Amplifikasjonsteknikker
- PCR
2015
Jan Egil Afset
Amplifikasjonsmetoder
• Signalamplifikasjon
– bDNA, hybrid capture
• Target amplifikasjon
– PCR
– Mange andre metoder
• Probeamplifikasjon
– Eks: Ligase chain reaction
2
Tema- PCR
•
•
•
•
•
•
•
•
Prinsipp
Reagenser
Amplifikasjonsbetingelser
Påvisning av PCR-produkt
Real-time PCR
Kvalitetskontroll
Varianter av PCR
Etablering av ny PCR
3
PCR metoder
Konvensjonell PCR
Amplifikasjon og deteksjon i
to operasjoner,
gelelektroforese
Real-time PCR
Amplifikasjon og
deteksjon i samme rør,
bruk av fluorescens
4
PCR-prinsipp
Målsekvens
+ buffer (MgCl, KCl etc)
Termocykling
5
Nukleotider
• Nucleotider – dNTP’er
– Tilsettes vanligvis i ekvimolar konsentrasjon
– Vanligvis 200-500 µM av hver nukleotid
6
DNA Polymerase
• Termostabile (Taq) DNA polymeraser
– 5’-3’ DNA polymerase (50-60 nukleotider/sek)
– 5’-3’ exonuklease
– Mangler 3’-5’ exonuklease (”proofreading”-aktivitet -feilfrekvens 1:104
baser)
– Tp optimum 72 C
– Amplifikasjon av fragment opp til 2-4 kb
5’
5’ 3’
3’
”Effektivitet”
-hvor hurtig (5-100nt/ sek)
-hvor langt
”Fidelity”
- nøyaktighet
7
Andre typer polymeraser
• Revers transkriptase (RT-PCR)
• Proofreading enzymer (high fidelity)
• Polymeraser for ”long range PCR” (5->20 kbp)
• Klenow fragment (DNA polymerase I, mangler 5’-3’
eksonuklease)
8
Reaksjonsmiks
• Rolle
– Sikre at DNA-polymerasen jobber mest mulig
effektivt (sensitivitet)
– Sikre at mest mulig spesifikk binding av primere
til target (spesifisitet)
• Flere ulike tilsetninger kan benyttes for å
forbedre PCRens sensitivitet og effektivitet
• Kommersielle DNA polymeraser kommer
med optimalisert reaksjonsmiks
9
Reaksjonsmiks
• MgCl2
– Mg2+ er kofaktor for Taq DNA polymerasen
(konsentrasjonsavhengig effekt)
– Mg2+ stabiliserer dobbelttrådet DNA inkludert uspesifikke primertemplat-bindinger
• Effekt av Mg2+
– Lav konsentrasjon fører til at Taq polymerasen blir mindre
effektiv
– Høy konsentrasjon fører til at DNA polymerasen blir mindre
nøyaktig (fidelity)
• Hvilken konsentrasjon er best?
–
–
–
–
Vanligvis benyttes konsentrasjoner fra 0,5-5mM
Krever evt optimalisering I laboratoriet
Ekvimolar binding mellom Mg2+og nukleotider (dNTP)
Kun fritt Mg2+ er tilgjengelig for DNA polymerasen
10
Reaksjonsmiks
• Buffer Tris-HCl (pH 6,8-8,3)
– For å stabilisere pH
– pH varierer med temperatur
• Påvirker nøyaktigheten av polymerasen
• lavere pH ved høyere temperatur- forbedret
nøyaktighet ved lav pH (accuracy)
• KCl
– Påvirker primer-templat binding under annealing
• For høy konsentrasjon kan føre til uspesifikke produkter
11
Termosykling
Denaturering (94-96ºC)
Ekstensjon (72ºC)
Annealing (50-65ºC)
12
Denaturering
• Initiell denaturering (hotstart prinsipp)
– Aktivering av Taq DNA polymerasen
– Sikre fullstendig denaturering av genomisk DNA i
templat før start av PCR amplifikasjon
• Kort denatureringstrinn i starten av hver PCRsykel
– Denaturering av PCR produkt
• Denatureringstiden bør være så kort som mulig for
å unngå at DNA polymerasen svekkes
13
Annealing
Smeltetemperatur (Tm)
• Valg av annealing temperatur
avhenger av primer-lengde og GCinnhold
– optimal Tp vanligvis 5 °C lavere enn
primer Tm
– Ved for lav Tp- uspesifikk binding
