Kvantitative analyser
praktiske eksempler
Kommersielle kvantitative analyser
ved St. Olav
• Tre kommersielle kvantitative metoder fra Roche
– Hepatitt B
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV Test, v2.0
Prøvemateriale: 650 µl plasma eller serum
Måleområde: 20 – 170 000 000 IU/ml
– Hepatitt C
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0
Prøvemateriale: 650 µl plasma eller serum
Måleområde: 15 – 10 000 000 IU/ml
– HIV-1
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1 Test, v2.0
Prøvemateriale: 1000 µl Plasma
Måleområde: 20 – 10 000 000 kopier/ml
Kommersielle
kvantitative analyser St. Olav
•
Samme instrumenter benyttes til alle kommersielle
kvantitative analyser ved St. Olav
•
Manuell forbehandling først:
–
–
–
–
•
COBAS Ampliprep:
–
–
COBAS® AmpliPrep Instrument (Roche)
•
Nukelinsyreekstraksjon
PCR setup
COBAS TaqMan 48
–
COBAS® TaqMan® 48 Analyzer (Roche)
Sentrifugering (1000 g 20 min)
Avpipettering serum/plasma
Evt. oppbevaring kjøl/frys
Pipettering av riktig testvolum i spesialrør for
Ampliprep.
Realtime PCR
•
Gir ut IU/ml og kopier/ml for HCV og HBV. HIV test
kun kopier/ml
•
Resultater ferdige innen 1 arb. dag.
Snart nytt instrument
Cobas 6800
• Helautomatisk
–
–
–
–
Innsett av primærrør mulig
Prøvefordeling
Prøvepreparering
PCR og deteksjon
• Kobles til LIS
Vant anbud om kvantitative analyser
Samme produsent av kit: Roche
Alle kommersielle kvantitative analyser
skal overføres (HBV,HCV,HIV1)
– Automatisk arbeidsliste
– Automatisk svaroverføring
mulig
• Ett oppsett ferdig på 3,5
timer
Egenutviklede kvantitative analyser
ved St. Olav
• Cytomegalovirus (CMV)
• Epstein barr virus (EBV)
Begge ble utviklet i 2001 av Spesialbioingeniør
Sidsel Krokstad
Hva må valideres for egenutviklede
kvantitative tester?
•
•
•
•
•
Valg av target, primer og probe
Sensitivitet (deteksjonsgrense)
Spesifisitet
Effektivitet
Presisjon
– Repeterbarhet (innen serie)
– Reproduserbarhet (mellom
serier)
– Presisjon mellom ulike
instumenter
• Sporbarhet (standarder og
kontroller)
• Metodebegrensninger
• Nøyaktighet
– Sann konsentrasjon
(internasjonale standarder, SLP)
• Linearitet
• Måleområde
• Holdbarhet prøvemateriale og
reagenser
• Robusthet
• Interferens
• Konverteringsfaktor kopier/ml
 IU/ml
Anbefalt artikkel om metodevalidering
for PCR analyser
Etablering av kvantitativ CMV realtime
PCR i 2001
• Ingen test kommersielt tilgjengelig
• Ingen standard kommersielt tilgjengelig
• Strategivalg???
• Etablert en FRET realtime PCR på Lightcycler med målgen:
glycoproteinB
• Validert for prøvemateriale: fullblod (EDTA)
• Ekstraksjon: NucliSENSE easyMAG (BioMèrieux)
– Ekstraksjonvolum: 100 µl, elueringsvolum: 55 µl
Egenprodusert CMV-standard
Fremgangsmåte
•
•
PCR produkt fra CMV-PCR ble
klonet for bruk til standard
Utført med kit for TA-kloning
(Promega)
By Vishnu2011 (Own work) [CC BY-SA 3.0
(http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0) or GFDL
(http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html)], via Wikimedia Commons
•
Dyrket opp i kompetente E.coli etter
transformasjon
•
Verifiserte at klon hadde riktig innsett
CMV PCR produkt med sekvensering
•
Plasmid ble isolert og DNA
konsentrasjon målt og antall molekyler
ble beregnet vha. Avogadros tall
•
Titreringsrekke (10-fold fortynninger)
– Tre paralleller av hver fortynning
– Fem fortynninger
•
Kalibrert med materiale fra QCMD
EBV kvantitativ PCR etablert 2001
• Ingen test kommersielt tilgjengelig
• Ingen standard kommersielt tilgjengelig
• Strategi??
