1. No category

Sensorveiledning-Eksamen ERN4210-2015
Oppgave 1 (BSS)
A) Beskriv mekanismen for hvordan Agouti-relatert protein (AgRP) virker på sult og
metthetsfølelsen i hjernen.
SVAR: AgRP er et neuropeptid i hjernen som er produsert av AgRP/NPY neuroner i den
ventromediale delen av nukleus arcuatus i hypotalamus. AgRP er uttrykt sammen med
Neuropeptid Y (NPY) og de virker sammen om å øke appetittfølelsen samtidig som
metabolisme og energiforbruket senkes. AgRP er en av de mest betydningsfulle
appetittstimulerende hormonene vi kjenner til i hjernen. Frigjøring av AgRP stimuleres av
grelin frigjort fra magen og hemmes av leptin fra fettvevet, samt metthetspeptidnene PYY,
GLP-1 og OXM fra tarmene. AgRP hemmer virkningen av leptin og dermed metthet ved å
virke som en antagonist for melanocortin reseptorene MC3-R and MC4-R. AgRP virker på
sultreseptorene Y1/Y5R i PVN. For mye AgRP vil føre til økt appetitt og overspising.
B) Endokrine og nervøse impulser regulerer appetitten. Beskriv dette samspillet med en skisse
og korte kommentarer. SVAR: se figur:
SKISSE OVER NEURAL OG HORMONELL REGULERING
AV APPETITT
Appetitt fremmende neuroner
Appetitt hemmende neuroner
(nucleus tractus
olitarius)
2
1
4
1 = nerver
2 = ”fetthormoner”
3 = pankreashormoner
3
4 = tarmhormoner
C) Beskriv hvordan insulin og stress regulerer proteinsyntese og cellevekst via henholdsvis
PKB og AMPK.
SVAR: Insulin binder insulinreseptor noe som medfører rekruttering av
insulinreseptorsubstrat. Dette rekrutterer PI-3K som forsforylerer inositol fosfat til inositol
3,4,5 trifosfat. Inositol 3,4,5 trifosfat rekrutterer PKB til membranen. PKB blir aktivert av
PDK1 ved forsforylering. Aktiv PKB hemmer effekten av guanidin exchangefaktoren
TSC2. TSC2 regulerer hydrolyse av GTP bundet til det lille G-proteinet Rheb. I GTPbundet form vil Rheb aktivere mTOR som gjennom forsforylering av p70S6K
oppregulerer proteinsyntese og cellevekst.
Stress med påfølgende økning av AMP/ATP ratio vil føre til AMPK aktivering og LKB1avhengig forsforylering av AMPK. Aktiv AMPK øker TSC2 aktivitet og hemmer mTOR
aktivitet. Til sammen fører dette til redusert proteinsyntese og cellevekst.
Oppgave 2 (CAD)
A) Hvilke effekter har ulike fettsyrer på plasma kolesterol og LDL-kolesterol nivået hos
mennesker?
Svar kan leses av nedenstående figur.
B) Via hvilke mekanismer kan fettsyrer utøve sin effekt?
Svar kan leses av nedenstående figur. I tillegg er fett en viktig energikilde.
Mechanisms of action for fatty acids
Platelets
W blood cells Chemotactic agents
n-3
n-3
1) Eicosanoids
2) Substrate for enzymes
COOH
COOH
CH 3
CH 3
3) Peroxidation
Red blood cells
4) M embranes are flexible
5) Acylation of proteins
more flexible
Protein
FA
membrane
FA
6) Transcription factors
Nucleus
DNA
mRNA
Promoter
CAD25
Protein
C) Beskriv forskjellen mellom brunt og hvitt fettvev. Tegn gjerne en figur som illustrerer ditt
svar.
Svar. Brune fettceller har mange mitokondrier (gir brunfargen) og mange små fettdråper
(multilokulære), istedenfor en stor fettdråpe (unlilokulær) og et lite antall mitokondrier
som finnes i hvite fettceller. Brune fettceller kan oksidere store mengder fettsyrer og
glukose uten at det dannes ATP – oksidativ frikobling vha UCP (uncopling protein) 1, som
er et protein i indremembran av mitokondrier som fungerer som en protonkanal. Derved
utlignes gradienten av protoner fra rommet mellom indre og ytre mitokondriemembran
slik at protonene strømmer inn i matrix av mitokondriene og derved frigjøres varme uten
at det dannes kjemisk energi I form av ATP.
Det er påvist brunt fettvev hos minst 20 % av yngre mennesker, og mengden avtar med
alder og økende omgivelsestemperatur.
