Amplifikasjonsteknikker
Amplifikasjonsteknikker - PCR 2015 Jan Egil Afset Amplifikasjonsmetoder • Signalamplifikasjon – bDNA, hybrid capture • Target amplifikasjon – PCR – Mange andre metoder • Probeamplifikasjon – Eks: Ligase chain reaction 2 Tema- PCR • • • • • • • • Prinsipp Reagenser Amplifikasjonsbetingelser Påvisning av PCR-produkt Real-time PCR Kvalitetskontroll Varianter av PCR Etablering av ny PCR 3 PCR metoder Konvensjonell PCR Amplifikasjon og deteksjon i to operasjoner, gelelektroforese Real-time PCR Amplifikasjon og deteksjon i samme rør, bruk av fluorescens 4 PCR-prinsipp Målsekvens + buffer (MgCl, KCl etc) Termocykling 5 Nukleotider • Nucleotider – dNTP’er – Tilsettes vanligvis i ekvimolar konsentrasjon – Vanligvis 200-500 µM av hver nukleotid 6 DNA Polymerase • Termostabile (Taq) DNA polymeraser – 5’-3’ DNA polymerase (50-60 nukleotider/sek) – 5’-3’ exonuklease – Mangler 3’-5’ exonuklease (”proofreading”-aktivitet -feilfrekvens 1:104 baser) – Tp optimum 72 C – Amplifikasjon av fragment opp til 2-4 kb 5’ 5’ 3’ 3’ ”Effektivitet” -hvor hurtig (5-100nt/ sek) -hvor langt ”Fidelity” - nøyaktighet 7 Andre typer polymeraser • Revers transkriptase (RT-PCR) • Proofreading enzymer (high fidelity) • Polymeraser for ”long range PCR” (5->20 kbp) • Klenow fragment (DNA polymerase I, mangler 5’-3’ eksonuklease) 8 Reaksjonsmiks • Rolle – Sikre at DNA-polymerasen jobber mest mulig effektivt (sensitivitet) – Sikre at mest mulig spesifikk binding av primere til target (spesifisitet) • Flere ulike tilsetninger kan benyttes for å forbedre PCRens sensitivitet og effektivitet • Kommersielle DNA polymeraser kommer med optimalisert reaksjonsmiks 9 Reaksjonsmiks • MgCl2 – Mg2+ er kofaktor for Taq DNA polymerasen (konsentrasjonsavhengig effekt) – Mg2+ stabiliserer dobbelttrådet DNA inkludert uspesifikke primertemplat-bindinger • Effekt av Mg2+ – Lav konsentrasjon fører til at Taq polymerasen blir mindre effektiv – Høy konsentrasjon fører til at DNA polymerasen blir mindre nøyaktig (fidelity) • Hvilken konsentrasjon er best? – – – – Vanligvis benyttes konsentrasjoner fra 0,5-5mM Krever evt optimalisering I laboratoriet Ekvimolar binding mellom Mg2+og nukleotider (dNTP) Kun fritt Mg2+ er tilgjengelig for DNA polymerasen 10 Reaksjonsmiks • Buffer Tris-HCl (pH 6,8-8,3) – For å stabilisere pH – pH varierer med temperatur • Påvirker nøyaktigheten av polymerasen • lavere pH ved høyere temperatur- forbedret nøyaktighet ved lav pH (accuracy) • KCl – Påvirker primer-templat binding under annealing • For høy konsentrasjon kan føre til uspesifikke produkter 11 Termosykling Denaturering (94-96ºC) Ekstensjon (72ºC) Annealing (50-65ºC) 12 Denaturering • Initiell denaturering (hotstart prinsipp) – Aktivering av Taq DNA polymerasen – Sikre fullstendig denaturering av genomisk DNA i templat før start av PCR amplifikasjon • Kort denatureringstrinn i starten av hver PCRsykel – Denaturering av PCR produkt • Denatureringstiden bør være så kort som mulig for å unngå at DNA polymerasen svekkes 13 Annealing Smeltetemperatur (Tm) • Valg av annealing temperatur avhenger av primer-lengde og GCinnhold – optimal Tp vanligvis 5 °C lavere enn primer Tm – Ved