13.02.2015
Basofil aktiveringstest
BAT
Livia Bajelan
Tromsø 12.02.2015
1
BAT
•
•
•
•
•
Basofile celler: struktur, funksjon
Definisjoner: atopi, sensibilisering, allergi
BAT: prinsipp, metode
Klinisk bruk
Oppsummering
2
1
13.02.2015
Basofile celler
• Subgruppe granulocytter, 12‐15 µ
• Mørke granula: histamin, cysteinyl lektoriene LTC4, cytokiner (IL‐4, IL‐13)
• Farges med basiske farger • Cytoliseresistent membran
• Sirkulerende celler, lavt tall <0,1x10 9 celler⁄L • Sterkt uttrykk av Fcε RI
3
Basofil celle 4
2
13.02.2015
Atopi ‐ definisjon
• Genetisk predisposisjon til å danne IgE
mot vanlige miljøallergener
•
•
•
Ca. 40 % av befolkningen i vestlige land Eksponering til mikrober i barndommen‐immunresponsen mot TH1 responser og nonatopi.
Barn med genetisk predisposisjon til atopi, lav eksponering til mikrober ‐Th2 responser
5
Allergi ‐ sensibilisering
Nature Rev Immunology 2008; Galli et al.
3
13.02.2015
Allergi ‐ degranulering
Nature Rev Immunology 2008; Gould et al.
Degranulering dose‐sted
8
4
13.02.2015
Allergi
• sensibilisering + symptomer
• sensibilisering ≠ allergi
9
Diagnose • Sensibilisering (IgE) + symptomer = allergi
• Relevant klinikk/anamnese
• Konfirmerende tester: IgE, SPT, tryptase, ECP, BHR, BAT, provokasjon
Industrialiserte land, sykefravær fra skole, jobb, kostbar sykdom.
Riktig diagnose og behandling.
10
5
13.02.2015
Inhalasjonsallergener Allergisk rhinitt, konjunktivitt
• Aktivering av mastceller og basofile under epitel
• Rennende nese, øye, kløe, lokal hevelse
• Sesongallergener (bjørk timotei)
• Helårsallergener (katt, hund, husstøvmidd)
Allergisk astma • Aktivering av mastceller og basofile i nedre luftveier
• Bronkokonstriksjon‐
sekunder
• Økt mucus produksjon
• Pustevansker
11
Mat/medisiner po
•
•
•
•
Matallergener: Fordøyelsesstabile (pepsin)
Diaré, oppkast (aktivering av mastceller og basofile under epitel)
Urticaria (rask absorbsjon av allergen fra tarmen inn i blodbanen f. eks. penicillin) Anafylaksi (aktivering av mastceller og basofile i bindevev : lavt BT, puls, bronkokonstriksjon‐peanøtter, fisk)
12
6
13.02.2015
BAT‐ prinsipp og metoder
• stimulering med spesifikk allergen
‐ frigjøring av mediatorer (BHR)
‐ oppregulering av CD63, CD203c (flowcytometri)
13
Markører‐ karakteristika
Julie Leysen, Vito Sabato Expert Rev Clin Immunol.2011;7(3):349‐355
14
7
13.02.2015
Degranulering
Ebo et al Flow assisted allergy diagnosis. Allergy 2006:61:1028‐1039
15
Aktiveringsmarkører
16
8
13.02.2015
Flowcytometrisk metode‐ materiale ‐ fullblod (mer fysiologisk, mindre sentrifugering, men interferens med serumproteiner anti‐IgG, anti‐IgE, medisiner)
‐ isolerte basofile (tap av celler gjennom separering)
17
Preaktivering med IL‐3
• Ikke generell konsensus
• Kort preaktivering (10 min) 2 ng/ml: primer cellene med økt mediator frigjøring (ikke oppregulering av CD63)
• Øker sensitiviteten Cozon G, Ferrandiz J, Detection of activated basophils using flowcytometri for diagnosis in atopic patients. Allergol Immunopathol (Madr) 1999;27:182‐187
• Ikke brukt for CD203c
18
9
13.02.2015
Allergener‐typer • Naturlige allergenekstrakter‐heterogene, har nonspesifikke inhiberende/stimulerende faktorer som endotoksiner, lektiner
• Hudtest ekstrakter‐toksiske, inhiberende konserveringsmidler. Lite brukt, med mindre de er dyalisert
• Medisiner‐ flytende form
19
Allergener‐
stimuleringskonsentrasjoner
Positive og negative kontroller
Histamin‐ og leukotrienefrigjøringstester‐ få
Tester for å finne stimuleringskonsentrasjoner
Identifisere cytotoksiske doser eller doser som forårsaker uspesifikk stimulering‐unngå falsk negative/positive resultater
• Optimal allergenkonsentrasjon (fullt blod/isolerte Bf. , priming med IL‐3)
•
•
•
•
20
10
13.02.2015
Falsk negative resultater
Non responders ( 5‐10 % oppregulerer ikke CD63 og CD203c‐ påvirker spesifisitet og sensitivitet, mange nevner ikke det i publiserte studier)
Nylig eksponering for allergen med midlertidig cellerefraktæritet eller midlertidig reduksjon av allergenspesifikk eller membranbundet IgE
Forsinket analysering av prøven‐ ideelt 6 uker ‐ 12 mnd etter allergisk episode
Medisiner: glukokortikoider, immunmodulerende, immunsupressiva, anti‐IgE
Dårlig lagring av prøvemateriale‐ideelt maksimum 24 timer i 4 0 Celsius
Ikke adekvat stimulering‐kontaminerte allergener, cytotoksiske allergenkonsentrasjoner
Repetisjon av negativ test ( non responders tilstanden‐ midlertidig)
Negative kontroll stimulering‐ se på spontan uttrykk av aktiveringsmarkører (innebærer inkubasjon med stimulasjonsbuffer)
•
•
•
•
•
•
•
•
21
Valg markører
•
•
•
•
•
•
•
•
Buhlmann, Switzerland CD63, CD203c
Orpegen, Tyskland
BD (fullt blod), Belgium CD63: CD123+HLA‐DR‐
CD203c forekommer kun på basofile ( trenger ikke anti‐IgE og anti‐HLA‐DR for identifisering av celler)
Hvilende Bf har av og til lavt spontant uttrykk av CD203c, oppregulering av CD203c<enn oppregulering av CD63. Pas. med spontant økt uttrykk av CD203c‐
oppreg. kan være absent eller minimal.
