1. No category

Kvantitative genteknologiske analyser
TH-28973 19.03.15
Svein Arne Nordbø
Indikasjoner for kvantitative analyser
• Vurdere klinisk betydning av mikrobefunn gjort
med meget sensitive metoder
• Monitorere grad av viremi før oppstart av
behandling
• Overvåke behandlingseffekt
• Diagnostikk av mutanter
Viktige trinn i analysen
•
•
•
•
•
•
•
Valg av prøvemateriale
Oppbevaring/transport
Nukleinsyreekstraksjon
cDNA syntese
Metodevalg
Standardisering
Tolkning
Prøvemateriale
• Serum/plasma
• EDTA-blod (helblod)
• Hvite blodlegemer
• Spinalvæske
• Andre biologiske materialer
– Nasofarynxaspirat
– Biopsi
– Fæces
Valg av prøvemateriale
• Bygger mye på empiri
• Serum/plasma (HIV, hepatitt B og C virus,
parvovirus B19 m.fl.)
• EDTA-blod (helblod) (CMV og EBV)
• Hvite blodlegemer (CMV og EBV: kopier/105 celler)
• Spinalvæske: sammenlikne konsentrasjoner med
samtidig tatt blodprøve hvis mistanke om defekt
blod/hjernebarriere
• Andre biologiske materialer: Store metodologiske
utfordringer pga forskjell i kvalitet på ulike
materialer
Oppbevaring/transport
• Serum/plasma oppbevares ved kjøleskaps-temperatur
inntil forsendelse
• EDTA-blod oppbevares ved 2-25ºC inntil evt. separasjon
(helst innen 6 t)
• Transporttiden uten nedkjøling bør helst ikke overstige
24 t (gjelder spesielt RNA-virus)
• Unngå om mulig frysetining
• Følg instruksjonene til kommersielle kit-leverandører
• Ved lengre tids lagring (>3 døgn) før analysering skal
prøvene oppbevares ved -70ºC
Nukleinsyre stabilitetstesting
Pakningsvedlegg TM48
Pakningsvedlegg TM48
Pakningsvedlegg TM48
Nukleinsyreekstraksjon
•
•
•
•
•
•
Evt. forbehandling av prøven
Manuell ekstraksjon
Automatisert ekstraksjon
Separat DNA eller RNA ekstraksjon
Kombinert DNA/RNA ekstraksjon (Boom)
Sensitiviteten avhengig av prøvevolum og
elueringsvolum
cDNA syntese (RNA/RT-PCR)
• Random primers
• Evt. tilsetting av spesifikk primer
• Separat trinn eller kombinert med PCRkjøringen (one-step)
Kvantitative metoder
• Signal-amplifikasjonsmetoder
– bDNA
– Hybrid capture
• Templat-ampifikasjonsmetoder
– PCR
• Konvensjonell
• Real-time
• ddPCR
– NASBA
– TMA
• Microarray
Templat-amplifikasjon vs signal-amplifikasjon
Virus,
bacterium
or cell
Target RNA or DNA
TMA
PCR
bDNA
Add primers
& enzymes
Add primers
& enzymes
Copies
(RNA)
Copies
(DNA)
One
detection
probe per
copy
Add target
probes and
amplification
probes
Multiple
detection
probes per
target
One
detection
probe per
amplified
copy
Signal-amplifikasjonsmetoder
• Litt lavere sensitivitet enn gen-amplifikasjonstestene
• Mindre lineært måleområde
• Noe bedre reproduserbarhet (lavere cv)
Ranges of HBV DNA Assays
103
3 x 104 105
Roche (PCR)
AMPLICOR Monitor v2.0
COBAS Monitor v2.0
TaqMan HBV ASR (PCR)
1000–40,000,000
200–200,000
170–640,000,000
Bayer (bDNA)
VERSANT HBV 1.0
VERSANT HBV 3.0
700,000–5,000,000,000
2000–100,000,000
Digene II (Hybrid Capture)
Ultrasensitive
Standard
0
Courtesy of Robert G. Gish, MD.