for lav Tp- uspesifikk binding – Ved for høy Tp- lite eller ingen amplifikasjon • Annealing- tid – For lang- risiko for uspesifikke PCRprodukter – For kort- redusert sensitivitet 14 Elongering/ ekstensjon • Optimal Tp 72 °C for de fleste DNApolymeraser • Tid avhenger av lengden av PCR produktet – Lengre produkt krever lengre elongeringstid 15 Antall cykler • Antall cykler som er nødvendig avhenger av konsentrasjonen av DNA templatet – Konvensjonell PCR: 25-35 cykler – Real-time PCR: 40-50 cykler • For mange cykler kan resultere i uspesifikke produkter • For få cykler kan resultere i for liten mengde produkt 16 Reagenser før og etter 30 cykler Initialt Reagens Konsentrasjon Etter 30 cycler Ratio til templat Konsentrasjon Ratio til templat Ratio vs amplifisert fragment Humant genomisk DNA 5fM 1 5fM 1 10-6 PCR target 5fM 1 5nM 106 1 Hver primer 0,5µM 108 0,495µM 108 99 Hver dNTP 50µM 1010 2x105 48µM 9,5x109 2x105 9,5x103 Taq DNA polymerase 1nM 1nM 0,2 17 PCR amplifikasjon 18 Termocykler • Oppvarming/ kjøling – metallblokk (peltier device) – Oppvarming tar tid: 1-2ºC/sek – Oppvarming i luft er raskere – tp-variasjon i blokken? • Varme i lokket • Tp-gradient analyse – Eks 50 – 65 ºC • ”Ramping” – Hvor raskt oppvarming/ nedkjøling foregår – Kan endres 19 20 Påvisning av PCR-produkt • Gelelektroforese – Agarose gel 1-4% kokes, kjøles til 60ºC, støpes – Buffer (Tris/ TBE) IPGRI and Cornell University, 2003 – Strømkilde – Gelkjøring ca 0,5-2 t – Farging • Ethidiumbromid • SybrGreen/ SybrGold • GelGreen/ GelRed – Foto av gel under UV-lys • Fluorescens 21 Påvisning av PCR-produkt Standard Prøve 1 Prøve 2 Pos ktr Neg ktr Standard Analyse av PCR produkt størrelse •Positiv kontroll •Negativ kontroll •Standard 22 Påvisning av PCR-produkt • Andre metoder – Kapillær gelelektroforese på mikrochip (Bioanalyzer) – Massespektrometri • Mass tags – DNA enzyme immunoassy (DEIA) • Anti-dDNA antistoff 23 Påvisning av PCR-produkt Brandal et al. 2007 • Kapillærelektroforese – Fluorescensmerkete primere – Godt egnet til deteksjon ved multipleks PCR • Verifisering av PCR-produkt – sekvensering, Southern blot 24 Varianter av PCR • • • • • • • Hotstart PCR Revers transkriptase PCR (RT-PCR) Multiplex PCR Nested PCR Touchdown PCR Broad-range PCR Realtime PCR 25 Hot-start PCR • Formål: Unngå ikkespesifikk amplifikasjon Tilsette eller aktivere polymerase • Metoder – Tilsette polymerase ved høy temperatur – Inaktiv DNA polymerase • kjemisk modifisert • spesifikke antistoffer • aktivering ved oppvarming – Bruk av voks • DNA polymerase skilt fra mix med voks 26 Revers transkriptase PCR (RT-PCR) • Amplifisering av RNA • Konvertering av RNA til cDNA* cDNA – Revers transkriptase – Primer • random primer • oligo-dT primer • spesifikk primer • Deretter amplifisering av cDNA ved PCR • Ett eller to trinn *c= complementary 27 Multiplex PCR • Flere primersett i samme reaksjonsblanding • Krever nøye design – Samme annealing Tp – Unngå komplementaritet mellom primere http://biocompute.bmi.ac.cn/MF Eprimer/ – Utprøving – Sensitivitet/effektivitet ofte lavere enn ved singel-PCR stx1 500bp 400bp 300bp stx1 • Bruk – Samtidig internkontroll – Analyse av flere gener