Hvitt fettvev har en rekke funksjoner:
• lagre energi i meget store mengder, med lite volum og vekt
• lagre kolesterol, vitamin D og E
• isolere termisk og beskytte mekanisk
• skille ut mange ulike hormoner (adipokiner)
• gir mekanisk polstring og termisk isolasjon
Oppgave 3 (KTD)
A) Beskriv, gjerne med figur, hvordan proteiner på overflaten til lipiddråper i fettvev
forandrer seg og gjør at lipiddråpen omdannes fra en lagrende til en frigjørende tilstand?
Svar: I basal tilstand finnes perilipin1 i ikke-fosforylert tilstand på LD-overflaten.
Den C-terminale delen av Perilipin1 binder til seg cgi-58/Abhd5. Det er trolig slik at
denne interaksjonen hemmer aktiviteten til cgi-58. Perilipin beskytter innholdet i
kjernen fra lipolyse.
Ved initiering av lipolyse aktiveres PKA grunnet økt cAMP nivå. PKA fosforylerer
hormone sensitive lipase (HSL) og perilipin1 (perilipin1 har potensielt 6
fosforyleringsseter). CGI-58 frigjøres fra perilipin 1 og binder til adipose
triglyderide lipase (ATGL). CGI-58 fungerer som en koaktivator av ATGL som
katalyserer nedbrytning av TG til DG. Fosforylering i den N-terminale delen av
perilipin1 rekrutterer HSL som katalyserer nedbrytning av DG til MG. Disse
molekylære forandringene gir >100-gangers forskjell i lipolytisk hastighet mellom
basal og stimulert lipolyse.
Følgende kan tenkes nevnt av ”A-kandidater”:
Fosforylering av sete 6 (Ser 517, C-terminalen) er nødvendig for at cgi58 skal
frigjøres fra perilipin1.
Fosforylering av sete 5 (Ser492) er nødvendig for fragmentering av LDer. Gir mer
LD overflate, noe som er antatt å øke lipolytisk hastighet.
Forsforylering i N-terminalen er viktig (men ikke essensielt) for rekrutering og
binding av HSL til perilipin1.
B) Overvekt skyldes opphopning av triasylglyserol i fettvev. Hvilke substrater trengs for å
lage triacylglyserol og beskriv kort hvordan de tre viktige energirike næringsstoffene
(protein, fett og glukose) kan omdannes til disse substratene.
SVAR: Spørsmålet har utgangspunkt blant annet i figuren under fra forelesning.
Triasylglyserol lages av substratene «3 fettsyrer» + «glycerol-3-fosfoat». Det
forventes ikke at studentene kan navnet på alle enzymene som gjør om disse
triasylglyserol. Det forventes at studenten har reflektert over er at glyseroldelen
krever 3-karbon.
Fettsyrer: Kan tas opp direkte via kosten, syntetiseres fra glukose (glykolysen +
lipogenese), eller ved nedbrytning av aminosyrer i proteiner til acetyl-CoA som kan
inngå i lipogenesen. Ergo, alle de tre energirike næringsstoffene kan omgjøres til
fettsyrer.
Glycerol-3-phosphat: Dannes fra glukose (eller andre karbohydrater)) nedover i
glykolysen. Glyserol-3-P kan også dannes ved nedbrytning av noen aminosyrer i
kosten (det forventes ikke at studentene vet det), men Glyserol-3-P kan ikke lages
fra fettsyrer.
Det betyr at ved lavt inntak av karbohydrater får en lavt substratnivå av glycerol-3P for dannelse av TAG. Av den grunn vil en slik kost legge til rette for mindre
akkumulering av TAG. Ved høy FA-diett vil en få høye nivåer av fettsyrer i blodet
som har andre effekter, hvor noen av disse er muligens ikke så gunstige.
C) Navngi to ulike lipaser og beskriv substratet og produktet de genererer. Det finnes
mennesker med mutasjoner i lipaser, hvor den affiserte lipasen ikke katalyserer
reaksjonen den skal. Noen typer celler/vev vil være mer affisert slike mutasjoner. Forklar
hvorfor.
SVAR: Det er naturlig at studentene her nevner de to lipasene adipose triglycerid lipase
(ATGL) og hormon sensitive lipase (HSL) som bryter ned TAG til henholdsvis DAG og
MAG.
I siste halvdel av spørsmålet må studentene reflektere:
Mennesker med mutasjoner i lipaser vil ha en senere nedbrytning av lipiddråper som
inneholder substratet det normalt bryter ned. Mutasjoner i lipaser vil generelt føre til en
akkumulering av lipider/lipiddråper i ulike vev.