4700–57,000,000
142,000–1,700,000,000
2
4
6
8
HBV DNA Concentration in Log10 Copies/mL
Chernoff, J Int Assoc Physicians AIDS Care 2002:1:134-40
Templat-amplifikasjonstester
• Meget sensitive og spesifikke metoder
• Varierende korrelasjon mellom ulike testmetoder
• Kontaminasjonsfare
– dUTP/UNG
• Internkontroll
– Spiking med fremmed DNA/RNA før ekstraksjon
• Egne primere (separat kjøring/multiplex)
– Tilsetting av internkontroll til PCR-mix
• Samme primere som målsekvensen
– Deteksjon av ”housekeeping genes”
• Glucose-6-phospate dehydrogenase (G6PDH) m.fl. (DNA)
• Beta-actin m.fl. (RNA)
Inhibisjon
• Revers transkribering (RT) og PCR trinn kan
inhiberes av urenheter i DNA/ RNA eluatet
• Inhibitorer kan stamme fra:
– Prøvematerialet
• Heparin, proteiner (hemoglobin…), polysakkarider, klorofyll,
melanin m.m.
– Nukleinsyre ekstraksjonen
• Detergenter (SDS), fenol, etanol, proteinase K, salter
(guanidinium, natrium acetate…)
Hvordan sjekke for inhibitorer
• Spike med positiv amplicon og vann (kontroll) før PCR
• Spike med positiv amplicon og prøve før PCR
• Spike før RT hvis det er RNA som skal amplifiseres
Ingen inhibisjon
∆ Rn
∆ Rn
Prøve
Kontroll
Inhibisjon
∆ Cq
Cq
Antall sykler
Cq Cq
Antall sykler
Internkontroll med hybridiseringsprober (FRET)
HIV-kvantitering: Korrelasjon mellom NASBA (EASYQ) og PCR (Roche)
Real-time PCR
•
•
•
•
•
•
Like sensitiv som nested PCR
Meget god reproduserbarhet
Betydelig raskere enn konvensjonell PCR
Semikvantitativ metode
Automatisert deteksjon med fluoroforer
Betydelig bedre presisjon og mye større dynamisk
område for kvantitative analyser
• Egner seg godt for multiplex PCR
Kvantitering med real-time PCR
• Hver PCR-syklus genererer dobbelt så mange amplicons
• En 10-folds endring i konsentrasjon tilsvarer 3,3 Ct (23,3)
Standard
•
•
•
•
•
Sekvens med kjent konsentrasjon
Ekstern: Amplifiseres i egen brønn/kapillær
Intern: Amplifiseres sammen med prøven
Eksogen: Tilsettes PCR-mixen
Endogen: Gensekvens som forekommer naturlig i
prøvematerialet (for eksempel housekeeping genes som
G6PDH)
Standard (forts.)
• Heterolog: Forskjellig sekvens som amplifiseres med
forskjellige primere
• Homolog: Minimal forskjell fra målsekvensen.
Amplifiseres med de samme primerene
• Kalibrator: Brukes til å justere verdiene pga lotvariasjoner (kalkulerte verdier divideres med verdien til
kalibratoren)
Retningslinjer for preparering av standarder
• Den amplifiserte sekvensen bør være homolog med
målsekvensen
• DNA
– Lineært plasmid
– Renset PCR-produkt
• RNA
– Syntetisk in vitro transkribert RNA
Beregning av konsentrasjon
Beregning av molekylvekt (MW)
Beregning av mengde
Standardkurve
• Ved bruk av eksterne standarder må amplifikasjonseffektiviteten være den samme som for målsekvensen
• En intern positiv kontroll kan kompensere for evt.
inhibisjon
• Fit points method
– Brukeren setter baseline selv
– Nyttig ved bakgrunnsstøy og problematisk standardkurve
• Second derivative maximum method
– Automatisert kalkulasjon
– Bruker kan evt. fjerne ”outlayers” blant replikater av hver enkelt
standard
Kvantitative metoder
• Absolutt kvantitering
– Med ekstern standard
– Med ekstern standard og intern positiv kontroll
• Relativ kvantitering
– Relatert til konsentrasjon av housekeeping gene
Digital droplet PCR (ddPCR)
• Ny teknikk som distribuerer ekstrahert DNA i meget
små (nano) dråper (olje-emulsjon)
• Måler fluorescens-intensitet i hver dråpe etter
amplifiseringen (endepunkts-PCR)
• Beregner templatmengden ved hjelp av Poissonstatistikk uten bruk av ekstern standard
• Meget god presisjon og reproduserbarhet (lav cv)
• Høy sensitivitet, men lavere dynamisk måleområde
enn real-time PCR
• Kostbar teknikk som fortsatt sliter med noen
«barnesykdommer»
Deteksjon av mutanter med ddPCR
Fig. 2 Detection of rare mutant alleles in a background of wild-type DNA by digital PCR. (A) In
conventional qPCR, mutant and wild-type alleles are mixed together in one bulk reaction
where rare mutants compete for reagents with more abundant wild-type DNA...
