Kvantitative analyser praktiske eksempler Kommersielle kvantitative analyser ved St. Olav • Tre kommersielle kvantitative metoder fra Roche – Hepatitt B COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV Test, v2.0 Prøvemateriale: 650 µl plasma eller serum Måleområde: 20 – 170 000 000 IU/ml – Hepatitt C COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 Prøvemateriale: 650 µl plasma eller serum Måleområde: 15 – 10 000 000 IU/ml – HIV-1 COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1 Test, v2.0 Prøvemateriale: 1000 µl Plasma Måleområde: 20 – 10 000 000 kopier/ml Kommersielle kvantitative analyser St. Olav • Samme instrumenter benyttes til alle kommersielle kvantitative analyser ved St. Olav • Manuell forbehandling først: – – – – • COBAS Ampliprep: – – COBAS® AmpliPrep Instrument (Roche) • Nukelinsyreekstraksjon PCR setup COBAS TaqMan 48 – COBAS® TaqMan® 48 Analyzer (Roche) Sentrifugering (1000 g 20 min) Avpipettering serum/plasma Evt. oppbevaring kjøl/frys Pipettering av riktig testvolum i spesialrør for Ampliprep. Realtime PCR • Gir ut IU/ml og kopier/ml for HCV og HBV. HIV test kun kopier/ml • Resultater ferdige innen 1 arb. dag. Snart nytt instrument Cobas 6800 • Helautomatisk – – – – Innsett av primærrør mulig Prøvefordeling Prøvepreparering PCR og deteksjon • Kobles til LIS Vant anbud om kvantitative analyser Samme produsent av kit: Roche Alle kommersielle kvantitative analyser skal overføres (HBV,HCV,HIV1) – Automatisk arbeidsliste – Automatisk svaroverføring mulig • Ett oppsett ferdig på 3,5 timer Egenutviklede kvantitative analyser ved St. Olav • Cytomegalovirus (CMV) • Epstein barr virus (EBV) Begge ble utviklet i 2001 av Spesialbioingeniør Sidsel Krokstad Hva må valideres for egenutviklede kvantitative tester? • • • • • Valg av target, primer og probe Sensitivitet (deteksjonsgrense) Spesifisitet Effektivitet Presisjon – Repeterbarhet (innen serie) – Reproduserbarhet (mellom serier) – Presisjon mellom ulike instumenter • Sporbarhet (standarder og kontroller) • Metodebegrensninger • Nøyaktighet – Sann konsentrasjon (internasjonale standarder, SLP) • Linearitet • Måleområde • Holdbarhet prøvemateriale og reagenser • Robusthet • Interferens • Konverteringsfaktor kopier/ml IU/ml Anbefalt artikkel om metodevalidering for PCR analyser Etablering av kvantitativ CMV realtime PCR i 2001 • Ingen test kommersielt tilgjengelig • Ingen standard kommersielt tilgjengelig • Strategivalg??? • Etablert en FRET realtime PCR på Lightcycler med målgen: glycoproteinB • Validert for prøvemateriale: fullblod (EDTA) • Ekstraksjon: NucliSENSE easyMAG (BioMèrieux) – Ekstraksjonvolum: 100 µl, elueringsvolum: 55 µl Egenprodusert CMV-standard Fremgangsmåte • • PCR produkt fra CMV-PCR ble klonet for bruk til standard Utført med kit for TA-kloning (Promega) By Vishnu2011 (Own work) [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0) or GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html)], via Wikimedia Commons • Dyrket opp i kompetente E.coli etter transformasjon • Verifiserte at klon hadde riktig innsett CMV PCR produkt med sekvensering • Plasmid ble isolert og DNA konsentrasjon målt og antall molekyler ble beregnet vha. Avogadros tall • Titreringsrekke (10-fold fortynninger) – Tre paralleller av hver fortynning – Fem fortynninger • Kalibrert med materiale fra QCMD EBV kvantitativ PCR etablert 2001 • Ingen test kommersielt tilgjengelig • Ingen standard kommersielt tilgjengelig • Strategi?? • Etablert