– Ved for høy Tp- lite eller ingen
amplifikasjon
• Annealing- tid
– For lang- risiko for uspesifikke PCRprodukter
– For kort- redusert sensitivitet
14
Elongering/ ekstensjon
• Optimal Tp 72 °C for de fleste DNApolymeraser
• Tid avhenger av lengden av PCR
produktet
– Lengre produkt krever lengre elongeringstid
15
Antall cykler
• Antall cykler som er nødvendig avhenger av
konsentrasjonen av DNA templatet
– Konvensjonell PCR: 25-35 cykler
– Real-time PCR: 40-50 cykler
• For mange cykler kan resultere i uspesifikke
produkter
• For få cykler kan resultere i for liten mengde
produkt
16
Reagenser før og etter 30 cykler
Initialt
Reagens
Konsentrasjon
Etter 30 cycler
Ratio til
templat
Konsentrasjon Ratio til templat
Ratio vs amplifisert
fragment
Humant genomisk DNA
5fM
1
5fM
1
10-6
PCR target
5fM
1
5nM
106
1
Hver primer
0,5µM
108
0,495µM
108
99
Hver dNTP
50µM
1010
2x105
48µM
9,5x109
2x105
9,5x103
Taq DNA polymerase
1nM
1nM
0,2
17
PCR amplifikasjon
18
Termocykler
• Oppvarming/ kjøling
– metallblokk (peltier device)
– Oppvarming tar tid: 1-2ºC/sek
– Oppvarming i luft er raskere
– tp-variasjon i blokken?
• Varme i lokket
• Tp-gradient analyse
– Eks 50 – 65 ºC
• ”Ramping”
– Hvor raskt oppvarming/ nedkjøling foregår
– Kan endres
19
20
Påvisning av PCR-produkt
• Gelelektroforese
– Agarose gel 1-4% kokes, kjøles til
60ºC, støpes
– Buffer (Tris/ TBE)
IPGRI and Cornell
University, 2003
– Strømkilde
– Gelkjøring ca 0,5-2 t
– Farging
• Ethidiumbromid
• SybrGreen/ SybrGold
• GelGreen/ GelRed
– Foto av gel under UV-lys
• Fluorescens
21
Påvisning av PCR-produkt
Standard Prøve 1 Prøve 2
Pos ktr
Neg ktr Standard
Analyse av PCR
produkt størrelse
•Positiv kontroll
•Negativ kontroll
•Standard
22
Påvisning av PCR-produkt
• Andre metoder
– Kapillær gelelektroforese
på mikrochip
(Bioanalyzer)
– Massespektrometri
• Mass tags
– DNA enzyme
immunoassy (DEIA)
• Anti-dDNA antistoff
23
Påvisning av PCR-produkt
Brandal et al. 2007
• Kapillærelektroforese
– Fluorescensmerkete primere
– Godt egnet til deteksjon ved multipleks PCR
• Verifisering av PCR-produkt
– sekvensering, Southern blot
24
Varianter av PCR
•
•
•
•
•
•
•
Hotstart PCR
Revers transkriptase PCR (RT-PCR)
Multiplex PCR
Nested PCR
Touchdown PCR
Broad-range PCR
Realtime PCR
25
Hot-start PCR
• Formål: Unngå ikkespesifikk amplifikasjon
Tilsette eller
aktivere polymerase
• Metoder
– Tilsette polymerase ved høy
temperatur
– Inaktiv DNA polymerase
• kjemisk modifisert
• spesifikke antistoffer
• aktivering ved oppvarming
– Bruk av voks
• DNA polymerase skilt fra
mix med voks
26
Revers transkriptase PCR
(RT-PCR)
• Amplifisering av RNA
• Konvertering av RNA til
cDNA*
cDNA
– Revers transkriptase
– Primer
• random primer
• oligo-dT primer
• spesifikk primer
• Deretter amplifisering av
cDNA ved PCR
• Ett eller to trinn
*c= complementary
27
Multiplex PCR
• Flere primersett i samme
reaksjonsblanding
• Krever nøye design
– Samme annealing Tp
– Unngå komplementaritet
mellom primere
http://biocompute.bmi.ac.cn/MF
Eprimer/
– Utprøving
– Sensitivitet/effektivitet ofte
lavere enn ved singel-PCR
stx1
500bp
400bp
300bp
stx1
• Bruk
– Samtidig internkontroll
– Analyse av flere gener samtidig