Ruth Hall Sedlak , Keith R. Jerome
Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction
Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, Volume 75, Issue 1, 2013, 1 - 4
http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2012.10.009
Klinisk anvendelse av kvantitative metoder
• Nytteverdi
• Utfordringer
Cumulative Incidence of HCC (%)
Baseline HBV DNA Level and
Cumulative Incidence of HCC
Entire Cohort (REVEAL Study)
16
14.89
14
12.17
12
N = 3653, 13-year follow-up
10
8
6
3.57
4
0
1.37
1.3
2
<300
300–<104
1IU = ~5 copies/mL
Chen C-J, et al. JAMA. 2006;295:65.
104–<105
105–<106
HBV DNA (Copies/mL)
≥106
Baseline HBV DNA Level and Cumulative
Incidence of HCC
Cumulative Incidence of HCC (%)
Subgroup of Noncirrhotic HBeAg– Patients with Normal ALT
16
13.50
14
12
N = 2925
10
7.96
8
6
4
2
0
3.15
0.89
0.74
<300
300–<104
Chen C-J, et al. JAMA. 2006;295:65.
104–<105
105–<106
HBV DNA (Copies/mL)
≥106
Viral Load Testing
Copies/mL to IUs*
Assay
Conversion Factor
Versant HBV DNA 3.0 (bDNA)
5.2 copies/mL = 1 IU/mL
Cobas Amplicor HBV Monitor
5.6 copies/mL = 1 IU/mL
Cobas TaqMan 48 HBV
5.8 copies/mL = 1 IU/mL
1 pg = 283,000 copies
*Conversion factors given by the manufacturers.
Zeuzem S. Methods Mol Med. 2004;95:3.
EBVgenom
Niesters et al. J Clin Microbiol. 2000;38:712-5.
Viral load as a marker for disease activity
– a negative viral load does
not exclude
PTLD
– a high viral load does not
prove PTLD
p < 0 ,0 0 0 1
10
E B V -c op ies /µ g D N A
• Viral load is significantly
higher in patients with
PTLD vs. patients without
• single cases prove the
opposite:
8
10 7
10 6
10 5
10 4
10 3
10 2
P atien ts w ith ou t P TL D
P atien ts w ith P TL D
Gärtner et al., J Clin Microbiol 2002;40:351
Journal of Clinical Virology 41 (2008) 45–48
The median time interval between NPAs taken at admission
and discharge was 7 (2–15) days, while the median interval
between admission and the first medical visit after discharge
was 21 (17–29) days.
Kasus
1 år gammel jente
Normal fødsel og utvikling
Plaget med kolikksmerter
Begynt i barnehage i januar 2007
Etter dette gastroenteritt 3 ganger, 1. gang påvist
norovirus
Siste 6 dager oppkast og diarè, hoste, tp. 40,5 ved
innleggelse, lettere dehydrert
Funn
• Nasofarynksaspirat
–
–
–
–
Humant metapneumovirus (Ct 41,0)
Adenovirus (Ct 36,4)
Humant bocavirus (Ct 26,6)
Hemophilus influenzae (middels vekst)
• Fæces
– Humant bocavirus (Ct 34,1)
– og rotavirus…….
Konklusjon
• Kvantitative analyser får stadig større betydning for
diagnostikk og behandling av infeksjoner
• Fortsatt noe mangelfull standardisering av metoder
• Internasjonale standarder mangler for mange agens
• Korrelasjon til klinikk kan være en utfordring
• Kvantiteringer utført ved ett laboratorium kan ikke uten
videre sammenlignes med kvantiteringer utført ved et
annet laboratorium
• Pasienter bør om mulig følges opp med samme metode
utført ved samme laboratorium
Oppgave: Er denne pasienten HBV-DNA positiv?