Under testing: CRTH2 (DP2)‐chemoattractant receptor‐homologous molecule uttrykt på TH2 celler
Aktiverings antigener CD13, CD107 a
22
11
13.02.2015
CD63‐CD203c‐CCR3
Anti‐CD63‐FITC
Anti‐CD203c‐PE‐DY647
Anti‐CCR3‐PE
Kontroller: ‐anti‐FcEpsilonRI (monoclonal antibody)
‐tripetide (fMLP) (aktiverer nonimmunologisk)
23
Kliniske applikasjoner
• Diagnostikk av IgE medierte allergier (luftveisallergener, mat, latex, hymenoptera, medikamenter)
• Sammenlikning av allergenisitet for naturlige ekstrakter, kjemisk modifiserte, rekombinante allergener
• Vurdering av passiv IgE sensibilisering via blodtransfusjoner
• Component‐resolved diagnosis: pollen og hymenoptera‐ allergi
24
12
13.02.2015
Sensitivitet og spesifisitet
Ebo et al Flow assisted allergy diagnosis. Allergy 2006:61:1028‐1039
25
NMBD
Julie Leysen, Vito Sabato Expert Rev Clin Immunol.2011;7(3):349‐355
26
13
13.02.2015
Inhalasjonsallergener
• Sensitivitet og spesifisitet 90 % •
Cozon G, Ferrandiz J, Detection of activated basophils using flow cytometri for diagnosis in atopic patients. Allergol Immunopathol (Madr) 1999;27:182‐187
•
Sanz ML, Sanchez G, Allergen‐induced basophil activation: CD63 cell expression detected by flow cytometri in patients allergic to Dermatophagoides pteronyssinus and Lolium perenne. Clin Exp Allergy 2001;31:1007‐1013
27
B‐lactamer
Julie Leysen, Vito Sabato Expert Rev Clin Immunol.2011;7(3):349‐355
28
14
13.02.2015
NSAIDS
Julie Leysen, Vito Sabato Expert Rev Clin Immunol.2011;7(3):349‐355
29
Latex
• Ikke nok sensitiv og spesifikk for å diagnostisere IgE mediert latex allergi, men hjelper til å skille mellom klinisk relevant og irrelevant IgE resultater Ebo DG, Lechkar Validation of a two‐colour flow cytometric assay detecting in vitro basophil activation for the diagnosis of IgE‐mediated natural rubber latex allergy. Allergy 2002;57:706‐712.
• Flere uavhengige grupper: spesifisitet og sensitivitet >90 %
Sanz ML, Gamboa PM et al Flow cytometric cellular allergen stimulation test in latex allergy. Int Arch Allergy Immunol 2003;130:33‐39.
Hemery ML, Arnoux B et al Confirmation of the diagnosis of natural rubber latex allergy by the basotest method, Int Arch Allergy Immunol 2005;136:53‐57.
30
15
13.02.2015
Basofil histamin frigjøringstest BHR
• Prøvemateriale: fullblod, isolerte MNC (basofile granulocytter), serum.
• Metode: direkte provokasjon på pasientens egne celler eller passiv sensibilisering av donorceller med pasientserum.
• Stimuli: allergenekstrakter, medikamenter, stoffer, anti‐IgE.
• Måling: Histamin, tryptase, leukotrien.
• Målemetode: RIA, ELISA, HPLC.
31
BHR
Clin Exp Allergy 2001, Crockard
32
16
13.02.2015
Basofil leukotriene test
Clin Exp Allergy 2001, Editorial; Crockard
Oppsummering
• Allergi = sensibilisering + symptomer
• Diagnostikk:
‐ Relevant klinikk/anamnese,
‐ tester: Spesifikk IgE, SPT, provokasjon,
‐ BAT : monitorering av anti‐IgE behandling, ASIT.
17