28
Nested PCR
• Ble utviklet for å øke både
sensitivitet og spesifisitet
Templat
• To sett primere og runder
PCR
• Høy kontaminasjonsrisk
pga transfer-trinn
PCR produkt
• Kan evt gjøres i ett trinn
– voks/ olje
– andre primerpar - vesentlig
lavere Tm (vil ikke bindes i
første amplifikasjon)
PCR produkt
• Benyttes lite i diagnostisk
mikrobiologi nå for tiden
29
Touchdown PCR
• Øke spesifisiteten
– kun amplifisering av
korrekt målsekvens
– øker konsentrasjonen av
ekte målsekvenser
• Protokoll
– starte med høy annealing
tp (65ºC)
• initial høy spesfisitet
– senke annealing temp 1ºC
hver 2. cykel de første 20
cyklene
– så fortsette med 10 cykler
55ºC
• økt effektivitet
30
Broad range PCR
•
•
•
Primere designet for konserverte gener for eksempel i 16S
ribosomalt RNA genet
PCR + sekvensering av PCR produkt
Problemer
– ”Bakgrunnsstøy” –bakterielt DNA i reagenser
– Blandingsinfeksjoner problematisk, utviklet software for
analyse
31
Real-time PCR
• Amplifikasjon og deteksjon i
ett trinn
Hybridization probe kurve
Fluorescens
Enz
Primer1Exponensiell fase
Ikke-exponensiell
platåfase
• Mer avanserte instrumenter
DNA
Primer2
• Fordel
– redusert kontaminasjonsrisiko
– hurtig < 1 hr
– (semi)kvantitativ analyse
• Ulemper
– dyrere
– ikke produktstørrelse
Treshold
Baseline
Cycle treshold
(CT eller Cq)value
32
Real-time PCR- påvisning av
PCR produkt
• Påvisning av dobbelttrådet DNA
– dsDNA-bindende farge; SybrGreen/ EvaGreen
• Fluorescerende probe
– Hybridiserings probe- mellom primerne
• fluorescens ved hybridisering (fluorescence resonance
energy transfer = FRET)
– Hydrolyse probe
• signal basert på Taq polymerasens 5`-3`exonuklease
aktivitet (TaqMan prober)
– Andre
• Molecular Beacon
• Scorpion
33
SYBRGreen1/ EvaGreen
Bindes til minor
groove i dsDNA
Fordel
Ulempe
•Binder alt dsDNA –
kan brukes til alle
gener
•binder uspesifikke
amplicon
(smeltepunktsanalyse)
•binder ikke
enkelttrådet DNA og
svak flourescens i
løsning
•krever omfattende
optimalisering
•Billig
•Enkelt å bruke
•evt. verifisering med
annen metode
•multiplex problematisk
34
Real-time PCR: amplifisering og
smeltepunktsanalyse
Smeltepunktanalyse:
PCR-produkter og
FRET-prober
Ikke mulig med
TaqMan probe
Smeltepunkt
bestemmes av
•Størrelse
•GC-innhold
35
Smeltepunktsanalyse
36
TaqMan prinsippet
Fluorofor/ quencher
Taq polymerase degraderer
proben under ekstensjon (5’-3’
eksonuclease)
Fluorescens øker med mengde
nedbrutt probe
TaqMan MGB probe
-høyere Tm, kortere probe
-Egnet for allele diskriminering
37
Deteksjonsmetoder - Hybridiserings prober
FRET
38
Molecular beacons
39
Uracil N-glycosylase
• dUTP (substitutt for dTTP)
• Pre-PCR behandling med
Uracyl-N-glycosylase enzyme
(UNG)
– UNG katalyserer utkutting av
uracil
– Deretter hydrolyseres DNA ved
høy Tp
• Hindrer ”carry-over”
kontamination
40
Quantitative real-time PCR
Gul: standard med
kjent kopitall
Patient
sample
Treshold
line
Cycle number
10
30
20
40
CT value
40
30
20
10
103
104
105
106
Copy number
41
Kvalitetskontroll i PCR-laboratoriet
• Primær-nivå
– Organisering av laboratoriet
– Forebygge og oppdage PCR kontaminering
• Sekundærnivå
– PCR design and optimalisering
• Sensitivitet, spesifisitet, effektivitet