Mutasjoner i ATGL vil hindre nedbrytning av TAG
Mutasjoner i HSL vil hindre nedbrytning av DAG (derav også føre til akkumulering av
TAG) og CE. Fettvev lagrer TAG, makrofager lagrer CE.
A-kandidater kan forventes å nevne noe av dette: Det er først og fremst i vev som normalt
har høy degradering av TAG eller CE en vil få opphopning. I fettvev har en normalt lite
lipolyse (kun ved faste er lipolysen aktiv). Derfor vil det være liten endring i akkumulering
av TAG i fettvevet. Effekten av ATGL mutasjon vil være størst i celler som tar opp
forbrenner mye fettsyrer (hjerte og oksidativ muskel). Effekt av HSL mutasjon vil føre til
akkumulering av DAG og i tillegg føre til opphopning av CE i vev som normalt
akkumulerer disse.
Oppgave 4 (LMG/A+B, SOK/C)
A) Hyperglykemi er vist å øke O-GlcNAcylering av proteiner i celler.
Hva er protein O-GlcNAcylering og hvordan aktiveres det? (Bruk gjerne figur for å illustrere).
SVAR: O-linked GlcNAcylation is a dynamic, transient posttranslational modification that
occurs on many different proteins in the cytoplasm and nucleus, (and mitochondria-ikke
forelest særlig om) affecting protein stability, protein-protein interactions, enzyme activity,
transcription, translation, cell signalling, apoptosis, cell shape. OGT is the enzyme that
confers O-GlcNAc modification of nucleocytoplasmic proteins and this enzyme is a unique
transferase that transferes one single GlcNAc molecule on the amino acids serine and
threonine O-linked (linked to OH-group on R side chain); O-linked GlcNAc. This is more
similar to reversible phosphorylation on ser /thr than classical glycosylation in ER/Golgi.
(Classical glycosylation in the secretory pathway is not dynamic and reversible as O-GlcNAc in
cytosol/nucleus (and mithocondria). Thus, the proteins are constituvely modified and the proteins
are either secreted or localised to membranes (ER, Golgi, plasmamembrane). Dette er forelest av
Svein Olav Kolset).
OGT-mediert O-GlcNAcylering av proteiner aktiveres av næringsstoffer (Glukose,
aminosyrer, fettsyrer) via hexosamine biosynteseveien (hexosamine biosynthetic pathwayfigur fra forelesning)) og dannelse av endepoduktet UDP-GlcNAc (substrat for OGT):
GFAT: L-glutamine:D-fructose-6-phosphate amidotransferase
Emeg32: glucosamine-6-phosphate (GlcN6P) acetyltransferase
O-GlcNAc signaling via OGT/OGA: OGT: O-linked GlcNAc transferase (GlcNAc: N-acetylglucosamine), OGA:
O-GlcNAcase. (For synthesis of glycoproteins, proteoglycans, glycolipids: Transferases in ER-Golgi)
Final product in hexosamin biosynthetic pathway: UDP-GlcNAc, a nucleotide sugar and a coenzyme in
metabolism. It is used by glycosyltransferases to transfer N-acetylglucosamine (GlcNAc) residues Nlinked on proteins (glycoproteins, proteoglycans) and lipids and extensively involved in intracellular
signaling as a substrate for nuclear/Cytoplasmic (and mitochondrial) O-linked Nactetylglucosamine transferases (OGTs) in a wide range of species.
B) I respons på næringstilgang, gi eksempler på mekanismer for aktivering av kjernereseptoren
LXR og målgener LXR regulerer i lever. Bruk gjerne figur for å illustrere.
SVAR: Spørsmålet har utgangspunkt blant annet i figurene under fra forelesning:
LXR er medlem av kjernereseptorfamilien (Nuclear Receptors) og inneholder
konserverte domener vist i figur. Heterodimeriserer med RXR og binder til
enhancer/promoter områder inneholdende DR4 (Direct Repeat) sekvens;
AGGTCAnnnnAGGTCA). Isoformer LXRalfa og beta, forelest at disse har lik sekvens,
men har minst lik sekvens i A/B og D-domenene (se figur), (noe som tyder på at de kan
aktiveres forskjellig og har like samt ulike målgener). Isoformene er ulikt uttrykt i
forskjellig vev. I lever (hepatocytter) spiller LXRalfa en sentral rolle og er sterkest
uttrykt. I respons på næringsstilgang, aktiveres LXR av oxysterol ligand (via LBD) og
glukose metabolisme via hexosaminsyntesevei og O-GlcNAcylering (se over; vårt arbeid
tyder på at dette skjer i ligand–uavhengig N-terminal domene AF-1; dette er det
forelest om). Insulin aktiverer også LXR, men mekanismene er ikke kjent; trolig
dannelse av oxysteroler og/eller fosforylering av LXR. (Insulin via aktivering av
glykolysen kan også bidra til O-GlcNAcylering av LXR). Faste (glukagon) aktiverer
PKA og AMPK og mye tyder på at LXR aktivitet hemmes via AMPK/PKA mediert
fosforylering av LXR.