samtidig 28 Nested PCR • Ble utviklet for å øke både sensitivitet og spesifisitet Templat • To sett primere og runder PCR • Høy kontaminasjonsrisk pga transfer-trinn PCR produkt • Kan evt gjøres i ett trinn – voks/ olje – andre primerpar - vesentlig lavere Tm (vil ikke bindes i første amplifikasjon) PCR produkt • Benyttes lite i diagnostisk mikrobiologi nå for tiden 29 Touchdown PCR • Øke spesifisiteten – kun amplifisering av korrekt målsekvens – øker konsentrasjonen av ekte målsekvenser • Protokoll – starte med høy annealing tp (65ºC) • initial høy spesfisitet – senke annealing temp 1ºC hver 2. cykel de første 20 cyklene – så fortsette med 10 cykler 55ºC • økt effektivitet 30 Broad range PCR • • • Primere designet for konserverte gener for eksempel i 16S ribosomalt RNA genet PCR + sekvensering av PCR produkt Problemer – ”Bakgrunnsstøy” –bakterielt DNA i reagenser – Blandingsinfeksjoner problematisk, utviklet software for analyse 31 Real-time PCR • Amplifikasjon og deteksjon i ett trinn Hybridization probe kurve Fluorescens Enz Primer1Exponensiell fase Ikke-exponensiell platåfase • Mer avanserte instrumenter DNA Primer2 • Fordel – redusert kontaminasjonsrisiko – hurtig < 1 hr – (semi)kvantitativ analyse • Ulemper – dyrere – ikke produktstørrelse Treshold Baseline Cycle treshold (CT eller Cq)value 32 Real-time PCR- påvisning av PCR produkt • Påvisning av dobbelttrådet DNA – dsDNA-bindende farge; SybrGreen/ EvaGreen • Fluorescerende probe – Hybridiserings probe- mellom primerne • fluorescens ved hybridisering (fluorescence resonance energy transfer = FRET) – Hydrolyse probe • signal basert på Taq polymerasens 5`-3`exonuklease aktivitet (TaqMan prober) – Andre • Molecular Beacon • Scorpion 33 SYBRGreen1/ EvaGreen Bindes til minor groove i dsDNA Fordel Ulempe •Binder alt dsDNA – kan brukes til alle gener •binder uspesifikke amplicon (smeltepunktsanalyse) •binder ikke enkelttrådet DNA og svak flourescens i løsning •krever omfattende optimalisering •Billig •Enkelt å bruke •evt. verifisering med annen metode •multiplex problematisk 34 Real-time PCR: amplifisering og smeltepunktsanalyse Smeltepunktanalyse: PCR-produkter og FRET-prober Ikke mulig med TaqMan probe Smeltepunkt bestemmes av •Størrelse •GC-innhold 35 Smeltepunktsanalyse 36 TaqMan prinsippet Fluorofor/ quencher Taq polymerase degraderer proben under ekstensjon (5’-3’ eksonuclease) Fluorescens øker med mengde nedbrutt probe TaqMan MGB probe -høyere Tm, kortere probe -Egnet for allele diskriminering 37 Deteksjonsmetoder - Hybridiserings prober FRET 38 Molecular beacons 39 Uracil N-glycosylase • dUTP (substitutt for dTTP) • Pre-PCR behandling med Uracyl-N-glycosylase enzyme (UNG) – UNG katalyserer utkutting av uracil – Deretter hydrolyseres DNA ved høy Tp • Hindrer ”carry-over” kontamination 40 Quantitative real-time PCR Gul: standard med kjent kopitall Patient sample Treshold line Cycle number 10 30 20 40 CT value 40 30 20 10 103 104 105 106 Copy number 41 Kvalitetskontroll i PCR-laboratoriet • Primær-nivå – Organisering av laboratoriet – Forebygge og oppdage PCR kontaminering • Sekundærnivå – PCR design and optimalisering • Sensitivitet, spesifisitet, effektivitet – Kvalitetskontroll av analyse • Positive and negative kontroller • Ekstern kvalitetssikring (Ringtester) – eks. UK Standards for Microbiology Investigations 42 Kommersiell vs in-house PCR • In-house tester – Må etablere og optimalisere selv – Selv ansvarlig for testens kvalitet – Høye utviklingskostnader – Lave kosnader per analysert prøve – Krever kvalifisert personale • Kommersielle tester – En leverandør tilbyr ferdig utviklet test – Levarandøren er ansvarlig for testens kvalitet – Lave utviklingskostnader – Høye kosnader per analysert prøve 43 Etablering av en ny PCR • Optimalisering av parametre som affiserer PCR reaksjonen – Denaturering: temperatur og tid – Annealing: temperatur og tid – Ekstensjon: temperatur og tid – MgCl2 konsentrasjon – Sensitivitet og spesifisitet – Effektivitet 44 Denaturering • Denaturatering – Konvensjonell PCR: – Real-time PCR: 94 °C 95 °C – For GC-rike templater kan det være nødvendig å øke tp til 96 °C 45 Annealing – Vanligvis kan en forsøke en annealing-temp 5 °C lavere enn primer-Tm • Jo høyere annealing Tp, jo mer spesifikk annealing • Når annealing tp senkes øker risikoen for amplifisering av ikke-spesifikke PCR-produkter • Finn optimal annealing tp ved gradient analyse • Annealing tid • Konvensjonell PCR: 30-90 sec • Real-time PCR: 5-10 sec 46 Annealing • Annealing Tp- gradient analyse 47 Ekstension • 72 °C er optimal ekstensjonstemp. for de fleste polymeraser • Konvensjonell PCR: 30sec – 2 min – I tillegg brukes ofte et post-PCR trinn på 7 min for å sikre fullstendige PCR produkt • Real-time PCR: – Ekstensjonstid avhengig av størrelse på amplikon • Vanlig regel: amplikon lenge delt på 25 • Eks: 250 bp amplikon behøver 10 sec ekstensjon 48 Beregning av PCR product størrelse DNA standard DNA standard size bp Gel elektroforese mm 298 40 344 38 396 36 506/ 517 31,5 1018 20 1636 15,5 2036 12 Fragment size (bp) Fragment size (mm) Regresjonslinje 49 Mg+ konsentrasjon • Konsentrasjonen av Mg2+ – Konvensjonell PCR: 1-3 mM • normalt1,5 mM • Avhengig av dNTP kons. – Real-time PCR: 1-5 mM • Normalt 5 mM – Finn optimal konsentrasjon ved å teste ulike konsentrasjoner-trinnvis 50 Sensitivitet • Analytisk sensitivitet/ deteksjonsgrense: – Fortynningsserier med kjent mengde DNA – Absolutt konsentrasjon beregnes ut fra • genomisk DNA, • CFU/ml eller • konsentrasjon av PCR produkt • Diagnostisk sensitivitet: • hvor god testen er til å skille positive og negative prøver (sammenlignet med en gullstandard) 51 Spesifisitet – Test PCRen med et panel av relevante prøver/mikroorganismer/ humant DNA 52 Beregning av PCR-effektivitet Log ipaH 6 5 4 3 2 1 CT value 16,1 19,2 23,1 26,5 30,7 34,5 Effektivitet (E): 10(-1/slope)-1= 0.86 53 Krav til optimalisert PCR • Lineær standardkurve – r>0,990 eller R2>0,980 • Høy amplifikasjonseffektivitet – 90-105% • Lav variasjon mellom replikater 54 Oppsummering • Viktig å kjenne prinsippet for PCR metoden og for ulike varianter av metoden • Konvensjonell PCR • Real-time PCR • Vurdere hvilken metode som er best egnet for eget laboratorium • Kjenne styrker og svakheter ved ulike metoder • Sikre optimal kvalitet • Kunne gjøre feilsøking når det trengs 55
© Copyright 2024