1. No category

-1-
Molekylære metoder i medisinsk mikrobiologi.
Laboratorieøvelser tirsdag 17.mars.
Øvelser:
1. Ekstraksjon av nukleinsyrer ved varmelysering (S. aureus)
2. DNA-isolering med Qiagen kolonne (to prøver: stafylokokk og en gruppe B
streptokokk).
3. Konvensjonell PCR for påvisning av mecA og nuc.
4. Realtime PCR med Evagreen-mastermiks for påvisninig av ETEC
Øvelse 1: Varmelysering
En S. aureus til MRSA-undersøkelse spredd på blodagar er utgangspunktet
(renspredning fra en koloni)






200 µl MBG-vann tilsettes et 1,5 ml eppendorf rør
3-4 kolonier fra renspredning på blodagar tilsettes røret med bakterieøse
Sett røret på varmeblokk med risting på 95 ºC i 15 min.
Sentrifuger eppendorf rørene ved 14500 rpm i 2 min.
Overfør 100 µl av supernatanten til et nytt eppendorfrør (unngå bunnfallet)
Prøven fortynnes deretter 1:10 (5 µl lysat + 45 µl vann) og videre til 1:100 (5 µl
av 1:10 fort.+ 45 µl vann) til PCR. (Benyttes videre i øvelse 3). Merk rør.
Øvelse 2: DNA-isolering ved Qiagen kolonne
Hver gruppe mottar 2 prøver ferdig enzym- og varmebehandlet som beskrevet på
side 5.
 Prøve 1 (GBS) skal etter DNA isolering med qiagen kolonne benyttes videre i
øvelse 7 (real-time Taqman PCR i morgen).
 Prøve 2a eller 2b (to ulike stafylokokker, halvparten av gruppene får den ene
og den andre halvparten får den andre prøven). Denne prøven skal etter DNA
isolering med qiagen kolonne benyttes videre i øvelse 3 (konvensjonell PCR
for påvisning av MecA og Nuc i dag).
-2Prosedyren som følger med reagenspakken til Qiagen kolonnen følges. Start på
punkt fire i prosedyren. I punkt 7 skal det elueres i 100 µl i stedet for 200 µl AE buffer.
Punkt 8 ikke nødvendig å utføre fordi vi skal ha rikelig med DNA i prøven.
Etter ekstraksjon skal prøve 1 oppbevares i kjøleskap til i morgen. Prøven merkes
godt med gruppenavn. Denne skal benyttes til real-time PCR for GBS (øvelse 7).
-3-
Øvelse 3: Konvensjonell PCR for påvisning av mecA og nuc
PCR instrument: Bio-Rad T100 Thermal cycler
Prinsipp: Konvensjonell PCR med påfølgende gelelektroforese av PCR produkt.
Metoden vil påvise genene mecA og nuc
PCR produkt størrelse:
mecA 533 bp
nuc 279 bp
Reaksjonsmiks til 6 prøver UTEN polymerase blir utlevert og inneholder:
Reaksjonsmiks pr. prøve:
5,0µl dNTP (1mM)
2,0µl mecA sense (10 µM)
2,0µl mecA antisense (10 µM)
2,0µl nuc sense (10 µM)
2,0µl nuc antisense (10 µM)
5,0µl 10×PCR bufferI m/15mM MgCl
29,5µl MBG-vann
_______________
Fremgangsmåte
 3 µl AmpliTaq Gold (polymerase) tilsettes reaksjonsmiksen utdelt. Bland godt!
 Merk 5 PCR rør med nr. og gruppenavn
 Fordel 48µl reaksjonsmix til hvert PCR-rør
 Tilsett deretter 2 µl prøve pr. PCR rør og bland. Oppsett som beskrevet under:
PCR oppsett:
1. 1:10 fortynning av varmelysert S. aureus
2. 1:100 fortynning av varmelysert S. aureus
3. Prøve 2a eller 2b fra DNA isolering Qiagen kolonne
4. Negativ kontroll (dH2O)
5. Positive kontroll (CCUG 60578)
Rørene settes over i PCR-maskin
PCR program
1. 94 °C i 15 min (aktivering av ampliTaq Gold)
2. 94 °C i 20 sek
3. 55 °C i 20 sek
4. 72 °C i 15 sek
Trinn 2-4 repeteres totalt 35 cykler
5. 72 °C i 7 min (ekstra elongering)
6. 4 °C ∞
-4-
Øvelse 4:
Realtime PCR med Evagreen-mastermiks for påvisning av ETEC
PCR instrument: CFX 96
Prinsipp: Realtime PCR med Evagreen -mastermiks med smeltepunktsanalyse.
Genene LT (varme-labilt enterotoksin) og STh/STp (varme-stabilt enterotoksin)
påvises.
Smeltetemperaturer:
Sth/p smeltepunkt 75,5 °C ± 1
Lt smeltepunkt 80,5 °C ± 0,5
PCR-produkt:
Varmelabilt enterotoksin LT:
Varmestabilt enterotoksin STp:
Varmestabilt enterotoksin STh:
273 bp
166 bp
120 bp
Hver gruppe får utdelt ETEC reaksjonsmiks til 5 prøver, positiv kontroll og en av
prøvene 3a, 3b eller 3c. Reaksjonsmiksen inneholder:
Reaksjonsmiks pr. prøve:
10 µl SsoFast EvaGreen Supermix
1 µl Lt sense (6 µM)
1 µl Lt antisense (6 µM)
1 µl STp sense (6 µM)
1 µl STp antisense (6 µM)
1µl STh sense (6 µM)
1 µl STh antisense (6 µM)
2 µl MBG-vann
Fremgangsmåte
 Fordel 18 µl reaksjonsmiks pr. prøve i PCR-strips.
 Tilsettes 2 µl templat og bland. Oppsett som beskrevet under.
 Sett på lokk (strimmel) ved hjelp av egnet verktøy. Ikke ta på den del av lokket
som dekker prøver. Fluorescensavlesning i PCR maskin skjer gjennom lokket.
 Merk strips med gruppenavn helt på enden.
Oppsett av prøver:
1. Prøve 3a, 3b eller 3c ufortynnet
2. Prøve 3a, 3b eller 3c 1:10 fortynnet
3. Negativ kontroll (MBG-vann)
4. Positiv kontroll (CCUG 38079)
PCR-program
1. 98 °C i 2 min
2. 98 °C i 2 sek
3. 57 °C i 5 sek
Trinn 2-3 repeteres totalt 40 cykler.
Smeltepunktsanalyse:
65 °C til 90 °C med økning på 0,2 °C pr. 10 sek.
-5-
Behandling utført på forhånd med prøver som skal ekstraheres på
Qiagen Spinkolonne
1. En koloni bakterier slemmes opp i 200 µl TE-buffer.
 Stapfylokokker: tilsettes 20 µl Proteinase K og 10 µl Lysostahin
 Gruppe B streptokokker: tilsettes 15 µl Lysozyme, 5 µl Proteinase K og
5 µl Mutanolysin.
2. Inkuber 15 min. ved 37 ºC
3. Inkuber 15 min. ved 65 ºC