Fravær av LXR (knock out mus) hemmer de novo lipogenese i lever. LXR er viktig for
transkripsjonell opp-regulering av transkripsjonsfaktorene SREBP1c og ChREBP og
sammen med SREBP1c og ChREBP regulerer LXR lipogene gener i lever i respons på
næringstilgang (insulin, glukose, lipider/oxysteroler) (se figur for målgener).
C) Et tidlig klinisk tegn på nyreforandringer ved diabetes er mikroalbuminuri. Nyrenes
filtreringsenhet, glomeruli, endres ved diabetes, blant ved at basalmembranen fortykkes. I
denne sammenheng har den ekstracellulære matriks viktige funksjoner.
Hvordan bidrar kollagen IV og andre matriskkomponenter, glykert kollagen IV,
proteoglykaner og sulfatering av proteoglykaner til endringer i basalmenbraner i glomeruli i
nyrer hos pasienter med diabetes?
Svar: Fortykket basalmembran skyldes: Økt syntese av kollagen IV og andre matrikskomponenter som fibronektin og laminin.Økt glykering (ikke glykosylering) som gir økt
protease-resistens og lavere turnover. Økt mengde matriks gir økt lagring av vekstfaktorer
som så stimulerer til mer matrikssyntese.Nedsatt proteoglykansyntese gjør at ratio melllom
proteoglykaner og andre matrikskomponenter endres og gjør matriks mer disorganisert og
tykkere.Nedsatt sulfatering av proteoglykaner endrer binding til andre
matrikskomponenter og vekstfaktorer som vil påvirke matriksomsetningen.
Oppgave 5 (Metode/Lab) (KTD/LMG)
A) Luciferase er et enzym som katalyserer denne reaksjonen
Luciferin + O2 -> oxyluciferin + light
Beskriv hvordan vi kan utnytte enzymet Luciferase og denne spesielle egenskapen hos luciferin
til å studere aktiviteten til en promoter.
SVAR: Spørsmålet har utgangspunkt blant annet i figuren under fra forelesning.
En kloner promotoren til et gen inn i en vektor som lager enzymet luciferase (kalles
reporter). I tillegg lager en plasmidet som uttrykker transkripsjonsfaktorene en ønsker
å studere (kalles ekspresjnsplasmider). Deretter får en disse plasmidene inn i celler (ved
hjelp av transfeksjon).
Transkripsjonsfaktorene og aktivering disse av med ligander vil ved binding til
reporteren (i regionen fra klonet promoter) påvirke hvor mye som dannes av enzymet
luciferase. Mengde luciferase enzym vil være proporsjonalt med mengde Luciferin som
metaboliseres og hvor mye lys som dannes. Deteksjon av lyset vil således være et mål på
promotoraktiviteten.
B) Hva er cDNA?
SVAR: cDNA betyr complementary DNA og er en komplementære DNA kopi
syntetisert fra mRNA. (Enzymet som brukes for å syntetisere cDNA fra mRNA er
revers transkriptase (finnes i en hel rekke virus)).
C) Hovedtema for laboratoriearbeidet har vært å arbeide praktisk med ulike
molekylærbiologiske teknikker for å belyse hvordan næringsstoffer regulerer transkripsjon
av gener. For å studere dette har vi arbeidet med lever fra fastede og reforede mus. Genet vi
har arbeidet med er fettsyre syntetase (FAS)
Beskriv hvordan du metodologisk gikk frem for å studere FAS mRNA eller protein.
SVAR: Svarene baserer seg i hovedsak på laboratorieprotokollene (lagt ut i FRONTER)
og laboratoriearbeid labuke 1+2 (uke1: lage cDNA fra mRNA og RT-PCR (Taqman
assay), uke 2: måle protein i prøve med BC assay, fortynne prøver til lik protein
konsentrasjon i alle prøver og Western blotting). Vktig at kandiadatene diskuterer
bruk av kontroller i analysene («houskeeping genes» som ikke reguleres av
faste/reforing og som resultatene kan normaliseres for).