– Kvalitetskontroll av analyse
• Positive and negative kontroller
• Ekstern kvalitetssikring (Ringtester)
– eks. UK Standards for Microbiology Investigations
42
Kommersiell vs in-house PCR
• In-house tester
– Må etablere og
optimalisere selv
– Selv ansvarlig for
testens kvalitet
– Høye
utviklingskostnader
– Lave kosnader per
analysert prøve
– Krever kvalifisert
personale
• Kommersielle tester
– En leverandør tilbyr
ferdig utviklet test
– Levarandøren er
ansvarlig for testens
kvalitet
– Lave
utviklingskostnader
– Høye kosnader per
analysert prøve
43
Etablering av en ny PCR
• Optimalisering av parametre som affiserer PCR
reaksjonen
– Denaturering: temperatur og tid
– Annealing: temperatur og tid
– Ekstensjon: temperatur og tid
– MgCl2 konsentrasjon
– Sensitivitet og spesifisitet
– Effektivitet
44
Denaturering
• Denaturatering
– Konvensjonell PCR:
– Real-time PCR:
94 °C
95 °C
– For GC-rike templater kan det være
nødvendig å øke tp til 96 °C
45
Annealing
– Vanligvis kan en forsøke en annealing-temp
5 °C lavere enn primer-Tm
• Jo høyere annealing Tp, jo mer spesifikk
annealing
• Når annealing tp senkes øker risikoen for
amplifisering av ikke-spesifikke PCR-produkter
• Finn optimal annealing tp ved gradient analyse
• Annealing tid
• Konvensjonell PCR: 30-90 sec
• Real-time PCR:
5-10 sec
46
Annealing
• Annealing Tp- gradient analyse
47
Ekstension
• 72 °C er optimal ekstensjonstemp. for de
fleste polymeraser
• Konvensjonell PCR:
30sec – 2 min
– I tillegg brukes ofte et post-PCR trinn på 7 min
for å sikre fullstendige PCR produkt
• Real-time PCR:
– Ekstensjonstid avhengig av størrelse på amplikon
• Vanlig regel: amplikon lenge delt på 25
• Eks: 250 bp amplikon behøver 10 sec ekstensjon
48
Beregning av PCR product størrelse
DNA standard
DNA
standard size
bp
Gel elektroforese
mm
298
40
344
38
396
36
506/
517
31,5
1018
20
1636
15,5
2036
12
Fragment
size (bp)
Fragment
size (mm)
Regresjonslinje
49
Mg+ konsentrasjon
• Konsentrasjonen av
Mg2+
– Konvensjonell PCR: 1-3
mM
• normalt1,5 mM
• Avhengig av dNTP kons.
– Real-time PCR: 1-5 mM
• Normalt 5 mM
– Finn optimal
konsentrasjon ved å
teste ulike
konsentrasjoner-trinnvis
50
Sensitivitet
•
Analytisk sensitivitet/ deteksjonsgrense:
– Fortynningsserier med kjent mengde DNA
– Absolutt konsentrasjon beregnes ut fra
• genomisk DNA,
• CFU/ml eller
• konsentrasjon av PCR produkt
• Diagnostisk sensitivitet:
• hvor god testen er til å skille positive og negative prøver
(sammenlignet med en gullstandard)
51
Spesifisitet
– Test PCRen med et panel av relevante
prøver/mikroorganismer/ humant DNA
52
Beregning av PCR-effektivitet
Log
ipaH
6
5
4
3
2
1
CT value
16,1
19,2
23,1
26,5
30,7
34,5
Effektivitet (E):
10(-1/slope)-1= 0.86
53
Krav til optimalisert PCR
• Lineær standardkurve
– r>0,990 eller R2>0,980
• Høy amplifikasjonseffektivitet
– 90-105%
• Lav variasjon mellom
replikater
54
Oppsummering
• Viktig å kjenne prinsippet for PCR metoden og for
ulike varianter av metoden
• Konvensjonell PCR
• Real-time PCR
• Vurdere hvilken metode som er best egnet for eget
laboratorium
• Kjenne styrker og svakheter ved ulike metoder
• Sikre optimal kvalitet
• Kunne gjøre feilsøking når det trengs
55