en realtime Taqman PCR med målgen LMP1 på lightcycler • Validert for prøvemateriale: fullblod (EDTA) • Ekstraksjon: NucliSENSE easyMAG (BioMèrieux) – Ekstraksjonvolum: 100 µl, elueringsvolum: 55 µl • Første kvantitative EBV test i Norge Egenprodusert EBV standard initialt • Forsøkte å klone PCR-produkt flere ganger uten suksess. • Bestilte syntese av oligonukleotid (75nt)tilsvarende PCR-produktet • Laget standardkurve • Kalibrerte med kvantitert materiale mottatt fra Sverige CMV og EBV kvantitering dagens metoder • Prøver analyseres først med kvalitativ PCR – – – – • • Endret standarder til helvirus standarder (standard må være lik prøve i effektivitet) – – CMV ad 169 (referansestamme) EBV positiv cellelinje: Daudi – Kjørt inn standardkurve i 5 fortynninger for begge analysene Fremgangsmåte – – – – – – • Enklere utførelse Validert for flere prøvematerialer Litt mer sensitiv (CMV) Unntak ved kjent positiv som kontrolleres ukentlig en periode – rett til kvantitativ test Prøver og positiv kontroll settes opp i triplikat Gjennomsnitt av ct-verdi benyttes videre Dersom gjennomsnitts Ct for kontroll ikke er innen satte grenseverdier – standardkurve kan ikke brukes feilsøking! Dersom kontroll ok: benyttes gjennomsnittlig Ct til å beregne konsentrasjon av CMV eller EBV i kopier/ml ut ifra standardkurve lagret i Excel Resultat skal kontrolleres av erfaren bioing. og lege før besvaring Internkontroll: humant husholdningsgen i parallell PCR reaksjon Eksternt kvalitetskontrollpanel fra QCMD (quality control for molecular diagnostics) årlig – krav for akkrediterte analyser Standardkurve i Excel Hvorfor benytte IU/ml? • Hensikt: standardisere kvantitative PCR resultater og gjøre dem sammenlignbare ved bruk av ulike metoder • Gjør det mulig å sammenligne deteksjonsgrenser mellom ulike teknikker • Enklere å utføre multisenterstudier • Kan sammenligne resultat hos en pasient ved oppfølging to ulike steder – I praksis ikke helt enkelt likevel men tester blir stadig bedre (mange faktorer spiller inn) Hvordan standardisere med IU/ml? • Måle en standard med kjent sann konsentrasjon (internasjonal standard) som en prøve mot laboratoriets standard (sekundærstandard) • Resultat med laboratoriets test i kopier/ml – Korreksjonsfaktor beregnes • Spesifikk for laboratoriets kombinasjon av prøvematriks og ekstraksjon/amplifikasjonsplattform. Hvordan standardisere med IU/ml? Eksempel for CMV: WHO-standard skal fortynnes 1:10 i prøvematriks som benyttes og fordeles og analyseres x3 i 4 dager på rad Eks. Gjennomsnitt av de 12 resultatene blir 3,08E+05 kopier/ml og beregnes korreksjonsfaktor ved: Sann verdi til internasjonal standard./gjennomsnitt egen analyse: (5x105)/(3,08x105)=1,622 Eks.20.000kopier/ml x 1,622= 32440 IU/ml Bli kjent med metoden din viktige valideringsparametre Lineært område/måleområde Presisjon • Viktig å kunne skille forskjeller i testresultat som skyldes sanne biologiske endringer hos pasient fra metodeforskjeller som skyldes teknisk testvariasjon • Angis som CV (variasjonskoeffisient) Oppsummering • En pasient bør fortsatt om mulig følges opp med samme metode utført ved samme laboratorium med samme prøvemateriale • Resultater i kopier/ml er ikke direkte sammenlignbare mellom laboratorier pga. manglende standardisering • Ved overvåkning av pasienter er det viktig å følge trender i kopitall i stedet for enkeltundersøkelser på grunn av testens presisjon – ikke ta prøver oftere enn hver 5-7 dag
© Copyright 2024