoffer, stoffer vi ikke
har renstoffer til eller beslag.
Spesialanalyser
• «Kjente ukjente»
– Har bibliotekspekter/eksakt masse i databasen
– Mangler renstoff  mangler retensjonstid
«CSI-light»
• Analyse med Q-TOF og sammenlikning
med en stor database/bibliotek kan da
hjelpe oss å løse noen saker, andre
ganger finner vi ikke noe svar.
Case 1: hvitt/rosa pulver
• Funnet ved en behandlingsinstitusjon.
• Pulveret ble identifisert som diklazepam – et
benzodiazepin designerdrug.
• Første gang vi fant dette stoffet. Det er nå en del av
rutinerepertoaret vårt, med flere positive funn!
Case 3: hvitt pulver fra Tollvesenet
• Beslag av angivelig “ hårmiddel ” importert av mann
• «Ukjente»
– Stoffer som ikke finnes i biblioteket/databasen
– Mulighet for generering av molekylformel
– MSMS-spektertolkning
Case 2: overdose med ukjent
medikament
• Blodprøve fra en person hvor det var funnet mange
tabletter i magesekken ved obduksjon. Tablettene
var ikke sendt inn til analyse.
• Ingen funn av betydning i standardrepertoaret.
• Stor topp i kromatogrammet med databasetreff på
mykofenolsyre, en transplantasjonsmedisin.
• Opplysninger i saken om at personen var nyretransplantert.
• Bekreftet mot renstoff i etterkant.
Får tentativ molekylformel vha TOF:
C17H18F3N3O3
Internettsøk finner hårmiddelet RU54881
tidligere kjent for “tvilsom” import.
• Stadige henvendelser fra moren til vedkommende
med etterlysning av stoffet.
• Analysert med GC/MS hos Toll-laben, men ikke funnet
m/z=369
ut hva det kunne være. Forhørt seg hos mange.
• Spørsmål om mulig strukturoppklaring.
Gjengitt med tillatelse fra Harry Jensen, Tollaboratoriet
4
02.02.2015
Case 4: dødsfall pga. NPS
•
•
•
Case 4: dødsfall pga. NPS
Case 4: dødsfall pga. NPS
•
Standardrepertoaret viste at prøven var positiv på
•
Analyse med Q-TOF viste en stor topp ved ca. samme
RT som bromodragonfly, men med annen
molekylformel.
•
Ingen treff i databasen.
•
Intens søking på internett ga forslag om AH-7921, en
opioid reseptor agonist med ganske like egenskaper
som morfin.
•
Renstoff ble bestilt og ID bekreftet.
paracetamol (124 µM) og kodein (1,4 µM)
•
Prøven ble også analysert for nye psykoaktive stoffer (NPS)
med UPLC-MS/MS. Vi hadde da renstoff for 4-MMC (=
mefedron), men ikke 3-MMC eller 4-FMA.
•
Stor topp for bromodragonfly med sur mobilfase, men ikke
riktig retensjonstid med basisk mobilfase.
Fordeler med TOF-MS
• Kortere tid til metodeutvikling da det ikke er
nødvendig å optimalisere MRM-overganger
• Mulig å reprosessere lagrede data for å se etter
andre forbindelser
• ”All of the ions, all of the time”
Mottatt blodprøve fra en ung mann
som døde uventet.
Opplysninger om at han hadde brukt
stoffer kjøpt på internett.
Funn av to poser med hvitt pulver,
merket hhv. 4-FMA og 3-MMC, men
dette materialet var ikke sendt med.
Fordeler med TOF-MS
• Ved tilgang på databaser eller bibliotek kan man
få forslag til identifikasjon av stoffer som man i
liten grad ville hatt mulighet til å finne ut av
ellers.
• Men vi kjøper inn renstoff og bekrefter mot dette
i etterkant!
– Kan se på mange flere stoffer samtidig enn med
trippelkvadrupoler
5
02.02.2015
Andre erfaringer
• Svært viktig med veldig rene løsningsmidler og
andre kjemikalier. Må testes!
Andre erfaringer
•
Fullt søk for en biologisk prøve etter alle mulige
forbindelser mot biblioteket (som inneholder ca.
9000 stoffer) kan gi mer enn 5000 foreslåtte
formler – og mange falske positive. God og
reproduserbar kromatografi gjør at man kan
bruke retensjonstid til å minske antallet.
•
Å finner ut av helt ukjente stoffer er svært
vanskelig!
• Viktig med regelmessig vedlikehold/vask av
systemet for å holde bakgrunnen nede.
• Kan få problemer dersom ulikt utstyr/trinn i
prøveopparbeidelsen gir mye bakgrunn slik som
plastmyknere, rester fra glassvask etc.
Takk til
• Unni Johansen, Veronica Horpestad Liane,
Kristin Opsal Svendsen og Elisabeth Leere
Øiestad, FHI.
• Harry Jensen, Toll-laben.
• Johnny Trahn, Matriks.
Og takk for oppmerksomheten! 
6