• Etablert en realtime Taqman PCR med målgen LMP1 på lightcycler
• Validert for prøvemateriale: fullblod (EDTA)
• Ekstraksjon: NucliSENSE easyMAG (BioMèrieux)
– Ekstraksjonvolum: 100 µl, elueringsvolum: 55 µl
• Første kvantitative EBV test i Norge
Egenprodusert EBV standard initialt
• Forsøkte å klone PCR-produkt flere ganger
uten suksess.
• Bestilte syntese av oligonukleotid
(75nt)tilsvarende PCR-produktet
• Laget standardkurve
• Kalibrerte med kvantitert materiale mottatt
fra Sverige
CMV og EBV kvantitering
dagens metoder
•
Prøver analyseres først med kvalitativ PCR
–
–
–
–
•
•
Endret standarder til helvirus standarder (standard må være lik prøve i effektivitet)
–
–
CMV ad 169 (referansestamme)
EBV positiv cellelinje: Daudi
–
Kjørt inn standardkurve i 5 fortynninger for begge analysene
Fremgangsmåte
–
–
–
–
–
–
•
Enklere utførelse
Validert for flere prøvematerialer
Litt mer sensitiv (CMV)
Unntak ved kjent positiv som kontrolleres ukentlig en periode – rett til kvantitativ test
Prøver og positiv kontroll settes opp i triplikat
Gjennomsnitt av ct-verdi benyttes videre
Dersom gjennomsnitts Ct for kontroll ikke er innen satte grenseverdier – standardkurve kan ikke brukes  feilsøking!
Dersom kontroll ok: benyttes gjennomsnittlig Ct til å beregne konsentrasjon av CMV eller EBV i kopier/ml ut ifra standardkurve
lagret i Excel
Resultat skal kontrolleres av erfaren bioing. og lege før besvaring
Internkontroll: humant husholdningsgen i parallell PCR reaksjon
Eksternt kvalitetskontrollpanel fra QCMD (quality control for molecular diagnostics) årlig – krav for akkrediterte
analyser
Standardkurve i Excel
Hvorfor benytte IU/ml?
• Hensikt: standardisere kvantitative PCR resultater og gjøre
dem sammenlignbare ved bruk av ulike metoder
• Gjør det mulig å sammenligne deteksjonsgrenser mellom
ulike teknikker
• Enklere å utføre multisenterstudier
• Kan sammenligne resultat hos en pasient ved oppfølging to
ulike steder
– I praksis ikke helt enkelt likevel men tester blir stadig bedre
(mange faktorer spiller inn)
Hvordan standardisere med IU/ml?
• Måle en standard med kjent sann
konsentrasjon (internasjonal standard) som en
prøve mot laboratoriets standard
(sekundærstandard)
• Resultat med laboratoriets test i kopier/ml
– Korreksjonsfaktor beregnes
• Spesifikk for laboratoriets kombinasjon av prøvematriks
og ekstraksjon/amplifikasjonsplattform.
Hvordan standardisere med IU/ml?
Eksempel for CMV:
WHO-standard skal fortynnes 1:10 i prøvematriks som
benyttes og fordeles og analyseres x3 i 4 dager på rad
Eks.
Gjennomsnitt av de 12 resultatene blir 3,08E+05 kopier/ml
og beregnes korreksjonsfaktor ved:
Sann verdi til internasjonal standard./gjennomsnitt egen analyse:
(5x105)/(3,08x105)=1,622
Eks.20.000kopier/ml x 1,622= 32440 IU/ml
Bli kjent med metoden din
viktige valideringsparametre
Lineært område/måleområde
Presisjon
• Viktig å kunne skille forskjeller i
testresultat som skyldes sanne
biologiske endringer hos pasient
fra metodeforskjeller som skyldes
teknisk testvariasjon
• Angis som CV
(variasjonskoeffisient)
Oppsummering
• En pasient bør fortsatt om mulig følges opp med
samme metode utført ved samme laboratorium
med samme prøvemateriale
• Resultater i kopier/ml er ikke direkte
sammenlignbare mellom laboratorier pga.
manglende standardisering
• Ved overvåkning av pasienter er det viktig å følge
trender i kopitall i stedet for enkeltundersøkelser på
grunn av testens presisjon – ikke ta prøver oftere
enn hver 5-7 dag